PT100122B - Polipeptidos correspondentes aos locais de ligacao induzidos no receptor (ribs), anticorpos anti-ribs e processos de deteccao e de isolamento do anticorpo - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

Campo Técnico

O presente invento refere-se a um local de ligação do anticorpo que é induzido num ligando, quando esse ligando é ligado por um receptor para formar um complexo receptor-ligando. Anticorpos monoclonais que imunorreagem com um tal local de ligação induzido pelo receptor, assim como processos terapêuticos e de diagnóstico associados estão também contemplados.

Antecedentes

As interacções dos ligandos com moléculas receptoras da superfície celular constituem as bases dos processos biológicos. São exemplos dessas interacções a ligação do ligando formado por uma porção da proteína do envelope (gpl40) do vírus da SIDA (HIV) com o receptor CD4 das células T, os receptores do complexo de histocompatibilidade principal que interagem com numerosos ligandos nos processos de auto/não-auto descriminação no sistema imunológico e a interacção do ligando fibrinogénio com o receptor celular GPIIb-IIIa, das plaquetas. 0 par ligando-receptor fibrinogénio:GPIIb-IIIa apresenta particular interesse na coagulação do sangue, na formação de trombos e são utilizados a partir de agora como exemplos de ligandos e de receptores.

Desde há muito que se procuram na arte métodos imunológicos para distinguir entre as formas ligada e não-ligada dos ligandos e receptores, porque essa capacidade permitiria a determinação do estado dos mecanismos fisiológicos mediados pela formação do complexo receptor:ligando. Até recentemente, esforços para realizar essas determinações por métodos imunológicos têm sido frustrados, porque as amostras biológicas podem conter ligandos e receptores em ambas as formas ligada (complexada) e livre.

Por exemplo, a vasculatura de indivíduos que sofrem acidentes trombóticos contém formas não-ligadas de fibrinogénio:GPIIb-IIIa, bem como plaquetas que possuem complexo

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fibrinogénio:GPIIb-IIIa na sua superfície. O complexo fibrinogénio e GPIIb-IIIa expressa determinantes antigénicos comuns ao fibrinogénio não-ligado e GPIIb-IIIa não-ligado, dificultando assim, a identificação de uma condição trombótica ou a localização de um trombo pelos métodos imunológicos existentes.

Recentemente, Frelinger et al., J. Biol. Chem., 263: 12397-12402 (1988) referiram a identificação de um determinante antigénico expresso pelo GPIIb-IIIa apenas quando o GPIIb-IIIa está ligado a um ligando. Isto é, o determinante antigénico, descrito por Frelinger et al. era expresso pelo receptor do complexo receptor:ligando.

Outros têm referido a preparação de anticorpos monoclonais que imunorreagem com um determinante antigénico expresso após ligação a superfícies artificiais, não-receptoras. Soria et al., J. Colloid Interface Sei.. 107:204-208 (1985) descrevem um anticorpo monoclonal particular referido como DSB², induzido pela imunização com fragmento de fibrina reticulado que adere a fibrinogénio adsorvido em plástico e também ao designado fragmento D de fibrinogénio, adsorvido em plástico ou livre em solução. Como várias vezes referido, o anticorpo não se liga ao fibrinogénio em fase de solução ou ao designado fragmento E do fibrinogénio, quando em solução.

Adicionalmente, Nilsson et al., Molec. Immunul.. 24:487-94 (1987) referem a preparação de anticorpos monoclonais que imunorreagem com fragmentos de partículas de complemento de C3 ligadas a Zymosan A, mas não com fragmentos C3 solúveis. A natureza da ligação da proteína ao Zymosan A envolve ligações químicas covalentes.

Noutra referência, Abrams et al., Blood (suppl. 1), 70: 355a (Dezembro 1987) discute resumidamente um anticorpo monoclonal designado por 9F9, que é referido no sumário publicado, ligar-se a fibrinogénio ligado a plaquetas. Essa referência breve, no entanto, não caracteriza as propriedades de

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-4ligação específicas do monoclonal 9F9.

Numerosos anticorpos monoclonais que imunorreagem com o fibrinogénio solubilizado têm sido referidos. Uma dessas referências é Lindon et al., Blood. 68:355-362 (Agosto 1988). Este artigo referencia o uso de anticorpos monoclonais anti-fibrinogénio humano disponíveis comercialmente, assim como de anticorpos policlonais, purificados por afinidade contra os fragmentos D e E.

Breve Sumário do Invento presente invento envolve o facto de se ter verificado que ligandos, ligados especificamente a um receptor podem ser distinguidos dos ligandos não ligados, pela presença de um local de ligação de anticorpo induzido por receptor (RIBS) expresso pelo ligando ligado ao receptor. Isto é, foi agora encontrada uma classe de determinantes antigénicos, na qual um determinante é expresso quando um ligando se liga especificamente a um receptor mas não quando o receptor e o ligando não estão ligados.

Um RIBS é expresso num ligando devido à interacção específica da ligação de um ligando ao seu receptor relacionado. Um RIBS não é um local determinante antigénico que é exposto quando uma proteína interage não especificamente com outra superfície, tal como proteína adsorvida a plástico, ou quando uma proteína interage por ligações químicas covalentes com uma superfície. Estes dois últimos exemplos estão descritos em Soria et al., e Nilsson et al., referências descritas anteriormente, e não envolvem uma interacção de ligação específica receptor-ligando que gera um RIBS tal como é aqui definido.

Também contemplados pelo presente invento estão moléculas de anticorpo que imunorreagem com um ligando quando está ligado a um receptor, mas não imunorreagem com o receptor ou com o ligando quando estes não estão ligados especificamente entre si. Numa concretização preferida, um anticorpo do invento reconhece um RIBS, localizado no fibrinogénio humano.

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Estes anticorpos reconhecem um RIBS induzido como consequência da interação do fibrinogénio com um receptor, portanto preferencialmente GPIIb-IIIa em plaquetas. Um anticorpo deste invento imunorreage selectivamente com fibrinogénio ligado, mesmo na presença de um largo excesso de fibrinogénio de plasma. As propriedades únicas destes anticorpos possibilitam então uma larga variedade de sistemas de diagnóstico e métodos terapêuticos aplicáveis.

Uma concretização preferida do presente invento é para um anticorpo monoclonal que imunorreage com um local de ligação induzido pelo receptor expresso por um complexo receptor-ligando. Preferencialmente, o anticorpo monoclonal é seleccionado de entre o grupo consistindo em anticorpos designados 2G5, 2F10, 3G11 e 4G10. O anticorpo monoclonal é produzido por um hibridoma seleccionado de entre o grupo consistindo em hibridoma 2G5, hibridoma 2F10, hibridoma 3G11 e hibridoma 4G10.

Outra concretização deste invento é uma composição de cultura de células que compreende:

a) um hibridoma que produz um anticorpo que imunorreage com um local de ligação induzido pelo receptor expresso por um complexo GPIIb-IIIa:fibrinogénio, o hibridoma seleccionado de entre o grupo consistindo em hibridoma 2G5, hibridoma 2F10, hibridoma 3G11 e hibridoma 4G10;

b) moléculas de anticorpo segregadas pelo hibridoma; e

c) um meio de cultura para o hibridoma.

Ainda contemplado é um processo de detecção da presença de um complexo receptor-ligando, em que o sistema compreende um anticorpo monoclonal que imunorreage com um local de ligação induzido pelo receptor (RIBS) expresso por um complexo receptor-ligando, RIBS esse que não é expresso pelo receptor não-ligado ou pelo ligando não-ligado. Preferencialmente, o

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—6— complexo receptor é GPIIb-IIIa:fibrinogénio. Também preferido é um processo em que o anticorpo monoclonal está ligado a um meio indicador in vivo.

Outro aspecto deste invento é um sistema de diagnóstico, na forma de um conjunto para ensaiar numa amostra de fluido vascular a presença do complexo GPIIb-IIIa:fibrinogénio, em que o sistema de diagnóstico compreende um anticorpo monoclonal que imunorreage com um RIBS expresso por este complexo.

Outra concretização deste invento é um processo de dispersão, in vivo, de um trombo num mamífero, que compreende:

a) administrar intravenosamente, ao referido mamífero, uma quantidade eficaz de um conjungado anticorpo monoclonal-enzima activador do plasminogénio, em que a região de anticorpo monoclonal do conjugado imunorreage com um RIBS expresso por um complexo GPIIb-IIIa:fibrinogénio. Preferencialmente o enzima activador do plasminogénio é um activador do plasminogénio tissular e o anticorpo monoclonal é seleccionado de entre o grupo consistindo em anticorpos designados 2G5, 2F10, 3G11 e 4G10.

Outro aspecto do presente invento consiste na detecção in vivo de um trombo num mamífero, que compreende os passos de:

a) administrar intravenosamente a um mamífero uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal que imunorreage com um RIBS expresso por um complexo GPIIb-IIIa:fibrinogénio indicativo de um trombo;

b) manter o mamífero a que foi feita a administração por um período de tempo predeterminado suficiente para o anticorpo monoclonal imunorreagir com o complexo GPIIb-IIIa:fibrinogénio de modo a formar um produto de imunorreacção com ele; e

c) ensaiar a presença de qualquer produto de imunorreacção formado no passo (b) e assim a presença do trombo.

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-7Também está contemplado um polipéptido que corresponde, em sequência de resíduos de aminoácido, a um RIBS do presente invento expresso por um complexo receptor-ligando. Numa concretização preferida o polipéptido contém uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a um RIBS num complexo GPIIb-IIIa:fibrinogénio. Mais preferivelmente, a sequência total do polipéptido é idêntica à sequência de aminoácidos do RIBS correspondente à cadeia gama do fibrinogénio humano. Um polipéptido particularmente preferível compreende até cerca de 40 resíduos de aminoácido e inclui uma sequência de resíduos de aminoácido com a fórmula: Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-LysLys-Thr-Thr-Met-Lys. Mais preferivelmente, o polipéptido tem a fórmula: H-Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr-Thr-Met-Lys-OH.

presente invento também se refere a um anticorpo que imunorreage com um polipéptido do presente invento, que mimetiza um epitopo RIBS na molécula ligando de um complexo receptor-ligando, por exemplo, tal como quando o polipéptido está imobilizado numa superfície. Preferencialmente, um anticorpo do invento também imunorreage com um complexo receptor-ligando, contendo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente do polipéptido. Um anticorpo particularmente preferido, neste ponto de vista, é segregado pelo hibridoma 2G5, tendo a designação ATCC HB9847.

Os polipéptidos e anticorpos do presente invento permitem um número de protocolos de terapia e de diagnóstico. Por exemplo, é contemplado um processo para inibir e/ou neutralizar um anticorpo do presente invento, de imunorre.agir com um complexo receptor-ligando num paciente, através do tratamento do paciente com um polipéptido do presente invento, tal como quando é misturado com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Assim, um polipéptido, tal como é descrito acima, imunorreage competitivamente com o anticorpo, reduzindo deste modo a presença de anticorpo livre no paciente.

Outro processo de uso contemplado para os polipéptidos e

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SCR 0725P/SC 163.2 POR anticorpos do presente invento consiste na detecção da presença de anticorpo numa solução contendo o anticorpo. Assim, a solução pode ser passada sobre uma superfície contendo um polipéptido do presente invento nela imobilizado, onde o anticorpo preferencialmente reage com o polipéptido de modo a formar um imunocomplexo detectável. A presença de imunocomplexo indica a presença de anticorpo na solução.

Ainda outro uso contemplado consiste no isolamento de um anticorpo do presente invento de uma solução contendo o anticorpo, por exemplo, de impurezas na solução. A solução contendo o anticorpo pode ser passada sobre um polipéptido do presente invento numa superfície, a partir da qual o anticorpo é subsequentemente deslocado. 0 anticorpo alvo é recolhido e assim purificado.

Descrição das Figuras

A Figura 1 representa a ligação de MAb 2G5 a fibrinogénio ligado a plaquetas. A ligação de ¹²⁵I-2G5 (0,1 μΜ) a plaquetas (1 x ΙΟθ/ml) foi efectuada com plaquetas não-estimuladas, estimuladas por ADP (10 μΜ) ou estimuladas por a-trombina (0,5 unidades/ml), na ausência (barra a tracejado) ou presença de 1 μΜ de fibrinogénio (barra a cheio). Em experiências paralelas, apenas a ligação de ¹²⁵I-fibrinogénio (0,3μΜ) foi medida (barra a branco).

A Figura 2 representa o isolamento de fragmentos proteolíticos de D100 reactivo com MAb 2G5. 0 D100 foi digerido com plasmina e submetido a cromatografia de afinidade em 2G5 imobilizado. Painel A, cromatograma seguido pela absorvância a 280 nm indica as fracções não retida (F) e ligada (B). 0 material ligado foi reunido e sujeito a HPLC (cromatografia líquida de elevada pressão), numa coluna Vydac C18 de fase inversa. Painel B, cromatograma de HPLC a 280 nm.

Descrição Detalhada do Invento

A. Definições

Sequência de Resíduos de Aminoácido: uma série de dois ou

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-9mais resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas entre resíduos adjacentes formando um péptido ou polipéptido. Uma sequência de resíduos de aminoácido é convenientemente representada por abreviaturas de uma ou três letras dos seus aminoácidos constituintes. As abreviaturas aqui usadas para aminoácidos são as fornecidas em 37 C.F.R. §$1.822 (b) (2) e estão reproduzidas na seguinte Tabela de Correspondência:

TABELA DE CORRESPONDÊNCIA

ABREVIATURA

AMINOÁCIDO uma letra três letras

Y	Tyr
G	Gly
F	Phe
M	Met
A	Ala
S	Ser
I	Ile
L	Leu
T	Thr
V	Vai
P	Pro
K	Lys
H	His
Q	Gin
E	Glu
Z	Glx
W	Trp
R	Arg
D	Asp
N	Asn
B	Asx
C	Cys
J	Xaa

tirosina glicina fenilalanina metionina alanina serina isoleucina leucina treonina valina prolina lisina histidina glutamina ácido glutâmico Glu e/ou Gin triptofano arginina ácido aspártico aspargina Asn e/ou Asp Cisteína Não especificado

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Aqui, os resíduos individuais compreendendo uma sequência de resíduos de aminoácido podem estar nas formas isoméricas D ou L, desde que a propriedade funcional desejada seja retida pela(s) moléculas(s) que incorporam a sequência de resíduos de aminoácido. De igual modo a sequência de resíduos de aminoácido pode incluir aminoácidos modificados pós-tradução, por exemplo, resíduos de aminoácidos hidroxilados, glicosados ou resíduos ligados por ligação dissulfureto. Adicionalmente, uma sequência de resíduos de aminoácido pode incluir um ou mais aminoácidos modificados ou invulgares, tais como aqueles listados em 37 C.F.R. $§1.822 (b) (4), que são aqui incorporados para referência. Uma sequência de resíduos de aminoácido pode ser representada através das abreviaturas correspondentes aos seus aminoácidos constituintes, na qual um hífen entre duas abreviaturas adjacentes indica uma ligação peptidica entre os resíduos correspondentes.

Péptido/Polipéptido; um polímero compreendendo, pelo menos, dois resíduos de aminoácido, no qual os resíduos adjacentes estão ligados por uma ligação peptidica entre o grupo amino alfa de um resíduo e um grupo carbonilo alfa de um resíduo adjacente. A estrutura primária de um polipéptido possui um grupo amina primário numa extremidade e um grupo ácido carboxílico na outra extremidade do polímero. Assim um polipéptido pode ser representado pela fórmula:

H-[NH-CH-C(O)- OH

I

R onde R é uma cadeia lateral característica de um dado resíduo de aminoácido e i indica um número de resíduos de aminoácido compreendendo o polímero cujo número é dois ou mais. Um polipéptido pode compreender uma ou mais sequências de resíduos de aminoácidos. De igual modo, um polipéptido em solução aquosa está geralmente numa ou mais formas zwiteriónicas dependendo do pH da solução.

Proteína: um polipéptido simples ou um conjunto de

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SCR 0725P/SC 163.2 POR —11— polipéptidos reticulados, compreendendo mais do que cerca de 50 resíduos de aminoácido. As proteínas podem apresentar reticulação química, isto é, através de pontes dissulfureto, no seio da mesma cadeia polipeptídica ou entre polipéptidos adjacentes. As proteínas podem ser glicosadas, designando-se, neste caso, por glicoproteínas.

Receptor; uma molécula proteica, biologicamente activa, que se liga especificamente a (ou com) outras moléculas, referidas como ligandos, para formar uma proteína receptor-ligando ou complexo glicoproteína.

Ligando e Ligando relacionado: Uma molécula que contém uma porção estrutural que está ligada por interacção específica com uma molécula particular de receptor.

Determinante Antigénico ou Antigénio: Determinante antigénico ou antigénio refere-se à porção estrutural efectiva do antigénio que está ligado imunologicamente por um local de combinação do anticorpo. Os termos são também usados permutavelmente com epítopo.

Neo-antiaénio: Um neo-antigénio, tal como aqui definido, é um determinante antigénico novo que não é expresso por um ligando antes da ligação ao receptor, mas que é expesso no complexo 1igando-receptor.

Determinante Antigénico Críptico: Refere-se a um determinante neo-antigénico formado por alteração na conformação de uma proteína ligando, após ligação ao seu receptor (específico) relacionado. Assim, um ligando aqui descrito não expressa um determinante antigénico críptico, a menos que o ligando esteja ligado especificamente a um receptor.

Local de Ligação Induzido pelo Receptor (RIBS): Um RIBS é um determinante neo-antigénico que é expresso pela porção de ligando de um complexo receptor-ligando, mas que não é expresso tanto pelo ligando não ligado ou pelo receptor não ocupado. Um

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-12RIBS pode ser conformacional ou sequencial. Um RIBS é o resultado de alterações específicas do ligando induzidas pela ligação do receptor, isto é, um determinante antigénico críptico.

Anticorpo: 0 termo anticorpo nas suas várias formas gramaticais é aqui utilizado para referir moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um local de combinação de anticorpo ou paratopo. Moléculas de anticorpo, que podem servir de exemplo, são moléculas intactas de imunoglobulina, moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e porções de uma molécula de imunoglobulina, incluindo as porções conhecidas na arte como Fab, Fab⁷, F(ab⁷)2 β F (v).

Local de Combinação do Anticorpo: um local de combinação do anticorpo é aquela porção estrutural de uma molécula de anticorpo constituída por uma cadeia pesada e uma leve variável e regiões hipervariáveis que se ligam especificamente (imunorreagem com) um antigénio. O termo imunorreage, nas suas várias formas significa ligação específica entre uma molécula contendo um determinante antigénico e uma molécula contendo um local de ligação do anticorpo, tal como uma molécula inteira de anticorpo ou uma sua porção.

Anticorpo Monoclonal: A frase anticorpo monoclonal nas suas várias formas gramaticais refere-se a uma população de moléculas de anticorpo que contêm essencialmente apenas uma espécie de local de combinação de anticorpo, capaz de imunorreagir com um antigénio particular. Assim, um anticorpo monoclonal apresenta tipicamente afinidade única de ligação para qualquer antigénio com o qual imunorreage. Deste modo, um anticorpo monoclonal pode conter uma molécula de anticorpo contendo uma pluralidade de locais de ligação de anticorpo, cada um imunoespecífico para um antigénio diferente, por exemplo, um anticorpo monoclonal biespecífico.

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B.

Locais de Ligação Induzidos pelo Receptor e Polipéptidos

Tal como foi antériorménté notado, a formação do complexo ligando-receptor reside na base de muitos processos biológicos.

Verificou-se agora que a par com a função biológica que acompanha a formação do ligando-receptor, outra alteração mais súbtil ocorre. A alteração é na conformação da molécula de ligando, que resulta da interacção de ligação com o receptor por formação do complexo. A alteração na conformação do ligando resulta na formação de um determinante neo-antigénico, que é expresso substancialmente apenas por formação do complexo. O determinante neo-antigénico é aqui referido como um local de ligação induzido pelo receptor (RIBS).

RIBS expresso pelo complexo formado pela ligação do fibrinogénio, como ligando, a GPIIb-IIIa, como receptor, é aqui utilizado ilustrativamente como exemplo do fenómeno de formação de RIBS. Anticorpos monoclonais que imunorreagem com o complexo fibrinogénio-GPIIb-IIIa, mas não reagem substancialmente com o ligando ou com o receptor quando não estão presentes como um complexo fibrinogénio-GPIIb-IIIa, são também aqui utilizados como exemplo de anticorpos monoclonais anti-RIBS (ou mais simplesmente RIBS).

Para além dos RIBS e anticorpos monoclonais RIBS dados como exemplo, aqui especificamente discutidos, vários complexos adicionais ligando-receptor são referidos na literatura. 0 presente invento contempla que esses complexos também formem RIBS, podendo ser produzidos anticorpos monoclonais contra esses RIBS, utilizando as técnicas aqui descritas. Esses anticorpos monoclonais imunorreagem apenas com a porção do ligando do complexo ligando ligado ao receptor e não com o receptor livre ou o ligando livre. Utilizando esses RIBS monoclonais pode-se agora ensaiar a presença e a quantificação de um complexo ligando-receptor, isto é, um receptor ocupado ou um ligando ocupado, na presença de, qualquer um ou ambos, ligando livre e receptor livre.

Como exemplo, pares de ligandos e receptores que formam

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-14RIBS encontram-se enumerados na Tabela I seguinte. Tenciona-se que estes pares sejam apenas ilustrativos não se limitando à combinação receptor-ligando que podem formar um RIBS do presente invento.

TABELA 1

PARES LIGANDO RECEPTOR

Ligando

Receptor

Citação No.

Factor de Von wilderbrand

GPllb-IIIa

Vitronectina Fibronectina ICAM-1

Laminina

Colagénio C3bi C3d

HIV-gpl40 Proteína de Libertação de FSH

Apo B-100 IL-2 Imunoglobulinas Gonadotropina coriónica

PDGF Transferina

GPllb-IIIa

Receptor de fibronectina LFA-1

CSAT

VLA-2

Receptor do complemento CR3

Receptor do complemento CR2

Receptor da célula CD4 T

Receptor FRP

Receptor de apolipoproteína Receptor de interleucina Receptor de Fc

Receptor de Somatostatina Receptor de PDGF Transferina

Ruoslahti et al., Science. 238:491-497 (1987).

Horwitz et al., J. Cell Biol., 101:2134 (1985).

Nieuwenhuis et al., Nature, 318:470 (1985).

Wrigth et al., PNAS, 84:1965 (1987).

Nemerow et al., J. Virol., 55:347 (1985).

Guyader et al., Nature, 320:662 (1987).

Yu et al., Nature, 330:765 (1987).

Yamada et al., J. Clin. Invest., 80:507 (1987).

Dower et al., Immunol. Todav, 8:46 (1987).

Anderson et al., J. Immunol, 138:2254 (1987).

Kim et al., J. Biol. Chem.,262:470 (1987).

Keating et al., J. Biol. Chem., 252:7932 (1987).

Kohgo et al., Blood, 70:1955 (1987).

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Numa concretização deste invento, é contemplado um polipéptido que mimetiza um epítopo do ligando num complexo receptor-ligando num RIBS do ligando. Consequentemente, um polipétido do presente invento possui uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde à do ligando na região do RIBS.

Numa concretização preferida, um polipéptido contém uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a uma sequência de resíduos de aminoácido na cadeia gama do fibrinogénio humano, que define um RIBS. Mais preferivelmente a sequência inteira do polipéptido será idêntica à da região do fibrinogénio que a mimetiza, no entanto, substituições conservativas do polipéptido a partir do fibrinogénio nativo são também contempladas.

Assim, num aspecto preferido do invento, um polipéptido deste invento possui uma sequência de resíduos de aminoácido representada pela fórmula seguinte:

H-X_n-Y-X_m-OH onde Y é uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionados de entre o grupo de sequências de resíduos de aminoácido da cadeia gama de fibrinogénio; X_n encontra-se ausente, quando n=0, e é uma sequência de resíduos de aminoácido N-terminal (segmento inicial) que contém até cerca de 30 resíduos, quando n=l; e X_m encontra-se ausente, quando m=0, e é uma sequência de resíduos de aminoácido C-terminal (segmento de cauda) que contém até cerca de 30 resíduos, quando m=l.

polipéptido inteiro compreende até cerca de 40 resíduos de aminoácido, mais preferivelmente até cerca de 30 resíduos, e muito preferivelmente até cerca de 20 resíduos.

Preferivelmente, Y corresponde a uma sequência de resíduos de aminoácido na cadeia gama do fibrinogénio humano a partir aproximadamente do resíduo 363 até aproximadamente ao resíduo 393. Muito preferivelmente, Y possui uma sequência de resíduos de aminoácido dada pela fórmula: Asn-Gly-Ile-Ile-Trp-Ala-Thr-Trp-Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr-Thr. Muito preferi-

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possui a fórmula: Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr-Thr-Met-Lys.

Preferivelmente, quando X_n ou X_m são uma sequência de resíduos de aminoácido, X_n ou X_m contêm até cerca de 20 resíduos, muito preferivelmente até cerca de 10 resíduos e idealmente até cerca de 5 resíduos de aminoácido. Tipicamente, X_n e X_m possuem, cada um, uma sequência de resíduos de aminoácido idêntica à da sequência correspodente, encontrada no fibrinogénio humano.

Numa concretização ainda mais preferida, um polipéptido do invento possui a fórmula:

H-Y-OH onde Y é definido como anteriormente.

Um polipéptido do presente invento pode ser usado para gerar uma variedade de anticorpos úteis, pelos meios aqui descritos. As utilidades dos polipéptidos serão evidentes a partir da discussão aqui, a seguir, fornecida.

Tipicamente, um polipéptido do presente invento não é glicosado, isto é, é sintetizado directamente por técnicas comuns de síntese peptídica ou por expressão de uma molécula de ADN recombinante do presente invento num hospedeiro procariota. Um polipéptido do presente invento produzido num eucariota é tipicamente glicosado.

Um polipéptido do presente invento pode incorporar uma variedade de alterações, tais como inserções, delecções e substituições de resíduos de aminoácido que são conservativas ou não conservativas desde que a molécula de polipéptido resultante exiba as propriedades desejadas. As propriedades desejadas, como aqui é referido, incluem o facto de o polipéptido ser imunogénico num hospedeiro apropriado e capaz de gerar anticorpos para o polipéptido e preferivelmente para um complexo GPIlb-llla-fibrinogénio, por exemplo, como expresso em plaquetas. Adicionalmente, o polipéptido é antigénico de forma

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que um anticorpo seja imunorreactivo com o polipéptido e preferivelmente com um complexo GPIIb-IIIa-fibrinogénio.

Quando um polipéptido do presente invento incorpora substituições conservativas das sequências correspondentes àquelas descritas anteriormente, os resíduos de aminoácido substituídos são substituídos por outros resíduos de aminoácido biologicamente semelhantes, de forma que o polipéptido resultante possua uma sequência de resíduos de aminoácido que seja diferente (outra) da sequência do fibrinogénio. Alguns exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de resíduos hidrofóbicos tais como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outros resíduos hidrofóbicos. Do mesmo modo, um resíduo polar tal como arginina, glicina, ácido glutâmino, ácido aspártico, glutamina, asparagina, e outros semelhantes podem ser substituídos conservativamente por outros membros deste grupo. Ainda outro aspecto de um polipéptido incorporando substituições conservativas ocorre quando um resíduo de aminoácido substituído substitui um resíduo de aminoácido não substituído da mesma família. Exemplos de aminoácidos substituídos podem ser encontrados em 37 C.F.R.$§l,822(b) (4), espécies essas que são aqui incorporadas para referência. Quando um polipéptido possui uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde à sequência do fibrinogénio, mas tem uma ou mais substituições conservativas, preferivelmente não mais de cerca de 20%, e mais preferivelmente não mais de cerca de 10% dos resíduos de aminoácido da proteína nativa são substituídos. Os polipéptidos substituídos conservativamente particularmente preferidos são os análogos monossubstituídos da sequência de resíduos de aminoácido da cadeia gama humana, tais como aqueles acima identificados.

Um polipéptido do presente invento pode ser sintetizado por qualquer técnica de síntese péptidos sintéticos conhecida dos peritos na arte. Um resumo de algumas das técnicas disponíveis pode ser encontrado em J. M. Stuard e J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman, Co., San Francisco (1969), J. Meinhofer, Hormonal Proteins and Peptides” vol. 2, pp. 46,

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Academic Press (New York) 1983 e na Patente U.s. n² 4 631 211 cuja descrição é aqui incorporada para referência. Quando um polipéptido desejado para uso no presente invento é relativamente curto (menos do que cerca de 40 resíduos de aminoácido, de comprimento) técnicas directas de síntese de péptidos são geralmente favorecidas, usualmente pelo emprego de uma técnica de fase sólida tal como a de Merrifield (Merrifield JACS 85: 2149 (1963)).

Um outro aspecto do invento é uma composição polipeptídica compreendendo um polipéptido do presente invento misturado com um excipiente farmacêutico adequado, preferivelmente numa forma de dosagem unitária. A composição polipeptídica pode ser utilizada para neutralizar moléculas de anticorpo que imunorreajam com o polipéptido do invento. Assim, moléculas de anticorpo presentes num mamífero que imunorreajam com moléculas do polipéptido do presente invento podem ser efectivamente removidas da circulação no mamífero, devido a complexação do péptido com o anticorpo.

Um aspecto preferido do invento acontece quando o anticorpo reconhece um polipéptido na composição polipeptídica que define um epítopo RIBS em fibrinogénio humano imunocomplexado com GPIIb-IIIa humano, tal como expresso em plaquetas. Uma concretização particularmente preferida do invento emprega um MAb 2G5 neutralizado por um polipéptido que inclui uma sequência de resíduos de aminoácido, listada anteriormente ou uma sua sequência substituída conservativamente.

Num outro aspecto do invento, um polipéptido do presente invento pode ser utilizado para gerar anticorpos que imunorreagem com o polipéptido por processos aqui descritos. 0 polipéptido pode ser usado para imunizar um animal quer por si só ou conjugado com outro grupo químico, por exemplo, uma molécula transportadora. Qualquer grupo transportador tolerado pelo hospedeiro é contemplado.

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-19C. Anticorpos Monoclonais

Um anticorpo monoclonal (MAb) do presente invento é caracterizado por compreender moléculas de anticorpo que imunorreagem com um local de ligação do receptor induzido do ligando. Um MAb do presente invento imunorreage com um RIBS, mas não imunorreage substancialmente com o ligando ou com o receptor não ligado (livre), isto é, quando o ligando ou o receptor estão livres em solução, permitindo, deste modo, a distinção entre as formas de ligando ligado e não ligado ao receptor. Um MAb do presente invento não imunorreage substancialmente” com outras espécies, tal como é aqui descrito, quando a imunorreacção do anticorpo monoclonal com o complexo ligando-receptor é inibida por não mais que 15 percento, e preferencialmente menos, tal como por ligação competitiva com ligando livre ou receptor não ligado.

Numa concretização preferida, um determinado MAb compreende moléculas de anticorpo que imunorreagem com um RIBS expresso por um complexo citoadesina-ligando. citoadesina é um nome dado a uma superfamília de moléculas de receptor, que se ligam todas a um ligando que contém a sequência de resíduos de aminoácido arginina-glicina-ácido aspártico ou RGD. (Plow et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 83:6002 (1986)). A esta superfamília também foi dado o nome de Integrina. (Ruoslahti et al., Science, 238:491-497 (1987)). A citoadesina particular com interesse para o exemplo aqui dado é a GPIIb-IIIa, também conhecida como um receptor de fibrinogénio das plaquetas.

Um anticorpo monoclonal preferido deste invento é segregado (produzido) por um dos seguintes hibridomas : hibridoma 2G5 possuindo a designação ATCC HB9847, hibridoma 2F10 possuindo a designação ATCC HB9844, hibridoma 3G11 possuindo a designação ATCC HB9845 e hibridoma 4G10 possuindo a designação ATCC HB9846. Os hibridomas anteriores foram depositados na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA em 29 de Setembro de 1988 de acordo com o Tratado de Budapeste.

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D. Processos para a Produção de Composições

presente invento contempla um processo de formação de um anticorpo monoclonal que imunorreage com um local de ligação induzido pelo receptor. O processo compreende os passos de:

(a) Imunização de um animal com um complexo receptor-ligando. Isto é tipicamente conseguido pela administração de uma quantidade imunologicamente eficaz, isto é, uma quantidade suficiente para produzir uma resposta imunitária, de imunogénio a um mamífero competente imunologicamente. Preferencialmente, o mamífero é um roedor, tal como um coelho, ratazana ou ratinho, apesar de outros mamíferos tal como cabras, cavalos e símios poderem ser usados. 0 mamífero é depois mantido durante um período de tempo suficiente para o mamífero produzir células secretoras de moléculas de anticorpo que imunorreagem com o complexo receptor-ligando.

(b) Uma suspensão de células secretoras de anticorpo, removidas do mamífero imunizado, é depois preparada. Isto é tipicamente efectuado através da remoção do baço do mamífero e da separação mecânica das células individuais do baço, num meio fisiologicamente tolerável, utilizando os métodos bem conhecidos na arte.

(c) As células produtoras de anticorpo em suspensão são tratadas com um agente transformador capaz de produzir uma linha celular transformada (imortalizada”). Agentes transformadores e o seu uso para produzir linhas celulares imortalizadas são bem conhecidos na área e incluem vírus de ADN, tal como o vírus de Epstein bar (EBV), o vírus 40 de símio (SV40), o vírus de polioma e outros semelhantes, vírus de ARN, tal como o vírus da leucemia murina de Moloney (MoMuLV), o vírus do sarcoma de Rous e outros semelhantes, células de mieloma, tal como P3X63-Ag8.653, Sp2/O-Agl4 e outras semelhantes.

Em concretizações preferidas, o tratamento com o agente transformador resulta na produção de um hibridoma, através da

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fusão das células do baço suspensas com células de mieloma de ratinho de uma linha celular adequada pela utilização de um promotor de fusão adequado. A razão preferida é cerca de 5 células do baço por célula de mieloma, numa suspensão contendo cerca de 10⁸ esplenócitos. Um promotor de fusão preferido é o polietilenoglicol, possuindo uma massa molecular média de cerca de 1000 a cerca de 4000 (disponível comercialmente como PEG 1000); no entanto, podem ser empregues outros promotores conhecidos na arte.

A linha celular utilizada deve ser preferencialmente do tipo denominado resistente a drogas, de modo a que as células do mieloma não fundidas não sobrevivam num meio selectivo, ao passo que os híbridos sobreviverão. A classe mais comum são as linhas celulares resistentes a 8-azaguanina, que não possuem o enzima hipoxantina-guanina-fosfo-ribosilo-transferase e portanto não proliferam em meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina). É também geralmente preferido que a linha celular de mieloma utilizada seja do tipo denominado não secretor, o qual não produz por si só qualquer anticorpo, apesar de poderem ser utilizados tipos secretores. Em certos casos, no entanto, linhas de mieloma secretoras podem ser preferidas.

(d) As células transformadas são depois clonadas, preferencialmente à monoclonalidade. A clonagem é preferencialmente efectuada num meio de cultura de tecidos que não suporte células não-transformadas. Quando as células transformadas são hibridomas, isto é tipicamente efectuado por diluição e cultura em recipientes separados da mistura de células de baço não fundidas, células de mieloma não fundidas e células fundidas (hibridomas), num meio selectivo que não suporta as células de mieloma não fundidas, durante um período de tempo suficiente para permitir a morte de células não fundidas (cerca de uma semana). A diluição e cultura é efectuada em recipientes separados, e a diluição pode ser uma diluição limitante, na qual o volume do diluente é estatisticamente calculado de modo a isolar um certo número de células (por exemplo, 1 - 4) em cada recipiente separado (por exemplo, cada

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(e) o meio de cultura de tecidos dos transformantes clonados é avaliado quanto à presença de moléculas de anticorpo segregadas que não imunorreagem com o ligando livre, mas que imunorreagem com o ligando quando este está presente como parte de um complexo receptor-ligando. A avaliação é efectuada utilizando as técnicas imunológicas bem conhecidas, tal como é aqui descrito.

(f) Uma vez identificado um transformante desejado no passo (e) , é seleccionado e desenvolvido num meio de cultura de tecidos adequado, durante um período de tempo adequado, seguido pela recuperação do anticorpo desejado a partir de sobrenadante da cultura. Um meio e um período de tempo de cultura adequados são também bem conhecidos na arte ou são facilmente determinados.

Para produzir uma concentração muito maior de anticorpo monoclonal ligeiramente menos puro, o hibridoma desejado pode ser injectado em ratinhos ou em outros mamíferos nos quais o hibridoma possa crescer, preferencialmente ratinhos singénicos ou semi-singénicos. O hibridoma provoca a formação de tumores produtores de anticorpo após um período de incubação adequado, que resulta numa concentração elevada do anticorpo desejado (cerca de 5 - 20 mg/ml) na corrente sanguínea e exudado peritoneal (líquido ascítico) do ratinho hospedeiro.

Meios e animais úteis para a preparação destas composições são ambos bem conhecidos na arte e estão disponíveis comercialmente, e incluem meios de cultura sintéticos, ratinhos consanguíneos e outros semelhantes. Um exemplo de meio sintético é o meio essencial minímo de Dulbecco (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8:396 (1959)), suplementado com 4,5 gm/1 de glucose, glutamina 20 mM e 20% de soro de vitelo fetal. Um exemplo de uma estirpe de ratinhos consanguíneos é a Balb/c.

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Um anticorpo monoclonal produzido pelo processo anterior pode ser utilizado, por exemplo, em modalidades de diagnóstico ou terapia, aqui posteriormente discutidas em maior detalhe, onde a formação de um produto de imunorreacção contendo RIBS é desejado. Tais utilizações incluem, por exemplo, métodos e sistemas de diagnóstico do presente invento para detectar plaquetas ligadas a fibrinogénio numa amostra corporal, por exemplo, para a detecção in vivo de um trombo, dispersão de um trombo ou visualização de trombo.

Um anticorpo monoclonal RIBS é utilizado tipicamente numa composição aquosa. Essa composição pode ser o meio de cultura de tecidos ou o fluido ascitico, tal como é obtido ou numa forma diluída. Estas composições são utilizadas tipicamente in vitro.

Para utilização in vivo, o anticorpo monoclonal RIBS é tipicamente purificado através de precipitação com sulfato de amónia, procedimento de purificação por afinidade e outros semelhantes e depois utilizado numa composição aquosa de um diluente farmaceuticamente aceitável. A concentração de anticorpos monoclonais RIBS, nessa composição aquosa, é ajustada de modo a ser adequada ao uso desejado.

E. Composições e Métodos Terapêuticos

Anticorpos monoclonais segregados por qualquer um dos hibridomas depositados, acima descritos, e anticorpos possuindo imunoespecificidade semelhante são particularmente úteis em áreas relacionadas a coágulos e trombos sanguíneos. Isto acontece porque esses tipos de anticorpo monoclonal anti-RIBS imunorreagem com o complexo receptor GPIIb-IIIa-fibrinogénio, que está presente nas plaquetas activadas contendo fibrinogénio ligado, e o fibrinogénio ligado a plaquetas está envolvido na formação de trombos. Adicionalmente, como por definição, aqueles anticorpos monoclonais RIBS não imunorreagem com o fibrinogénio solúvel, tal como está presente in vivo no sangue em circulação, uma especificidade extrema de imunorreacção pode ser conseguida através do uso de um ou mais destes anticorpos monoclonais. Seguem-se descrições de alguns usos preferidos de uma composição

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SCR 0725P/SC 163.2 POR —24— de anticorpo do presente invento.

1. Dispersão de Trombo

Um aspecto deste invento consiste num processo para a dispersão de um trombo. Aqui, as moléculas de anticorpo, de um anticorpo monoclonal produzido pelo menos por um dos hibridomas 2G5, 2F10, 3G11 e 4G10 depositados na ATCC, é ligada quimicamente a um enzima activador de plasminogénio, de modo a formar um conjugado, no qual a ligação da porção de anticorpo do conjugado ao seu RIBS é substancialmente não impedida e a actividade activadora de plasminogénio do enzima está substancialmente não impedida. Métodos de preparação de um conjugado anticorpo-proteína, no qual as actividades de ambas as porções do conjugado estão substancialmente não impedidas, são bem conhecidas dos peritos.

Um enzima activador de plasminogénio refere-se ao grupo de drogas fibrinolíticas na classe de protrombólise, tal como activadores de plasminogénio tissular, que induz a trombólise sem fibrinólise sistémica ou quebra do fibrinogénio. Outras drogas fibrinolíticas contempladas são aquelas que interagem com o plasminogénio proactivador e incluem, mas não estão limitadas a estreptoquinase, uroquinase (u-PA) e activador de plasminogénio tissular (t-PA).

De acordo com este processo, uma composição aquosa farmaceuticamente aceitável contendo uma quantidade dispersora de trombo de um conjugado anteriormente descrito é administrada, por exemplo, por injecção intravenosa ou infusão, a um mamífero, tal como um humano contendo um trombo a ser disperso. 0 mamífero assim tratado é mantido durante um período de tempo suficiente para a porção de anticorpo do conjugado imunorreagir com o complexo fibrinogénio ligado a plaquetas, presente no trombo, e para a porção de enzima activador de plasminogénio do conjugado activar o plasminogénio. Como a remoção do conjugado seria uma tarefa difícil e demorada, o mamífero tratado é mantido por um período de tempo suficiente para o seu própio corpo eliminar o conjugado pelos meios normais.

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2.

Inibição da Formação de Trombo

É contemplado um outro processo de tratamento para animais com risco de formação de trombo, tal como pessoas nos primeiros dias a seguir a uma grande operação, por exemplo, uma operação coronária de derivação coronária.

Aqui, uma quantidade de um anticorpo monoclonal inibidora de trombo, contendo moléculas de anticorpo produzidas pelo menos por um dos hibridomas 2G5, 2F10, 3G11 e 4G10 depositados na ATCC, presentes numa composição aquosa farmaceuticamente aceitável, é administrada a um mamífero, tal como um humano no qual a formação do trombo deve ser inibida. 0 mamífero tratado (mamífero a que se fez a administração) é mantido durante um período de tempo suficiente para os anticorpos monoclonais RIBS administrados serem eliminados do seu corpo pelos meios usuais.

Neste processo, a imunorreacção dos anticorpos monoclonais RIBS com plaquetas activadas contendo fibrinogénio ligado inibe a formação do trombo. Evidentemente, como um anticorpo monoclonal RIBS imunorreage com o complexo fibrinogénio-GPIIb-IIIa na plaqueta, e não com o fibrinogénio no sangue, o funcionamento normal do animal tratado não é alterado.

Numa concretização relacionada, é contemplado um processo de inibição da agregação de plaquetas é contemplado, o qual compreende a administração, a uma solução contendo plaquetas, de uma composição aquosa farmaceuticamente aceitável contendo moléculas de anticorpo monoclonal produzidas pelo menos por um dos hibridomas 2G5, 2F10, 3G11 e 4G10 depositados na ATCC. Uma quantidade de anticorpo inibidora de agregação de plaquetas é administrada in vivo a um animal paciente, no qual a inibição da agregação das plaquetas é desejável, ou é misturada in vitro com uma solução contendo plaquetas, tal como plasma ou sangue. A imunorreacção dos anticorpos monoclonais RIBS com o complexo fibrinogénio-GPIIb-IIIa nas plaquetas forma um produto de imunorreacção que inibe a agregação das plaquetas.

Um único anticorpo monoclonal RIBS, acima descrito, pode

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-26ser utilizado em cada um dos processos anteriores, ou uma mistura contendo mais que um pode ser utilizada. Assim, apesar de cada um dos anticorpos monoclonais produzidos pelos quatro hibridomas depositados na ATCC compartilharem a propriedade de serem um monoclonal RIBS, cada local de combição do anticorpo não imunorreage com o mesmo epítopo. Assim, é obtida vantagem através da utilização de uma mistura daqueles anticorpos monoclonais (sozinhos ou no conjugado), de modo que a ligação múltipla dos locais de combinação a uma única molécula de fibrinogénio ligada pode ocorrer.

Deve ser compreendido que apesar dos dois processos anteriores terem sido descritos em termos de anticorpos monoclonais RIBS que imunorreagem especificamente com o complexo fibrinogénio-GPIIb-IIIa, processos semelhantes são aplicáveis para outros complexos ligando-receptor que contêm RIBS.

A preparação de uma composição aquosa farmaceuticamente aceitável que contenha moléculas de anticorpo como ingredientes activos é bem compreendida na arte. Tipicamente, tais composições são preparadas como injectáveis, em soluções ou suspensões líquidas, no entanto, formas sólidas adequadas para solução ou suspensão num líquido aquoso antes da injecção podem também ser preparadas. A preparação pode também ser emulsionada.

O conjugado ou o anticorpo monoclonal sozinho é frequentemente misturado com um excipiente que é farmaceuticamente aceitável e compatível com o conjugado ou com o anticorpo monoclonal, tal como é bem conhecido. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou outros semelhantes e suas combinações. Adicionalmente, se desejado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares, tal como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tampão de pH, que aumentam a eficácia do ingrediente activo.

Um conjugado ou anticorpo monoclonal pode ser formulado nas

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aquosas anteriores como farmaceuticamente aceitáveis. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livre do enzima ou da molécula de anticorpo) que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfórico, ou com ácidos orgânicos tais como acético, tartárico, mandélico e outros semelhantes. Sais formados com os grupos carboxilo livres podem também ser derivados a partir de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, de potássio, de amónio, de cálcio ou férrico, e de bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaina e outras semelhantes.

As composições terapêuticas contendo moléculas de anticorpo são convencionalmente administradas intravenosamente, tal como por injecção de uma dose unitária, por exemplo. Uma composição é administrada numa maneira compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade terapeuticamente eficaz, isto é, numa de dispersão de trombo ou de inibição de trombo.

3. Neutralização de Anticorpo

Contemplam-se também processos terapêuticos para a neutralização” ou inibição de um anticorpo anti-RIBS que imunorreage com um polipéptido deste invento. Por esta razão, a concentração de um anticorpo presente num paciente a um nível inaceitavelmente elevado, como quando o anticorpo inibe excessivamente a agregação de plaquetas, pode ser eficazmente reduzida por administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido anteriormente descrito. Tipicamente, o polipéptido é administrado como uma composição farmaceuticamente estéril e numa forma de dosagem unitária tal como aqui descrita.

4. Regimes de Administração

Dose unitária, quando se refere ao inoculo do presente invento, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para animais, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material activo calculada para

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produzir o efeito imunogénico desejado em associação com o diluente requerido; isto é, transportador ou veículo. As «t especificações para a nova dose unitária deste invento são ditadas por e directamente dependentes de (a) características únicas do material activo e efeito imunológico particular a ser alcançado e (b) limitações inerentes à arte de composição de tal material activo para uso imunológico em animais, tal como aqui divulgado em detalhe, sendo estas características do presente invento.

Formas de dosagem unitária são tipicamente preparadas a partir de anticorpos, congelados ou secos, através da dispersão num diluente ou veículo fisiologicamente tolerável (aceitável) tal como água, solução salina ou solução salina tamponada com fosfato, para formar uma composição aquosa. Tais diluentes são bem conhecidos na arte e são discutidos, por exemplo, em Remington^/s Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1980) nas páginas 1465-1467.

Formas de dosagem podem também incluir um adjuvante como parte do diluente. Adjuvantes, tal como o adjuvante completo de Freund (CFA), adjuvante incompleto de Freund (IFA) e alúmen são materiais bem conhecidos na arte e estão disponíveis comercialmente a partir de várias fontes.

A quantidade de composição de anticorpo a ser administrada depende, entre outros, da espécie animal a ser tratada, do tamanho do animal paciente, da dimensão do trombo (se conhecida), da quantidade presente de plaquetas ligadas a fibrinogénio, e da capacidade do paciente para utilizar o conjugado ou o anticorpo monoclonal. Quantidades precisas de conjugado ou anticorpo monoclonal requeridas para serem administradas dependem do critério do profissional e são peculiares para cada indivíduo, particularmente quando os seres humanos são os animais tratados. Gamas de dosagem, no entanto, podem ser caracterizadas por uma concentração sanguínea terapeuticamente eficaz e podem variar a partir de uma concentração de conjugado contendo anticorpo, ou anticorpo

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sozinho, do presente invento de cerca de 0,01 μΜ a cerca de 100 μΜ, preferencialmente de cerca de 0,1 μΜ a cerca de 10 μΜ.

Regimes adequados para administração inicial e injecções de reforço são também variáveis, mas são exemplificadas por uma administração inicial seguida de doses repetidas a intervalos de uma ou mais horas, por uma injecção subsequente ou outra administração. Alternativamente, é contemplada a infusão intravenosa contínua suficiente para manter concentrações terapeuticamente eficazes no sangue.

F. Sistemas de Diagnóstico

Um sistema de diagnóstico, na forma de conjunto, do presente invento inclui, numa quantidade suficiente para pelo menos um ensaio, um anticorpo monoclonal RIBS do presente invento, tal como um produzido por um dos quatro hibridomas depositados na ATCC, como um reagente embalado separadamente. Uma marcação para indicar a presença de uma imunorreacção entre o RIBS e o anticorpo monoclonal RIBS é também preferencialmente incluida na mesma ou em embalagem separada. Instruções para a utilização do reagente embalado são também tipicamente incluídas.

Instruções para a utilização, incluem tipicamente uma expressão clara da descrição do reagente ou pelo menos um parâmetro do método de ensaio, tal como as quantidades relativas de reagente e amostra a ser misturadas, período de tempo de manutenção para as misturas reagente/amostra, temperatura, condições de tampão e outras semelhantes.

Uma concretização deste invento consiste num sistema de diagnóstico na forma de um conjunto para ensaiar as plaquetas ligadas a fibrinogénio numa amostra de fluido vascular contendo plaquetas, tal como o sangue ou o plasma. 0 sistema compreende uma embalagem contendo um anticorpo monoclonal, que imunorreage com um RIBS expresso pelo complexo receptor-ligando. Preferencialmente, as moléculas de anticorpo anti-RIBS do anticorpo monoclonal são aquelas produzidas por um dos seguintes

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SCR 0725P/SC 163.2 POR hibridomas: hibridoma 2G5, hibridoma 2F10, hibridoma 3G11 e hibridoma 4G10. Preferencialmente, as moléculas de anticorpo estão presentes como uma composição de anticorpo monoclonal a qual contém mais do que um anticorpo monoclonal particular. Preferíveis ainda são os conjuntos de reagentes onde as moléculas de anticorpo estão ligadas a um marcador de radionuclidos, preferencialmente um marcador Marcadores úteis são aqui discutidas posteriormente.

Noutra concretização, um sistema de diagnóstico do presente invento é adequado para ensaiar a presença de um trombo in vivo. 0 sistema compreende uma embalagem contendo moléculas de anticorpo monoclonal que imunorreagem com um RIBS expresso por um complexo receptor-ligando. Preferencialmente, as moléculas de anticorpo presentes são aquelas segregadas por um hibridoma seleccionado de entre o grupo consistindo em 2G5, 2F10, 3G11 e 4G10. As moléculas de anticorpo são preferencialmente ligadas a um marcador in vivo ou meios indicadores.

Apesar de um conjunto para visualização in vivo poder muitas vezes ser utilizado para ensaios in vitro. deve ser compreendido que o oposto não é verdade. Por exemplo, os anticorpos monoclonais utilizados para o trabalho in vivo devem estar isentos de pirogénios, assim como quaisquer sais tampão das composições aquosas e reagentes. A isenção de pirogénios não é uma necessidade para os ensaios in vitro. Adicionalmente, os meios indicadores úteis para visualização in vivo são tipicamente diferentes daqueles utilizados in vitro, tal como é aqui posteriormente discutido. Assim, o sistema de ensaio é adequado para visualização in vivo e sais tampão, soluções aquosas e meios indicadores adequados podem ser fornecidos como parte do conjunto na mesma ou em embalagens separadas.

Em concretizações preferidas, um sistema de diagnóstico do presente invento inclui ainda um marcador ou meio indicador capaz de sinalizar a formação de um complexo de imunorreacção contendo uma molécula de anticorpo do presente invento.

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Tal como é aqui utilizado, os termos marcador e meio indicador, nas suas várias formas gramaticais, referem-se a átomos únicos e moléculas que estão envolvidos directa ou indirectamente na produção de um sinal detectável para indicar a presença de um complexo. Marcadores ou meios indicadores in vivo são aqueles úteis no corpo de um paciente humano e incluem

¹⁸⁶Re e ¹³²I.

Qualquer marcador ou meio indicador pode ser ligado a, ou incorporado numa molécula de anticorpo que é parte de um conjugado ou composição de anticorpo monoclonal do presente invento, e esses átomos ou moléculas podem ser utilizadas sozinhos ou em conjugação com reagentes adicionais. Tais marcações são por si só bem conhecidas na química de diagnóstico clínico e constituem uma parte deste invento na medida em que são utilizados com proteínas, processos e/ou sistemas de outro modo novos.

A ligação dos marcadores, isto é, a marcação, aos anticorpos é bem conhecida na arte. Por exemplo, moléculas de anticorpo produzidas por um hibridoma podem ser marcadas por incorporação metabólica de aminoácidos contendo radio-isótopos fornecidos como uma componente do meio de cultura. Ver, por exemplo, Galfre et al., Meth. Enzvmol.. 73:3-46 (1981). As técnicas de conjugação de proteína ou acoplamento através de grupos funcionais activados são particularmente aplicáveis. Ver, por exemplo, Aurameas et al., Scand. J. Immunol.. Vol.8 Suppl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech. . 3:889-894 (1984) e Patente U.S. No. 4 493 795.

Os sistemas de diagnóstico in vitro podem também incluir, preferencialmente como uma embalagem em separado, um agente de ligação específico. Um agente de ligação específico é uma identidade molecular capaz de se ligar selectivamente a um anticorpo monoclonal do presente invento, mas não é por si só uma molécula de anticorpo do presente invento. Como exemplo, agentes de ligação específicos são moléculas de anticorpo secundárias, proteínas do complemento ou seus fragmentos,

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proteína A de S.aureus e outras semelhantes. 0 agente de ligação específico liga-se à molécula de anticorpo monoclonal RIBS, deste invento, quando esse anticorpo monoclonal está presente como parte de um imunocomplexo com o complexo ligando-receptor. Em concretizações preferidas, o agente de ligação específico é marcado. No entanto, quando o sistema de diagnóstico inclui um agente de ligação específico que não é marcado, o agente de ligação específico é tipicamente utilizado como um meio ou reagente de amplificação e um segundo reagente que é marcado liga-se ao agente de ligação específico (meio amplificador). Nestas concretizações, o segundo reagente marcado é capaz de se ligar especificamente ao meio amplificador, quando o meio amplificador está ligado a um imunocomplexo contendo um anticorpo monoclonal RIBS.

Um conjunto de diagnóstico do presente invento pode ser utilizado num formato ELISA para detectar a presença ou quantidade de complexo ligando-receptor, tal como plaquetas ligadas a fibrinogénio, numa amostra de fluido corporal tal como soro, plasma ou urina. ELISA refere-se a um ensaio de imunossorção de enzima ligado que emprega um anticorpo ou antigéneo ligado (aqui, o complexo receptor-ligando contendo RIBS) a uma matriz de fase sólida que forma um suporte sólido e um conjungado enzima-antigénio ou enzima-anticorpo para detectar e quantificar a quantidade de um antigénio ou anticorpo presente numa amostra. Uma descrição da técnica de ELISA é encontrada no capítulo 22 da 4^a edição de Basic and Clinicai Immunoloqy por

D.P. Sites et al., publicado por Lange Medicai Publications of Los Altos, CA em 1982 e nas Patentes U.S. No. 3 654 090: No. 3 850 752 e No. 4 016 043, as quais são aqui incorporadas para referência.

Numa concretização preferida de um conjunto de ELISA, uma molécula de anticorpo do presente invento é afixada a uma matriz sólida para formar o suporte sólido que é embalado separadamente nos sistemas de diagnóstico. Os anticorpos são tipicamente afixados à matriz sólida por adsorção a partir de um meio aquoso, apesar de poderem ser usados outros modos de afixação,

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SCR 0725P/SC 163.2 POR bem conhecidos dos peritos da arte.

Um agente de ligação específico marcado, que se liga a um complexo ligando-receptor ou a um dos seus constituintes, ou um agente de ligação específico não marcado mais um segundo reagente marcado que se liga ao agente de ligação específico, são também incluídos em uma ou duas embalagens em separado, respectivamente, no conjunto. Utilizando um dos anticorpos monoclonais produzidos por um dos hibridomas depositados na ATCC como exemplo de um anticorpo ligado à matriz, anticorpos antifibrinogénio marcados, como estão disponíveis comercialmente, são exemplo do agente de ligação específico.

Matrizes sólidas úteis são bem conhecidas na arte. Tais materiais incluem o dextrano reticulado, disponível sob a marca SEPHADEX de Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ); agarose; esferas de poliestireno de cerca de 1 micron a cerca de 5 milímetros de diâmetro disponíveis em Abbott Laboratories de North Chicago, IL; poli(cloreto de vinilo), poliestireno, poliacrilamida reticulada, teias à base de nitrocelulose ou nylon, tais como folhas, faixas ou pás; ou tubos, placas ou alvéolos de uma placa de microtitulação tal como aquelas feitas de poliestereno ou poli(cloreto de vinilo).

Um anticorpo monoclonal (marcado ou não), agente de ligação específico marcado ou reagente amplificador de qualguer sistema de diagnóstico, aqui descrito, pode ser fornecido em solução, como uma dispersão liquida ou como um pó substancialmente seco, por exemplo, na forma liofilizada. Quando o meio indicador é um enzima, o substrato do enzima pode também ser fornecido numa embalagem em separado do sistema de conjunto. Uma matriz de suporte sólido tal como a placa de microtitulação anteriormente descrita e um ou mais tampões podem também ser incluídos como elementos separadamente embalados neste sistema de ensaio de diagnóstico.

As embalagens aqui discutidas em relação aos sistemas de diagnóstico são aquelas habitualmente utilizadas em sistemas de

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diagnóstico. Tais embalagens incluem garrafas e frascos de vidro e plástico (por exemplo, polietileno, polipropileno e policarbonato), envelopes de plástico ou revestidos a plástico e outros semelhantes.

G. Processos de Ensaio

O presente invento contempla um processo para detecção de um complexo receptor-ligando, como por exemplo é encontrado num trombo ou em plaquetas ligadas a fibrinogénio, preferencialmente GPIIb-IIIa:fibrinogénio. 0 método utiliza a expressão de um local de ligação induzido pelo receptor (RIBS) e uma molécula de anticorpo monoclonal que imunorreage com o RIBS na porção ligando do complexo receptor-ligando, mas que não reage com o receptor não-ligado ou com o ligando não-ligado. Os peritos na arte compreenderão que existem numerosos procedimentos de química de diagnóstico clínico bem conhecidos que podem ser utilizados para formar tais imunocomplexos. Assim, embora sejam aqui descritos processos de ensaio como exemplo, o invento não lhes está limitado.

1. Detecção de trombo

Mais especificamente, um processo para detecção da presença de um trombo num mamífero tal como um humano é contemplado. Uma composição aquosa, contendo uma quantidade eficaz, para visualização de, um anticorpo monoclonal do presente invento contendo moléculas de anticorpo ligadas a um meio indicador in vivo, é administrado intravenosamente a um mamífero tal como um humano com necessidade de tal tratamento.

mamífero, ao qual foi feita a administração, é mantido por um período de tempo pré-determinado suficiente para a molécula de anticorpo marcada imunorreagir com o complexo fibrinogénio ligado a plaquetas presente como parte de um trombo. 0 mamífero paciente é então ensaiado para a presença, e preferencialmente localização, de qualquer imunocomplexo marcado formado, e por esse meio detectando, e preferencialmente localizando, o trombo. Quando um anticorpo monoclonal RIBS marcado normalmente contém um radionuclido como marcador ou meio

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indicador, o ensaio é efectuado pelas usuais, bem conhecidas, técnicas de radiovisualização. Tais técnicas podem distinguir a concentração relativamente elevada de radiomarcador no trombo da quantidade relativamente baixa de radiomarcador sistémico. Quando radio-isótopos de período de vida relativamente longo são utilizados, o mamífero, ao qual se fez a administração, pode ser mantido por um período de tempo suficiente para substancial clearance sistémica do anticorpo monoclonal marcado, fornecendo desse modo uma quantidade ainda relativamente baixa de sinal de fundo da do radiomarcador.

2. Detecção de Plaquetas Ligadas a Fibrinogénio numa Amostra Corporal

Podem ser empregues vários protocolos de ensaio heterogéneo e homogéneo, competitivos ou não-competitivos, para a detecção da presença e preferencialmente da quantidade de plaquetas ligadas a fibrinogénio numa amostra corporal contendo plaquetas e/ou contendo fibrinogénio livre, preferencialmente uma amostra de fluído corporal tal como o sangue ou uma porção de sangue contendo plaquetas. Por exemplo, mistura-se uma amostra de sangue conservada com heparina (não-coagulado) e uma forma marcada de das moléculas de anticorpo RIBS depositadas anteriormente discutidas. Evidentemente, utilizam-se quantidades e concentrações de amostra sanguínea e anticorpo monoclonal marcado para que um resultado significativo possa ser obtido. A mistura de imunorreacção assim formada é mantida sob condições de ensaio biológico por um período de tempo suficiente para que as plaquetas ligadas a fibrinogénio, presentes na amostra, imunorreajam com os anticorpos marcados e formem um produto de imunorreacção marcado. 0 produto de imunorreacção marcado, quando presente, é então separado de qualquer anticorpo marcado que não tenha reagido e que possa estar presente. Em ensaios homogéneos, a separação é tipicamente por centrifugação suficiente para depositar todas as plaquetas presentes na amostra. Em ensaios heterogéneos tal como uma ELISA, o produto de imunorreacção é ligado ao suporte sólido e a separação é tipicamente efectuada por um passo de lavagem, no qual qualquer anticorpo RIBS não-ligado é descartado e o produto de

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-36imunorreacção ligado ao suporte sólido é retido.

Deve ser compreendido que quando um anticorpo monoclonal RIBS não-marcado é utilizado para imunorreagir com um complexo receptor-ligando contendo RIBS, uma segunda mistura é formada entre o imunocomplexo separado, anteriormente descrito, e um reagente de ligação marcado ou um reagente de ligação não-marcado utilizado como um meio amplificador. Essa mistura de reacção é mantida em condições biológicas por um período de tempo suficiente para se formar um segundo complexo de ligação entre o primeiro imunocomplexo formado e o reagente de ligação específico.

Quando o reagente de ligação específico compreende moléculas de anticorpo, esse segundo complexo de ligação é um segundo imunocomplexo. Quando a proteína A de S. aureus é utilizada, por exemplo, o segundo complexo de ligação não se baseia na ligação ao local de ligação do anticorpo, e esse complexo é melhor referido como um complexo de ligação. Como um imunocomplexo é um complexo de ligação específico, o complexo formado entre o reagente de ligação específico e o denominado primeiro imunocomplexo, é um segundo complexo de ligação. 0 segundo complexo de ligação é, seguidamente, separado de qualquer reagente de ligação específico que não tenha reagido e que possa estar presente, tal como por uma técnica previamente mencionada, e a presença do marcador e, por esse meio, a do imunocomplexo, é determinada e preferencialmente quantificada.

Quando o reagente de ligação específico não é marcado e é utilizado como um meio amplificador, uma terceira mistura é formada a partir do anterior segundo complexo de ligação separado, quando presente, e um segundo reagente de ligação contendo marcador. A presença de marcação no segundo complexo de ligação não é, evidentemente, determinada no processo anteriormente descrito onde nenhum reagente marcado foi misturado. Os passos de manutenção e separação, acima descritos, são repetidos para este aspecto do processo, sendo formado e retido um terceiro complexo de ligação contendo marcador. A

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presença e preferencialmente a quantidade de marcação é seguidamente determinada.

Assim, em cada um dos aspectos anteriormente descritos deste ensaio, a presença e preferencialmente a quantidade de marcador fornece a base para a determinação da presença e preferencialmente da quantidade de plaquetas ligadas a fibrinogénio.

É notado que o profissional efectuando um ensaio, anteriormente descrito, usualmente não sabe se um ou mais dos imunocomplexos ou complexos de ligação foram de facto formados até a quantidade de marcador presente ser determinada. De qualquer modo, todos os passos de um dado procedimento de ensaio são efectuados como se o complexo contendo RIBS estiver de facto presente.

Deve ser realçado que devido à especificidade única dos anticorpos monoclonais RIBS, o ensaio anteriormente descrito para plaquetas ligadas a fibrinogénio e o ensaio de vizualização anteriormente descrito para um trombo podem ser, e preferencialmente são, efectuados na presença das plaquetas livres e do fibrinogénio livre, isto é, plaquetas não-complexadas e fibrinogénio. Como um resultado, procedimentos de manuseamento especiais, tais como os passos de separação e lavagem, não necessitam de ser efectuados na amostra corporal antes do uso dessa amostra num ensaio. Esta característica é comum a todos os ensaios utilizando anticorpos monoclonais RIBS.

3. Deteccão de Anticorpo

É também contemplado um processo para detectar um anticorpo do presente invento, como numa amostra de sangue. Tal processo compreende os passos de:

(a) submeter uma solução aquosa que se suspeita conter o anticorpo a um polipéptido deste invento imobilizado numa superfície, por exemplo numa coluna de Sepharose;

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SCR 0725P/SC 163.2 POR (b) manter o anticorpo em contacto com o polipéptido imobilizado por um período de tempo suficiente e sob condições de reacção predeterminadas, de modo que um imunocomplexo anticorpo-polipéptido seja formado; e (c) determinar a presença do imunocomplexo formado, que está relacionada com a presença de anticorpo na solução testada. A detecção pode ser por radiomarcação do anticorpo, análise ELISA do anticorpo ligado, e outras semelhantes, tal como é bem conhecido.

Condições de ensaio biológico são aquelas que mantêm a actividade biológica das moléculas de anticorpo deste invento e as plaquetas ligadas a fibrinogénio ou outros complexos contendo RIBS, a ser ensaiados. Essas condições incluem uma gama de temperaturas de cerca de 4°C a cerca de 45°C, preferencialmente cerca de 37°C, uma gama de valores de pH de cerca de 5 a cerca de 9, preferencialmente cerca de 7 e uma força iónica variando desde a da água destilada até cerca de um molar de cloreto de sódio, preferencialmente a cerca daquela da solução salina fisiológica. Métodos para optimizar tais condições são bem conhecidos na arte.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos ilustram mas não limitam o âmbito do presente invento.

1. Produção de Hibridomas e de Anticorpos Monoclonais

Anticorpos monoclonais foram produzidos usando a tecnologia comum de hibridomas. Resumidamente, ratinhos Balb/c foram imunizados e posteriomente submetidos a reforço três vezes com cerca de 50 microgramas (^g) por ratinho de imunogénio dímero D de fibrina, preparado substancialmente como descrito em Cierniewski et al., Thromb. Haemostas., 48: 33-37 (1982).

Subsequentemente, 1,23 x 10⁸ células esplenocíticas de um ratinho imunizado, cujos anticorpos imunorreagem com o imunogénio, foram misturadas com 2,46 x 10⁷ células de mieloma

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SCR 0725P/SC 163.2 POR de ratinho P3Ag8653.1 na presença do promotor de fusão celular, polietilenoglicol 4000. As células produtoras de anticorpo assim transformadas foram transferidas para placas de microtitulação de 96 alvéolos a uma densidade de 3 xlO⁴ células por alvéolo e cultivadas.

Os sobrenadantes das culturas de tecidos de 235 alvéolos que aparentemente possuíam hibridomas viáveis após cerca de 14 dias de cultura foram analisadas por ensaio radio-imunológico no que respeita à presença de moléculas de anticorpo anti-RIBS. Resumidamente, 100 microlitros (μΐ) de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1 /ug/ml de fibrinogénio ou lipoproteína de baixa densidade (LDL) (controlo) foram misturados em alvéolos de placas de microtitulação de polivinilo de 96 alvéolos de fundo plano, como matriz de fase sólida. As placas foram depois mantidas durante cerca de 16-20 horas, a 4°C, de forma a permitir que o fibrinogénio ou a LDL adsorvessem à superfície dos alvéolos formando um suporte sólido. A solução de revestimento foi removida por agitação, os alvéolos foram lavados e ΙΟΟμΙ de solução de bloqueamento (PBS contendo 5% de soro normal de cabra) foram adicionados a cada alvéolo, de forma a bloquear os locais de ligação de proteínas em excesso.

Os alvéolos foram mantidos durante cerca de 30 minutos a 37°C e posteriormente a solução de bloqueamento foi removida. Em cada alvéolo foram depois misturados 100μ1 de (a) sobrenadante de cultura de tecidos de hibridoma diluida 1:10 em PBS ou (b) sobrenadante de hibridoma diluído 1:10 com PBS contendo 100^g/ml de fibrinogénio, como inibidor competitivo. As misturas de imunorreacção assim formadas foram mantidas à temperatura ambiente durante cerca de 16-20 horas a 4°C para permitir a formação de um produto de imunorreação ligado à fase sólida e uma fase líquida, que inclui qualquer molécula não-ligada de anticorpo monoclonal.

A cada alvéolo foram depois adicionados 100μ1 de IgG de cabra anti-ratinho, marcada com ¹²⁵I. A mistura imunorreacional marcada assim formada foi mantida cerca de 6-20 horas a 4°C de

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SCR 0725P/SC 163.2 POR forma a permitir a formação de um segundo produto de imunorreação marcado com ¹²⁵I em fase sólida. As fases sólida e liquida foram separadas para remover qualquer IgG de cabra anti-ratinho, marcado com ¹²⁵I. A quantidade de¹²⁵I ligado a cada alvéolo foi determinada por cintilação gama.

A presença de pelo menos cerca de 3 vezes a quantidade de ¹²⁵I ligada não específicamente como determinado a partir de alvéolos revestidos com LDL, em alvéolos revestidos com fibrinogénio, indica a presença de anticorpos anti-fibrinogénio no sobrenadante de cultura de tecidos. Uma redução do ¹²⁵i ligado á fase sólida de não mais de 15% pela presença do competidor fibrinogénio de fase liquida, na mistura de imunorreacção (parte (b) acima) indica a presença de anticorpos anti-RIBS no sobrenadante da cultura de tecidos.

procedimento de rastreio anterior, resultou na identificação de 4 hibridomas, designados por 2G5, 2F10, 3G11 e 4G10, que produzem anticorpos anti-RIBS que se ligam a um complexo fibrinogénio:GPIIb-IIIa. Os hibridomas possuem a seguinte identificação ATCC de depósito: 2G5 (HB9847), 2F10 (HB9844), 3G11 (HB9845) e 4G10 (HB9846).

Cada um dos quatro hibridomas acima descritos foram clonados duas vezes por diluição limitante e subsequentemente usados para produzir fluido ascítico. Os anticorpos foram depois isolados dos fluidos ascíticos através do uso de proteína A-Sepharose.

Composições contendo fragmentos Fab do anticorpo monoclonal (Mab) 2F10 foram preparadas por digestão do Mab 2F10 isolado por proteína A-Sepharose, com papaína (200:1 peso por peso de Mab para papaína) durante 6 horas a 37°C, seguindo os métodos de Mage et al., Methods in Enzvmologv, 70:142-50 (1980). O anticorpo não digerido e os fragmentos Fc foram removidos por cromatografia em proteína A-Sepharose. Os fragmentos Fab resultantes foram recolhidos da Sepharose formando a preparação de Fab de 2F10.

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2. Detecção de um RIBS Fibrinogénio:GPIIb-IIIa em Plaquetas Activadas.

Anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas 2G5, 2F10 e 3G11 , isto é Mab 2G5, Mab 2F10 e Mab 3G11, respectivamente, foram examinados no que respeita à sua capacidade para imunorreagir com RIBS ligado à superfície celular. Cada um dos quatro monoclonais foi marcado com ¹²⁵I usando uma metodologia comum de Cloramina-T. Greenwood et al. Biol. chem. J., 89:114-123 (1963).

Sessenta mililitros (ml) de sangue completo humano, foram recolhidos em 5 ml de ACD ( ácido cítrico 0,065 M, citrato de sódio 0,085 M, 2% de dextrose) contendo hirudina (Sigma, Chemical Co., St. Louis, MO) a uma concentração de fórmula de 0,06 unidades por ml (U/ml) e centrifugadas durante 15 minutos a 120 x g. 0 sobrenadante resultante, designado plasma enriquecido em plaquetas, foi recuperado, isolado e posteriormente centrifugado durante 15 minutos a 1200 x g, formando um sedimento de plaquetas isoladas.

As plaquetas isoladas foram ressuspensas em 2 ml de tampão de Tyrode (sem cálcio) (NaCl 0,13 M, KCI 0,0026 M, MgCl₂“6 H₂0 0,002M, Hepes 5 mM, NaHCO₃ 0,012 M, pH 7,2) contendo 1 mg/ml de albumina do soro de bovino (BSA) e 1 mg/ml de dextrose. A suspensão de plaquetas foi posteriormente aplicada a uma coluna de Sepharose CL2B (40 ml de volume total de leito; Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) equilibrada com o mesmo tampão de Tyrode. As plaquetas lavadas foram recuperadas a patir do volume de vazio da coluna CL2B num volume final de cerca de 4 a 5 ml.

Amostras de plaquetas lavadas foram depois estimuladas (activadas) por mistura com adenosina-difosfato (ADP) a uma concentração de 10 micromolar (μΜ) ou com trombina a uma concentração de 0,1 unidades por ml. Algumas amostras de plaquetas estimuladas pelo ADP foram também misturadas com fibrinogénio a uma concentração de fibrinogénio de 1 mM.

A cada amostra de plaquetas, incluindo algumas amostras não

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SCR 0725P/SC 163.2 POR estimuladas de controlo, uma concentração de imunorreacção assim formada foi mantida durante 30 minutos a 22 °C para permitir a formação do produto de imunorreacção. Os produtos de imunorreacção foram separados do ¹²⁵I-Mab não ligado por centrifugação através de 0,3 ml de 20% de sacarose. A quantidade de ¹²⁵I-Mab associada ao sedimento de plaquetas foi determinada por espectrometria de cintilação.

Os resultados deste estudo, exibidos na Tabela 2, abaixo, indicam que os anticorpos monoclonais anti-RIBS não imunorreagem substancialmente com paquetas não estimuladas. Contudo, quando as plaquetas são estimuladas com um agonista como o ADP ou a trombina, é obtida uma imunorreação significativa dos Mabs com o complexo fibrinogénio:GPIIb-IIIa nas células. A estimulação das plaquetas com ADP ou trombina resulta na secreção e ligação à superfície pelo GPIIb-IIIa do fibrinogénio endógeno das plaquetas. A adição de fibrinogénio exógeno não neutralizou (inibiu) a ligação de ¹²⁵I-Mab às plaquetas estimuladas, indicando assim que os Mabs são específicos para os RIBS, isto é, não imunorreagem com fibrinogénio livre em solução. Resultados semelhantes são obtidos com o Mab 4G10.

Plaquetas	TABELA 2 ^•2^I-MAb Licrados (com/Dlacrueta)
2G5	2F10	3G11
Não estimuladas	1.200	2.800	1.300
Estimuladas por ADP	33.750	43.600	31.550
Estimuladas por
ADP + fibrinogénio	35.600	51.300	30.150
Estimuladas pela trombina	28.620	32.000	28.400

De forma a realçar o facto de que o fibrinogénio adicionado exogenamente não está associado a células (isto é, não é parte do complexo receptor-ligando) mas, contudo não neutraliza a

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SCR 0725P/SC 163.2 POR imunorreactividade dos Mabs 2G5, 2F10, 3G11 e 4G10 com o complexo fibrinogénio:GPIIb-IIIa, a imunorreactividade dos Mabs com as plaquetas foi examinada usando plasma enriquecido em plaquetas, contendo 2-3 mg/ml de fibrinogénio.

Tal como mostrado na Tabela 3 abaixo, apesar do elevado excesso de fibrinogénio livre, cada um dos quatro ¹²⁵I-Mabs imunorreagiram com fibrinogénio:GPIIB-IIIA RIBS na superfície das plaguetas.

TABELA 3 ^{12 5}1-MAb Ligados (cpm/plagueta)

Plaquetas

2G5 2F10

3G11

4G10

Não estimuladas

Estimuladas por ADP

174 662

17.823 7.471

218 678

20.382 19.540

Ainda como indicação da especificidade dos quatro Mabs depositados para RIBS, estudos semelhantes de ligação com MAb foram conduzidos usando células contendo um receptor MAC-1, em vez das plaquetas contendo o receptor de glicoproteína de plaqueta GPIIb-IIIa. Ambos o Mac-1 e o GPIIb-IIIa ligam-se especificamente ao fibrinogénio segundo um processo tipo receptor-ligando, mas as duas interacções produzem resultados biológicos distintos. Nos estudos de ligação, os quatro RIBS depositados não exibem imunorreacção com o complexo fibrinogénio-Mac-1, mas imunorreagem com o fibrinogénio, num complexo fibrinogénio:GPIIb-IIIa. Por esta razão, os quatro Mabs testados imunorreagem especificamente com RIBS em fibrinogénio expresso no complexo com GPIIb:IIIa mas não com RIBS em fibrinogénio quando complexado com Mac-1.

3. Inibição da Agregação de Plaquetas por Anticorpos RIBS

Duzentos μΐ de plaquetas isoladas preparadas como descrito no Exemplo 2 foram misturadas com 190 μΐ de Tampão de Tyrode, contendo BSA e dextrose (cada a 1 mg/ml), fibrinogénio (1 mM),

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cálcio (5mM), e um fragmento Fab do Mab 2F10, preparado no Exemplo 2 e presente em quantidades variáveis como indicado na Tabela 4 abaixo indicada. Dez μΐ de ADP (80 μΜ em tampão de Tyrode) foram depois misturados para estimular a agregação das plaquetas. A mistura foi mantida a 37°C enquanto a variação na transmissão da luz da mistura era seguida ao longo do tempo usando Medidor de Agregação Para Duas Amostras (Modelo DP-247E, Sienco Inc., Morrison, CO).

O medidor de agregação foi calibrado usando uma solução contendo 200μ1 de PRP e 200μ1 de tampão de Tyrode para estabelecer uma baixa linha de base de transmissão de luz a 5 por cento para agregações de controlo e a 10 por cento para agregações na presença de anticorpo. O limite superior de 100% de transmissão de luz foi uniformemente estabelecido usando uma mistura de ΙΟΟμΙ de PRP e 300μ1 de tampão de Tyrode.

Os resultados obtidos quando medida a inibição da agregação de plaquetas pelo anticorpo estão referidos na Tabela 4, e são expressos como uma percentagem de transmissão de luz (100%) obtida na ausência de anticorpo quando medida cerca de 3 a 4 minutos após ADP ser misturado.

TABELA 4

Inibição da agregação de plaquetas pelo MAb 2F10

Concentração de Fab Percentagem de transmissão μΜ

0,25 μΜ

0,5 μΜ

1,25 μΜ

1,87 μΜ

100

62.5

34.5

17.5

0s resultados da Tabela 4 mostram que o fragmento do Mab

2F10 produziu uma inibição da agregação de plaquetas, dependente

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da dose. Assim, os resultados indicam as dosagens eficazes capazes de inibir a agregação de plaquetas e processos que envolvam a agregação de plaquetas, tais como formação de trombos, quando se usam anticorpos do presente invento que imunorreagem com um RIBS específico para o complexo fibrinogénio:GPIIb-IIIa.

4. Propriedades do Mab 2G5 anticorpo monoclonal, designado por 2G5, é uma igG da subclasse 1 com uma cadeia leve capa. A produção, purificação e caracterização do anticorpo purificado encontra-se descrita noutro lado (Zammarron et al., Thromb Haemost., 64: 41 (1990). O anticorpo purificado foi marcado com éster de biotina-N-hidroxissuccinimida (Calbiochem, La Jolla, CA) de acordo com processos comuns (Guesdon et al., J. Histochem Cvtochem.. 27:1131 (1979) e com¹²⁵I por um procedimento, modificado, com cloramina T (McConahey et al., Int. Arch. Allerqy Apl. Immunol.. 29: 181 (1966), a uma actividade específica de aproximadamente IpCl/yg. Os fragmentos Fab do anticorpo foram preparados através de digestão com papaína ((Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a uma razão enzima para substrato de 1:100 (2/2) durante 6 horas a 37°C (Porter, Biochem J. , 73:119 (1959). o anticorpo não digerido e os fragmentos Fc foram removidos por cromatografia em proteína A-Sepharose (Pharmacia, AB, Uppsala, Suécia). A completa digestão do anticorpo e a pureza da preparação de Fab foi confirmada por SDS-PAGE. Outros anticorpos monoclonais para fibrinogénio usados neste estudo resultaram de ratinhos imunizados com dímero D de fibrina e foram purificados dos fluidos ascíticos pelo mesmo protocolo usado para o 2G5.

fibrinogénio foi purificado a partir de sangue fresco humano por precipitação diferencial com etanol (Doolittle et al., Arch. Biochem. Biophys., 118: 456 (1967) e foi marcado radioactivamente com ¹²⁵I como descrito previamente (McConahey et al., Int. Arch. Allerqy Apl. Immunol.. 29: 181 (1966)). A digestão com plasmina do fibrinogénio foi efectuada de acordo com protocolos descritos (Veradi et al., Biochemistrv, 25: 519

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Λ ......

(4 ώ'' (1986)). Fibrinogénio (2 mg/ml) NaCl 0,15 M, Tris 0,05 M, pH

7,4, contendo Ca²⁺ 5 mM, foi primeiro digerido com plasmína, formada pela adição de plasminogénio (20/xg/ml, concentração final) e estreptoquinase (Sigma) (200 unidades/ml, concentração final), durante 1 hora a 37°C. As espécies predominantes desta digestão, D100 (fragmentos de massa molecular aproximadamente 100.000) foram isolados por cromatografia de afinidade numa coluna 2G5 (ver abaixo). Digestão adicional foi realizada por diálise da amostra em tampão Tris contendo EGTA 5 mM ((ácido etileno-bis-(oxietilenonitrilo))tetraacético) em vez de Ca²⁺ 5 mM, e incubação da mistura plasminogénio/estreptoquinase durante 4 horas a 37°C. Em experiências seleccionadas, o D100 isolado foi ainda digerido na ausência de Ca²⁺, com plasmina durante 24 horas a 37°C, suplementada com uma segunda adição de plasmina após 8 horas. A proteólise foi terminada pela adição de trasilol (FBA Pharmaceutical, New York, NY) (200 unidades inibidoras de calicreína/ml).

5. Estudos de Ligação a Plaquetas

Isolaram-se plaquetas a partir de sangue humano fresco por centrifugação diferencial, seguida de filtração por gel em Sepharose 2B em tampão de Tyrode sem iões divalentes, pH 7,3, contendo 0,1% de albumina de soro de bovino (Marguerie et al., J Biol Chem, 255: 154 (1980). A ligação do anticorpo às plaquetas foi realizada como a seguir se descreve. As plaquetas foram suspensas a lxl0^{5 * * 8}/ml em tampão de Tyrode sem iões divalentes. Adicionaram-se as plaquetas CaC^, a uma concentração final de 1 mM e o estímulo, ΙΟμΜ de ADP ou 0,5 unidades/ml de alfa-trombina. Quando a trombina foi usada como estímulo, foi adicionado D-fenilalanil-L-prolil-arginina-cetona 30 nM (Calbiochem) 5 minutos após a adição da trombina para inactivar o enzima. Adicionou-se depois anticorpo marcado com _{a uma} concentração final de 0,1 μΜ, e a ligação foi medida na ausência ou presença de fibrinogénio 1 μΜ. Em experiências paralelas foi medido o -*-²⁵I-fibrinogénio ligado às células, com o ligando a 0,3 μΜ como descrito (Marguerie et al., J Biol Chem, 255: 154 (1980)). Os ligandos ligados a plaquetas foram separados dos ligandos livres por centrifugação de alíquotas de 50 μΐ da

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mistura de reacção através de sacarose a 20%, e as moléculas do ligando ligado foram calculadas com base na sua actividade específica.

6. Estudos de Ligação a Plaquetas

Agitaram-se plaquetas (lxl0⁸/ml) a 37°C na presença de fibrinogénio humano (0,3μΜ) e CaCl₂ (1 mM) . Concentrações diferentes (de 0 a 2 μΜ) de 2G5, os seus fragmentos Fab ou uma subclasse de anticorpo de controlo, coincidente, foram depois adicionadas, e a agregação foi iniciada pela adição de ADP 10 μΜ. A agregação foi seguida como a variação na transmissão de luz através da suspensão de plaquetas usando um agregómetro de duas amostras (Sienco, Inc., Morrison CO).

7. Ensaio de Imunoabsorção de Enzima Ligado (ELISA)

Revestiram-se alvéolos de microtitulação de polivinilo com ΙΟΟμΙ de proteína a uma concentração de 2 μg/ml, durante a noite a 4°C. As placas foram pós-revestidas com PBS (NaCl 0,25 M, tampão fosfato 0,01M, pH 7,3) contendo 1% de albumina de soro bovino, depois lavadas com PBS-Tween 20 a 0,05% e incubadas durante duas horas com o anticorpo, na forma não-marcada ou na forma biotinilada. As placas foram então extensivamente lavadas com PBS-Tween 20 e incubadas com um segundo anticorpo ou avidina, conjugada com fosfatase alcalina (Calbiochem), durante uma hora. Após lavagem, a ligação foi quantificada utilizando o substrato p-nitrofenilfosfato e medindo a absorvância a 405 nm. Quando foram efectuadas experiências competitivas, o competidor foi incubado durante 15 minutos, a 22 °C com o anticorpo, antes da adição aos alvéolos das placas de microtitulação.

8. Síntese de Péptidos e Sequenciacão de Proteínas

Prepararam-se péptidos correspondendo em sequência a segmentos da cadeia gama de fibrinogénio por síntese em fase sólida num sintetizador de péptidos modelo 430, Applied Biosystems (Foster City, CA) usando resinas fenilacetamidometilo e a aminoácidos t-butoxicarbonilo, adquiridos à Applied Biosystems. Os péptidos foram analisados no que respeita a homogeneidade por HPLC, usando uma coluna C18 μ Bonapak com um

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SCR 0725P/SC 163.2 POR gradiente linear de acetonitrilo em 0,1% de ácido trifluoroacético e determinou-se serem mais que 85% homogéneos. As composições em aminoácidos dos péptidos foram determinadas em hidrolisados com 24 horas em HC1 6 N, e os resultados estavam consistentes com os rendimentos teóricos.

As sequências proteicas foram determinadas a partir das bandas seleccionadas por coloração com azul de Coomassie de SDS-PAGE. As bandas com interesse foram excisadas dos geles e sujeitas a sequenciação a partir da extremidade NH₂ directamente num sequenciador de fase gasosa (Applied Biosystems modelo 475A) como descrito (Matsudaira, J Biol Chem, 262:10035 (1987)). Os alinhamentos das sequências de aminoácidos das cadeias individuais de fibrinogénio humano, bovino e de ratazana foram obtidos de Rixon et al., Biochemistrv 22:3237 (1983); Chung et al-, Biochemistrv 22:3244 (1983); Chung et al., Biochemistry 22:3250 (1983); Crabtree et al., Cell 31:159 (1982) e base de dados GeneBank.

9. Procedimentos Analíticos

Realizou-se cromatografia de afinidade em 2G5 por acoplamento do anticorpo purificado a Sepharose 4B activada com CnBr (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante. 0 grau de substituição foi 1 mg de anticorpo ligado por ml de gel sedimentado. A cromatografia de afinidade foi realizada numa coluna com 1,1 x 4,5 cm equilibrada com PBS-azida a 0,04% a 22°C. A amostra foi aplicada à coluna, e o material ligado foi eluido com hidróxido de amónio 1 M (pH 11,5). Realizou-se SDS-PAGE em geles planos, verticais no sistema tampão Laemmli (Laemmli, Nature, 227: 280 (1970)). Para as análises de imunotransferência de Western, as amostras proteicas foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidas electroforeticamente para membranas Immobilon PVDF (Millipore, Bedford, MA). Os transferidos foram sondados com o anticorpo na forma biotinilada (5 /xg/ml), e as reacções foram visualizadas com fosfatase alcalina conjugada com avidina (Calbiochem) e os substratos enzimáticos fosfato de bromocloro-indolilo e nitro azul de tetrazólio (Sigma). A análise dos pontos transferidos foi

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realizada pela aplicação de uma gota da solução de proteína directamente na membrana Immobilon. A reactividade do anticorpo com a proteína absorvida foi visualizada como descrita (Zamarron et al., Thromb Haemost, 64:41 (1990).

10. Discussão dos Exemplos 1-9.

Expressão de RIBS por Fibrinogénio Ligado a Plaquetas Reconhecido pelo 2G5

Num estudo prévio (Zamarron et al., Thromb Haemost, 64:41 (1990) mostrou-se que o anticorpo monoclonal 2G5 reagiu com fibrinogénio imobilizado em placas de microtitulação de plástico ou em papel de filtro, mas 2G5 não reagiu com fibrinogénio solúvel. A questão posta inicialmente no presente estudo foi se a ligação do fibrinogénio a GPIIb-IIIa, seu receptor na superfície das plaquetas também se encontrava exposto ao epítopo reconhecido; isto é, se a ocupação do receptor induzia alterações conformacionais no ligando fibrinogénio para originar um epítopo RIBS.

A Figura 1 mostra a ligação do anticorpo radiomarcado a plaquetas humanas lavadas em condições resultantes numa ocupação variável de GPIIb-IIIa com o fibrinogénio. O fibrinogénio liga-se minimamente a plaquetas não-estimuladas, e o anticorpo também não se liga às células na presença ou ausência de fibrinogénio adicionado exogenamente. A estimulação pelo ADP das plaquetas converte o GPIIb-IIIa de um estado latente a outro o qual é capaz de ligar fibrinogénio. A estimulação de plaquetas na ausência de fibrinogénio produz apenas um ligeiro aumento na ligação do anticorpo.

Contudo, quando o fibrinogénio estava presente, extensa ligação de anticorpo a células estimuladas pelo ADP foi observada. 0 incremento na ligação de anticorpo a plaquetas estimuladas pelo ADP na presença de fibrinogénio foi aproximadamente de 17 vezes. Nestas mesmas condições experimentais utilizando plaquetas de 3 dadores diferentes, este incremento foi de 17,2 ± 2,4 vezes. Considerando que apenas 0,1% do fibrinogénio adicionado está ligado a plaquetas na mistura, a

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-50ligação do anticorpo ao fibrinogénio

altamente selectivo. 0 reconhecimento de fibrinogénio ligado a plaquetas também ocorre quando as células foram estimuladas com diferentes agonistas (trombina). As plaquetas estimuladas pela trombina também ligam anticorpo na presença de fibrinogénio adicionado exogenamente. Observou-se ligação modesta do anticorpo a plaquetas estimuladas por trombina mesmo na ausência de fibrinogénio adicionado e podem reflectir a ligação do anticorpo a fibrinogénio endógeno o qual é segregado e fica ligado a GPIIb-IIIa na superfície celular (Courtois et al., Eur J Biochem. 159: 61 (1986)). Em conjunto, estas observações indicam que a ligação do fibrinogénio a GPIIb-IIIa em plaquetas expõe o epítopo reconhecido por 2G5.

Efeito do 2G5 na Agregação de Plaquetas

A ligação de fibrinogénio ao seu receptor das plaquetas é um passo necessário para a agregação de plaquetas. Em estudos iniciais o efeito de 2G5 intacto nesta interacção célula-célula foi analisado usando plaquetas lavadas estimuladas com ADP na presença de fibrinogénio adicionado. Tal como indicado na Tabela 5, abaixo, a uma concentração final de 1 μΜ, o 2G5 eliminava completamente a agregação de plaquetas. Três outros anticorpos para fibrinogénio foram testados como controlos. Dois destes anticorpos, anti-Fg-88 e anti-Fg-85, não tinham efeito na agregação de plaquetas. O terceiro anticorpo de controlo anti-Fg-128 também anulava a agregação de plaquetas. A base para a actividade inibidora do anti-Fg-128 pode ser atribuída à sua inibição da ligação do fibrinogénio a plaquetas, isto é, a uma concentração de 0,6 μΜ, o anti-Fg-128 bloqueia a ligação de 125i_fIbrinogénio.

(segue TABELA 5) / /

73 666		β* //
		( ' -
SCR 0725P/SC 163.2 POR		/ ·' .L . .··
	-51-
	TABELA 5

Efeito de Anticorpos de Fibrinogénio na Agregação de Plaquetas e na Ligação de Fibrinogénio a Plaquetas

Anticorpo	Concentração (UM)	% de Inibição de agregação de plaquetas	% de Inibição da Ligação de Fibrinogénio a Plaquetas
2G5	1	100	0
Anti-Fg-128	0,6	100	81
Anti-Fg-88	1	0	ND
Anti-Fg-85	1	0	ND

ND = não determinado

O efeito do 2G5 na agregação de plaquetas foi ainda explorado. Fragmentos Fab do anticorpo retinham a capacidade de inibir a agregação de plaquetas. A actividade inibidora dos fragmentos Fab era dependente da dose e a inibição completa desta resposta funcional foi obtida a uma concentração de fragmentos de 2 μΜ. Os fragmentos Fab não interferiam com a estimulação das plaquetas como indicado pela ocorrência de alteração de forma das plaquetas apesar da anulação da subsequente resposta de agregação.

Localização do Epitopo do 2G5

Mostrou-se que o epitopo do 2G5 é expresso pela cadeia gama de fibrinogénio e pelo produto de degradação de plasmina, de elevada massa molecular (Mr = 100.000), D100 (Zamarron et al., Thromb Haemost, 64:41 (1990)). Assim, o epitopo reside no segmento da cadeia gama do domínio D do fibrinogénio. Mostrou-se que o D100 existe em duas formas DIA e Dl diferindo apenas nos resíduos amino terminais dos segmentos das suas cadeias gama. Os dois fragmentos D100 contêm o terminal carboxilo da cadeia gama (resíduo 411), mas DIA começa em gama 65 enquanto que Dl começa em gama 85 (Veradi et al., Biochemistrv. 25:519 (1986)).

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-52Como um passo inicial, foi desejável determinar se o epítopo reconhecido dependia do segmento gama 65-85. Digeriu-se fibrinogénio com plasmina na presença (digerido 1) ou ausência de Ca²⁺ (digerido 2). Estes digeridos foram sujeitos a uma cromatografiade afinidade em 2G5 imobilizado, para originar fracções não retidas (F1 e F2 dos digeridos 1 e 2, respectivamente) e ligadas (BI e B2), eluidas a pH básico. Estas fracções foram analisadas por SDS-PAGE, seguida de coloração com azul de Coomassie ou imunotrasferência de Western após transferência electroforética. Apenas as espécies de maior massa molecular dos fragmentos D reagiram com 2G5 na coluna de afinidade e por imunotransferência. Embora fragmentos D de baixa massa molecular de Mr = 85-91.000 tenham sido detectados no digerido 2, estes não reagiram com o anticorpo, verificando-se a restrição do epítopo a D100. Quando sujeitas a SDS-PAGE sob condições redutoras, BI e B2 exibiram padrões semelhantes: um dupleto de Mr = 40.000 (remanescentes das cadeias beta e gama) e uma única banda de Mr = 14.000 (remanescente da cadeia alfa), consistindo com relatórios descritos (Veradi et al. , Biochemistrv. 25:519 (1986); Southan et al. J Biol Chem, 260: 13095 (1985)).

Excisaram-se bandas de Mr = 40.000 dos geles e submeteram-se a análise de sequenciação dos aminoácidos NH₂-terminais. As sequências obtidas foram : AIQLTY e SRKML, para as bandas de Mr = 40.000 das fracções BI e B2, respectivamente. Ambas as sequências foram encontradas na cadeia gama do fibrinogénio; a primeira sequência corresponde aos resíduos 65 a 70 da cadeia gama e a segunda aos resíduos 85 a 89. A sequência DNENV estava também presente e corresponde aos resíduos 134 a 138 da cadeia beta do fibrinogénio. Estes resultados indicam que o epítopo reconhecido por 2G5 não reside na gama 65-85. Adicionalmente, a incapacidade dos fragmentos D de baixa massa molecular reagirem com o anticorpo indica que os aspectos do carboxilo terminal da cadeia gama devam estar intactos para a expressão do epítopo (Veradi et al. , Biochemistrv. 25:519 (1986)).

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Em experiências subsequentes, as fracções ligadas da coluna de afinidade foram sujeitas a digestão posterior com plasmina para assegurar que todo o D100 fosse degradado em formas de baixa massa molecular. Este digerido foi depois reaplicado à coluna de afinidade e o material ligado foi eluído a pH básico. 0 cromatograma, seguido a 280 nm, é mostrado na Figura 2A. A maioria do material aplicado à coluna foi recuperado como uma fracção ligada. Todavia, quando analisado por SDS-PAGE (geles de acrilamida gradiente 7,5-20%) nenhuma banda corada por coloração com azul de Coomassie foi detectada. 0 material ligado foi então conjuntamente misturado, neutralizado com ácido fosfórico e fraccionado por HPLC, numa coluna de fase inversa Vydac C18. 0 perfil de HPLC, seguido a 280nm, é mostrado na Figura 2B. Apenas foi detectado um pico principal, com um tempo de retenção de cerca de 4 minutos.

Fracções de diferentes tempos de eluição foram recolhidas, liofilizadas, redissolvidas em PBS e depois testadas para a sua capacidade de inibição da ligação de 2G5 ao fibrinogénio imobilizado num ensaio ELISA. A única fracção (No. 1) com actividade inibidora correspondeu àquela eluída da coluna de HPLC, ao fim de 4 minutos, que contém o pico de absorvância a 280 nm. Como controlo, o tampão de eluição da coluna de afinidade foi neutralizado com ácido fosfórico e aplicado à coluna de HPLC. Quando a fracção correspondente à No.l foi recollhida e testada pelo ensaio ELISA, nenhuma actividade inibidora foi detectada. Neste ensaio o digerido plasmático de D100 reteve actividade, verificando-se a estabilidade do epítopo RIBS-I durante a digestão plasmática posterior.

A fracção de HPLC seleccionada foi depois submetida a análise da sequência de aminoácidos do terminal NH₂- Embora os rendimentos tenham sido baixos (na gama de 1-2 pmole), sugerindo a ocorrência de algum bloqueio durante o processamento, foi obtida a seguinte sequência: GGTY. Estes quatro resíduos correspondem a 351-354 da cadeia gama do fibrinogénio. Estes resultados sugerem que os resíduos de 2G5 de um segmento que se prolonga no sentido da extremidade carboxilo da cadeia gama a

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partir do resíduo 351.

Síntese do Epitopo 2G5

Para verificar a localização do epitopo 2G5 na região da extremidade carboxilo da cadeia gama do fibrinogénio e para posteriormente definir a sua estrutura, foi sintetizado um conjunto de péptidos sobrepostos, correspondentes aos resíduos 340 a 411 da cadeia gama. A ligação directa do anticorpo a esses péptidos foi primeiro testada. Revestiram-se placas de microtitulação com os péptidos (10 /xg/ml em PBS) e a ligação de 2G5 (50^g/ml) foi determinada usando fosfatase alcalina conjugada com o segundo anticorpo. Como mostrado na Tabela 6, abaixo, o anticorpo reagiu fortemente com dois dos péptidos, P3 e P4. Estes péptidos sobrepõem-se e correspondem aos resíduos 365-383 (P3) e 373-385 (P4) da cadeia gama. Um anticorpo monoclonal de controlo, contra GPIIb-IIIa não reagiu com estes dois ou quaisquer outros péptidos. Além disso a especificidade da ligação do 2G5 a P3 e a P4 foi mostrada à medida que a reacção foi inibida por D100 solúvel ou por digeridos plasmáticos seus derivados; para ο P4, os valores de IC50 para D100 e seu digerido plasmático foi de 150 gg/ml e 30 /xg/ml, respectivamente.

TABELA 6

Reactividade do MAb 2G5 com Péptidos sintéticos *

Péptido	Sequência de Aminoácidos	Resíduos	Absorvância a 405 nm
PI	HAGHLNGVYYQGGTYSKA	P^340-57	0,086
P2	GGTYSKASTPNGYDNGIIWA	F9351-70	0,097
P3	NGIIWATWKTRWYSMKKTT	F^365-83	0,520
P4	KTRWYSMKKTTMK	F^373-85	0,624
P5	YSMKKTTMKIIPFNRLTIG	f9377-95	0,099
P6	MKIIPFNRLTIGEGQQHL	F^384-402	0,045
P7	QQHHLGGDKQAGDV	F^398-411	0,071

*A reactividade do anticorpo 2G5 com os péptidos imobilizados em placas de microtitulação foi testada num formato ELISA. Os resultados são expressos como absorvância a 405 nm.

Noutro conjunto de experiências, as placas de

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SCR 0725P/SC 163.2 POR microtitulação foram revestidas com D100 purificado por afinidade e foi determinada a capacidade dos péptidos sintéticos em inibir a ligação do 2G5. P4 inibiu a ligação de anticorpo a D100 imobilizado, enquanto que P2 não tinha efeito. (P3 comportou-se anormalmente, aumentando, em vez de inibir ou não apresentar efeito na reacção, possivelmente devido à ligação do péptido P3 ao fragmento imobilizado). A actividade inibidora do P4 foi bastante semelhante àquela observada com D100 solúvel ou seu digerido plasmático.

Mostrou-se também por cromatografia de afinidade, que o péptido P4 reage com 2G5. P4 (1 mg por ml de PBS) foi aplicado à coluna de anticorpo e após extensa lavagem da coluna, o péptido ligado foi eluído a pH básico e a sua recuperação foi quantificada. Baseada na sua absorvãncia a 280 nm, foi estimado que 44 /imoles de péptido estavam ligadas à coluna. Assumindo que todas as 26 /imoles de anticorpo na coluna estavam inteiramente funcionais, a recuperação do péptido aproximou-se do limite teórico de duas moles de péptido ligado por mole de anticorpo. Quando o péptido P2 foi aplicado à coluna sob as mesmas condições, nenhum material detectável foi eluído da coluna. Adicionalmente, quando P4 foi também aplicado a uma coluna de albumina-Sepharose, nenhum péptido se ligou à coluna.

Papel de Aminoácidos Específicos e Conformação Proteica no Estabelecimento do Epítopo 2G5.

Uma análise da reactividade de 2G5 com fibrinogénio de bovino e de ratazana permite a compreensão dos requisitos estruturais finos do epítopo RIBS-1. Por análise de pontos transferidos, o fibrinogénio de ratazana e de bovino não reagiu com o anticorpo, quando aplicado ao papel de filtro a 1 mg/ml, ao passo que mostrou reacção com fibrinogénio humano na mesma análise a 10 Mg/ml.

Como mostrado na Tabela 7, o alinhamento da sequência P4 da cadeia gama, Lys373-Lys385, com as correspondentes sequências nas cadeias gama de fibrinogénio de ratazana e de bovino indicou apenas diferenças num único aminoácido: lisina381 no

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SCR 0725P/SC 163.2 POR fibrinogénio humano é substituída por glutamina no fibrinogénio de ratazana, e treonina374 no fibrinogénio humano é substituída por uma serina no fibrinogénio de bovino.

Os péptidos correspondentes às sequências da cadeia gama de ratazana e de bovino foram sintetizados, imobilizados em placas de microtitulação e a sua reactividade com o anticorpo foi determinada por ensaio ELISA. Nem o péptido de ratazana nem o de bovino reagiram com o anticorpo, enquanto que foi observada a sua reacção com o péptido humano, no mesmo ensaio. (Tabela 7). Um controlo não relacionado não produziu sinal detectável com o péptido humano, bem como com os outros dois péptidos no mesmo ensaio.

TABELA 7

Reactividade do MAb 2G5 com Péptidos Homólogos de Cadeia Gama de Fibrinogénio Humano, de Ratazana e de Bovino

Espécie	Sequência de Aminoácidos dos Péptidos Sintéticos	Absorvância a 405 nm*
Humano	KTRWYSMKKTTMK	0,660
Ratazana	KTRWYSMKQTTMK	0,070
Bovino	KSRWYSMKKTTMK	0,046

* As condições são as mesmas daquelas empregues nos estudos referidos na Tabela 6 efeito da redução, alquilação e/ou desnaturação na expressão do epítopo 2G5 em fibrinogénio humano foi também analisado. Como avaliado por imunotransferência de Western, o epítopo era mantido quando a molécula era desnaturada com guanidina HC1 6 M, reduzida com ditiotreitol, ou alquilada com ácido iodoacético. Por contraste, quando o fibrinogénio era reduzido e alquilado na presença ou ausência de desnaturante, o epítopo não era mais detectado. Numa experiência de controlo, o péptido sintético P4 foi submetido a redução e alquilação nas

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Quando

mesmas condições que anulavam o epítopo no fibrinogénio.

imobilizado em placas de microtitulação, a reactividade do P4 tratado e não tratado, com 2G5 foi a mesma. Assim, a perda do epítopo RIBS-I no fibrinogénio reduzido e alquilado parece resultar de alterações que ocorrem fora da sequência linear

Lys373-Lys385.

Discussão

A GPIIb-IIIa pode existir em múltiplos estados conformacionais (Plow et al., Progress in Hemostasis and Thrombosis, vol 9 (Coller, B. S., ed) , pp. 117-156 (1989)). Algumas dessas transições conformacionais são induzidas por agonistas de plaquetas os quais convertem GPIIb-IIIa de um estado latente a outro no qual é competente para ligar ligandos. Ainda são induzidas outras transições conformacionais pela ligação do ligando ao receptor como documentado por alteração nas propriedades biofísicas e espectrais do receptor ocupado (Parise et al., J Biol Chem. 262:12597 (1987)) e pela exposição de epitopos LIBS (Frelinger et al., J Biol Chem. 263:12397 (1988); Frelinger et al., J Biol Chem. 265:6346 (1990)). A expressão de epitopos RIBS indica que o ligando sofre também alterações conformacionais após ligação ao receptor e confirma a natureza dinâmica de acontecimentos de ocupação pós-receptor. Como a ligação do ligando tem mostrado agora originar múltiplos epitopos LIBS dos GPIIb-IIIa (Frelinger et al., J Biol Chem, 265:6346 (1990)) é razoável colocar a hipótese de que vários epitopos RIBS distintos possam ser originados quando o fibrinogénio é ligado a este receptor. 2G5 e 9F9 (Abrams et al., Blood, 75: 128 (1990)) podem representar dois exemplos distintos de epitopos RIBS. Extensões lógicas da hipótese RIBS incluem as possibilidades de que esses epitopos possam ser induzidos: 1) quando outros ligandos, tal como o factor de von Willebrand ou fibronectina se ligam a GPIIb-IIIa; 2) quando o fibrinogénio se liga a outros receptores de integrina (tais como a_vj8₃ [Cheresh et al., Cell, 58:954 (1989)] ou Mac-1 [Altieri et al., J Cell Biol, 107: 1983 (1988)] e de não integrina [Levesque et al., J Biol Chem.. 265:328 (1990)] e 3) quando ligandos se ligam a outros receptores de integrina ou não integrina. 0 suporte

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inicial para tais previsões pode resultar da evidência de que epítopos LIBS são originados por ligações múltiplas de ligandos a GPIIb-IIIa e por ligação de ligandos a outras integrinas diferentes de GPIIb-IIIa [Frelinger et al., J Biol Chem. 265:6346 (1990); 0'Toole et al., Cell Requl. 1: 883 (1990)].

RIBS reconhecido por 2G5 é o primeiro epítopo RIBS a ser localizado. O péptido P3 corresponde aos resíduos 365-383 da cadeia gama, ambos ligados a 2G5. Assim, pelo menos parte dos epítopos têm de residir nos resíduos 373-383 da cadeia gama. Como o péptido P5, que corresponde aos resíduos 377-395, não reagiu com o anticorpo, os quatro resíduos (373) KTRW (376) deve ser um elemento chave na definição do epítopo 2G5.

Uma substituição conservativa única de uma treonina para uma serina na posição correspondente ao resíduo 374 é suficiente para anular a reactividade do anticorpo. A análise de fragmentação proteolítica restringe este epítopo à região entre o resíduo 351 e o terminal carboxilo da cadeia gama e proporciona corroboração independente da localização. Apesar da importância dos resíduos KTRW de gama 373-376 para reactividade do anticorpo, o epítopo 2G5 mostra consideravelmente mais complexidade. Uma substituição de um aminoácido na posição 381 também anula o epítopo. Adicionalmente, a estrutura secundária e terciária do fibrinogénio contribui significativamente para o epítopo. Assim, a redução e alquilação do fibrinogénio também destruiu o epítopo 2G5, se bem que a exposição do péptido P4 a agentes redutores e alquilantes não tivesse conseguido realizar a reacção do anticorpo com o péptido. Estes resultados indicam que pelo menos uma das estruturas secundária, terciária e quaternária do fibrinogénio deva estabilizar a sequência gama linear 373-385 numa conformação que é reactiva com o anticorpo ou que uma segunda região de fibrinogénio trazida para a proximidade por alteração conformacional da molécula possa também fazer parte do epítopo.

As previsões da estrutura secundária [Chou et al., Biochemistrv, 13:222 (1974)] sugerem uma transição de uma hélice

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a uma folha β, comecando no resíduo Lys373 e que a cadeia gama começa outra vez a assumir uma conformação helicoidal em Gly395. Tais transições na estrutura secundária formam frequentemente epítopos nas moléculas de proteína [Todd et al., Trends Biochem Sei, 7: 212 (1982)]. Adicionalmente num traçado hidropático [Hop et al., Natl Acad Sei USA, 78:3824 (1981) prevê-se que esta região tenha carácter hidrofílico, ajustando-se assim este critério à antigenicidade [Berzofsky, Science , 229:932 (1985)]. A presença de aminoácidos aromáticos numa cadeia de aminoácidos é um determinante adicional da antigenicidade em péptidos [Appel et al., J Immunol, 144: 976 (1990)], e gama 373-383 contém um resíduo triptofano e tirosina. Por isso, gama 373-383 possui elevada probabilidade de formar um epítopo na molécula de fibrinogénio. Contudo, esta região não é acessível ao anticorpo 2G5 na molécula nativa. Em modelos de fibrinogénio baseados em microscopia electrónica [Weisel et al., Science, 230: 1388 (1985)], parece que esta região da cadeia gama reside num domínio globolar independente, e esta organização pode limitar o acesso do anticorpo ao epítopo. Esta interpretação tem certas implicações, no que respeita a uma estratégia geral para produzir anticorpos RIBS. Isto sugere que uma forma alterada do ligando, tal como a induzida por desnaturação suave em proteólise limitada, pode proporcionar uma forma de imunogénio para originar anti-RIBS. No caso do RIBS 2G5, um fragmento proteolítico de fibrinogénio originou o anticorpo.

A região do terminal carboxilo da cadeia gama do fibrinogénio desempenha um papel importante na polimerização da fibrina como evidenciado pela localização de substituição de um único aminoácido na região gama 275-330 dos fibrinogénios com defeitos de polimerização [Terukina et al., Blood. 74:2681 (1989); Reber et al., Thromb Haemost, 56:401 (1986); Reber et al., Blood, 67: 1751; Bantia et al. , Blood, 75:1659 (1990); Bantia et al., Blood, 76:2279 (1990)]. Além disso, os estudos de Veradi e Scheraga [Veradi et al., Biochemistrv, 25:519 (1986)] sugerem que a região gama 365-405 está envolvida na polimerização da fibrina, embora a conformação da proteína desempenhe um papel crucial na mediação desta função

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SCR 0725P/SC 163.2 POR [Cierniewski et al., J Biol Chem , 261:9116 (1986)].

A capacidade do anticorpo 2G5 em inibir a agregação de plaquetas e a polimerização da fibrina [Zamarron et al., Thromb Haemost, 64:41 (1990)] sugere uma ligação prévia não reconhecida entre as duas funções da molécula de fibrinogénio. Num modelo simplista da agregação de plaquetas, uma única molécula de fibrinogénio, devido à sua estrutura dimérica e seus múltiplos locais de interacção com GPIIb-IIIa estabelece pontes directamente entre receptores em plaquetas adjacentes induzindo, assim, a sua agregação. Tal modelo de estabelecimento directo de pontes não explica porque certas preparações de plaquetas (fixadas com formaldeído [Peerschke at al., Blood, 57: 663 (1981)] ou plaquetas refractórias [Peerschke , J Lab Clin Med. 106: 111 (1985)] não agregam, apesar da normal ligação de fibrinogénio a GPIIb-IIIa. Estas inconsistências juntamente com o modelo de estabelecimento directo de pontes sugerem que acontecimentos de ocupação pós-receptor possam ser necessários para a agregação de plaquetas.

Embora o presente invento esteja descrito com algum pormenor através de ilustração e exemplo por motivos de clareza, será evidente que certas modificações podem ser efectuadas dentro do âmbito das reivindicações em apêndice.

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Claims (13)

1. REIVINDICACÕES

   1 - Polipéptido caracterizado por compreender até cerca de 40 resíduos de aminoácido incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido possuindo a fórmula: Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr-Thr-Met-Lys.
2. 2 - Polipéptido caracterizado por compreender até cerca de 20 resíduos de aminoácido incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido possuindo a fórmula: Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr-Thr-Met-Lys.
3. 3 - Polipéptido de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por possuir a fórmula:

   H-Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr-Thr-Met-Lys-OH.
4. 4 - Polipéptido caracterizado por compreender até cerca de 20 resíduos de aminoácido incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido possuindo a fórmula: Asn-Gly-Ile-Ile-Trp-Ala-Thr-Trp-Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-LysLys-Thr-Thr.
5. 5 - Polipéptido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por possuir a fórmula: H-Asn-Gly-Ile-Ile-Trp-Ala-Thr-Trp-Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-MetLys-Lys-Thr-Thr-OH.
6. 6 - Composição de polipéptido caracterizado por compreender um polipéptido de acordo com a reivindicação 1 e um excipiente farmacêutico.
7. 7 - Anticorpo caracterizado por imunorreagir com o poli de acordo com a reivindicação 1.
8. 8 - Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por não reagir substancialmente com plaquetas humanas inactivadas.

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   SCR 0725P/SC 163.2 POR
9. 9 - Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por não reagir substancialmente com fibrinogénio humano na presença de um complexo plaquetas-fibrinogénio.
10. 10 - Anticorpo caracterizado por imunorreagir com um complexo plaquetas-fibrinogénio.
11. 11 - Anticorpo monoclonal caracterizado por ser segregado por um hibridoma seleccionado do grupo consistindo em:

    2G5 possuindo o número de acesso ATCC HB9847;

    2F10 possuindo o número de acesso ATCC HB9844;

    3G11 possuindo o número de acesso ATCC HB9845; e 4G10 possuindo o número de acesso ATCC HB9846.
12. 12 - Processo de detecção da presença de um anticorpo de acordo com a reivindicação 7, numa solução contendo o referido anticorpo, caracterizado por:

    submeter a referida solução a um polipéptido imobilizado numa superfície, compreendendo o referido polipéptido até cerca de 40 resíduos de aminoácido incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido possuindo a fórmula: Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr-Thr-Met-Lys;

    manter o anticorporpo em contacto com o polipéptido por um período de tempo suficiente para que se forme um imunocomplexo anticorpo-polipéptido; e determinar a presença do imunocomplexo formado e desta forma a presença do anticorpo em solução.
13. 13 - Processo de isolamento de um anticorpo de acordo com a reivindicação 7, a partir de uma solução contendo o referido anticorpo, caracterizado por:

    submeter a referida solução a um polipéptido imobilizado numa superfície, compreendendo o referido polipéptido até cerca de 40 resíduos de aminoácido incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido possuindo a fórmula: Lys-Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-Thr-Thr-Met-Lys; e deslocar o referido anticorpo do referido polipéptido imobilizado, isolando assim o anticorpo.

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