DE60223688T2

DE60223688T2 - Verfahren zur behandlung von multiplem myelom

Info

Publication number: DE60223688T2
Application number: DE60223688T
Authority: DE
Inventors: Robert Lindsay Pennant Hills RAISON; Rosanne Dorothy Seaforth DUNN; Boon Hwa Andre 12-238 CHOO
Original assignee: IMMUNE SYSTEMS THERAPEUTICS Ltd; Immune System Therapeutics Ltd
Current assignee: IMMUNE SYSTEMS THERAPEUTICS Ltd; Immune System Therapeutics Ltd
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-07-05
Publication date: 2008-10-30
Anticipated expiration: 2022-07-06
Also published as: CN1551783B; EP1414492B1; AUPR617901A0; ZA200400959B; ES2296952T3; US20090263358A1; MXPA04000130A; JP2005504018A; EP1414492A4; NZ530099A; CN1551783A; CA2461989A1; JP4535424B2; US20040214761A1; CA2461989C; US20080199463A1; AU2006202148A1; US7556803B2; EP1414492A1; DE60223688D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für die Behandlung von multiplem Myelom. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Induzieren von Apoptose in Myelom-Zellen durch Verabreichung eines K121-ähnlichen Antikörpers.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Multiples Myelom (MM) ist eine B-Zellen-Malignität, gekennzeichnet durch die Anhäufung von terminal differenzierten B-Zellen (Plasmazellen) im Kochenmark. Neuere Forschung hat einige von den genetischen und molekularen Defekten identifiziert, die in myelomatösen Plasmazellen vorkommen (Drach, J., et al. (2000) Cancer Res Clin Oncol. 126: 441; Ludwig, H., et al. (1999) Annals Oncol. 10 (6): S31). Diese Werte zeigen an, dass multiple molekulare Ereignisse zu nachhaltiger genetischer Instabilität der Zellen, Resistenz gegen Chemotherapie und erhöhter Neovaskularisation des Knochenmarks führen. Die gegenwärtige Therapie für MM ist Chemotherapie mit hoher Dosis und/oder autologe periphere Blutstammzellentransplantation. Derzeit wird die letztere Behandlung favorisiert, zurückzuführen auf eine höhere 5-Jahre-Überlebensrate (52% im Verhältnis zu 12%). Kürzlich haben antiangiogene Mittel wie beispielsweise Thalidomid eine objektive Reaktion bei ungefähr 30% der refraktären Patienten erzeugt. MM ist trotz dieser drastischen Therapien irreversibel tödlich, wobei mittlere Überlebenszeiten von 4–6 Jahren von der Art der Behandlung abhängen (Kyle, RA., et al. (2001) The Oncologist. 6 (2): 119).
Es gibt gegenwärtig 40000 Patienten mit MM in den Vereinigten Staaten, mit einer Schätzung, dass jedes Jahr ungefähr 14000 neue Patienten diagnostiziert werden (Chauhan, D., und Anderson, KC., (2001) Apoptosis. 6 (1–2): 47). Die Inzidenz von MM weltweit liegt zwischen 1,5–4,5/100000/Jahr, abhängig von dem Land (Hurez, D., (1993) Revue du Praticien. 43 (3): 271).
Die malignanten B-Zellen bei MM erzeugen überschüssige Mengen von leichter Kette, einer Komponente von Immunoglobulin, und diese leichten Ketten sind in dem Serum und Urin von Individuen mit dieser Krankheit vorhanden. Ungefähr 70% von MM-Patienten erzeugen leichte Ketten vom kappa-Typ, wobei die verbleibenden 30% vom lambda-Typ sind (Kyle, RA., (1999) Path Biol. 47 (2): 148).
K121 ist ein muriner monoklonaler Antikörper (mAb), der spezifisch humane freie kappa-leichte Ketten und ein Antigen, exprimiert auf der Oberfläche von Myelom-Zellen vom kappa-Typ, erkennt. Dieses Antigen wird als kappa-Myelom-Antigen oder KMA bezeichnet (Boux, HA., et al. (1983) J Exp Med. 158: 1769). Es wurde festgestellt, dass KMA aus freien kappa-leichten Ketten, exprimiert in nicht-kovalenter Assoziation mit Aktin auf der Zellmembran, besteht (Goodnow et al. (1985) J. Immunol. 135: 1276). K121 zeigt keine Kreuzreaktivität mit irgendwelchen normalen oder malignanten Lymphoid-Zellen oder mit intakten Molekülen von humanem Immunoglobulin (Boux, HA, et al. (1984) Eur. J. Immunol. 14: 216).
Ein quantitativer Immunoassay zum Messen von freien kappa-leichten Ketten in dem Serum und Urin von Patienten, die an MM leiden, wurde unter Verwendung von K121 entwickelt (Axiak, SM., (1987) J Immunol Methods. 99: 141). Die neuere Literatur weist darauf hin, dass Quantifizierung von freien leichten Ketten verwendet werden kann, um den Fortschritt der Therapie dieser Patienten und die Reaktion auf sie zu überwachen (Drayson, M., (2001) Blood 97 (9): 2900).
Es wurde ebenfalls darauf hingewiesen, dass K121 verwendet werden kann, um kappa-Myelom-Zellen Zytotoxine zuzuführen (Goodnow et al. (1985) J. Immunol. 135: 1276). In der Tat ist ein Immuntoxin, umfassend das zytolytische Peptid Melittin, verknüpft mit einem K121-scFV-Fragment (scFv-mel), als potentielles therapeutisches Mittel für die Behandlung von MM entwickelt worden (Dunn, RD., et al. (1996) Immunotechnology 2: 229). K121 wurde früher verwendet, um B-pro-lymphozytische Leukämie zu behandeln (WESTON et al. (1998) Leukemia and Lymphoma 29: 361).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben jetzt gefunden, dass K121 allein (d. h. nicht konjugiert mit einem Toxin oder einem zytolytischen Mittel) imstande ist, KMA tragende Zellen durch Induktion von Apoptose zu töten. Weiterhin haben die Erfinder demonstriert, dass K121 allein das Wachstum von Tumorzellen in vivo verhindern kann. Diese Ergebnisse zeigen an, dass K121-ähnliche Antikörper potentiell als primäre therapeutische Mittel bei der Behandlung von multiplem Myelom verwendbar sind.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren für die Behandlung von multiplem Myelom vom kappa-Typ bei einem Subjekt bereit, wobei das Verfahren Verabreichen einer wirksamen Menge von einem K121-ähnlichen Antikörper an das Subjekt umfasst, wobei der K121-ähnliche Antikörper nicht mit einem Toxin oder einem zytolytischen Mittel konjugiert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung eines K121-ähnlichen Antiköpers für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von multiplem Myelom vom kappa-Typ bereit, wobei der K121-ähnliche Antikörper nicht mit einem Toxin oder einem zytolytischen Mittel konjugiert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts umfasst das Verfahren weiterhin den Schritt, das Subjekt zu behandeln, um die in der Flüssigkeit des Subjekts vorhandenen Mengen an freien kappa-leichten Ketten vor der Verabreichung des K121-ähnlichen Antikörpers zu reduzieren. Vorzugsweise werden die in dem Serum des Subjekts vorhandenen Mengen an freien kappa-leichten Ketten reduziert. Eine Reduzierung der Mengen an freien kappa-leichten Ketten kann durch zum Beispiel Plasmapharese erreicht werden. Es wird bevorzugt, dass die Behandlung zum Reduzieren der Mengen an freien kappa-leichten Ketten bei dem Subjekt unmittelbar vor der Verabreichung des K121-ähnlichen Antikörpers durchgeführt wird.
In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur autologen hämatopoetischen Zelltransplantation bei einem Subjekt bereit, wobei das Verfahren umfasst

(i) Entfernen einer hämatopoetischen Vorläufer-Zellpopulation aus dem Subjekt,
(ii) Behandeln der Zellpopulation mit einem K121-ähnlichen Antikörper, und
(iii) Transplantieren der behandelten Zellpopulation von Schritt (ii) in das Subjekt,

In einer bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspekts beinhaltet das Verfahren auch intravenöse Infusion eines K121-ähnlichen Antikörpers in das Subjekt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspekts wird das Verfahren der autologen Transplantation an dem Subjekt während oder nach zytoreduktiver Therapie durchgeführt.
In einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Töten von Myelom-Zellen vom kappa-Typ in einer gemischten Zellpopulation bereit, wobei das Verfahren Inkontaktbringen der gemischten Zellpopulation mit einem K121-ähnlichen Antikörper umfasst, wobei der K121-ähnliche Antikörper nicht mit einem Toxin oder einem zytolytischen Mittel konjugiert ist.
In einem vierten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Induzieren von Apoptose in KMA-tragenden Zellen bereit, wobei das Verfahren Einwirken eines K121-ähnlichen Antikörpers auf die Zellen umfasst, wobei der K121-ähnliche Antikörper nicht mit einem Toxin oder einem zytolytischen Mittel konjugiert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des vierten Aspekts sind die KMA-tragenden Zellen Myelom-Zellen vom kappa-Typ.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist der K121-ähnliche Antikörper die CDR-Loops (CDR1, CDR2 und CDR3) des K121-Antikörpers, wie in 9a gezeigt, auf. In einer anderen Ausführungsform weist der K121-ähnliche Antikörper das VH- und VL-Gen des K121-Antikörpers, wie in 9a gezeigt, auf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der K121-ähnliche Antikörper ein chimärer Antikörper oder ein humanisierter Antikörper.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. (a) Zytotoxische Aktivität von mAb K121 auf HMy2- und K562-Lymphoblastoid-Zellen, wie durch das Austreten von zytoplasmatischer LDH (Extinktion bei 492 nm) gemessen. Zellen inkubiert für 20 h in Anwesenheit und Abwesenheit von K121 mAb (6,25 μM). (b) Kinetik von K121-induziertem Zelltod. (c) Konzentrationsabhängigkeit des Tötens von HMy2-Zellen durch K121.
2. Durchflusszytometrische Analyse von K121-induzierter Apoptose von HMy2-Zellen. Lichtstreuungsprofil von HMy2-Zellen, inkubiert mit PBS oder K121 für 16 und 20 h. FSC und SSC entsprechen der Zellgröße bzw. Zellkomplexität.
3(a) Durchflusszytometrische Analyse von K121-induzierter Apoptose von HMy2-Zellen unter Verwendung von Annexin-V-FITC. HMy2-Zellen wurden in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von K121 bei 37°C für 16 oder 20 h inkubiert. Danach wurden die Zellen mit Annexin-V-FITC inkubiert und mit Propidiumiodid gegengefärbt. (b) Zytotoxizität von K121 mAb auf HMy2-Zellen, ausgeführt parallel mit dem Annexin-V-Assay. HMy2-Zellen wurden bei 37°C für 16 oder 20 h in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit (5,35 μM) von K121 mAb inkubiert. Der Kulturüberstand wurde zur Analyse des Austreten von zytosolischer LDH geerntet.
4(a) Durchflusszytometrische Analyse von K121-induzierter Apoptose von HMy2-Zellen unter Verwendung des TUNEL-Assays. HMy2-Zellen wurden in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit von K121 bei 37°C für 16 oder 20 h inkubiert. Danach wurden die Zellen fixiert und intrazelluläre DNA wurde enzymatisch mit Fluorescein-12-dUTP an dem 3'-Ende markiert. (b) Zytotoxizität von HMy2-Zellen nach 16 und 20 Stunden Inkubation mit und ohne K121, ausgeführt parallel mit dem TUNEL-Assay. HMy2-Zellen wurden bei 37°C für 16 oder 20 h in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit (5,35 μM) von K121 mAb inkubiert. Der Kulturüberstand wurde zur Analyse des Austreten von zytosolischer LDH geerntet.
5. Zeitverlauf der Serumspiegel von humanem IgG, sekretiert durch HMy2 in SCID-Mäusen nach (a) keiner Behandlung (PBS), (B) Behandlung mit scFv-mel oder (c) Behandlung mit K121 mAb. Zellen (10⁷) wurden am Tag 0 i. p. injiziert und Behandlung mit scFv-mel (0,5 mg/Dosis) oder K121 mAb (1,25 mg/Dosis) an den Tagen 1–3 gegeben. Innerhalb einer Behandlungsgruppe stellt jedes Symbol IgG-Werte für eine individuelle Maus dar.
6. Auswirkung von Antikörperbehandlung auf Tumorwachstum in SCID-Mäusen. SCID-Mäuse, injiziert mit HMy2-Zellen am Tag 0 und K121 mAb, verabreicht über 3 Tage (Tag 1, 2 und 3) mit Gesamtdosismengen von 3,0, 1,5, 0,3, 0,15 und 0 (PBS-Kontrolle) mg. Das Tumorwachstum wurde durch Quantifizierung von humanem IgG in Mäuseserum bewertet. Die aufgetragenen Werte sind Mittelwerte von 6 Mäusen, ausgenommen der Woche-6-Wert in der unbehandelten Gruppe, wo der Wert von einer einzigen Maus ist.
7. Auswirkung der Antikörperdosis auf das Überleben von Tumor tragenden Mäusen.
8. Spiegel von humanem IgG in dem Serum von unbehandelten und Antikörper-behandelten Mäusen 42 Tage nach der Injektion von Tumorzellen. Die Werte sind für individuelle Mäuse. *Humanes IgG nicht nachweisbar, † Mortalitäten
9. (a) Die Aminosäuresequenz und entsprechende DNA-Sequenz für die variablen Regionen der schweren Kette (VH) und leichten Kette (VL) von K121. Die CDR-Regionen sind in Fettdruck gezeigt. (b) Überlappende Oligonucleotide (VH1–VH6), abgeleitet von dem VH-Gen von K121. (c) Überlappende Oligonucleotide (VL1–VL6), abgeleitet von dem VL-Gen von K121. (d) PCR-Primer für Oligonucleotid-Extension von K121 VH. (e) PCR-Primer für Oligonucleotid-Extension von K121 VL. (f) Schematische Darstellung eines Verfahrens zum Erzeugen der variablen Regionen der schweren und leichten Kette des monoklonalen Antikörpers K121 unter Verwendung der Oligonucleotid-Extension.
10. PCR-Primer für PCR-Amplifikation von K121-VH- und VL-Gen. Die Restriktionsenzymstellen für gerichtetes Klonieren in die Säuger-Expressionsvektoren sind unterstrichen. Die cK-VH-R- und cK-VL-R-Primer schließen eine Spleißakzeptorstelle (gezeigt in Fettdruck) ein.
11(a). ELISA zum Nachweis und zur Quantifizierung von humanem Antikörper in dem Überstand von transfizierten CHO-Zellen. Der Kulturüberstand von den transfizierten CHO-Zellen wurde seriell verdünnt und humaner Antikörper, der an das immobilisierte anti-humane IgG + A + M der Ziege gebunden war, wurde mit anti-humanem Fc-spezifischen AP-Konjugat der Ziege nachgewiesen. Eine Standardkurve wurde parallel unter Verwendung serieller Verdünnungen von humanem IgG1 κ durchgeführt. Gebundener Antikörper wurde durch Farbentwicklung und Extinktion, gemessen bei 405 nm, visualisiert. (b) Ein ELISA zum Nachweis der Bindung von chimärem K121 an humane kappa-leichte Kette. Kulturüberstand von transfizierten und untransfizierten CHO-Zellen wurde seriell verdünnt und Antikörper, der an immobilisierte humane kappa-leichte Ketten gebunden war, wurde unter Verwendung von anti-humanem Fc-spezifischen AP-Konjugat der Ziege nachgewiesen. Nach der Farbentwicklung wurde gebundener Antikörper durch Extinktion bei 405 nm nachgewiesen.
12. Zytotoxische Aktivität von chimärem K121 (cK121) auf HMy2- und K562-Lymphoblastoid-Zellen, wie durch das Austreten von zytoplasmatischer LDH gemessen. Zielzellen wurden in Anwesenheit von PBS (Kontrolle), 5,5 μM murinem K121 (mK121) oder 0,8 μM chimärem K121 (cK121) für 20 h bei 37°C in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert.
13. Konzentration von cK121, sekretiert durch individuelle Klone. Die Konzentration von cK121 wurde durch einen ELISA unter Verwendung von mit antihumanem IgG, IgA und IgM beschichteten Vertiefungen bestimmt. Die Werte stellen die positiven Klone 1–5 und einen negativen Klon 6 dar.
14(a). Schematische Darstellung eines Verfahrens zur Humanisierung von K121 VL unter Verwendung eines humanen VL-Gens als Gerüst. (b) Die DNA-Sequenz von einer VL mit humanem Gerüst und K121-VL. (c) Oligonucleotide für K121-VL-Humanisierung unter Verwendung von PCR.
15(a). DNA-Sequenz der Gene von K121 und der variablen schweren Kette von humanem VH3 (hVH). (b) VH-Mutagenese-Primer zur Verwendung bei der Humanisierung von K121.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wenn hier verwendet bezeichnet der Ausdruck „K121-ähnlicher Antikörper" einen Antikörper, welcher nicht mit einem Toxin oder zytolytischen Mittel konjugiert ist und die VH- und VL-Region, gezeigt in 9a, aufweist oder mit einem Antiköper, der die VH- und VL-Region, gezeigt in 9a, aufweist, zum Binden an Myelom-Zellen vom kappa-Typ konkurriert. Vorzugsweise bezeichnet der Begriff „K121-ähnlicher Antikörper" einen Antikörper, der an das gleiche Epitop wie ein Antikörper mit der VH- und VL-Region, gezeigt in 9a, bindet.
Der K121-ähnliche Antikörper weist vorzugsweise die CDR-Loops (CDR1, CDR2 und CDR3) des K121-Antikörpers, wie in 9a gezeigt, auf. Der K121-ähnliche Antikörper kann das VH- und VL-Gen des K121-Antikörpers, wie in 9a gezeigt, aufweisen.
K121-ähnliche Antikörper können durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, mit K121 (oder chimären oder humanisierten Formen von K121) beim Binden an KMA auf HMy2-Zellen zu konkurrieren. Bei dieser Verfahrensweise kann K121 unter Verwendung etablierter Verfahrensweisen mit Biotin konjugiert werden (Hofmann, K., et al. (1982) Biochemistry 21: 978–84). K121-ähnliche Antikörper werden dann durch ihre Fähigkeit eingeschätzt, mit der Bindung von biotinyliertem K121 an KMA auf HMy2-Zellen zu konkurrieren. Die Bindung von biotinyliertem K121 an HMy2-Zellen kann durch die Zugabe von Fluorescein-markiertem Streptavidin bewertet werden, welches an Biotin auf K121-Molekülen bindet. Die Fluoreszenz-Färbung von Zellen wird dann durch Durchflusszytometrie und die konkurrierende Wirkung des exprimierten K121-ähnlichen Antikörpers als Prozentgehalt der Fluoreszenz-Niveaus, erhalten in Abwesenheit des Konkurrenten, quantifiziert.
Für die Zwecke dieser Erfindung schließt der Begriff „Antikörper", wenn nicht gegenteilig festgelegt, zweiwertige Fragmente ganzer Antikörper, die ihre Bindungsaktivität für ein Zielantigen behalten, ein. Derartige Fragmente schließen zum Beispiel F(ab')₂-Fragmente ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der K121-ähnliche Antikörper ein rekombinanter oder monoklonaler Antikörper. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein chimärer oder humanisierter Antikörper.
Wenn in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, ist der K121-ähnliche Antikörper nicht mit einem Toxin oder zytolytischen Mittel konjugiert. Mit „Toxin" meinen wir ein beliebiges auf dem Fachgebiet bekanntes Toxin wie beispielsweise Ricin, Saprin, Diphtherie-Toxin und Pseudomonas-Exotoxin. Mit „zytolytischem Mittel" meinen wir ein Mittel wie beispielsweise Melittin, das Lyse von Zellen verursacht.
Überall in dieser Beschreibung beinhalten das Wort „umfassen" oder Variationen wie beispielsweise „umfasst" oder „umfassend" selbstverständlich den Einschluss eines angegebenen Elements, einer ganzen Zahl oder eines Schrittes oder einer Gruppe von Elementen, ganzen Zahlen oder Schritten, aber nicht den Ausschluss irgendeines anderen Elements, einer ganzen Zahl oder eines Schrittes oder einer Gruppe von Elementen, ganzen Zahlen oder Schritten.
Monoklonale Antikörper
Monoklonale Antikörper, die gegen KMA-Epitope gerichtet sind, können durch den Fachmann leicht hergestellt werden. Die allgemeine Methodik zum Erzeugen monoklonaler Antikörper durch Hybridome ist bekannt. Immortale Antikörper-erzeugende Zelllinien können durch Zellfusion und auch durch andere Techniken wie beispielsweise direkte Transformation von B-Lymphozyten mit onkogener DNA oder Transfektion mit dem Epstein-Barr-Virus erzeugt werden. Platten von monoklonalen Antikörpern, hergestellt gegen KMA-Epitope, können auf verschiedenartige Eigenschaften; d. h. für Isotyp- und Epitop-Affinität, gescreent werden.
Mäuse-abgeleitete monoklonale Antikörper können für sowohl direkte in vivo als auch extrakorporale Immuntherapie verwendet werden. Jedoch wurde beobachtet, dass, wenn Mäuse-abgeleitete monoklonale Antikörper bei Menschen als therapeutische Mittel verwendet werden, der Patient humane anti-Mäuse-Antikörper erzeugt. So werden Mäuse-abgeleitete monoklonale Antikörper zur Therapie, insbesondere für langfristigen Gebrauch, nicht bevorzugt. Mit etablierten Techniken der Gentechnologie ist es jedoch möglich, chimäre oder humanisierte Antikörper zu erzeugen, die Tier-abgeleitete und Mensch-abgeleitete Anteile haben. Das Tier kann eine Maus oder ein anderes Nagetier wie beispielsweise eine Ratte sein.
Wenn die variable Region des chimären Antikörpers Mäuse-abgeleitet ist, während die konstante Region Mensch-abgeleitet ist, wird der chimäre Antikörper im allgemeinen weniger immunogen sein als ein „reiner" Mäuse-abgeleiteter monoklonaler Antikörper. Diese chimären Antikörper würden wahrscheinlich für therapeutischen Gebrauch mehr geeignet sein, sollte es sich herausstellen, dass „reine" Mäuse-abgeleitete Antikörper ungeeignet sind.
Chimäre Antikörper
Methodiken zum Erzeugen chimärer Antikörper sind für den Fachmann verfügbar. Zum Beispiel können die leichte und schwere Kette unter Verwendung von zum Beispiel der leichten Kette von Immunoglobulin und der schweren Ketten von Immunoglobulin in gesonderten Plasmiden gesondert exprimiert werden. Diese können dann gereinigt und in vitro zu vollständigen Antikörpern zusammengebaut werden; Methodiken zum Bewerkstelligen von derartigem Zusammenbau sind beschrieben worden. Siehe zum Beispiel Scharff, M., Harvey Lectures 69: 125 (1974). Siehe auch Oi et al. Bio Techniques 4 (4): 214–221 (1986); und Sun et al. Hybridoma 5 (1986) Suppl 1: 517–20. Ein derartiges DNA-Konstrukt kann DNA, codierend funktionell umgeordnete Gene für die variable Region einer leichten oder schweren Kette eines K121-ähnlichen Antikörpers, verknüpft mit DNA, codierend eine humane konstante Region, umfassen. Lymphoid-Zellen wie beispielsweise Myelome oder Hybridome, transfiziert mit den DNA-Konstrukten für leichte und schwere Kette, können die Antikörperketten exprimieren und zusammenbauen.
In-vitro-Reaktionsparameter für die Erzeugung von IgG-Antikörpern aus reduzierten isolierten leichten und schweren Ketten sind ebenfalls beschrieben worden. Siehe zum Beispiel Beychok, S., Cells of Immunoglobulin Synthesis (Zellen der Immunoglobulinsynthese), Academic Press, New York, S. 69, 1979. Coexpression von leichten und schweren Ketten in den gleichen Zellen, um intrazelluläre Assoziation und Verknüpfung von schweren und leichten Ketten zu vollständigen H₂L₂-IgG-Antikörpern zu erreichen, ist ebenfalls möglich. Eine derartige Coexpression kann unter Verwendung entweder der gleichen oder verschiedener Plasmide in der gleichen Wirtszelle bewerkstelligt werden.
Humanisierte Antikörper
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der K121-ähnliche Antikörper humanisiert, das heißt, durch molekulare Modellierungstechniken ein Antikörper erzeugt, bei dem der humane Gehalt des Antikörpers maximiert wird, während wenig oder kein Verlust von Bindungsaffinität, zuzuschreiben der variablen Region des murinen Antikörpers, verursacht wird.
Die nachstehend beschriebenen Verfahren sind auf die Humanisierung von K121-ähnlichen Antikörpern anwendbar. Eine zwei-Schritt-Herangehensweise kann verwendet werden, welche beinhaltet (a) Auswählen von Sequenzen des humanen Antikörpers, die als humane Gerüste zur Humanisierung verwendet werden, und (b) Bestimmen, welche Reste der variablen Region des tierischen monoklonalen Antikörpers zur Insertion in das gewählte humane Gerüst ausgewählt werden sollten.
Der erste Schritt beinhaltet Auswahl der besten verfügbaren Sequenzen des humanen Gerüsts, für welche Sequenzinformation verfügbar ist. Dieses Auswahlverfahren basiert auf den folgenden Auswahlkriterien.
(1) Prozent Identitäten
Die Sequenzen der variablen Regionen der schweren und leichten Kette eines tierischen monoklonalen Antikörpers, der humanisiert werden soll, werden optimal ausgerichtet und vorzugsweise mit allen bekannten Sequenzen der variablen Region der schweren und leichten Kette des humanen Antikörpers verglichen.
Sobald die Sequenzen so verglichen sind, werden die Identitäten des Rests aufgezeichnet und die Prozent Identitäten werden bestimmt. Wenn alle anderen Faktoren gleich sind, ist es wünschenswert, einen humanen Antikörper auszuwählen, welcher die höchsten Prozent Identität mit dem tierischen Antikörper hat.
(2) Sequenz-Ambiguitäten
In Fällen, wo Sequenzen durch direkte Proteinsequenzierung abgeleitet sind, können die bekannten Kettensequenzen des humanen Antikörpers auf die Anwesenheit von unidentifizierten Resten und/oder Ambiguitäten eingeschätzt werden, welche Sequenzunsicherheiten sind. Die häufigsten von derartigen Unsicherheiten sind fehlerhafte Identifizierung einer sauren Aminosäure für eine Amidaminosäure, zurückzuführen auf den Verlust von Ammoniak während der Sequenzierungsprozedur, z. B. inkorrekte Identifizierung eines Glutaminsäurerests, wenn der tatsächlich in dem Protein vorhandene Rest ein Glutaminrest war. Wenn alle anderen Faktoren gleich sind, ist es wünschenswert, eine Kette eines humanen Antikörpers mit so wenig derartigen Ambiguitäten wie möglich auszuwählen.
(3) Pin-Region-Abstand
Variable Regionen der Antikörperkette enthalten in der Domäne Disulfidbrücken. Die Entfernung (Anzahl von Resten) zwischen den diese Brücken umfassenden Cysteinresten, wird als der Pin-Region-Abstand bezeichnet (Chothia et al. J. Mol. Biol. 196: 901 (1987)). Wenn alle anderen Faktoren gleich sind, ist es am meisten wünschenswert, dass der Pin-Region-Abstand eines ausgewählten humanen Antikörpers ähnlich oder identisch mit dem des tierischen Antikörpers ist. Es ist ebenfalls wünschenswert, dass der Pin-Region-Abstand der humanen Sequenz ähnlich mit dem der 3-dimensionalen Struktur eines bekannten Antikörpers ist, um die Computermodellierung zu erleichtern.
Basierend auf den vorhergehenden Kriterien wird der humane Antikörper (oder die Antikörper) mit der besten Gesamtkombination von wünschenswerten charakteristischen Eigenschaften als Gerüst zur Humanisierung des tierischen Antikörpers ausgewählt. Die ausgewählten schweren und leichten Ketten können von den gleichen oder verschiedenen humanen Antikörpern sein.
Der zweite Schritt in den Verfahren dieser Erfindung beinhaltet die Bestimmung, welche Sequenzen von der variablen Region des tierischen Antikörpers zum Pfropfen in das humane Gerüst ausgewählt werden sollten. Dieses Auswahlverfahren basiert auf den folgenden Auswahlkriterien:
(1) Restauswahl
Zwei Typen von Resten der potentiellen variablen Region werden in den Sequenzen des tierischen Antikörper eingeschätzt, von welchen die ersten „minimale Reste" genannt werden. Diese minimalen Reste umfassen strukturelle CDR-Loops plus alle erforderlichen zusätzlichen Reste, wie gezeigt durch Computermodellierung, um die strukturellen CDR-Loops zu stützen und/oder zu orientieren.
Der andere Typ von Resten der potentiellen variablen Region wird als „maximale Reste" bezeichnet. Sie umfassen die minimalen Reste plus alle zusätzlichen Reste, welche, wie bestimmt durch Computermodellierung, innerhalb etwa 10 Å von Resten des strukturellen CDR-Loops fallen und besitzen eine Wasser-Lösungsmittel-zugängliche Oberfläche (Lee et al., J. Biol. Chem. 55: 379 (1971)).
(2) Computermodellierung
Um potentielle Reste der variablen Region zu identifizieren, wird Computermodellierung ausgeführt an (a) den Sequenzen der variablen Region des tierischen Antikörpers, der humanisiert werden soll, (b) den ausgewählten Sequenzen des Gerüsts des humanen Antikörpers und (c) allen möglichen rekombinanten Antikörpern, umfassend Sequenzen des Gerüsts des humanen Antikörpers, in welchen die verschiedenartigen minimalen und maximalen Reste des tierischen Antikörpers gepfropft worden sind.
Die Computermodellierung wird durchgeführt, indem Software, geeignet für Proteinmodellierung, und strukturelle Information, erhalten von einem Antikörper, der (a) Aminosäuresequenzen der variablen Region, am nächsten identisch denjenigen des tierischen Antikörpers, hat und (b) eine bekannte 3-dimensionale Struktur hat, verwendet wird. Ein Beispiel von Software, die verwendet werden kann, ist die Software SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Der Antikörper, von dem die strukturelle Information erhalten werden kann, kann, aber muß nicht notwendigerweise ein humaner Antikörper sein.
Basierend auf in der vorhergehenden Analyse erhaltenen Ergebnissen werden rekombinante Ketten, enthaltend die tierischen variablen Regionen, die eine Computermodellierungsstruktur erzeugen, die sich am nächsten an die des tierischen Antikörpers annähert, zur Humanisierung ausgewählt.
Gänzlich humane Antikörper können hergestellt werden, indem Bibliotheken der Expression von humanem Immunoglobulin (Stratagene Corp., La Jolia, Calif.) verwendet werden, um Fragmente humaner Antikörper (V_H, V_L, F_V, Fd, Fab oder F(ab')₂) zu erzeugen, und diese Fragmente verwendet werden, um unter Verwendung von Techniken, ähnlich denjenigen zum Erzeugen chimärer Antikörper, vollständige humane Antikörper zu konstruieren.
Arten der Verabreichung
K121-ähnliche Antikörper können direkt an ein Subjekt verabreicht werden, das einer Behandlung für multiples Myelom bedarf
Das Wachstum von Tumorzellen kann gehemmt oder vermindert werden, indem an ein Subjekt, das der Behandlung bedarf eine wirksame Menge eines K121-ähnlichen Antikörpers verabreicht wird. Typischerweise kann der Antikörper in einer Menge von etwa 0,001 bis 2000 mg/kg Körpergewicht pro Dosis und stärker bevorzugt etwa 0,01 bis 500 mg/kg Körpergewicht pro Dosis verabreicht werden. Wiederholte Dosen können wie durch den behandelnden Arzt vorgeschrieben verabreicht werden. Jedoch sind andere Mengen ebenfalls geeignet. Im allgemeinen wird die Verabreichung des Antikörpers durch Infusion durchgeführt, so dass die vorhandene Menge des Antikörpers, die eine nachteilige Wirkung erzeugen kann, durch Verändern der Verabreichungsrate unter Kontrolle gehalten werden kann. Typischerweise kann die Infusion einer Dosis einige Stunden dauern. Jedoch wird hier ebenfalls die konstante Infusion einer Dosis für therapeutische Zwecke in Erwägung gezogen, die die Aufrechterhaltung eines konstanten Spiegels des Antikörpers im Serum gestattet. Die Infusion des K121-ähnlichen Antikörpers kann wie folgt durchgeführt werden. Intravenöses (i. v.) Schlauchmaterial kann vorbehandelt, z. B. mit 0,9% NaCl und 5% humanem Serumalbumin, und für intravenöse Verabreichung plaziert werden. Die i. v.-Infusion kann ein Gesamtvolumen von 250 ml von 0,9% NaCl und 5% humanem Serumalbumin umfassen und kann über einen Zeitraum von etwa 2 Stunden, abhängig von allen beobachteten geschwindigkeitsabhängigen Nebenwirkungen, infundiert werden. Lebenszeichen sollten z. B. alle fünfzehn Minuten während der Infusion und jede Stunde nach der Infusion bis zur Stabilität genommen werden. Eine sorgfältige kardiopulmonäre physische Untersuchung kann vor und beim Abschluss der Infusion durchgeführt werden. Medimenkatöse Behandlungen, die Acetaminophen, Diphenhydramin, Epinephrin und Corticosteroide einschließen, können zur Behandlung von allergischen Reaktionen, sollten sie vorkommen, bei der Hand gehalten werden. Die Verabreichung des Antiköpers kann wiederholt werden, wenn es durch den praktischen Arzt als wünschenswert angesehen wird.
Wie durch den Fachmann anerkannt ist, haben einige Myelom-Patienten signifikante Mengen an freier kappa-leichter Kette in ihrem Blutkeislauf. Da K121-ähnliche Antikörper mit freien kappa-leichten Ketten reagieren, kann ihre Anwesenheit in der Flüssigkeit des Subjekts die Wirksamkeit der Behandlung verringern. Dementsprechend umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das Verfahren der Behandlung weiterhin den Schritt, das Subjekt zu behandeln, um vor der Verabreichung des K121-ähnlichen Antikörpers die Mengen an freien kappa-leichten Ketten, die in der Flüssigkeit (z. B. Blut) des Subjekts zirkulieren, zu reduzieren. Dieser zusätzliche Behandlungsschritt kann zum Beispiel Plasmapherese beinhalten. Wie dem Fachmann bekannt sein wird, ist Plasmapherese ein Vorgang, bei welchem das Plasma aus Blutzellen durch eine Vorrichtung, bekannt als Zellseparator, entfernt wird. Der Separator arbeitet entweder durch Zentrifugieren des Bluts mit hoher Geschwindigkeit, um die Zellen von der Flüssigkeit abzutrennen, oder durch Hindurchführen des Bluts durch eine Membran mit Poren, die so klein sind, dass nur das Plasma hindurchgehen kann. Die Zellen werden in das Subjekt zurückgeführt, während das Plasma, das die freien kappa-leichten Ketten enthält, verworfen und mit anderen Flüssigkeiten ersetzt wird. Eine medikamentöse Behandlung, um das Blut vor dem Gerinnen zu bewahren (z. B. ein Antikoagulans), kann während der Prozedur durch eine Vene gegeben werden.
K121-ähnliche Antikörper sind auch auf das Ausspülen von malignanten Plasmazellen aus biologischen Proben, seien es Flüssigkeits- oder Gewebeproben, anwendbar. Das Spülen von Myelom-Zellen aus einer Flüssigkeitprobe ist Teil der Erfindung und kann praktisch ausgeführt werden, indem eine biologische Flüssigkeit, von der vermutet wird, dass sie malignante Plasmazellen umfasst, mit einem K121-ähnlichen Antikörper in Kontakt gebracht wird, der fähig ist, selektiv an malignante Zellen zu binden und deren Apoptose zu verursachen. Dieses Verfahren kann zum Ausspülen ungewünschter Zellen ex vivo benutzt werden, indem eine biologische Probe von einem Patienten extrahiert wird, die malignanten Zellen durch Apoptose, induziert durch K121-ähnliche Antikörper, eliminiert werden und dann die gespülte Probe in den Patienten zurückgefüllt wird.
Es wird erkannt, dass Verfahren zum Behandeln von multiplem Myelom, die die Verwendung eines K121-ähnlichen Antikörpers beinhalten, in Isolation oder als Zusatz zu bekannten Regimes der Chemotherapie oder Radiotherapie durchgeführt werden können. Zum Beispiel kann die Behandlung mit K121-ähnlichem Antikörper in Verbindung mit oder nach der Behandlung mit Arzneimitteln wie beispielsweise Melphalan oder Cyclophosphamid durchgeführt werden.
Damit die vorliegende Erfindung klarer verständlich ist, werden bevorzugte Formen mit Bezug auf die folgenden nichtbegrenzenden Beispiele beschrieben.
BEISPIEL 1: Bewertung der Zytotoxizität
Die zytotoxische Aktivität von mAb K121 wurde unter Verwendung des CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit (Promega) eingeschätzt, welches Lactat-Dehydrogenase (LDH), freigesetzt in den Überstand von Zellen während der Zell-Lyse, misst. HMy2 (KMA-positiv) und K562 (KMA-negativ) Zellen wurden von Vorratskulturen geerntet und mit 1 × 10⁶ Zellen/ml in 2 × RPMI, ergänzt mit 5% FBS, resuspendiert. Aliquots von 3 × 10⁴ Zellen wurden in individuelle Vertiefungen einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. K121 mAb mit Konzentrationen von 2,5, 5,0, 7,5, 10, 12,5 μM wurde in doppelter Ausführung in einem Volumen von 30 μl in geeignete Vertiefungen gegeben. Nach 20 h Inkubation bei 37°C in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ wurde der Überstand aus jeder Vertiefung gesammelt und mit 3000 g für 1 min zentrifugiert. Der geklärte Überstand (50 μl) wurde in eine andere Mikrotiterassay-Platte mit 96 Vertiefungen überführt und mit einem gleichen Volumen von Substrat gemischt. Die Platte wurde bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 min inkubiert und die Reaktion mit 50 μl Stoplösung gestoppt. Extinktionswerte wurden auf einem Mikroelisa-Plattenlesegerät Organon Teknika (Turnhout, Belgien) bei 492 nm gemessen. Kulturmedium (1 × RPMI, ergänzt mit 2,5% FBS) allein wurde als Hintergrudkontrolle eingeschlossen, weil FBS und Phenolrot in dem Medium zu scheinbar erhöhten LDH-Niveaus führen können. Für Untersuchungen des Zeitverlaufs wurden HMy2-Zellen mit 12,5 μM von K121 mAb inkubiert und der Kulturüberstand wurde 4, 8, 12, 16 und 20 Stunden nach Zugabe des Antikörpers geerntet.
BEISPIEL 2: Apoptose-Assays
Der Mechanismus der zytotoxischen Aktivität von K121 auf HMy2-Zellen wurde auf zwei Wegen, Annexin-V-Bindung und dem TUNEL-Assay, eingeschätzt. Ein paralleler LDH-Assay wurde während beider Assays ausgeführt, um zu bestätigen, dass Zelltod erfolgte.
Annexin-V-Bindung. Annexin V ist ein Protein, das spezifisch an Phosphotidyl-Serin in der Zellmembran bindet. Bindung erfolgt, sobald die Membran begonnen hat zusammenzubrechen, und das Phospholipid „flippt aus" in das extrazelluläre Medium. Infolgedessen misst dieses Verfahren das früheste Stadium der Apoptose. Das Verfahren der Annexin-V-Bindung wird kurz beschrieben. HMy2-Zellen wurden von Vorratskulturen geerntet und in 1 × RPMI, ergänzt mit 5% FBS zu einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml, resuspendiert. Fünfhundert-Mikroliter-Aliquots von Zellen wurden in eine Gewebekulturplatte mit 6 Vertiefungen gegeben. Ein gleiches Volumen von K121 mAb mit einer Konzentration von 10,7 μM wurde zu den Zellen gegeben und das Assay-Gefäß bei 37°C in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert. Für die negative Kontrolle wurde ein gleiches Volumen von PBS hinzugegeben. Die Zellen wurden durch Zentrifugation aus den Vertiefungen bei t = 16 und 20 h geerntet. Ein Aliquot des Überstands wurde dem Assay für extrazelluläre LDH unterzogen und das Zellpellet wurde in Bindungspuffer (10 mM HEPES, 140 mM NaCl and 2,5 mM CaCl₂·2H₂O) gewaschen. Gewaschene Zellen wurden in 100 μl Bindungspuffer resuspendiert und mit 2 μl Annexin-V-FITC (Bender MedSystems, Wien, Österreich) für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Zusätzliche 400 μl Bindungspuffer wurden hinzugegeben und die Zellen mit 1 μl von 1 mg/ml Propidiumiodid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) auf Eis für 15 min gegengefärbt. Die Zellen wurden dann durch Durchflusszytometrie unter Verwendung eines FACScan (BD) analysiert.
TUNEL-Assay. In den Endstadien der Apoptose macht die chromosomale DNA ein charakteristisches Muster der Fragmentierung durch. Der TUNEL-Assay stützt sich auf ein terminales Transferase-Enzym, um die 3'-Enden der fragmentierten DNA zu markieren. Daher ist dieser Assay ein Maß für die Endstadien der Apoptose. Kurz gesagt wurden Vertiefungen in doppelter Ausführung, die HMy2-Zellen in Anwesenheit von K121/oder PBS enthielten, eingerichtet und inkubiert, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben ist. Der Assay der TdT-vermittelten dUTP-nick-end-Markierung (TUNEL) wurde unter Verwendung des Apoptosis Detection System Fluorescein (Apoptose-Nachweissystem mit Fluorescein) (Promega, Madison, W1) durchgeführt. Die Zellen wurden vorbereitet und der Assay wie von den Herstellern beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt wurden die Zellen in PBS gewaschen und mit 10% Formaldehyd und nachfolgend 70% Alkohol fixiert. Intrazelluläre DNA wurde enzymatisch mit Fluorescein-12-dUTP an dem 3'-Ende markiert und auf dem FACScan analysiert.
BEISPIEL 3: SCID-Mäusetumor-Modell
Um die potentiellen anti-Tumor-Wirkungen von K121 in vivo einzuschätzen, wurden 6 Wochen alten SCID-Mäusen am Tag 0 intraperitoneal (i. p.) HMy2-Zellen injiziert. Anschließend an die Injektion von Tumorzellen wurde den Mäusen entweder K121-Antikörper oder PBS durch i. p.-Injektion verabreicht. Da HMy2-Zellen humanes IgG sekretieren, wurde Fortschreiten des Tumorwachstums durch Quantifizierung von humanem IgG in dem Serum von Empfängermäusen unter Verwendung eines für humanes IgG spezifischen Immunoassays überwacht.
BEISPIEL 4: Quantifizierung von humanem IgG
Ein Enzym-verknüpfter Immunosorbent-Assay (ELISA) wurde verwendet, um die Spiegel von humanem IgG in den Seren von SCID-Mäusen zu quantifizieren. Protein A in PBS-Az (50 μl/Vertiefung von 100 μg/ml) wurde in einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Die Vertiefungen wurden 3 Mal mit PBS-Az gewaschen und nichtspezifische Bindungsstellen wurden mit 3% BSA in PBS-Az bei 37°C für 1 Stunde blockiert. Die Vertiefungen wurden zweimal in PBS-Az gewaschen und bei 37°C für 1 Stunde mit 50 μl/Vertiefung von Mäuseserum, verdünnt 2,5-fach mit 1% BSA in PBS-Az, inkubiert. Nach 3 Waschungen mit PBS-Az wurden die gebundenen Antikörper mit 50 μl/Vertiefung antihumaner κ-leichter Kette von der Ziege, AP-konjugiert (1:1000 Verdünnung in 1% BSA-PBS-Az) bei 37°C für 1 Stunde, nachgewiesen. Die gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe wurden durch die Zugabe von p-Nitrophenylphosphat-(pNPP)-Substrat (50 μl/Vertiefung mit 1 mg/ml) in ELISA-Substratpuffer (0,1 M Glycin, 1 mM MgCl₂, 1 mM ZnCl₂, pH 10,4) nach 2 Waschungen in PBS-Az, einer in MilliQ-Wasser und einer in ELISA-Substratpuffer, visualisiert. Die Farbe wurde bei Raumtemperatur für 10 min entwickelt und die Reaktion wurde durch die Zugabe von 3 M NaOH (50 μl/Vertiefung) gestoppt. Die Extinktion wurde bei 405 nm unter Verwendung eines Mikroelisa-Plattenlesegeräts Organon Teknika (Turnhout, Belgien) bestimmt.
Für die Quantifizierung von humanem IgG wurde eine Standardkurve in den Assay eingeschlossen. Mäuseserum wurde mit seriellen Verdünnungen von gereinigtem humanem IgG1 kappa (6 μg/ml–6 ng/ml; Serotec Ltd, Oxford, England) ersetzt.
BEISPIEL 5: Inkubation mit K121 führt zum Tod von Antigen-tragenden Zellen
Inkubation von HMy2- und K562-Zellen mit K121 enthüllte, dass das mAb spezifischen Zielzellentod in einer sowohl zeit- als auch konzentrationsabhängigen Weise induziert (1). Die zytotoxische Aktivität von K121 wurde zuerst ungefähr 12 h nach Zugabe zu der Zielzellkultur nachgewiesen und das Niveau des Zelltodes vergrößerte sich über die folgenden 8 h. Die zytotoxische Wirkung von K121 war maximal bei einer Endkonzentration von 3,6 μM, wobei signifikante Zytotoxizität bei 2,5 μM nachgewiesen wurde. Die beobachtete zytotoxische Aktivität von K121 erfolgte in Abwesenheit von hinzugegebenen zusätzlichen Effektorzellen oder Serumkomponenten (d. h. Komplement).
HMy2-Zellen, inkubiert in Anwesenheit oder Abwesenheit von K121, wurden mit 200× Vergrößerung unter einem umgekehrten Lichtmikroskop beobachtet. Gleichzeitige Untersuchungen von HMy2-Zellen, inkubiert mit einem scFv-mel-Immuntoxin (Dunn, RD., et al., (1996) Immunotechnology 2: 229) wurden ausgeführt. Zellen, inkubiert mit K121 mAb, zeigten Anzeichen von Zellschrumpfung und Membran-"Bläschenbildung". Im Gegensatz dazu verursachte das scFv-mel Klumpen der Zellen und Membran-Lyse.
Durchflusszytometrische Analyse von K121-behandelten HMy2-Zellen zeigte eine Zunahme in den 90°-Lichtstreueigenschaften, verglichen mit unbehandelten Zellen (2), welche eine Zunahme in der innerlichen Körnigkeit und Chromatin-Kondensation in den Antikörper-behandelten Zellen widerspiegelt. Es gab eine begleitende Abnahme in den vorwärts-Lichtstreueigenschaften von Antikörper-behandelten Zellen, welche ein Anzeichen von Zellschrumpfung ist. Die Kombination von vergrößerter Körnigkeit, Chromatin-Kondensation und Zellschrumpfung, gezeigt durch die K121-behandelten Zellen, ließ darauf schließen, dass diese Zellen als Ergebnis der Induktion von Apoptose sterbend waren.
BEISPIEL 6: Die Wechselwirkung von K121 mit Zielzellen induziert Apoptose
Zwei unabhängige Assaysysteme wurden verwendet, um den Mechanismus zu bestimmen, durch welchen K121 Antigen-tragende Zellen tötet. Apoptose im frühen Stadium wurde durch die Bindung von Annexin V an K121-behandelte Zellen bewertet. Immunofluoreszenzfärbung mit Annexin-V-FITC enthüllte eine zunehmende Anzahl von positiv gefärbten HMy2-Zellen 16 und 20 h nach initiierender Behandlung mit K121, verglichen mit nicht-Antikörper-behandelten Zellen (3a). Der zunehmende Prozentgehalt von Annexin-V-gefärbten Zellen korrelierte mit einem vergrößerten Anteil von toten Zellen, wie durch Färben mit Propidiumiodid (3a) und Austreten von LDH (3b) bestimmt wurde.
Die Analyse der DNA-Fragmentierung, ein Vorgang im späten Stadium von Apoptose, wurde unter Verwendung des TUNEL-Verfahrens bewertet. Die Verschiebung der Fluoreszenz, beobachtet in HMy2-Zellen, inkubiert mit K121, war signifikant nach 16 und 20 Stunden Inkubation, wenn mit unbehandelten Zellen verglichen wurde (4a), und ist typisch für das mit Apoptose verbundene DNA-Fragmentierungsschema. Wiederum korrellierte die Messung von Apoptose mit einer zunehmenden Anzahl von toten Zellen, wie sie durch Austreten von LDH bestimmt wurde (4b). Wenn zusammengenommen zeigen diese Werte, dass K121-behandelte Zellen Apoptose durchmachen.
BEISPIEL 7: K121 verhindert das Wachstum von HMy2-Tumorzellen in Mäusen
SCID-Mäusen, die 10⁷ HMy2-Zellen am Tag 0 erhalten hatten, wurden entweder 3 aufeinander folgende Dosen von K121 (jeweils 1,25 mg) (n = 6) oder scFv-mel (jeweils 0,5 mg) (n = 7) an den Tagen 1, 2 und 3 oder PBS (jeweils 1,25 mg) (n = 6) als Behandlungskontrolle verabreicht. Blutproben wurden vor der Verabreichung der Tumorzellen und in wöchentlichen Intervallen nach der Injektion von Tumorzellen genommen, und das Wachstum von HMy2-Zellen wurde durch das Erscheinen von humanem IgG in dem Serum der Tiere überwacht. In den PBS-behandelten Kontrollmäusen wurde humanes IgG in dem Serum von 6/6 Tieren nachgewiesen (5a), wobei die Zeit für den anfänglichen Nachweis von humanem IgG von 3 Wochen bis 8 Wochen nach der Injektion von Tumorzellen reichte. Ähnlich zeigten Mäuse, behandelt mit einem Immuntoxin, umfassend das zytolytische Peptid Melittin, verknüpft mit einem K121-scFv-Fragment (scFv-mel), erhöhte Spiegel von humanem IgG 3 Wochen nach der Injektion von Zellen (5b). Im Gegensatz dazu wurde humanes IgG in dem Serum von K121-behandelten Tieren über den gleichen Zeitraum nicht nachgewiesen (5c). Im allgemeinen zeigten die PBS- und scFv-mel-behandelten Tiere abdominale Schwellung, wurden lethargisch und nach 9 Wochen waren 5/6 Mäuse gestorben. Mit K121 behandelte Mäuse zeigten diese Symptome nicht und alle waren in der Woche 9 am Leben, zu welcher Zeit eine Maus aus dieser Gruppe zusammen mit dem überlebenden Tier aus der Kontrollgruppe getötet und seziert wurde. Das K121-behandelte Tier hatte keine groben Organabnormalitäten. Das unbehandelte Tier jedoch hatte eine große Tumormasse in der Abdominalhöhle, eine vergrößerte Milz und Schwund der Lungen. Gewebeproben von beiden Tieren werden gegenwärtig durch immunozytochemische Techniken auf HMy2-Infiltration untersucht. Diese Studien demonstrierten klar, dass K121 allein fähig ist, das Wachstum von humanen Lymphoblastoid-Tumorzellen in einem Modell mit immunschwachen (SCID) Mäusen zu verhindern.
In einem zweiten Beispiel erhielten SCID-Mäuse, denen 10⁷ HMy2-Zellen am Tag 0 injiziert wurden, variierende Dosierungsmengen von K121 an den Tagen 1, 2 und 3 wie folgt:
Gruppe 1; PBS-Kontrolle (n = 6)
Gruppe 2; 1,0 mg K121 pro Dosis. Gesamtantikörperdosierung, 3,0 mg (n = 6)
Gruppe 3; 0,5 mg K121 pro Dosis. Gesamtantikörperdosierung, 1,5 mg (n = 6)
Gruppe 4; 0,1 mg K121 pro Dosis. Gesamtantikörperdosierung, 0,3 mg (n = 6)
Gruppe 5; 0,05 mg K121 pro Dosis. Gesamtantikörperdosierung, 0,15 mg (n = 6)
Das Fortschreiten des Tumors wurde durch Quantifizierung von humanem IgG in dem Serum der Mäuse überwacht.
Alle unbehandelten Mäuse entwickelten erhöhte Spiegel von humanem IgG bis zum Tag 28 (6) und die Mehrheit (4/5) von dieser Gruppe starb bis zum Tag 42 (7). Postmortale Untersuchung enthüllte vergrößerte Milzen und makroskopische Tumore in Leber und Niere. Tumor tragende Mäuse, behandelt mit K121, zeigten entweder verzögertes Einsetzen des Fortschreitens von Tumor oder vollständige Abwesenheit von Tumorwachstum, wie durch Spiegel von humanem IgG im Serum (6 und 8) und postmortale Untersuchung bei Beendigung des Experiments am Tag 56 angezeigt wurde. Über die 4 Behandlungsgruppen zeigten 7 von 24 Mäusen nicht nachweisbare Spiegel von humanem IgG in ihrem Serum am Tag 42 (8). Sechs von diesen Mäusen zeigten keine groben Anzeichen von Tumorwachstum bei postmortaler Untersuchung am Tag 56. Alle unbehandelten Mäuse starben oder wurden aus ethischen Gründen am Tag 49 euthanasiert, während 13/24 Mäuse in den Antikörper-Behandlungsgruppen bis zum Tag 56 überlebten (7).
Zusammenfassend gesagt reagierten Tumor tragende Mäuse auf K121-Behandlung in einer dosisabhängigen Weise. Vollständige Abwesenheit von Tumorwachstum am Tag 42 war bei 30% der Mäuse offensichtlich, wobei diese Wirkung bei den Mäusen am ausgesprochensten war, die eine Gesamtdosierung von 1,5 mg K121 erhielten (8). Das Tumorwachstum war schnell und aggressiv bei unbehandelten Mäusen mit 100% Mortalität bis zum Tag 49 (7). An diesem Zeitpunkt zeigten die vereinigten Behandlungsgruppen eine Mortalität von weniger als 10%.
BEISPIEL 8: Synthese eines K121-ähnlichen Antikörpers durch Oligonucleotidzusammenbau unter Verwendung von PCR
Ein Beispiel der Strategie, die verwendet wird, um einen monoklonalen Antikörper durch Extension von synthetischen Oligonucleotiden unter Verwendung der PCR zu erzeugen, ist kürzlich in der Literatur beschrieben worden (Sato et al. (1994) Molecular Immunology 31 (5): 371). Um einen K121-ähnlichen monoklonalen Antikörper aus der veröffentlichten DNA-Sequenz (wie in 9a gezeigt) zu erzeugen, kann das VH-Gen in sechs überlappende Oligonucleotide VH1–VH6 geteilt werden (9b). In ähnlicher Weise kann das K121-VL-Gen in sechs überlappende Oligonucleotide VL1–VL6 geteilt werden (9c). Drei von den VH-Oligonucleotiden würden die sense-DNA-Sequenz haben (9d, VH1, 3 und 5) und drei würden die anti-sense-DNA-Sequenz haben (9d, VH2, 4 und 6). Ähnlich würden drei von den VL-Oligonucleotiden die sense-DNA-Sequenz haben (9e, VL1, 3 und 5) und drei würden die antisense-DNA-Sequenz haben (9e, VL2, 4 und 6).
Die erste PCR unter Verwendung einer Taq-Polymerase werde die drei Gruppen von Oligonucleotiden zusammenbauen, um drei doppelsträngige DNA-Fragmente zu erzeugen (9f). Die drei Produkte der ersten Amplifikation würden dann Gel-extrahiert werden und die isolierten DNA-Fragmente würden als Template zum Zusammenbauen der vollen Gensequenz unter Verwendung einer Taq-Polymerase verwendet werden. In dem ersten Zusammenbau des VH-Gens würde ein PCR-Primer, komplementär zu der 5'-Region des Gens (VHF), und ein antisense-Primer, komplementär zu der 3'-Region des Gens (VHR), verwendet werden, um die vollständige K121-VH-Gensequenz zu erzeugen. Ähnlich sollten PCR-Primer zur 5' (VLF) und 3' (VLR) Region des VL-Gens zur Amplifikation des vollständigen K121-VH-Gens verwendet werden. Die finalen Genprodukte sollten sequenziert werden, um die Anwesenheit und genaue Übereinstimmung der vollen V-Gene zu bestätigen.
Das synthetisierte K121-VH- und -VL-Gen sollte dann in einen Säugerexpressionsvektor ligiert werden, der die relevanten Gene der murinen Ig-konstanten Region enthält; Cγ1 für die schwere Kette und Cκ für die leichte Kette. Eine Säugerzelllinie sollte dann mit den resultierenden Vektoren transfiziert werden und die Expression von funktionellem K121 sollte durch Immunoassay überwacht werden, wie für den chimären Antikörper beschrieben ist.
BEISPIEL 9: Konstruktion des chimären Antikörpers, cK121
Isolation von K121-VH- und -VL-Gen
Die Gene der variablen Region der schweren Kette (K121 VH) und der leichten Kette (K121 VL) des monoklonalen Antikörpers, K121, wurden durch PCR isoliert. Das Templat zur Amplifikation des VH- und VL-Gens war das scFv-mel-Genkonstrukt. PCR-Primer (10), die zur Amplifikation verwendet wurden, waren gestaltet, um kompatible Restriktionsstellen für gerichtetes Klonieren in die Säugerexpressionsvektoren pCMV-γ1 und pCMV-KR einzuführen (Makler et al. (1997) Immunotechnology 3: 31).
Die Produkte der PCR-Amplifikation wurden durch Elektrophorese auf einem 1%-Agarosegel getrennt und die DNA-Banden der erwarteten Größe wurden unter Verwendung eines QIAquick Gel-Extraktions-Kits (Qiagen, Deutschland) extrahiert. Die isolierten Genfragmente wurden dann in den pGEM-T-Vektor ligiert und in kompetente Bakterienzellen, JM109 (Promega, USA), transformiert. Nach Inkubation über Nacht identifizierte PCR-Screening unter Verwendung von Vektor-spezifischen Primern (M13) die ein Insert enthaltenden Kolonien. Positive Klone von VH und VL wurden gewählt und Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Kits Wizard Mini-prep (Promega, USA) hergestellt. Zwei Klone, die VH und VL darstellten, wurden auf einem ABI-automatisierten DNA-Sequenzer von dem Sydney University Prince Alfred Macromolecular Analysis Centre (SUPAMAC) sequenziert. Die DNA-Sequenzen von K121 VH und VL waren mit den in 9a gezeigten identisch, wobei die zusätzlichen Restriktionsenzym-Stellen und Nucleotide in die PCR-Primer eingebracht waren (10).
Ligation von K121 VH und VL in den Expressionsvektor
Die Gene für K121 VH und VL wurden aus pGEM-T-Klonen unter Verwendung der Restriktionsenzyme BamHI und ApaLI restriktionsverdaut. Die restriktionsverdauten VH- und VL-Inserte wurden durch Gelextraktion gereinigt. Eine Leadersequenz für die schweren und leichten Ketten wurde durch Restriktion von pCMV-γ1 mit ApaLI und HindIII und nachfolgende Gelextraktion des Leadersequenzinserts isoliert. Die Hind-III- und Apa-LI-verdaute Leadersequenz wurde gleichzeitig mit dem K121-VH- und -VL-Gen in restriktionsverdaute Hind-III- und Bam-HI-pCMV-γ1 bzw. pCMV-KR ligiert. Nach Transformation in kompetente JM109-Zellen wurden Inserte enthaltende Kolonien durch PCR unter Verwendung der VH- und VL-Gen-spezifischen Primer gescreent. Plasmid-DNA wurde aus positiven Klonen hergestellt und die Inserte wurden durch Restriktionsenzymverdauung mit BamHI und HindIII bestätigt. In diesem Stadium sollten die pCMV-γ1-cVH- und pCMV-KR-cVL-Plasmide unter Verwendung von Vektor-spezifischen Primern sequenziert werden, um die korrekte K121-VH- und -VL-DNA-Sequenz zu bestätigen.
Transfektion von Expressionsplasmiden in CHO-Zellen
CHO-K1 (Chinese Hamster Ovarian (vom Eierstock des chinesischen Hamsters)) Zellen wurden in DMEM/F12-Medium mit 10% FBS (Sigma Aldrich, USA) gezüchtet und bei 37°C in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert. Eine Gesamtmenge von 5 μg der Plasmidzubereitungen, pCMV-γ1-cVH und pCMV-KR-cVL, wurde mit 4 × 10⁶ CHO-Zellen in 200 μl RPMI-Medium (Sigma Aldrich, USA), ergänzt mit 10% FBS und 2 mM L-Glutamin (Trace Biosciences, NSW), inkubiert. Das Zell/DNA-Gemisch wurde in einer Küvette plaziert und Elektroporation wurde in einem Gene Pulser (Gen-Elektroporator) (BioRad, USA) mit den folgenden Einstellungen ausgeführt; Widerstand 100 Ohm, Volt 0,3, Kapazität Ext 960 μFD und Zeitkonstante 33–38 ms. Danach wurden die Zellen in 10 ml DMEM/F12-Medium mit 10% FBS überführt und für 48 h bei 37°C in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ gezüchtet. Die Auswahl von transfizierten Zellen wurde unter Verwendung des Neo-Selektionsmediums, enthaltend 400 μg/ml G418-Antibiotikum (GENETICIN, Sigma Aldrich, USA) in DMEM/F12, durchgeführt. Nach 3 Tagen wurde der Kulturüberstand ausgetauscht und die Zellen wurden in 150-cm²-Gewebekulturkolben expandiert. Nach 7 Tagen im Selektionsmedium wurde die Expression von cK121 durch zwei gesonderte ELISAs bewertet.
BEISPIEL 10: Bewertung des exprimierten chimären Antikörpers, cK121
Die Verfahrensweise für den ELISA wurde wie ausführlich in Beispiel 4 beschrieben mit einigen Veränderungen in speziellen Reagenzien ausgeführt. Kurz gesagt wurde, um die Expression eines chimären Antikörpers, enthaltend die humane Fc-Region, zu bestimmen, ein ELISA durchgeführt, indem die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen mit antihumanem IgG, IgA und IgM von der Ziege beschichtet wurden (50 μl/Vertiefung von 10 μg/ml). Konditioniertes Medium von den transfizierten CHO-Zellen wurde dann in den Vertiefungen inkubiert, gefolgt von einem anti-humanem (Fc-spezifischen) AP-Konjugat von der Ziege und Farbentwicklung mit dem Substrat pMPP (Sigma Aldrich, USA). Eine Standardkurve für den ersten ELISA wurde unter Verwendung serieller Verdünnungen von humanem IgG1 kappa (6 μg/ml–6 ng/ml) hergestellt. Parallel wurde geklärter Überstand von transfizierten CHO-Zellen serieller Verdünnung unterworfen und die Proben wurden analysiert (11a). Eine Verdünnungskurve ähnlich der Standardkurve wurde für die cK121 exprimierenden CHO-Zellen erhalten. Die geschätzte Konzentration von cK121 in dem konditionierten Medium der CHO-Zellen war 6 ng/μl.
Ein zweiter ELISA wurde ausgeführt, um die Bindung des exprimierten Antikörpers an das Antigen, speziell erkannt von K121, zu demonstrieren. Die Vertiefungen der zweiten Assay-Platte wurden mit humanen freien kappa-leichten Ketten beschichtet (50 μl/Vertiefung von 100 μg/ml Lösung). In dem zweiten ELISA zeigte geklärter CHO-Zellüberstand Bindung an humane freie kappa-leichte Ketten über einen Bereich von Probenverdünnungen (11b). Durch Vergleich wurde keine Bindung für konditioniertes Medium von untransfizierten CHO-Zellen beobachtet.
BEISPIEL 11: Reinigung von cK121
Die Reinigung von cK121 wurde durch Ausfällung von Proteinen mit Ammoniumsulfat in dem konditionierten CHO-Zellmedium (1,4 Liter) ausgeführt. Nach extensiver Dialyse des resolubilisierten Proteins in PBS-Az wurde die Probe der Affinitätsreinigung auf Protein-A-Agarose (Sigma Aldrich, USA) unterworfen. Verdünnte Proben wurden in PBS pH 7,4 dialysiert, auf einer Amicon-Rührzelle (Millipore, USA) eingeengt und filtersterilisiert (Minisart RC15, 0,2 μm, Sartorius, AG). Die Konzentration von cK121 wurde unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 14 mit einer Extinktion von 280 nm abgeschätzt.
BEISPIEL 12: Zytotoxizität von cK121 auf HMy2- und K562-Lymphoblastoid-Zellen
Die Zytotoxizität von cK121 auf HMy2- und K562-Lymphoblastoid-Zellen wurde unter Verwendung des Assays mit Austreten von zytoplasmatischer LDH wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Der gereinigte cK121 zeigte signifikante zytotoxische Aktivität gegen Antigen-positive HMy2-Zellen und reagierte nicht mit der nicht-Antigen-tragenden Zelllinie, K562 (12). Diese Ergebnisse zeigen an, dass cK121 die Fähigkeit, Zelltod in der Zielzelllinie zu induzieren, bewahrt hat. Um zu bestätigen, dass der Mechanismus von Zelltod Apoptose ist, sollten die in Beispiel 2 beschriebenen Assays auf HMy2-Zellen unter Verwendung von gereinigtem cK121 durchgeführt werden.
BEISPIEL 13: Auswahl von stabilen cK121 sekretierenden Zellen
Herstellung von cK121 in großem Maßstab erfordert Auswahl einer Zelllinie, die in Abwesenheit von Selektionsantibiotikum, G418, zu stabiler Antikörper-Sekretion fähig ist. Daher wurden Klone aus den Vertiefungen, die positive Ergebnisse in beiden ELISAs (A 405 nm > 0,2) erzeugten, ausgewählt und durch begrenzende Verdünnung kloniert. Anschließend wurden CHO-Zellen von einzelnen Klonen, die imstande waren, sekretierten cK121 zu erzeugen, in DMEM-F12 ohne das Antibiotikum gezüchtet. Zellen, die in Abwesenheit von Antibiotikum fortfuhren, cK121 zu sekretieren, wurden als stabile cK121 erzeugende Zelllinien ausgewählt. Konditioniertes Medium von cK121-CHO-Zelllinien wurde durch Immunoassay wie in Beispiel 9 beschrieben bewertet und die erzeugte Menge von Antikörper wurde aus der Standardkurve von humanem IgG 1 kappa bestimmt. 13 zeigt 5 positive Klone, die für zukünftige Expression ausgewählt wurden (Klone 1–5). Ein negativer Klon wurde als Kontrollprobe eingeschlossen.
Um weitere funktionelle Untersuchungen an den in Beispiel 13 erzeugten cK121-Klonen auszuführen, kann ein Experiment mit Expression in großem Maßstab durchgeführt werden. Der cK121 kann gereinigt werden und Experimente mit in-vivo-Tier-Untersuchung können durchgeführt werden.
BEISPIEL 14: Strategie zur Humanisierung des Gens der variablen Region der leichten Kette (VL) von K121 unter Verwendung einer Region des Vκ-humanen VL-Gerüsts
Ein schematischer Überblick über die zur Humanisierung von K121 VL verwendete PCR-Verfahrensweise ist in 14a abgebildet. Die humane Region des VL-Gerüsts (hVL) wurde früher identifiziert und aus cDNA isoliert, indem eine früher beschriebene, auf PCR basierende Strategie (Asvadi, PhD Thesis, UTS, 1998) verwendet wurde. Plasmid-DNA von einem einzigen Klon, enthaltend das hVL-Gen, wurde sequenziert und wird in 14b mit der DNA-Sequenz von K121 VL verglichen. DNA-Sequenz, gezeigt in Fettdruck, kodiert die Komplementarität bestimmenden Regionen (CDR's) von K121. Die Oligonucleotide, die verwendet werden, um die DNA-Sequenz für CDR1, CDR2 und CDR3 von K121 in die Gerüstregion von hVL einzubringen, werden in 14c gezeigt. Die Gerüstregion, die die K121-CDR2 enthält, kann von hVL durch Verdauung der Gene mit dem Restriktionsenzym Age1 unterschieden werden und die Restriktionsstelle wird in dem PCR-Primer VLC gezeigt.
PCR-Amplifikation
Wie in 14a gezeigt war das Templat für PCR-Amplifikation das hVL-Gen, und die Reaktionen in der ersten PCR wurden unter Verwendung der Primer-Paare VLA + VLE, VLB + VLF, VLC + VLG und VLD + VLH ausgeführt. Amplifikation der vier Fragmente wurde unter Verwendung des Kits TITANIUM Taq PCR (Clontech, CA) ausgeführt. Die Produkte aus jeder Reaktion wurden durch Agarosegelelektrophorese mit Ethidiumbromid visualisiert und durch Gelextraktion (Promega, MA) isoliert. Eine zweite PCR wurde ausgeführt, um die vier amplifizierten Fragmente zusammenzubauen. Das resultierende amplifizierte Produkt hatte ungefähr 380 bp. Die DNA-Bande wurde Gel-extrahiert und in den Vektor pGEM-T entsprechend dem Protokoll, empfohlen durch den Hersteller (Promega, MA), ligiert. Ein Aliquot des Ligationsgemisches wurde in wärmekompetente JM109-Zellen transformiert und Proben wurden auf LB-amp-Platten ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden einzelne Kolonien ausgesucht und über Nacht in SOC-Medium entsprechend dem Protokoll (Promega, MA) gezüchtet. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines DNA-Reinigungssystems Wizard Plus Miniprep isoliert. Zehn Klone wurden entsprechend der empfohlenen Verdauungsprozedur (Promega, MA) der Verdauung mit den Restriktionsenzymen Age1 und BamH1 unterworfen. Produkte aus der Verdauung wurden auf einem Ethidiumbromid enthaltenden 1%-Agarosegel visualisiert. Ein einzelner Klon, der ein DNA-Fragment von ungefähr der korrekten Größe erzeugte, sollte sequenziert werden, um zu bestätigen, dass das Insert das modifizierte VL-Gen enthält. Das humanisierte K121-VL-Gen sollte dann in den Säuger-Expressionsvektor pCMV-KR ligiert werden, wie in Beispiel 9 beschrieben ist.
BEISPIEL 15: Humanisierung des Gens der variablen Region der schweren Kette (VH) von K121 unter Verwendung eines Gens des humanen VH3-Gerüsts
Das humane Gen der variablen Region der schweren Kette, hVH, wurde isoliert und kloniert, indem eine PCR-Strategie verwendet wurde, wie sie in Beispiel 14 beschrieben ist. Bin pGEM-T-Plasmid, enthaltend das hVH-Gen, wurde als Templat für die Verfahrensweise des QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit verwendet (15a). Primer, die verwendet wurden, um die drei CDR's aus K121 VH in das hVH-Gerüst einzubringen, sind in 15b abgebildet. Nach jeder Runde von Mutagenese sollte das Plasmid sequenziert werden, um zu bestätigen, dass die DNA-Sequenz korrekt ist. Das humanisierte K121-VH-Gen sollte dann in den Säuger-Expressionsvektor pCMV-γ1 ligiert werden, wie in Beispiel 9 beschrieben ist.
DISKUSSION
Die hier ausführlich beschriebenen Experimente demonstrieren, dass der marine monoklonale Antikörper K121 Zelltod in einer humanen Lymphoblastoid-Zelllinie, HMy2, in Abwesenheit von irgendwelchen zusätzlichen Effektorzellen oder zugesetzten Serumkomplementproteinen induziert. Wir haben früher gezeigt, dass HMy2-Zellen ein Antigen, KMA, exprimieren, welches von K121 erkannt wird. Wenn HMy2-Zellen mit K121 allein bei einer Konzentration von 3,6 μM inkubiert wurden, erfolgte signifikanter Zelltod, wie durch die Freisetzung von intrazellulärer LDH angezeigt wurde (1).
Die Spezifik der zytotoxischen Aktivität von K121 wird durch die Tatsache demonstriert, dass Behandlung einer KMA-negativen Zelllinie, K562, nicht zu signifikantem Zelltod führte (1).
Mikroskopische Beobachtung von HMy2-Zellen, inkubiert in Anwesenheit oder Abwesenheit von K121, zeigte an, dass Zelltod in Anwesenheit von K121 erfolgte. In Anwesenheit von K121 schienen die Zellen zu schrumpfen und es gab Anzeichen von Membran-"Bläschenbildung". Diese Auswirkungen sind typisch für Zellen, die einen Prozeß, bezeichnet als programmierter Zelltod oder Apoptose, durchmachen (Kerr, JFK, et al. (1972) Br J Cancer 26: 239). Im Gegensatz dazu führte die Inkubation von HMy2-Zellen mit dem Immuntoxin scFv-mel zu Zellverklumpen und Membranlyse. Offensichtlich war das Aussehen von Zellen, inkubiert mit K121, verschieden von dem derjenigen, inkubiert mit dem Immuntoxin, scFv-mel. Diese vorbereitenden Beobachtungen lassen darauf schließen, dass der Mechanismus, der unter Verwendung von K121 zu Zelltod führt, verschieden von der zytotoxischen Wirkung von scFv-mel ist.
Analyse der Lichtstreueigenschaften von HMy2-Zellen, die K121-induzierten Zelltod durchmachten, enthüllte Veränderungen in der inneren Struktur und Größe der Zellen, die konsistent mit Apoptose waren (2). Diese Interpretation des Mechanismus, durch welchen K121 Zielzellen tötet, wurde durch zwei gesonderte Assays zur Apoptose bestätigt, die frühe bzw. späte Stadien des Prozesses messen (3 & 4). So induziert K121 in Abwesenheit von irgendwelchen exogenen Faktoren Apoptose in KMA-tragenden Zellen in vitro. Weiterhin verhindert K121 das Wachstum von Tumorzellen in vivo. Verabreichung von K121 an Mäuse, die eine Tumor-induzierende Dosis von HMy2-Zellen erhalten hatten, verhinderte Tumorwachstum, wie durch die Anwesenheit von humanem IgG im Serum der Empfängermaus gemessen wurde (5). Tumorwachstum wurde bei allen Mäusen in der PBS-behandelten Gruppe beobachtet, wie durch Spiegel von humanem IgG im Serum und grobe Morphologie bei der Sektion angezeigt wurde.
Apoptose ist ein wichtiges biologisches Ereignis, einbezogen in die embryonale Entwicklung und insbesondere die Entwicklung und das Funktionieren des Immunsystems (Mastrangelo AJ. und Betenbaugh M. (1998) TIBTECH. 16: 88). Im Gegensatz zu dem Zelltod, entstehend aus Nekrose, erfolgt Apoptose in Abwesenheit irgendeiner Pathologie und ruft keine entzündliche Reaktion hervor (Kerr, JFR. et al. (1972) Br J Cancer 26: 239). Dies ist eine wichtige Betrachtung im Hinblick auf die Verwendung potentieller therapeutischer Mittel, die Apoptose in Zielzellen auslösen können.
Alle oben erwähnten Publikationen werden hierin im vollem Umfang als Referenz einbezogen. SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verwendung eines Antikörpers, der nicht mit einem Toxin oder einem zytolytischen Mittel konjugiert ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung des Multiplen Myeloms vom kappa-Typ bei einem Subjekt, wobei der Antikörper Myelom-Zellen vom kappa-Typ, die in einer gemischten Zellpopulation vorhanden sind, tötet, und der Antikörper die in SEQ ID Nr. 1 angegebene VH-Region und die in SEQ ID Nr. 3 angegebene VL-Region aufweist oder mit einem Antikörper, der die in SEQ ID Nr. 1 angegebene VH-Region und die in SEQ ID Nr. 3 angegebene VL-Region aufweist, um die Bindung an kappa Myelom Antigen (KMA) konkurriert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament die Apoptose in KMA-tragenden Zellen induziert.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Subjekt zuvor behandelt wurde, um die in einer Flüssigkeit des Subjekts vorhandenen Mengen an freien kappa-leichten Ketten zu reduzieren.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die vorangehende Behandlung eine Plasmapherese umfasst.
Verwendung nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, welche die Behandlung einer hämatopoetischen Vorläufer- Zellpopulation, die aus dem Subjekt entfernt wurde, mit dem Antikörper umfasst.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Subjekt zuvor eine zytoreduktive Therapie erhalten hat.
Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Antikörper die CDR-Loops des Antikörpers, wie in 9a gezeigt, aufweist.
Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Antikörper ein chimärer Antikörper oder ein humanisierter Antikörper ist.
Verfahren zur Behandlung von Myelom-Zellen vom kappa-Typ, bei welchem die Behandlung Myelom-Zellen vom kappa-Typ, die in einer gemischten Zellpopulation vorhanden sind tötet, umfassend das Behandeln einer hämatopoetischen Vorläufer-Zellpopulation, die aus einem Subjekt entfernt wurde, mit einem Antikörper, der nicht mit einem Toxin oder einem zytolytischen Mittel konjugiert ist, wobei der Antikörper die in SEQ ID Nr. 1 angegebene VH-Region und die in SEQ ID Nr. 3 angegebene VL-Region aufweist oder mit einem Antikörper, der die in SEQ ID Nr. 1 angegebene VH-Region und die in SEQ ID Nr. 3 angegebene VL-Region aufweist, um die Bindung an kappa-Myelom-Antigen konkurriert.
Verfahren nach Anspruch 10, bei welchem die Behandlung eine Apoptose in KMA-tragenden Zellen, die in einer gemischten Zellpopulation vorhanden sind, induziert.
Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei der Antikörper die CDR-Loops des Antikörpers, wie in 9a gezeigt, aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei der Antikörper ein chimärer Antikörper oder ein humanisierter Antikörper ist.