DE69201045T2

DE69201045T2 - Restriktionsendonuklease vom Typ II, Apo I, aus Arthrobacter protophormiae und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Info

Publication number: DE69201045T2
Application number: DE69201045T
Authority: DE
Inventors: Keith Lunnen; Carol Polisson; Derek Robinson
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1991-10-25
Filing date: 1992-10-20
Publication date: 1995-08-10
Anticipated expiration: 2012-10-21
Also published as: DE69201045D1; US5200337A; DE539160T1; JPH05219950A; EP0539160A1; EP0539160B1

Description

HINTERGRUND DER BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Typ II-Restriktionsendonuklease, Apo I, erhältlich aus Arthrobacter protophormiae und auf Verfahren zur Herstellung derselben.
Restriktionsendonukleasen sind eine Klasse von Enzymen, die in Bakterien natürlich vorkommen. Wenn sie von anderen kontaminierenden bakteriellen Komponenten gereinigt werden, können Restriktionsendonukleasen im Labor verwendet werden, um DNA-Moleküle in präzise Fragmente zu spalten. Diese Eigenschaft befähigt DNA-Moleküle, eindeutig identifiziert und in ihre Genbestandteile zerlegt zu werden. Restriktionsendonukleasen haben sich als unerläßliche Werkzeuge in moderner genetischer Forschung erwiesen. Sie sind die biochemischen "Scheren", mittels derer genetische Technik und Analysen durchgeführt werden.
Restriktionsendonukleasen wirken durch Erkennung und Bindung an bestimmte Sequenzen von Nukleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang dem DNA-Molekül. Einmal gebunden, spalten sie das Molekül innerhalb oder an einer Seite der Sequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonukleasen haben eine Affinität zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Die Mehrheit der Restriktionsendonukleasen erkennt Sequenzen von 4 bis 6 Nukleotiden in der Länge, obwohl kürzlich eine kleine Zahl von Restriktionsendonukleasen, welche 7 oder 8 eindeutig spezifizierte Nukleotide erkennen, isoliert worden ist. Die meisten Erkennungssequenzen enthalten eine dyadische Symmetrieachse und in den meisten Fällen werden alle Nukleotide eindeutig spezifiziert. Dennoch haben einige Restriktionsendonukleasen degenerierte oder abgeschwächte Spezifitäten (relaxed specificities) insofern, als sie viele Basen an einer oder mehreren Positionen in ihrer Erkennungssequenz erkennen, und einige Restriktionsendonukleasen erkennen asymmetrische Sequenzen. Hae III, welches die Sequenz 5' GGCC 3' erkennt, ist ein Beispiel einer Restriktionsendonuklease, die eine symmetrische, nicht degenerierte Erkennungssequenz hat, während Hae II, welches 5' (Pu)GCGC(Py) 3' erkennt, Restriktionsendonukleasen typifiziert, die eine degenerierte oder abgeschwächte Erkennungssequenz aufweisen. Endonukleasen mit symmetrischen Erkennungssequenzen spalten im allgemeinen symmetrisch in oder in Nachbarschaft der Erkennungsstelle, während jene, die asymmetrische Sequenzen erkennen, dazu tendieren, bei einem Abstand von 1 bis 18 Nukleotiden von der Erkennungsstelle zu spalten. Über 125 eindeutige Restriktionsendonukleasen sind unter vielen Tausenden von bakteriellen Spezies identifiziert worden, die bis zum heutigen Tag untersucht wurden.
Bakterien besitzen typischerweise nur eine kleine Zahl von Restriktionsendonukleasen pro Spezies. Die Endonukleasen werden entsprechend der Bakterien, von denen sie erhalten werden, benannt. Somit synthetisiert die Spezies Haemophilus aegyptius beispielsweise drei unterschiedliche Restriktionsendonukleasen, genannt Hae I, Hae II und Hae III. Diese Enzyme erkennen und spalten jeweils die Sequenzen (AT)GGCC(AT), PuGCGCPy und GGCC. Escherichia coli RY13, synthetisiert andererseits nur ein Enzym, EcoR I, welches die Sequenz GAATTC erkennt.
Während man nicht an die Theorie gebunden zu sein wünscht, glaubt man, daß in der Natur Restriktionsendonukleasen eine schützende Rolle in dem Wohlergehen der Bakterienzelle spielen. Sie befähigen Bakterien, widerstandsfähig gegen eine Infektion durch fremde DNA-Moleküle wie Viren und Plasmide zu sein, die sie andererseits zerstören oder parasitieren wurden. Sie verleihen Widerstandsfähigkeit durch Bindung an das infizierende DNA-Molekül und spalten dieses an jeder Stelle, an der die Erkennungssequenz auftritt. Der Abbau hat Inaktivitäten vieler infizierender Gene zum Ergebnis und macht die DNA anfällig für weiteren Abbau durch Exonukleasen.
Eine zweite Komponente von bakteriellen schützenden Systemen sind die Modifikations-Methylasen. Diese Enzyme sind komplementär zu Restriktionsendonukleasen und sie stellen das Mittel zur Verfügung, durch welches Bakterien fähig sind, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikations-Methylasen erkennen und binden an dieselbe Nukleotiderkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuklease, aber statt die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch das eine oder andere Nukleotid innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe. Der Methylierung folgend, wird die Erkennungssequenz nicht länger durch die Restriktionsendonuklease gebunden oder gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle ist durch die Aktivität ihrer Modifikationsmethylase immer ganz modifiziert, und sie ist daher völlig unanfällig gegen die Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuklease. Es ist nur unmodifizierte und daher identifizierbar fremde DNA, die gegenüber der Erkennung und dem Angriff der Restriktionsendonuklease empfindlich ist.
Mehr als 1000 Restriktionsendonukleasen sind aus Bakterienstämmen isoliert worden. Von diesen erkennen mehr als 125 eindeutig Sequenzen, während sich der Rest allgemeine Erkennungsspezifitäten teilt. Restriktionsendonukleasen, welche dieselbe Nukleotidsequenz erkennen, werden als "Isoschizomere" bezeichnet. Obwohl die Erkennungssequenzen von Isoschizomeren dieselben sind, können sie hinsichtlich der Spaltungsstelle (z.B. Xma I v. Sma I, Endow et al., J. Mol. Biol. 112:521 (1977); Waalwijk et al., Nucleic Acids Res. 5:3231 (1978)) und der Spaltungsgeschwindigkeit an verschiedenen Stellen variieren (Xho I v. PaeR7I, Gingeras et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:402 (1983)).
Es gibt einen ständigen Bedarf an neuen Typ II-Restriktionsendonukleasen. Obwohl Typ II-Restriktionsendonukleasen, die eine Zahl von spezifischen Nukleotidsequenzen erkennen, derzeit verfügbar sind, liefern neue Restriktionsendonukleasen, die neue Sequenzen erkennen, größere Möglichkeiten und Fähigkeit zur genetischen Manipulation. Jede neue eindeutige Endonuklease befähigt Wissenschaftler, DNA präzise an neuen Stellen zu spalten, mit allen Möglichkeiten, die dieses bietet.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine neue Restriktionsendonuklease zur Verfügung gestellt, die erhältlich ist aus Arthrobacter protophormiae NEB#723, im folgenden "Apo I" genannt, wobei die Endonuklease:
(1) die Nukleotidsequenz PuAATTPy in einem doppelsträngigen DNA-Molekül, wie unten gezeigt wird, erkennt,
(worin Pu Guanin oder Adenin darstellt, Py Cytosin oder Thymin darstellt, A Adenin darstellt und T Thymin darstellt);
(2) besagte Sequenz in den Phosphodiesterbindungen zwischen dem ersten und zweiten 5'-Basenpaar spaltet, um eine 4-basige 5'-Extension zu bilden, wie mit den Pfeilen gezeigt wird; und
(3) Apo I die folgende Anzahl von Erkennungsstellen in diesen DNAs hat: pUC19 (1), pBR322 (1), phiX174 (7), M13mp18 (11), T7 (13), Lambda (58) und Adeno2 (29).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf Verfahren zur Herstellung der neuen Restriktionsendonuklease Apo I. Ein Verfahren umfaßt die Kultivierung von Arthrobacter protophormiae unter geeigneten Bedingungen zur Expression von Apo I, Sammeln der kultivierten Zellen, Erhalten eines zellfreien Extraktes daraus und Abtrennung und Sammeln der Restriktionsendonuklease Apo I aus dem zellfreien Extrakt. Das andere Verfahren umfaßt Klonierung des Apo I R-M-Systems durch Bildung einer Bibliothek, die die DNA aus Arthrobacter prototphormiae enthält, Isolierung derjenigen Klone, welche DNA enthalten, die für die Apo I- Modifikations-Methylase kodieren, und Screenen dieser, um diejenigen zu identifizieren, die ebenfalls das Apo I- Restriktionsendonukleasegen enthalten. Rekombinantes Apo I kann durch Kultivierung der Wirtszelle erhalten werden, die die DNA enthält, die für die Apo I-Endonuklease kodiert, unter Bedingungen für die Expression von Apo I, Sammeln der kultivierten Zellen, Erhalten eines zellfreien Extraktes daraus und Abtrennen und Sammeln der Restriktionsendonuklease Apo I aus dem zellfreien Extrakt.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 ist eine Restriktionskarte des 4,8 kb Bgl II-Fragmentes von Arthrobacter, das für die Apo I-Restriktionsendonuklease und Modifikations-Methylase kodiert.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erkennungssequenz der Endonuklease der vorliegenden Erfindung wurde durch vollständigen Verdau von phiX174 DNA mit Apo I bestimmt. Die Größe der resultierenden Fragmente wurde durch Agarosegel-Elektrophorese bestimmt. Die Größen der experimentell beobachteten Fragmente waren 2680, 1325, 550, 320, 225 und 170 Basenpaare. Die durch den Computer kalkulierten (Deveraux J. et al. (1984) NAR 12:387-395) Zahl und Größen der Fragmente, die durch Spaltung an der 5' PuAATTPy 3'-Stelle erzeugt würden: 2690, 1290, 554, 326, 239, 185 und 102 Basenpaare, korrelieren mit den beobachteten Fragmenten. Um die Erkennungssequenz weiter zu testen, wurden 6 andere DNA-Moleküle mit Apo I verdaut und es wurde unter Verwendung eines 1,0%igen Agarosegels eine Elektrophorese durchgeführt. Diese DNA-Moleküle waren pUC19, pBR322, M13mp18, T7, Lambda und Adeno-2 und enthalten jeweils die folgende Zahl an PuAATTPy-Sequenzen: 1, 1, 11, 13, 58, 29. Die experimentell beobachteten Zahlen und Größen der resultierenden DNA-Fragmente, paßten zu den vom Computer vorhergesagten Fragmenten, die durch die Spaltung an 5' PuAATTPy 3' erzeugt werden würden. Aus diesen Daten schließen wir, daß Apo I die Sequenz 5' PuAATTPy 3' erkennt.
Die Spaltungsstelle innerhalb der Apo I-Erkennungssequenz wird durch Dideoxy-Sequenzierungsanalyse der terminalen Basensequenz bestimmt, die aus der Apo I-Spaltung erhalten wird (Sanger, F. et al. (1977) PNAS 74:5463-5467, Brown, N.L. et al. (1980), J. Mol. Biol. 140:43-148). Unter Verwendung von M13mp18-DNA als Matrize mit einem geeigneten Primer werden die vier Standard-Dideoxy-DNA-Sequenzierungsreaktionen durchgeführt und eine fünfte Reaktion, die keine Dideoxy-Terminierungen enthält, wurde über die Apo I-Stelle ausgedehnt. Die fünfte Reaktion wurde durch Wärmebehandlung beendet, um die Klenow-DNA-Polymerase zu inaktivieren. Apo I wurde zur fünften Reaktion hinzugefügt. Das gespaltene Produkt führte zu einer einzigen Bande, welche mit dem 5'- Pu in der Sequenz 5' GAATTC 3' komigrierte. Die Zugabe von Klenow nach Apo I-Verdau führte zu einer Bande, welche vier Nukleotide länger ist, und welche mit dem am meisten nach 3' hin liegenden T-Rest komigriert. Diese Ergebnisse zeigen, daß Apo I nach dem ersten Purinrest der Erkennungssequenz in der 5' nach 3'-Richtung auf beiden Strängen spaltet, die einen symmetrischen Vierbasen 5'-Überhang bildet, wie durch die Pfeile gezeigt wird:
Das Enzym der vorliegenden Erfindung hat die folgenden zusätzlichen Eigenschaften:
(a) NaCl-Konzentration: Die optimale Salzkonzentration lag bei 50 mM NaCl, die relative Aktivität betrug 25% für 0 mM NaCl und 50% für 100 mM NaCl.
(b) Temperatur: Die Aktivität war bei 50ºC höher als bei 37ºC oder 60ºC.
(c) Stabilität: 0,13 Einheiten (wie oben definiert) von Apo I waren erforderlich, um 1 mg Lambda-Phage in 16 Stunden bei 50ºC vollständig zu spalten. 40 Einheiten von Apo I konnten durch Vorbehandlung bei 65ºC für 20 Minuten nicht vollständig inaktiviert werden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird Apo I durch Kultivierung eines Arthrobacter protophormiae-Stammes NEB#723 und Aufarbeitung der Endonuklease aus den Zellen erhalten. Eine Probe von Arthrobacter protophormiae NEB#723 ist bei der American Type Culture Collection am 30. August 1991 hinterlegt worden und trägt die Zugriffsnummer ATCC 55228.
Um das Enzym der vorliegenden Erfindung zu gewinnen, kann A. protophormiae unter Verwendung üblicher Techniken gezüchtet werden. Beispielsweise kann A. protophormiae in einem Medium gezüchtet werden, welches 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 1 g/l Dextrose, 1 g/l MgCl&sub2; 6H&sub2;O (pH 7,2) umfaßt, welches bei 30ºC mit Bewegung und Belüftung inkubiert wird. Zellen im spätlogarithmischen Stadium des Wachstums werden durch Zentrifugieren gesammelt und entweder sofort aufgebrochen oder bei -70ºC gefriergelagert.
Das Apo I-Enzym wird vorzugsweise folgendermaßen aus A. protophormiae-Zellen isoliert: die Zellmasse wird in einer Pufferlösung suspendiert und durch Beschallung, Hochdruckdispersion oder enzymatischen Verdau behandelt, um eine Extraktion der Endonuklease durch die Pufferlösung zu ermöglichen. Intakte Zellen und Zelldebris werden durch Zentrifugieren entfernt, um einen zellfreien Extrakt zu erhalten, der Apo I enthält. Die Apo I-Endonuklease wird dann von dem zellfreien Extrakt durch Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Molekularsiebchromatographie oder eine Kombination aus diesen Verfahren gereinigt, um die Endonuklease der vorliegenden Erfindung herzustellen.
Das Enzym dieser Erfindung kann ebenfalls durch rekombinierende DNA-Techniken hergestellt werden, da das Gen, welches dieses Enzym kodiert, aus Arthrobacter protophormiae-Genom- DNA kloniert worden ist. Die vollständige kodierende Sequenz für die Apo I-Restriktionsendonuklease und das Methylasegen kann von dem Plasmid pKLApoIRM11-6 abgeleitet werden. Dieses Plasmid wurde am 7. Oktober 1991 bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt und hat die Zugriffsnummer ATCC 75119.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Klone der Apo I- Restriktions- und Modifikationsgene sowie auf die Restriktionsendonuklease Apo I, die aus solchen Klonen hergestellt wird. Die Apo I-Gene werden durch ein Verfahren kloniert, welches die Tatsache ausnutzt, daß bestimmte Klone, welche auf der Basis des Enthaltens und der Expression des Apo I- Modifikations- oder Methylasegens ausgewählt werden, auch das Apo I-Restriktionsgen enthalten. Die DNA solcher Klone ist in vitro gegenüber einem Verdau mit Apo-I-Restriktionsendonuklease widerstandsfähig. Diese Widerstandsfähigkeit gegenüber Verdau bietet ein Mittel zur selektiven Isolierung von Klonen, die die Apo I-Methylase und Restriktionsendonuklease kodieren.
Die folgenden Beispiele sind dazu bestimmt, Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen, wie sie gegenwärtig bevorzugt praktiziert werden. Es ist so zu verstehen, daß die Beispiele erläuternd sind, und daß die Erfindung nicht als darauf beschränkt betrachtet werden soll, außer so wie in den anhängenden Ansprüchen gezeigt wird.

BEISPIEL 1

Reinigung von Apo I aus Arthrobacter protophormiae

Arthrobacter protophormiae-Stamm NEB#723 wurde in einem Medium gezüchtet, das aus 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt und 5 g/l NaCl (auf pH 7,2 eingestellt) besteht. Die Zellen wurden bei 30ºC bis zur spätlogarithmischen Stufe unter Belüftung und Bewegung inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und der resultierende Zellbrei bei -70ºC gefroren gelagert.
262 g der oben erhaltenen Zellmasse wurden aufgetaut und in drei Volumen Puffer A suspendiert (20 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 6 mM 2-Mercaptoethanol, 5% Glycerin, pH 8,0), eingestellt auf 100 mM NaCl. Die Zellsuspension wurde sechsmal durch eine Gaulin-Presse bei 12.000 PSI hindurchgeleitet. Näherungsweise 31 mg Protein/Gramm Zellen wurden freigesetzt. Das Lysat wurde bei 4ºC für 40 Minuten zentrifugiert. Das Überstandsvolumen betrug 900 ml bei pH 7,3. Das Debrisgewicht betrug 160 g. Das Überstandsvolumen enthielt 7.200.000 Einheiten Apo I.
Die Überstandslösung wurde auf eine 353 ml DEAE-Sepharosesäule (Pharmacia) aufgetragen, die mit einer auf 100 mM NaCl eingestellten Puffer A-Lösung äquilibriert war. Der Durchfluß wurde chargenweise gesammelt. Die Säule wurde mit 400 ml Puffer A, eingestellt auf 100 mM NaCl, gewaschen. Der Durchfluß und die Waschlösung (wash) wurden kombiniert. Der kombinierte DEAE-Durchfluß- und Waschlösungs-Pool enthielt 2.600.000 Einheiten von Apo I in 1300 ml. Die DEAE- Säule wurde mit einem 2-Liter-Gradienten von 100 mM bis 700 mM NaCl in Puffer A eluiert. Zusätzliche Apo I-Aktivität eluierte von 34 bis 41% des Gradientenvolumens. 200 ml, die 1.600.000 Einheiten von Apo I-Aktivität enthielten, wurden gesammelt und gegen auf 100 mM NaCl eingestellten Puffer A dialysiert.
Der DEAE-Durchfluß- und Waschlösungs-Pool wurde auf eine 59 ml Heparin-Sepharose-Säule aufgetragen, die in Puffer A, welcher auf 100 mM NaCl eingestellt war, äquilibriert war. Die Säule wurde mit 300 ml auf 100 mM NaCl eingestellten Puffer A gewaschen. Das Enzym wurde mit einem 600 ml-Gradienten von 100 mM bis 1 M NaCl in Puffer A eluiert. Die Fraktionen wurden auf Apo I und Exonukleaseaktivität getestet. Die Apo I-Aktivität eluierte von 56 bis 68% des Gradientenvolumens. Die Hauptaktivität der Exonuklease eluierte von 0 bis 58% des Gradientenvolumens. Der an die DEAE- Säule gebundene Pool wurde aufgetragen, gewaschen und von der Heparin-Sepharose-Säule eluiert, wie oben. Die Fraktionen, die Apo I-Aktivität von beiden Heparin-Sepharose-Säulenreinigungen enthielten, wurden gesammelt und gegen Puffer B (20 mM KPO&sub4;, 6 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA, 5% Glycerin, pH 6,7), der auf 100 mM NaCl eingestellt war, dialysiert.
Das 200 ml-Dialysat, das 200 mg Protein enthielt, wurde auf eine 17 ml Whatman-Phosphocellulose-Säule aufgebracht, die in Puffer B, eingestellt auf 100 mM NaCl, äquilibriert war. Die Säule wurde mit 100 ml des auf 100 mM NaCl eingestellten Puffers B gewaschen. Das Enzym wurde mit einem 200 ml Gradienten von Puffer B von 100 mM bis 1 M NaCl eluiert. Die Apo I-Aktivität eluierte von 38% bis 53% des Gradientenvolumens. Der Phosphocellulose-Pool, der 3.200.000 Einheiten von Apo I in 50 ml enthielt, wurde gegen Puffer C (20 mM KPO&sub4;, 6 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA, 5% Glycerin, pH 6,3), eingestellt auf 50 mM NaCl, dialysiert. Die Hauptaktivität der Exonuklease eluierte bei ungefähr 35% des Gradientenvolumens.
Das Dialysat, das 100 mg Protein enthielt, wurde in drei gleiche Aliquots geteilt und drei getrennte 7,5 MMID TSK- GEL-Heparin-5PW-(TosoHaas)-Säulen wurden gefahren. Diese wurden in Puffer C äquilibriert, der auf 50 mM NaCl eingestellt war. Die Proteinlösung wurde mit einem 70 ml-Gradienten von 50 mM bis 0,7 M NaCl in Puffer C eluiert. Die Apo I-Aktivität eluierte bei 0,6 M NaCl. Die Hauptaktivität der Exonuklease eluierte bei 0,43 M NaCl. Der kombinierte 4 ml-Pool von Apo I aus den drei Säulenläufen enthielt 1.600.000 Einheiten. Dieser Pool wurde auf 50 mM NaCl mit Puffer B verdünnt.
Das verdünnte Heparin-5PW wurde auf eine WCX-7um-HPLC-Säule (Custom LC, Inc.) aufgetragen, äquilibriert in einem auf 50 mM NaCl eingestellten Puffer B. Die Proteinlösung wurde mit einem 50 ml Gradienten von 50 mM bis 0,6 M NaCl in Puffer B eluiert. Die Apo I-Aktivität eluierte bei 0,42 M NaCl. Die Apo I-Aktivität wurde gesammelt und als im wesentlichen frei gefunden von kontaminierendem DNA-bindenden Protein, Exonuklease und Endonuklease. Rinderserumalbumin wurde als ein Stabilisator hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 200 ug/ml zu erhalten, und das Apo I wurde gegen Aufbewahrungspuffer (50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 1,0 mM Dithiothreitol, 50% Glycerin, pH 7,5) dialysiert. Dieser letzte Apo I-Pool war im wesentlichen rein und enthielt 1.500.000 Einheiten, eine 20%ige Ausbeute.

Aktivitätsbestimmung

Apo I-Aktivität: Eine 1 ul-Probe der zu testenden Fraktion wurde zu 25 ul der Substratreaktions-Pufferlösung (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol, pH 7,9, die 0,5 ug Lambda-Phagen-DNA enthielt) hinzugefügt, die mit 100 ug/ml Rinderserumalbumin ergänzt wurden. Die enzymatische Reaktion wurde bei 50ºC für die angezeigte Zeit, 5 bis 30 Minuten, inkubiert. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 7,0 ul einer Stoplösung (50% Glycerin, 50 mM EDTA, pH 8,0, und 0,02% Bromphenol-Blau) beendet. Die Reaktionsmischung wurde auf ein 1,0%iges Agarosegel aufgebracht und es wurde eine Elektrophorese durchgeführt. Die erhaltenen Banden wurden im Vergleich mit DNA-Längenstandards identifiziert.
Exonuklease-Aktivität: Eine 5 ul-Probe der Proteinlösung wurde zu 50 ul einer Lösung aus (50 mM NaCl, 10 mM Tris- HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol, pH 7,9, die 25 ug/ml ³H-DNA enthielt), hinzugefügt. Ergänzt wurde mit 100 ug/ml Rinderserumalbumin. Die enzymatische Reaktion wurde bei 50ºC für die angezeigte Zeit, 1 bis 4 Stunden, inkubiert.
Einheiten-Definition: Eine Einheit von Apo I spaltet 1 ug Lambda-Phagen-DNA vollständig in einer Stunde bei 50ºC.
Optimale Pufferbedingung: Für eine optimale Apo I-Aktivität wurde der folgende Puffer verwendet: 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol, pH 7,9, der 0,5 ug Lambda-Phagen-DNA enthielt, ergänzt mit 100 ug/ml Rinderserumalbumin.

BEISPIEL II

Klonierung der Apo I-Restriktionsendonuklease- und Methylasegene

1. DNA-Reinigung: Um die DNA von Arthrobacter protophormiae herzustellen, wurden 5 g Zellmasse in 10 ml der 25%igen Sucrose resuspendiert, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 ml von 0,25 M EDTA, pH 8,0, und 3 ml von 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris, pH 8,0, wurden hinzugefügt. Die Suspension wurde für eine Stunde auf Eis gehalten, dann wurden 12 ml 1% Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8,0, 67 mM EDTA zu der Lösung hinzugefügt, und diese wurde für zwei Stunden bei 37ºC belassen. Die Zellyse war unvollständig, so daß die DNA-Lösung bei 4ºC für 64 Stunden belassen wurde. SDS wurde zu 0,1% hinzugefügt und die Lösung wurde mit 30 ml Phenol (vorherige Äquilibrierung mit 0,5 M Tris, pH 8,0), und 30 ml Chloroform extrahiert. Die Emulsion wurde bei 15000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert, um festen Debris zu entfernen. Der geklärte Überstand wurde in einen Dialyseschlauch gegeben und gegen vier Wechsel an DNA-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde dann mit RNase bei einer Endkonzentration von 100 mg/ml für eine Stunde bei 37ºC verdaut. Die DNA wurde dann durch die Zugabe von 5 M NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0,4 M, und 0,55 Volumen an Isopropylalkohol gefällt. Die gefällte DNA wurde auf einen Glasstab gewikkelt, luftgetrocknet, dann wieder in DNA-Puffer bei einer Endkonzentration von annähernd 100 ug/ml gelöst und bei 4ºC gelagert.
2. Teilweiser Verdau: Die gereinigte DNA wurde mit Bgl II gespalten, um einen teilweisen Verdau wie folgt zu erreichen: 0,45 ml DNA mit 50 ug/ml in 50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 1 mM DTT wurden in ein 100 ul-Aliquot und sieben 50 ul-Aliquots geteilt. Zu dem 100 ul- Röhrchen wurden 40 Einheiten von Bgl II hinzugefügt, um 8,0 Einheiten Enzym pro ug DNA zu erhalten. 50 ul wurden aus dem ersten Röhrchen entfernt und auf das zweite Röhrchen übertragen, um vier Einheiten Bgl II/ug zu erhalten usw., jedes nachfolgende Röhrchen erhielt die Hälfte der vorherigen Menge von Bgl II. Die Röhrchen wurden bei 37ºC für eine Stunde inkubiert, dann bei 72ºC für 10 Minuten wärmebehandelt, und 10 ul von jedem wurden durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die Röhrchen, die mäßigen, aber unvollständigen Verdau aufwiesen, wurden getrennt von jenen Röhrchen gepoolt, die einen vollständigen Verdau aufwiesen, als eine Quelle zur Klonierung.
3. Ligation: Die fragmentierte DNA wurde folgendermaßen in pBR322 ligiert: 2,0 ug von mit Bgl II - vollständig oder teilweise verdauter - A. protophormiae-DNA (40 ul) wurden mit 1,0 ug BamHI-gespaltenem und dephosphoryliertem pBR322 (10 ul) vermischt. 10 ul der 10X-Ligationsmischung (500 mM Tris, pH 7,8, 100 mM MgCl&sub2;, 200 mM DTT, 10 mM ATP, 500 mg/ml Rinderserumalbumin) wurden hinzugefügt plus 44 ul steriles destilliertes Wasser, um das Endvolumen auf 100 ul zu bringen. 3,75 ul T4-DNA-Ligase wurden hinzugefügt und die Mischung wurde bei 17ºC über Nacht inkubiert, dann durch Hinzufügen von 10 ul Chloroform sterilisiert. Ungefähr 32 ul der ligierten DNA von jedem vollständigen oder teilweisen Bgl II-Pool wurden verwendet, um E.coli-Stamm RRI folgendermaßen zu transformieren: 64 ul DNA (32 ul des vollständigen Bgl II-Pools + 32 ul des teilweise ligierten Pools von Bgl II) wurden mit 0,5 ml SSC/CaCl&sub2; (50 mM NaCl, 5 mM Na&sub3;-citrat, 67 mM CaCl&sub2;) auf Eis vermischt und 1,0 ml von eisgekühlten kompetenten E.coli RRI (hsd R&supmin;M&supmin;, ATCC Nr. 31343)-Zellen wurden hinzugefügt. Nach einer 6-minütigen Inkubation bei 43ºC wurden die Zellen durch Hinzufügen von 8 ml von Luria-Nährmedium (L-Nährmedium) verdünnt und dann bei 37ºC für 4 Stunden inkubiert.
4. Erste Zellbibliothek: Die transformierte Zellkultur wurde kurz zentrifugiert, die überstehende Lösung wurde dekantiert und die Zellen in 1,0 ml des L-Nährmediums resuspendiert. 200 ul-Portionen wurden auf Luria-Agar (L- Agar)-Platten plattiert, die 100 ug/ml Ampicillin enthielten. Nach einer Über-Nacht-Inkubation bei 37ºC wurden die Platten jeweils mit 2,5 ml von 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; geflutet und die übertragenen Kolonien wurden zusammengeschabt und gepoolt, um die erste Zellbibliothek zu bilden.
5. Erste Plasmidbibliothek: Die erste Plasmidbibliothek wurde folgendermaßen hergestellt: 2,5 ml der ersten Zellbibliothek wurden in 500 ml L-Nährmedium angeimpft, das 100 ug/ml Ampicillin enthielt. Die Kultur wurde über Nacht bei 37ºC geschüttelt, dann bei 4000 Upm für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 10 ml einer 25%igen Sucrose, 50 mM Tris, pH 8,0, bei Raumtemperatur resuspendiert. 5 ml einer 0,25 M EDTA, pH 8,0, wurden hinzugefügt, gefolgt von 3 ml 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris, pH 8,0. Die Lösung wurde für eine Stunde auf Eis gelassen, dann wurden 12 ml einer lytischen Mischung (1% Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8,0, 67 mM EDTA) energisch hinein pipettiert und die Zellsuspension sanft verwirbelt, um eine Lyse zu erreichen. Nach der Lyse wurde die Mischung auf ein 50 ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen übertragen und bei 17000 Upm und 4ºC für 45 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt. 20,0 g des festen CsCl wurden in einem 50 ml Kunststoffröhrchen mit verschraubbarem Deckel abgewogen und 22,0 g des Überstands wurden in das Röhrchen pipettiert und vermischt. 1,0 ml der Ethidiumbromidlösung (5 mg/ml Ethidiumbromid in 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) wurden zu der Mischung hinzugefügt. Die Lösung wurde auf zwei 5/8 Inch x 3 Inch-Polyallomer-Zentrifugenröhrchen übertragen und verschlossen. Diese Röhrchen wurden dann in einem Beckman Ti70-Rotor für 42 Stunden bei 44000 Upm und 17ºC zentrifugiert. Um die Plasmide zu sammeln, wurden die oberen Enden der Röhrchen mit einem Skalpell durchstochen und die unteren der zwei fluoreszierenden DNA-Banden wurden mittels einer Spritze unter ultraviolettem Licht gesammelt. Die untere Bande von beiden Röhrchen wurde in einem Glasröhrchen mit verschraubbarem Deckel vereinigt und das Ethidiumbromid wurde durch viermalige Extraktion mit gleichem Volumen wassergesättigtem eisgekühltem N-Butanol extrahiert.
Die extrahierte Lösung wurde in einen Dialyseschlauch übertragen und für 24 Stunden gegen vier Wechsel DNA-Puffer dialysiert. Die dialysierte DNA-Lösung wurde dann auf ein vorher gewogenes steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen übertragen und sein Volumen wurde gemessen. 5 M NaCl wurden zu einer Endkonzentration von 0,4 M hinzugefügt, dann wurden 2 Volumina Isopropanol hinzugefügt und gemischt. Die Lösung wurde über Nacht bei -20ºC gelagert, um die DNA auszufällen. Nach dem Ausfällen wurde die Lösung bei 15.000 Upm und 4ºC für 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Röhrchen wurde auf dem Arbeitstisch 15 Minuten zum Lufttrocknen gelassen, dann wurde das DNA-Pellet in 500 ul DNA-Puffer gelöst und bei -20ºC gelagert. Die DNA-Konzentration der Plasmide, die in dieser Weise hergestellt wurden, lag ungefähr bei 30 ug/ml.
6. Verdau des Plasmid-Pools: Der erste Plasmid-Pool von Bgl II wurde verdaut, um nicht-Apo I-Methylaseklone folgendermaßen zu zerstören: 1,0 ug (35 ul) Plasmid-DNA wurde mit 50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 100 ug/ml BSA in einem Volumen von 45 ul vermischt und Apo I wurde bis zu 16 Einheiten/ug DNA hinzugefügt. Das Röhrchen wurde bei 37ºC für zwei Stunden inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf 72ºC für 10 Minuten inaktiviert, dann für 5 Minuten auf Eis gelegt. 1 ul (10 Einheiten) der CIAP (Alkalische Phosphatase aus Kalbsintestinum) wurden hinzugefügt und das Röhrchen wurde bei 37ºC für eine Stunde liegengelassen.
7. Transformation: Eine 12,5 ul-Probe aus dem Röhrchen wurde verwendet, um E.coli RRI zu transformieren. Die Zell/DNA-Mischungen wurden sofort nach dem Hitzeschritt, ohne zwischenzeitliches Verdünnen und Waschen, auf L-Agar- Platten plattiert, die 100 ug/ml Ampicillin enthielten. Nach einer Über-Nacht-Inkubation bei 37ºC wurden die Platten überprüft. Es wurde herausgefunden, daß der Verdau der Plasmidbibliothek mit Apo I und gefolgt von Behandlung mit CIAP, eine um einen Faktor von größer als 10³ verminderte Anzahl an Transformanten aufwies. Vierzehn individuelle Kolonien wurden von der Platte aufgenommen und jede Kolonie wurde in 10 ml L-Nährmedium angeimpft, das Ampicillin enthielt, um eine Minikultur herzustellen, und wurde auch auf L-Agar-Platten ausgestrichen, die Ampicillin enthielten, um eine Stammkultur (master stock) herzustellen.
8. Analyse der überlebenden Individuen: Ungefähr vierzehn der überlebenden Kolonien, die aus Abschnitt 7 erhalten wurden, wurden in 10 ml-Kulturen gezüchtet (Abschnitt 7) und die Plasmide, die sie trugen, wurden durch das folgende Miniprep-Reinigungsverfahren hergestellt, das von dem Verfahren von Birnboin und Doly (Nucleic Acids Res. 7: 1513 (1979)) abgeleitet wurde.
Miniprep-Verfahren: Jede Kultur wurde bei 5000 Upm für 5 Minuten zentrifugiert; der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 1,0 ml 25 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose, pH 8,0, der 1 mg/ml Lysozym enthielt, resuspendiert. Nach 1 Minute bei Raumtemperatur wurden 2,0 ml von 0,2 M NaOH, 1% SDS zu jedem Röhrchen hinzugefügt und die Röhrchen wurden geschüttelt, um die Zellen zu lysieren. Als die Lösungen sich geklärt hatten, wurden 1,5 ml 3 M Natriumacetat, pH 4,8, zu jeder hinzugefügt und geschüttelt. Die Niederschläge, die sich gebildet hatten, wurden bei 15000 Upm und 4ºC für 10 Minuten abzentrifugiert. Jeder Überstand wurde in ein Zentrifugenröhrchen gegossen, das 3 ml Isopropanol enthielt, und gemischt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Röhrchen bei 15.000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert, um die gefällten Nukleinsäuren zu pelletieren. Die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten luftgetrocknet. Einmal getrocknet, wurden die Pellets in 850 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, resuspendiert. 75 ul 5 M NaCl wurden zu jeder hinzugefügt und die Lösungen wurden auf Eppendorf-Röhrchen übertragen, die 575 ul von eisgekühltem Isopropanol enthielten, und wieder für 10 Minuten bei Raumtemperatur ausgefällt. Die Röhrchen wurden dann für 45 Sekunden in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und die Pellets wurden luftgetrocknet. Die Pellets wurden dann in 500 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, gelöst, die 100 ug/ml RNase enthielten, und für eine Stunde bei 37ºC inkubiert, um die RNA zu verdauen. Die DNA wurde einmal mehr durch das Hinzufügen von 50 ul 5 M NaCl, gefolgt von 350 ul Isopropanol ausgefällt. Nach 1 Minute bei Raumtemperatur wurde die DNA für 45 Sekunden durch Zentrifugation abzentrifugiert, die überstehende Lösung wurde verworfen und die Pellets wurden wieder in einer Endlösung von 150 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, gelöst. Die Plasmid- Minipreps wurden anschließend durch Verdau mit Apo I analysiert.
9. Methylasegen-Klone: Es wurde gefunden, daß die Mehrheit der analysierten Plasmide empfindlich gegenüber einem Verdau mit Apo I ist und daß sie Zufallsfragmente der Arthrobacter protophormiae-DNA tragen. Diese Plasmide waren unerwünschte Überlebende von keinem weiteren Interesse und wurden verworfen. Vier der vierzehn waren widerstandsfähig gegenüber Apo I-Verdau. Eines dieser vier Plasmide aus der pBR322 Bgl II-Bibliothek war nicht nur widerstandsfähig gegenüber Apo I, sondern trug ein Bgl II-Fragment von ungefähr 4,8 Kb (Siehe Fig. 1) und es wurde anschließend gezeigt, daß es nicht nur das Apo I-Modifikationsmethylasegen, sondern auch das Restriktionsendonukleasegen trägt.
10. Restriktionsgen-Klone: Der Bgl II-Klon, der oben als das Apo I-Modifikationsmethylasegen tragend identifiziert wurde (Abschnitt 9), wurde auf E.coli-Stamm MM294 (ATCC 33625) übertragen. Es wurde durch einen in-vitro-Test der Restriktionsendonuklease herausgefunden, daß der Bgl II- Klon das Apo-I-Restriktionsendonukleasegen trägt:
Endonuklease-Tests: Um die Endonukleaseaktivität zu testen, wurden zwei Lösungen hergestellt:
(i) 10X-Restriktionsendonukleasepuffer: 500 mM Tris, pH 57,9, 100 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1000 mM NaCl; und
(ii) Verdaureaktionsmischung: 40 ul Phage T7-DNA (250 ug/ml, 45 ul 10X-Restriktionsendonuklease-Puffer, 361 ul destilliertes Wasser, um 25 ug/ml DNA zu erreichen.
Der Zellextrakt wurde folgendermaßen hergestellt: eine 100 ml-Kultur des zu testenden Klons wurde über Nacht in L- Nährmedium plus 100 ug/ml Ampicillin bei 37ºC gezüchtet, und die Zellen wurde durch Zentrifugieren bei 4000 Upm für 5 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 3 ml Beschallungsspuffer (75 mM KPO&sub4;, pH 7,0, 10 mM BME, 0,1 mM EDTA) resuspendiert. Einmal resuspendiert, wurden 0,3 ml eines Beschallungsspuffers hinzugefügt, der 10 mg/ml Lysozym enthielt. Die Suspension wurde verwirbelt und für eine Stunde auf Eis gelassen. Eine 1 ml- Probe wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und sanft mit zwei 20-Sekunden-Stößen beschallt, um die Zellen auf zubrechen. Das Röhrchen wurde für 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und der Überstand wurde als Zellextrakt verwendet. Um den Extrakt zu testen, wurde die Verdaureaktionsmischung auf vier Röhrchen verteilt, 75 ul in das erste Röhrchen und 50 ul in jedes der verbleibenden drei Röhrchen. 3 ul des Extraktes wurden zu dem ersten Röhrchen hinzugefügt und gemischt. 25 ul wurden aus dem ersten Röhrchen entfernt und auf das zweite Röhrchen übertragen, gemischt usw. Das erste Röhrchen erreichte daher ungefähr 1,5 ul des Extraktes pro ug DNA, das zweite Röhrchen 0,5 ul/ug, das dritte 0,15 ul/ug und das vierte Röhrchen 0,05 ul/ug. Die Röhrchen, wobei jedes jetzt 50 ul enthält, wurden bei 50ºC für eine Stunde inkubiert, dann wurde eine 20 ul-Probe von jedem durch Gelelektrophorese analysiert. Der Titer des Extraktes war größer als 1x10³ Einheiten Apo I-Restriktionsendonuklease pro Gramm nasser Zellpaste.
11. Die Herstellung der Apo I-Endonuklease kann aus dem rekombinanten Plasmid pKLApoIRM 11-6, welches das Apo I- Modifikationsgen und Endonukleasegen trägt, durch Vermehrung in einem Fermenter in einem reichen Medium, das Ampicillin enthält, bewirkt werden. Die Zellen werden nachher durch Zentrifugieren geerntet und durch Beschallung aufgebrochen, um einen Zellrohextrakt herzustellen, der Apo I- Endonukleaseaktivität enthält.
Der Zellrohextrakt, der die Apo I-Endonuklease enthält, wird durch Standardprodukt-Reinigungstechniken wie Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie gereinigt.

Claims

1. Eine im wesentlichen reine Typ II-Restriktionsendonuklease, erhältlich aus Arthrobacter protophormiae (ATCC#55228), welche die folgende Basensequenz in doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäuremolekülen erkennt:

und welche eine Spaltungsposition aufweist, die durch die Pfeile definiert ist.

2. Die Typ II-Restruktionsendonuklease nach Anspruch 1, welche doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure lambda cI857 in 58, Adeno-2 in 29, und pBR322 in 1 Position spaltet.

3. Ein Verfahren zum Erhalten der Typ II-Restriktionsendonuklease gemäß Anspruch 1, welches umfaßt:

Kultivieren einer Probe von Arthrobacter protophormiae unter Bedingungen, welche die Produktion der Endonuklease begünstigen und Trennen der Endonuklease davon.

4. Die Typ II-Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1, wobei die Restriktionsendonuklease aus Arthrobacter protophormiae (ATCC#55228) gereinigt wird.

5. Die Typ II-Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1, worin die Restriktionsendonuklease gereinigt wird aus einem transformierten Wirt, welcher die DNA-Sequenz, die die Restriktionsendonuklease codiert, enthält.

6. Isolierte DNA, welche für die Apo I Restriktionsendonuklease codiert, wobei die isolierte DNA erhältlich ist aus dem Vektor pKLApoIRM11-6 (ATCC 75119).

7. Ein rekombinanter DNA-Vektor, welcher einen Vektor umfaßt, in welchen ein DNA-Segment eingeführt wurde, welches für die Restriktionsendonuklease gemäß Anspruch 1 codiert.

8. Isolierte DNA, welche für die Apo I Restriktionsendonuklease und Methylase codiert, wobei die isolierte DNA erhältlich ist aus dem Vektor pKLApoIRM11-6 (ATCC 75119).

9. Ein Klonierungsvektor, welcher die isolierte DNA gemäß Anspruch 8 umfaßt.

10. Der Klonierungsvektor nach Anspruch 9, wobei der Klonierungsvektor pKLApoIRM11-6 (ATCC 75119) umfaßt.

11. Eine Wirtszelle, welche durch den Klonierungsvektor gemäß Anspruch 7, 9 oder 10 transformiert wurde.

12. Ein Verfahren zum Herstellen einer Apo I Restriktionsendonuklease, welche Kultivieren einer Wirtszelle umfaßt, welche mit dem Vektor gemäß Anspruch 7, 9 oder 10 transformiert wurde, unter für die Expression der Endonuklease geeigneten Bedingungen.