DE69132479T2

DE69132479T2 - Pilzresistente Pflanzen, Verfahren zur Gewinnung pilzresistenter Pflanzen und dafür verwendbare rekombinante Polynukleotide

Info

Publication number: DE69132479T2
Application number: DE69132479T
Authority: DE
Inventors: John Ferdinand Bol; Bernardus Johannes Clemens Cornelissen; Hubertus Josephus Maria Linthorst; Leo Sjoerd Melchers; Elisabeth Josine Sophie Meulenhoff; Marianne Beatrix Sela-Buurlage; Jeroen Sebastiaan Charles Van Roekel; Alexandra Aleida Vloemans; Charles Peter Woloshuk
Original assignee: Universiteit Leiden; Mogen International NV
Current assignee: Syngenta Mogen BV
Priority date: 1990-01-30
Filing date: 1991-01-30
Publication date: 2001-05-17
Anticipated expiration: 2011-01-31
Also published as: JPH08280283A; ATE197815T1; PT96599B; ES2152213T3; AU654471B2; GR3035470T3; US5670706A; IL97020A0; EP0440304A1; CA2035134A1; PT96599A; DE69132479D1; IL97020A; IE910298A1; AU7003491A; EP0440304B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der DNA-Rekombinationstechnik, insbesondere im Zusammenhang mit der genetischen Manipulation von Pflanzen, und betrifft ein Verfahren zur Herstellung von pilzresistenten Pflanzen aufgrund genetischer Manipulation, sowie die genetisch manipulierten Pflanzen und Pflanzenzellen selbst (inklusive Teilbestandteile der genetisch manipulierten Pflanzen sowie durch vegetative oder generative Vermehrung hergestellte Nachkommen) sowie die rekombinanten Polynukleotide (DNA oder RNA), die für die genetische Manipulation verwendet werden können.

HINTERGRUND

Die meisten landwirtschaftlichen und gartenbaulichen Kulturpflanzen sind einer ständigen Bedrohung durch Pilzbefall ausgesetzt. Um die Kulturpflanzen vor wesentlichen, durch Pilzkrankheiten hervorgerufenen Verlusten zu schützen, werden die Kulturpflanzen und gelegentlich der Boden, in dem die Kulturpflanzen gezogen werden, regelmässig mit grossen Fungizidmengen behandelt. Diese Fungizide wirken sich stark auf die beim Kulturpflanzenbau anfallenden Kosten und, was noch wichtiger ist, auf die Umwelt und die Landwirte aus. Ausserdem ist die Behandlung sehr arbeitsaufwendig. Es besteht daher ein Bedarf an finanziell weniger aufwendigen sowie sichereren Verfahren zum Schutz von Pflanzen vor Pilzbefall, bei denen vorzugsweise nicht erforderlich ist, dass der Mensch ständig eingreift.

Induzierte Resistenz

Bei Pflanzen treten im allgemeinen mehrere Arten der Resistenz gegen Pathogene auf, nämlich "Non- Host"-Resistenz, "horizontale" oder teilweise Resistenz sowie "vertikale" Resistenz. Bei keiner dieser Resistenzformen ist besonders gut bekannt, was auf molekularer Ebene passiert. Zusätzlich zu diesen konstitutiv exprimierten Formen der Resistenz existiert ein Resistenzmechanismus, der durch bestimmte pathogene Infektionen sowie verschiedene biotische und abiotische Faktoren induziert werden kann. Diese induzierte Resistenz ist sehr breit und richtet sich gegen verschiedene Pathogene, darunter auch Pilze. Dies wird unten genauer beschrieben.
Die Inokulation der unteren Blätter einer überempfindlich reagierenden Tabaksorte (Nicotiana tabacum, Sorte Samsun NN) mit Tabakmosaikvirus (TMV) führt zur Bildung lokaler Läsionen auf den inokulierten Blättern. Die nichtinokulierten Blätter scheinen nach 3 Tagen gegenüber einer Zweitinfektion mit TMV resistent zu sein; diese Resistenz hält mindestens 20 Tage lang an, und das Resistenzoptimum wird nach 7 Tagen beobachtet. Die Resistenz gegen die Zweitinfektion richtet sich auch gegen andere Viren wie das Tabaknekrosevirus, das Tabakringfleckenvirus (Ross & Bozarth, 1960; Ross, 1961) sowie gegen Pilze wie Thielaviopsis basicola (Hecht & Bateman, 1964), Phytophthora nicotianae und Peronospora tabacina (Mclntyre & Dodds, 1979; Mclntyre u. Mitarb., 1981).
Das Phänomen der induzierten Resistenz wurde an zahlreichen anderen Wirtspflanzen sowie ausserdem in Kombination mit mehreren anderen Pathogenen untersucht (Kuc, 1982; Sequeira, 1983). Das allgemeine Bild, das sich aus diesen Untersuchungen ergibt, ist, dass eine Hypersensitivitätsreaktion mit einer Resistenz gegen verschiedenste Pathogene einhergeht, und zwar unabhängig von der Art des Pathogens, das die Erstinfektion verursacht hat.

Proteine, die gleichzeitig mit der induzierten Resistenz exprimiert werden

Gemeinsam mit der Resistenz werden viele Proteine synthetisiert, die vor der Infektion nicht vorhanden waren.
Man unterscheidet grob zwischen drei Proteinkategorien:
1) Schlüsselenzyme bei der Synthese von Sekundärmetaboliten wie Phytoalexinen, die eine antimikrobielle Wirkung aufweisen, sowie Vorläufern des Lignin; letzteres wird zur Verstärkung der Zellwände der Pflanze nach dem Eintreten des Pathogens verwendet. Diese Enzyme, bzw. ihre messenger-RNAs, finden sich hauptsächlich in Zellen in unmittelbarer Nähe der Infektionsstelle (Elliston u. Mitarb., 1976; Cramer u. Mitarb., 1985; Bell u. Mitarb., 1986).
2) Hydroxyprolinreiche Glykoproteine (HRGPs) oder Extensine, die in die Zellwand eingebaut werden können und dort möglicherweise als Matrix für die Anheftung aromatischer Verbindungen wie Lignin dienen (Fry, 1986). Bei den HRGPs handelt es sich um wichtige Strukturkomponenten der pflanzlichen Zellwände, und sie reichern sich als Reaktion auf Pilze, Bakterien und Viren an (Mazau & Esquerre-Tugaye, 1986). Im Gegensatz zur Situation bei den obengenannten Schlüsselenzymen finden sich HRGPs und ihre mRNAs in beträchtlichen Mengen in nichtinfizierten Teilen der Pflanze sowie rund um die Infektionsstelle (Showalter u. Mitarb., 1985).
3) Eine dritte Gruppe induzierter Gene codiert Proteine, die sich sowohl innerhalb der Zellen als auch im Apoplastenraum anreichern. Zu diesen Proteinen zählen hydrolytische Enzyme wie Chitinasen und Glucanasen. Nach einer nekrotischen Infektion finden sich diese Enzyme häufig in höheren Konzentrationen als vor der Infektion überall in der Pflanze, darunter auch in den nichtinfizierten Teilen. Eine verstärkte Synthese dieser Enzyme scheint auch durch mikrobielle auslösende Faktoren, üblicherweise Präparate von Pilzzellwänden, induziert zu werden (Darvill & Albersheim, 1984; Toppan & Esquerre-Tugaye, 1984; Mauch u. Mitarb., 1984; Chappel u. Mitarb., 1984; Kombrink & Hahlbrock, 1986; Hedrick u. Mitarb., 1988).

Struktur der Pilzzellwände

Es ist bekannt, dass die Zellwände von Pilzen aus einer Anzahl unterschiedlicher Kohlenhydratpolymere bestehen. Die meisten Pilze mit Ausnahme der Oomyceten enthalten beträchtliche Mengen an Chitin. Bei Chitin handelt es sich um ein Polymer von N-Acetyl glucosaminmolekülen, die über β-1,4-Bindungen verknüpft sind und bei Pilzzellwänden häufig mit β-1,3/β-1,6-Glucan, Polymeren der Glucose mit β-1,3- und β-1,6-Bindungen, assoziert sind. Pilze aus der Gruppe der Zygomyceten enthalten keine Glucane mit β-1,3- und β-1,6-Bindungen, während bei den meisten Oomyceten die Glucane mit Cellulose assoziert sind (Übersicht: siehe Wessels and Sietsma, 1981).

In-vitro-Abbau isolierter Pilzzellwände

Es ist seit langem bekannt, dass isolierte Zellwände von Pilzen in vitro durch Pflanzenextrakte (Hilborn & Farr, 1959; Wargo, 1975; Young & Pegg, 1982) sowie durch Chitinase- und β-1,3-Glucanasepräparate mikrobiellen Ursprungs (Skujins u. Mitarb., 1965; Hunsley & Burnett, 1970; Jones u. Mitarb., 1974) abgebaut werden können.
In jüngerer Zeit wurde gezeigt, dass eine gereinigte Tomaten-endo-β-1,3-Glucanase in Kombination mit einer exo-β-1,3-Glucanase pilzlichen Ursprungs fähig war, isolierte Zellwände des Pilzes Verticillium alboaturm zu hydrolysieren. Alleine für sich hatte keines der Präparate Wirkung (Young & Pegg, 1982). Eine gereinigte Soyabohnen-β-1,3-Glucanase (Keen & Yoshikawa, 1983) sowie eine gereinigte Bohnen-Chitinase (Boller u. Mitarb., 1983) waren ebenso nachweislich fähig, isolierte Zellwände von Pilzen ja vi r abzubauen. Wurden Erbsen-Chitinase und β-1,3-Glucanase an isolierten Zellwänden von Fusarium solani geprüft, schienen beide wirksam zu sein; in Kombination schienen sie synergistisch zu wirken (Mauch u. Mitarb., 1988b).
Es ist nicht bekannt, ob diese hydrolytischen Enzyme die Polymerverbindungen in Zellwänden lebender Pilze wirksam bzw. überhaupt abbauen können.

Hemmung des Pilzwachstums auf synthetischen Medien durch pflanzliche Chitinasen und Glucanasen

Manche pflanzliche Chitinasen und Glucanasen können das Wachstum von Pilzen auf synthetischen Medien hemmen. Aus der Bohne aufgereinigte Chitinase kann das Wachstum des Pilzes Trichoderma viride in Agarplattentests hemmen (Schlumbaum u. Mitarb., 1986). Eine Kombination von Chitinase und β-1,3-Glucanase, die beide aus Erbsenhülsen aufgereinigt wurden, hemmen das Wachstum mancher Pilze auf Agarplatten, während andere Pilze nicht gehemmt werden. Der Ascomycet Cladosporium cucumerinum schien schwach empfindlich zu sein, während die Oomyceten Phythophthora cactorum, Pythium aphanidermatum und Phythium ultimum nicht empfindlich waren.
Erbsen-Chitinase allein hat eine Auswirkung auf das Wachstum von T. viride, während β-1,3-Glucanase das Wachstum von Fusarium f. sp. pisi hemmt. Es wurde festgestellt, dass die Hemmung des Pilzwachstums in diesen Tests durch die Lyse der Hyphenspitzen hervorgerufen wurde (Mauch u. Mitarb., 1988b). Es scheint, dass die hydrolytischen Enzyme zu ihrem Substrat in den Zellwänden lebender Pilze Zutritt haben, wenn diese auf synthetischen Medien gezüchtet werden, obwohl zumindest ein Teil der wirksamen pflanzlichen hydrolytischen Enzyme für bestimmte Pilze spezifisch zu sein scheinen.
Über die Auswirkung von hydrolytischen Enzymen auf Pilze im Biotop, d. h. im Boden oder auf Pflanzenblättern, ist wenig bekannt, und obwohl einige dieser Enzyme mutmassliche Kandidaten für eine Rolle bei Pilzresistenz sind, haben offenbar nicht alle Chitinasen und Glucanasen eine Auswirkung auf lebende Pilze. Möglicherweise sind das Infektionsstadium und die Infektionsstelle, zu dem bzw. wo die hydrolytischen Enzyme mit dem eindringenden Pilz in Kontakt kommen, sehr wichtig.

Das Auftreten von Chitinasen und Glucanasen in Pflanzen

Soweit bekannt ist, treten Chitinasen und β- 1,3-Glucanasen in den meisten Pflanzenarten, wenn nicht allen, auf, und zwar sowohl in Monokotyledonen als auch in Dikotyledonen. Man unterscheidet zwischen mindestens zwei Klassen von Chitinasen und zwei Klassen von Glucanasen, nämlich intrazelluläre und extrazelluläre. Sowohl die Chitinase- als auch die Glucanasegene einer bestimmten Klasse scheinen von Genfamilien codiert zu werden.

Die natürliche Expression der Chitinasegene und Glucanasegene in Pflanze

Es ist bekannt, dass die Chitinase- und Glucanasegene in Pflanzen sowohl konstitutiv als auch auf streng regulierte Weise exprimiert werden.
Chitinasen und β-1,3-Glucanasen werden in den Wurzeln von Tabakpflanzen konstitutiv synthetisiert (Felix und Meins, 1986, Shinshi u. Mitarb., 1987,; Memelink u. Mitarb., 1987, 1989). Tabakpflanzen sind trotzdem gegen Infektion mit Phytophthora parasitica var. nicotianae (einem Wurzelpathogen des Tabaks) nicht resistent. Eine Resistenz gegen dieses Pathogen kann jedoch in Tabakpflanzen nach Inokulation mit TMV induziert werden (Mclntyre & Dodds, 1979). Dies lässt darauf schliessen, dass ein Komplex bis dato unbekannter Faktoren anstelle von bzw. zusätzlich zu Chitinasen und Glucanasen an einer Resistenz gegen Pilze beteiligt sein kann.
Andererseits sind Pflanzenarten bekannt, die gegen Pilzinfektion resistent zu sein scheinen, obwohl kein wesentlicher Anstieg des Chitinase- oder Glucanasegehalts zu beobachten ist. Bei der Tomate zum Beispiel führt eine kompatible Wechselwirkung mit dem Pilz Phytophthora infestans zu einer systemischen Resistenz (Christ & Mösinger, 1989), d. h. einer Resistenz gegen Infektion in der gesamten Pflanze, obwohl in diesen Blättern keine Chitinasen oder Glucanasen nachgewiesen werden können (Fischer u. Mitarb., 1989). Es scheint, dass keine eindeutige Korrelation zwischen der Expression von Genen codierenden hydrolytische Enzyme und Pilzresistenz existiert.
Zusätzlich zu diesen Beobachtungen weisen manche Chitinasen ein reguliertes Expressionsmuster auf, das nicht sofort eine Korrelation mit Pilzresistenz nahelegt.
Zum Beispiel ist bekannt, dass für Chitinasen codierende Gene unter anderem in Tabakblüten auf entwicklungsabhängige Weise exprimiert werden (Lotan u. Mitarb., 1989). Es ist bekannt, dass Glucanasen in grossen Mengen in Gerstenkeimlingen auftreten (Swegle u. Mitarb., 1989; Woodward & Fincher, 1982; Hoj u. Mitarb., 1988, 1989).
Bei Tabakzellensuspensionen lässt sich die Synthese von intrazellulären Chitinasen und Glucanasen durch Zugabe von Cytokininen oder Auxinen hemmen (Mohnen u. Mitarb., 1985; Felix & Meins, 1986; Shinshi u. Mitarb., 1987; Bauw u. Mitarb., 1987).
Die Synthese der gleichen hydrolytischen Enzyme lässt sich durch Cytokinin induzieren, wenn dieses Hormon dem Wachstumsmedium, in dem normale Tabakpflanzen axenisch kultiviert werden, zugegeben wird. Unter gewissen Umständen kann das Pflanzenhormon Ethylen ebenso die Synthese von Chitinase und Glucanase induzieren (Felix & Meins, 1987).
In den Wurzeln und unteren Blättern von sowohl im Boden als auch axenisch gezogenen Tabakpflanzen lassen sich intrazelluläre Chitinasen und Glucanasen nachweisen, während sie in den oberen Blättern gar nicht oder nur wesentlich schwächer nachweisbar sind (Felix & Meins, 1986; Shinshi u, Mitarb., 1987; Memelink 1987, 1989). Die Expression der intrazellulären Chitinasen und Glucanasen erfolgt daher auch organspezifisch.
Die Regulation der Expression der die extrazellulären Chitinasen und Glucanasen codierenden Gene wird kaum oder gar nicht durch Cytokinine beeinflusst (Memelink u. Mitarb., 1987., 1989). In Tabakblüten werden die extrazellulären Chitinasen spezifisch in den Antheren, in den Blütenblättern und im Ovarium exprimiert.
Die Expression der die extrazellulären Chitinasen codierenden Gene erfolgt daher ebenfalls mindestens organspezifisch.

Pilzresistente Pflanzen, die Chitinase-Hybridgene exprimieren

Obwohl viele Merkmale in bezug auf Art und Rolle der hydrolytischen Enzyme bei der Pilzresistenz noch ungeklärt sind, existieren Berichte über anfängliche Erfolge bei der Ausstattung von Pflanzen mit einer verringerten Anfälligkeit gegen Pilzbefall.
Im US-Patent 4,940,840 wurde gezeigt, dass Tabakpflanzen, die ein Bakterien-Chitinasegen (d. h. das chiA-Gen aus Strratia marcescens) exprimieren, weniger anfällig gegenüber dem Pilz Alternaria longipes sind.
In der internationalen Patentanmeldung WO 9007001 scheinen die Pflanzenarten Tabak und Raps, die eine Bohnen-Chitinase unter der Regulation eines starken Viruspromoters oder eines Pflanzenpromoters exprimieren, weniger anfällig gegenüber zwei der geprüften Pilze, nämlich Botrytis cinerea und Rhizoctonia solani, zu sein.
Es ist jedoch nicht bekannt, ob diese Pflanzen auch eine wirksame Resistenz gegenüber anderen Pilzen zeigen.
In der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 292 435 wurde vorgeschlagen, dass eine Resistenz gegenüber gewissen Pilzklassen dadurch erzeugt werden kann, dass man ein Gen, das Chitinase exprimiert, in die Pflanzengewebe einbringt.
Das Targeting der Genprodukte in die Mitochondrien, die Vakuolen, die endoplasmatischen Vesikel und andere Teile der Zelle oder sogar in die interzellulären Räume (Apoplastenräume) wurde in gewissen Fällen als bevorzugt angegeben.
Die Art der Chitinase oder des bevorzugten Wirkorts der Chitinase zur Erzielung der gewünschten Wirkung wurde nicht gelehrt.
In EP-A-0 270 248 wird ein Mechanismus für das Targeting eines Bakteriengens (das β-Glucuronidasegen aus E. coli) zur Pflanzenzellwand hin unter Verwendung der Leitsequenz des Tomaten-Polygalacturonasegens vorgeschlagen. Unter anderem wurde das Targeting von Chitinasen oder Glucanasen zur Pflanzenzellwand vorgeschlagen, um Pilzbefall zu bekämpfen. Es wurden keine Ergebnisse gezeigt und es wurde auch nicht angegeben, welche hydrolytischen Enzyme verwendet werden sollten oder wie das Targeting von intrazellulären Pflanzenproteinen aus der Pflanzenzelle heraus durchgeführt werden sollte.
EP-A-0 332 104 beschreibt Genkonstrukte mit chemisch regulierbaren Sequenzen, die sich von Pflanzengenen ableiten, darunter den sogenannten PR-Genen, zu denen die Chitinase und Glucanase codierenden Gene zählen. Es wurden keine so erzielten pilzresistenten Pflanzen gezeigt.

Zusammenfassung des Stands der Technik

Pflanzen enthalten mindestens zwei Klassen von Chitinasen und β-1,3-Glucanasen, nämlich extrazelluläre und intrazelluläre. Die Expression der diese hydrolytischen Enzyme codierenden Gene ist nicht konstitutiv, zumindest nicht in allen Geweben, wird jedoch unter anderem entwicklungs- oder gewebespezifisch reguliert. Die Expression der Gene kann jedoch auch unter bestimmten Stressbedingungen, wie zum Beispiel einer Infektion mit einem nekrotisierenden Pathogen, induziert werden. Meistens geht die Induktion der Synthese von Chitinasen und β-1,3-Glucanasen mit der Induktion einer Resistenz gegen verschiedenste Pathogene, darunter auch phytopathogenen Pilzen, einher. Ob eine kausale Beziehung zwischen Pilzresistenz und Expression der hydrolytische Enzyme codierenden Gene besteht, ist noch unklar.
Die Zellwände phythopathogener Pilze enthalten Glucane und häufig eine gewisse Chitinmenge. Diese Kohlenhydratpolymere stellen Substrate für Glucanasen bzw. Chitinasen dar. Es ist reizvoll, die Hypothese aufzustellen, dass beide hydrolytischen Enzyme für die beobachtete Resistenz verantwortlich sind. In Anbetracht der vielen Beobachtungen, die dieser Hypothese eindeutig widersprechen, ist dies jedoch in keiner Weise naheliegend.
Es ist daher noch unklar, ob hydrolytische Enzyme eine wesentliche Rolle bei der Pilzresistenz spielen oder, wenn dies der Fall ist, wie wichtig ihre Rolle bei der Pilzresistenz ist. Dass eine beliebige Chitinase eine breite Schutzwirkung für Pflanzen gegen phytopathogene Pilze ausüben kann, scheint zumindest zweifelhaft zu sein. Im allgemeinen ist sogar fraglich, ob Chitinasen und Glucanasen alleine fähig sind, einen ausreichenden Schutz gegen verschiedenste pflanzenpathogene Pilze zu bilden.
Die Rolle der hydrolytischen Enzyme bei dem komplexen Vorgang, eine (induzierte) Pilzresistenz zu erwerben, ist in ihren Grundzügen noch immer wenig geklärt. Es existiert jedoch ein Bedarf für ein Verfahren, Pflanzen durch genetische Modifikation wirksam gegen (verschiedenste) phytopathogene Pilze zu schützen.

KURZEDARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, Pflanzen bereitzustellen, die eine verbesserte Resistenz gegen Pilzbefall aufweisen. Dazu werden Pflanzen genetisch dadurch transformiert, dass man in das Genom dieser Pflanzen mindestens ein rekombinantes Polynukleotid mit einem eine Chitinase, vorzugsweise eine intrazelluläre Chitinase, codierenden Gen und einem eine Glucanase codierenden Gen unter der Kontrolle eines Promoters, der in einem oder mehreren Geweben eine ausreichend starke Expression gestattet, einführt.
In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Pflanzen bereit, die ein Gen, das eine intrazelluläre pflanzliche Chitinase, deren Targeting in den Apoplastenraum erfolgt, codiert, und zusätzlich eines oder mehrerere Gene, die ein hydrolytisches Enzym aus der Gruppe der intrazellulären Glucanasen und extrazellulären Glucanasen codieren, konstitutiv exprimieren.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um eine Pflanze, die die für eine intrazelluläre Chitinase, eine extrazelluläre Chitinase, eine intrazelluläre β-1,3-Glucanase und eine extrazelluläre β-1,3-Glucanase codierenden Gene exprimiert. Darunter sind Gene, die die intrazellulären Formen der genannten pflanzlichen hydrolytischen Enzyme codieren, ganz besonders bevorzugt. Noch stärker bevorzugt ist die Verwendung von Genen, die intrazelluläre hydrolytische Enzyme codieren und mittels genetischer Manipulation dahingehend modifiziert sind, dass ein Targeting in den Apoplasten erfolgt. Um ein Targeting der intrazellulären hydrolytischen Enzyme in den Apoplasten zu erzielen, wird das 3'-Ende des für das C-terminale Ende der intrazellulären hydrolytischen Enzyme codierende Gen modifiziert, so dass bei Expression der Gene die Cterminalen Aminosäuren, die an einem intrazellulären Targeting der betreffenden Enzyme beteiligt sind, fehlen. Im allgemeinen ist das Ergebnis solch einer Modifikation, dass mindestens 3 Aminosäuren des C-terminalen Endes, oder soviele Aminosäuren wie gewünscht fehlen, solange die Enzymfunktion und/oder andere entsprechende Domänen des Proteins nicht negativ beeinflusst werden. Solche Modifikationen führen vorzugsweise zur Deletion von 3 bis 25 Aminosäuren bei den intrazellulären β-1,3-Glucanasen und 3 bis 10 Aminosäuren bei den intrazellulären Chitinasen. Stärker bevorzugt sind die Deletionen von 4-8 Aminosäuren.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung sind die rekombinanten DNA-Moleküle mit einer oder mehreren in Pflanzen exprimierbaren DNA-Sequenzen, die mindestens eine pflanzliche Chitinase codiert bzw. codieren, die vorzugsweise so modifiziert ist, dass ein Targeting der Chitinase in den Apoplastenraum erzielt wird, sowie weitere DNA-Sequenzen, die ein oder mehrere hydrolytische Enzyme aus der Gruppe der intrazellulären Glucanasen und extrazellulären Glucanasen codieren.
Bestimmte bevorzugte Ausführungsformen sind die auf dem BcoRI-SstI-Fragment von pMOG200 befindlichen Gene für die intrazellulären Chitinase, das von Petunia hybrida stammende, auf pMOG200 befindliche Gen für die extrazelluläre Chitinase, das auf dem XbaI-SstI-Fragment von pMOG212 befindliche Gen für die intrazelluläre β-1,3-Glucanase, das sich auf dem SstI-UindIII-Fragment von pMOG212 befindliche die extrazelluläre β-1,3-Glucanase codierende Gen, oder Gene, die den genannten Genen im wesentlichen homolog sind.
Besonders bevorzugt sind modifizierte Versionen der intrazelluläre Formen der genannten hydrolytischen Enzyme codierenden Gene, die ein Targeting in den Apoplasten bewirken. Dazu zählen das modifizierte Gen für die intrazelluläre Chitinase von pMOG189 (oder dessen verkürzte Formen, bei denen die Wirksamkeit gegen Pilze erhalten bleibt) sowie modifizierte Formen von Genen für die intrazellulärer Chitinase, die dem Gen für die intrazellulären Chitinase von pMOG189 im wesentlichen homolog sind. Ebenso bevorzugt ist das modifizierte Gen für die intrazelluläre Glucanase von pMOG512, in dem ein Stop-Codon in die Codierregion eingeführt ist, um ein Targeting der produzierten intrazellulären β-1,3- Glucanase in den Apoplasten zu bewirken.
Ausserdem werden Klonierungsvektoren, Expressionsvektoren und Transformationsvektoren mit DNA-Sequenzen, die diese Gene enthalten, sowie Mikroorganismen mit diesen DNA-Sequenzen bereitgestellt.
Zu weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zählen intakte, pilzresistente Pflanzen, die nach erfindungsgemässen Verfahren erhalten wurden, sowie Protoplasten, Zellen, Teile (wie Samen, Früchte, Blätter, Blüten usw.) sowie beliebige andere Teile der Pflanze, die entweder geschlechtlich, ungeschlechtlich oder auf beide Arten vermehrt werden können, sowie Nachkommen dieser Pflanzen.
Die Vorteile und das Anwendungsgebiet sind der folgenden genauen Beschreibung der Erfindung leicht zu entnehmen.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosequenz einer vollständigen cDNA, die einer extrazellulären Chitinase aus Petunia hybrida entspricht. Der senkrechte Pfeil zeigt die Spaltstelle des Signalpeptids.
Für 2 zeigt die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz eines BamHI-DNA-Fragments, das einer intrazellulären Chitinase aus Tabak entspricht. Die Sequenz der Nukleotide 2 bis 22 stammt von einem synthetischen Fragment, während die Nukleotide 23-27 den Rest der EcoRI-Erkennungsstelle bilden. Die PstI-Erkennungsstelle (5'-CTGCAG-3') liegt in Position 129-134. Die letzten 21 Nukleotide der Sequenz stellen der Reihe nach eine aufgefüllte EcoRI-Erkennungsstelle dar, die von einem zur Konstruktion der cDNA-Bibliothek verwendeten EcoRI-Linker-Moleküls stammt, sowie eine SmaI und eine BamHI-Erkennungsstelle, die beide von dem pICl9H-Polylinker stammen. Der Pfeil zeigt die Spaltstelle des Signalpeptids.
Fig. 3 zeigt die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz eines für eine extrazelluläre β-1,3-Glucanase aus Tabak codierenden Gens. Der senkrechte Pfeil zeigt die Stelle in der Aminosäuresequenz, an der das Signalpeptid gespalten wird. Die Position des Introns wird gezeigt; die Sequenz des Introns ist nur teilweise angegeben.
Fig. 4 zeigt die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz eines für eine intrazelluläre β-1,3-Glucanase aus Tabak codierenden Gens. Der senkrechte Pfeil zeigt die Stelle in der Aminosäuresequenz, an der das Signalpeptid gespalten wird.
Fig. 5 ist eine schematische Darstellung des Expressionsvektors pMOG181. Ampr steht für das Ampicillinresistenzgen. Eine eingeklammerte Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym gibt an, dass die betreffende Stelle nicht mehr in dem Plasmid vorhanden ist.
Fig. 6 ist eine schematische Darstellung des Vektors pMOG183, einem Derivat von pMOG181, bei dem die EcoRI-Erkennungsstelle durch eine SstI-Stelle ersetzt ist.
Fig. 7 ist eine schematische Darstellung des Vektors pMOG184, eines Derivats von pMOG181, bei dem die HindIII-Erkennungsstelle durch eine SstI-Stelle ersetzt ist.
Fig. 8 ist eine schematische Darstellung des Vektors pMOG185, einem Derivat von pMOG184, bei dem die EcoRI-Erkennungsstelle durch eine XhaI-Stelle ersetzt ist.
Fig. 9 ist eine schematische Darstellung des binären Vektors pMOG23.
Fig. 10 ist eine schematische Darstellung des binären Vektors pMOG22, einem Derivat von pMOG23, bei dem das Kanamycinresistenzgen (NPTII) durch ein Hygromycinresistenzgen (HPT) ersetzt ist.
Fig. 11 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pMOG200, einem Derivat von pMOG23, bei dem zwei Expressionskassetten in den Polylinker kloniert sind, d. h. eine mit der Codiersequenz für eine intrazelluläre Chitinase (Chil) und eine mit der Codiersequenz für eine extrazelluläre Chitinase (ChiE). Der Pfeil gibt die Transkriptionsrichtung in den Kassetten ausgehend vom CaMV 35S-Promoter an.
Fig. 12 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pMOG212, einem Derivat von pMOG22, bei dem zwei Expressionskassetten in den Polylinker kloniert sind, d. h. eine mit der Codiersequenz für eine extrazelluläre β-1,3-Glucanase (GluE) und eine mit der Codiersequenz für eine intrazelluläre β-1,3-Glucanase (Glul). Der Pfeil gibt die Transkriptionsrichtung ausgehend vom CaMV 35S-Promoter an.

DEFINITIONEN

Unter einem extrazellulären Protein ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Protein zu verstehen, das nach der korrekten Expression in der Ausgangspflanze im Apoplastenraum lokalisiert ist.
Unter einem intrazellulären Protein ist daher ein Protein zu verstehen, das nach der korrekten Expression in der Ausgangspflanze intrazellulär lokalisiert ist.
Der Apoplastenraum ist hier als der extrazelluläre Raum inklusive der pflanzlichen Zellwand definiert.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird von einem Protein dann gesagt, dass es intrazellulär lokalisiert ist, wenn es in einem beliebigen Kompartiment der Zelle, das nicht Bestandteil des Apoplastenraums ist, lokalisiert ist; zu diesen Kompartimenten zählen Zellkerne, Chloroplasten, Mitochondrien, Vakuolen, das endoplasmatische Retikulum, andere Membranorganellen, das Cytoplasma sowie alle Membranen, darunter auch die Plasmamembran.
Von Genen wird gesagt, dass sie im wesentlichen homolog sind, wenn ihre DNA-Sequenzen einander zu über 60% entsprechen, falls nicht anders erwähnt.
Unter Hybridgenen versteht man, dass Gene physisch an Regulatorsequenzen (z. B. Promoter, Enhancer oder DNA-Sequenzen, die eine bestimmte Art der Regulation des Gens vermitteln) gekoppelt sind, die nicht natürlicherweise mit diesem Gen gekoppelt sind, um die ursprüngliche Art seiner Expressionsregulation zu ändern.
Unter Pflanze versteht man eine beliebige monokotyle oder dikotyle Pflanze inklusive der Nachkommenschaft oder Teile solcher Pflanzen, Zellen oder Protoplasten usw., sowie beliebiges anderes Pflanzenmaterial, das transformiert und anschliessend zu einer intakten Pflanze regeneriert werden kann.
Unter relativer Überexpression versteht man eine beliebige Expression eines Hybridgens, die schliesslich zu grösseren Mengen des codierten Proteins in einem vorbestimmten Pflanzenteil im Vergleich zur Expression des Nichthybridgens im gleichen Pflanzenteil der Ausgangspflanze führt.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Angesichts ihrer vermuteten Beteiligung an der Pilzresistenz fand man überraschenderweise, dass aufgereinigte extrazelluläre Chitinasen aus Tabak und Petunie im Vergleich zu intrazellulären Chitinasen keine wesentliche Wirkung gegen Pilze aufweisen. In einem Test gegen Pilze wurden gleiche Mengen chitinolytischer Aktivität von aufgereinigten intrazellulären und extrazellulären Chitinasen anstatt nicht gleicher Proteinmengen verglichen. Die Wirksamkeit der geprüften extrazellulären Formen gegen Pilze war praktisch nicht nachweisbar.
Die Expression eines eine extrazelluläre Chitinase codierenden Hybridgens in einer transformierten Pflanze als solche ist daher nicht ausreichend, um eine Resistenz gegen Pilze zu bewirken. Es kann trotzdem nicht vollständig ausgeschlossen werden, dass extrazellulären Chitinasen eine unterstützende Rolle bei der Resistenz gegen Pilze dadurch zukommt, dass sie die Wirkung anderer vorhandener hydrolytischer Enzyme gegen Pilze verstärkt. Diese Beobachtung hat wichtige Konsequenzen für die Herstellung einer pilzresistenten Pflanze, die auf der Expression von für pflanzliche hydrolytische Enzyme codierenden Genen beruht.
In einer Versuchsreihe wurde die kombinierte Wirkung von Chitinasen und Glucanasen in Gesamtproteinextrakten und extrazellulären Flüssigkeiten von Blättern transgener Pflanzen untersucht.
Tabakpflanzen wurden mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt transformiert, welches im wesentlichen folgendes umfasste:
1. ein Gen, das eine intrazelluläre β-1,3-Glucanase aus Tabak codiert, welche durch Modifikation des C-terminalen Endes einem Targeting in den Apoplasten unterliegt;
2. ein Gen, das eine intrazelluläre Chitinase aus Tabak und die intrazelluläre β-1,3-Glucanase aus Tabak codiert, wobei beide durch Modifikation des Cterminalen Endes der hydrolytischen Enzyme einem Targeting in den Apoplasten unterliegen.
Transgene Tabakpflanzen, die die Hybridgene gut exprimierten, wurden ausgewählt und die extrazelluläre Flüssigkeit (EF) und der Gesamtproteinextrakt (TE) der Blätter wurden isoliert. Sowohl die EF als auch der TE von Pflanze 1, 'die intrazelluläre β-1,3-Glucanase mit Targeting in den Apoplasten exprimiert, wiesen eine schwache Wirksamkeit gegen den Pilz Fusarium solani auf. Die EF und der TE von Pflanze 2, die sowohl die intrazelluläre Chitinase mit Targeting in den Apoptasten als auch die intrazelluläre β-1,3-Glucanase mit Targeting in den Apoplasten exprimierte, wiesen eine überraschend starke Wirkung gegen Pilze auf; diese Wirkung war etwas höher als bei der EF bzw. dem TE einer Pflanze eines früheren Versuchs (die nur das Gen, das für die intrazelluläre Chitinase mit Apoplast-Targeting codierte, exprimierte).
Aus diesen Versuchen lässt sich der Schluss ziehen, dass eine Modifikation des C-terminalen Endes der intrazellulären β-1,3-Glucanase erfolgreich zu einem Targeting des (Grossteils des) Enzyms in den Apoplasten führt und dass die C-terminale Modifikation die Wirksamkeit der intrazellulären β-1,3-Glucanase gegen Pilze nicht negativ beeinflusst. Ausserdem wird gezeigt, dass die Wirkung der Expression sowohl eines Hybridgens für intrazellulären Chitinase als auch eines Hybridgens für intrazellulären β-1,3-Glucanase gegen Pilze höher ist als die Wirkung, die bei Expression jedes dieser Gene allein erzielt wird.
In einem Aspekt der Erfindung werden daher Pflanzen mit einer verbesserten Pilzresistenz bereitgestellt, die ein pflanzliches Chitinase-Hybridgen und ein pflanzliches Glucanase-Hybridgen, die beide unter der Regulation des CaMV 35S-Promoters stehen, exprimieren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Pflanzen bereitgestellt, die mit mindestens einem eine intrazelluläre Chitinase und eine intrazelluläre β-1,3-Glucanase codierenden Gen transformiert wurden. Vorteilhaft ist es, wenn die letztgenannten Pflanzen die modifizierten Formen der hydrolytischen Enzyme exprimieren, so dass bei diesen Enzymen ein Targeting in Apoplasten erfolgt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine Pflanze, die eine intrazelluläre Chitinase, vorzugsweise mit Targeting in den Apoplasten, eine extrazelluläre Chitinase, eine intrazelluläre Glucanase, vorzugsweise mit Targeting in den Apoplasten, sowie eine extrazelluläre Glucanase konstitutiv exprimiert.
Im Prinzip kann jede beliebige Kombination von Genen, die pflanzliche hydrolytische Enzyme codieren, gewählt werden, egal ob sie modifiziert oder nicht modifiziert sind, solange eine genügend starke Expression dieser Gene die Zellfunktion des transformierten pflanzlichen Wirts nicht stört. Ausser Genen, die pflanzliche hydrolytische Enzyme codieren, können auch noch andere pflanzliche oder nichtpflanzliche Gene (z. B. Gene, die von Bakterien, Hefe, Pilzen oder anderen Quellen stammen) verwendet werden.
Die die hydrolytischen Enzyme codierenden pflanzlichen Gene können in bezug auf die zu transformierende Pflanze entweder endogen oder exogen sein.
Natürlich können zusätzlich zu den erwähnten Chitinase- und β-1,3-Glucanasegenen hydrolytische Enzyme codierende Gene auch leicht aus anderen Pflanzenarten isoliert werden. Ausserdem bedeutet der Begriff Gene im vorliegenden Sinn auch, dass diese vollsynthetisch sein können.
Die gewünschten hydrolytischen Enzyme codierenden Gene oder cDNAs lassen sich zum Beispiel aus Tabak (z. B. Legrand u. Mitarb., 1987; Shinshi u. Mitarb., 1987) oder aus der Tomate (Joosten u. Mitarb., 1989) isolieren, eine alkalische intrazelluläre Chitinase lässt sich aus der Kartoffel isolieren (Gaynor, 1988; Kombrink u. Mitarb., 1988), eine extrazellulare Chitinase aus der Gurke (Metraux & Boller, 1986; Metraux u. Mitarb., 1986), und sowohl intrazelluläre Chitinasen als auch intrazelluläre Glucanasen lassen sich aus der Bohne isolieren (Broglie u. Mitarb., 1986; Vögeli u. Mitarb., 1988; Mauch & Staehelin, 1989).
Ausserdem lassen sich Chitinasen und β-1,3- Glucanasen mit Chitosan als Induktor aus der Erbse isolieren (Mauch u. Mitarb., 1984). Weitere Untersuchungen ergaben, dass mindestens fünf Hydrolasen, nämlich zwei alkalische β-1,3-Glucanasen und drei alkalische Chitinasen vorlagen (Mauch u. Mitarb., 1988a). Intrazelluläre und extrazelluläre Chitinasen, die mit einer intrazellulären Chitinase aus der Bohne serologisch verwandt sind, lassen sich aus Allium porrum L. isolieren (Spanu u. Mitarb., 1989). Endochitinasen und Glucanasen lassen sich auch nach Inokulation der Blätter mit BMV (Trespenmosaikvirus) aus Mais isolieren (Nasser u. Mitarb., 1988). Chitinasen, die mit einer intrazellulären Endochitinase aus der Bohne serologisch verwandt sind (Swegle u. Mitarb., 1989), lassen sich aus der Gerste (Hordeum vulgare) isolieren. β-1,3-Glucanasen sowie andere Glucanaseklassen lassen sich ebenfalls aus der Gerste isolieren (Balance u. Mitarb., 1976; Hoj u. Mitarb., 1988, 1989). Es ist bekannt, dass in Hafer mindestens 4 unterschiedliche Chitinasen und 5 unterschiedliche β-1,3-Glucanasen vorkommen (Fink u. Mitarb., 1988).
Natürlich ist das Ausgangsmaterial für die Gewinnung hydrolytischer Enzyme zum Schutz von Pflanzen gegen Pilzbefall nicht auf die obige Liste beschränkt; diese dient nur als Erläuterung.
cDNAs, die pflanzliche Chitinasen und β-1,3- Glucanasen codieren, erhält man geeigneterweise durch Immun-Screening einer cDNA-Expressionsbibliothek, die mit polyA+-RNA hergestellt wurde, welche aus Pflanzen nach der Induktion der Synthese der hydrolytischen Enzyme mit Hilfe eines Antikörpers gegen das gewünschte hydrolytische Enzym isoliert wurden. Um korrekt exprimiert zu werden, müssen die Gene operativ mit einem Promoter verbunden sein.
Die Wahl des Promoters hängt von dem gewünschten Expressionsniveau und der gewünschten Art, auf die die Gene unter seiner Kontrolle reguliert werden, ab. All dies entspricht dem normalen Fachwissen.
Vorzugsweise verwendet man starke konstitutive Promoter, die in der gesamten Pflanze funktionsfähig sind, wobei sie die Entwicklungsmuster so wenig wie möglich einschränken. Ein Beispiel eines konstitutiven Promoters für starke Expression ist der CaMV 35S-Promoter. Dieser Promoter kann von sogenannten Enhancer-Sequenzen flankiert sein (McGuilley u. Mitarb., 1987), um das Expressionsniveau weiter zu verstärken. Zu weiteren Beispielen von starken lichtinduzierbaren Promotern zählen unter anderen der Promoter der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphatcarboxylase (r cSSU), der Promoter des Chlorophyll a/b Bindungsproteins (Cab) und so weiter. Gelegentlich kann es erwünscht sein, die Expression des eingeführten Hybridgens auf ein oder wenige vorbestimmte Gewebe zu beschränken, zum Beispiel auf diejenigen, auf die der Pilzbefall abzielt, wie Wurzeln und Epidermiszellen und so weiter. Ein gutbekanntes Beispiel eines gewebespezifischen Promoters ist zum Beispiel der wurzelspezifische Patatin Klasse-II Promoter. Die Expression von Hybridgenen kann auch von äusseren Reizen wie Verwundung, Trockenheit, Temperatur und so weiter abhängig sein.
Im allgemeinen ist das Gen bzw. sind die Gene der Wahl in einer Expressionskassette enthalten, die mindestens einen Promoter und einen Transkriptionsterminator enthält, welche gegenüber dem Gen fremd sein können. Es ist gut bekannt, wie solche Elemente verbunden sein müssen, um richtig zu funktionieren, und dies kann bestimmt werden, ohne erfinderisch tätig zu sein. Gelegentlich enthalten (genomische) Eukaryontengene Introns. Das Vorhandensein solcher Introns, egal ob diese natürlich sind oder durch genetische Modifikationen eingeführt wurden, ist im Zusammenhang mit der Erfindung nicht besonders wichtig. Die Techniken für die Manipulation von Genen stehen dem Fachmann bereits zur Verfügung (siehe z. B.: Maniatis u. Mitarb., 1982).
Zusätzlich zu Genen, die hydrolytische Enzyme codieren, können auch Gene, die andere Proteine codieren, welche eine zusätzliche Wirkung auf die Resistenz gegen Erreger haben, in die interessierende Pflanze eingeführt werden, um die Wirkung zu verbessern oder das Erregerspektrum zu erweitern. Solche Proteine werden geeigneterweise aus der Gruppe, die z. B. Lectine, den Trypsininhibitor aus der Langbohne (CpTI), Bacillus thuringiensis-Toxine und so weiter enthält, ausgewählt.
Zur Gewinnung von transgenen Pflanzen, die konstitutiv mehr als ein Hybridgen exprimieren können, stehen mehrere Möglichkeiten zur Verfügung, die von der vorliegenden Erfindung umfasst sind, darunter die folgenden:
A. die Verwendung eines rekombinanten Polynukleotids, z. B. eines Plasmids, mit mehreren modifizierten Genen, die physisch an ein Selektionsmarkergen gekoppelt sind.
B. Fremdbestäubung transgener Pflanzen, die bereits ein oder mehrere Hybridgene, die mit einem einen Selektionsmarker codierenden Gen gekoppelt sind, exprimieren können, mit Pollen einer transgenen Pflanze, die ein oder mehrere an einen anderen Selektionsmarker gekoppelte Genkonstrukte enthalten. Das Saatgut, das aus dieser Kreuzung entsteht, wird anschliessend auf der Grundlage des Vorhandenseins der beiden Marker selektiert. Die von den selektierten Samen erhaltenen Pflanzen können anschliessend für weitere Kreuzungen verwendet werden.
C. Verwendung von mehreren verschiedenen rekombinanten Polynukleotiden, z. B. Plasmiden, mit jeweils einem oder mehreren Hybridgenen und einem anderen Selektionsmarker. Ist die Kotransformationsfrequenz hoch, dann reicht die Selektion auf der Grundlage von nur einem Marker aus. Andernfalls wird die Selektion auf der Grundlage von mehr als einem Marker bevorzugt.
D. Aufeinanderfolgende Transformationen von transgenen Pflanzen mit neuen zusätzlichen Hybridgenen und Selektionsmarkergenen.
E. Kombinationen der obengenannten Ansätze. Welcher Ansatz tatsächlich verwendet wird, ist für die beschriebene Erfindung nicht kritisch und kann leicht aufgrund von Faktoren wie dem gewünschten Konstrukt, den verfügbaren Materialien und der Vorliebe der Fachleute bestimmt werden.
Für die Transformation von Pflanzen stehen mehrere Techniken zur Verfügung. Die Wahl der Technik ist im allgemeinen für die Erfindung nicht kritisch, solange das transformierende Genkonstrukt, das die erfindungsgemässen Gene und Regulationselemente enthält, in eine Pflanze eingeführt und in das Genom dieser Pflanze stabil integriert werden kann.
Zur Erläuterung seien beispielhaft die folgenden erwähnt: Protoplastentransformation mit der Calcium/Polyethylenglykolmethode (Krens u. Mitarb., 1982; Negrutiu u. Mitarb., 1987), Elektroporation (Zitat) sowie Mikroinjektion (Crossway u. Mitarb., 1986), Beschuss mit (umhüllten) Partikeln (Klein u. Mitarb., 1987), Infektion mit Viren usw. Nach der Selektion und/oder dem Durchmustern auf transformiertes Pflanzenmaterial wird das transformierte Material nach fachbekannten Methoden zu intakten Pflanzen regeneriert.
Anschliessend werden transformierte Pflanzen auf das Vorhandensein der gewünschten Eigenschaften und/oder das Ausmass, in dem die gewünschten Eigenschaften exprimiert werden, ausgewertet. Eine erste Auswertung kann zum Beispiel das Expressionsniveau der neu eingeführten Gene, den Grad der Pilzresistenz der transformierten Pflanzen, stabile Erblichkeit der gewünschten Eigenschaften, Feldversuche usw. umfassen.
Zweitens können, falls gewünscht, die transformierten Pflanzen mit anderen Sorten gekreuzt werden, zum Beispiel mit Sorten, die einen höheren Marktwert haben oder Sorten, in die andere erwünschte Merkmale bereits eingeführt wurden, oder die für die Herstellung von Hybridsamen verwendet werden oder mit denen ein weiterer Transformationsschritt durchgeführt wird usw.
Pflanzen oder deren für den Markt interessante Teile mit einer verbesserten Resistenz gegen phytopathogene Pilze können im Feld oder in Treibhäusern angebaut werden und anschliessend als Tierfutter, für den direkten Konsum durch den Menschen, für die Langzeitlagerung, in der nahrungsmittelverarbeitenden Industrie und in anderen Industriezweigen usw. verwendet werden. Die Vorteile der erfindungsgemässen Pflanzen bzw. deren Teile sind ein verringerter Bedarf an Fungizidbehandlungen, was die Material- und Arbeitskosten erniedrigt und die Umweltverschmutzung verringert, bzw. eine verlängerte Lagerfähigkeit der Produkte (z. B. Früchte, Samen usw.) solcher Pflanzen.
Jede beliebige Pflanzenart oder -sorte, die in irgendeiner Form von Pilzen befallen werden kann, kann mit einem oder mehreren erfindungsgemässen genetischen Konstrukten transformiert werden, um die Infektionsrate und/oder die Auswirkungen eines solchen Befalls zu verringern. Zur Erläuterung sind die Arten der folgenden Liste, die keine Beschränkung darstellt, von besonderem Interesse: essbare Blüten wie Blumenkohl (Brassica oleracea), Artischoke (nan. scolymus), (essbare Blüten); Zierblüten wie zum Beispiel Chrysanthemum, Lilie, Rosa; essbare Früchte wie zum Beispiel Apfel (z. B. Malus domesticus), Banane, Beeren (z. B. Johannisbeere, Ribes rubum), Süsskirsche (Pmnus avium), Gurke (Cucumis sativus), Weintraube (Vitis vinifera), Zitrone (Citrus limon), Melone (Cucumis sativus), Nüsse (z. B. Walnuss Juglans regia), Orange, Pfirsiche (Prunus persica), Birne (Pyra communis), Paprika (Solanum capsicum), Pflaumen (Prunus domestica), Erdbeere (Fragaria), Tabak (Nicotiana), Tomate (z. B. Lycopersicon esculentum); Blattgemüse wie Kohl (Brassica), Endivie (Cichoreum endivia), Salat (Lactuca sativa), Spinat (Spinacia oleraceae), Lauch (Allium porrum); essbare Wurzeln wie zum Beispiel Rübe (Beta vulgaris), Karotte (Daucus carota), Stoppelrübe/Kohlrübe (Brassica rapa), Radieschen (Raphanus sativus) (essbare Wurzeln); essbare Samen wie zum Beispiel Bohne (Phaseolus), Erbse (Pisum sativum), Sojabohne (Glycine max), Weizen (Triticum aestivum), Gerste (Hordeum vulgare), Mais (Zea maya), Reis (Oryza); essbare Knollen wie Kohlrabi, Kartoffel (Solanum tuberosum), usw.
Die folgenden Anwendungsbeispiele dienen dazu, die Erfindung weiter zu erläutern und stellen keine Begrenzung oder Beschränkung der vorliegenden Erfindung dar.

VERSUCHSTEIL

BEISPIEL 1

Test auf Wirkung gegen Pilze

Die Wirkung verschiedener Proteinlösungen auf das Pilzwachstum wurde in einem Mikrotiterplattentesic geprüft. In jedes Näpfchen einer Mikrotiterplatte mit 24 Näpfchen wurden 250 ul Kartoffeldextroseagar (PDA) pipettiert. Pilzsporen wurden in Wasser suspendiert und die Näpfchen wurden mit 300-500 Sporen in 50 ul versetzt. Die Sporen wurden über Nacht vorkeimen gelassen. Anschliessend versetzte man mit 100 ul sterilfiltrierter (0,22 um Filter) Proteinlösungen. Als Kontrolle wurden die Proteine 10 Minuten lang abgekocht. Die Mikrotiterplatten wurden mit Parafilm verschlossen und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 1-2 Tagen wurde das Myzel des wachsenden Pilzes in den Näpfchen mit Lactophenol-Baumwollblau gefärbt und das Ausmass des Wachstums abgeschätzt.

BEISPIEL 2

Chitinaseaktivitätstest

Die Chitinaseaktivität wurde durch Strahlungsmessung mit tritiummarkiertem Chitin als Substrat gemessen (Molano u. Mitarb., 1977). Das tritiummarkierte Chitin wurde durch Acetylierung von Chitosan mit tritiummarkiertem Anhydrid dargestellt (Molano u. Mitarb., 1977). Die spezifische Aktivität des Endprodukts betrug ungefähr 1,2 · 10&sup6; cpm/mg. Vor der Verwendung wurde das tritiummarkierte Chitin dreimal gewaschen. 100 ul 10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 6,4 mit 0,02% Natriumazid wurden mit 50 ul tritiummarkiertem Chitin (ungefähr 150.000 cpm) und 50 ul Proteinlösung versetzt. Die Mischung wurde unter Schütteln 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 600 ul 10%iger Trichloressigsäure gestoppt. Das Chitin wurde zu einem Pellet abzentrifugiert (10 Minuten in einer Mikrozentrifuge), und anschliessend wurden 500 ul des Überstands durch Glaswolle filtriert und in ein Szintillationsröhrchen pipettiert. Man versetzte mit 5 ml Szintillationsflüssigkeit und bestimmte die Radioaktivität. Die freigesetzte Radioaktivität (als Zählimpulse pro Minute) wurde als Mass für die Chitinaseaktivität genommen.

BEISPIEL 3

Chitinaseaktivität gegen Pilze

Die Aktivität von Chitinasen gegen Pilze wurde in dem oben beschriebenen Mikrotiterplattentest unter Verwendung des Pilzes Fusarium solani bestimmt. Zwei gereinigte extrazelluläre Tabak-Chitinasen (auch als pathogeneseassoziierte Proteine P und Q bekannt), eine gereinigte intrazelluläre Tabak-Chitinase (32-kD-Protein) und eine gereinigte extrazelluläre Petunien-Chitinase wurden geprüft. In allen Fällen betrug die zugesetzte Aktivität ungefähr 2000 Zählimpulse pro Minute (was bedeutet, dass diese Aktivität im Chitinasetest 2000 cpm aus tritiummarkiertem Chitin freisetzt). Diese Aktivität liegt in dem Bereich, in dem zwischen der Proteinkonzentration und der Aktivität eine lineare Beziehung besteht. Als Kontrollen wurden Rinderserumalbumin (BSA), Puffer oder hitzeinaktivierte Chitinase zugegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Wachstumshemmung von Fusarium solani durch Chitinasen.

Zugesetztes Protein Hemmung
extrazelluläre Petunien-Chitinase -
extrazelluläre Petunien-Chitinase, abgekocht -
extrazelluläre Tabak-Chitinase (PR-P) -
Tabak-PR-P, abgekocht
extrazelluläre Tabak-Chitinase (PR-Q) -
Tabak-PR-Q, abgekocht
intrazelluläre 32-kD-Tabak-Chitinase +
intrazelluläre 32-kD-Tabak-Chitinase, abgekocht -
BSA -
Puffer -
- keine Hemmung; +. Hemmung
Aus den Ergebnissen in Tabelle I ist ersichtlich, dass die extrazellulären Tabak- und Petunien-Chitinasen keine Wirkung gegen Pilze aufweisen.

BEISPIEL 4

4.0 Klonierung von cDNAs die Chitinase entsprechen

Polyadenylierte RNA wurde aus TMV-infiziertem Tabak der Sorte Samsun NN isoliert, und DuplexcDNA wurde unter Verwendung von Oligo(dT) als Primer unter Verwendung von fachbekannten Standardtechniken hergestellt (Hooft von Huijsduijnen u. Mitarb., 1986). Die Duplex-DNA wurde mit "C-Schwänzen" versehen, die mit "G-Schwänzen" hybridisiert wurden, welche in das Plasmid pUC9 eingeführt wurden, nachdem dieses Plasmid mit stI geöffnet wurde (Maniatis u. Mitarb., 1982). Die so erhaltenen Konstrukte wurden zur Transformation von Escherichia coli MH-1 verwendet. Die Transformanten wurden in doppelter Ausführung auf nitrozellulose Filter übertragen. Das erste Filter wurde in vitro mit transkribierter cDNA von Poly(A)-RNA aus TMV-infiziertem Tabak hybridisiert, während das andere Filter mit cDNA gegen Poly(A)-RNA aus gesundem Tabak hybridisiert wurde (Maniatis u. Mitarb., 1982). Transformanten, die besser mit der ersten Sonde als mit der zweiten hybridisierten, enthielten cDNA, die mRNAs entsprach, deren Synthese durch die TMV-Infektion induziert war. Die gewonnenen cDNA-Klone liessen sich aufgrund der Kreuzhybridisierung der Inserte in sechs Cluster einteilen: innerhalb eines Clusters hybridisieren die Inserte aller Klone miteinander, während zwischen den Clustern unter den verwendeten Hybridisierungs- und Waschbedingungen (0,1 SSC, 1% SDS, 65ºC; Maniatis u. Mitarb., 1982) keine Kreuzhybridisierung stattfand (Hooft von Huijsduijnen u. Mitarb., 1986). Durch Northern-Blot- Analysen, die dem Fachmann gut bekannt sind, wurde bestätigt, dass die Synthese der mRNAs, die den Inserten der Klone der sechs Cluster entsprechen, durch TMV induzierbar war (Hooft von Huijsduijnen u. Mitarb., 1986).
Durch Immunprezipitationen von in-vitro-Translationsprodukten von mRNAs mittels selektiver Hybridisierung mit (den Insertionen von) cDNA-Klonen der sechs Cluster wurde festgestellt, dass die Klone von zwei Clustern, nämlich D und F, den mRNAs für Proteine, die serologisch mit den sogenannten PR-Proteinen P und Q verwandt waren, entsprachen (Hooft von Huisduijnen u. Mitarb., 1987). Die Versuche wurden mit Standardtechniken durchgeführt, die dem Fachmann bekannt sind. Die PR-Proteine P und Q wurden bereits früher als extrazelluläre saure Chitinasen identifiziert, und Antikörper gegen die beiden Proteine gehen mit den zwei alkalischen Chitinasen, die auch im Tabak vorhanden sind, eine Kreuzreaktion ein (Legrand u. Mitarb., 1987).
Inserte von Klonen der Cluster D und F wurden in M13- Vektoren subkloniert und die Sequenz der Insertionen wurde nach dem Verfahren von Sanger u. Mitarb. (1977) bestimmt. Ein Klon von Cluster F, nämlich PROB3, schien eine 412 Basenpaare lange Insertion zu enthalten, in der ein offenes Leseraster existiert, das für 109 Aminosäuren codiert, deren Sequenz mit der C-terminalen Sequenz einer alkalischen Tabak-Chitinase identisch zu sein scheint (Hooft von Huijsduijnen u. Mitarb., 1987). Die Aminosäuresequenz dieser Chitinase wurde aus der Nukleotidsequenz eines cDNA-Klons, nämlich pCHN50, bestimmt (Shinshi u. Mitarb., 1987). Cluster F inklusive Klon PROB3 entspricht daher einer oder mehreren intrazellulären alkalischen Chitinasen aus Tabak.
Cluster D enthält einen Klon, nämlich PROB30, mit einer Insertion von 404 Basenpaaren, in der ein offenes Leseraster existiert, das 67 Aminosäuren codiert (Hooft von Huijsduijnen u. Mitarb., 1987). Die Homologie zwischen den von den Nukleotidsequenzen der Insertionen von PROB3 und PROB30 abgeleiteten Aminosäuresequenzen scheint 65% zu betragen, während die Nukleotidsequenzen selbst nur zu 56% homolog waren. Hieraus zog man den Schluss, dass PR0B30 einer Chitinase entspricht, die mit der intrazellulären Chitinase verwandt ist, jedoch nicht mit dieser identisch ist. Nachdem Aminosäure-Teilsequenzen für die PR-Proteine P und Q bestimmt worden waren, zog man den Schluss, dass PROB30 dem PR-Protein P, einer extrazellulären sauren Chitinase aus Tabak, entsprach.

4.1 Konstruktion von cDNA-Klonen, die eine vollständige extrazelluläre Chitinase codieren

Um cDNA-Klone zu erhalten, die die vollständige Codiersequenz für die Chitinasen enthalten, wurde der Klon PROB30 als Sonde für die Selektion von Klonen einer Petunia hybrida-cDNA-Bibliothek verwendet. DuplexcDNA wurde wie oben beschrieben synthetisiert, mit EcoRI-Methylase behandelt, mit EcoRI-Linkern ausgestattet, mit den Armen des Vektors lambda gtll ligiert und in E. coli Y1090 transfiziert, wobei ganz nach dem Verfahren vorgegangen wurde, das in der Gebrauchsanleitung von dem "cDNA cloning system lambda gt11" (Amersham International plc, 1986) beschrieben ist. Anschliessend wurde die neu konstruierte Bibliothek mit der Plaque- Hybridisierungstechnik von Benton und Davis (1977) durchmustert, wobei der oben beschriebene saure Chitinase-cDNA-Klon als Sonde diente. Auf diese Weise erhielt man fünf rekombinante Phagen mit Sequenzen, die zu PROB30 homolog waren. Rekombinante Phagen-DNA wurde isoliert und die Insertionen wurden anschliessend mit EcoRI herausgeschnitten und in ein pUC-Plasmid subkloniert, wodurch man zu den Klonen D1, D2, D5, D6 und D8 gelangte. Nachdem Abschnitte in M13-Phagen subkloniert worden waren, wurden die Nukleotidsequenzen der ursprünglichen Insertionen vollständig oder teilweise bestimmt. Fig. 1 ist eine Darstellung der Sequenz von Klon D1 und einer abgeleiteten Aminosäuresequenz. Die ersten und letzten 7 Nukleotide stammen von den EcoRI- Linkern, die zur Konstruktion der Bibliothek verwendet wurden. Die Sequenz von acht A-Resten am Ende der Insertion direkt vor der EcoRI-Erkennungsstelle stellen den Rest des poly(A)-Schwanzes der ursprünglichen mRNA dar, was daher die Orientierung der Insertion, die zuvor durch das grosse offene Leseraster zugeordnet worden war, sowie die Homologie zu der abgeleiteten Aminosäuresequenz anderer Chitinasen bestätigt (siehe oben). Die Insertion von Klon D5 scheint am 5'-Ende 10 Nukleotide länger zu sein als diejenige von D1; der Rest des poly(A)-Schwanzes wurde jedoch wie auch bei der Insertion von D6 25 Nukleotide vorher in der Sequenz gefunden. Soweit nachgewiesen werden konnte, schienen die Sequenzen der Insertionen von D8, D2 und D6 mit denen von D1 und D5 identisch zu sein.
Die Homologie zwischen der bestimmten Aminosäuresequenz des Petunia-Klons D1 und des Tabak-Klons PROB30 beträgt ungefähr 80%. Bei PROB30 handelt es sich um einen partiellen cDNA-Klon, der dem PR-Protein P, einer extrazellulären Chitinase, entspricht. In Analysen von transgenen Pflanzen wurde bestätigt, dass die an D1 codierte Chitinase zumindest beim Tabak extrazellulär lokalisiert ist. D1 enthält daher die vollständige, eine extrazelluläre Chitinase codierende Nukleotidsequenz.
Um die einer extrazellulären Chitinase entsprechende cDNA auf einem BamHI-Fragment zu klonieren, wurden die folgenden Versuche durchgeführt.
Es wurden zwei der Oligonukleotide, nämlich 5'- AGCTTGGATCCGTCGACGGTCCT-3' und 5' - AATTAGGATCCGTCGACGGATCCA-3' synthetisisiert und miteinander hybridisiert, wodurch man zu einem Duplex-DNA- Fragment gelangte, dessen ein Ende mit der HindIII-Erkennungsstelle und ein Ende mit der EcoI-Erkennungsstelle kompatibel war. Ausserdem enthielt das Fragment Erkennungsstellen für BamHI, HincII und nochmals BamHI. Dieses Fragment wird in pUC19 kloniert, mit EcoRI und HindIII geöffnet, wodurch die HindIII-Erkennungsstelle wiederhergestellt wird, die EcoRI-Erkennungsstelle jedoch nicht.
Das neue Plasmid wurde pUC19+ genannt. Nachdem die Enden der EcoRI-Insertionen von Klon D1 gemäss Standardtechniken mit Klenow-Polymerase aufgefüllt worden waren, wurde das Fragment in die HincII-Stelle von pUC19+ kloniert.

4.2 Konstruktion eines cDNA-Klons, der eine vollständige intrazelluläre Chitinase codiert

Durch Durchmustern einer neuen Samsun-NN-Bibliothek (die gleich wie die oben beschriebene petunia- Bibliothek konstruiert wurde) mit der PROB3-Insertion erhielt man einen rekombinanten Phagen. Die Insertion dieses Phagen wurde als EcoRI-Fragment in ein Plasmid subkloniert, wodurch man zu Klon F1 gelangte. Die Aufklärung der Primärstruktur zeigte, dass die Nukleotidsequenz der Insertion von F1 mit dem Klon pCHN50, der von Shinshi und Mitarbeitern (1987) charakterisiert worden war, identisch war. Da die Insertion von pCHN50 als Sequenz, die der intrazellulären Chitinase aus Tabak entsprach, charakterisiert worden war, wurde der Schluss gezogen, dass die Insertion von El ebenfalls einer intrazellulären Chitinase entspricht. Die Insertion von pCHN50 enthält nicht die gesamte Codiersequenz und ist daher unvollständig. Obwohl die Insertion von F1 am 5'-Ende um 30 Nukleotide länger ist als pCHN50 ist die in F1 enthaltene Chitinase-Codiersequenz ebenfalls unvollständig.
Um ein Fragment mit einer Sequenz, die für eine vollständige Chitinase codiert, zu erhalten, wurden die folgenden Klonierungsschritte durchgeführt. Die Insertion von F1 wurde als EcoRI-Fragment so in pICl9H (Marsh u. Mitarb., 1984) geklont, dass das 3'-Ende der Insertion richtig an die BamHI-Stelle des Polylinkers gelangte. Auf diese Weise erhielt man das Plasmid pIC19/F1.
Zwei Oligonukleotide (5'-GATCCAACATGAGGCTGTGCA- 3' und 5'-AATTTGCACAGCCTCATGTTG-3'), die nach Hybridisierung miteinander ein Fragment bilden, wurden synthetisiert. Dieses Fragment wird zusammen mit dem EcoRI- PstI-Fragment in einer Dreifachligation in ein mit BamHI-PßtI geöffnetes pUC-Plasmid kloniert, wobei das 5'-Ende des offenen Leserasters in der Insertion von pICl9/F1 liegt. Diese Klonierung führt zu pUC/5'F1. Die Sequenz der Oligonukleotide wurde so gewählt, dass das Fragment fünf Aminosäuren codierte, sowie so, dass die EcoRI-Erkennungsstelle in dem schliesslich erhaltenen BamHI-PstI-Fragment eliminiert war und die Tripletts für diese fünf Aminosäuren in Phase mit dem offenen Leseraster in F1 waren. Nachdem pICl9H/F1 mit Hindill und (teilweise) mit Pstl verdaut worden war, wurde das HindIII/PstI-Fragment mit dem 3'-Teil der Insertion in einen Zwischenvektor ohne EcoRI-Erkennungsstelle kloniert. Die EcoRI-Stelle auf dem Ende der Insertion wurde durch Auffüllen und Rückligation ersetzt, also mittels Techniken, die dem. Fachmann bekannt sind. Nach Elimination der EcoRI-Erkennungsstelle wurde das HindIII-PstI-Fragment in pUC/5'Fa kloniert. Das so erhaltene Plasmid enthält auf einem BamHI-Fragment eine cDNA mit einer vollständigen Codiersequenz für eine intrazelluläre Chitinase aus Tabak. In Fig. 2 ist die Sequenz dieses BamHI-Fragments mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz dargestellt. Die Sequenz der Nukleotide 2 bis 22 stammt von dem synthetischen Fragment, während die Nukleotide 23-27 den Rest der EcoRl-Erkennungsstelle bilden. Die PstI-Erkennungsstelle (5'- CTGCAG-3') liegt in Position 129-134. Die letzten 21 Nukleotide dieser Sequenz stellen der Reihe nach eine aufgefüllte E~RI-Erkennungsstelle, die von einem zur Konstruktion der cDNA-Bibliothek verwendeten EcoRI-Linkermolekül stammt, eine SmaI- und eine B~ mHI-Erkennungsstelle, die beide von dem Polylinker von pIC19H stammen, dar.

4.3 Konstruktion eines Gens, das eine intrazelluläre Chitinase codiert, die für ein Targeting in den Apoplasten modifiziert ist.

Zur Konstruktion eines Gens, das eine intrazelluläre Chitinase mit Targeting in den Apoplasten codiert, wurde die in Fig. 2 dargestellte Sequenz des intrazellulären Chitinasegens modifiziert. Das G in Position 961 wurde in ein T umgeändert, wodurch ein Stopcodon erzeugt wurde. Ein zweites Stopcodon wurde dadurch eingeführt, dass man den T-Rest in Position 968 durch ein A ersetzte. Durch eine Veränderung des T- Rests in Position 975 zu einem C schuf man eine SalI- Stelle. Diese Modifikationen wurden dadurch eingeführt, dass man eine dem Fachmann bekannte Technik der überlappenden Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendete. Nachher wurde die ganze Seguenz auf eine eventuelle Einführung von Mutationen aufgrund der PCR-Technik überprüft.

BEISPIEL 5

5.0 Klonierung von Genen, die extra und intrazelluläre Glucanasen codieren

Die oben beschriebene lambda gtll Tabak-cDNA- Bibliothek wurde mit Antiserum von Kaninchen, die mit den Tabak-PR-Proteinen 2 und N immunisiert worden waren, auf rekombinante Phagen, die PR-2, PR-N oder verwandte Sequenzen exprimieren, durchmustert. Die Technik, nach der man vorging, beruhte auf den von Huynh u. Mitarb. (1985) beschriebenen Methoden, und es kann angenommen werden, dass diese dem Fachmann bekannt sind. Die Insertion eines nach dieser Methode identifizierten rekombinanten Phagen wurde als Sonde verwendet, um die Bibliothek nochmals zu durchmustern, dies mal jedoch mit der Plaque-Hybridisierungstechnik von Benton & Davis (1977). Mit dieser Methode wurden 30 rekombinante Phagen identifiziert. Die Insertionen in der DNA dieser Phagen wurden mit EcoRI geöffnet und in ein pUC-Plasmid subkloniert. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Restriktionsmuster wurden die so erhaltenen Klone in mehrere Gruppen eingeteilt. Nach dem Subklonieren in ein M13- Vektoren wurden die Nukleotidsequenzen mehrerer Klone jeder Gruppe bestimmt und die Aminosäuresequenzen der von ihnen codierten Peptide wurden abgeleitet. Aus diesen Untersuchungen in Kombination mit dem Vergleich der so erhaltenen Sequenzen mit vorbekannten Sequenzen geht hervor, dass bei mindestens fünf Klongruppen jeder eine einzigartige β-1,3-Glucanase codiert. Hybridisierungsversuche mit Gesamt-RNA aus Tabak, wobei eine der Glucanase-cDNAs als Sonde verwendet wurde, zeigten, dass diese Glucanase-mRNAs auch nach Induktion mit Salicylat oder im Anschluss an TMV-Infektion synthetisiert wurden (Memelink u. Mitarb., 1989).

5.1 Isolation von Genen, die extrazelluläre β-1,3- Glucanasen codieren

Unter Verwendung eines der oben beschriebenen cDNA-Klone wurde eine DNA-Genombibliothek aus dem Zellkern von Samsun-NN-Tabak teilweise mit Sau3AI geöffnet (Cornelissen u. Mitarb., 1987) und anhand von rekombinanten Phagen mit Glucanasen codierenden Genen durchmustert. Man erhielt mehrere rekombinante Phagen, von denen vier, nämlich gIl, g13, g14 und g19 (PR-N) näher charakterisiert wurden. Durch Southern-Blot-Analysen erhielt man Restriktionskarten, die zeigten, dass jeder der vier Klone ein einzigartiges Gen enthielt. Nach dem Subklonieren in eine Reihe von pUC-Plasmide und M13- Vektoren wurden mit g13 und g19 Sequenzanalysen durchgeführt. Die Sequenz des Gens vom Klon g19 sowie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Fig. 3 dargestellt. Aus Vergleichen geht hervor, dass angesichts der Tatsache, dass die 21. Aminosäure am C-terminalen Ende, ein Threoninrest, in PR36 nicht vorzuliegen schien, diese Aminosäuresequenz mit derjenigen der extrazellulären β-1,3-Glucanase PR36, deren Aminosäuresequenz teilweise aufgeklärt worden war (Van den Bulcke u. Mitarb., 1989) identisch ist. Das hier beschriebene Gen ist die erste isolierte und charakterisierte DNA- Sequenz, die eine extrazelluläre β-1,3-Glucanase codiert.
Um das Gen in einen Expressionsvektor zu klonieren, wurden die folgenden Behandlungen durchgeführt. Mit der fachbekannten PCR-Technik wurde eine BamHI-Erkennungsstelle vor dem Gen und eine HindIII-Erkennungsstelle nach dem Gen eingeführt. Anschliessend wird die Sequenz auf die eventuelle Einführung von Mutationen aufgrund der PCR-Technik überprüft. Nach Ligation des Gens als BamHI-HINdIII-Fragment in den Expressionsvektor pMOG183 (siehe Punkt 6) und im Auschluss an Linearisierung durch Öffnung mit BamHI und HindIII gelangt man zu einer Expressionseinheit auf einem SCI-HindIII- Fragment mit dem Transkriptionsterminator des Glucanasegens selbst.

5.2 Isolation von Genen, die intrazelluläre Glucanasen codieren

Ein Klon, der einer intrazellulären Glucanase entspricht (Memelink, u. Mitarb., 1989), wird als Sonde zum Durchmustern der oben beschriebenen Genombibliothek verwendet. Obwohl viele rekombinante Phagen mit einzigartigen Insertionen erhalten wurden, schien es nach der Restriktionsanalyse, dass nur 2 einzigartige Gene betroffen sind. Die DNA des einen Phagen, nämlich gGLB50, wurde durch Southern-Blot-Analyse, Subklonieren und durch Aufklärung der Primärstrukturen von Insertionen der relevanten Subklone weiter charakterisiert, wobei immer unter Verwendung von fachbekannten Techniken vorgegangen wurde. Die Primärstruktur des schliesslich erhaltenen Gens sowie der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz sind in Fig. 4 dargestellt.
Aus Vergleichen geht hervor, dass diese Aminosäuresequenz in äusserst starkem Ausmass der Sequenz einer intrazellulären alkalischen β-1,3-Glucanase aus Tabak, wie etwa von Shinshi und Mitarbeitern (1988) von den Sequenzen mehrerer überlappender cDNA-Klone abgeleitet, homolog ist. Obwohl die cDNAs möglicherweise einander stark entsprechen, handelt es sich trotzdem um unterschiedliche Gene. Mindestens einer der cDNA-Klone enthält eine Insertion mit einer Sequenz, die mit einem Teil des hier beschriebenen Gens identisch ist.
Um das Gen in einen Expressionsvektor zu klonieren, wurden die folgenden Schritte durchgeführt. Unter Verwendung der fachbekannten PCR-Technik wird eine BamHI-Erkennungsstelle vor dem Gen und eine SstI-Erkennungsstelle nach dem Gen eingeführt. Anschliessend wird die Sequenz auf die eventuelle Einführung von Mutationen aufgrund der PCR-Technik überprüft. Nach Ligation des Gens als BamHI-SntI-Fragment in den Expressionsvektor pMOG185 (siehe Beispiel 6) und nach Linearisierung des Vektors durch Verdauung mit BamH1 und Sstl entsteht eine Expressionseinheit auf einem XbaI-Sst.I-Fragment mit dem Transkriptionsterminator des Glucanasegens selbst.
Zusätzlich wird unter Verwendung der PCR-Technik vor dem Gen eine BamHI-Erkennungsstelle eingeführt. Die Sequenz wird nachher auf die eventuelle Einführung von Mutationen aufgrund der PCR-Technik überprüft. Anschliessend wird das das Glucanasegen enthaltende BamHI-XbaI-Fragment in das Plasmid pIC19H (Marsh u. Mitarb., 1984) kloniert, nachdem das Plasmid durch Verdauung mit BarnHI und XbaI linearisiert wurde. Nach Linearisierung des Expressionsvektors pMOG 183 (siehe Punkt 6) durch Verdauung mit BamHI und indill wurde das Gen in diesem Vektor als BamHI-indIII-Fragment ligiert, was zu einer Glucanaseexpressionseinheit auf einem SstI-HindIII-Fragment mit dem Transkriptionsterminator des Glucanasegens selbst führte.

5.3 Konstruktion eines Gens das eine intrazelluläre Glucanase codiert, die für ein Targeting des Proteins in den Apoplasten modifiziert ist.

Zur Konstruktion eines Gens, das eine intrazelluläre Glucanase mit Targeting in den Apoplasten codiert, wurden in der Sequenz des in 5.2 beschriebenen intrazellulären Glucanasegens Modifikationen durchgeführt. Dazu wurde die Sequenz GTCTCTGGTGG (Nukleotide 1883-1893 in Fig. 4) mittels PCR-Technik in die Sequenz TGATATCGTTA umgewandelt. Diese Modifikation führt zur Einführung von zwei Stopcodons mit einer dazwischenliegenden EcoRV-Erkennungsstelle. Die Sequenzen wurden auf die eventuelle Einführung von Mutationen aufgrund der PCR-Technik überprüft.

BEISPIEL 6

6.0 Konstruktion der Expressionsvektoren

Eine starke konstitutive Genexpression hängt unter anderem von dem Promoter der betroffenen Gene ab. Um diese Ansprüche zu erfüllen, wurde der Expressionsvektor pMOG181 konstruiert, der in Fig. 5 dargestellt ist. Dazu wird die Expressionskassette von pROK1 (Baulcombe u. Mitarb., 1986) als EcoRI-HindIII-Fragment in pUC18 kloniert. Diese Kassette enthält den 35S-Promoter des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) auf einem EcoRI- BamI-Restriktionsfragment und den Nopalinsynthase (nos)-Transkriptionsterminator auf einem BamHI-HindIII- Fragment. Das Promoterfragment besteht aus der Sequenz, die mit dem Rest -800 beginnt, und erstreckt sich auf bis inklusive den Rest +1 des CaMV-Genoms, wobei die Position +1 die Transkriptionsstartstelle darstellt (Guilley u. Mitarb., 1982). Aus der Literatur ist bekannt, dass eine Duplikation der Sequenz zwischen -343 und -90 die Aktivität des CaMV 35S-Promoters erhöht (Kay u. Mitarb., 1987). Um ein Promoterfragment mit einer doppelten sogenannten Enhancer-Sequenz zu erhalten, wurden die folgenden Klonierungsschritte mittels fachbekannten Techniken durchgeführt. Erst wurde die Sequenz stromaufwärts von der NcoI-Erkennungsstelle in Position -512 deletiert und die NcoI-Erkennungsstelle selbst in eine EcoRI-Erkennungsstelle umgewandelt. Dazu wurde die Expressionskassette in pUCIS mit NcoI geöffnet, die so erhaltenen Enden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt, und ein EcoRI-Linker in die Enden einligiert. Das erhaltene Plasmid wurde mit EqQRI geöffnet, was zur Deletion des EcoRI-Fragments führte, und die Enden wurden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt. Anschliessend wurde das aufgefüllte AccI-EcoRV-Promoterfragment (Position -388 bis -90) in das lineare Plasmid kloniert, wodurch die Ligation der aufgefüllten EcoRI- mit der aufgefüllten AccI-Erkennungsstelle eine neue EcoRI- Stelle ergab. Das neu erhaltene Plasmid pMOG181 enthält den CaMV 35S-Promoter mit doppelten Enhancer-Sequenzen in einer Expressionskassette, die noch immer auf dem EcoRI-HindIII-Fragment liegt.
Mit pMOG181 wurden verschiedene Derivate hergestellt. Ein Adaptor (5'-AATTGAGCTC-3') wurde in die EcoRI-Erkennungsstelle so kloniert, dass die EcoRI- Stelle nicht wiedergewonnen wurde und eine SstI-Erkennungsstelle eingeführt wurde. Das entstandene Plasmid pMOG183 (Fig. 6) enthält nun die Expressionskassette eines SstI-HindIII-Fragments. Auf gleiche Weise wurde pMOG184 aus pMOGl81 (Fig. 7) dadurch entwickelt, dass man die HindIII-Stelle durch eine SstI-Erkennungsstelle ersetzte. Der Ersatz der EcoRI-Stelle durch eine XbaI- Stelle in pMOG184 ergab pMOG185 (Fig. 8).

BEISPIEL 7

Binäre Vektoren

Zur Einführung der Chitinase- und β-1,3-Glucanase-Hybridgene in das Tabakgenom durch Agrobacterium tumefaciens verwendeten wir die binären Vektoren pMOG23 (Fig. 9) und pMOG22 (Fig. 10). Bei Vektor pMOG23 handelt es sich um Derivate von Vektor BIN19 (Bevan, 1984). Angesichts des letztgenannten Vektors wurden die folgenden, nicht erfindungswesentlichen Änderungen durchgeführt, bei denen fachbekannte Techniken verwendet wurden. Erstens werden die Positionen am linken Rand (LB) und am rechten Rand (RB) in bezug auf das Neomycin-Phosphotransferase-Gen II (NPTII-Gen) gegeneinander ausgetauscht. Anschliessend wird die Orientierung des NPTII-Gens umgekehrt, so dass die Transkription des Gens in Richtung LB erfolgt. Schliesslich wird der BIN19-Polylinker durch einen Polylinker mit Erkennungsstellen für die folgenden Restriktionsenzyme ersetzt: EcoRI, KpnI, SmaI, BamHI, XliaI, S. SacI, XhaI und HindIII.
Bei Vektor pMOG22 handelt es sich um ein Derivat von pMOG23, bei dem das NPTII-Gen durch ein Hygromycinresistenzgen ersetzt ist. Das verwendete Gen codiert eine Hygromycinphosphortransferase (HPT) aus Escherichia coli und stammt von dem Plasmid PLG90 (Van den Elzen u. Mitarb., 1985). Bei diesem Plasmid handelt es sich um ein Derivat von pLG86 (Gritz u. Mitarb., 1983), das eine BaniHI-Erkennungsstelle enthält, die sich 19 Basenpaare vor dem Translationsinitiationscodon bis 20 Basenpaare nach dem Stopcodon des Gens erstreckt. Durch ortsgerichtete Mutagenese, eine dem Fachmann bekannte Standardtechnik bei der Rekombination von DNA, wird das ATG-Codon vier Nukleotide vor dem Translationsinitiationscodon zu einem ATA-Codon geändert. Auf gleiche Weise wird die EcoRI-Erkennungsstelle in der Codierregion des HPT-Gens zu 5'-CAATTC-3' geändert. Anschliessend wird das amHI-Fragment nach dem Auffüllen der beiden BamHI-Enden mit Klenow-Polymerase (Maniatis u. Mitarb., 1982) in die BamHl-Erkennungsstelle der Expressionskassette von pROKI (Baulcombe u. Mitarb., 1986) kloniert, nachdem beide BamHI-Enden ebenfalls aufgefüllt worden waren. Auf diese Weise erhält man eine Expressionseinheit, bei der die HPT-Codiersequenz zwischen dem CaMV 35S-Promoter und dem nos- Transkriptionsterminator liegt.

BEISPIEL 8

Klonierung von Hybridgenen in binäre Vektoren

Die cDNA, die die extrazelluläre Chitinase codiert (Beschreibung bei 4.1), die cDNA für intrazelluläre Chitinase (Beschreibung bei 4.2) und die cDNA für die modifizierte intrazelluläre Chitinase (Beschreibung in 4.3) und die cDNA für die modifizierte intrazelluläre Chitinase (Beschreibung in 4.3) werden als BamHI- Fragmente in pMOG181 kloniert. Durch Restriktionsenzymanalyse wurden Klone ausgewählt, bei denen die Codiersequenzen in der richtigen Orientierung nach dem Promoter lagen. Anschliessend wurden die als EcoRI- HindIII-Fragmente isolierten Expressionskassetten in den binären Vektor pMOG23 kloniert, nachdem dieses Plasmid mit EcoRI und HindIII linearisiert worden war.
Die entstandenen Plasmide erhalten die Bezeichnung pMOG196, pMOG198 bzw. pMOG189. Ausserdem wird die Expressionskassette mit dem Gen, das für die intrazelluläre Chitinase mit Targeting des Proteins in den Apoplasten codiert, zusätzlich in pMOG22 kloniert, wodurch man pMOG289 erhält.
Das SstI-HindIII-Fragment mit der Expressionseinheit für die intrazelluläre Glucanase mit Targeting des Proteins in den Apoplasten (Beschreibung bei 5.3) wird in pMOG23 kloniert, wodurch man pMOG512 erhält.
Die für die extrazelluläre Chitinase codierende cDNA wird als BamHI-Fragment in pMOG184 und die für die intrazelluläre Chitinase codierende cDNA als $amHI- Fragment in pMOG183 kloniert. Im Anschluss an die beiden Klonierungsschritte werden Klone durch Restriktionsenzymanalyse ausgewählt, bei denen die Codiersequenzen in der richtigen Orientierung nach dem Promoter zu liegen kamen. Anschliessend wurden beide Kassetten als EcoRI-SstI- bzw. SstI-Hind-III-Fragmente isoliert und in einer Dreifachligation in pMOG23 kloniert, nachdem dieses Plasmid mit EcoRI und HindIII linearisiert worden war. Das erhaltene Plasmid pMOG200 (Fig. 11) enthält nun beide Chitinasegene auf einem binären Plasmid, das physisch mit dem NPTII-Gen gekoppelt ist.
Das stI-HindIII-Fragment mit der Expressionseinheit für die extrazelluläre Glucanase und das XbaI- SstI-Fragment mit der Expressionseinheit für die intrazelluläre Glucanase werden in einer Dreifachligation in den binären Vektor pMOG22 kloniert, nachdem dieses Plasmid mit XbaI und HindIII linearisiert worden war. Das entstandene binäre Plasmid pMOG212 (Fig. 12) enthält nun beide Glucanasegene, die physisch mit dem Hydromycinresistenzgen gekoppelt sind.

BEISPIEL 9

Transgene Pflanzen

Zur Transformation von Tabak verwendet man Blattscheiben (Horsch u. Mitarb., 1985), die von axenisch gezogenen Pflanzen stammen. Es wurde mit Bakterienstämmen kultiviert, die vom Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 (CBS 191.83; Hoekama u. Mitarb., 1983) abstammten, wobei ein binärer Vektor durch Mobilisierung mit Hilfe des Plasmids pRK2013 (Ditta u. Mitarb., 1980) eingekreuzt worden war. Die so erhaltenen Aarobacterium-Stämme wurden unter Selektionsdruck gehalten (Rifampicin 20 mg/l, Kanamycin 100 mg/l) und als solche für die Kokultivierung gezüchtet. Transgene Sprosse wurden dann, wenn Derivate des binären Vektors pMOG23 verwendet wurden, auf Medien mit 100 mg/l Kanamycin und bei Verwendung von pMOG22-Derivaten auf Medien mit 20 mg/l Hygromycin gebildet. Die von den Sprossen erhaltenen transgenen Pflanzen wurden mit der sogenannten Western-Blot-Technik auf Expression der neu eingeführten Gene untersucht. Die Western-Blot-Technik ist dem Fachmann bekannt. Manchmal wurden Blattscheiben von transgenen Pflanzen entnommen, um weitere Gene einzuführen. Kanamycinresistente Blattscheiben wurden mit Agrobacterium-Stämmen, die pMOG22-Derivate enthielten, kokultiviert, und hygromycinresistente Blattscheiben wurden mit pMOG23-Derivaten kokultiviert. Die Pflanzen, die zur konstitutiven Expression aller eingeführter Gene befähigt waren, wurden selektiert, und Samen wurden nach Selbstbefruchtung gewonnen. F1-Sämlinge dieser transgenen Pflanzen wurden weiter untersucht.
Es wurden transgene Tabakpflanzen erhalten, die entweder mit pMOG196, pMOG198, pMOG189 oder pMOG512 transformiert waren und die entweder mit pMOGl96 + pMOG289, pMOG512 + pMOG289 oder pMOG200 + pMOG212 doppelt transformiert waren.

BEISPIEL 10

Targeting der intrazellulären Chitinase in den Apoplasten

Zur Beurteilung der Möglichkeit eines Targeting der intrazellulären Chitinase in den Apoplastenraum wurde der folgende Versuch durchgeführt.
Tabakpflanzen der Sorte Samsun NN wurden mit pMOG196 transformiert, um das Gen für extrazelluläre Chitinase aus der Petunie konstitutiv zu exprimieren (Pflanzenlinie 1); mit pMOG198, um das Gen für intrazelluläre Chitinase aus Tabak konstitutiv zu exprimieren (Linie 2); mit pMOG189, um das Gen für modifizierte iritrazelluläre Chitinase konstitutiv zu exprimieren (Linie 3) und mit pMOG196 + pMOG289, um das Gen für extrazelluläre Chitinase und das Gen für intrazelluläre Chitinase mit Modifikation für ein Targeting in den Apoplastenraum konstitutiv zu exprimieren. Die transgenen Pflanzenlinien wurden auf hohe Expression jedes Hybridgens selektiert (es wurde bis zu 0,5% der gesamten löslichen Proteinfraktion erzielt). Aus jeder der vier selektierten Linien wurden sowohl Extrazellulärflüssigkeit (zur Vorgangsweise bei der Isolation siehe Parent & Asselin, 1984) und Gesamtblattproteinextrakte hergestellt (Kaufmann u. Mitarb., 1987), und diese wurden auf Aktivität gegen den Pilz Fusarium solani geprüft. Eine Chitinaseaktivität wurde in der Extrazellulärflüssigkeit (EF) der Pflanzenlinien 1, 3 und 4 und im Gesamtproteinextrakt (TE) aller Pflanzenlinien (1 bis 4) nachgewiesen. Beim Test auf Wirkung gegen Pilze wurde mit 100 ul EF der Linien 1, 3 und 4 versetzt, auf eine Chitinaseaktivität von ungefähr 2000 cpm verdünnt (siehe Beispiel 2). Die Verdünnungen der EF von Linie 2 und der nichttransgene Kontrolltabak waren gleich wie die Verdünnung der Linie 1. Die 100 ul des verdünnten TE der vier transgenen Linien enthielten eine Chitinaseaktivität von ungefähr 2000 cpm. Die TE-Verdünnung der Kontrolle entsprach der der Pflanzenlinie 1. Die Ergebnisse des Tests auf Wirkung gegen Pilze sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Wachstumshemmung von Fusarium solani durch Chitinasen aus transgenen Tabakpflanzen
- keine Hemmung; +. Hemmung
Wie aufgrund der Versuche mit den gereinigten Chitinasen zu erwarten war (siehe Beispiel 3), zeigten weder die EF noch der TE der Linie 1, die das Gen für extrazelluläre Chitinase aus der Petunie exprimierte, irgendeine Wirkung gegen Pilze. Das Vorhandensein einer Chitinaseaktivität in der EF der Linie 1 zeigt, dass die Petunia-Chitinase in Tabak einem Targeting in den Apoplastenraum unterliegt.
Obwohl in den meisten Versuchen in der EF von Linie 2 weder eine Chitinaseaktivität noch eine Wirksamkeit gegen Pilze nachgewiesen werden konnte, wurde in manchen Versuchen in der EF eine Chitinaseaktivität gefunden, was vermutlich auf ein Ausfliessen der (relativ über-)exprimierten intrazellulären Chitinase aus den Zellen zurückzuführen ist. Der TE von Linie 2 wies eine starke Wirkung gegen Pilze auf. Bei der Linie 3, die das intrazelluläre Chitinasegen mit Modifikation für Targeting in den Apoplasten exprimierte, wiesen sowohl die EF als auch TE eine starke Wirkung gegen Pilze auf. Dies beweist, dass die intrazelluläre Chitinase der Linie 3, die einem Targeting unterliegt, noch eine Wirkung gegen Pilze aufweist. Offenbar hat die Deletion (eines Teils) des C-terminalen Signals für Targeting in die Vakuole keine wesentliche Auswirkung auf die Wirksamkeit der intrazellulären Chitinase auf Pilze.

BEISPIEL 11

Synergistische Wirkung von Glucanase auf die Wirkung von Chitinase gegen Pilze

Tabakpflanzen der Sorte Samsun Nil wurden mit pMOG512 transformiert, um das Gen für modifizierte intrazelluläre Glucanase konstitutiv zu exprimieren (Linie 1); mit pMOG512 + pMOG289, um das modifizierte Gen für intrazelluläre Chitinase und das modifizierte Gen für intrazelluläre Glucanase konstitutiv zu exprimieren (Linie 2), sowie mit pMOG189, um das modifizierte Gen für intrazelluläre Chitinase zu exprimieren (Linie 3; siehe Beispiel 10). Die Pflanzenlinien wurden auf hohe Expressionsniveaus jedes Hybridgens selektiert. Aus jeder der selektierten Linien wurden Extrazellulärflüssigkeit (EF) (Parent & Asselin, 1984) und Gesamtblattproteinextrakte (TE) (Kaufmann u. Mitarb., 1987) hergestellt. Mit der EF und dem TE der Linien 2 und 3 wurden Ausgangsverdünnungen hergestellt, um eine Chitinaseaktivität von ungefähr 2000 cpm zu erhalten (siehe Beispiel 2). Die Ausgangsverdünnungen der EF und des TE von Linie 1 entsprachen denen der Linie 3. Anschliessend wurden mit den Ausgangsverdünnungen Reihenverdünnungen durchgeführt, die auf eine Wirksamkeit gegen Pilze geprüft wurden. Zwischen den Verdünnungsreihen der EF und des TE bestanden bezüglich der Wirksamkeit gegen Pilze keine Unterschiede. Ausserdem wurde die höchste Wirksamkeit gegen Pilze in den (verdünnten) Extrakten der Linie 2 gefunden. Es scheint, dass die intrazelluläre Glucanase mit Targeting in den Apoplasten eine synergistische Wirkung auf die Wirksamkeit gegen Pilze der intrazellulären Chitinase mit Targeting in den Apoplasten ausübt.

BEISPIEL 12

Analyse von transgenen Pflanzen mit gemeinsamer Expression einer nichtmodifizierten intrazellulären Chitinase und Glucanase und einer extrazellulären Chitinase und Glucanase

Bei Phytophthora nicotianae var. nicotinanae (Pnn) handelt es sich um einen Pilz der Familie der Oomyceten. Er ist unter anderem ein Erreger, der die Tabakwurzel befällt. Die Infektion dieser Pflanze führt zur Blattwelke und/oder Fäulnis des Stengelgrunds (Setzlingkrankheit). Schliesslich führt die Infektion zum Absterben der Tabakpflanze.
Um die Pilzresistenz transgener Pflanzen, die nichtmodifizierte Gene, die pflanzliche hydrolytische Enzyme codieren, auszuwerten, kann der folgende Versuch durchgeführt werden. Zehn transgene Pflanzen, die die zwei nichtmodifizierten Gene für Chitinase und die zwei nichtmodifizierten Gene für β-1,3-Glucanase (das nichtmodifizierte Chitinasegen von pMOG 200; das nichtmodifizierte β-1,3-Glucanasegen von pMOG212) konstitutiv exprimieren, zehn Kontrollpflanzen, die mit dem Leervektor transformiert wurden, sowie zehn nichttransgene Pflanzen werden mit einer wässrigen Suspension von 2 · 105 Pnn-Zoosporen inokuliert. Die Suspension wird auf den Stengelgrund im Boden in dem Topf, in dem die Pflanze gezogen wird, pipettiert und anschliessend mit Wasser gespült. Anschliessend werden die Pflanzen auf Entwicklung von Krankheitssymptomen beobachtet. Nach zwei bis drei Tagen werden die Kontrollpflanzen und die nichttransgenen Pflanzen die ersten Krankheitssymptome aufweisen; nach drei Wochen werden ungefähr 17 der 20 Pflanzen Symptome aufweisen; einige Pflanzen werden abgestorben sein. Von den transgenen Pflanzen, die die zwei Chitinase- und β-1,3-Glucanasegene konstitutiv exprimieren, werden nach 3 Wochen nur einige Pflanzen leichte Welkesymptome aufweisen.
Bei einem anderen Versuch können Blattscheiben mit einem Durchmesser von ungefähr 1 cm von den Blättern transgener Pflanzen, die zur konstitutiven Expression beider Chitinasen und beider Glucanasen befähigt sind, von transgenen Kontrollpflanzen und von nichttransgenen Tabakpflanzen gewonnen werden. Anschliessend werden 10 ul einer wässrigen Pnn-Zoosporensuspension (5000 Zoosporen pro ml) auf die (Unterseite der) Scheiben pipettiert und die Scheiben werden anschliessend in steriles Wasser gegeben und bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Pro Test können drei Gruppen zu fünf Scheiben verwendet werden, also ingesamt zehn Kontrollscheiben pro Versuch. Der Versuch kann mehrmals mit dem gleichen übereinstimmenden Ergebnis durchgeführt werden. Nach ungefähr einem Tag werden die ersten Anzeichen einer beginnenden Infektion auf den Kontrollscheiben beobachtet. Nach fünf Tagen werden diese vollständig befallen sein. Die Scheiben der transgenen Pflanzen, die zur Expression von Chitinasen und Glucanasen befähigt sind, werden auch noch nach fünf Tagen schwächer ausgeprägte Krankheitssymptome aufweisen.
Blattscheibentests, die genau wie oben beschrieben durchgeführt werden, lassen sich auch mit Sporen des Pilzes Thanatephorus cucumeris (Anamorph Rhizoctönia solani Kuhn), einem Basidiomyceten, durchgeführt werden. Die verwendete Inokulumkonzentration kann 5000-10000 Basidiosporen pro ml Wasser betragen. Nach zehn Tagen werden die Scheiben überprüft. Die Scheiben der nichttransgenen Pflanzen und der transgenen Kontrollpflanzen werden alle infiziert aussehen, während die Scheiben transgenen Pflanzen, die die Chitinase- und β-1,3-Glucanasehybridgene exprimieren, wesentlich weniger stark befallen sein werden.
Ebenso kann die Anfälligkeit von transgenen Pflanzen und Kontrollpflanzen in bezug auf den Pilz Alternaria alternata, einem Ascomyceten, geprüft werden.
Dieser Pilz verursacht die "Dürrfleckenkrankheit" des Tabaks. Die Versuche lassen sich wie von Spurr im Jahr 1973 beschrieben durchführen. Die verwendete Inokulumkonzentration kann 5000-10000 Konidien pro ml betragen. Nach 10 Tagen wird die Entwicklung der "Dürrfleckenkrankheit" auf dem inokulierten Blattmaterial gemäss den von Spurr (1973) vorgeschlagenen Kriterien beurteilt. Das nichttransgene Blattmaterial und das Kontrollblattmaterial werden schwach bis sehr stark ausgeprägte Nekrosen aufweisen, während das Blattmaterial mit konstitutiver Expression der beiden Chitinasegene und der beiden β-1,3-Glucanasegene keine oder wesentlich schwächer ausgeprägte Krankheitssymptome (hellgelbe Lesionen) aufweisen werden.
Werden die Versuche wie oben beschrieben durchgeführt, so wird gezeigt werden, dass die konstitutive Expression einer extrazellulären Chitinase und einer extrazellulären β-1,3-Glucanase und einer intrazellulären Chitinase und einer intrazellulären β-1,3-Glucanase Resistenz gegen, oder zumindest eine verringerte Empfindlichkeit oder Anfälligkeit gegenüber, Pilzinfektionen bewirkt.
Alle in dieser Anmeldung genannten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind ein Hinweis auf die Fähigkeiten der Fachleute auf dem Gebiet, in dem die Erfindung liegt. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen werden hiermit durch Bezugnahme gleichermassen eingeschlossen, wie wenn jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und einzeln durch Bezugnahme eingeschlossen würde.
Obwohl die obige Erfindung in gewissen Grenzen zum leichteren Verständnis durch Erläuterungen und Beispiele beschrieben wurde, wird klar sein, dass gewisse Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der angefügten Ansprüche durchgeführt werden können.

HINTERLEGUNG DER MIKROORGANISMEN

Der Escherichia coli-Stamm DH5α, der das Plasmid pMOG23 enthält (CBS 102.90) und der Escherichia co i-Stamm DHSα, der das Plasmid pMOG22 enthält (CBS 101.90) wurden am 29. Januar 1990 beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, Niederlande, hinterlegt. Der Genotyp Escherichia coli-Stamm DH5α lautet: F, gndAl, hsdR17 (rk- mmk+), supE44, thi-1, lambda, recA1, avrA96, relA1, 80dlacz M15.

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Claims

1. Pflanze oder beliebiger Pflanzenteil, der zur Herstellung dieser Pflanze regeneriert wird, die bzw. der zur Expression eines Chitinasegens und eines β-1,3-Glucanasegens in mindestens einem ihrer bzw. seiner Gewebe zu exprimieren befähigt ist, dadurch gekennzeichnet, dass sie bzw. er mit einem oder mehreren rekombinanten Polynukleotiden mit Hybridsequenzen, die für diese Chitinase und β-1,3-Glucanase codieren, transformiert worden ist.

2. Pflanze nach Anspruch 1, worin das Chitinasegen ein Gen für intrazelluläre pflanzliche Chitinase ist.

3. Pflanze nach Anspruch 1 oder 2, worin das β-1,3- Glucanasegen ein Gen für intrazelluläre pflanzliche β- 1,3-Glucanase ist.

4. Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die des Weiteren als ein Ergebnis der Transformation dieser Pflanze oder eines Vorfahrens oder eines beliebigen Pflanzenteils, der zur Herstellung dieser Pflanze regeneriert wurde, mit einem oder mehreren rekombinanten Polynukleotiden eine Expression eines Gens für die extrazelluläre pflanzliche Chitinase und/oder eines Gens für die extrazelluläre pflanzliche Glucanase aufweist.

5. Pflanze nach einem der Ansprüche 2 bis 4, worin das Gen für intrazelluläre pflanzliche Chitinase am 3'- Ende seines offenen Leserasters modifiziert ist, wodurch die von ihm produzierte intrazelluläre pflanzliche Chitinase einem Targeting in den Apoplasten unterliegt.

6. Pflanze nach Anspruch 3, worin das Gen für intrazelluläre β-1,3-Glucanase am 3'-Ende seines offenen Leserasters modifiziert ist, wodurch die von ihm produzierte intrazelluläre β-1,3-Glucanase einem Targeting in den Apoplasten unterliegt.

7. Pflanze nach Anspruch 5 oder 6, worin die Modifikation darin besteht, dass ein Translationsstopcodon, das eine Deletion von 3 bis 10 C-terminalen Aminosäuren der Vorstufe der intrazellulären pflanzlichen Chitinase bewirkt, eingeführt wird.

8. Pflanze nach Anspruch 6, worin die Modifikation darin besteht, dass ein Translationsstopcodon, das eine Deletion von 3 bis 25 C-terminalen Aminosäuren der Vorstufe der intrazellulären pflanzlichen β-1,3-Glucanase bewirkt, eingeführt wird.

9. Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin diese Chitinasegene und/oder diese Glucanasegene unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promoters sind.

10. Pflanze nach Anspruch 1, worin das Chitinasegen das Gen für intrazelluläre Chitinase aus Tabak ist.

11. Pflanze nach Anspruch 2, worin das Gen für intrazelluläre pflanzliche β-1,3-Glucanase das Gen für intrazelluläre pflanzliche β-1,3-Glucanase aus Tabak ist.

12. Pflanze nach Anspruch 10 oder 11, wobei es sich nicht um eine Tabakpflanze handelt.

13. Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die weniger anfällig gegen Pilzbefall ist.

14. Rekombinantes Polynukleotid umfassend genetische Information für die Expression eines Chitinasegens und eines β-1,3-Glucanasegens in mindestens einem der Gewebe der Pflanze.

15. Rekombinantes Polynukleotid nach Anspruch 14, worin das Chitinasegen ein Gen für intrazelluläre pflanzliche Chitinase ist.

16. Rekombinantes Polynukleotid nach Anspruch 14, worin das β-1,3-Glucanasegen ein Gen für intrazelluläre pflanzliche β-1,3-Glucanase ist.

17. Rekombinantes Polynukleotid nach einem der Ansprüche 14 bis 16, umfassend des Weiteren die genetische Information für die relative Überexpression eines Gens für extrazelluläre pflanzliche Chitinase und/oder eines Gens für extrazelluläre pflanzliche Glucanase.

18. Rekombinantes Polynukleotid nach Anspruch 15 oder 16, worin das Gen für intrazelluläre pflanzliche Chitinase am 3'-Ende seines offenen Leserasters modifiziert ist, wodurch die dadurch produzierte intrazelluläre pflanzliche Chitinase einem Targeting in den Apoplasten unterliegt.

19. Rekombinantes Polynukleotid nach Anspruch 16, worin das Gen für intrazelluläre pflanzliche β-1,3-Glucanase am 3'-Ende seines offenen Leserasters modifiziert ist, wodurch die dadurch produzierte intrazelluläre pflanzliche β-1,3-Glucanase einem Targeting in den Apoplasten unterliegt.

20. Rekombinantes Polynukleotid nach Anspruch 18 oder 19, worin die Modifikation darin besteht, dass ein Translationsstopcodon, das zu einer Deletion von 3 bis 25 C-terminalen Aminosäuren der Vorstufe der intrazellulären pflanzlichen β-1,3-Glucanase bewirkt, eingeführt wird.

21. Rekombinantes Polynukleotid nach einem der Ansprüche 14 bis 20, worin das Chitinasegen und/oder das β-1,3-Glucanasegen unter der Kontrolle des CaMV 35S- Promoters stehen.

22. Rekombinantes Polynukleotid nach Anspruch 15, worin das Gen für intrazelluläre Chitinase aus Tabak stammt.

23. Rekombinantes Polynukleotid nach Anspruch 16, worin das Gen für intrazelluläre β-1,3-Glucanase aus Tabak stammt.

24. Klonierungs- oder Transformationsvektor umfassend ein rekombinantes Polynukleotid nach einem der Ansprüche 14 bis 23.

25. Bakterien enthaltend einem Vektor nach Anspruch 24.

26. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, die zur Expression einer Chitinase und einer β-1,3-Glucanase befähigt sind, bei dem ein rekombinantes Polynukleotid nach einem der Ansprüche 14 bis 23 in das Genom dieser Pflanzen oder ihrer Vorfahren oder eines beliebigen Pflanzenteils, der zur Herstellung dieser Pflanze regeneriert werden kann, eingeführt wird.

27. Verwendung des rekombinanten Polynukleotids nach einem der Ansprüche 14 bis 23, um einer Pflanze Pilzresistenz zu verleihen.