DE69131482T2

DE69131482T2 - Phosphotyrosin phosphatase als neuer rezeptor-typ

Info

Publication number: DE69131482T2
Application number: DE69131482T
Authority: DE
Inventors: Joseph Schlessinger
Original assignee: New York University NYU
Current assignee: New York University NYU
Priority date: 1990-07-11
Filing date: 1991-07-11
Publication date: 1999-11-18
Anticipated expiration: 2011-07-12
Also published as: EP0538401A1; JPH05508777A; AU8412891A; EP0538401A4; AU662296B2; DE69131482D1; WO1992001050A1; CA2087008A1; ATE182624T1; EP0538401B1; JP2002136292A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung aus dem Gebiet der Biochemie, Zellbiologie und Molekularbiologie betrifft neuartige Protein-Tyrosin-Phosphatase-Proteine oder -Glykoproteine vom Rezeptortyp, die als R-PTPase-α, -β und -gamma bezeichnet werden, die fiür diese kodierende DNA, Verfahren zur Erzeugung und Identifizierung der Proteine und Verfahren zum Screenen von Verbindungen, die an die PTPase binden und die PTPase-Enzymaktivität hemmen oder stimulieren können.

Beschreibung des Standes der Technik

Die Identifizierung verschiedener Rezeptoren für Wachstumsfaktoren sowie retroviraler Onkogene als tyrosinspezifische Proteinkinasen wies darauf hin, daß die Proteinphosphorylierung an Tyrosinresten eine Schlüsselrolle bei der zellulären Wachstumskontrolle spielt. Diese Auffassung wurde kürzlich durch die Beobachtung unterstützt, daß das Ausmaß der Tyrosinphosphorylierung von Enzymen, von denen angenommen wird, daß sie eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion spielen (wie die Phospholipase C) mit der erhöhten Aktivität der Enzyme nach Stimulierung durch Wachstumsfaktoren korreliert, wodurch eine funktionelle Rolle der Tyrosinphosphorylierung aufgezeigt wurde (Ullrich, A., et al., Cell 61: 203-212 (1990)).
Das Ausmaß und das Muster der Phosphorylierung von Tyrosinresten zellulärer Proteine wird durch die entgegengesetzt gerichteten Aktivitäten von Protein-Tyrosin-Kinasen (PTKasen; ATP : Protein-Tyrosin-O-Phosphotransferase, EC 2.7.1.112) und Protein-Tyrosin- Phosphatasen (PTPasen; Protein-Tyrosin-Phosphat-Phosphohydrolase, EC 3.1.3.48) reguliert. Die strukturellen Charakteristika und die Evolution von PTKasen sowie ihre Rolle bei der Regulation des Zellwachstums wurden in Übersichtsartikeln zusammengefaßt (Hunter, T., et al., Annu. Rev. Biochem. 54: 897-930 (1985); Ullrich, A., et al., siehe oben).
Tyrosinkinasen bilden eine eigene Familie von Enzymen, die die gleichen Vorfahren haben wie Serin/Threonin-spezifische Proteinkinasen, sich aber von diesen erheblich unterscheiden (Hanks, S. K., et al., Science 241: 42-52 (1988)). Die Mechanismen, die zu Veränderungen der Aktivität von Tyrosinkinasen führen, sind am besten für Tyrosinkinasen vom Rezeptortyp verstanden, die sich durch Membranen hindurch erstrecken (Ullrich, A., et al., siehe oben). Für diese Kinasen nimmt man an, daß die Bindung spezifischer Liganden an die extrazelluläre Domäne dieser Enzyme ihre Oligomerisierung induziert, was zu einer Erhöhung der Tyrosinkinaseaktivität und zur Aktivierung der Signaltransduktionswege führt (Ullrich, A., et al., siehe oben). Die Bedeutung dieser Aktivität wird durch den Befund unterstützt, daß eine Fehlregulation der Kinaseaktivität als Folge einer Mutation oder Überexpression einen Mechanismus der onkogenen Transformation darstellt (Hunter, T., et al., siehe oben; Ullrich, A., et al., 1990, siehe oben).
Die Proteinphosphatasen umfassen wenigstens zwei getrennte und eigene Familien (Hunter, T., Cell 58: 1013-1016 (1989)), die Protein-Serin/Threonin-Phosphatasen und die Protein-Tyrosin-Phosphatasen. Das steht im Gegensatz zu den Proteinkinasen, bei denen sich die Sequenzen der Serin-Threonin-spezifischen und der Tyrosin-spezifischen Enzyme stark ähneln.
Offenbar gibt es zwei verschiedene Typen von PTPase-Molekülen. Die erste Gruppe besteht aus kleinen löslichen Enzymen, die eine einzige konservierte katalytische Phosphatase-Domäne enthalten, und zu denen (I) die plazentare PTPase 1 B (Charbonneau, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5252-5256 (1989); Chernoff, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2735-2789 (1990)), (2) die T-Zell-PTPase (Cool, D. E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5257-5261 (1989)) und (3) die PTPase aus Rattenhirn (Guan, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1501-1505 (1990)) gehören.
Die zweite Gruppe besteht aus den komplexeren, mit einem Rezeptor verknüpften PTPasen, die als R-PTPasen bezeichnet werden, ein hohes Molekulargewicht aufweisen und zwei tandemartig wiederholte konservierte Domänen enthalten, die von 56-57 Aminosäuren getrennt sind. Ein Beispiel für R-PTPasen sind die "Leukocyte Common Antigens" (LCA) (Ralph, S. J., EMBO J. 6 : 1251-1257 (1987); Charbonneau, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7182-7186 (1988)). Die LCA, die auch als CD45, T200 und Ly-5 (Übersichtsartikel in Thomas, M. L., Annu. Rev. Immunol. 7 : 339-369 (1989)) bekannt sind, bestehen aus einer Gruppe von Membranglykoproteinen, die ausschließlich in hämatopoetischen Zellen (außer in reifen Erythrozyten) exprimiert werden und die durch alternative Splicing-Ereignisse, die das Aminoende der Proteine betreffen, aus einem gemeinsamen Gen hervorgehen. Obwohl die genaue Funktion des CD45 unbekannt ist, haben viele Studien diese Antigene mit verschiedenen Prozessen in Verbindung gebracht, zu denen die Aktivität zytotoxischer T-Lymphozyten und natürlicher Killerzellen, die Expression des IL-2-Rezeptors, die Differenzierung von B-Zellen und die Proliferation von T-Lymphozyten gehören (Pingel, J. T., et al., Cell 58: 1055-1065 (1989)).
Andere Beispiele für R-PTPasen sind das mit dem LCA verwandte Protein LAR (Streuli, M., et al., J. Exp. Med. 168: 1523-1530 (1988)) und die mit dem LAR verwandten Drosophila- Proteine DLAR und DPTP (Streuli, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8698-8702 (1989)). Jirik et al. screenten eine cDNA-Bank der menschlichen Hepatoblastomzellinie HepG2 mit einer Sonde, die für die zwei PTPase-Domänen des LCA kodierte (FASEB J. 4: A2082 (1990), Abstract 2253), und entdeckten einen cDNA-Klon, der für eine neue R-PTPase kodierte, die als He-PTP bezeichnet wurde. Das HePTP-Gen wurde offenbar in einer Vielzahl von Zellinien und Geweben des Menschen und der Maus exprimiert.
Zwar beginnen wir gerade, mehr über die Struktur und die Vielfalt der PTPasen zu verstehen, aber bezüglich ihrer zellulären Funktionen ist noch vieles unklar. Es wurde vorgeschlagen (Tonks, N. K., et al., Biochemistrv 27: 8695-8701 (1988)), daß die kleinen löslichen PTPase- Enzyme eine "Haushaltsfunktion" haben könnten. Andererseits würde man erwarten, daß die R-PTPasen aufgrund ihrer Lokalisation in der Zellmembran und ihrer potentiellen Regulation durch extrazelluläre Liganden bezüglich ihrer Aktivitäten eingeschränkter sind. Hinsichtlich der Rolle von LCA (CD45) in T-Zellen hat sich gezeigt, daß T-Zell-Klone, die keine LCA exprimieren, nach einer Stimulation durch ein spezifisches Antigen oder durch das Quervernetzen des CD3 nicht proliferierten (Pingel, J. T., et al., siehe oben). Das Quervernetzen der PTPase hemmt die durch den T-Zell-Rezeptor vermittelte Aktivierung menschlicher T-Zellen (Kiener, P. A., et al., J. Immunol. 143: 23-28 (1989)). Die PTPase-Aktivität der LCA spielt eine Rolle bei der Aktivierung der pp56ick, einer lymphozytenspezifischen PTKase (Mustelin, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6302-6306 (1989); Ostergaard, H. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8959-8963 (1989)). Diese Autoren stellten die Hypothese auf, daß die Phosphataseaktivität der LCA die pp56ick durch Dephosphorylierung eines C-terminalen Tyrosinrestes aktiviert, was wiederum mit der T-Zell-Aktivierung in Beziehung stehen könnte.
Indem sie die ortsspezifische Mutagenese zur Beantwortung der Frage einsetzten, welcher der vier konservierten Cysteinreste der LCA (zwei pro Phosphatasedomäne) für die Enzymaktivität gegenüber künstlichen Substraten benötigt wurde, fanden Streuli et al. (EMBO J. 9: 2399-2407 (1990), daß nur ein Cysteinrest (Rest 177 der LCA-Phosphatasedomäne-1) der LCA für die Aktivität essentiell war, was zeigte, daß höchstwahrscheinlich nur die erste Phosphatasedomäne enzymatische Aktivität aufweist. Jedoch wurde die Möglichkeit, daß die zweite Domäne ein anderes Substrat dephosphorylieren kann, nicht ausgeschlossen. Kürzlich zeigten Streuli et al. (EMBO J. 9: 2399-2407 (1990)), daß die zweite konservierte Domäne der LCA (und des LAR) keine nachweisbare Phosphataseaktivität aufweist, aber daß Sequenzen innerhalb der Domäne die Substratspezifität beeinflussen können.
Um den Phosphotyrosinmetabolismus besser begreifen und ihn kontrollieren zu können, muß man nicht nur die Rolle der Kinaseaktivität, sondern auch die Aktivität von Phosphatase- Enzymen verstehen. Die Vermehrung zellulärer Phosphotyrosinreste kann über Mechanismen erfolgen, die nicht über die Aktivierung einer Tyrosinkinase ablaufen. Zum Beispiel induziert die Expression des v-crk-Onkogens, obwohl dieses selbst keine Tyrosinkinase ist, die Phosphorylierung von Tyrosinresten über einen schlecht verstandenen Mechanismus (Mayer, B. J., et al., Nature 332: 272-275 (1988)). Potentiell könnte eine derartige Folge entweder aus einer Mutation des Substrates oder aus einer allgemeinen Abnahme der zellulären Phosphataseaktivität resultieren, insbesondere im Hinblick auf den normalerweise hohen Turnover zellulärer Tyrosinphosphate (Sefton, B. M., et al., Cell 20: 807-816 (1980)). Die letztere Möglichkeit wird durch den Nachweis unterstützt, daß Tyrosin-Phosphatase-lnhibitoren Zellen "reversibel transformieren" können (Klarlund, J. K., Cell 41: 707-717 (1985)). PTPasen könnte man deshalb als potentielle rezessive Onkogene ansehen.
Es wird zunehmend klar, daß die Dephosphorylierung von Tyrosin als solche ein wichtiger regulatorischer Mechanismus sein kann. Die Dephosphorylierung eines C-terminalen Tyrosinrestes stimuliert die Tyrosinkinaseaktivität in der src-Familie von Tyrosinkinasen (Hunter, T., Cell 49: 1-4 (1987)). Es wurde vorgeschlagen, daß die Tyrosindephosphorylierung ein obligatorischer Schritt bei der mitotischen Aktivität der MPF (maturation promoting factor)-Kinase ist (Morla, A. O., et al., Cell 58: 193-203 (1989)). Und schließlich hat die Mutantenanalyse primitiver Eukaryonten äußerst wichtige Rollen für die Serinphosphatase in der Zellphysiologie gezeigt (Cyert, M. S., et al., Cell 57: 891-893 (1989)). Diese Beobachtungen weisen auf die auf diesem Gebiet bestehende Notwendigkeit hin, das Verständnis der Mechanismen, die die Tyrosinphosphataseaktivität regulieren, zu verbessern.
Es ist auf diesem Gebiet klar, daß weitere Analysen der Struktur-Funktions-Beziehungen dieser Membranrezeptoren benötigt werden, um das Verständnis der Mechanismen des Zellwachstums, der Differenzierung und der Onkogenese voranzutreiben.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder haben eine Rolle der R-PTPasen in zellulären Kontrollmechanismen, sowohl als potentielle Anti-Onkogene als auch als Effektoren in einem neu entdeckten Mechanismus der Signalübertragung durch die Membran, vor Augen. Sie haben deshalb eine Suche nach einer R-PTPase durchgeführt, die potentiell in diesen Prozessen eine Rolle spielen könnte, und sie beschreiben hier die Identifizierung eines neuartigen, in weitem Umfang exprimierten Mitglieds der R-PTPase-Familie, das sich durch eine Membran erstreckt. Die neuartige R-PTPase wird, analog den Tyrosinkinasen vom Rezeptortyp, direkt durch verschiedene extrazelluläre Liganden reguliert.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein menschliches Protein-Tyrosin-Phosphatase-α-Protein (R-PTPase-α-Protein) vom Rezeptortyp, wie es in der Zeile 1 der Fig. 4 beschrieben ist, das vom "Leukocyte Common Antigen" (LCA oder CD45) und dem mit dem "Leukocyte Common Antigen" verwandten Protein (LAR) verschieden ist, ein funktionelles Derivat der menschlichen R-PTPase-α oder ein Homologes der menschlichen R-PTPase-α in einer anderen Säugetierspezies bereit. Wenn das Molekül natürlichen Ursprungs ist, dann ist es im wesentlichen frei von anderen Proteinen oder Glykoproteinen, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist. Dieses natürlich vorkommende Molekül kommt normalerweise in der Leber, der Niere und dem Gehirn von Säugetieren vor. Alternativ kann das R-PTPase-α-Molekül eines nicht natürlichen Ursprungs sein, wie z. B. eines, das mittels chemischer oder gentechnischer Verfahren hergestellt wird.
Das im wesentlichen reine R-PTPase-α-Protein oder -Glykoprotein der Erfindung kann durch biochemische Reinigung des Glykoproteins natürlichen Ursprungs hergestellt werden; alternativ kann die R-PTPase-α durch gentechnische Verfahren in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirten erzeugt werden.
Insbesondere zielt die Erfindung auf das R-PTPase-α-Molekül ab, das die Aminosäuresequenz der Fig. 4 aufweist, oder auf ein funktionelles Derivat von diesem.
Ein DNA-Molekül, das im wesentlichen aus einer Nukleotidsequenz besteht, die für die R-PTPase-α der Maus oder des Menschen oder die R-PTPase-β oder die R-PTPase-gamma, beide menschlichen Ursprungs, oder ein funktionelles Derivat von diesen kodiert, in Form der cDNA oder der genomischen DNA, wird ebenfalls hier offengelegt. Die Erfindung ist außerdem auf die DNA-Sequenz in Form eines Expressionsvektors sowie auf prokaryontische und eukaryontischen Wirte, die mit der DNA transformiert wurden, gerichtet.
Ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist ein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen R-PTPase-α-Proteins oder -Glykoproteins dieser Erfindung, oder eines funktionellen Derivats von diesem, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Kultivieren eines Wirts, der in der Lage ist, das Protein oder Glykoprotein unter Kultivierungsbedingungen zu exprimieren,
(b) Exprimieren des Proteins; und
(c) Gewinnen des Proteins aus der Kultur.
Die Erfindung zielt auch auf einen Antikörper ab, polyklonal, monoklonal oder schimärisch, der spezifisch für das R-PTPase-α-Protein oder -Glykoprotein ist.
Die Erfindung zielt auch auf ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit einer Nukleinsäure, die für eine normale oder mutierte R-PTPase-α kodiert, in einem Lebewesen ab, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Inkontaktbringen einer Zelle oder eines Zellextrakts aus dem Lebewesen mit einer Oligonukleotidsonde, die für wenigstens einen Teil der normalen oder mutierten R-PTPase-α kodiert, unter Hybridisierungsbedingungen; und
(b) Messen der Hybridisierung der Sonde mit der Nukleinsäure der Zelle, wodurch die Anwesenheit der Nukleinsäure nachgewiesen wird.
Die DNA kann vor dem Test selektiv mittels der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert werden. Die Erfindung zielt weiterhin auf ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder zur Bestimmung der Menge einer R-PTPase-α in einer Zelle oder einem Lebewesen ab, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Inkontaktbringen der genannten Zelle oder eines Zellextrakts mit einem Antikörper, der für ein Epitop der R-PTPase-α spezifisch ist; und
(b) Nachweisen der Bindung des Antikörpers an die Zelle oder den Zellextrakt oder Messen der Menge des gebundenen Antikörpers,
wodurch die Anwesenheit der R-PTPase-α nachgewiesen oder ihre Menge gemessen wird.
Die vorliegende Erfindung zielt auch auf Verfahren zur Identifizierung und Isolierung einer Verbindung ab, die in der Lage ist, an die R-PTPase-α in einem chemischen oder biologischen Präparat zu binden, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Befestigen der R-PTPase-α oder ihres ligandenbindenden Anteils an einer Festphasenmatrix;
(b) Inkontaktbringen des chemischen oder biologischen Präparats mit der Festphasenmatrix, Ermöglichen der Bindung der Verbindung und Entfernen des nicht gebundenen Materials durch Waschen;
(c) Nachweisen der Anwesenheit der an die Festphase gebundenen Verbindung; und, zum Zwecke der Isolierung,
(d) Eluieren der gebundenen Verbindung, wodurch die Verbindung isoliert wird.
Schließlich umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die in der Lage ist, die enzymatische Aktivität einer R-PTPase-α zu stimulieren oder zu hemmen, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Inkontaktbringen der Verbindung mit der R-PTPase-α in reiner Form, in einer Membranpräparation oder in einer ganzen lebenden oder fixierten Zelle;
(b) Inkubieren der Mischung im Schritt (α) für einen ausreichenden Zeitraum;
(c) Messen der enzymatischen Aktivität der R-PTPase-α,
(d) Vergleichen der enzymatischen Aktivität mit derjenigen der R-PTPase-α, die ohne die Verbindung inkubiert wurde,
wodurch bestimmt wird, ob die Verbindung die Aktivität stimuliert oder hemmt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Fig. 1 zeigt die vorhergesagte Primärstruktur der R-PTPase-α der Maus. Die Abbildung (A) zeigt die Sequenz des cDNA-Inserts des Phagen Lambda-109 und die vorhergesagte R-PTPase-α-Proteinsequenz (es wird der Standard-Code für Aminosäuren aus einem Buchstaben verwendet). Das Initiationskodon ATG ist mit kursiven Buchstaben dargestellt, und das Stopkodon ist mit einem Stern markiert. Die vermutliche Transmembrandomäne (Aminosäuren 143 bis 166) ist unterstrichen, ebenso wie die potentiellen N-Glykosylierungsstellen in der extrazellulären Domäne. Die Enden der Homologie zwischen den tandemartig wiederholten PTPase-Domänen (I und 11) sind mit eckigen Klammern bezeichnet. Cysteinreste, die in der katalytischen Domäne aller bekannten R-PTPasen konserviert sind, sind ebenfalls unterstrichen. Die Abbildung (B) zeigt eine schematische Struktur eines Lambda-109-cDNA- Klons, der die für die R-PTPase-α kodierende Sequenz enthält. Die R-PTPase-Domänen I und 11 sind als schwarze Kästen angegeben, und die Transmembrandomäne ist schattiert. Der Beginn des N-terminal-verkürzten PTP-DeltaC-Proteins, das in der Fig. 3 unten erwähnt ist, ist mit einem Pfeil (bei der Aminosäure 214) angegeben. Die Positionen der Restriktionsstellen, die zur Erzeugung überlappender Deletionen für die Sequenzierung verwendet wurden, sind angegeben. Abkürzungen: TM, Transmembrandomäne; B, BamHI-Stelle; Bs, BstEII-Stelle; N, Ncol-Stelle; Nd, Ndel-Stelle; P, PstI-Stelle; R, EcoRI-Stelle; S. Sachl-Stelle; St, Stul-Stelle. Die Fig. 2 ist ein Diagramm eines Northern-Blots, der die Expression der mRNA der R-PTPase-α der Maus zeigt. 5 ug Poly-A+-RNA aus Mäusegeweben und -zellinien wurden auf formaldehydhaltigen Agarosegelen fraktioniert und einer Northern-Analyse unterzogen, wobei als Sonde die gesamte R-PTPase-α-cDNA verwendet wurde. Die Positionen der ribosomalen 28S- und 185-RNA sind angegeben.
Spuren: 1: Niere; 2: Lunge; 3: Herz; 4: Magen; 5: Gehirn; 6: Milz; 7: Leber; 8: NIH-3T3-Fibro blastenzellinie (Honegger, A. M., et al., Cell 51: 199-209 (1987)); 9: BAF-prepro-B-lymphoide Zellinie (Palacios, R., et al., Cell 41: 727-734 (1985)).
Die Fig. 3 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse der PAGE von Immunpräzipitaten des R-PTPase-α-Proteins der Maus zeigt. COS-Zellen wurden transient mittels der DEAE-Dextran- Methode entweder mit einem als Negativkontrolle dienenden Plasmid (Expressionsvektor pLSV ohne Insert) transfiziert, mit pLSV-PTP-α (dem gleichen Expressionsvektor, der die R-PTPaseα-cDNA enthält) oder mit dem Expressionsvektor pLSVDeltaC, der so konstruiert wurde, daß ein verkürztes R-PTPase-α-Protein (PTP-DeltaC, Aminosäuren 214-794) exprimiert wird, von dem die Transmembran- und die Extrazellulär-Domäne entfernt wurden (es wurde mittels ortsspezifischer Mutagenese ein Initiatormethioninrest in dieser Position eingeführt). Nach metabolischer Markierung mit [35S]Methionin wurde entweder mit einem Präimmunserum (Spuren 1 und 2) oder mit einem Antiserum (2A) (Spuren 3-8), das gegen ein synthetisches Peptid gewonnen worden war, das dem C-terminalen Ende des R-PTPase-α-Proteins entsprach, in Abwesenheit oder Anwesenheit von 100 ug des immunisierenden Peptids eine Immunpräzipitation durchgeführt. Die Größen der Molekulargewichtsmarker sind in kDa angegeben. Die Pfeile markieren die Position des R-PTPase-α-Proteins von 130 kDa (Spur 5).
Spuren: 1: pLSV, Präimmunserum; 2: pLSV-PTP-α, Präimmunserum; 3: pLSV, Antiserum 2A; 4: pLSV, Antiserum 2A in Anwesenheit von synthetischem Peptid; 5: pLSV-PTP-α, Antiserum 2A; 6: pLSV-PTP-α, Antiserum 2A in Anwesenheit von synthetischem Peptid; 7: pLSVDeltaC, Antiserum 2A; 8: pLSVDeltaC, Antiserum 2A in Anwesenheit von synthetischem Peptid. Die Fig. 4 zeigt die von der Sequenz von cDNA-Klonen abgeleitete Struktur der R-PTPase-α des Menschen.
(A) Zusammengesetzte Restriktionskarte [3615 Basenpaare (bp)] der überlappenden Klone 31-4 und 27-1, die zusammen den gesamten kodierenden Bereich der R-PTPase-α des Menschen enthalten.
B) Relative Positionen der Klone 31-4 und 27-1. Beide Stränge jedes Klons wurden unter Verwendung einer Serie von Oligonukleotid-Primern vollständig sequenziert. Der schattierte Bereich im Klon 31-4 entspricht dem Fragment, das als Sonde für den Northern-Blot (Fig. 6 unten) sowie für die Zuordnung zum entsprechenden Chromosom verwendet wurde.
C) Vergleich der Aminosäuresequenzen der R-PTPase-α des Menschen (Zeile 1) und der Maus (Zeile 2). Es wird der Aminosäurecode aus einem Buchstaben verwendet. Es sind lediglich die Unterschiede gezeigt. Die gestrichelte Linie gibt eine Abfolge von Aminosäuren an, die in der Sequenz der Maus nicht vorkommt. Der kodierende Teil der R-PTPase-α des Menschen und seine Position relativ zu den Klonen 31-4 und 27-1 (B) sind oben gezeigt. Es werden die folgenden Bereiche gekennzeichnet: Signalpeptid (I), extrazelluläre Domäne mit unterstriche nen potentiellen N-Glykosylierungsstellen für das menschliche Protein (II), Transmembrandomäne (III), der Membran benachbarte Domäne (IV), erste Phosphatasedomäne (V), Zwischendomäne (VI), zweite Phosphatasedomäne (VII), C-Terminus (VIII).
Die Fig. 5 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen der ersten (A) und der zweiten (B) konservierten Phosphatase der R-PTPasen LCA, α, β und gamma des Menschen. CON ist die Konsensussequenz: Ein Großbuchstabe zeigt vollständige Übereinstimmung an, während ein kleiner Buchstabe eine Übereinstimmung zwischen zwei oder drei der vier Sequenzen anzeigt. Ein Gedankenstrich gibt das Fehlen einer Übereinstimmung an.
Die Fig. 6 zeigt ein Gelmuster, das die relative Expression der R-PTPase-α des Menschen in verschiedenen Geweben und Zellinien angibt, wie sie durch Northern-Blot-Hybridisierung mit einer R-PTPase-α-Sonde (oben) und einer β-Actin-Sonde (unten) erhalten wurde. Es wurden Proben der Gesamt-RNA (linke 5 Spuren) oder der Poly-A+-RNA (rechte 5 Spuren) der angegebenen menschlichen Zellinien oder Gewebe analysiert. A431 ist eine menschliche epidermoide Karzinomzellinie; HEL ist eine Erythroleukämiezellinie; alle anderen Spuren repräsentieren schockgefrorene Gewebeproben (HUVEC - menschliche Endothelzellen der Nabelschnurvene).
Die Fig. 7 ist ein Matrixdiagramm, das die chromosomaie Lokalisation der R-PTPase-α des Menschen, basierend auf der Analyse von 17 Hybriden somatischer Zellen von Nagetier und Mensch, zeigt. Ein vollständig getupftes Quadrat zeigt an; daß das Hybrid das Chromosom enthielt, das in der oberen Reihe angegeben ist; Tupfen in der unteren rechten Ecke bedeuten die Anwesenheit des langen Arms des Chromosoms (oder eines Teils des langen Arms, was durch eine geringere Tupfenfläche angezeigt ist); Tupfen in der oberen linken Ecke bedeuten die Anwesenheit des kurzen Arms des Chromosoms (oder eines Teils des kurzen Arms); ein leeres Quadrat bedeutet die Abwesenheit des Chromosoms. Die Säule für Chromosom 20 ist fett umrandet und getupft, um die Korrelation der Anwesenheit dieses Chromosoms (oder eines Abschnitts des Chromosoms) mit der Anwesenheit des R-PTPase-α-Gens hervorzuheben. Das Muster des Vorkommens der Sequenzen der menschlichen R-PTPase-α in den Hybriden ist rechts gezeigt (RPTPα): Die Anwesenheit des Gens ist durch ein "+" in einem getupften Quadrat angegeben; die Abwesenheit des Gens ist durch ein "-" in einem offenen Quadrat angegeben.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Mittels der Verwendung gentechnischer Verfahren haben die Erfinder dieser Erfindung neuartige Säugetier-Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTPase; EC 3.1.3.48) vom Rezeptortyp (die sich durch Membranen erstrecken) identifiziert. Die R-PTPase-α der Maus weist 794 Ami nosäuren auf, während die R-PTPase-α des Menschen 802 Aminosäuren aufweist. Im Hinblick auf seine rezeptorartige Struktur und die Wahrscheinlichkeit, daß es ein Mitglied einer Familie darstellt, haben die Erfinder dieses Protein R-PTPase-α genannt (Rezeptor-Protein-Tyrosin- Phosphatase-α). Die Familie wird hier als die "R-PTPasen" bezeichnet.
Die R-PTPase-α hat eine intrazelluläre Domäne, die den katalytischen Domänen anderer Tyrosinphosphatasen homolog ist. Die Erfinder haben weiterhin festgestellt, daß die extrazelluläre Domäne von 142 Aminosäuren Länge (einschließlich des Signalpeptids) einen hohen Serin- und Threoningehalt (32%) und acht potentielle N-Glykosylierungsstellen aufweist. Die Erfinder haben cDNA-Klone hergestellt, die für das neuartige Protein kodieren, und das Protein in eukaryontischen Wirten exprimiert. Northern-Analyse wurde eingesetzt, um die natürliche Expression des Proteins in verschiedenen Zellen und Geweben nachzuweisen. Sie haben weiterhin durch Immunisierung mit einem synthetischen Peptid der R-PTPase-α einen polyklonalen Antikörper gegen das Protein erzeugt, der in Zellen, die mit einem cDNA-Klon transfiziert wurden, der für einen Teil der R-PTPase-α kodiert, ein Protein von 130 kDa identifiziert.
Bemerkenswerterweise enthält die Rezeptorfamilie, zu der die R-PTPasen gehören, zusätzlich dazu, daß sie intrazelluläre Domänen mit enzymatischer Aktivität aufweist, Transmembranproteine mit N-terminalen extrazellulären Domänen das ist der Familie der Tyrosinkinase-Enzyme analog (Tonks, N. K., et al., Biochemistrv 27: 8695-8701 (1988); (Charbonneau, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7182-7186 (1988); Streuli, M., et al., J. Exp. Med. 168: 1523-1530 (1988); Streuli, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8698-8702 (1989)). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung ziehen deshalb die Schlußfolgerung, daß Liganden in der extrazellulären Umgebung die Aktivität dieser membranassozüerten Unterklasse der PTPasen kontrollieren.
Die R-PTPase-α und die anderen R-PTPasen der vorliegenden Erfindung sind für Verfahren zum Screenen von Arzneimitteln und anderen Agenzien nützlich, die imstande sind, die R-PTPase-Aktivität zu aktivieren oder zu hemmen und dadurch wichtige Wege des zellulären Stoffwechsels zu beeinflussen. Durch das Befestigen einer intakten R-PTPase oder ihres ligandenbindenden Anteils an einer Festphasenmatrix wird eine Affinitätssonde erzeugt, die verwendet werden kann, um biologische Produkte oder chemische Agenzien bezüglich ihrer Fähigkeit, mit dem Rezeptor in Wechselwirkung zu treten, basierend auf ihrer Bindungsaktivität zu screenen. Gebundenes Material kann dann von der Affinitätssonde in gereinigter Form eluiert werden.
Die Verfahren zur Kopplung von Proteinen und Peptiden an die Festphase, die Festphasensubstanzen, die für diese Verfahren nützlich sind, und die Elutionsmittel sind dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt.
Das R-PTPase-Protein oder Derivate von diesem mit enzymatischer Aktivität können zum Testen von Verbindungen verwendet werden, die imstande sind, die Phosphataseaktivität zu steigern oder zu hemmen. Die Fähigkeit einer Verbindung zur Modifizierung der Phosphataseaktivität kann in einem In-vitro-System untersucht werden, bei dem die Testverbindung zu dem gereinigten R-PTPase-Protein oder enzymatisch aktiven Derivaten von diesem gegeben wird und die Effekte auf die Enzymaktivität mittels enzymologischer Standardverfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind, gemessen werden.
Alternativ kann die Wirkung einer Verbindung auf die R-PTPase-Aktivität in einer Präparation aus ganzen Zellen gemessen werden, wobei lebende oder fixierte Zellen verwendet werden können, oder in einer Membranfraktion, die von lebenden oder fixierten Zellen gewonnen wurde. Dieses Verfahren ist für das Screenen von Verbindungen nützlich, die über den extrazellulären Rezeptoranteil des Proteins wirken, sowie für Verbindungen, die direkt auf den enzymatischen Anteil des Proteins wirken. Eine Testverbindung wird mit Zellen, oder mit einer von diesen erhaltenen Membranpräparation, inkubiert, die große Mengen der R-PTPase dieser Erfindung exprimieren, z. B. transfizierten COS- oder NIH-3T3-Zellen. Dann wird die Menge des zellulären Phosphotyrosins mittels Verfahren gemessen, die auf diesen Gebiet gut bekannt sind (Honegger, H. M., et al., Cell 51: 199-209 (1987); Margolis, B., et al., Cell 57: 1101-1107 (1989)). Die Ergebnisse werden mit Ergebnissen verglichen, die in Abwesenheit der Testverbindung oder in Abwesenheit oder Anwesenheit eines bekannten Aktivators der R-PTPase erhalten werden. In derartigen Studien kann auch die Wirkung der Testverbindung in Anwesenheit eines Aktivators von Tyrosinkinasen gemessen werden.
Eine Verbindung, die die R-PTPase-Aktivität stimuliert, führt zu einer Nettoabnahme der Menge des Phosphotyrosins, während eine Verbindung, die die R-PTPase-Aktivität hemmt, zu einer Nettozunahme der Menge des Phosphotyrosins führt.
Im Falle von Wachstumsfaktor-Rezeptoren, die Tyrosinkinasen sind, wie den Rezeptoren für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) oder für den Platelet-Derived-Wachstumsfaktor (PDGF), ist die Tyrosinphosphorylierung mit dem Zeliwachstum und der onkogenen Transformation verbunden. Die Aktivierung von PTPasen, die zur Dephosphorylierung führt, würde als entgegengesetzt wirkender Mechanismus zur Hemmung oder Verhinderung des Wachstums dienen und könnte als ein endogener regulatorischer Mechanismus gegen Krebs dienen. Somit könnte eine Mutation oder Fehlregulation dieses Rezeptor/Enzym-Systems die Empfindlichkeit gegenüber Krebs erhöhen.
Der Insulinrezeptor ist ebenfalls eine Tyrosinkinase, und die Phosphorylierung von Tyrosin in Zellen, die Insulinrezeptoren enthalten, ist mit einer normalen physiologischen Funktion assoziiert. Im Gegensatz zum Falle von Zellwachstum und Krebs würde die Aktivierung einer R-PTPase Insulineffekten entgegenwirken. Subnormale R-PTPase-Mengen oder - Enzymaktivitäten würden zur Ausschaltung der normalen gegenregulatorischen Mechanismen führen. Vielleicht noch wichtiger ist die Möglichkeit, daß eine Überaktivität oder eine unpassende Aktivierung einer R-PTPase eine Hemmung oder vollständige Ausschaltung der Wirkung von Insulin auf Zellen bewirken könnte, was zu einer (insulinunabhängigen) Form von Diabetes führen könnte. Somit könnte eine Empfindlichkeit gegenüber Diabetes mit einer Fehlregulation der R-PTPase assoziiert sein.
Somit könnten die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung normaler oder mutierter R-PTPase-Gene oder zur Messung der Menge oder Aktivität der R-PTPase in Zellen oder Geweben als Verfahren zur Identifizierung der Empfindlichkeit gegenüber Krebs, Diabetes oder anderen Krankheiten dienen, die mit Veränderungen im zellulären Phosphotyrosin-Metabolismus assoziiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und der Menge normaler oder mutierter R-PTPase in einem Lebewesen bereit. Die Abwesenheit oder, was typischer ist, niedrige Expression der R-PTPase oder die Anwesenheit einer mutierten R-PTPase in einem Lebewesen kann als wichtige Möglichkeit zur Vorhersage der Empfindlichkeit gegenüber einer onkogenen Transformation und der Entstehung von Krebs dienen. Alternativ kann eine Überexpression der R-PTPase, möglicherweise aufgrund eines mutierten Rezeptor/Enzym-Systems, das unempfindlich gegenüber einer negativen Regulation ist, oder aufgrund des erhöhten Vorkommens eines stimulatorischen Liganden im Körper als ein wichtiges Instrument zur Vorhersage der Empfindlichkeit gegenüber Diabetes dienen.
Es werden Oligonukleotidsonden, die für bestimmte Abschnitte der R-PTPase kodieren (siehe unten), verwendet, um Zellen eines Lebewesens hinsichtlich der Anwesenheit von DNA- oder RNA-Sequenzen, die für die R-PTPase kodieren, zu untersuchen. Eine bevorzugte Sonde wäre eine, die auf eine Nukleinsäuresequenz gerichtet ist, die für wenigstens vier Aminosäurereste, vorzugsweise wenigstens fünf Aminosäurereste, der R-PTPase-α oder eines anderen R- PTPase-Proteins der vorliegenden Erfindung kodiert. Mit derartigen Sonden können qualitative oder quantitative Tests durchgeführt werden. Zum Beispiel wird eine Northern-Analyse (siehe Beispiele III und VI unten) verwendet, um die Expression einer R-PTPase-mRNA in einer Zell- oder Gewebepräparation zu messen.
Derartige Methoden können nach Einsatz selektiver Amplifizierungstechniken auch mit sehr geringen Mengen von DNA, die von einem Lebewesen erhalten wurden, durchgeführt werden. Gentechnische Verfahren zur Amplifizierung gereinigter Nukleinsäurefragmente sind schon lange bekannt. Typischerweise beinhalten derartige Verfahren die Einführung des Nukleinsäurefragmentes in einen DNA- oder RNA-Vektor, die klonale Amplifizierung des Vektors und die Wiedergewinnung des amplifizierten Nukleinsäurefragmentes. Beispiele für derartige Methoden finden sich bei Cohen et al. (US-Patent 4 237 224) und Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cvld Spring Harbor, New York (1989), wobei diese Literaturstellen hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen werden.
Vor einiger Zeit wurde ein enzymatisches In-vitro-Verfahren beschrieben, das die Konzentration derartiger gewünschter Nukleinsäuremoleküle erhöhen kann. Dieses Verfahren wird als die Polymerase-Kettenreaktion oder "PCR" bezeichnet (Mullis, K., et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51 : 263-273 (1986); Erlich, H., et al., EP 50 424; EP 84 796; EP 258 017; EP 237 362; Mullis, K., EP 201 184; Mullis, K., et al., US 4 683 202; Erlich, H., US 4 582 788; und Saiki, R., et al., US 4 683 194).
Die Polymerase-Kettenreaktion stellt ein Verfahren zur selektiven Erhöhung der Konzentration einer bestimmten Nukleinsäuresequenz bereit, sogar wenn diese Sequenz zuvor nicht gereinigt wurde und nur als eine einzige Kopie in der jeweiligen Probe vorkommt. Das Verfahren kann zur Amplifizierung von einzel- oder doppelsträngiger DNA verwendet werden. Im wesentlichen beinhaltet das Verfahren die Verwendung von zwei Oligonukleotidsonden, die als Primer für die matrizenabhängige, durch die Polymerase katalysierte Replikation eines gewünschten Nukleinsäuremoleküls dienen.
Die genaue Art der beiden Oligonukleotidsonden der PCR-Methode ist kritisch für den Erfolg des Verfahrens. Wie gut bekannt ist, besitzt ein DNA- oder RNA-Molekül eine bestimmte Richtung, die durch die 5'-3'-Verbindung der Phosphatgruppen des Moleküls festgelegt ist. Sequenzen von DNA oder RNA werden durch die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen der terminalen 5'-Phosphatgruppe der einen Sequenz und der terminalen 3'-Hydroxygruppe einer zweiten Sequenz gebildet. Die polymeraseabhängige Amplifizierung eines Nukleinsäuremoleküls erfolgt durch die Anfügung eines 5'-Nukleosidtriphosphats an das 3'- Hydroxyende eines Nukleinsäuremoleküls. Somit verlängert die Aktivität einer Polymerase das 3'-Ende eines Nukleinsäuremoleküls. Diese inhärenten Eigenschaften werden bei der Auswahl der Oligonukleotidsonden für die PCR ausgenützt. Die Oligonukleotidsequenzen der Sonden für die PCR-Methode werden so ausgewählt, daß sie Sequenzen enthalten, die identisch mit oder komplementär zu den Sequenzen sind, die die jeweilige Nukleinsäuresequenz flankieren, deren Amplifizierung gewünscht wird.
Genauer gesagt werden die Oligonukleotidsequenzen der "ersten" Sonde so ausgewählt, daß sie imstande ist, mit einer Oligonukleotidsequenz zu hybridisieren, die 3'-ständig zur gewünschten Sequenz lokalisiert ist, während die Oligonukleotidsequenz der zweiten Sonde so ausgewählt wird, daß sie eine Oligonukleotidsequenz enthält, die identisch mit einer Sequenz ist, die 5'-ständig zum gewünschten Bereich vorkommt. Beide Sonden besitzen 3'-Hydroxygruppen und können deshalb als Primer für die Nukleinsäuresynthese dienen.
Bei der PCR werden die Reaktionsbedingungen zyklisch zwischen solchen Bedingun gen gewechselt, die für die Hybridisierung und die Nukleinsäurepolymerisation geeignet sind, und solchen, die zur Denaturierung von Duplexmolekülen führen. Beim ersten Schritt der Reaktion werden die Nukleinsäuren der Probe vorübergehend erhitzt und dann abgekühlt, um möglicherweise vorhandene doppelsträngige Moleküle zu denaturieren. Die "ersten" und "zweiten" Sonden werden dann der Probe in einer Konzentration zugegeben, die erheblich höher ist als diejenige des gewünschten Nukleinsäuremoleküls. Wenn die Probe unter Bedingungen inkubiert wird, die für die Hybridisierung und Polymerisierung geeignet sind, hybridisiert die "erste" Sonde mit dem Nukleinsäuremolekül der Probe in einer Position, die 3'-ständig zu der Sequenz angeordnet ist, die amplifiziert werden soll. Wenn das Nukleinsäuremolekül der Probe ursprünglich doppelsträngig war, dann hybridisiert die "zweite" Sonde mit dem komplementären Strang des Nukleinsäuremoleküls in einer Position, die 3'-ständig zu der Sequenz angeordnet ist, die komplementär zu derjenigen Sequenz ist, deren Amplifizierung gewünscht wird. Nach der Zugabe einer Polymerase werden die 3'-Enden der "ersten" und (wenn das Nukleinsäuremolekül doppelsträngig war) "zweiten" Sonden verlängert. Die Verlängerung der "ersten" Sonde führt zur Synthese eines Oligonukleotids, das die exakte Sequenz des gewünschten Nukleinsäuremoleküls aufweist. Die Verlängerung der "zweiten" Sonde führt zur Synthese eines Oligonukleotids, das die exakte Sequenz des komplementären Stranges des gewünschten Nukleinsäuremoleküls aufweist.
Die PCR-Reaktion ist zur exponentiellen Amplifizierung spezifischer Nukleinsäuresequenzen imstande, da das Verlängerungsprodukt der "ersten" Sonde notwendigerweise eine Sequenz enthält, die komplementär zu einer Sequenz der "zweiten" Sonde ist und somit als eine Matrize für die Erzeugung eines Verlängerungsproduktes der "zweiten" Sonde dienen kann. Ganz ähnlich enthält das Verlängerungsprodukt der "zweiten" Sonde notwendigerweise eine Sequenz, die komplementär zu einer Sequenz der "ersten" Sonde ist und somit als eine Matrize für die Erzeugung eines Verlängerungsproduktes der "ersten" Sonde dienen kann. Somit kann, wenn man Zyklen aus Polymerisierung und Denaturierung ablaufen läßt, ein geometrischer Anstieg der Konzentration des gewünschten Nukleinsäuremoleküls erhalten werden. Übersichtsartikel über die PCR finden sich bei Mullis, K. B. (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 (1986)); Saiki, R. K., et al.; Bio/Technology 3: 1008-1012 (1985)); und Mullis, K. B., et al., (Meth. Enzymol. 155: 335-350 (1987)).
Bei einer Ausführungsform zielt die Erfindung auf eine natürlich vorkommende R- PTPase-α des Säugetiers ab. Bei einer anderen Ausführungsform zielt die Erfindung auf eine rekombinante R-PTPase-α des Säugetiers ab. Die bevorzugten R-PTPasen der vorliegenden Erfindung sind menschlichen Ursprungs. Die Erfindung stellt das natürlich vorkommende Molekül im wesentlichen frei von anderen Proteinen bereit, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist. "Im wesentlichen frei von anderen Proteinen oder Glykoproteinen" zeigt an, daß das Protein zu wenigstens 90 Prozent (auf Gewichtsbasis), oder sogar zu wenigstens 99 Prozent, wenn es gewünscht ist, von anderen Proteinen und Glykoproteinen befreit ist, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist, und somit im wesentlichen frei von diesen ist. Das kann dadurch erreicht werden, daß die Zellen, das Gewebe oder die Flüssigkeiten, die die R-PTPase enthalten, Standardverfahren zur Proteinreinigung unterzogen werden, z. B. Immunoadsorbenssäulen, die monoklonale Antikörper gegen das Protein enthalten. Andere Formen der Affinitätsreinigung können Festphasensubstrate einsetzen, die die PTPase-Domäne binden, oder einen Liganden, der an die Rezeptordomäne bindet. Alternativ kann die Reinigung durch eine Kombination von Standardverfahren erreicht werden, wie einer Ammoniumsulfatfällung, einer Molekularsiebohromatographie und einer Ionenaustauschchromatographie.
Es versteht sich, daß die Säugetier-R-PTPase der vorliegenden Erfindung biochemisch aus einer Vielzahl von Zellen oder Geweben gereinigt werden kann. Für die Gewinnung einer natürlich vorkommenden R-PTPase werden Gewebe wie die Plazenta oder das Gehirn von Säugetieren, besonders menschlichen Ursprungs, bevorzugt.
Alternativ kann das Polypeptid, da das Gen für die R-PTPase isoliert oder synthetisiert werden kann, im wesentlichen frei von anderen Proteinen oder Glykoproteinen von Säugetieren in einem prokaryontischen Organismus oder in einem eukaryontischen Organismus, der kein Säugetier ist, synthetisiert werden, wenn es gewünscht wird. Wie es bei der vorliegenden Erfindung vorgesehen ist, ist ein rekombinantes R-PTPase-α-Molekül, das in Säugetierzellen, wie transfizierten COS-, NIH-3T3- oder CHO-Zellen, erzeugt wird, entweder eine natürlich vorkommende Proteinsequenz oder ein funktionelles Derivat von dieser. Wenn ein natürlich vorkommendes Protein oder Glykoprotein mit gentechnischen Verfahren erzeugt wird, wird es im wesentlichen frei von anderen Proteinen und Glykoprotein bereitgestellt, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist.
Alternativ gibt es gut bekannte Methoden zur Synthese von Polypeptiden einer gewünschten Sequenz auf Festphasenträgern und ihrer anschließenden Trennung vom Träger.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung "funktionelle Derivate" der R- PTPase bereit. Unter "funktionellem Derivat" versteht man ein "Fragment", eine "Variante", ein "Analoges" oder ein "chemisches Derivat" der R-PTPase, wobei die Begriffe unten definiert sind. Ein funktionelles Derivat behält wenigstens einen Teil der Funktion der R-PTPase bei, wie die Bindung an einen spezifischen Antikörper, die enzymatische Phosphataseaktivität oder die Bindung der extrazellulären Domäne an einen Liganden, was seine Einsetzbarkeit gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht.
Ein "Fragment" der R-PTPase bezieht sich auf einen beliebigen Teil des Moleküls, d. h. ein kürzeres Peptid.
Eine "Variante" der R-PTPase bezieht sich auf ein Molekül, das im wesentlichen entwe der dem gesamten Peptid oder einem Fragment von diesem ähnlich ist. Peptidvarianten können auf bequeme Weise durch direkte chemische Synthese der Peptidvariante unter Verwendung von Methoden, die in diesem Gebiet gut bekannt sind, hergestellt werden.
Alternativ können Aminosäuresequenzvarianten des Peptids durch Mutationen in der DNA hergestellt werden, die für das synthetisierte Peptid kodiert. Zu solchen Varianten gehören z. B. Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz. Es kann auch eine beliebige Kombination von Deletion, Insertion und Substitution erzeugt werden, um zum fertigen Konstrukt zu kommen, vorausgesetzt, daß das letztendliche Konstrukt die gewünschte Aktivität aufweist. Offensichtlich dürfen die Mutationen, die in der DNA, die für die Peptidvariante kodiert, erzeugt werden, den Leserahmen nicht verändern und vorzugsweise keine komplementären Regionen erzeugen, die sekundäre mRNA-Strukturen bilden (siehe Europäische Patentveröffentlichung Nr. EP 75 444).
Auf der genetischen Ebene werden diese Varianten üblicherweise durch ortsspezifische Mutagenese (wie man es z. B. bei Adelman et al., DNA 2: 183 (1983) findet) der Nukleotide der DNA, die für das Peptidmolekül kodieren, hergestellt, wodurch eine DNA, die für die Variante kodiert, erzeugt wird, und durch anschließendes Exprimieren der DNA in einer rekombinanten Zellkultur (siehe unten). Die Varianten weisen typischerweise qualitativ die gleiche biologische Aktivität wie das normale Peptid auf.
Ein "Analoges" der R-PTPase bezieht sich auf ein Molekül, das nicht natürlichen Ursprungs ist und entweder dem gesamten Molekül oder einem Fragment von diesem im wesentlichen ähnlich ist.
Ein "chemisches Derivat" der R-PTPase enthält zusätzliche chemische Gruppen, die normalerweise nicht Teil des Peptids sind. Kovalente Modifikationen des Peptids sind im Umfang dieser Erfindung enthalten. Derartige Modifikationen können in das Molekül eingeführt werden, indem bestimmte Aminosäurereste des Peptids mit einem organischen Derivatisierungsmittel umgesetzt werden, das imstande ist, mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten zu reagieren.
Cysteinreste werden üblicherweise mit α-Haloacetaten (und den entsprechenden Aminen) umgesetzt, wie Chloressigsäure und Chloracetamid, wodurch die Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethyl-Derivate erhalten werden. Cysteinreste werden auch durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidazoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleinimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2- Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
Histidinreste werden durch Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5-7,0 umgesetzt, da dieses Agens relativ spezifisch für die Histidinseitenkette ist. Parabromphenacylbromid ist ebenfalls nützlich; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durch geführt.
Lysinreste und aminoterminale Reste werden mit Succinanhydrid oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Die Derivatisierung mit diesen Agenzien bewirkt eine Umkehrung der Ladung der Lysinreste. Zu anderen geeigneten Reagenzien zur Derivatisierung von Resten mit α-Aminogruppen gehören Imidoester wie Methylpicolinimidat, Pyridoxalphosphat, Chlorborhydrid, Trinitrobenzolsulfonsäure, O-Methylisoharnstoff, 2,4-Pentandion und die transaminasekatalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Argininreste werden durch Reaktion mit einem herkömmlichen Reagens oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert, zu denen Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin gehören. Für die Derivatisierung von Argininresten ist es erforderlich, daß die Reaktion wegen des hohen pKa-Wertes der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Weiterhin können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysinresten sowie der Epsilon-Aminogruppe des Arginins reagieren.
Die spezifische Modifizierung von Tyrosinresten er se ist intensiv untersucht worden, wobei ein besonderes Interesse an der Einführung spektraler Markierungen in Tyrosinreste durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan bestand. Am häufigsten werden N-Acetylimidazol und Tetranitromethan zur Bildung von O-Acetyltyrosinspezies bzw. 3-Nitroderivaten verwendet.
Carboxyseitengruppen (Aspartat oder Glutamat) werden durch Umsetzen mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-R') wie 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodümid oder 1-Ethyl-3-(4- azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodümid selektiv modifiziert. Weiterhin werden Asparaginsäure- und Glutaminsäurereste durch Umsetzen mit Ammoniumionen in Asparagin- und Glutaminreste umgewandelt.
Glutamin- und Asparaginreste werden häufig zu den entsprechenden Glutaminsäure- und Asparaginsäureresten desamidiert. Alternativ werden diese Reste unter milden sauren Bedingungen desamidiert. Beide Formen dieser Reste sind im Umfang dieser Erfindung enthalten.
Die Derivatisierung mit bifunktionellen Agenzien ist für das Quervernetzen des Peptids mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder anderen makromolekularen Trägern nützlich. Zu üblicherweise verwendeten Vernetzungsmitteln gehören z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, z. B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionellen Imidoestern, einschließlich von Disuccinimidylestern wie 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat) und bifunktionelle Maleinimide wie Bis-N-Maleinimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat führen zu photoaktivierbaren Intermediaten, die in Gegenwart von Licht Quervernetzungen ausbilden können. Alternativ werden reaktive wasserunlösliche Matrices, wie cyanogenbromidaktivierte Kohlenhydrate und die reaktiven Substrate, die in den US-Patenten 3 969 287 + 3 691 016, 4 195 128, 4 247 642, 4 229 537 und 4 330 440 beschrieben werden, zur Immobilisierung von Proteinen eingesetzt.
Zu anderen Modifikationen gehören die Hydroxylierung des Prolins und Lysins, die Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Serin- oder Threonin-Resten, die Methylierung der α-Aminogruppen des Lysins, Arginins und Histidins (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, Seite 79-86 (1983)), die Acetylierung der N-terminalen Aminogruppen und, in einigen Fällen, die Amidierung der C-terminalen Carboxygruppen.
Derartige derivatisierte Gruppen können die Löslichkeit, die Absorption, die biologische Halbwertszeit und dergleichen verbessern. Die Gruppen können alternativ eine mögliche unerwünschte Nebenwirkung des Proteins und dergleichen verhindern oder abschwächen. Gruppen, die imstande sind, derartige Effekte zu vermitteln, werden z. B. in Reminciton's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1980) offengelegt.
Diese Erfindung zielt auch auf einen Antikörper ab, der für ein Epitop der R-PTPase, vorzugsweise der R-PTPase-α und am bevorzugtesten der R-PTPase-α des Menschen, spezifisch ist, und auf die Verwendung eines derartigen Antikörpers zum Nachweis der Anwesenheit und zur Bestimmung der Menge oder Konzentration der R-PTPase in einer Zelle, einem Zell- oder Gewebeextrakt oder in einer biologischen Flüssigkeit.
Der Begriff "Antikörper" soll polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAbs), schimärische Antikörper und anti-idiotypische (anti-ID) Antikörper umfassen.
Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die aus Seren von Tieren gewonnen werden, die mit einem Antigen immunisiert wurden.
Monoklonale Antikörper sind eine im wesentlichen homogene Population von Antikörpern gegen spezifische Antigene. MAbs können mit Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, erhalten werden; siehe z. B. Köhler und Milstein, Nature 256: 495-497 (1975) und das US-Patent Nr. 4 376 110. Derartige Antikörper können aus jeder beliebigen Immunglobulinklasse, einschließlich von IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und einer beliebigen Unterklasse von diesen, stammen. Das Hybridom, das die mAbs dieser Erfindung erzeugt, kann in vitro oder in vivo kultiviert werden. Die Erzeugung hoher Titer von mAbs in vivo macht dieses Herstellungsverfahren gegenwärtig zur bevorzugten Methode der Erzeugung. Kurz gesagt werden die jeweiligen Hybridomzellen intraperitoneal Pristan-behandelten BALB/c-Mäusen injiziert, um Ascitesflüssigkeit zu erzeugen, die hohe Konzentrationen der gewünschten mAbs enthält. MAbs des IgM- oder lgG-lsotyps können unter Verwendung von säulenchromatographischen Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind, aus derartigen Ascitesflüssigkeiten oder aus den Überständen von Zellkulturen isoliert werden.
Schimärische Antikörper sind Moleküle, die unterschiedliche Abschnitte enthalten, die von verschiedenen Tierspezies stammen, wie diejenigen, die eine variable Region aufweisen, die von einem mAb der Maus stammt, und eine konstante Immunglobulinregion vom Menschen. Schimärische Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind in diesem Fachgebiet bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (1984); Cabilly et al., Europäische Patentanmeldung 125023 (veröffentlicht am 14. November 1984); Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., Europäische Patentanmeldung 171496 (veröffentlicht am 19. Februar 1985); Morrison et al., Europäische Patentanmeldung 173494 (veröffentlicht am 5. März 1986); Neuberger et al., PCT-Anmeldung WO 86/01533 (veröffentlicht am 13. März 1986); Kudo et al., Europäische Patentanmeldung 184187 (veröffentlicht am 11. Juni 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., Internationale Patentveröffentlichung Nr. PCT/US86/02269 (veröffentlicht am 7. Mai 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988)). Diese Literaturstellen werden hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen.
Ein anti-idiotypischer (anti-Id) Antikörper ist ein Antikörper, der spezifische Determinanten erkennt, die im allgemeinen mit der antigenbindenden Stelle eines Antikörpers assoziiert sind. Ein Anti-Id-Antikörper kann hergestellt werden, indem ein Tier der gleichen Spezies und des gleichen genetischen Typs (z. B. Mäusestammes) wie dasjenige, von dem der monoklonale Antikörper stammt, mit dem mAb immunisiert wird, gegen den ein Anti-Id-Antikörper hergestellt wird. Das immunisierte Tier erkennt die idiotypischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers und antwortet, indem es einen Antikörper gegen diese idiotypischen Determinanten bildet (den Anti-Id-Antikörper).
Der Anti-Id-Antikörper kann auch als ein "Immunogen" zur Induktion einer Immunantwort in noch einem anderen Tier verwendet werden, wodurch ein sogenannter Anti-anti-Id-Antikörper erzeugt wird. Der Anti-anti-Id-Antikörper kann bezüglich seines Epitops identisch mit dem ursprünglichen mAb sein, der den Anti-anti-Id-Antikörper induzierte. Somit ist es durch Verwendung von Antikörpern gegen die idiotypischen Determinanten eines mAb möglich, andere Klone zu identifizieren, die Antikörper mit der gleichen Spezifität exprimieren.
Dementsprechend können mAbs, die gegen die R-PTPase der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden, verwendet werden, um Anti-Id-Antikörper in geeigneten Tieren, z. B. BALB/c- Mäusen, zu induzieren. Milzzellen von solchen immunisierten Mäusen werden verwendet, um Ant-Id-Hybridome zu erzeugen, die Anti-Id-mAbs sezernieren. Weiterhin können die Anti-IdmAbs an einen Träger gekoppelt werden, wie das Hämocyanin der Schlüsselloch-Napf schnecke (KLH), und zur Immunisierung weiterer BALB/c-Mäuse verwendet werden. Seren dieser Mäuse enthalten Anti-Anti-Id-Antikörper, die die Bindungseigenschaften des ursprünglichen, für ein R-PTPase-Epitop spezifischen mAbs haben.
Die Anti-IdmAbs haben somit ihre eigenen idiotypischen Epitope oder "Idiotope", die strukturell dem untersuchten Epitop, wie der R-PTPase-α, ähnlich sind.
Der Begriff "Antikörper" soll auch sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente von diesen umfassen, z. B. Fab und F(ab')&sub2;, die imstande sind, das Antigen zu binden. Die Fab- und F(ab')&sub2;-Fragmente weisen nicht das Fc-Fragment des intakten Antikörpers auf, verschwinden schneller aus dem Blutkreislauf und können weniger unspezifische Gewebebindung als ein intakter Antikörper aufweisen (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).
Es wird klar sein, daß die Fab- und F(ab')2-Fragmente sowie andere Fragmente der Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, zum Nachweis und zur Quantifizierung der R-PTPase gemäß den hier offengelegten Verfahren für intakte Antikörpermoleküle verwendet werden können. Derartige Fragmente werden typischerweise unter Verwendung von Enzymen wie Papain (zur Erzeugung von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Erzeugung von F(ab')2-Fragmenten) durch proteolytische Spaltung erzeugt.
Von einem Antikörper sagt man, daß er "zur Bindung eines Moleküls fähig" ist, wenn er fähig ist, spezifisch mit dem Molekül zu reagieren und dadurch das Molekül an den Antikörper zu binden. Der Begriff "Epitop" soll sich auf denjenigen Teil eines beliebigen Moleküls, das von einem Antikörper gebunden wird, beziehen, der ebenfalls von diesem Antikörper erkannt werden kann. Epitope oder "antigene Determinanten" bestehen im allgemeinen aus chemisch aktiven Oberflächengruppen von Molekülen, wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, und weisen spezifische dreidimensionale strukturelle Charakteristika sowie spezifische Ladungseigenschaften auf.
Ein "Antigen" ist ein Molekül oder ein Teil eines Moleküls, das bzw. der imstande ist, von einem Antikörper gebunden zu werden, wobei es bzw. er außerdem dazu imstande ist, ein Tier dazu zu bringen, einen Antikörper zu erzeugen, der imstande ist, an ein Epitop dieses Antigens zu binden. Ein Antigen kann ein Epitop oder mehr als ein Epitop aufweisen. Die oben erwähnte spezifische Reaktion soll bedeuten, daß das Antigen auf äußerst selektive Weise mit seinem entsprechenden Antikörper reagiert und nicht mit der großen Zahl der anderen Antikörper, die durch andere Antigene hervorgerufen sein können.
Die für die vorliegende Erfindung nützlichen Antikörper oder Fragmente von Antikörpern können verwendet werden, um die Anwesenheit von Zellen quantitativ oder qualitativ nachzuweisen, die das R-PTPase-Protein exprimieren. Das kann mit Immunfluoreszenztechniken erreicht werden, die einen fluoreszenzmarkierten Antikörper (siehe unten) verwenden, gekoppelt mit einem lichtmikroskopischen, durchflußzytometrischen oder fluorimetrischen Nachweis.
Die für die vorliegende Erfindung nützlichen Antikörper (oder Fragmente von diesen) können histologisch eingesetzt werden, wie in der Immunfluoreszenz- oder Immunelektronenmikroskopie, um die R-PTPase in situ nachzuweisen. Ein In-situ-Nachweis kann erreicht werden, indem eine histologische Probe aus einem Patienten entnommen und ein markierter Antikörper der vorliegenden Erfindung mit einer derartigen Probe in Kontakt gebracht wird. Der Antikörper (oder das Fragment) wird vorzugsweise zugeführt, indem der markierte Antikörper (oder das markierte Fragment) auf eine biologische Probe aufgebracht oder geschichtet wird. Durch die Anwendung einer derartigen Prozedur ist es möglich, nicht nur die Anwesenheit der R-PTPase nachzuweisen, sondern auch ihre Verteilung im untersuchten Gewebe. Beim Einsatz der vorliegenden Erfindung wird es einem Fachmann mit durchschnittlichem Wissen klar sein, daß jedes beliebige Verfahren aus einer großen Vielzahl histologischer Verfahren (wie Färbungsmethoden) modifiziert werden kann, um einen solchen In-situ-Nachweis zu erreichen. Derartige Tests für die R-PTPase umfassen typischerweise die Inkubation einer biologischen Probe, z. B. einer biologischen Flüssigkeit, eines Gewebeextraktes, frisch geernteter Zellen, wie Lymphozyten oder Leukozyten, oder von Zellen, die in Gewebekultur inkubiert wurden, in Gegenwart eines zum Nachweis markierten Antikörpers, der imstande ist, die R- PTPase zu identifizieren, sowie das Nachweisen des Antikörpers mit einer beliebigen aus einer Vielzahl von Techniken, die in diesem Fachgebiet gut bekannt sind.
Die biologische Probe kann mit einem Festphasenträger, wie Nitrozellulose oder einem anderen festen Träger, der imstande ist, Zellen, Zellteilchen oder lösliche Proteine zu immobilisieren, behandelt werden. Der Träger kann dann mit geeigneten Puffern gewaschen werden, woran sich die Behandlung mit dem für den Nachweis markierten R-PTPase-spezifischen Antikörper anschließt. Der Festphasenträger kann dann ein zweites Mal mit dem Puffer gewaschen werden, um nicht gebundenen Antikörper zu entfernen. Die Menge der gebundenen Markierung an dem genannten Festphasenträger kann dann mittels herkömmlicher Verfahren bestimmt werden.
Unter "Festphasenträger" soll jeder beliebige Träger verstanden werden, der imstande ist, Antigene oder Antikörper zu binden. Zu gut bekannten Trägern oder Stützmaterialien gehören Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Zellulose, Polyacrylamide, Gabbros und Magnetide. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann der Träger entweder in einem gewissen Umfang löslich oder auch unlöslich sein. Das Trägermaterial kann praktisch jede beliebige strukturelle Konfiguration aufweisen, solange das gekoppelte Molekül imstande ist, an ein Antigen oder an einen Antikörper zu binden. Somit kann die Konfiguration des Trägers sphärisch sein, wie bei einem Korn, oder zylindrisch, wie bei der inneren Fläche eines Teströhrchens oder der äußeren Fläche eines Stabes. Alternativ kann die Oberfläche flach sein, wie bei einem Blatt, einem Teststreifen etc.. Zu bevorzugten Trägern gehören Polystyrolkörner. Der Fachmann kennt viele andere geeignete Träger zur Bindung von Antikörpern oder Antigenen oder ist imstande, die Verwendbarkeit von solchen durch Routineexperimente zu bestimmen.
Die Bindungsaktivität einer bestimmten Charge des Anti-R-PTPase-Antikörpers kann mittels gut bekannter Verfahren bestimmt werden. Der Fachmann ist in der Lage, mittels Routineexperimenten operative und optimale Testbedingungen für jede Bestimmung festzulegen.
Andere derartige Schritte, wie Waschen, Rühren, Schütteln, Filtern und dergleichen, können, wenn es für die jeweilige Situation üblich oder notwendig ist, in die Tests eingearbeitet werden.
Eines der Verfahren, durch das der R-PTPase-spezifische Antikörper nachweisbar markiert werden kann, besteht darin, ihn an ein Enzym zu binden und in einem Enzymimmunoassay (EIA) einzusetzen. Dieses Enzym wird seinerseits später, wenn es mit einem geeigneten Substrat in Kontakt gebracht wird, mit dem Substrat so reagieren, daß eine chemische Gruppe erzeugt wird, die z. B. durch spektraiphotometrische, fluorimetrische oder optische Verfahren nachgewiesen werden kann. Zu Enzymen, die zur Markierung eines Antikörpers für den Nachweis verwendet werden können, gehören, ohne auf diese beschränkt zu sein, die Malatdehydrogenase, die Staphylokokkennuklease, die Delta-5-steroidisomerase, die Alkoholdehydrogenase der Hefe, die α-Glycerinphosphatdehydrogenase, die Triosephosphatisomerase, die Meerrettichperoxidase, die alkalische Phosphatase, die Asparaginase, die Glucoseoxidase, die β-Galaktosidase, die Ribonuklease, die Urease, die Katalase, die Glucose-6-phosphatdehydrogenase, die Glucoamylase und die Acetylcholinesterase. Der Nachweis kann mit kolorimetrischen Verfahren, die ein chromogenes Substrat des Enzyms einsetzen, erreicht werden. Der Nachweis kann auch durch den Vergleich des Ausmaßes der enzymatischen Reaktion eines Substrats mit derjenigen ähnlich hergestellter Standards mit bloßem Auge bewerkstelligt werden.
Der Nachweis kann durch den Einsatz eines beliebigen aus einer Vielzahl anderer Immunoassays bewerkstelligt werden. Zum Beispiel ist es mittels radioaktiver Markierung der Antikörper oder Antikörper-Fragmente möglich, die R-PTPase mittels eines Radioimmunoassays (RIA) nachzuweisen (siehe, z. B., Work, T. S., et al., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biolopy, North Holland Publishing Company, New York, 1978; diese Literaturstelle wird mit der entsprechenden Quellenangabe hier aufgenommen). Das radioaktive Isotop kann z. B. durch die Verwendung eines Gammazählers oder eines Szintillationszählers oder durch Autoradiographie nachgewiesen werden.
Es ist auch möglich, den Antikörper mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Wenn der fluoreszenzmarkierte Antikörper Licht geeigneter Wellenlänge ausgesetzt wird, kann seine Anwesenheit aufgrund der Fluoreszenz nachgewiesen werden. Zu den am häufig sten verwendeten fluoreszierenden Markierungsverbindungen gehören Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin.
Der Antikörper kann für den Nachweis auch mit fluoreszierenden Metallen, wie ¹&sup5;²EU oder anderen Metallen aus der Reihe der Lanthanoiden, markiert werden. Diese Metalle können unter Verwendung metallchelatierender Gruppen, wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), am Antikörper befestigt werden.
Der Antikörper kann für den Nachweis auch durch Koppeln an eine chemilumineszierende Verbindung markiert werden. Die Anwesenheit des chemilumineszenzmarkierten Antikörpers wird dann durch den Nachweis von Lumineszenz erkannt, die während einer chemischen Reaktion entsteht. Beispiele für besonders nützliche chemilumineszierende Markierungsverbindungen sind Luminol, Isoluminol, theromatische Acridiniumester, Imidazol und Oxalatester.
Ganz ähnlich kann eine biolumineszierende Verbindung zur Markierung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Biolumineszenz ist ein Typ von Chemilumineszenz, der in biologischen Systemen gefunden wird, bei denen ein katalytisches Protein die Effizienz der Chemilumineszenzreaktion erhöht. Die Anwesenheit eines biolumineszierenden Proteins wird durch den Nachweis der Anwesenheit von Lumineszenz geführt. Wichtige biolumineszierende Verbindungen für eine Markierung sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
Die Antikörpermoleküle der vorliegenden Erfindung können einem Einsatz in einem immunometrischen Test, auch bekannt als "zweiseitiger Test" oder "Sandwich-Test", angepaßt werden. In einem typischen immunometrischen Test wird eine bestimmte Menge des unmarkierten Antikörpers (oder eines Fragmentes des Antikörpers) an einen festen Träger gebunden, und es wird eine bestimmte Menge des für den Nachweis markierten löslichen Antikörpers zugesetzt, um den Nachweis und/oder die Quantifizierung des ternären Komplexes zu ermöglichen, der sich aus dem Festphasen-Antikörper, dem Antigen und dem markierten Antikörper bildet.
Zu typischen und bevorzugten immunometrischen Tests gehören "Vorwärtstests", bei denen der an die feste Phase gebundene Antikörper zuerst mit der Probe, die getestet werden soll, in Kontakt gebracht wird, um das Antigen durch die Bildung eines binären Festphasen- Antikörper-Antigen-Komplexes aus der Probe zu extrahieren. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird der feste Träger gewaschen, um die Reste der flüssigen Probe zu entfernen, einschließlich des nicht umgesetzten Antigens, wenn solches vorhanden ist, und dann mit der Lösung in Kontakt gebracht, die eine unbekannte Menge des markierten Antikörpers (der als ein "Reportermolekül" fungiert) enthält. Nach einer zweiten Inkubationszeit, die dazu dient, es dem markierten Antikörper zu ermöglichen, einen Komplex mit dem über den unmarkierten Antikörper an den festen Träger gebundenen Antigen zu bilden, wird der feste Träger ein zweites Mal gewaschen, um den nicht umgesetzten markierten Antikörper zu entfernen.
Bei einem anderen Typ des "Sandwich"-Tests, der auch für die Antigene der vorliegenden Erfindung nützlich sein kann, werden sogenannte "simultane" oder "umgekehrte" Tests verwendet. Ein simultaner Test umfaßt einen einzigen Inkubationsschritt, da der an den festen Träger gebundene Antikörper und der markierte Antikörper gleichzeitig zur Probe, die untersucht werden soll, gegeben werden. Nach dem vollständigen Ablauf der Inkubation wird der feste Träger gewaschen, um die Reste der flüssigen Probe und den nicht komplexierten markierten Antikörper zu entfernen. Die Anwesenheit des markierten, mit dem festen Träger assoziierten Antikörpers wird dann wie in einem konventionellen "Vorwärts"-Sandwich-Test nachgewiesen.
Beim umgekehrten" Test wird im ersten Schritt zunächst eine Lösung des markierten Antikörpers zur flüssigen Probe gegeben, woran sich, nach einer geeigneten Inkubationszeit, der Zusatz des an einen festen Träger gebundenen unmarkierten Antikörpers anschließt. Nach einer zweiten Inkubation wird die feste Phase auf herkömmliche Weise gewaschen, um sie von den Resten der Probe, die untersucht wird, und der Lösung des nicht umgesetzten markierten Antikörpers zu befreien. Die Bestimmung des markierten, mit einem festen Träger assoziierten Antikörpers wird dann wie bei den "simultanen Tests" und den "Vorwärtstests" durchgeführt.
Das Vorkommen einer normal funktionierenden R-PTPase in einem Lebewesen kann auch mittels direkter enzymatischer Tests für die Tyrosinphosphataseaktivität untersucht werden. Derartige biochemische Messungen können unter Verwendung gereinigter Enzyme in vitro durchgeführt werden, was die genaue Bestimmung der Enzymaktivität ermöglicht, oder mit Membranpräparationen oder ganzen Zellen, wobei die Gesamtmenge des Phosphotyrosins bestimmt wird.
Bei weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden eine DNA- Sequenz, die für ein R-PTPase-Molekül kodiert, sowie Verfahren zur Expression der DNA- Sequenz bereitgestellt. Ein durchschnittlicher Fachmann auf diesem Gebiet weiß, wie man unter Verwendung der genetischen Sequenzen und Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung weitere R-PTPase-Moleküle des Menschen oder anderer Säugetierspezies, die eine Sequenzhomologie zu den hier beschriebenen R-PTPase-Molekülen aufweisen, ohne übermäßiges Experimentieren identifiziert und kloniert. Weiterhin erlaubt die Manipulation der genetischen Konstrukte der vorliegenden Erfindung das Aufpfropfen einer bestimmten ligandenbindenden Rezeptordomäne auf die Transmembranbereiche und katalytischen Bereiche der R-PTPase, was zu schimärischen Molekülen führt. Zu nicht-limitierenden Beispielen derartiger schimärischer Moleküle gehört die R-PTPase, bei der der Rezeptor ein Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor, ein Rezeptor für den Fibroblasten-Wachstumsfaktor und der gleichen ist. Gentechnisch konstruierte schimärische Rezeptoren sind in diesem Fachgebiet gut bekannt (siehe z. B. Riedel, H., et al., Nature 324: 628-6760 (1986)).
Genetische Konstrukte, die für die R-PTPase-α kodieren, funktionelle Derivate von dieser und schimärische Moleküle, wie die oben beschriebenen, können in der Gentherapie eingesetzt werden. Eine anormale oder nicht richtig funktionierende R-PTPase, die zu einer Krankheit führt, kann durch Infusion von Zellen der gewünschten Abstammung (wie hämatopoetischen Zellen), die mit einer normalen R-PTPase transfiziert sind, ersetzt werden. Alternativ oder zusätzlich können Zellen, die eine schimärische R-PTPase aufweisen, die einen Rezeptor für einen ausgewählten Liganden (z. B. EGF) besitzt, für eine derartige Gentherapie eingesetzt werden.
Die rekombinanten DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung können mittels eines beliebigen von vielen Verfahren hergestellt werden, z. B. durch DNA- oder RNA-Synthese oder, bevorzugter, durch Anwendung gentechnischer Verfahren. Techniken zur Synthese derartiger Moleküle sind z. B. bei Wu, R., et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21: 101-141 (1978) offengelegt. Verfahren zur Konstruktion rekombinanter Moleküle gemäß dem oben beschriebenen Verfahren werden bei Sambrook et al. (siehe oben) offengelegt.
Das 3'-Ende des rekombinanten Moleküls dieser Erfindung wird vorzugsweise so behandelt, daß es für die Polymerisation ungeeignet wird. Eine derartige Behandlung kann erreicht werden, indem der Terminus mit chemischen Verfahren blockiert wird, oder indem die terminalen Basen modifiziert werden, so daß sie die Polymeraseaktivität sterisch behindern. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird diese Behandlung erreicht, indem das 3'-Ende immobilisiert wird, z. B. durch Koppeln an einen festen Träger (wie z. B. Glas, Kunststoff, Latex etc.). Der Träger kann jede beliebige Form haben (z. B. ein Bogen, ein Stab, eine Kugel, ein ovaler Körper etc. sein). Verfahren für eine derartige Immobilisierung sind einem durchschnittlichen Fachmann gut bekannt. Bei der bevorzugtesten Ausführungsform wird das 3'-Ende des rekombinanten Moleküls kovalent an den festen Träger gebunden. Es kann ein Spacerbereich eingesetzt werden, um die Sonde vom festen Träger nach außen zu verlängern, solange (I) sie nicht sterisch eine Funktion oder ein Charakteristikum des rekombinanten Moleküls stört und (2) die Sequenz des Spacerbereiches nicht an den Hybridisierungs- oder Polymerisierungsreaktionen des Tests teilnimmt. Typischerweise ist es erwünscht, verschiedene, und vorzugsweise eine große Zahl, derartiger rekombinanter Moleküle am Träger zu immobilisieren. Oligonukleotide, die einen Abschnitt einer R-PTPase repräsentieren, sind für das Screenen auf die Anwesenheit von Genen, die für derartige Proteine kodieren, und für das Klonieren der R-PTPase-Gene nützlich. Techniken zur Synthese derartiger Oligonukleotide sind z. B. bei Wu, R., et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21: 101-141 (1978) offengelegt.
Proteinmoleküle werden z. B. mit Cyanogenbromid oder mit Proteasen wie Papain, Chymotrypsin, Trypsin etc. fragmentiert (Oike, Y., et al., J. Biol. Chem. 257: 9751-9758 (1982); Liu, C., et al., Int. J. Pept. Protein Res. 21: 209-215 (1983)). Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon für die Kodierung einer bestimmten Aminosäure verwendet werden (Watson, J. D., in: Molecular Biolopv of the Gene, 4. Ausgabe, Benjamin/Cummings Publishing Co., Menlo Park, Kalifornien (1987)). Mittels des genetischen Codes kann ein Oligonukleotid oder können mehrere Oligonukleotide identifiziert werden, von denen jedes die Aminosäure kodieren könnte. Die Wahrscheinlichkeit, daß ein bestimmtes Oligonukleotid tatsächlich die wirkliche XXX-kodierende Sequenz darstellt, kann abgeschätzt werden, indem die anormalen Basenpaarungsbeziehungen und die Häufigkeit, mit der ein bestimmtes Codon tatsächlich in eukaryontischen Zellen (für die Kodierung der jeweiligen Aminosäure) verwendet wird, berücksichtigt werden. Derartige "Regeln der Codonverwendung" werden bei Lathe, R., et al., J. Molec. Biol. 183: 1-12 (1985) offengelegt. Unter Verwendung der "Regeln der Codonverwendung" von Lathe wird ein einziges Oligonukleotid oder eine Reihe von Oligonukleotiden, das bzw. die eine theoretisch "am wahrscheinlichsten" funktionierende Nukleotidsequenz enthält bzw. enthalten, die imstande ist, für die R-PTPase-Sequenzen zu kodieren, identifiziert.
Obwohl gelegentlich eine Aminosäuresequenz nur von einem einzigen Oligonukleotid kodiert werden kann, kann die Aminosäuresequenz häufig durch ein beliebiges aus einer Reihe ähnlicher Oligonukleotide kodiert werden. Es ist wichtig, daß, obwohl alle Mitglieder dieser Reihe Oligonukleotide enthalten, die imstande sind, für das Peptidfragment zu kodieren, und somit potentiell die gleiche Oligonukleotidsequenz enthalten wie das Gen, das dieses Peptidfragment kodiert, nur ein Mitglied dieser Reihe die Nukleotidsequenz enthält, die mit der Nukleotidsequenz des Gens identisch ist. Da dieses Mitglied in der Reihe vorkommt und auch in Anwesenheit der anderen Mitglieder dieser Reihe zur Hybridisierung an die DNA fähig ist, ist es möglich, die unfraktionierte Reihe der Oligonukleotide auf die gleiche Weise zu verwenden, wie man ein einziges Oligonukleotid einsetzen würde, um das Gen zu klonieren, das für das Peptid kodiert.
Das Oligonukleotid oder die Reihe von Oligonukleotiden, das bzw. die die theoretisch "wahrscheinlichste" Sequenz enthält bzw. enthalten, die zur Kodierung des R-PTPase-Fragmentes fähig ist, wird verwendet, um die Sequenz eines komplementären Oligonukleotids oder einer Reihe von Oligonukleotiden zu identifizieren, die imstande ist, mit der "wahrscheinlichsten" Sequenz oder Reihe von Sequenzen zu hybridisieren. Ein Oligonukleotid, das eine derartige komplementäre Sequenz enthält, kann als eine Sonde zur Identifizierung und Isolierung des R-PTPase-Gens verwendet werden (Sambrook et al., siehe oben).
Ein geeignetes Oligonukleotid oder eine Reihe von Oligonukleotiden, das bzw. die imstande ist, für ein Fragment des R-PTPase-Gens zu kodieren (oder das komplementär zu einem derartigen Oligonukleotid oder Reihe von Oligonukleotiden ist) wird identifiziert (unter Verwendung der oben beschriebenen Prozedur), synthetisiert und mittels Verfahren, die in diesem Gebiet gut bekannt sind, mit einer DNA oder, bevorzugter, einer cDNA-Präparation hybridisiert, die von Zellen stammt, die zur Expression des R-PTPase-Gens fähig sind. Einsträngige Oligonukleotide, die komplementär zu der Sequenz sind, die "am wahrscheinlichsten" für ein R-PTPase-Peptid kodiert, können unter Verwendung von Verfahren synthetisiert werden, die einem durchschnittlichen Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind (Belagaje, R., et al., J. Biol. Chem. 254: 5765-5780 (1979); Maniatis, T., et al., in: Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, Nierlich, D. P., et al. (Hrsg.), Acad. Press, New York (1976); Wu, R., et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21: 101-141 (1978); Khorana, R. G., Science 203: 614-625 (1979)). Außerdem kann die DNA-Synthese durch die Verwendung automatischer Synthesegeräte bewerkstelligt werden. Techniken der Nukleinsäurehybridisierung werden bei Sambrook et al. (siehe oben) und bei Haymes, B. D., et al. (in: Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)) offengelegt; diese Literaturstellen werden hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen. Techniken wie die oben beschriebenen oder ähnliche Techniken wurden erfolgreich eingesetzt für die Klonierung von Genen der menschlichen Aldehyddehydrogenasen (Hsu, L. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3771-3775 (1985)), des Fibronectins (Suzuki, S., et al., EMBO J. 4: 2519- 2524 (1985)), des Gens für den menschlichen Östrogenrezeptor (Walter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7889-7893 (1985)), des Plasminogenaktivators vom Gewebetyp (Pennica, D., et al., Nature 301: 214-221 (1983)) und der cDNA der menschlichen plazentaren alkalischen Phosphatase (Kam, W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8715-8719 (1985)).
Bei einem alternativen Weg zur Klonierung des R-PTPase-Gens wird eine Bank von Expressionsvektoren durch Klonieren von DNA oder, bevorzugter, cDNA (aus einer Zelle, die zur Expression der R-PTPase fähig ist) in einen Expressionsvektor hergestellt. Die Bank wird dann nach Vektoren durchsucht, die zur Expression eines Proteins fähig sind, das an den Anti- R-PTPase-Antikörper bindet, und die eine Nukleotidsequenz aufweisen, die zur Kodierung von Polypeptiden fähig ist, die die gleiche Aminosäuresequenz wie die R-PTPase oder Fragmente von dieser aufweisen. Bei dieser Ausführungsform wird DNA oder, bevorzugter, cDNA aus einer Zelle, die zur Expression des R-PTPase-Proteins fähig ist, extrahiert und gereinigt. Die gereinigte cDNA wird fragmentiert (durch Scheren, Endonukleaseverdau etc.), um einen Pool von DNA- oder cDNA-Fragmenten zu erzeugen. Die DNA- oder cDNA-Fragmente aus diesem Pool werden dann in einen Expressionsvektor kloniert, um eine genomische Bank von Expressionsvektoren herzustellen, die alle ein individuelles kloniertes Fragment der DNA oder cDNA enthalten.
Ein "Expressionsvektor" ist ein Vektor, der (aufgrund des Vorkommens der geeigneten Kontrollsequenzen für die Transkription und/oder die Translation) imstande ist, ein DNA-Mole kül (oder cDNA-Molekül) zu exprimieren, das in den Vektor kloniert wurde, und der dadurch fähig ist, ein Polypeptid oder Protein zu erzeugen. Die Expression der klonierten Sequenzen erfolgt, wenn der Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wird. Wenn ein prokaryontischer Expressionsvektor verwendet wird, dann wäre die geeignete Wirtszelle jede beliebige prokaryontische Zelle, die zur Expression der klonierten Sequenzen fähig ist. Ähnlich wäre, wenn ein eukaryontischer Expressionsvektor verwendet wird, die geeignete Wirtszelle jede beliebige eukaryontische Zelle, die zur Expression der klonierten Sequenzen fähig ist. Da eukaryontische DNA eingeschobene Sequenzen enthalten kann, und da derartige Sequenzen in prokaryontischen Zellen nicht korrekt prozessiert werden können, wird es für die Erzeugung einer Bank prokaryontischer genomischer Expressionsvektoren bevorzugt, eine cDNA aus einer Zelle einzusetzen, die imstande ist, die R-PTPase zu exprimieren. Verfahren zur Gewinnung von cDNA und zur Erzeugung einer genomischen Bank werden bei Sambrook et al. (siehe oben) offengelegt.
Eine DNA-Sequenz, die für die erfindungsgemäße R-PTPase oder für deren funktionelle Derivate kodiert, kann mit Vektor-DNA mittels herkömmlicher Techniken rekombiniert werden, einschließlich von stumpfen oder abgestuften Termini für die Ligation, eines Verdaus mit Restriktionsenzymen zur Bereitstellung geeigneter Termini, des Ausfüllens von kohäsiven Enden, der Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Vermeidung unerwünschter Verknüpfungen und der Ligation mit geeigneten Ligasen. Techniken für derartige Manipulationen werden bei Sambrook et al. (siehe oben) offengelegt und sind in diesem Fachgebiet gut bekannt.
Man sagt von einem Nukleinsäuremolekül, z. B. DNA, daß es "imstande ist, ein Polypeptid zu exprimieren", wenn es Nukleotidsequenzen aufweist, die die Information für die Regulation der Transkription und der Translation enthalten, und diese Sequenzen auf passende Weise mit Nukleotidsequenzen verknüpft sind, die für das Polypeptid kodieren. Eine passende Verknüpfung ist eine Verknüpfung, bei der die regulatorischen DNA-Sequenzen und die DNA- Sequenz, die exprimiert werden soll, so verknüpft sind, daß die Genexpression ermöglicht wird. Die genaue Art der regulatorischen Regionen, die für die Genexpression benötigt werden, kann von Organismus zu Organismus unterschiedlich sein, aber sie sollen im allgemeinen einen Promotorbereich enthalten, der, in Prokaryonten, sowohl den Promotor (der die Initiation der RNA-Transkription regelt) als auch die DNA-Sequenzen enthält, die, wenn sie in RNA transkribiert werden, das Signal für die Initiation der Proteinsynthese geben. Derartige Regionen enthalten normalerweise solche 5'-ständigen nicht kodierenden Sequenzen, die eine Rolle bei der Initiation der Transkription und Translation spielen, wie z. B. die TATA-Box, die Capping- Sequenz, die CAAT-Sequenz und dergleichen.
Wenn es gewünscht wird, kann der nicht kodierende Bereich auf der 3'-Seite der Gen sequenz, die für das Protein kodiert, mittels der oben beschriebenen Verfahren erhalten werden. Dieser Bereich kann wegen seiner regulatorischen Sequenzen, die die Transkription terminieren, wie der Terminations- und der Polyadenylierungssequenz, beibehalten werden. Somit können durch das Erhalten der 3'-Region, die natürlicherweise direkt an die DNA- Sequenz, die für das Protein kodiert, anschließt, die Terminationssignale für die Transkription bereitgestellt werden. Wenn die Terminationssignale für die Transkription in der für die Expression verwendeten Wirtszelle nicht auf befriedigende Weise funktionieren, dann kann ein 3'-Bereich, der in der Wirtszelle funktionsfähig ist, eingesetzt werden.
Man sagt, daß zwei DNA-Sequenzen (wie eine Sequenz einer Promotorregion und eine Sequenz, die für eine R-PTPase kodiert) passend verknüpft sind, wenn die Art der Verknüpfung der beiden DNA-Sequenzen (I) nicht zur Einführung einer Rasterschubmutation führt, (2) nicht die Fähigkeit der Sequenz der Promotorregion zur Steuerung der Transkription der Sequenz des R-PTPase-Gens stört oder (3) nicht die Fähigkeit der Sequenz des R-PTPase- Gens, durch die Sequenz der Promotorregion transkribiert zu werden, beeinflußt. Eine Promotorregion ist auf passende Weise mit einer DNA-Sequenz verknüpft, wenn der Promotor imstande ist, die Transkription dieser DNA-Sequenz zu bewirken. Somit sind für die Expression des Proteins Transkriptions- und Translationssignale, die von einem geeigneten Wirt erkannt werden, erforderlich.
Ein Promotor ist ein doppelsträngiges DNA- oder RNA-Molekül, das imstande ist, die RNA-Polymerase zu binden und die Transkription eines passend verknüpften Nukleinsäureabschnittes einzuleiten. So wie der Begriff hier verwendet wird ist eine "Promotorsequenz" die Sequenz des Promotors, die auf demjenigen Strang der DNA oder RNA vorkommt, der durch die RNA-Polymerase transkribiert wird. Eine "komplementäre Promotorsequenz" ist ein Nukleinsäuremolekül, dessen Sequenz komplementär zu einer "Promotorsequenz" ist. Somit wird bei der Verlängerung einer Primer-DNA oder -RNA, die an eine "einsträngige komplementäre Promotorsequenz" oder einer "Promotorsequenz" angrenzt, ein doppelsträngiges Molekül erzeugt, das einen funktionellen Promotor aufweist, wenn diese Verlängerung in Richtung der "Promotorsequenz" oder der "komplementären Promotorsequenz" erfolgt. Dieser funktionelle Promotor steuert die Transkription eines Nukleinsäuremoleküls, das passend mit demjenigen Strang des doppelsträngigen Moleküls verknüpft ist, der die "Promotorsequenz" enthält (und nicht mit demjenigen Strang des Moleküls, der die "komplementäre Promotorsequenz" enthält).
Bestimmte RNA-Polymerasen weisen eine hohe Spezifität für derartige Promotoren auf. Die RNA-Polymerasen der Bakteriophagen T7, T3 und SP-6 sind besonders gut charakterisiert und weisen eine hohe Promotorspezifität auf. Die Promotorsequenzen, die spezifisch für jede dieser RNA-Polymerasen sind, weisen auch die Polymerasen an, nur einen Strang der beiden Stränge einer doppelsträngigen DNA-Matrize zu verwenden (d. h. zu transkribieren). Die Aus wahl des Stranges, der transkribiert wird, wird durch die Orientierung der Promotorsequenz bestimmt. Diese Auswahl bestimmt die Richtung der Transkription, da RNA enzymatisch nur durch die Anknüpfung eines Nukleosid-5'-phosphats an ein 3'-Hydroxyende polymerisiert wird.
Man sagt, daß zwei Sequenzen eines Nukleinsäuremoleküls "passend" verknüpft sind, wenn sie auf eine Weise miteinander verknüpft sind, die es entweder beiden Sequenzen ermöglicht, auf das gleiche RNA-Transkript transkribiert zu werden, oder wenn sie es einem RNA-Transkript, das in einer Sequenz begonnen wurde, ermöglicht, in eine zweite Sequenz ausgedehnt zu werden. Somit sind zwei Sequenzen, wie ein Promotorsequenz und eine beliebig andere "zweite" DNA- oder RNA-Sequenz passend miteinander verknüpft, wenn die Transkription, die in der Promotorsequenz beginnt, ein RNA-Transkript der passend angeknüpften zweiten Sequenz erzeugt. Damit die beiden Sequenzen "passend verknüpft" sind, ist es nicht erforderlich, daß sie unmittelbar aneinandergrenzen.
Somit muß, wie oben festgestellt wurde, eine Promotorsequenz, damit sie als ein Promotor funktioniert, als ein doppelsträngiges Molekül vorliegen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die beiden Stränge einer funktionierenden Promotorsequenz als ein "Transkript"-Strang und ein "komplementärer" Strang bezeichnet. Der "Transkript-Strang" ist derjenige Strang des Duplexes, der durch die RNA-Polymerase transkribiert wird (d. h. der als Matrize für die Transkription dient). Der "komplementäre" Strang ist derjenige Strang, der eine Sequenz hat, die komplementär zum "Transkript-Strang" ist, und der vorhanden sein und mit dem "Transkript-Strang" hybridisiert sein muß, damit die Transkription erfolgen kann. Somit führt, wenn der "Transkript-Strang" einer Promotorsequenz auf geeignete Weise mit einer zweiten Sequenz verknüpft ist, die Hybridisierung des "Transkript-Stranges" mit dem "komplementären" Strang in Gegenwart einer Polymerase zur Transkription des "Transkript- Stranges" und zur Erzeugung eines RNA-Transkriptes, wobei die Sequenz des "Transkript- Stranges" als Matrize verwendet wird.
Die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung können entweder prokaryontisch, eukaryontisch oder viral sein. Geeignete Promotoren sind reprimierbar oder, bevorzugter, konstitutiv. Zu Beispielen für geeignete prokaryontische Promotoren gehören Promotoren, die die T4-Polymerase (Malik, S., et al., J. Biol. Chem. 263: 1174-1181 (1984); Rosenberg, A. H., et al., Gene 59: 191-200 (1987); Shinedling, S., et al., J. Molec. Biol. 159 : 471-480 (1987); Hu, M., et al., Gene 42: 21-30 (1986)), die T3-, Sp6- und T7-Polymerasen (Chamberlin, M., et al., Nature 228: 227-231 (1970); Bailey, J. N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2814-2818 (1983); Davanloo, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2035-2039 (1984)) erkennen; die PR- und PL-Promotoren des Bakteriophagen Lambda (The Bacteriophage Lambda, Hershey, A. D., Hrsg., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1973); Lambda II, Hendrix, R. W., Hrsg., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1980); die trp-, recA-, Heat-Shock- und lacZ-Promotoren von E. coli; den α-Amylase-spezifischen Promotor (Ulmanen, I., et al., J. Bacteriol. 162: 176-182 (1985)) und die σ-28-spezifischen Promotoren von B. subtilis (Gilman, M. Z., et al., Gene 32: 11-20 (1984)); die Promotoren der Bakteriophagen von B. subtilis (Gryczan, T. J., in: The Molecular Bioloay of the Bacilli, Academic Press Inc., New York (1982)); Promotoren von Streptomyces (Ward, J. M., et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468-478 (1986)); den int-Promoter des Bakteriophagen Lambda; den bla-Promotor des β- Lactamase-Gens von pBR322 und den CAT-Promotor des Chloramphenicol-Acetyltransferase- Gens von pPR325 etc.. Übersichten über die prokaryontischen Promotoren finden sich bei Glick, B. R. (J. Ind. Microbiol. 1: 277-282 (1987)); Cenatiempo, Y. (Biochimie 68: 505-516 (1986)); Watson, J. D., et al. (in: Molecular Bioloqy of the Gene, 4. Ausgabe, Benjamin Cummins, Menlo Park, Kalifornien (1987)); und bei Gottesman, S. (Ann. Rev. Genet. 18: 415- 442 (1984)). Zu bevorzugten eukaryontischen Promotoren gehören der Promotor des Metallothionein-1-Gens der Maus (Hamer, D., et al., J. Mol. Anpl. Gen. 1: 273-288 (1982)); der TK-Promotor des Herpes-Virus (McKnight, S., Cell 31: 355-365 (1982)); der SV40-Early-Promotor (Benoist, C., et al., Nature (London) 290: 304-310 (1981)); und der Promotor des gal4-Gens der Hefe (Johnston, S. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6971-6975 (1982); Silver, P. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5951-5955 (1984)). Alle der oben aufgeführten Literaturstellen werden hier mit den entsprechenden Quellenangaben aufgenommen.
Es werden starke Promotoren bevorzugt. Beispiele für derartige bevorzugte Promotoren sind diejenigen, die die T3-, SP6- und T7-Polymerasen erkennen, der PL-Promotor des Bakteriophagen Lambda, der recA-Promotor und der Promotor des Metallothionein-I-Gens der Maus. Ein äußerst bevorzugter Promotor für die eukaryontische Expression der R-PTPase ist ein SV40-Promotor wie derjenige, der die Transkription im pLSV-Vektor antreibt (Livneh, E., et al., J. Biol. Chem. 261 : 12490-12497 (1986)). Die Sequenzen derartiger Erkennungsstellen für die Polymerase werden bei Watson, J. D., et al. (in: Molecular Biology of the Gene, 4. Ausgabe, Benjamin/Cummings Publishing Co. Inc., Menlo Park, Kalifornien (1987)) offengelegt.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben worden ist, wird sie durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele leichter verständlich werden, die zum Zwecke der Veranschaulichung gebracht werden, und die die vorliegende Erfindung nicht einschränken sollen, es sei denn, es ist etwas anderes angegeben.

BEISPIEL 1

Isolierung und Analyse von R-PTPase-α-cDNA-Klonen der Maus

1. Screenen einer Bank

Es wurde eine cDNA-Bank aus dem Gehirn von BALB/C-Mäusen im Lambda-Phagen gtll (die von Dr. Y. Citri erhalten wurde) bei verminderter Stringenz gescreent (6 · SSC, 5xDenhardts, 0,1% SDS, 50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 mg/ml DNA aus Lachssperma, Hybridisierungstemperatur 50ºC), wobei als Sonde ein Bglll-Accl-Fragment von 2400 Basenpaaren verwendet wurde, das die intrazelluläre Domäne und die Transmembrandomäne des menschlichen T200-Glykoproteins repräsentierte (Ralph, S. J., et al., EMBO J. 6: 1251-1257 (1987)) und mittels des Random-Priming-Verfahrens mit 32P markiert worden war. Das Waschen erfolgte bei 50ºC in 6 · SSC, 0,1% SDS. Aus 10&sup6;-Klonen wurden 51 positive isoliert, selektiert und durch Restriktionsenzymkartierung charakterisiert. EcoRl-Fragmente von 0,95, 1,6 und 0,3 kb, die aus dem Phagenklon isoliert wurden, der das längste Insert enthielt (Lambda-109), wurden in Bluescript-KS-plus und -minus-Vektoren subkloniert. Es wurde eine Reihe versetzter Deletionen unter Verwendung von Restriktionsstellen, die die klonierten cDNA-Fragmente und die Polylinker-Region des Plasmidvektors gemeinsam hatten, erzeugt. Die verwendeten einzelnen Restriktionsstellen sind in der Fig. 1b gezeigt. Aus diesen Konstrukten wurde einzelsträngige DNA hergestellt, die als Matrize für die Sequenzanalyse mittels des Dideoxynukleotid-Kettenabbruchverfahrens verwendet wurde (Sequenase, United States Biochemical). Alle Bereiche wurde auf beiden Strängen sequenziert. Die relative Reihenfolge und Orientierung der EcoRl-Fragmente im rekombinanten Phagen wurde durch Restriktionskartierung bestimmt. Um sicherzustellen, daß die verschiedenen EcoRl-Fragmente nicht cDNA- Fragmenten entsprachen, die keine Beziehung zueinander hatten und während des Prozesses der Konstruktion der Bank ligiert worden waren, wurde die Restriktionskartierung auch mit einem anderen und unabhängigen Isolat, Lambda-113, durchgeführt.

2. Ergebnisse

Es ist schon länger bekannt, daß Gehirngewebe eine reiche Quelle für viele Typen von Tyrosinkinasen ist, und seit kurzem gibt es biochemische Hinweise, daß auch multiple Formen von PTPase-Aktivität vorkommen (Jones, S. W., et al., J. Biol. Chem. 264: 7747-7753 (1989)). Für die Suche nach einer neuen PTPase vom Rezeptortyp screenten die Erfinder dieser Erfindung bei geringer Stringenz eine cDNA-Bank aus Mäusehirn, wobei als Hybridisierungssonde die intrazelluläre Domäne des menschlichen CD45 verwendet wurde, die zwei tandemartig angeordnete PTPase-Domänen enthält (Tonks, N. K., et al., siehe oben; Charbonneau, H., et al., siehe oben; Ralph, S. J., et al., siehe oben). Positive Klone wurde durch Kreuzhybridisierung und Restriktionskartierung in verschiedene Kategorien eingeteilt, und das längste Phageninsert (Lambda-109), das der am häufigsten vorkommenden Klasse entsprach, wurde für die Subklonierung und weitere Analyse ausgewählt.
Das Ergebnis der Analyse der Nukleotidsequenz ist in der Fig. 1 gezeigt. Die Übersetzung der cDNA-Sequenz zeigt die Existenz eines offenen Leserahmens von 794 Aminosäuren, wobei angenommen wird, daß die Translation bei Nukleotid 259 einsetzt (ein Stopcodon im Leserahmen kommt 60 Nukleotide stromaufwärts vor). Das vermutliche Methionin-Initiationscodon ist in eine relativ übliche Standardumgebung für die Initiation der Translation eingebettet (Kozak, M., Nucl. Ac. Res. 15: 8125-8148 (1987)), und ihm folgt eine charakteristische hydrophobe Abfolge von Aminosäuren, die wahrscheinlich als Signalpeptid fungiert. Gemäß der "-3,-1"-Regel (von Heijne, G., Nucl. Ac. Res. 14: 4683-4690 (1986)) sind die Reste 20 und 25 beide wahrscheinliche Kandidaten für den N-Terminus des reifen Proteins. Eine zweite hydrophobe Abfolge findet sich zwischen den Aminosäuren 143 und 166, und ihr folgt eine Reihe stark geladener Reste, in Übereinstimmung mit den Stopsignalen für den Transfer, die bei vielen durch Membranen reichenden Domänen gefunden wird. Die vorhergesagte intrazelluläre Domäne des Proteins besteht aus zwei sich tandemartig wiederholenden Sequenzen, die hinsichtlich ihrer Sequenz zu 44% identisch sind (Reste 259-486 und 552-776). Jede dieser Wiederholungen weist eine beträchtliche Übereinstimmung der Sequenz mit denjenigen der intrazellulären katalytischen Domänen der früher beschriebenen, sich durch Membranen erstreckenden PTPasen CD45 (Ralph, S. J., et al., siehe oben) und LAR (Streuli, M., et al. (1988), siehe oben) auf (45% bzw. 53% Identität der Aminosäuresequenz). Im Gegensatz dazu enthalten die EMBL- und GENBANK-Datenbanken keine signifikante Homologie mit bekannten Sequenzen der vermuteten extrazellulären Domäne des kodierten Proteins. Zu den Eigenschaften der extrazellulären Domäne gehören ein extrem hoher Gehalt an Serin- und Threoninresten (> 32%), das Fehlen von Cysteinresten und die Anwesenheit von 8 potentiellen N-Glykosylierungsstellen.
Es wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß die isolierte cDNA für ein neues Mitglied der Transmembran-PTPase-Familie kodierte, das einen neuartigen Typ von extrazellulärer Domäne aufweist. Im Hinblick auf ihre rezeptorartige Struktur und die Wahrscheinlichkeit, daß, basierend auf den hier vorgelegten experimentellen Hinweisen, weitere Mitglieder dieser Familie gefunden werden können, wurde der Name muR-PTPase-α (murine receptor protein tyrosine phosphatase-α) zur Bezeichnung dieses Proteins gewählt.

BEISPIEL 11

Chromosomale Lokalisation des R-PTPase-α-Gens der Maus

Rekombinante STS/A-, 020/A-, CXS- und OXA-Inzuchtmäuse (RI-Mäuse) und die CXB- RI-Stämme N, O, P, Q und R wurden von Dr. Jo Hilgers (Niederländisches Krebsinstitut) zur Verfügung gestellt. Alle anderen lnzuchtmäuse wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) gekauft. Rückgekreuzte Tiere wurden an der Universität New York mit lnzuchtvorläufern, die vom Jackson Laboratory erhalten worden waren, verpaart. Der weibliche Elternteil wird bei allen Kreuzungen und F1-Bezeichnungen zuerst genannt. Genomische DNA aus der Milz der AKXD-, AKXL-, BXD-, BXH- und G-, H-, I-SWXL-RI-Stämme sowie der CXB-RI-Stämme D, E, G, H, I, J und K wurde von der "DNA Resource" des Jackson Laboratory gekauft. Für alle anderen Mäuse wurde die genomische DNA durch eine Standardabfolge aus Proteaseverdau, Phenol- und Chloroformextraktion und Ethanolfällung aus grob isolierten Leberzellkernen isoliert. Die genomische DNA der Mäuse wurde einer Southern-Blot-Analyse mit leichten Modifizierungen von Standardvorschriften, genau wie es kürzlich beschrieben wurde (Silver, J., J. Hered. 76: 436-440 (1985)), unterzogen. Ein EcoRl-Fragment von 1,8 kb, das den intrazellulären Phosphatasedomänen der R-PTPase-α entsprach, und ein Sachl-EcoRl-Fragment von 0,7 kb, das ihren intrazellulären und Transmembrandomänen entsprach, wurden in den Bluescript- KS-Vektor kloniert, wodurch die Plasmide p109 bzw. p923 erhalten wurden.
DNA-Restriktionsfragment-Längenvarianten, die mit dem II-1a-Locus (Interleukin-1α) assoziiert sind, wurden durch Southern-Blotting wie kürzlich beschrieben (D'Eustachio, P., et al Immunogenetics 26: 339-343 (1987)) identifiziert. Die Signifikanz der Abweichungen von der 1 : 1-Segregation für Markerpaare wurde nach dem Bayesschen Verfahren von Silver und Buckler (Silver, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 1423-1427 (1986); Blank, R. D., et al., Genetics 120: 1073-1083 (1988)) berechnet. Die Entfernungen in den Karten wurden aus dem Ausmaß der Rekombinationshäufigkeiten im RI-Stamm nach B. A. Taylor (in: Morse, H. C. III, Hrsg., Origins of lnbred Mice, Academic Press, New York, 1978, Seite 423-438) abgeschätzt, und ihre binomischen 95%-Vertrauensgrenzen wurden nach Silver (1985, siehe oben) berechnet. Die Wahrscheinlichkeiten alternativer Reihenfolgen von drei Markern wurden nach D. Bishop (Genet. Epidemiol. 2: 349-361 (1985), Gleichung 1) berechnet. Computerberechnungen wurden mit einem VAX6000-410-Computer durchgeführt.
Southern-Blot-Analysen genomischer DNA von Inzuchtstämmen der Mäuse ergaben zwei nützliche Restriktionslängenvarianten, wobei die eine mit einer Sonde dargestellt wurde, die der intrazellulären Domäne der muR-PTPase-α (p109) entsprach, und eine mit einer Sonde für die extrazelluläre Domäne und die Transmembrandomäne (p923) dargestellt wurde. Zusammen erlaubten diese drei Varianten die Definition von drei allelischen Formen der muR- PTPase-α in den 10 untersuchten Inzuchtstämmen der Mäuse (Tabelle 1). TABELLE 1 Restriktionsfragment-Längenvarianten, nachgewiesen mit muR-PTPase-α-Sonden
Mit TagI-Restriktionsendonuklease verdaute genomische Leber-DNA wurde durch Southern- Blotting analysiert. Es sind die Größen der Fragmente in Kilobasen gezeigt.
Es wurde die Vererbung dieser Allele in RI-Mäusen untersucht. Ein Vergleich der für die muR-PTPase-α beobachteten Verteilungsmuster in den Stämmen (Tabelle 2) mit denjenigen, die zuvor für andere Marker mit bekannter chromosomaler Lokalisation in diesen Mäusen beobachtet worden waren, ergab eine enge Verknüpfung der Loci für die muR-PTPase-α und für II-1a (Interleukin-1) auf Chromosom 2 (3 RI-Stämme unter 89 untersuchten). Dieses Ausmaß an Übereinstimmung würde mit einer Wahrscheinlichkeit von weniger als 0,00001 zufällig auftreten, wenn die Loci nicht verknüpft wären. Der beobachtete Anteil rekombinanter Stämme zeigt einen Kartenabstand von 0,9 cm zwischen den Loci an (Vertrauensgrenzen 0,2-0,6 cm). TABELLE 2 Vererbung von muR-PTPase-α- und II-1 α-DNA- Sequenzvarianten in RI-Mäusestämmen
Die RI-Stämme wurden hinsichtlich der Allele der muR-PTPase-α- und des 11-1a mittels Southern-Blotting von TagI-Restriktionsendonuklease-verdauter DNA typisiert (siehe Tabelle 1 und D'Eustachio, P., et al., Immuno4enetics 26: 339-343 (1987)). Die II-1a-Allele für den AKXD- Stamm, die CXB-Stämme D-K und für BXH-Mäuse wurden bei D'Eustachio, P., et al., siehe oben, offengelegt. Alle RI-Stämme sind hinsichtlich jedes Locus eines Alleis der Vorläufer- Stämme homozygot; das Allel ist mittels eines Großbuchstabens gekennzeichnet, der dem Elternstamm wie folgt entspricht:
A, AKR/J; B, C57BL/6J; C, BALB/c; D, DBA/2J; H, C3H/HeJ; J, SJL/J; C57L/J; S, SWR/J; T; STS/A.
Das Verfolgen der Vererbung der muR-PTPase-α, von II-1a und von a (Nonagouti) unter den Nachkommen der reziproken Rückkreuzung zwischen den C57BLl6 J- und SWR/J-Stämmen bestätigte die Verknüpfung zwischen muR-PTPase-α und II-1a und legte eine Reihenfolge der beiden Gene nahe (Tabelle 3). Von 150 Nachkommen waren 14 rekombinant bezüglich muR-PTPase-α und a, und ein Nachkomme war rekombinant bezüglich muR-PTPase-α und IIla. Wenn die Reihenfolge der Loci "Zentromer-II-1a-muR-PTPase-α-a" wäre, dann würden diese Ergebnisse keine doppelten Crossover erfordern; alternative Reihenfolgen erfordern ein oder 14 derartige(s) Ereignis(se) und sind, berechnet nach dem Verfahren von Bishop (siehe oben), mindestens 9,5 mal weniger wahrscheinlich. Die Entfernung von 0,6 cm (95% -Vertrauensgrenzen 0,1-2,4 cm) zwischen II-1a und muR-PTPase-α stimmt innerhalb des Stichprobenfehlers mit der Entfernung überein, die aus den Daten der RI-Stämme abgeschätzt wurde. Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit Ergebnissen, die kürzlich für Bmp-2a (morphogenes Knochenprotein 2a, Dickinson, M. E., et al., Genomics 6: 505-520 (1990)) erhalten wurden, läßt es wahrscheinlich erscheinen, daß die beiden Gene eng verknüpft sind, obwohl keine offensichtliche Strukturhomologie zwischen ihnen vorliegt. TABELLE 3 Verknüpfung von Markern auf Chromosom 2 in den Nachkommen von Rückkreuzungen A. ALLEL-KOMBINATIONEN DER F&sub1;-ELTERN UND DIE TATSÄCHLICHE ANZAHL DER VON C57BL/6 J-STAMMENDEN (b) UND VON SWR/J-STAMMENDEN (s) GEFUNDENEN ALLELE B. ANZAHL DER NACHKOMMEN JEDER RÜCKKREUZUNG, DIE DIE MÖGLICHEN ALLELKOMBINATIONEN ERBTEN
150 Nachkommen der Rückkreuzung zwischen (C57BL/GJ · SWR/J)F&sub1;-Mäusen (F&sub1;) und C57BL/6 J-Mäusen (B) wurden visuell bezüglich der Vererbung des Nonagouti-Markers (a) und, mittels Southern-Blotting, der Allele der muR-PTPase-α- und II-1a-Loci typisiert.

BEISPIEL III

Expression der R-PTPase-α-RNA von Mäusen

1. Northern-Analyse

Poly-A+-RNA wurde aus den Geweben adulter Mäuse und aus Zellinien mittels Oligo(dT)-Selektion wie beschrieben hergestellt (Vennström, B., et al., Cell 28: 135-143 (1982)), mittels Standardverfahren auf einem formaldehydhaltigen Gel (5 ug pro Spur) fraktioniert und auf Nitrozellulose (Hybond C, Amersham) übertragen. Eine ³²P-markierte Sonde wurde durch Primerverlängerung an einer einzelsträngigen Matrize hergestellt, die aus der gesamten Lambda-109-cDNA bestand, die in die EcoRI-Stelle des Bluescript-Vektors in Antisense-Orientierung kloniert worden war, wobei das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase zur Verlängerung eines gebundenen T7-Primers in Gegenwart von ³²P-ATP verwendet wurde. Die Hybridisierung wurde bei 42ºC in 50% Formamid, 5 · SSC, 25 mM KPO&sub4;, 5xDenhardts, 10 ug/ml DNA aus Lachssperma und 10% Sulfat durchgeführt. Das Waschen erfolgte bei 48ºC in 0,1 · SSC, 0,1% SDS. Waschungen des Filters bei höherer Stringenz (58ºC) hatte keinen bemerkbaren Einfluß auf das Hybridisierungsmuster.

2. Expression des R-PTPase-α-Proteins der Maus

Es wurde das gesamte cDNA-Insert aus dem Phagen Lambda-109 als ein Fragment mittels partiellen EcoRl-Verdaus freigesetzt und in den Bluescript-KS-Vektor kloniert. Ein cDNA-Fragment, dem der größte Teil der nicht translatierten Leadersequenz (beginnend mit der Sachl-Stelle an Position 226; siehe Fig. 1b) fehlte, wurde in den vom SV40-Promotor (Livneh, E., et al., J. Biol. Chem. 261: 12490-12497 (1986) gesteuerten pLSV-Vektor subkloniert, und die resultierende Plasmid-DNA (pLSV-PTP-α) wurde mittels des DEAE-Dextran-Verfahrens (Lopata, M. A., et al., Nucl. Ac. Res. 12: 5707-5717 (1984) irr COS-Zellen transfiziert. Der Expressionsvektor pLSV-C, der für das N-terminal-verkürzte muR-PTPase-α-Protein kodierte, wurde als Kontrolle im Immunpräzipitationsexperiment eingesetzt.

3. Ergebnisse

Es wurde Poly-A&spplus;-RNA aus verschiedenen Mäusegeweben präpariert, um die Expression des muR-PTPase-α-Gens zu untersuchen. Eine Northern-Analyse (Fig. 2) ergab ein breites Muster des Expression. Eine mRNA von 3,0 kb kam in allen untersuchten Geweben vor, außer der Milz, wobei das Gehirn und die Niere die höchsten Expressionsniveaus zeigten. Eine mRNA ähnlicher Größe konnte auch in den NIH-3T3-Mäusefibroblasten, 2.2, und in der prepro- B-ymphoiden Zellinie BAF beobachtet werden (Fig. 2). Eine kürzere Exposition des Northern- Blots zeigte deutlich, daß in verschiedenen Geweben (z. B. dem Gehirn) zusätzlich eine zweite mRNA-Spezies sehr ähnlicher Größe (3,2 kb) in niedrigerer Menge vorkommt. Die Daten lassen es auch wahrscheinlich erscheinen, daß, obwohl ein Poly-A&spplus;-Schwanz und ein Polyadenylierungssignal am 3'-Ende der cDNA-Sequenz nicht beobachtet wurden, der isolierte cDNA-Klon (2872 Nukleotide) weitgehend mit der vollen Länge der mRNA übereinstimmte.

BEISPIEL IV

Transiente Expression des R-PTPase-α-Proteins der Maus

1. Antikörpergewinnung und Immunprazipitation

Kaninchen wurde ein synthetisches Peptid injiziert, das dem vorhergesagten C-Terminus des muR-PTPase-α-Proteins (Reste 777-794) entsprach und unter Verwendung von EDCI (1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodümid) als Kopplungsreagenz an BSA gekoppelt war. Das Antigen wurde in einer Emulsion von 1 mg Peptid und komplettem Freundschen Adjuvans intradermal und subkutan injiziert. Es wurden 3 Booster-Injektionen mit jeweils 0,5 mg Peptid und inkomplettem Freundschem Adjuvans in zwei- bis dreiwöchigen Abständen verabreicht. Ein Antiserum, das mittels dieses Verfahrens erhalten wurde, wurde als "2A" bezeichnet. Die metabolische Markierung mit [³&sup5;S]Methionin, die Herstellung des Zellextraktes (60 Stunden nach der Transfektion) und die indirekte Immunpräzipitation unter Verwendung von Protein-A- Sepharose wurden mittels Standardverfahren durchgeführt (Yarden, Y., et al., EMBO J. 6: 3341-3351 (1987)).

2. Ergebnisse

Zur Bestimmung der Größe des reifen Proteins klonierten wir die muR-PTPase-α-cDNA mit Ausnahme des größten Teils der nicht translatierten Leadersequenz in den pLSV-Vektor (Livneh, E., et al., J. Biol. Chem. 261: 12490-12497 (1986)) unter der Kontrolle des SV40-Promotors, wodurch der Expressionsvektor pLSV-PTP-α erhalten wurde. Der Vektor wurde in COS-Zellen transfiziert, und 60 Stunden später wurden [35S]Methionin-markierte Gesamtzellextrakte für die Immunpräzipitation mit dem Antiserum 2A hergestellt.
Wie aus der Fig. 3 hervorgeht, erkannte das Antiserum verschiedene Banden, von denen eine, eine diffuse Bande bei 130 kDa (Pfeil), nur in Immunpräzipitaten transfizierter Zellen vorkam (Spur 5), aber nicht in denen scheintransfizierter Zellen (Spur 3) (transfiziert mit pLSV ohne die muR-PTPase-α-cDNA). Die Präzipitation konnte kompetitiv durch das Peptid, das zur Immunisierung verwendet worden war, gehemmt werden (Spur 6).
Der Unterschied zwischen dem vorhergesagten (88 kDa) und dem beobachteten (130 kDa) Molekulargewicht für die muR-PTPase-α wird auf ihre extensive Glykosylierung zurückgeführt.
Als weitere Kontrolle für die Spezifität des Antiserums transfizierten wir auch COS-Zellen mit einer N-verkürzten Version der muR-PTPase-α-cDNA (die bei der Aminosäure 214 begann und somit die Transmembrandomäne und die extrazelluläre Domäne nicht besaß) im gleichen Vektor. Es erschien ein neues und in großer Menge vorhandenes Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 55 kDa in Immunpräzipitaten der Zellen, die mit diesem Vektor transfiziert worden waren, wobei die Immunpräzipitation wieder kompetitiv vom antigenen Peptid gehemmt wurde (Spuren 7 und 8). Daß das verkürzte Protein im Vergleich zum reifen muR-PTPase-α-Protein in größerer Menge vorkam, wurde in verschiedenen unabhängigen Transfektionsexperimenten übereinstimmend beobachtet.

Allgemeine Diskussion der Beispiele I-IV

Die oben dargestellten Beispiele beschreiben die Identifizierung einer neuartigen PTPase vom Rezeptortyp, der R-PTPase-α, die ein breites Expressionsmuster aufweist. Es wird deshalb erwartet, daß die R-PTPasen weitreichende Funktionen über die Regulation der Aktivität lymphoider Zellen hinaus, die man bis jetzt, basierend auf Untersuchungen zum CD45, kannte, besitzen.
Untersuchungen unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die gegen die extrazelluläre Domäne des CD45-Proteins gerichtet waren, zeigten, daß eine Quervernetzung von R- PTPasen ausgeprägte Effekte auf verschiedene zelluläre Aktivitäten haben kann, obwohl ein direkter Effekt auf die enzymatische PTPase-Aktivität noch nicht gezeigt wurde. Da jedoch eine ligandeninduzierte Aggregation von Rezeptoren ein zentrales Ereignis bei der Signalübertragung durch Membranen über Rezeptor-Tyrosinkinasen ist (Ullrich, A., et al., siehe oben), wird von den Erfindern postuliert, daß vermutlich existierende extrazelluläre Liganden der R- PTPasen die Fähigkeit haben, die Aktivität von R-PTPasen in vivo zu regulieren.
Es wird postuliert, daß die R-PTPasen auf eine Weise, die derjenigen analog ist, die für die Rezeptor-Tyrosinkinasen (PTKs) vorgeschlagen wurde, über verschiedene Genfusionsereignisse zwischen einer Stamm-PTPase-Domäne und Domänen, die zur Bindung extrazellulärer Liganden fähig sind, entstanden sind (Ullrich, A., et al., Hanks, S. K, et al., siehe oben). Es wird erwartet, daß die Vielfalt der extrazellulären Domänen, die möglicherweise unter Bildung rezeptorartiger Proteine mit den PTPase-Domänen verbunden sind, den Bereich der möglichen Liganden reflektiert, die fähig sind, über einen ähnlichen Mechanismus zu wirken. Die Verfügbarkeit klonierter R-PTPasen, wie derjenigen, die hier offengelegt wurden, wird für die Bestimmung ihrer Substratspezifität und für das Verstehen ihrer Funktion sowie für das Manipulieren ihrer Aktivität wertvoll sein.
R-PTPasen könnten eine breite Spezifität aufweisen, die auf wichtige Tyrosinkinasesubstrate gerichtet ist, wobei ihre verschiedenen extrazellulären Domänen in erster Linie eine unterschiedliche Regulation von Mechanismen erlauben, die auf verschiedene Signale in der extrazellulären Umgebung antworten. Basierend auf dieser Ansicht wird von ihnen erwartet, daß sie die Ansprechbarkeit einer Zelle auf diejenigen Polypeptid-Wachstumsfaktoren modulieren, die über Protein-Tyrosin-Kinasen vom Rezeptortyp wirken. Wie bei den PTKs würde die Ligandenbindung zu einer Aktivierung der Enzymaktivität führen. In diesem Licht betrachtet wären die R-PTPase-α und ähnliche Moleküle negative Wachstumsregulatoren, und sie können als potentielle rezessive Onkogene angesehen werden.
Zum Beispiel scheint die Deletion eines Teils des Chromosoms 2 der Maus, auf dem sich die R-PTPase-α befindet, ein frühes Ereignis in der Entwicklung der strahleninduzierten myeloischen Leukämie bei SJL/J-Mäusen zu sein (Trakhtenbrot, L, et al., Leukemia 2: 545-550 (1988)), in Übereinstimmung mit einer Rolle als rezessives Onkogen. Weiterhin sind Rearrangements, die das menschliche Chromosom 20 betreffen (αuf dem sich das menschliche R-PTPase-α-Gen befindet), mit der lymphoiden Leukämie des Menschen in Verbindung gebracht worden (Mitelman, F., Hrsg., Catalog of Chromosome Aberrations in Human Cancer, A. Liss, New York).
Alternativ kann die R-PTPase-α auf eine Weise wirken, die derjenigen analog ist, die für die Wechselwirkung zwischen CD45 und c-Ick vorgeschlagen wurde (Oostergard, H. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 8959-8963 (1989); Mustelln, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6302-6306 (1989)). Danach dephosphoryliert die R-PTPase-α negative regulatorische Stellen in membranassoziierten PTKs, die keine Rezeptoren sind, und die breiter exprimiert sind als die Ick (wie z. B. die Tyr&sup5;²&sup7;-Stelle im pp60c-src). Würde sie auf diese Weise wirken, wäre die R-PTPase-α an der ositiven Wachstumskontrolle und der Differenzierung beteiligt.
Obwohl die Erfinder nicht beabsichtigen, sich auf irgendeine bestimmte Theorie festzulegen, weist die ausgeprägte Konservierung der katalytischen Domänen der verschiedenen Rezeptor-PTPasen zwischen den Spezies auf eine wichtige Rolle für diese Rezeptoren bei der Kontrolle des Zellwachstums hin.

BEISPIEL V

Isolierung und Charakterisierung der R-PTPase-cDNA des Menschen (Kaplan, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7000-7004 (1990))

A. Materialien

Restriktionsendonukleasen und modifizierende Enzyme wurden von Boehringer-Mannheim oder New England Biolabs bezogen. Taq-DNA-Polymerase war von Perkin-Elmer/Cetus. Die in den Polymerase-Kettenreaktionen verwendeten vorwärts und rückwärts gerichteten Lambda-gt11-Primer (24-mers) sowie alle für die Sequenzierung verwendeten Primer wurden unter Verwendung von entweder Methoxy- oder β-Cyanoethylphosphoramiditen (House, C., et al., J. Biol. Chem. 262: 772-777 (1987)) mittels eines automatischen DNA-Synthesegeräts (Applied Biosystems, Modell 380A) synthetisiert. Die Lambda-gt11-cDNA-Bank aus menschlichem Hirnstamm wurde von der American Type Culture Collection (Nr. 37432) bezogen. Der LCA- (CD 45) Klon, der als Sonde für das Screenen der Bank verwendet wurde, wurde von E. H. Fisher (University of Washington, Seattle) erhalten. Alle Sequenzierungsreaktionen wurden mittels des Sequenase-Kits (United States Biochemical) durchgeführt.

B. Methoden

Es wurden ungefähr 300000 Plaques aus einer Lambda-gt11-cDNA-Bank aus dem Hirnstamm eines 1 Tage alten Kindes unter Bedingungen verminderter Stringenz mit einer nicktranslatierten LCA-Sonde, die beide konservierten Phosphatasedomänen umfaßte, auf Nitrozellulosefiltern in Duplikaten gescreent (Charbonneau, H., et al. (1989), siehe oben). Die Hybridisierung wurde bei 55ºC über Nacht in einer Lösung aus 5 · SSPE (SSPE besteht aus 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,4, 0,18 M NaCl, 1 mM EDTA), die 0,25% enifettete Trockenmilch, 0,1% SDS und 10&sup6; cpm/ml einer ³²P-markierten LCA-Sonde enthielt, durchgeführt. Die Filter wurden dreimal 20 Minuten lang bei 55ºC in 2 · SSPE, 0,2% SDS gewaschen und dann einer Autoradiographie unterzogen. Dieser Screen ergab 79 doppelt Positive; 12 davon, die in unterschiedlichem Ausmaß mit der LCA-Sonde hybridisierten, wurden durch erneutes Screenen mit der gleichen Sonde als Plaques gereinigt. Dann wurde die Polymerase- Kettenreaktion (Saiki, R. K., et al., Science 230: 1350-1354 (1985)) eingesetzt, um die Größe der cDNA-Inserts zu bestimmen. Die DNA-Matrizen bestanden aus Teilen der Eluate eines jeden reinen Plaques, die 15 Minuten lang auf 75ºC erhitzt worden waren, um die DNA freizusetzen. Die Matrizen wurden mit den vorwärts und rückwärts gerichteten Lambda-gt11-Primern geprimed. Die Reaktionsmischungen (0,1 ml) wurden wie beschrieben hergestellt (Dionne, C. A., et al., Biotechniques 8: 190-194 (1990)). Die Amplifizierung wurde durch 30 Zyklen erreicht, von denen jeder aus einer Denaturierung bei 94ºC für 1,5 Minuten, einem Annealing bei 65º für 2 Minuten und einer Verlängerung bei 72ºC für 4 Minuten in einem automatischen Perkin-Elmer-Thermocycler bestand. Ein Teil jeder Probe (15 ul) wurde durch Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel, das 1 ug/ml Ethidiumbromid enthielt, analysiert (Sambrook et al., siehe oben). Aus den vier größten Klonen wurde unter Verwendung von LambdaSorb (Promega) DNA präpariert und dann mit EcoRI verdaut. Die Fragmente wurden für die Sequenzierung getrennt in die EcoRI-Stelle des M13mp18 subkloniert. Die Nukleotidsequenzen wurden mittels der Dideoxynukleotid-Kettenabbruchtechnik (Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977)) unter Verwendung modifizierter T7-Polymerase (Tabor, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4767-4771 (1987)) bestimmt.
Alle Computeranalysen der Sequenzdaten wurden mittels eines Micro-VAX-II-Computers unter Verwendung von Programmen von IntelliGenetics durchgeführt. Die DNA-Sequenzen würden mittels des GEL-Programmes analysiert und zusammengefügt. Die Hydrophobieanalysen von Proteinen basierten auf dem in das PEP-Programm implementierten Algorithmus von Kyte und Doolittle (Kyte, J., et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)). Die gegenseitige Ausrichtung von Proteinsequenzen wurde mittels des GENALIGN-Programmes (Sobel, E., et al., Nucleic Acids Res. 14: 363-374 (1985); Karlin, S., et al., Mol. Biol. Evol. 1: 357-370 (1984); Needleman, S. B., et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)) durchgeführt. Die Ausrichtungen erfolgten zunächst unter Verwendung des Protein-Alphabetes von Jimenez-Montano (Jimenez- Montano, M., et al., Proc. 7th Int'l. Biophysics Congress, 1981, Mexico City).

C. Ergebnisse

Mit dem Ziel, neue Mitglieder der PTPase-Familie zu identifizieren, wurden 300000 Plaques einer cDNA-Bank aus dem Hirnstamm eines menschlichen Kindes im Lambda-gt11 unter nicht stringenten Bedingungen mittels einer nicktranslatierten LCA-Sonde gescreent, die beide konservierten Phosphatasedomänen umfaßte. Vier der ursprünglichen 79 doppelt positiven Klone wurden vollständig sequenziert. Zwei Klone, 31-4 und 27-1, enthielten überlappende Teile der gesamten kodierenden Region einer menschlichen R-PTPase (huR-PTPase), die als α bezeichnet wurde (Fig. 4B). Die kombinierten Längen der Klone 31-4 und 27-1 ergaben 3615 bp (Fig. 4A), womit sie ein Protein von 802 Aminosäuren kodierten (Fig. 4C) und weitere 695 bp bzw. 510 bp eines 5'- bzw. 3'-nicht translatierten Bereiches enthielten. Zwei der vier Klone enthielten Abschnitte von Genen, die für zwei weitere R-PTPasen, die als β und gamma bezeichnet wurden, kodieren (Fig. 5). Wie die R-PTPase-α enthalten diese beiden Proteine typische hydrophobe Transmembranbereiche und eigene extrazelluläre Domänen, was anzeigt, daß sie auch andere R-PTPasen darstellen.
Das Maushomologe dieses Gens wurde gleichzeitig mit dem R-PTPase-α-Gen des Menschen kloniert und sequenziert (siehe Beispiele I-IV oben). Ein Vergleich der Proteinsequenzen der Maus und des Menschen ist in der Fig. 4C gezeigt. Mit Ausnahme der extrazellulären Domäne, bei der eine gewisse Variabilität besteht, wurden nur fünf Reste gefunden, die sich zwischen den beiden Proteinen unterscheiden. Eine Untersuchung der Struktur der menschlichen R-PTPase-α zeigt die folgenden Charakteristika: eine relativ kurze extrazelluläre Domäne, die aus 150 Resten besteht und ein hydrophobes Signalpeptid enthält, das das einzige Cystein in diesem Bereich aufweist. Es gibt acht potentielle N-Glykosylierungsstellen sowie eine Anzahl potentieller O-Glykosylierungsstellen (da diese Domäne reich an Serin und Threonin ist). Die extrazellulären Domänen der R-PTPase-α, der LCA und der LAR sind offenbar nicht strukturverwandt. Es gibt eine hydrophobe Transmembranregion, die auf beiden Seiten mit geladenen Resten verankert ist. Dieser folgen die beiden tandemartig wiederholten, konservierten Phosphatasedomänen von jeweils ungefähr 235 Resten, die von 57 Aminosäuren getrennt sind, was typisch für R-PTPasen, wie LCA und LAR. und die beiden Drosophila- PTPasen DLAR und DPTP ist.
Die Fig. 5A und B zeigen die Übereinstimmungen der Aminosäuren in der ersten bzw. der zweiten konservierten Phosphatasedomäne zwischen der LCA und den R-PTPasen α, β und gamma. Es ist offensichtlich, daß von den vier R-PTPasen die β-Form und die gamma-Form die größte Ähnlichkeit hinsichtlich ihrer Sequenz aufweisen. Es wurde berichtet (Hunter, T., et al., siehe oben), daß in den Sequenzen der konservierten Phosphatasedomänen der PTPasen 1 B, LCA, LAR, DLAR und DPTP 29 nicht variierende Reste vorkommen. Zwar kommen viele dieser Reste auch in den beiden Phosphatasedomänen der R-PTPase-α, - β und -gamma vor, aber interessanterweise weisen die zweiten konservierten Phosphatasedomänen sowohl der β- als auch der gamma-Form mehrere dieser Aminosäuren, einschließlich der beiden Cysteine in den Positionen 104 und 201 in der Phosphatasedomäne 2 der LCA, nicht auf (siehe Fig. 5B).

D. Diskussion

Die Sequenzen der konservierten Phosphatasedomänen der drei hier identifizierten R- PTPasen des Menschen (α, β und gamma) wurden miteinander sowie mit den Sequenzen der LCA, der LAR und von zwei löslichen PTPasen, der plazentaren Phosphatase 1B und der T- Zell-PTPase, verglichen (Tabelle 4). Die zwei löslichen Enzyme weisen eine Sequenzübereinstimmung von 70% auf; wenn sie jedoch mit den R-PTPasen (Phosphatasedomänen PD1 oder PD2) verglichen werden, dann sinkt dieser Wert auf 29-42%. In allen Fällen wiesen die löslichen PTPasen einen größere Übereinstimmung mit PD1 als mit PD2 der R-PTPasen auf. Die R-PTPase-α ist offenbar am stärksten mit der LAR verwandt, da ihre PD1-Sequenzen zu 56% und ihre PD2-Sequenzen zu 52% übereinstimmen. Die konservierten Domänen der R- PTPasen β und gamma sind untereinander am stärksten verwandt, sogar noch mehr, als es die beiden löslichen PTPasen β und gamma sind, deren PD1- und PD2-Regionen zu 75% übereinstimmen. Es ist interessant, daß im allgemeinen die Sequenzbeziehung zwischen PD1 und PD2 innerhalb einer beliebigen R-PTPase offenbar nicht enger ist als die zwischen verschiedenen Mitgliedern einer Familie, d. h. die Übereinstimmungen zwischen PD1 und PD2 reichen von einem hohen Wert von 47% bei der LAR zu einem niedrigen Wert von 29% bei der R- PTPase gamma.
Während die zytoplasmatischen Domänen der R-PTPase-α, -β und -gamma hoch konserviert sind, sind die extrazellulären Domänen dieser Rezeptoren nicht verwandt untereinander und auch nicht mit denen der LAR und der LCR. Das legt nahe, daß jeder dieser Rezeptoren seinen eigenen spezifischen Liganden hat. Es ist wahrscheinlich, daß die Bindung derartiger Liganden an die R-PTPasen im Verein mit Wachstumsfaktor-Rezeptoren, die PTKase- Aktivität aufweisen, eine essentielle Rolle bei der Regulation des Ausmaßes der Tyrosinphosphorylierung von Zielproteinen spielt, die in die Signalübertragung involviert sind. Die Verschiedenheit der R-PTPasen, die hier beschrieben werden, läßt die Existenz einer Multigenfamilie erkennen. Ein besseres Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehungen zwischen diesen Membranrezeptoren wird zu bedeutenden Einblicken in die Mechanismen führen, die in Zellwachstum, Differenzierung und Onkogenese involviert sind. TABELLE 4 Übereinstimmungen zwischen konservierten Phosphatasedomänen (Prozent)
Die gegenseitige Ausrichtung der konservierten Phosphatasedomänen wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die verglichenen Bereiche sind in den Fig. 4C und 5 angegeben. PD = Phosphatasedomäne

BEISPIEL Vl

Untersuchung der Expression der R-PTPase-α des Menschen durch Northern-Blot-Analyse

Proben, die entweder 20 ug Gesamt-RNA oder 2 ug Poly-A+-RNA enthielten, wurden in einem Formaldehyd/Agarose-Gel aufgetrennt und auf Nitrozellulose übertragen. Sonden für die R-PTPase-α und β-Actin wurden durch Random-Priming markiert (Sambrook et al., siehe oben). Hybridisierungen und Waschschritte wurden bei 65ºC wie beschrieben durchgeführt (Church, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995 (1984)). Die mit der R-PTPase-α- Sonde hybridisierten Blots wurden mit einem XAR-2-x-Röntgenfilm (Kodak) und einer Verstärkerfolie 72 Stunden bei -80ºC exponiert. Die Ergebnisse der Blots mit der Actinsonde wurden nach 15 Stunden bei den gleichen Bedingungen erhalten.
Es wurde die Expression der R-PTPase-α in verschiedenen Zellinien und Geweben untersucht (Fig. 6). Die Ergebnisse zeigen, daß vor allem zwei RNA-Transkripts von ungefähr 4,3 bzw. 6,3 kb vorliegen. Die größere der beiden Spezies kommt offenbar in fötalen Geweben in größerer Menge vor, und sie liegt in besonderer Menge in der Poly-A&spplus;-Probe fötaler Leber vor, in der auch die höchste relative Menge des Transkripts von 4,3 kb vorkommt. Es ist möglich, daß die unterschiedliche Expression der beiden Transkripte vom Entwicklungsstadium abhängt und/oder ein Ergebnis eines alternativen Splicing-Mechanismus ist, was auch bei der LCA gesehen wurde (Ralph, S. J., siehe oben). Das Gehirn des Erwachsenen hat eine relativ niedrige Expression der R-PTPase-α. Die Ergebnisse legen es nahe, daß die R-PTPase-α in einem gewissen Umfang in vielen Geweben exprimiert wird. Es wurde auch gezeigt, daß die R- PTPase-α der Maus in vielen Geweben exprimiert wird, und am stärksten in Gehirn und Niere (Sap, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6112-6116 (1990); siehe auch die Beispiele III und IV oben).

BEISPIEL VII

Chromosomale Lokalisation des R-PTPase-α-Gens des Menschen

Die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung der parentalen und somatischen Zellhybride, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden beschrieben (Durst, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1070-1074 (1987); Ku, D.-H., et al., Somatic Cell Mol. Genet. 15: 297- 307 (1989); Juan, C.-C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8910-8913 (1988)). Die Anwesenheit spezifischer menschlicher Chromosomen oder von Bereichen von Chromosomen wurde mittels DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden für Gene, die auf spezifischen Chromosomenbereichen lokalisiert sind, sichergestellt. Die Hybrid-DNAs wurden mit einem Überschuß der Restriktionsendonukleasen HindIII oder EcoRI verdaut, durch Elektrophorese in 0,8%igen Agarosegelen nach ihrer Größe aufgetrennt, auf Nylonfilter übertragen und wie beschrieben hybridisiert (Durst, et al., siehe oben). Die R-PTPase-α-Sonde bestand aus den äußersten 3'-ständigen 0,8 Kilobasen (kb) des Klons 31-4 (siehe Fig. 4B).
DNA aus 17 Zellhybriden aus somatischen Zellen des Menschen und von Nagetieren, die überlappende Subsets von Chromosomenbereichen des Menschen enthielt, die das gesamte menschliche Genom repräsentierten, wurde durch Northern-Blot-Analyse auf die Anwesenheit des menschlichen Locus der R-PTPase-α untersucht. Die Ergebnisse (Fig. 7) zeigen, daß die Anwesenheit des menschlichen R-PTPase-α-Locus in den Zellhybriden nur mit der Anwesenheit eines Teils des menschlichen Chromosoms 20 korreliert. Die Daten erlauben auch eine genauere Lokalisierung des R-PTPase-α-Locus, da bei den Hybriden PB5-1 und AB3 jeweils ein Teil des langen Arms des Chromosoms 20 fehlt, sie aber trotzdem den R-PTPase-α-Locus enthalten. Die Lokalisation des menschlichen R-PTPase-α-Gens ist somit 20pter-20q12.
Es wurde beobachtet (Lalley, P. A., et al., Cytogenet. Cell Genet. 51: 503-532 (1989j), daß die Maushomologen aller menschlichen Gene, die dem menschlichen Chromosom 20 zugeordnet wurden, auf dem Chromosom 2 der Maus vorkommen. Das ist offenbar auch bei der R-PTPase-α der Fall (siehe Beispiel 11 oben). Der lange Arm des Chromosoms 20 spielt eine Rolle bei der Translokation und bei Deletionen in myeloischen Erkrankungen und Neoplasien (Trent, J. M., et al., Cytogenet. Cel) Genet. 51: 533-562 (1989)). Der menschliche R- PTPase-α-Locus kann spezifisch in die Deletion bei 20q involviert sein; in diesem Falle würde es die Möglichkeit unterstützen, daß er ein Tumorsuppressorgen oder ein Anti-Onkogen ist. Ganz ähnlich scheint bei Mäusen des SJL/J-Stammes eine Deletion des Chromosoms 2 in die Entwicklung der strahleninduzierten myeloischen Leukämie involviert zu sein (Trakhtenbrot, L., et al., Leukemia 2: 545-550 (1988)).
Die oben zitierten Literaturstellen werden mit den entsprechenden Quellenangaben aufgenommen, ganz gleich, ob sie spezifisch aufgenommen werden oder nicht.
Nachdem diese Erfindung nun vollständig beschrieben worden ist, wird es einem Fachmann auf diesem Gebiete klar sein, daß sie innerhalb eines breiten Bereiches von äquivalenten Parametern, Konzentrationen und Bedingungen durchgeführt werden kann, ohne daß von der Idee und dem Bereich der Erfindung abgewichen wird, und ohne daß ein übermäßiges Experimentieren erforderlich ist.
Auch wenn diese Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen ihrer Ausführungsformen beschrieben worden ist, wird es klar sein, daß weitere Modifikationen eingeführt werden können. Diese Anmeldung soll alle beliebigen Variationen, Anwendungen oder Adaptationen der Erfindungen abdecken, die ganz allgemein auf den Prinzipien der Erfindung beruhen, und die solche Abweichungen von der vorliegenden Offenlegung mit einschließen, die in den Rahmen der bekannten oder üblichen Praxis auf dem Gebiet, auf das sich die Erfindung bezieht, fallen, und die auf die wesentlichen Züge, die im vorhergehenden dargelegt wurden, angewandt werden können, wie aus dem Umfang der beigefügten Ansprüche hervorgeht.

Claims

1. Ein isoliertes humanes Protein-Tyrosin-Phosphatase-α- Protein oder -Glykoprotein vom Rezeptor-Typ, wie es in Zeile 1 von Fig. 4 gezeigt ist.

2. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein humanes Protein-Tyrosin-Phosphatase-α-Protein oder -Glykoprotein vom Rezeptor-Typ kodiert, wie es in Zeile 1 von Fig. 1 gezeigt ist.

3. Ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, das ein cDNA- Molekül ist.

4. Ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, das ein Genom-DNA- Molekül ist.

5. Ein Nukleinsäuremolekül, das für das Protein nach Anspruch 2 kodiert.

6. Rekombinanter Vektor, der das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2 oder 5 enthält.

7. Expressionsvektor, der das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2 oder Anspruch 5, das operativ mit einem Element verknüpft ist, das die Expression des Nukleinsäuremoleküls in einer Wirtszelle kontrolliert, enthält.

8. Eine gentechnisch veränderte Wirtszelle, die das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2 oder 5 enthält.

9. Gentechnisch veränderte Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 6 oder 7 enthält.

10. Gentechnologisch veränderte Wirtszelle nach Anspruch 6 oder 7, die eukaryotisch ist.

11. Gentechnisch veränderte Wirtszelle nach Anspruch 6 oder 7, die prokaryotisch ist.

12. Verfahren zur Herstellung eines humanen Protein-Tyrosin- Phosphatase-α-Proteins oder -Glykoproteins vom Rezeptor-Typ nach Anspruch 1, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Kultivieren eines Wirts, der in der Lage ist, das genannte Protein, Glykoprotein unter Kultivierungsbedingungen zu exprimieren,

(b) Exprimieren des genannten Proteins oder Glykoproteins; und

(c) Gewinnen des genannten Proteins oder Glykoproteins aus der genannten Kultur.

13. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 2 oder eines Mutantenallels davon in einem Lebewesen, das umfaßt:

(a) Inkontaktbringen einer Zelle aus dem geannten Lebewesen oder eines Extrakts daraus mit einer Nukleinsäuresonde, die für wenigstens einen Teil einer normalen humanen Protein-Tyrosin-Phosphatase-α vom Rezeptor-Typ oder des genannten Mutantenallels davon kodiert, unter Hybridisierungsbedingungen; und

(b) Messen der Hybridisierung der genannten Sonde an die Nukleinsäure der genannten Zelle,

wodurch die Anwesenheit des genannten Nukleinsäuremoleküls nachgewiesen wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, das zusätzlich vor Stufe (a) umfaßt:

(c) die selektive Vervielfältigung der DNA-Menge der genannten Zelle, die für die genannte Protein-Tyrosinphosphatase vom Rezeptor-Typ kodiert.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung, die mit einer anormalen Protein- Tyrosin-Phosphatase-α vom Rezeptor-Typ verbunden ist, wobei die genannte Zusammensetzung einen pharmazeutisch zulässigen Träger und eine therapeutisch wirksame Menge des Proteins oder Glykoproteins oder Polypeptids nach Anspruch 1 enthält.

16. Verfahren zur Isolierung aus einer chemischen oder biologischen Präparation einer Verbindung, die in der Lage ist, die Protein-Tyrosin-Phosphatase-α vom Rezeptor-Typ zu binden, das umfaßt:

(a) Inberührungbringen der Mischung mit dem Protein oder Glykoprotein oder Polypeptid nach Anspruch 1, das an eine Festphasenmatrix gebunden ist, unter solchen Bedingungen und für eine solche Zeit, die ausreichen, daß es zu einer Bindung kommt;

(b) Entfernen nicht gebundener Komponenten; und

(c) Eluieren der gesamten Verbindung, die an das Protein oder Glykoprotein oder Polypeptid gebunden ist, von der Festphase und Sammeln der eluierten Verbindung.

17. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die in der Lage ist, die enzymatische Aktivität von Protein-Tyrosin- Phosphatase-α vom Rezeptor-Typ zu stimulieren oder inhibieren, das umfaßt:

(a) Inkubieren der genannten Verbindung mit dem Protein oder Glykprotein oder Polypeptid nach Anspruch 1 in reiner Form, in einer Membranpräparation oder in einer ganzen Zelle;

(b) Messen der Enzymaktivität des Proteins oder Glykoproteins oder Polypeptids; und

(c) Vergleichen der Enzymaktivität mit der des Proteins oder Glykoproteins oder Polypeptids, mit dem die genannte Verbindung inkubiert wurde, um dadurch festzustellen, ob die genannte Verbindung die enzymatische Aktivität der Protein-Tyrosin-Phosphatase-α vom Rezeptor-Typ stimuliert oder inhibiert.