JPH05508777A - 新規なレセプター型ホスホチロシンホスファターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なレセプター型ホスホチロシンホスファターゼ［技術分野］ 生化学、細胞および分子生物学の分野における本発明は、Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓ ｅ−α、βおよびγ（ガンマ）と呼ばれる新規なレセプター型タンパク質、チロ シンホスファターゼタンパク質または糖タンパク質、そのＤＮＡコード、該タン パク質の製造法および同定法、並びにＰ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅ酵素活性と結合するこ とができ、またこれを阻害または促進することのできる物質をスクリーニングす る方法に関する。

［背景技術］ 幾つかの成長因子レセプターおよびチロシン特異的プロティンキナーゼとしての レトロウィルスがん遺伝子の同定によって、チロシン残基上におけるタンパク質 のリン酸化が細胞の成長コントロールに重要な役割を果たしていることが示唆さ れた。この考え方は最近になって、シグナルトランスダクション（例えばホスホ リパーゼＣなど）に重要な役割を果たすと考えられるチロシンリン酸化のレベル が成長因子刺激に際してその活性増加と相関し、したがってチロシンリン酸化の 機能的役割を確立することとなった観察によって支持を得た（Ｕｌｌｒｉｃｈ、 　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　６１：２０３−２１２、１９９０）。

細胞タンパク質のチロシン残基のリン酸化の程度およびパターンは、プロティン −チロシンキナーゼ（ＰＴＫａｓｅ　：ＡＴＰ　ニブロチイン−チロシンＯ−ホ スホトランスフェラーゼ、ＥＣ２，７、１．１１２）およびプロティン−チロシ ン−ホスファターゼ（ＰＴＰａｇｅ　；プロティン−チロシン−ホスフェートリ ン酸加水分解酵素、ＥＣ３，１，３，４８）の相反する活性によって調節されて いる。ＰＴＫａｓｅの構造の特徴と進化、並びに細胞成長の調ａ１．．　Ａｎｎ ｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５４：８９７−９３０．１９８５；　Ｕｌ ｌｒｉｃｈ、　Ａ、ｅｔａｌ、、前出）。

チロシンキナーゼはセリン／トレオニン特異的プロティンキナーゼと共通の起源 をもつが、これとは大きく異なる別の酵素のファミリーからなる（ｌ（ａｎｋｓ 、　Ｓ、に、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：４２−５２゜１９８ ８）。チロシンキナーゼの活性における変化へと導くメカニズムについは、トラ ンスメンプラントポロジーを有するレセプター型チロシンキナーゼで最もよく理 解されている（ＵＩ　Ｉｒ１ｃｈ、　Ａ。

ｅｔ　ａｉ、、前出）。このようなキナーゼでは、これらの酵素の細胞外ドメイ ンへの特異的リガンドの結合がそのオリゴマー化を誘導してチロシンキナーゼ活 性の増加とシグナルトランスダクション経路の活性化へと導くと考えられる（Ｕ ｌｌｒｉｃｈ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、前出）。突然変異または過剰発現による キナーゼ活性の調節異常が癌性形質転換のメカニズムであるという知見によって この活性の重要性が支持されている（Ｈｕｎｔｅｒ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、前 出；　Ｕｌｌｒｉｅｈ、　Ａ。

ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．前出）。

プロティンホスファターゼは少なくとも２つの異なる区別されるファミリーから なり（Ｈｕｎｔｅｒ、　Ｔ、　Ｃｅ１ｌ　５８：１０１３−１０１６．１９８９ ）、これはプロティンセリン／トレオニンホスファターゼおよびプロティンチロ シンホスファターゼである。これはセリン／トレオニン特異的酵素とチロシン特 異的酵素との間に明らかな配列類似性を示すプロティンキナーゼとは対照的であ る。

Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅ分子には２種類あるように思われる。第１のグループは、保 存性ホスファターゼ触媒ドメインを１つ含む小さな可溶性酵素からなり、（１） 胎盤ＰＴＰａｓｅ　Ｉ　Ｂ　（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ、　Ｈ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８６：５２ ５２−５２５６（１９８９）；Ｃｈｅｒｎｏｆｆ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８７：２７３５−２７ ８９．１９９０）、（２）Ｔ細胞ＰＴＰａｇｅ　（Ｃｏｏｌ、　Ｄ、Ｅ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：５２５７−５２６１．１９８９）　、お よび（３）ラット脳ＰＴＰａｇｅ　（Ｇｕａｎ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：１５０１−１５０ ３．１９９０）を含む。

第２のグループは、高分子量で、５６−５７アミノ酸によって隔てられた２つの 一列に並ぶ反復保存ドメインを含む、Ｒ−ＰＴＰａｇｅと呼ばれる、より複雑で レセプターに結合したＰ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅからなる。Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅの 一例としては、白血球共通抗原（ＬＣＡ）　（Ｒａｌｐｈ、　Ｓ、Ｊ、、　ＥＭ ＢＯＪ、、　６：１２５１−１２５７．１９８７；　Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ、 　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ　８５ニア１８２−７１８６．１９８８）が挙げられる。ＣＤ４５、Ｔ２Ｏ０ およびｌ、　ｙ　−５（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｍ、Ｌ、、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、、　７：３３９−３６９．１９８９にまとめられている）としても 知られるＬＣＡは、タンパク質のアミノ酸末端を必要とする別のスプライシング によって共通の遺伝子から得られる造血細胞（後期赤芽球を除く）中においての み発現する一群の膜着タンパク質からなる。ＣＤ４５の正確な機能はまだ分かつ ていないが、細胞毒性１９７３球およびナチュラルキラー細胞の活性、ＩＬ−２ レセプター発現、Ｂ細胞の分化、およびＴリンパ球の増殖を含む多数の過程にお ける上記抗原の関与を多くの研究が示唆している（Ｐｉｎｇｅｌ、　Ｊ、Ｔ、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　５８：１０５５−１０６５゜１９８９）。

Ｒ−ＰＴＰａｇｅのその他の例としては、ＬＣＡ関連タンパク質、ＬＡＲ（Ｓｔ ｒｅｕｌｉ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　！！ｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６８ ：１５２３−１５３０゜１９８８）およびＬＡＲ関連ショウジヨウバエタンパク 質ＤＬＡＲおよびＤＰＴＰ　（Ｓｔｒｅｕｌｉ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ　８６：８６９８−８７０ ２．１９８９）がある。Ｊｉｒｉｋらは、ヒト肝芽腫細胞系ＨｅｐＧ２由来のｅ ＤＮＡライブラリーを、ＬＣＡの２つのＰ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅ　ドメインをコード するプローブでスクリーニングして（ＦＡＳＥＢ　Ｊ、　４：Ａ２０８２．１９ ９０．要旨２２５３）　、Ｈｅ−ＦＴＰと名付けた新規なＲ−ＰＴＰａｓｅをコ ードするｃＤＮＡクローンを発見した。Ｈｅ−ＦＴＰ遺伝子は多くのヒトおよび マウス細胞系および組織で発現すると思われた。

我々はＰ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅの構造と多様性についてより多くの理解をし始めたの であるが、その細胞での機能についてはまだ分からないことが多い。小さい可溶 性Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅは“ハウスキーピング機能をもつことが示唆された（Ｔｏ ｎｋｅ、　Ｎ、に、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７＋８６９ ５−８７０１．１９８９）　、一方、Ｒ−ＰＴＰａｇｅは細胞膜に位置しており 、細胞外リガンドによって制御される可能性があるので、その活性はより制限さ れると予測される。Ｔ細胞におけるＬＣＡ（ＣＤ４５）の役割に関しては、ＬＣ Ａの発現が不十分なＴ細胞クローンは、特異的抗原またはＣＤ３の架橋によって 刺激しても増殖できないことが見いだされた（Ｐｉｎｇｅｌ、　Ｊ、Ｔ、　ｅｔ 　ａｌ、、前出）　ｏ　Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅ架橋は、ヒトＴ細胞におけるＴ細胞 レセプターＣＤ３媒介性の活性化を阻害する（Ｋｉｅｎｅｒ、　Ｐ、Ａ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｔ、　１４３：２３−２８．１９８９）　。Ｌ ＣＡのＰ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ活性はリンパ球特異的ＰＴＰａｓｅであるｐｐ５６１ ′にの活性化で役割を演じる（Ｍｕｓｔｅｌｔｎ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：６３０２−６３ ０６゜１９８９；　Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ、　Ｈ，Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ８６：８９５９−８９６３ ．１９８９）。これらの著者は、ＬＣＡのホスファターゼ活性がＣ末端チロシン 残基の脱リン酸化によってｐｐ５５１ｃλを活性化し、これが次いでＴ細胞活性 化に関係するかも知れないとの仮説を出した。

ＬＣＡ中の４つの保存システィン（ホスファターゼドメイン１つ当たりに２個） のうちのどれが人工基質の酵素活性に必要であるかを決定するために、部位特異 的突然変異誘発を用いて、５ｔｒｅｕ　ｌ　ｉら（１９８９、前出）はＬＣＡの うちの１つのシスティン残基（ＬＣＡホスファターゼドメイン−１の残基１７７ ）だけが活性のために必須であることを発見し、第１のホスファターゼドメイン だけが酵素活性を有するらしい、と示唆した。しかしながら、第２のドメインが 異なる基質を脱リン酸化するという可能性を排除できない。もっと最近になって 、５ｔｒｅｕｌｉら（ＥＭＢＯＪ、　９：２３９９−２４０７．１９９０）は、 ＬＣＡ　（およびＬＡＲ）の第２の保存ドメインは検出しつるホスファターゼ活 性を欠くが、ドメイン中の配列が基質特異性に影響を及ぼすことができると結論 した。

ホスホチロシンの代謝をよりよく理解し、コントロールするためには、キナーゼ 活性の役割だけでな（、ホスファターゼ酵素の作用も理解しなければならない。

細胞性ホスホチロシンの上昇はチロシンキナーゼ自体の活性化を必要と（７ない メカニズムによって起きるのかも知れない。例えば、チロシンキナーゼ自体によ らないｖ−ａｒｋがん遺伝子の発現が、今までによく知られていないメカニズム によって千ロジン残基のリン酸化を誘導する（Ｍａｙｅｒ、　１３．Ｊ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３３２：２７２−２７５．１９８８）　６特に細胞 性チロシン−リン酸の通常は高い代謝回転速度という観点からすると、おそらく 、このような結果は基質の突然変異によるか、あるいは細胞性ホスファターゼ活 性の一般的減少によるかのいずれかによるものである（Ｓｅｆｔｏｎ、　Ｂ、Ｍ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　２０：８０７−８１６．１９８０）。

チロシンホスファターゼ阻害剤が細胞を”逆形質転換（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ　 ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）″することができることを示すことによって、後者の可能 性が示唆された（Ｋｌａｒｌｕｎｄ、　Ｊ、Ｋ。

Ｃｅ１ｌ　４１ニア０７−７１７．１９８５）　、したがって、Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａ ｓｅは劣性がん遺伝子となりうるとみなすことができる。

チロシンの脱リン酸化自体が重要な調節メカニズムとして機能しうることが徐々 に明らかになっている。Ｃ末端チロシン残基の脱リン酸化がチロシンキナーゼの ｓｒｃファミリーにおけるチロシンキナーゼ活性を刺激する（Ｉ（ｕｎｔｅｒ、 　Ｔ、、　Ｃｅ１ｌ　４９：ｌ−１，１９８７）。チロシン脱リン酸化はＭＰＦ 　（成熟促進因子：ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ ）キナーゼの有糸***活性化に必須の段階であることが指摘されてきた（Ｍｏｒ ｌａ、　Ａ、０．　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅ１ｌ　５８：１９３−２０３．１９８ ９）　、最後に、原始的な真核生物の突然変異分析によって、細胞生理学におけ るセリンホスファターゼの決定的役割が確立された（Ｃｙｅｒｔ、　Ｍ、Ｓ、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１５７：８９１−８９３．１９８９）。これらの観察は 、チロシンホスファターゼ活性を制御するメカニズムについてより理解を深める 必要性を指摘１５ている。

細胞成長、分化および発癌のメカニズムについての重要な理解を得るためには、 これら膜レセプターの構造と機能との関係をさらに分析することが当該分野で必 要であることは明らかである。

（本頁以下余白） 発明の要約 本発明者らは、可能性のある抗腫瘍遺伝子としての、さらにはトランスメンブラ ンシグナリングの新たに発見された機構でのエフェクターとしての、細胞制御機 構におけるＲ−ＰＴＰａｓｅの役割について考えた。かくして、彼らは、このよ うなプロセスに関与すると思われるＲ−ＰＴＰａｓｅの検索に着手し、本明細書 ではトランスメンプラントボロジーを有するＲ−ＰＴＰａｓｅファミリーの広範 に発現された新規メンバーの同定について開示する。重要なことには、その細胞 外ドメインは以前に記載された他のどのＲ−ＰＴＰａｇｅにも無関係である。新 規Ｒ−ＰＴＰａｓｅは、レセプターチロシンキナーゼに類似した方法で、種々の 異なる細胞外リガンドによる直接調節を受けやすい。

従って、本発明は、白血球共通抗原（ＬＣＡまたはＣＤ４５）および白血球共通 抗原−関連タンパク質（ＬＡＲ）以外のヒトレセプター型タンパク質のチロシン ホスファターゼ（Ｒ−ＰＴＰａｓｅ）タンパク質または糖タンパク質分子、ヒト Ｒ−ＰＴＰａｓｅの機能的誘導体または他の哺乳動物種におけるヒトＲ−ＰＴＰ ａｓｅの同等物を提供する。当該分子が天然由来のものである場合、この分子は 自然界でそれと結合している他のタンパク質や糖タンパク質を実質的に含まない 。この自然界に存在する分子は一般に哺乳動物の肝臓、腎臓および脳に存在して いる二これとは別に、Ｒ−ＰＴＰａｓｅ分子は天然由来のものでなくてもよく、 例えば化学的または組換え手法により製造されたものであり得る。

本発明の実質的に純粋なＲ−ＰＴＰａｓｅタンパク質または糖タンパク質は天然 由来の糖タンパク質の生化学的精製により調製することができ、またＲ−ＰＴＰ ａｓｅは原核または真核細胞宿主での組換え手法により生産することもできる。

とりわけ、本発明は、図４のアミノ酸配列を有する分子Ｒ−ＰＴＰａｓｅ、また はその機能的誘導体に関するものである。他の態様では、本発明はヒトＲ−ＰＴ Ｐａｓｅ−βに向けられる。さらに他の態様では、本発明はヒトＲ−ＰＴＰａｓ ｅ−ガンマに向けられる。

本発明はさらに、マウスまたはヒト由来のＲ−ＰＴＰａｓｅ−α、またはヒト由 来のＲ−ＰＴＰａｓｅ−βもしくはＲ−ＰＴＰａｓｅ−ガンマ、あるいはその機 能的誘導体をコードするヌクレオチド配列から本質的に成る、ｃＤＮＡまたはゲ ノムＤＮＡの形のＤＮＡ分子に関するものである。本発明はまた、発現ベヒクル （運搬体）の形のＤＮＡ配列、およびこのＤＮＡにより形質転換された原核また は真核細胞宿主に向けられる。

本発明には、さらに、本発明のＲ−ＰＴＰａｓｅタンパク質または糖タンパク質 、もしくはその機能的誘導体を生産する方法が含まれ、この方法は： （ａ）培養条件下で該タンパク質を発現し得る宿主を培養し：（ｂ）該タンパク 質を発現させ；そして（Ｃ）培養物から該タンパク質を回収する：ことから成っ ている。

本発明は、Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−αタンパク質または糖タンパク質に対して特異的 な、ポリクローナル、モノクローナル、またはキメラの抗体にも向けられる。

また、本発明は、被検者における正常または変異Ｒ−ＰＴＰａｓｅをコードする 核酸の存在を検出する方法に関し、この方法は： （ａ）被検者由来の細胞またはその抽出物を、正常または変異Ｒ−ＰＴＰ　ａ　 ｓ　ｅの少なくとも一部をコードするオリゴヌクレオチドプローブと、ハイブリ ダイゼーション条件下で接触させ：そして （ｂ）該細胞の核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを測定し、これによ り該核酸の存在を検出する：ことから成っている。このＤＮＡは、アッセイに先 立って、ポリメラーゼ・チェイン・リアクションを使って選択的に増幅させるこ とができる。

本発明はさらに、細胞または被検者におけるＲ−ＰＴＰａｓｅの存在を検出し、 その量を測定する方法に関し、この方法は：（ａ）該細胞またはその抽出物を、 Ｒ−ＰＴＰａｓｅのエピトープに対して特異的な抗体と接触させ；そして（ｂ） 該細胞またはその抽出物への該抗体の結合を検出するか、または結合した抗体の 量を測定し、これによりＲ−ＰＴＰａｓｅの存在を検出し、その量を測定する； ことから成っている。

本発明はまた、化学的または生物学的調製物からＲ−ＰＴＰａｓｅに結合し得る 化合物を同定・単離する方法に関し、この方法は： （ａ）　Ｒ−ＰＴＰａ　ｓ　ｅまたはそのリガンド結合部分を固相マトリックス に付着させ； （ｂ）化学的または生物学的調製物を該固相マトリックスと接触させて該化合物 を結合させ、そして未結合物質を洗い流し； （Ｃ）該固相に結合した化合物の存在を検出し：そして、単離するために、 （ｄ）結合した化合物を溶離し、これにより該化合物を単離する； ことから成っている。

最後に、本発明は、Ｒ−ＰＴＰａｓｅの酵素活性を刺激または阻害し得る化合物 を同定する方法を含み、この方法は：（ａ）純粋な形の、メンプラン調製物中の 、または生存もしくは固定した全細胞中のＲ−ＰＴＰａｓｅと該化合物とを接触 させ； （ｂ）工程（ａ）からの混合物を十分な時間インキュベートし；（ｃ）　Ｒ−Ｐ ＴＰ　ａ　ｓ　ｅの酵素活性を測定し；（ｄ）その酵素活性を、該化合物の不在 下でインキュベートしたＲ−ＰＴＰａｓｅのそれと比較し、これにより該化合物 が酵素活性を刺激するのかまたは阻害するのかを判定する；ことから成っている 。

図面の簡単な説明 図１は、マウスＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの推定−次構造を提示する。パネル（ａ） は、ファージラムダ−１０９ｃＤＮＡ挿入物の配列および推定Ｒ−ＰＴＰａｓｅ −αタンパク質配列（標準−文字アミノ酸表記を使用）を示す。開始コドンＡＴ Ｃはイタ１ルック体で示してあり、停止コドンは星印で示しである。推定トラン スメンブランドメイン（アミノ酸１４３−１６６）には下線が引いてあり、細胞 外ドメイン中の可能性のあるＮ−結合グリコシル化部位にも下線が引いである。

タンデムに反復されたＰＴＰａｇｅドメイン（ＩおよびＩＩ）間の相同の境界は 四角のかっこで示しである。全ての既知Ｒ−ＰＴＰａｓｅの触媒ドメインに保存 されたシスティン残基にも下線が引いである。パネル（ｂ）は、Ｒ−ＰＴＰａｓ ｅ−αコード配列を含むラムダー１０９　ｃＤＮＡクローンの概略的構造を示す 。Ｒ−ＰＴＰａｓｅドメインＩおよび１１は黒のボックスとして示してあり、ト ランスメンブランドメインには陰影が付けである。図３に示したＮ−末端切断型 のＰＴＰ−Ｄｅｌｔａｃタンパク質の開始を矢印（アミノ酸２Ｉ４）で示す。

配列決定のためにｎｅｓｔｅｄｄｅｌｅｔｉｏｎを生成に使用された制限部位の 位置も示しである。略号：ＴＭ、トランスメンブランドメイン；Ｂ、Ｂａｍ旧部 位；　Ｂ　ｓ、　ＢｓｔＥＩＮ部位；　Ｎ、　Ｎｃｏ１部位；Ｎｄ。

Ｎｄｅ［部位；　Ｐ、　Ｐｓｔ１部位；　Ｒ，ＥｃｏＲ１部位；　Ｓ、　５ａｃ １１部位；Ｓｉｔ　５ｔｕ１部位。

図２は、マウスＲ−ＰＴＰａｓｅ−ａ　ｍＲＮＡの発現を示すノーザンプロット の図である。マウス組織・細胞系由来の５μｇのポリＡ”　ＲＮＡをホルムアル デヒド含有アガロースゲルで分画化し、プローブとして全Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−α 　ｃＤＮＡを使ってノーザン分析にかけた。２８Ｓおよび１８ＳリポソームＲＮ Ａの位置を示す。

レーン：１．腎臓；２．肺；３．心臓；４．胃：５．脳：６．膵臓；７．肝臓、 ８．ＮｒＨ−３Ｔ３線維芽細胞系ＣＨａｎｅｇｇｅｒ。

Ａ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）　Ｃｅ１ｌ　５１．１９９−２０９）　； 　９．　ＢＡＦブレプローＢリンパ様細胞系（Ｐａｌａｃｉｏｓ、　Ｒ，ｅｔ　 ａｔ、　（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４１．７２７−７３４）。

図３は、マウスＲ−ＰＴＰａｓｅ−αタンパク質の免疫沈降のＰＡＧＥの結果を 示す図である。ＤＥＡＥ−デキストラン法を使って、ＣＯ８細胞を、陰性対照プ ラスミド（挿入物を含まない発現ベクターｐＬＳＶ）　、ｐＬＳＶ−ＦＴＰ−ａ 　（Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−α　ｃＤＮＡを含む同一の発現ベクター）、またはトラ ンスメンプランおよび細胞外ドメインが除かれた（部位特異的突然変異誘発によ りこの位置にイニシエーターメチオニン残基を導入した）末端切断型のＲ−ＰＴ Ｐａ　ｓ　ｅ−αタンパク質（ＦＴＰ−Ｄｅｌｔａｃ、アミノ酸２１４−７９４ ）を発現するようにデザインされた発現ベクターｐＬＳＶＤｅ　１　ｔ　ａＣで 一時的にトランスフェクトした。［”　Ｓ　］−メチオニンで代謝物を標識した 後、免疫前血清（レーンｌおよび２）またはＲ−ＰＴＰａｓｅ−αタンパク質の Ｃ末端に対応する合成ペプチドに対して誘導された、１００μｇの免疫用ペプチ ドの不在または存在下での抗血清（２Ａ）（レーン３−８）を用いて免疫沈降を 行った。分子量マーカーの大きさはｋＤａで示しである。矢印は１３０　ｋＤの Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−αタンパク質の位置を示す（レーン５）。

レーンは次の通りである：　１　：　ｐｔ、ｓｖ、免疫前血清；２：ｐＬＳＶ− ＰＴＰ−α、免疫前血清、　３　：　ｐｉ、ｓｖ、抗血清２Ａ。

４：Ｉ）ＬＳＶ、合成ペプチドの存在下での抗血清２Ａ；５：ｐＬＳＶ−ＰＴＰ −ａ、抗血清２Ａ　；　６　：　ｐＬＳＶ−ＰＴＰ−ａ、合成ペプチドの存在下 での抗血清２Ａ　：　７　：　ｐＬＳＶＤｅ　ｌ　ｔ　ａＣ。

抗血清２Ａ　；　８　：　１）ＬＳＶＤｅ　ｌ　ｔ　ａＣ，合成ペプチドの存在 下での抗血清２Ａ０ 図４は、ｃＤＮＡクローンの配列から推定されたヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの構 造を示す。

（Ａ）ヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの全コード領域を含む、重複するクローン３１ 〜４および２７−１の混成制限地図［３６１５塩基対（ｂｐ）　〕。

（Ｂ）クローン３１−４および２７−１の相対位置。一連のオリゴヌクレオチド プライマーを使って、各クローンの両鏡とも全体の配列を決定した。クローン３ １−４の斜線領域はノーザンプロット用（下記の図６）および染色体指定用のプ ローブとして使用したフラグメントに相当する。

（Ｃ）ヒト（レーン１）およびマウス（レーン２）Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−αのアミ ノ酸配列の比較。−文字アミノ酸表記を使用する。

差異だけを示しである。ダッシュ（−）で示した線はマウス配列に存在しないア ミノ酸の広がりを示す。ヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−αのコード部分、およびクロー ン３１−４および２７−１　（Ｂ）に対するその位置を上に示す。次の領域が示 しである：シグナルペプチド（Ｉ）、下線を施したヒトタンパク質の可能なＮ− グリコジル化部位を含む細胞外ドメイン（ＩＩ）、トランスメンブラン（ＩＩＩ ）、ジャクスタメンプラン（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ）　ＣａＶ）、第１ホ スフアターゼドメイン（Ｖ）、インタードメインｍ）、第２ホスフアターゼドメ イン（ｖＩＩ）、Ｃ末端（ＶＩ　Ｉ　＋）。

図５は、ヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ　ＬＣＡ、α、βおよびガンマの第１　（Ａ）お よび第２（Ｂ）保存ホスファターゼのアミノ酸配列の比較を示す。ＣＯＮはコン センサス配列であり、大文字は完全な一致を示すが、小文字は４つの配列のうち ２つまたは３つの一致を示す。ダッシュはコンセンサスの欠如を示す。

図６は、Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−αプローブ（上）とβ−アクチンプローブ（下）を 用いたノーザンブロットハイプリダイゼーションにより測定した、種々の組織お よび細胞系でのヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの相対的発現を示すゲルパターンの図 である。表示したヒト細胞系または組織からの全ＲＮＡ　（左側の５つのレーン ）またはポリ（Ａ）”　ＲＮＡ　（右側の５つのレーン）試料を分析した。Ａ４ ３１はヒト類表皮腫細胞系であり、ＨＥＬは赤白血病細胞系であり、他の全ての レーンはフラッシュ凍結組織試料（ＨＵＶＥＣ−ヒトＩＮＦ静脈内皮細胞）を表 す。

図７は、１７の鰯歯目−ヒト体細胞ハイブリッドのパネルの分析に基づいたヒト Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−αの染色体局在化を示すマトリックス図である。完全点刻ボ ックスは、そのハイブリッドが上の列に示した染色体を含むことを示し、右下の 点刻は染色体の長腕（または長腕の一部、より小さい点刻域で示される）の存在 を示し、左上の点刻は染色体の短腕（または短腕の一部）の存在を示し、オーブ ンボックスは染色体の不在を示す。染色体２０の縦列は、この染色体（または染 色体領域）の存在とＲ−ＰＴＰａｓｅ−α遺伝子の存在との相関性を強調するよ うにはっきりと描かれ、点刻されている。ハイブリッドにおけるヒトＲ−ＰＴＰ ａｓｅ−α配列の保持パターンを右側（ＲＰＴＰα）に示しである。該遺伝子の 存在は点刻ボックス中に“＋”で示され、該遺伝子の不在はオープンボックス中 に“−”で示される。

（本頁以下余白） 好ましい実施態様についての記載 組換えＤＮＡ技術を用いることにより、本発明者らは新規哺乳動物レセプター型 （トランスメンブラン）タンパク質チロシン・ホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ　 ；　ＥＣ３，１，３，４８）を同定している。

マウスＲ−ＰＴＰａｓｅ−αは７９４アミノ酸を有しているが、ヒトＲ−Ｐ　Ｔ 　Ｐ　ａｓｅ−αは８０２アミノ酸を有している。そのレセプター様構造と、あ るファミリーの一員である可能性を考慮して、本発明者らはこのタンパク質をＲ −Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ−α（レセプター・タンパク質・チロシン・ホスファター ゼ・アルファ）と命名した。このファミリーをここでは“Ｒ−ＰＴＰａｇｅ”と 命名する。

Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ−αは他のチロシン・ホスファターゼの触媒ドメインに 相同な細胞内ドメインを有している。さらに本発明者らは１４２アミノ酸細胞外 ドメイン（シグナル・ペプチドを含む）をセリンとトレオニン含有量が高＜（３ ２％）、そして８ケ所のＮ−グリコシル化部位を有するものとして、特徴決定し た。本発明者らは、新規タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンを生成し、そ のタンパク質を真核生物宿主で発現させた。種々の細胞や組織中でのタンパク質 の自然な発現を同定するために、ノーザン分析を用いた。さらに本発明者らはＲ −Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ−αの合成ペプチドで免疫化することによりそのタンパク 質に対するポリクローナル抗体を生成し、この抗体はＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの一 部をコードするｃＤＮＡクローンでトランスフェクトした細胞中の１３０ｋＤａ タンパク質を同定する。

注目すべきことに、酵素活性を有する細胞内ドメインにより構成されているのに 加えて、Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅが属するレセプター・ファミリーはＮ末端細胞 外ドメインを有するトランスメンブラン・タンパク質を含んでいる：これはチロ シン・キナーゼ酵素ファミリーに類似している（Ｔａｎｋｓ、　Ｎ、に、ら、　 （１９８８）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７．８６９５−８７０１；　Ｃｈａ ｒｂｏｎｎｅａｕ、　Ｈ，ら、（１９８８）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５．　７１８２−７１８６；　５ｔｒｅｕｌｉ、　Ｍ、ら、 （１９８８）　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ。

１６８．１５２３−２５３０；　５ｔｒｅｕｌｉ、　Ｍ、ら、（１９８９）　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＬＩＳＡ、　８６．８６９８−８７０２）。従って、本発明者らは細胞外環境に おけるリガンドがＰＴＰａｓｅのこの膜結合サブクラスの活性を制御すると結論 した。

本発明のＲ−ＰＴＰａｓｅ−ａと他のＲ−ＰＴＰａｓｅは、Ｒ−ＰＴＰａｓｅ活 性を活性化するかまたは阻害することができ、それにより細胞の代謝の主要経路 に影響を与える、薬剤や他の作用物質をスクリーニングする方法に有用である。

固相マトリックスに完全なままのＲ−ＰＴＰａｓｅまたはそのリガンド結合部分 を付着させることにより、結合活性に基づいてレセプターと相互作用する能力に 関して、生物学的産物または化学薬品をスクリーニングするために用いられるア フィニティー・プローブを作製する。続いて、結合物質を精製された形でアフィ ニティー・プローブから溶出する。

固相にタンパク質やペプチドをカップリングする方法、これらの方法に有用な固 相物質、溶出媒体は当業者によく知られている。

酵素活性を有するＲ−ＰＴＰａｇｅタンパク質またはその誘導体は、ホスファタ ーゼ活性を高めるかまたは阻害することができる化合物の検査に使用することが できる。ホスファターゼ活性を変化させる被検化合物の能力は、被検化合物を精 製Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅタンパク質またはその酵素的に活性な誘導体に加え、 当業者によく知られている標準酵素的方法を用いて酵素活性に及ぼす影響を測定 する、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ系で検査される。

または、化合物のＲ−ＰＴＰａｇｅ活性に及ぼす作用を生きた細胞または固定化 細胞を用いて完全細胞調製物中で、または生きた細胞または固定化細胞から得ら れた膜画分中で測定する。この方法はタンパク質の細胞外レセプタ一部分を介し て作用する化合物およびタンパク質の酵素部分に直接作用する化合物をスクリー ニングするのに有用である。トランスフェクトしたＣＯ８細胞またはＮＩＨ−３ ７３細胞のように本発明のＲ−ＰＴＰａｇｅを多量に発現する、細胞またはそれ らから得られた膜間製物と被検化合物をインキュベートする。続いて、当分野で よく知られている方法を用いて、細胞のホスホチロシンの量を測定する（Ｈｏｎ ｅｇｇｅｒ、　Ａ。

屹ら、Ｃｅ１１５１＋１９９−２０９　（１９８７）；　Ｍａｒｇｏｌｉｓ、Ｂ 、ら、Ｃｅ１ｌ　５７：１１０１−１１０７　（１９８９））。結果を、被検化 合物の非存在下で得られた結果、またはＲ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅの既知の活性化 物質の非存在下または存在下で得られた結果と比較する。このような研究におい て、チロシン・キナーゼの活性化物質の存在下での被検化合物の作用もまた測定 する。

Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅ活性を刺激する化合物はホスホチロシン量の実質的低下 をもたらし、一方Ｒ−ＰＴＰａｇｅ活性を阻害する化合物はホスホチロシン量の 実質的増加をもたらす。

例えば上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）や血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のレセプ ターのように、チロシン・キナーゼである成長因子レセプターの場合、チロシン リン酸化は細胞増殖および癌形成性形質転換と関連している。脱リン酸化へ導＜ ＰＴＰａｇｅの活性化は、増殖を妨げるまたは阻害する逆の調節メカニズムとし て働き、癌に対する内在性調整メカニズムとして働くかもしれない。

従って、このレセプター／酵素系の変異または調節異常により、癌にかかりやす くなるかもしれない。

インシュリン・レセプターもまたチロシン・キナーゼであり、インシュリン・レ セプターを担持する細胞でのチロシンのリン酸化は正常な生理学的機能と関連す るであろう。細胞増殖および癌の場合と対照的に、Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅの活 性化はインシュリン作用を中和するであろう。正常以下のＲ−ＰＴＰａｓｅレベ ルまたは酵素活性は、正常な逆の調節メカニズムを除去するように作用するであ ろう。しかしながら、さらに重要なことは恐らく、Ｒ−ＰＴＰ　ａｇｅの活性過 剰または不適切な活性が細胞に対するインシュリンの作用を阻害または完全に妨 げることが予想され、（インシュリン耐性型の）糖尿病を生じるであろう。従っ て糖尿病への罹病　′性はＲ−ＰＴＰａｓｅの調節異常と関連している。

従って、正常または変異Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅ遺伝子を同定する、または細胞 または組織と関連したＲ−ＰＴＰａｇｅの量または活性を測定する、本発明の方 法は、細胞のホスホチロシン代謝の変化と関連した癌、糖尿病または他の疾患に 対する罹病性を同定する方法としての役割を果す。

本発明は被験者の正常または変異Ｒ−ＰＴＰａｓｅの存在およびレベルを評価す る方法を提供する。個人のＲ−ＰＴＰａｇｅの非存在または、さらに一般的には 低い発現性または、変異Ｒ−ＰＴＰａｓｅの存在は癌形成性形質転換や癌の発生 に対する罹病性の重要な予告としての役割を果す。または、恐らく負の調節に反 応しない変異レセプター／酵素系によるか、または体内の刺激性リガンド過多に よるＲ−ＰＴＰａｇｅの過剰発現は糖尿病に対する罹病性の重要な予告としての 役割を果す。

Ｒ−ＰＴＰａｇｅの種々の部分をコードするオリゴヌクレオチド・プローブ（下 記参照）を用いて、Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配 列の存在について被験者の細胞を検査する。

好ましいプローブは、本発明のＲ−ＰＴＰａｓｅ−αまたは他のＲ−Ｐ　Ｔ　Ｐ 　ａｇｅタンパク質の少なくとも４アミノ酸残基、好ましくは少なくとも５アミ ノ酸残基をコードする核酸配列に関するものであろう。そのようなプローブを用 いて、定性的または定量的アッセイを行う。例えば、ノーザン分析（下記実施例 ■と■参照）を用いて、細胞または組織調製物中のＲ−ＰＴＰａｓｅ　ｍＲＮＡ の発現を測定する。

このような方法は、選択的増幅法の採用により、個人から得られたＤＮＡが極め て少ない場合にも使用できる。精製核酸フラグメントを増幅できる、組換えＤＮ Ａ方法は長い間認められている。

通常、その方法は核酸フラグメントのＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの導入、ベ クターのクローン増幅、そして増幅核酸フラグメントの回収を必要とする。その ような方法の例は、Ｃｏｈｅｎら、（米国特許第４．２３７．２２４号）　、Ｓ ａｍｂｒｏｏｋら、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｆｎｇ：　ＡＬａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８９）により提供され 、これらの文献は参照によりここに引用されるものとする。

最近、そのような所望の核酸分子の濃度を増加することができるｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ酵素法が記載されている。この方法は“ポリメラーゼ・チェイン・リアクショ ン”すなわち“ＰＣＲ”と呼ばれる（Ｍｕｌｌｉｓ、Ｋら、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、５１：２６３−２７３ （１９８６）；　Ｅｒ１ｉｃｈ、Ｈら、ＢＰ　５０，４２４．　ＢＰ　８４，７ ９６．　ＢＰ　２５８，０１７．　ＥＰ２３７．３６２；　Ｍｕｌｌｉｓ、Ｋ、 、ＢＰ　２０１，１８４；　Ｍｕｌｌｉｓ、Ｋ、ら、ＵＳ　４，６８３．２０２ ；　Ｅｒ１ｉｃｈ、Ｈ，、ＩＪＳ　４，５８２，７８８；　ａｎｄ　５ａｉｋｉ 、Ｒら、ＵＳ　４，８８３，１９４）。

ポリメラーゼ・チェイン・リアクションは、特定の核酸配列が前もって精製され ておらず、特定の試料中に、はんのｌコピしか存在しない場合でさえ、その配列 の濃度を選択的に増加する方法を提供する。この方法を用いて一本鎖ＤＮＡでも または二本鎖ＤＮＡでも増幅できる。この方法の基本は、所望の核酸分子の鋳型 依存性、ポリメラーゼ媒介複製のプライマーとして働く２本のオリゴヌクレオチ ド・プローブの使用を必要とする。

ＰＣＲ法の２本のオリゴヌクレオチド・プローブの正確性はこの方法の成功を左 右する。よく知られているように、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は方向性を有し、こ の方向性はその分子のホスフェート基の５°−３′結合により与えられる。ＤＮ ＡまたはＲＮＡの配列は第１配列の末端５′ホスフエート基と第２配列の末端３ ゛ヒドロキシル基との間のホスホジエステル結合の形成により連結されている。

５°ヌクレオチド・トリホスフェートを核酸分子の３′　ヒドロキシル末端に付 加することにより、核酸分子のポリメラーゼ依存性増幅が進行する。従って、ポ リメラーゼの作用により核酸分子の３′末端が伸長する。ＰＣＨのオリゴヌクレ オチド・プローブの選択では、これらの固有の性質を利用する。ＰＣＲ法のプロ ーブのオリゴヌクレオチド・プローブは、増幅を特徴とする特定の核酸配列のフ ランキング配列と同じか、または相補となる配列を含むように選択される。

さらに詳細には、′第一”プローブのオリゴヌクレオチド配列は、それが所望の 配列の３′側に位置するオリゴヌクレオチド配列にハイブリッド形成できるよう に選択し、一方、“第二”プローブのオリゴヌクレオチド配列は、それが所望の 領域の５゛側に存在する配列と同じオリゴヌクレオチド配列を含むように選択す る。両プローブは３′　ヒドロキシ基を保有し、従って核酸合成のプライマーと して働く。

ＰＣＲにおいて、反応条件はハイブリッド形成と核酸重合に導く反応条件と二本 鎖分子の変性を生じる反応条件の繰り返しである。反応の第一段階において、存 在し得る、あらゆる二本鎖分子を変性させるために試料の核酸を一時的に熱し、 続いて冷ます。

続いて、“第一”および“第二”のプローブを所望の核酸分子の濃度よりはるか に高い濃度で試料に加える。試料をハイブリッド形成と重合へ導く条件下でイン キュベートする場合、“第一”のプローブは増幅される配列の３°側の位置で試 料の核酸分子にハイブリッド形成する。試料の核酸分子が最初二本鎖だとしたら 、“第二”のプローブは増幅が必要な配列の相補鎖である配列の３“側の位置で 核酸分子の相補鎖とハイブリッド形成する。ポリメラーゼの添加後、“第一”お よび（核酸分子が二本鎖の場合）“第二”のプローブの３“末端が伸長される。

“第一“のプローブの伸長は、所望の核酸の正確な配列を有するオリゴヌクレオ チドの合成を生じる。′第二”のプローブの伸長は、所望の核酸の相補鎖の正確 な配列を有するヌクレオチドの合成を生じる。

ＰＣＲ反応は特定の核酸配列の指数的増幅を可能にする。なぜなら“第一”のプ ローブの伸長産物は“第二”のプローブの配列に相補となる配列を当然含み、従 って“第二”のプローブの伸長産物の生成のための鋳型としての役割を果す。同 様に、“第二”のプローブの伸長産物は“第一”のプローブの配列に相補となる 配列を当然含み、従って“第一”のプローブの伸長産物の生成のための鋳型とし ての役割を果す。従って、重合と変性を繰り返すことにより所望の核酸分子の濃 度の幾何級数的増加が達成される。

ＰＣＲの概説はＭｕｌｌｉｓ、　Ｋ、Ｂ、　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｔｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ。

一実施態様において、本発明は自然界に存在する哺乳動物のＲ−ＰＴＰａｓｅ− αに関する。別の実施態様において、本発明は組換え哺乳動物Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　 ａｓｅ−αに関する。本発明の好ましいＲ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅはヒト起源であ る。本発明は、その分子が自然界で結合している他のタンパク質を実質的に含ま ない自然界に存在する分子を提供する。′他のタンパク質または糖タンパク質を 実質的に含まない”とは、そのタンパク質が自然界で結合している他のタンパク 質や糖タンパク質の少なくとも９０％（重量ベースで）、所望により少なくとも ９９％までもが除かれて精製されており、従って、それらを実質的に含まないこ とを示す。それは、例えばＲ−ＰＴＰａｇｅを含む細胞、組織または体液を、こ のタンパク質に対して反応するモノクローナル抗体を担持する免疫吸着カラムの ような標準的タンパク質精製法にかけることにより達成できる。

アフィニティー精製の他の形態は、Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅ　ドメインに結合する固 相支持体またはレセプター・ドメインに結合するりガントを利用する。または標 準的方法の組合わせ、例えば硫安沈澱、分子ふるいクロマトグラフィーおよびイ オン交換クロマトグラフィーにより精製を達成する。

本発明の哺乳動物Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅは様々な細胞源または組織源から生化 学的に精製されると解釈されよう。自然界に存在するＲ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅの 調製のためには哺乳動物の（特にヒト由来の）胎盤または脳のような組織が好ま しい。

または、Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅの遺伝子は単離または合成され得るので、必要 に応じてポリペプチドは原核生物中で、または哺乳動物以外の真核生物中で哺乳 動物由来の他のタンパク質または糖タンパク質を実質的に含むことなしに合成す ることができる。本発明により意図されているように、例えば、トランスフェク トされたＣＯ３，ＮＩＨ−３Ｔ３またはＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞中で生 成された組換えＲ−ＰＴＰａｓｅ−α分子は自然界に存在するタンパク質配列ま たは、その機能的誘導体である。自然界に存在するタンパク質または糖タンパク 質が組換え法により生成される場合、そのタンパク質が天然で結合している他の タンパク質および糖タンパク質を実質的に含まない状態で提供される。

また、固相上での所望の配列のポリペプチドの合成およびその後の支持体からの 分離についての方法がよく知られている。

別の実施態様において、本発明はＲ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅの“機能的誘導体”を 提供する。１機能的誘導体”とはＲ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅの“フラグメント”、 “変異型”、１類似体”、または“化学的誘導体”を意味し、これらの用語は下 記で定義される。機能的誘導体は、本発明通りにその有用性を可能にする、例え ば特異的抗体への結合、ホスファターゼ酵素活性または細胞外ドメインのりガン トへの結合といった、Ｒ−ＰＴＰａｇｅの機能の少なくとも一部を保持する。

Ｒ−ＰＴＰａｇｅの“フラグメント”とは分子の任意のサブセット、すなわち短 かいペプチドを言う。

Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅの“変異型”とは、ペプチド全体またはそのフラグメン トに実質的に類似している分子を言う。当分野でよく知られている方法を用いて 、変異型ペプチドはその直接的化学合成により都合よく調製される。

または、ペプチドのアミノ酸配列変異型は合成されたペプチドをコードするＤＮ Ａの変異により調製される。そのような変異型は、例えば、アミノ酸配列内の残 基の欠失または挿入または置換を含む。最終的構築物が所望の活性を保有するな らば、最終構築物に到るどんな欠失、挿入および置換の組合わせも行うことがで きる。明らかに、変異型ペプチドをコードするＤＮＡ中になされる変異はリーデ ィング・フレームを変化させてはならないし、好ましくは、第二のｍＲＮＡ構造 をつくり得る相補領域をつくってはならない（ヨーロッパ特許公報ＢＰ第７５． ４４４号参照）。

遺伝子レベルで、これらの変異型はペプチド分子をコードするＤＮＡ中のヌクレ オチドの部位特異的突然変異誘発（例えばＡｄｅｌＮＡを発現させる（下記参照 ）。変異型は非変異型ペプチドと同じ定性的生物学的活性を通常は示す。

Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅの“類似体”とは、分子全体またはそのフラグメントと 実質的に類似した天然のものでない分子を言う。

Ｒ−ＰＴＰａｇｅの“化学的誘導体”とは、通常ペプチドの一部でない追加の化 学的部分を含む。ペプチドの共有結合修飾は本発明の範囲に含まれる。ペプチド の標的アミノ酸残基と、選択された側鎖または末端残基と反応できる有機誘導体 化剤と、を反応させることにより、そのような修飾を分子に導入する。

最も一般的には、システイニル残基をクロロ酢酸またはクロロアセトアミドのよ うなアルファーハロアセテート（および相当するアミン類）と反応させて、カル ボキシメチルまたはカル゛ボキシアミドメチル誘導体を生成する。システイニル 残基はまたプロモトリフルオロアセトン、アルファーブロモ−ベーター（５−イ ミドジイル）プロピオン酸、クロロアセチル　ホスフェート、Ｎ−アルキルマレ イミド、３−ニトロ−２−ピリジル　ジスルフィド、メチル２−ピリジル　ジス ルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾ工−ト、２−クロロヌルクリ−ニトロトロ フェノールまたはクロロ−７−二トロベンゾー２−オキサ−１，３−ジアゾール との反応により誘導体化される。

ヒスチジル残基は、ｐＨ５，５−７，０でジエチルプロカーボネートとの反応に より誘導体化される。なぜならこの薬剤がヒスチジル側鎖に比較的特異的だから である。パラブロモフェナシル　プロミドもまた有用である：この反応は好まし くはｐＨ６，０の０．　ｌ　Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。

リシニルおよびアミノ末端残基を無水コハク酸または他のカルボン酸無水物と反 応させる。これらの薬剤での誘導体化はリシニル残基の電荷を反対に変える作用 を用する。アルファーアミノ含有残基の誘導体化のための他の好適な試薬はメチ ルビコリンイミデートのようなイミドエステル；ピリドキサールホスフェート； ピリドキサール；クロロポロハイドライド；トリニトロベンゼンスルホン酸：Ｏ −メチルイソ尿素；２，４ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトラン スアミナーゼ触媒反応を含む。

アルギニル残基は１または数個の従来の試薬、そのなかでもフェニルグリオキサ ール、２，３−ブタンジオン、１．２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリ ンとの反応により修飾される。アルギニン酸基の誘導体化は、グアニジン官能基 の高いｐＫａのためにアルカリ条件下で反応を行うことが必要である。さらに、 これらの試薬はりシンのアミノ基およびアルギニンのイプシロン・アミノ基と反 応するだろう。

チロシル残基自体の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニト ロメタンとの反応によりスペクトル標識をチロシル残基に導入することに特別の 関心を払って、鋭意研究された。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾールお よびテトラニトロメタンを用いて、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３− 二トロ誘導体を生成する。

カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、例えばｌ−シクロへキ シル−３−（２−モルフオリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたはｌ−エ チル−３−（４−アゾニア−４゜４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのよう なカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾する 。さらにアスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によ りアスパラギニルおよびグルタミル残基に変換される。

グルタミニルおよびアスパラギニル残基はしばしば脱アミド化されて対応するグ ルタミルおよびアスパルチル残基になる。または、これらの残基は弱酸性条件下 で脱アミド化される。これらの残基のどちらの形態も本発明の範囲に入る。

二官能性薬剤での誘導体化は水不溶性支持体マトリックスまたは他の高分子担体 へのペプチドの架橋に有用である。通常用いられる架橋剤は、例えばｌ、■−ビ ス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド：Ｎ−ヒドロ キシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３． ３′−ジチオビス（スクシンイミジル−プロピオネート）のようなジスクシンイ ミジルエステルを含むホモ三官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミ ド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミドを含む。メチル−３−〔（ｐ −アジドフェニル）ジチオ〕プロピオイミデートのような誘導体化剤は、光の存 在下で架橋を形成できる光活性化可能な中間体を生成する。または、臭化シアン 活性化炭水化物および米国特許第３．９６９．２８７号、　３．６９１．０１６ 号、　４．１９５．１２８号、　４．２４７．６４２号、　４．２２９．５３７ 号および４．３３０．４４１号に記載されている反応性担体のような反応性の水 不溶性マトリックスをタンパク質固定化に使用する。

他の修飾はプロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残 基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖の α−アミノ基のメチル化（Ｔ、　Ｅｌ。

Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌｅ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ 、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ｐｐ、７９−８５　（１９８３））、Ｎ 末端アミンのアセチル化およびいくつかの場合においては、Ｃ末端カルボキシル 基のアミド化を含む。

そのような誘導体化部分は溶解度、吸収、生物学的半減期その他を改善する。ま たは、その部分はタンパク質の望ましくない任意の副作用その他を除去または軽 減する。そのような作用を媒介できる部分は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｇ　 Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ。

１６　ｔｈ　ｅｄ、、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｊｓｈｊｎｇ　Ｃｏ、、　Ｅａｓｔ ｏｎ、　ＰＡ　（１９８０）に記載されている。

本発明はまたＲ　−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅのエピトープ、好ましくはＲ−ＰＴＰａ ｓｅ−αのエピトープ、最も好ましくはヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−αのエピトープ に特異的な抗体、および細胞中、細胞または組織抽出物中または生物の体液中の Ｒ−ＰＴＰａｇｅの存在を検出するための、または量、濃度を測定するためのそ のような抗体の使用に関する。

“抗体”の用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）　、キ メラ抗体、および抗イデイオタイプ（抗Ｉｄ）抗体を含むと解される。

ポリクローナル抗体は抗原で免疫化された動物の血清から得られた抗体分子の不 均質集団である。

モノクローナル抗体は特定の抗原に対する抗体の実質的均質集団である。ｍＡｂ は当業者に知られている方法により得られる。

例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔａｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　２５６： ４９５−４９７　（１９７５）および米国特許第４．３７６、１１０号を参照。

そのような抗体はＩｇＧ。

ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤおよびその任意のサブクラスを含む任意の免 疫グロブリンクラスのものであってよい。本発明のｍＡｂを生成するハイブリド ーマはｉｎ　Ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで培養される。ｉｎ　ｖｉｖｏ生 成されるｍＡｂが高い抗体価を示すので現在における好ましい生成方法となって いる。簡略に述べると、個々のハイブリドーマからの細胞をプリスタン感作Ｂ　 Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの腹腔内に注入し、高い濃度の所望のｍＡｂを含む腹 水液を生成する。当業者によく知られているカラムクロマトグラフィーを用いて 、アイソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのｍＡｂをそのような腹水液または培養物上 清から精製する。

キメラ抗体は、例えばマウスｍＡｂから得られた可変領域とヒト免疫グロブリン ネ変領域を有するもののような、異なる動物種に由来する異なる部分を有する分 子である。キメラ抗体およびその生成方法は当分野で知られている（Ｃａｂｉｌ ｌｙら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

：６４３−６４６　（１９８４）；　Ｃａｂｉｌｌｙら、ヨーロッパ特許出願第 １２５０２３号（１９８４年１１月１４日公告）ＨＮｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａ ｔｕｒｅ　３１４：２６８−２７０　（１９８５）　；Ｔａｎｉｇｕｃｈｆ　ら 、ヨーロッパ特許出願第１７１４９６号（１９８５年２月１９日公告）；　Ｍｏ ｒｒｉｓｏｎら、ヨーロッパ特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公 告）；　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ出願ＷＯ８６１０１５３３（１９８６年 ３月１３日公告）；　Ｋｕｄｏ、ヨーロッパ特許出願第１８４１８７号（１９８ ６年７月１１日公告）ＨＭｏｒｒｉｓｏｎら、ヨーロッパ特許出願１７３４９４ 　（１９８６年３月５日公告）ＨＳａｈａｇａｎら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１ ３７：１０６６−１０７４　（１９８６）ＨＲｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許公告 ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２２６９　（１９８７年５月７照によりここに引用される ものとする。

抗イデイオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は抗体の抗原結合部位と一般に関連している特 有の抗原決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄを調製しようとす るｍＡｂで、ｍＡｂの起源と同じ種および遺伝子型（例えばマウス株）の動物を 免疫化することにより調製される。免疫化された動物は免疫抗体のイディオタイ プ決定基を認識し、これに応答して、これらのイディオタイプ決定基に対する抗 体（抗Ｉｄ抗体）を生成する。

抗Ｉｄ抗体もまたさらに別の動物中で免疫応答を誘発する“免疫原”として用い られ、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を生成する。抗−抗１ｄは抗Ｉｄを誘発した最初 のｍＡｂとニブトープが同じである。従ってｍＡｂのイディオタイプ決定基に対 する抗体を用いることにより、同じ特異性を有する抗体を発現する他のクローン を同定することが可能である。

従って、本発明のＲ−ＰＴＰａｇｅに対して生成されたｍＡｂはＢＡＬＢ／ｃマ ウスのような好適な動物中で抗Ｉｄ抗体を誘発するために用いられる。そのよう な免疫マウスからの膵臓細胞を用いて抗ＩｄｍＡｂを分泌する抗Ｉｄハイブリド ーマを生成する。

さらに、抗１ｄｍＡｂをキーホール・リンペット・ヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ） のような担体に結合させ、別のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスＴＰａｇｅエピト ープに特異的な最初のｍＡｂの結合特性を有する抗−抗Ｉｄ抗体を含むだろう。

従って、抗ＩｄｍＡｂは、Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−ａのような、評価しようとするエ ピトープに構造的に類似している、独自のイディオタイプエピトープすなわち“ イディオトープ”を有している。

“抗体”の用語もまた完全な分子およびそのフラグメント、例えば抗原に結合可 能なＦａｂおよびＦ（ａｂ’）ｚ、を両方とも含むことを意味する。Ｆａｂおよ びＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃフラグメントを欠いており、 循環系からより速く消失し、完全な抗体よりも非特異的組織結合が少ない（Ｗａ ｈｌら、Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ。

２１：　３１６−３２５　（１９８３））。

本発明において有用な抗体のＦａｂとＦ　（ａｂ’　）、および他のフラグメン トが、完全な抗体分子に関してここに開示された方法により、Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　 ａｇｅの検出および定量化に用いられることが認識されよう。そのようなフラグ メントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成する）またはペプシン（Ｆ（ａ ｂ’）ｔフラグメントを生成する）のような酵素を用いてタンパク質分解切断に より通常生成される。

抗体が分子と特異的に反応して、それにより分子を抗体に結合させることができ る場合、抗体は分子に“結合できる”と言われる。“エピトープ”の用語は、抗 体により結合される任意の分子の部分をさすものと解され、またその抗体により 認識されるものでもある。エピトープまたは“抗原決定基”は通常アミノ酸や糖 側鎖のような分子の化学的に活性な表面配置から成り、特別の三次元構造特性お よび特別の電荷特性を有する。

“抗原”は抗体により結合される分子または分子の部分であり、さらに動物にそ の抗原のエピトープに結合可能な抗体の生成を誘発できる。抗原は１または１以 上のエピトープを有する。上述の特異的反応とは、非常に選択的に抗原がその対 応する抗体と反応し、他の抗原により誘起される多数の他の抗体とは反応しない ことを指すと解される。

本発明に有用な抗体または抗体のフラグメントは、Ｒ−ＰＴＰａｓｅタンパク質 を発現する細胞の存在を定量的または定性的に検出するために用いられる。これ は、光学顕微鏡、フローサイトメトリーまたは蛍光定量検出と共に蛍光標識抗体 （下記参照）を使用する免疫蛍光法により達成される。

免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡におけるようにＲ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅのｉｎ 　５ｉｔｕ検出のために、本発明に有用な抗体（またはそのフラグメント）を、 組織学的に使用しうる。患者から組織学的標本を取り出し、本発明の標識抗体を そのような標本に供給することにより、ｉｎ　ｓｏｕ検出は達成される。標識抗 体（またはフラグメント）を生物学的試料に加えることにより、または重層する ことにより抗体（またはフラグメント）を供給することが好ましい。そのような 方法の使用により、Ｒ−ＰＴＰａｓｅの存在だけでなく検査組織上のその分布も また決定することが可能である。本発明を用いることにより、当業者は、そのよ うなｉｎ　５ｉｔｕ検出を達成するように広く様々な組織学的方法（例えば染色 法）のどれも改変可能であることを容易に考え及ぶであろう。Ｒ−ＰＴＰａｇｅ のためのそのようなアッセイは、通常Ｒ−ＰＴＰａｓｅを同定できる検出用に標 識された抗体の存在下で生物学的試料、例えば生物学的体液、組織抽出物、リン パ球または白血球のような新しく収穫した細胞、または組織培養でインキュベー トされている細胞をインキュベートし、当分野でよく知られている数多くの方法 のうちの任意のものを用いて抗体を検出することから成る。

生物学的試料は、ニトロセルロースのような固相支持体または細胞、細胞粒子ま たは可溶性タンパク質を固定化できる他の固相支持体で処理する。続いて、支持 体を好適な緩衝液で洗浄し、続いて検出用に標識したＲ−ＰＴＰａｓｅ特異的抗 体で処理する。続いて、固相支持体を２回目に緩衝液で洗浄し未結合抗体を取り 除く。続いて、該固相支持体上の結合標識物の量を従来の方法により検出する。

“固相支持体”とは抗原または抗体に結合可能な任意の支持体を意図する。よく 知られている支持体または担体はガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ エチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾されたセルロ ース、ポリアクリルアミド、斑れい岩および磁鉄鉱を含む。担体の性質は本発明 の目的のためにある程度可溶性であっても、不溶性であってもよい。支持体材料 は、結合分子が抗原または抗体に結合できる限り、事実上あらゆる可能な構造的 形状をとり得る。従って、支持体形状はビーズのように球体、試験管の内面のよ うにまたは棒の外面のように円筒状である。または、その表面はシート、テスト 帯片その他のように平らである。好ましい支持体はポリスチレンビーズを含む。

当業者は抗体または抗原を結合するために他の多くの好適な担体を知っていよう し、またはそれらを通常の実験で用いることにより確認できるであろう。

所定のロットの抗Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅの結合活性はよく知られた方法により 測定できる。当業者は通常の実験を使用することにより各測定の最適アッセイ条 件を決定することができるだろう。

特定の状況に通常用いられるまたは必要とされる洗浄、攪拌、振とう、ろ過等の 他の工程をアッセイに加えてもよい。

Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ特異的抗体を検出用に標識する方法の一つはその抗体を 酵素イムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）に用いる酵素に結合することである。その後 適切な基質にさらされた場合、この酵素は、例えば分光光度計、フルオロメトリ ーまたは可視手段により検出可能な化学部分を生成するように、基質と反応する ことになる。

抗体を検出用に標識するために用いられる酵素は、マレート・デヒドロゲナーゼ 、スタフィロコッカス・ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、 酵母アルコール・デヒドロゲナーゼ、アルファーグリセロホスフェート・デヒド ロゲナーゼ、トリオース・ホスフェート・イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシ ダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース・オキシダ ーゼ、ベータ・ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ 、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびア セチルコリンエステラーゼを含むが、これらに限定されない。酵素に対して発色 性基質を用いる比色法により検出は達成される。検出はまた、同じ様に調製され た標準と基質の酵素反応の程度を視覚的に比較することにより達成される。

検出は、様々な他のイムノアッセイのどれを用いても達成される。例えば、抗体 または抗体フラグメントを放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ ＲＩＡ）を用０てＲ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅを検出することが可能である（たとえ ば、ここに参照により引用される、Ｗｏｒｋ、　Ｔ、Ｓ、ら、Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｇｕｅｓ　ａｎｄ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＹｏｒｋ、　 １９７８を参照）。放射性アイソトープはガンマ・カウンターまたはシンチレー ション・カウンターまたまオートラジオグラフィーのような方法により検出でき る。

抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識された抗体を適正な波 長の光にさらした場合、その存在が蛍光によりすぐに検出される。なかでも最も 一般に用いられる蛍光標識化合物は、フルオレセイン・イソチオシアネート、ロ ーダミン、フイコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、０−フタ ルアルデヒドおよびフルオレサミンである。

抗体はまた蛍光発光金属、例えばｌ５ｔＢｕまたは他のランタニド系のものを用 いて検出用に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五 酢酸（ＤＴＰＡ）またｃ−ｈエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレ ート化剤を用０て抗体に付着させる。

抗体はまたそれを化学発光化合物と結合させること：こより検出用に標識できる 。続いて化学発光標識抗体の存在を化学反応中に起る発光の存在を検出すること により決定する。特に有用なイヒ学発光標識化合物の例はルミノール、イソルミ ノールアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ 酸エステルである。

同様に、生物発光化合物を本発明の抗体を標識するため番ご用（１てもよい。生 物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的系にみら れる化学発光の型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出する ことにより測定される。標識の目的で重要な生物発光化合物はルシフェリン、ル シフェラーゼおよびエクオリンである。

本発明の抗体分子は″′２サイト”または“サンドイッチ”アッセイとしても知 られる、イムノメトリックアッセイに有用なように適合させ得る。通常のイムノ メトリックアッセイでは、ある量の非標識抗体（または抗体°のフラグメント） を固相支持体に結合させ、ある量の検出可能に標識した、可溶性抗体を加えて、 固相抗体、抗原および標識抗体との間で形成された三成分複合体の検出および／ または定量化を可能にする。

通常の、かつ好ましいイムノメトリックアッセイは、固相に結合された抗体を最 初に検査される試料と接触させて、二成分から成る固相抗体−抗原複合体の形成 により試料から抗原を抽出する、“フォーワード（ｆｏｒｗａｒｄ）″アッセイ を含む。適切なインキュベーション期間の後、固相を洗浄し、未反応の抗原（も しあれば）を含む液体試料の残渣を取り除き、続いて未知の量の標識抗体（“リ ポータ−分子”として機能する）を含む溶液と接触させる。

標識抗体が非標識抗体により固相と結合した抗原と複合体形成する２回目のイン キュベーション期間の後、固相は２回目の洗浄をして未反応標識抗体を取り除く 。

本発明の抗原にも有用である別の型の“サンドイッチ”アッセイでは、いわゆる “同時”および“逆”アッセイを用いる。同時アッセイは固相支持体に結合され た抗体と標識抗体との両方が検査される試料に同時に加えられる、１回のインキ ュベーション・ステップを必要とする。インキュベーション終了後、固相を洗浄 し、液体試料および未複合化標識抗体の残渣を取り除く。続いて、固相支持体と 結合した標識抗体の存在を、従来の“フォーワード”サンドイッチアッセイでな されるように測定する。

“逆”アッセイでは、最初に標識抗体の溶液を液体試料へ添加し、適当なインキ ュベーション期間の後に固相に結合した非標識抗体を添加する段階的添加を用い る。２度目のインキュベーション後、固相を従来の方法で洗浄し、検査される試 料の残渣および未反応標識抗体の溶液を固相から取り除く。続いて固相に結合し た標識抗体の測定は“同時”および“フォーワード”アッセイのように測定され る。

被験者の正常に機能するＲ−ＰＴＰａｇｅの存在は、直接酵素アッセイを用いて 、チロシンホスファターゼ活性について検査することもできる。酵素活性の正確 な測定を可能にする精製された酵素を用いて、または正味のホスフォチロシンレ ベルが測定される膜間製物または完全細胞を用いて、そのような生化学測定を１ ｎｖｉｔｒＯで行う。

本発明の別の実施態様において、Ｒ−ＰＴＰａｓｅ分子をコードするＤＮＡ配列 およびそのＤＮＡ配列を発現する方法が提供される。当業者は、過度な実験をす ることなく、本発明の遺伝子配列およびオリゴヌクレオチドを用いて、ここで記 載されているＲ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ分子に相同の配列を有する、ヒトまたは他 の哺乳動物種の別のＰＴＰａｇｅ分子を同定しクローン化する方法がわかるであ ろう。さらに、本発明の遺伝子構築物の操作により、Ｒ−ＰＴＰ　ａｓｅのトラ ンスメンプランおよび触媒部分に特定のリガンド結合レセプター・ドメインをグ ラフトしてキメラ分子を生成することができる。そのようなキメラ分子の例とし ては、レセプターが上皮細胞成長因子レセプター、繊維芽細胞成長因子レセプタ ー等であるＲ　−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅを含む。遺伝子工学的に操作されたキメラ ・レセプターは当分野で知られている（例えばＲｉｅｄｅｌ、　Ｈ，ら、！！！ ｔｕｒｅ　３２４：６２８−６７０　（１９８６）を参照）。

Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−α、その機能的誘導体、および記載されているキメラ分子を コードする遺伝子構築物は遺伝子療法に用いられる。疾患を起こす、異常または 機能不全Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅは正常のＲ−ＰＴＰａｇｅでトランスフェクト された所望の系統の細胞（例えば造血細胞）の注入により置換される。また、あ るいは、さらに、所定のリガンド（例えばＥＧＦ）に対するレセプターを有する キメラＲ−ＰＴＰａｓｅを担持する細胞はそのような遺伝子療法に用いられる。

本発明の組換えＤＮＡ分子は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ合成、より好ましくは 組換えＤＮＡ法の適用のような種々の方法のうちのどれによっても生成される。

そのような分子を合成する方法は、例えばＷｕ、　Ｒ，、ら（Ｐｒｏｇ、　Ｎｕ ｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　２１：１０１−１ ４１　（１９７８））により開示されている。上記方法により組換え分子を構築 する方法はＳａｍｂｒｏｏｋら（上記）により開示されている。

本発明の組換え分子の３′末端は、それが重合に不向きになるように処理するこ とが好ましい。そのような処理は、化学的方法により末端をブロックするか、ま たは末端塩基がポリメラーゼ作用を立体的に妨げるようにそれらを変更すること により達成される。好ましい実施態様において、そのような処理は、例えば３゛ 末端を固相支持体（例えば、ガラス、プラスチック、ラテックス等）に結合させ て、それを固定化することにより達成される。支持体はどのような形態でもよい （すなわちシート、棒、球体、卵形等）。そのような固定化の方法は当業者によ く知られている。

最も好ましい実施態様において、組換え分子の３゛末端部は固相支持体に共有結 合で結合される。スペーサー領域は、（１）それが組換え分子のどのような機能 または特性も立体的に妨害せず、そして（２）スペーサー領域の配列がアッセイ のハイブリッド形成または重合反応に関与しない限り、固相支持体から外方向に プローブを伸長させるために用いられる。通常、数個の、好ましくは数多くのそ のような組換え分子を支持体に固定化することが望ましい。

Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅの一部に相当するオリゴヌクレオチドは、そのようなタ ンパク質をコードする遺伝子の存在をスクリーニングするために、そしてＲ−Ｐ ＴＰａｓｅ遺伝子のクローニングに有用である。そのようなオリゴヌクレオチド を合成する方法は、例えばＷｕ、　Ｒ，、ら（Ｐｒｏｇ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ ｄ、　Ｒｅｓ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉａｌ、　２１：ｌ０ｌ−１４１（１９７８ ））に開示されている。

タンパク質分子は臭化シアンまたはパパイン、キモトリプシン、トリプシン等の ようなプロテアーゼでフラグメント化される（Ｏｉｋｅ。

Ｙ、、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５７：９７５１−９７５８　（１９ ８２）：　Ｌｉｕ、Ｃ，、ら。

Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、　２１：２０９−２１ ５　（１９８３））。遺伝暗号は縮重するので、１以上の暗号が特定のアミノ酸 をコードするのに用いられる（Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ、Ｄ、、　Ｉｎ：　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＧｅＰａｒｋ、　ＣＡ　（１９８ ７））。遺伝暗号を用いて、ｌまたはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドが同 定され、その各々はアミノ酸をコードし得るであろう。事実、特定のオリゴヌク レオチドが実際のＸＸＸコード配列を構成するという可能性は、異常な塩基対合 関係および特定のコドンが実際に真核細胞で（特定のアミノ酸をコードするため に）用いられる頻度を考慮することにより推定される。

そのような“コドン使用規則”はｔａｔｈｅ、　Ｌｌ　ら、　Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、 　Ｂｉｏｌ、遅＋３：１−１２　（１９８５）により開示されている。Ｌａｔｈ ｅの“コドン使用規則”を用いて、Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅをコードできる、理 論上の“最も可能性のある”ヌクレオチド配列を含む単一のオリゴヌクレオチド または１組のオリゴヌクレオチドを同定する。

時々、アミノ酸配列は単一のオリゴヌクレオチドでのみコードされるが、しばし ばアミノ酸配列は１組の類似のオリゴヌクレオチドのどれかによりコードされる 。重要なことは、この組の全てのメンバーはペプチドフラグメントをコードでき るオリゴヌクレオチドを含み、従って、ペプチドフラグメントをコードする遺伝 子と同じオリゴヌクレオチド配列を含み得るが、その組のひとつのメンバーだけ が遺伝子のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含むことである。このメ ンバーはその組の中に存在し、その組の他のメンバーの存在下でさえＤＮＡとハ イブリッド形成できるので、単一のオリゴヌクレオチドを用いてペプチドをコー ドする遺伝子をクローンするのと同じ方法で、分画化してない組のオリゴヌクレ オチドを用いることが可能である。

Ｒ−ＰＴＰａｓｅフラグメントをコードできる、理論上の“最も可能性の高い“ 配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組を用いて、′最も 可能性の高い”配列または配列の組にハイブリッド形成できる、相補オリゴヌク レオチドの配列またはオリゴヌクレオチドの組を同定する。そのような相補配列 を含むオリゴヌクレオチドは、Ｒ−ＰＴＰａｇｅ遺伝子を同定、単離するプロー ブとして用いられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、上記）。

Ｒ−ＰＴＰａｓｅ遺伝子のフラグメントをコードしうる好、適なオリゴヌクレオ チドまたはオリゴヌクレオチドの組（または、そのようなオリゴヌクレオチドま たはオリゴヌクレオチドの組に相補的なもの）は同定され（上記方法を用いて） 、合成され、そして当分野で知られている方法によりＤＮＡまたは最も好ましく はＲ−ＰＴＰａｓｇ遺伝子を発現できる細胞から得られたｃＤＮＡｍ製物とハイ ブリッド形成される。′最も可能性の高い’　Ｒ−ＰＴＰａｇｅペプチドをコー ドする配列に相補的な一重鎖オリゴヌクレオチド分子は当業者によく知られてい る方法を用いて合成される（Ｂｅｌａｇａｊｅ、　Ｒ，、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ、　２５４：５７６５−５７８０　（１９７９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ、 　Ｔ１．ら、Ｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｃｈａｎｉｇｍｓ　ｉｎ　ｔｈ ｅ　ＣｏｎｔｒｏｌｏｆＧｅｎｅ　Ｅ！ｘｐｒｅｓｇｉｏｎ、　Ｎ１ｅｒｌｉｃ ｈ、Ｄ、Ｐ、、ら、Ｅｄｓ、、Ａｃａｄ、Ｐｅｒｓｓ、ＮＹ（１９７６）；　Ｗ ｕ、Ｒ，、ら、Ｐｒｏｇ、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ 、２１：ｌ０Ｉ−１４１（１９７８）；　Ｋｈｏｒａｎａ、　Ｒ，Ｇ、、　５ｃ ｉｅｎｃｅ　２０３：６１４−６２５　（１９７９））。さらに、ＤＮＡ合成は 自動合成機の使用により達成される。

核酸ハイブリッド形成の方法はＳａｍｂｒｏｏｋら（上記）、およびＨａｙｍｅ ｓ、　Ｂ、Ｄ、、ら（Ｉｎ：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄ：ｚａ ｔｉｏｎ、　Ａ　Ｐｒａｃ目ｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　 Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　ＤＣ（１９８５乃、により開示され、これらの文献は 、ここに参照により引用されるものとする。

例えば上記のような技法、またはそれに類似の技法はヒトアルデヒドデヒドロゲ ナーゼ（Ｈｓｕ、　Ｌ、Ｃ，、ら、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅ ｉ。

レセプター遺伝子（Ｗａｌｔｅｒ、　Ｐ、、　ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　 Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、　ＬＩＳＡ　８２ニア８８９−７８９３　（１９８５）） 、組織型プラスミノーゲンアクチベータ−（Ｐｅｎｎｌｃａ、　Ｄ、、ら、　Ｎ ａｔｕｒｅ　３０１：２１４−２２１　（１９８３））およびヒト出産期胎盤ア ルカリホスファターゼ相補ＤＮＡ　（Ｋａｍ、　Ｗ、、う、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：８７１５−８７１９　（１９８ ５））のクローニングを可能にすることに成功した。

Ｒ−ＰＴＰａｓｅ遺伝子をクローニングする別の方法において、発現ベクターの ライブラリーがＤＮＡまたはさらに好ましくはＣＤＮＡ　（Ｒ−ＰＴＰａｇｅを 発現できる細胞からの）を発現ベクターにクローニングすることにより調製され る。続いて、ライブラリーを、抗Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ抗体に結合し、Ｒ−Ｐ ＴＰａｇｅまたはそのフラグメントと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを コードできるヌクレオチド配列を有するタンパク質を発現することができるメン バーを選ぶためにスクリーニングする。この実施態様において、ＤＮＡまたはさ らに好ましくはｃＤＮＡをＲ−ＰＴＰａｓｅタンパク質を発現できる細胞から抽 出、精製する。精製したｃＤＮＡをフラグメント化しく剪断、エンドヌクレアー ゼ消化等により’）ＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントのプールを生成する。続 いてメンバーの各々が唯一のクローン化ＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを含 む発現ベクターのゲノムライブラリーを生成するために、このプールからのＤＮ ＡまたはｃＤＮＡフラグメントを発現するベクターにクローン化する。

“発現ベクター”とはベクターにクローン化されたＤＮＡ　（またはｃＤＮＡ） 分子を発現でき、それによりポリペプチドまたはタンパク質を生成できるベクタ ー（適切な転写および／または翻訳制御配列の存在により）である。クローン化 配列の発現は発現ベクターが適切な宿主細胞に導入された時に起る。原核生物発 現ベクターを用いる場合、適切な宿主細胞はクローン化配列を発現できる任意の 原核生物細胞であろう。同様に、真核生物発現ベクターを用いる場合、適切な宿 主細胞はクローン化配列を発現できる任意の真核生物細胞であろう。重要なこと は、真核生物ＤＮＡは介在配列を含み、そのような配列が原核生物細胞で正しく プロセシングできないので、原核生物ゲノム発現ベクター・ライブラリーを生成 するためにはＲ−ＰＴＰａｇｅを発現できる細胞からのｃＤＮＡを使用すること が好ましい。ｃＤＮＡを調製する方法、ゲノムライブラリーを生成する方法はＳ ａｍｂｒｏｏｋらの上記により開示されている。

本発明のＲ−ＰＴＰａｇｅをコードするＤＮＡ配列またはその機能的誘導体は、 ライゲーションのための平滑末端化または粘着末端化末端、適切な末端を生成す るための制限酵素消化、適切になるように粘着末端部の充填、望ましくない結合 を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および適切なりガーゼでのライゲ ーションを含む従来の方法に従ってベクターＤＮＡと再結合される。

そのような操作の技術はＳａｍｂｒｏｏｋらの上記により開示され、当業者によ く知られている。

ＤＮＡのような核酸分子は、それが転写および翻訳調節情報を含むヌクレオチド 配列を含み、そしてそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配 列と“操作可能な連結”をしているならば、ポリペプチドを“発現できる”と言 われる。操作可能な連結とは、調節ＤＮＡ配列と発現をめられるＤＮＡ配列が遺 伝子発現を可能にするように接続されている連結である。遺伝子発現に必要な調 節領域の正確な性質は種々に生物により異なり、原核生物では（ＲＮＡ転写の開 始を指示する）プロモーターおよび、ＲＮＡに転写された場合にタンパク質合成 の開始を知らせるＤＮＡ配列の両方を含むプロモーター領域を一般に含む。その ような領域は、例えばＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列等の転写 や翻訳の開始に必要なこれらの５′非コ一ド配列を通常含む。

必要に応じて、タンパク質をコードする遺伝子配列の３°非コード領域を上記方 法により得る。この領域はターミネーションおよびポリアゾニレ−シコンのよう なその転写終了調節配列を保持する。従って、タンパク質をコードするＤＮＡ配 列に天然では隣接する３′領域を保持することにより、転写終了シグナルが提供 される。転写終了シグナルが発現宿主細胞中で十分に機能しない場合は、宿主細 胞で機能する３′領域が置換される。

２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が（１）フレームシフト変異の導入を生じない 、ｆ２ＪＲ−ＰＴＰａｇｅ遺伝子配列の転写を指示するプロモーター領域配列の 能力を妨げない、または（３）プロモーター領域配列により転写されるＲ−ＰＴ Ｐａｓｅ遺伝子配列の能力を妨げない、ならば２つのＤＮＡ配列（例えばプロモ ーター領域配列およびＲ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅをコードする配列）は操作可能な 連結であると言える。プロモーター領域は、プロモーターがそのＤＮＡ配列の転 写に作用できるならばＤＮＡ配列と操作可能な連結であろう。従って、タンパク 質を発現するためには、適切な宿主により認識される転写および翻訳シグナルが 必要である。

プロモーターはＲＮＡポリメラーゼに結合でき、“操作可能な連結“核酸配列の 転写を促進できる二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。ここで用いられている ように、′プロモーター配列”はＲＮＡポリメラーゼにより転写されるＤＮＡま たはＲＮＡの鏡上にみられるプロモーターの配列である。′プロモーター配列相 補”とはその配列が“プロモーター配列”の相補である核酸分子である。従って 、−末鎖“プロモーター配列相補”に隣接するプライマーＤＮＡまたはＲＮＡの 伸長または“プロモーター配列”の伸長後に、その伸長が“プロモーター配列” または“プロモーター配列相補”の方向へ進行するならば機能的プロモーターを 含む二本鎖分子が生成される。この機能的プロモーターは、（“プロモーター配 列相補”を含む分子の鎖ではなく）“プロモーター配列”を含む二本鎖分子の鎖 に操作可能な連結をしている核酸分子の転写を指示する。

いくつかのＲＮＡポリメラーゼはそのようなプロモーターに高い特異性を示す。

バクテリオファージＴ７．Ｔ３および５Ｐ−６のＲＮＡポリメラーゼは特によく 特徴づけられ、高いプロモーター特異性を示す。これらＲＮＡポリメラーゼの各 々に特異的なプロモーター配列もまたポリメラーゼが二本鎖ＤＮＡ鋳型の二本鎖 の一本鎖だけを利用する（すなわち転写）ように指示する。どの鎖が転写される かの選択は、プロモーター配列の方向性により決定される。ＲＮＡは、３”　ヒ ドロキシル末端にヌクレオチド５゜ホスフェートを加えることにより酵素的に重 合されるだけなので、この選択が転写の方向を決定する。

核酸分子の２つの配列は、両配列が同じＲＮＡ転写物に転写されるかまたはＲＮ Ａ転写物が１配列に始まり２番目の配列に伸長するような仕方でそれらが互いに 連結している場合、“操作可能な連結”であると言える。従って、プロモーター 配列およびＤＮＡまたはＲＮＡの他の“第２″配列のような２つの配列は、プロ モーター配列で始まる転写が操作可能な連結をした第２配列のＲＮＡ転写物を生 成する場合、操作可能な連結である。′操作可能な連結”であるためには、２配 列が互いに直接隣接している必要はない。

従って、上に示しているように、プロモーターとして機能するためには、プロモ ーター配列は二本鎖分子として存在しなければならない。本発明の目的のために 、機能的プロモーター配列の二本鎖を“転写”鎖および“相補”鎖と呼ぶ。“転 写”鎖はＲＮＡポリメラーゼにより転写される二本鎖のうちのその鎖である（す なわち転写の鋳型として働く）。“相補”鎖とは、′転写”鎖に相補な配列を有 し、転写が行なわれるためには存在してかつ“転写”鎖とハイブリッド形成しな ければならない鎖である。従って、プロモーター配列の“転写”鎖が２番目の配 列と操作可能な連結をしている場合、′転写”鎖の“相補”鎖とのハイブリッド 形成はポリメラーゼ存在で“転写′鎖の転写を生じて、鋳型として“転写”鎖の 配列を用いてＲＮＡ転写物を生成する。

本発明のプロモーター配列は原核生物、真核生物またはウィルスである。好適な プロモーターは抑制可能であるかまたはさらに好ましくは構成的である。好適な 原核生物プロモーターの例は、Ｔ４　（Ｍａｌｉｋ、　Ｓ、ら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、　２６３：１１７４−１１８１　（１９８４）；Ｒｏｇｅｎｂｅｒ ｇ、　Ａ、Ｈ，ら、　Ｇｅｎｅ　５９：ｌ９ｌ−２００（１９８７）；　Ｓｈｉ ｎｅｄｌｉｎｇ、　Ｓ。

ら、Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、１９５；４７１−４８０　（１９８７）；　 Ｈｕ、　Ｍ、ら、ＧｅｎｅＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ Ｕ、Ｓ、Ａ、）　８１：２０３５−２０３９　（１９８４））ポリメラーゼを認 識できるプロモーター：バクテリオファージラムダのＰ、とＰＬプロモーター（ Ｔｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｌａｍｂｄａ、　Ｈｅｒｓｈｅｙ。

Ａ、Ｄ、、　Ｅｄ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

ＮＹ　（１９７３）ニラムダＩ［Ｈｅｎｄｒｉｘ、　Ｒ，Ｗ、、　Ｅｄ、、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８０） ；　ｔ！、ｃｏｌｉのｔｒｐ、　ｒｅｃＡ、ヒートショックおよびＩａｃｚプロ モーター；α−アミラーゼ（Ｌｌｌｍａｎｅｎ、　１．、ら、　Ｊ、　Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌ、　１６２：１７６−１８２　（１９８５）およびＢ、サブチリスの σ−２８−特異的プロモーター（Ｃｉｌｍａｎ、　Ｍ、Ｚ、、ら、　Ｇｅｎｅ　 ３２：ｌｌ−２０（１９８４））：バチルスのバクテリオファージのプロモータ ー（Ｇｒｙｏｚａｎ、　Ｔ、Ｊ、、　Ｉｎ：　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｔｌｌｉ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、、　ＮＹ　（１９８２））；ストレプ トミセスのブ０％−ター（Ｗａｒｄ、　Ｊ、Ｍ、、ら、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　 Ｇｅｎｅｔ、　２０３：　４６８−４７８　（１９８６））；バクテリオファー ジラムダのｉｎｔプロモーター、　ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂ ｌａプロモーターおよびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランス ファラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーター等を含む。

原核生物プロモーターは、Ｇ１１ｃｋ、　Ｂ、Ｒ，（Ｊ、　Ｉｎｄ、　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｆ。

！＋２７７−２８２　（１９８７））；　Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ、　Ｙ、　（Ｂ ｉｏｃｈｉｍｉｅ　６８：５０５−５１６（１９８６））；　Ｗａｔｓｏｎ、　 Ｊ、Ｄ、ら、（Ｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅＧ ｅｎｅ、Ｆｏｕｒｔｂ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｂｅｎｊａｍｊｎ　Ｃｕｍｍ１ｎｓ 、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡ　（１９８７））；およびＧｏｔｔｅｓｍａ ｎ、　Ｓ、　（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８：４１５−４４２　（ １９８４））により概説されている。好ましい原核生物プロモーターはマウスメ タロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ＋　Ｄ、＊ら。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　ｌ：２７３−２８８　（１９８２）） ；　ヘルペスウィルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、　Ｓ、、　Ｃｅ 旦３１：３５５−３６５　（１９８２））；ＳＶ初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉ ｓｔ、　Ｃ，、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２９０：３０４−３１ ０　（１９８１））；および酵母ｇａ１４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏ ｎ。

Ｓ、　Ａ、　、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ） ７１：６９７１−６９７５　（１９８２）；５ｉｌｖｅｒ、　Ｐ、Ａ、、ら、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　８１：５９５１− ５９５５（１９８１））を含む。上記の参照文献はここに参照文献として編入さ れている。

強力なプロモーターが好ましい。そのような好ましいプロモーターの例は、Ｔ３ 、ＳＦ３およびＴ７ポリメラーゼを認識するプロモーター、バクテリオファージ ラムダのＰＬプロモーター、ｒｅｃＡプロモーターおよびマウスモタロチロネイ ンＩ遺伝子のプロモーターである。Ｒ−ＰＴＰａｓｅの真核生物発現のために最 も好ましいプロモーターは、ｐＬｓＶベクター（Ｌｉｖｎｅｈ、　Ｅ、、ら、　 （１９８Ｂ）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１．１２４９０−１２４９７ ）中で転写をうながすＳＶ４０プロモーターであるる。そのようなポリメラーゼ 認識部位の配列は１１ａｔｓｏｎ、Ｊ、Ｄ、ら、（Ｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、ＦｏｕｒｔｈＥｄｉｔｉｏｎ、　Ｂ ｅｎｊａｍｊｎ／ＣｕＣｕｍｍ１ｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｉｎｃ 、、　Ｍｅｎｌ。

Ｐａｒｋ、　ＣＡ、　（１９８７））により開示されている。

本発明を一般的に記載したが、本発明は下記の実施例を参考にすることにより、 より容易に理解されるであろう。しかし実施例は説明のために提供しているので あり、特にことわらない限り、本発明を限定することを意図するものではない。

（本頁以下余白） 実施例Ｉ マウスＲ−ＰＴＰａｓｅ　−ａ　ｅＤＮＡクローンの単離と分析１、ライブラリ ー・スクリーニング ラムダｇｔｌｌ中のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウス脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｄｒ、 Ｙ、Ｃ１ｔｒｉから恵与された）を、緩和な緊縮条件（６ｘＳＳＣ，５ｘＤｅｎ ｈａｒｄｔｓ、０．１％　ＳＤＳ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５，１ｍＭ　 ＥＤＴＡ、Ｏ，１ｍｇ／ｍｌ　サケ***ＤＮＡ、ハイブリダイゼーション温度５ ０℃）で、あらかじめランダムプライミング法でＲａｐ標識しておいたヒトＴ２ Ｏ０糖タンパク質（Ｒａｌｐｈ、　Ｓ、Ｊ、　ｅｔ　ａｔ、、　ＥＭＢＯＪ、　 ６：１２５１−１２５７．１９８７）の細胞内およびトランスメンブランドメイ ンを表す２４００ｂｐのＢｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＡｃｃＩ断片をプローブとして用いて スクリーニングした。８ｘＳＳＣ１０，１％　ＳＤＳ中、５０℃で洗浄を行った 。１０１個のクローンから５１個のポジティブなりローンを取り出し、選択し、 制限酵素マツピングにより特徴決定した。最長の挿入物を含むファージクローン （ラムダ−１０９）から単離した０、９５．１．　６および０．３ＫｂのＥｃｏ ＲＩ断片をブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＫＳプラアスおよびマイ ナスベクター中にサブクローニングした。クローン化ｃＤＮＡ断片とプラスミド ベクターのポリリンカー領域に共通な制限部位を使用することにより、一連のｎ ｅｓｔｅｄ　ｄｅｌｅｔｉｏｎを作成した。使用した個々の制限部位を図１ｂに 示す。これら構築物から１本鎖ＤＮＡを調製し、ジデオキシヌクレオチド鎖末端 法（シーケナーゼ、Ｕｎｉｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用 いる配列決定の鋳型として用いた。

両方の鎖の全ての領域を配列決定した。組換えファージ中のＥｃｏＲＩ断片の相 対的順序および方向性は制限酵素マツピングにより決定した。異なるＥｃｏＲＩ 断片が、ライブラリー構築過程で一緒にライゲーションした無関係なｃＤＮＡ断 片に対応しないことを確認するために、別の独立した単離物であるラムダ−１１ ３についても制限酵素マツピングを実施した。

２、結果 脳組織は、多くの型のチロシンキナーゼに富むことが既に証明されており、最近 の生化学的検証により複数の型のＰ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅ活性の存在も示唆されてい る（Ｊｏｎｅｓ、　Ｓ、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、 、　２６４ニア７４７−７７５３．１９８９）　、新しいレセプター型ＰＴＰａ ｓ６を検索するために、本発明者らは、２つの一列に並ぶＰ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅ　 ドメインを含むヒトＣＤ４５の細胞内ドメインをハイブリダイゼー低緊縮条件で スクリーニングした（Ｔｏｎｋｓ、　Ｎ、に、　ｅｔ　ａｌ、、前出：Ｃｈａｒ ｂｏｎｎｅａｕ、　Ｆｆ、　ｅｔ　ａｌ、・前出；　Ｒａ１ｐｈ、　Ｓ、Ｊ、　 ｅｔ　ａｌ、、前出）０クロスハイブリダイゼーシコンおよび制限酵素マツピン グによりポジティブなりローンをいくつかの範躊に分類して、最も多く現れたク ラスに対応する最長のファージ挿入物（ラムダ−１０９）を選択して次のサブク ローニングおよび分析に用いた。

ヌクレオチド配列分析の結果を図１に示す。ｃＤＮＡ配列の概念的翻訳から、７ ９４アミノ酸の主要オープンリーディングフレームの存在が明らかとなり、ヌク レオチド２５９で翻訳が開始される（フレーム内停止コドンは６０ヌクレオチド 上流に存在する）ことが推定された。推定される開始メチオニンコドンは翻訳開 始にとって比較的標準的な環境中（Ｋｏｚａｋ、　Ｍ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ、 　Ｒｅｓ、。

１５：８１２５−８１４６．１９８７）に位置しており、おそらくシグナルペプ チドとして機能する典型的疎水性アミノ酸群がこれに続く。”−３、−１”ルー ル（ｗｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、　Ｇ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ、　Ｒｅｓ、、　１４ ：４６８３−４６９０、１９８６）に従えば、残基２０および２５がいずれも成 熟タンパク質のＮ末端を構成する候補となりつる。第２の疎水性アミノ酸群はア ミノ酸１４３から１６６に見られ、一連の高荷電残基がこれに続き、これは多く の腹積かけ（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）　ドメインに関連して見ら れる停止−移動シグナルと一致する。タンパク質の予測される細胞内ドメインは 、お互いに４４％の配列同一性を有する２つのタンデムリピートからなる（残基 ２５９−４８６および５５２−７７６）。これらのリピートのそれぞれは、以前 記載されたトランスメンブランＰＴＰａｓｅＣＤ　４５　（Ｒａｌｐｈ、　Ｓ、 Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、前出）およびＬＡＲ（Ｓｔｒｅｕｌｉ、　Ｍ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　１９８８．前出）の細胞内触媒ドメインと有意な配列同一性を示す（そ れぞれ４５％および５３％のアミノ酸配列が同一）。

これとは対照的に、ＥＭＢＬおよびＧＥＮＢＡＮＫデータベースには、コードさ れるタンパク質の推定細胞外ドメインの既知の配列と有意な相同性を示すものを 含まない。細胞外ドメインの特徴は、セリンおよびトレオニン残基の極めて高い 含量（〉３２％）、システィン残基の非存在並びに８個のＮ−結合グリコシル化 しうる部位の存在を含む。

単離されたｃＤＮＡは、新規な型の細胞外ドメインをもつ新しいトランスメンブ ランＰ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅファミリーをコードすることが結論された。そのレセプ ター様の構造と、本実験の結果からこのファミリーの別のものがさらに発見され る可能性があることから、このタンパク質をｍｕＲ−ＰＴＰａｓｅ−ａ（ｍｕｒ ｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈ ａｔａｓｅ−ａ）　と命名した。

実施例ＩＩ マウスＲ−ＰＴＰａｓｅ−α遺伝子の染色体分布ＳＴＳ／Ａ、０２０／Ａ、、Ｃ ＸＳおよびＯＸＡ組換え同種交配（ＲＩ）マウス、並びにＣＸＢ　ＲＩ株Ｎ、Ｏ ，Ｐ、ＱおよびＲは、Ｄｒ、Ｊｏ　Ｈｉｌｇｅｒｓ（Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａ ｎｄｓ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）から恵与された。その他の全ての 同種交配マウスはＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（Ｂａｒ　Ｈａｒｂ ｏｒ、Ｍａｉｎｅ）から購入した。

戻し交雑（Ｂ　Ｃ）動物はＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した 同種交配の原種との間でＮｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいて交配 した。全ての交配において雌親を第１代トシ、Ｆ　１　ト名付けた。ＡＫＸＤＳ ＡＫＸＬ、ＢＸＤ、ＢＸＨおよびＧ、Ｈ，Ｉ　５ＷＸＬ　２１株からの、並びに ＣＸＢ。

Ｒ１株り、Ｅ、Ｇ、Ｈ１■、ＪおよびＫからの膵臓ゲノムＤＮＡはＪａｃｋｓｏ ｎ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＤＮＡ　Ｒｅ５ｏｕｒＣｅから購入した。その他の 全てのマウスについては、ブロテａｓｅ消化、フェノールおよびクロロホルム抽 出、およびエタノール沈殿などの標準法によって肝臓の組積からゲノムＤＮＡを 調製した。文献（Ｓｉｌｖｅｒ、　Ｊ、、　Ｊ、　Ｈｅｒｅｄ、、　７６：４３ ６−４４０．１９８５）に詳述するように、標準法を少し変更したサザンプロッ ト分析にマウスゲノムＤＮＡを付す。Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ−αの細胞内ホス ファターゼドメインに対応する１、８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片、並びにその細胞外 およびトランスメンブランドメインに対応する０、７ｋｂのＳａｃ　Ｉ　Ｉ−Ｅ ｃｏＲＩ断片をブルースクリプトＫＳベクターにクローニングして、それぞれプ ラスミドｐ１０９およびｐ９２３を作成した。

Ｉ　ｌ−１α（インターロイキン−１アルファ）遺伝子座と関連するＤＮＡ制限 断片長変異型を、文献に記載されているようにサザンブｏット法（Ｄ’Ｅｕ５ｔ ａｃｈｉｏ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎ＋ｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　２６： ３３９−３４３．１９８７）で検出した。マーカ一対のｌ：１分離から得られる 偏差の有意性を５ｉｌｖｅｒおよびＢｕｃｋｌｅｒのＢａｙｅｓｉａｎ法から計 算した（Ｓｉｌｖｅｒ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ。、　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＪ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：１４２３−１４２７．１９８６；　Ｂｌ ａｎｋ、　Ｒ，Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１２０＋１０７３− １０８３．１９８８）　０地図上の距離を＊　Ｂ−Ａ、　Ｔａｙｌｏｒの方法（ Ｍｏｒｓｅ、　Ｈ，Ｃ，ＩＩＩ、編集Ｏｒｉｇｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｎｂｒｅｄ　Ｍ ｉｃｅ、　Ａｃａｄｅｎ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７８ ．　ｐｐ、４２３−４３８）に従い、２１株の組換え分画測定から算出し、５ｉ ｌｖｅｒの方法（１９８５、前出）によりその関連９５％二項信頼限界（ｂ　ｉ 　ｎｏｍｉ　ｎａｌ　ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ　１１ｍ１ｔｓ）を計算した。Ｄ。

Ｂ１５ｈｏｐの方法（Ｇｅｎｅｔ、　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ、、　２：３４９−３ ６１．１９８５、等式１）によりマーカー３つの順序の可能性を計算した。コン ピュタ−処理はＶＡＸ６０００−４１０コンピュタ−で行った。

マウスの同種交配株からのゲノムＤＮＡのサザンプロット分析によって、２つの 有用な制限断片長夜異型が明らがとなり、１つはｍｕＲ−ＰＴＰａｓｅ　−ａ　 （ｐ　１０９）の細胞内ドメインニ対応するプローブで見ることができ、他の１ つは細胞外およびトランスメンブランドメインプローブ（ｐ　９２３）で見るこ とができた。

結合すると、これらの変異型によって、検索したマウスのｌＯの同種交配株中に ｍｕＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの３つの対立遺伝子型が同定された（表１）。

表１ ｍｕＲ−ＰＴＰａｓｅ−αプローブによって検出された制限断遺伝子　ｐ　１０ ９　ｐ　９２３ ａ　９．４　５．９＋　４．２　ＢＡＬＢ／ｃＪｂ６．５　４．２＋１．８　Ｃ ５７ＢＬ／６Ｊ、、Ｃ５７Ｌ／Ｊ、ＤＢＡ／２Ｊｃ　６．５　５．９＋４．２　 Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、０２０／Ａ、　ＡＫＲ／Ｊ、ＳＷＲ／Ｊ、　ＳＪＬ／Ｊ、　Ｓ ＴＳ／ＡＴａｑＩ制限エンドヌクレａｓｅで消化した肝臓ゲノムＤＮＡをサザン プロットで分析した。断片の大きさはキロベースで示す。

ＲＩエマウスおけるこれらの対立遺伝子の遺伝を測定した。Ｒエマウスにおける 既知の染色***座位のその他のマーカーで観察されたものと比較したｍｕＲ−Ｐ ＴＰａｓｅ−αでの株分布パターン（表２）は、染色体２上でのｍｕＲ−ＰＴＰ ａｓｅ−ａとｌｌ−１ａ（インターロイキン−１アルファ）との間の緊密な連鎖 を示唆した（検索した８９のうち３つのＲ１株で）。この−政変は、もしも遺伝 子座が連鎖していない場合に起こる可能性の０．０Ｏ００１よりも小さい。観察 された組換え株の分画から、遺伝子座の間の地図距離は０．９ａＭであることが 示された（９５％信頼限界　０．２−０．　６ａＭ）。

表２ マウスゲノムにおけるｍｕＲ−ＰＴＰａｓｅ−αおよび１ｌ−１ａ　ＤＮＡ配列 変異型の遺伝 Ｒ−ＰＩチーα　ＤＤＤＡＤＡＡＤＡＡＤＡＤＡＤＡＤＡＤＡＤＡ＾＾Ｄ！ＧＨ ＩＪＩＣ）１０ＰＱＲ１２３４５ｇ７８９０１２３４ＴａｑＩで消化したＤＮＡ のサザンプロットにより、Ｒ１株をｍｕＲ−ＰＴＰａｓｅ−ａおよびＩｆ−１ａ の対立遺伝子に分けた（表１およびＤ’Ｅｕ５ｔａｃｂｉｏ、　Ｐ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　１ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｅｓ　２６：３３９−３４３゜１９８７参照 ）。ＡＫＸＤ、ＣＸＢ株Ｄ−に、およびＢＸＨマウスのｌＮ−１ａ対立遺伝子は Ｄ’　Ｅｕ５ｔａｃｈｉｏら、前出に記載されている。全てのＲＩマウスは各遺 伝子座における原種株対立遺伝子のうちの１つのホモ接合体である。対立遺伝子 は以下の親株に対応する大文字で示す：　Ａ、　ＡＫＲ／Ｊ　；　Ｂ、　Ｃ５７ ＢＬ／６Ｊ　；　Ｃ，ＢＡＬＢ／ｃ　；Ｄ、ＤＢＡ／２Ｊ　；Ｈ，Ｃ３Ｈ／Ｈｅ Ｊ　；Ｊ、ＳＪＬ／Ｊ　；Ｌ、Ｃ５７Ｌ／Ｊ　；　Ｓ、ＳＷＲ／Ｊ　；　Ｔ、Ｓ ＴＳ／Ａ。

Ｃ５７ＢＬ／６ＪとＳＷＲ／Ｊ株との間の相互戻し交雑による子孫におけるｍｕ Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−ａ、ｌｌ−１ａおよび見（ノンアグーチ：ｎｏｎａｇｏｕｔ ｉ）の遺伝の追跡調査によって、ｍｕＲ−ＰＴＰａｓｅ−ａとｌｌ−１ａとの連 鎖が確認され、２つの遺伝子の順序を示唆した（表３）。１５０の子孫のうち、 １４はｍｕＲ−ＰＴＰａｓｅ−αとａとの間の組換えであり、１つはｍｕＲ−Ｐ ＴＰａｓｅ−αと１ｌ−１ａとの間の組換えであった。もしも遺伝子座がセント ロメア・Ｉ　１−１　ａ−ｍｕＲ−ＰＴＰａｓｅ−α・ａの順序であるならば、 二重交差が全く起こらないことになり；これ以外の順序ならばｌまたは１４のこ のような事象を要することになり、Ｂ１５ｈｏｐの方法（前出）から計算して、 少なくとも９．５倍ありそうにない。ｌｌ−１ａとｍｕＲ−ＰＴＰａｓｅ−ａと の距離、０．　６　ｃＭ　（９５％信頼限界：０．ｌ−２゜４ａＭ）は、ＲＩ株 のデータから計算される距離とサンプリング変動の範囲内で一致する。この結果 を最近Ｂｍｐ−２ａ（骨形態タンパク質２ａ：ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉ ｃ　ｐｒｏｔｅ　ｉ　ｎ　２　ａ　；　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｍ、Ｅ、　ｅｔ 　ａｔ、、　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　６：５０５−５２０゜１９９０）で得られた結 果と比較して、２つの遺伝子の間には明瞭な構造的相同性がないが、これら２つ の遺伝子は緊密に連鎖して（することか示唆された。

Ａ、Ｆｌ親からの対立遺伝子の組み合わせ、並びに実際に観察されたＣ５７ＢＬ ／６Ｊ由来（ｂ）およびＳＷＲ／Ｊ由来（ｓ）対立遺伝子の数 遺伝子座　可能な対立遺伝子の組み合わせ　Σｂ　Σ５ＩＩ−１ａ　ｂｓ　ｂｓ 　ｂｓ　ｂｓ　７６　７４Ｒ−ＰＴＰ−ａ　ｂ　ｓ　ｂ　ｓ　’ｓ　’ｔ　″” ５ｂ７７７３ａ　ｂｓ　；ｂｓｂｂｓ　６９８１ Ｂ、それぞれの可能な対立遺伝子の組み合わせを遺伝したそれぞれの戻し交雑か らの子孫の数 戻し交雑　子孫の数 Ｆ＋ｘＢ　４４４３　９１　０１　００（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ　ｘ　ＳＷＲ／Ｊ） Ｆ＋（Ｆｌ）およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ　（Ｂ）マウスの間のＢＣから得た１５０ の子孫について、ノンアグーチ（ａ）マーカーの遺伝を肉眼で型に分け、ｍｕ　 Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ−αおよびｌｌ−１ａの対立遺伝子をサンプリングで調 べて分類した。

実施例■ マウスＲ−ＰＴＰａｓｅ　−ａ　ＲＮＡの発現１、ノーザン分析 文献記載の方法（Ｖｅｎｎｓｔｒ５ａ＋、　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　 ２８：ｌ３５−１４３．１９８２）によるオリゴ（ｄＴ）選択により、成人マウ ス組織および細胞系からポリＡ”　ＲＮＡを調製し、ホルムアルデヒド含有ゲル 上で分画しくレーン当たり５μｇ）、標準法を用いてニトロセルロース（Ｈｙｂ ｏｎｄ　Ｃ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移しとった。

”Ｐ−ｄＡＴＰの存在下に、アニールしたＴ７プライマーからの伸長を行うため のＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントを用いて、ブルースクリプト・ベ クターのＥｃｏＲＩ部位にアンチセンスの方向にクローン化した全ラムダ−１０ ９ｃＤＮＡからなる１重鎖鉾型上で、プライマー伸長法により３寸標識プローブ を調製した。５０％ホルムアルデヒド、５ｘＳＳＣ１２５ｍＭＫＰ　Ｏ＋、５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ、１０Ｒｇ／ｍｌサケ***ＤＮＡ、および１０％硫酸塩 中、４２℃で／’％イブリダイゼーションを行った。洗浄はｏ、ｔｘｓｓｃ、ｏ 、ｉ％ＳＤＳ中で４８℃で行った。フィルターを高緊縮条件（５８℃）で洗浄し ても、ハイブリダイゼーション・パターンに検知し得る影響を与えなかった。

２、マウスＲ−ＰＴＰａｓｅ−αタンパク質の発現ファージ・ラムダ−１０９か らの全ｃＤＮＡ挿入物を部分的ＥｃｏＲＩ消化によってファージから１断片とし て放出し、ブルースクリプトＫＳベクター中にクローン化した。非翻訳リーダー 配列の大半を欠＜ｃＤＮＡ断片（位置２２６にある５ａｃ１１部位から開始する ；図１ｂ参照）を、ＳＶ４０プロモーターを入れたｐＬＳＶ−ベクターにサブク ローニングしくＬｉｖｎｅｈ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２６１：１２４９０−１２４９７．１９８６ ）　、得られたプラスミドＤＮＡ　（ｐＬＳＶ−ＦＴＰ−α）をＤＥＡＥ−デキ ストラン法によってＣＯ８細胞にトランスフェクションした（Ｌｏｐａｔａ、　 Ｍ、Ａ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ、　Ｒｅｓ、、　１２：５７０７−５７１７ ．１９８４）　ｏ　Ｎ末端を切ったｍ　ｕ　Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ−αタンパ ク質をコードする発現ベクターｐＬｓＶ　Ｃを免疫沈降試験の対照として用いた 。

３、結果 各種のマウス組織からのポリＡ”　ＲＮＡを調製して、ｍ　ｕ　Ｒ−ＰＴＰａｓ ｅ−α遺伝子の発現を研究した。ノーザン分析（図２）によって広範な発現パタ ーンが明らかになった。膵臓を除く試験した全ての組織に３．ＯｋｂのｍＲＮＡ が存在し、脳と腎臓が最も高い発現レベルを示した。同様の大きさのｍ　ＲＮ　 ＡがＮＩＨ−３Ｔ３マウス繊維芽細胞系２．２、およびプレプロ−Ｂリンパ球系 ＢＡＦにも観察された（図２）。ノーザンプロットを短時間さらすと、別の非常 によく似た大きさく３．２ｋｂ）の第２のｍＲＮＡ種が幾つかの組織（例えば脳 ）で少量存在することを明らかに示した。ｃＤＮＡ配列の３′末端にポリＡテイ ルおよびポリアデニル化シグナルは観察されなかったが、単離したｃＤＮＡクロ ーン（２８７２ヌクレオチド）はｍＲＮＡの全長にほぼ一致することもデータは 示唆している。

実施例ＩＶ マウスＲ−ＰＴＰａｓｅ−αタンパク質の過渡的発現！、抗体の調製および免疫 沈降 カップリング試薬としてＥＤＣＩ　（１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピ ル）カルボジイミド）を用いてＢＳＡとカップリングさせたｍｕＲ−ＰＴＰａｓ ｅ−αタンパク質の予測されるＣ末端（残基７７７−７９４）に対応する合成ペ プチドをウサギに注射した。抗原は１ｍｇのペプチドと完全フロイント・アジュ バントの懸濁液を皮肉および経皮で注射した。０．５ｍｇのペプチドと不完全ア ジュバントで３回のブースター注射を２−３週間の間隔で行った。この方法を用 いて得られた抗血清を“２Ａ”と命名した。代謝性ｘｓＳ−メチオニン標識、細 胞抽出物の調製（トランスフェクション後６０時間）およびプロティン−Ａ−セ ファロースを用いる間接免疫沈降は標準法で実施した（Ｙａｒｄｅｎ、　Ｙ、　 ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　６：３３４１−３３５１．１９８７）。

２、結果 成熟タンパク質の大きさを決定するために、ＳＶ４０プロモーターの制御下に、 非翻訳リーダーの大半を除いて、ｍｕＲ−ＰＴＰ−ａｓｅ−ａをｐＬＳＶベクタ ー中にクローニングして（Ｌｉｎｖｎｅｈ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１：１２４９０−１２４９７．１９８６）　、発現 ベクターｐＬＳＶ−ＰＴＰ−αを得た。このベクターをＣＯ８細胞にトランスフ ェクションし、６０時間後に３ｓＳ−メチオニン標識された全細胞抽出物を抗血 清２人を用いて調製して、免疫沈降に用いた。

図３から明らかなように、抗血清は幾つかのバンドを認識し、そのうちの１つで ある拡散した１３０ｋＤａのバンド（矢印）はトランスフェクションされた細胞 からの免疫沈降（レーン５）にのみ存在し、モック・トランスフェクションされ た細胞（レーン３）（ｍｕＲ−ＰＴＰａｓｅ　−ａ　ｃＤＮＡのないｐＬＳＶで トランスフェクションされた）がらの免疫沈降には存在しなかった。

沈降は免疫感作に用いたペプチドで競合された（レーン６）。

ｍｕＲ−ＰＴＰａｓｅ−ａの予測される分子量（８８ｋＤａ）と実測分子量（１ ３０ｋＤａ）との差は、著しいグリコジル化によるものである。

抗血清の特異性の別の制御として、ｍｕＲ−ＰＴＰａｓｅ−αｃＤＮＡのＮ末端 切断形（アミノ酸２１４がら始まり、したがってトランスメンブランおよび細胞 外ドメインを欠く）を同じベクター中に入れたものでもｃｏｓ細胞をトランスフ ェクションした。

このベクターでトランスフェクションした細胞がらの免疫沈降で、５５ｋＤａの 見かけ上の分子量をもつ新規で大量のタンパク質が観察され、これを再び抗原性 ペプチドと競合させた（レーン７および８）。成熟ｍｕＲ−ＰＴＰａｓｅ−αと 比較してのＮ末端切断形タンパク質の豊富さは、複数の独立したトランスフェク ション実験での結果と一致した。

実施例■〜ＩＶに関する一般的議論 上記の実施例は広範な発現パターンをもつ新規なレセプター様ＰＴＰａｓｅ　、 　Ｒ−ＰＴＰａｓｅ　−ａの同定を記載したものである。

したがって、Ｒ−ＰＴＰａｇｅは、従来ＣＤ４５の研究をもとにして考えられて いたようなリンパ球細胞活性の調節以外の広範な機能を有することが期待される 。

ＣＤ４５タンパク質の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体を用いる研究 によって、Ｒ−ＰＴＰａｇｅの架橋が様々な細胞活性に重大な影響を及ぼし得る ことを示したが、Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅ酵素活性に対する影響はまだ研究の余地が ある。しかしながら、リガンド誘導のレセプターの凝集が、レセプター・チロシ ン・キナーゼによるトランスメンブラン・シグナリングの中心的な出来事である ので（Ｕｌｌｒｆｃｈ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、前出）　、Ｒ−ＰＴＰａｓｅの ための推定的細胞外リガンドがｉｎ　ｖｉｖｏでのＲ−ＰＴＰａｓｅの活性を調 節する能力をもつことを本発明者らは提案する。

レセプター・チロシン・キナーゼ（ＰＴＫ）について提案されたのと類似の方法 で、Ｒ−ＰＴＰａｇｅは、先祖式々のＰ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅドメインと、細胞外リ ガンドと結合し得るドメインとの複数の遺伝子融合を経て生じたものだと提案す ることができる（Ｕｌｌｒｉｃｈ。

＾、　ｅｔ　ａｌ、　；　Ｒａｎｋｓ、　Ｓ、に、　ｅｔ　ａｌ、、前出）。

Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅ　ドメインと結合してレセプター様タンパク質を形成し得る 細胞外ドメインの多様性が、同様のメカニズムで作用し得る可能なリガンドの範 囲と対応することが期待される。本明細書に開示したようなりローン化Ｒ−Ｐ　 Ｔ　Ｐ　ａｇｅの入手可能性は、その基質特異性を決定するうえで、またその機 能を理解しその活性を操作するうえで有用である。

Ｒ−ＰＴＰａｇｅは主要なチロシン・キナーゼ基質に対する広範な特異性を有し ており、その異なる細胞外ドメインが、細胞外環境における異なるシグナルに応 答する異なる調節メカニズムを可能にする主な原因である。この観点に基づいて 、レセプター・タンパク質、千ロジン・キナーゼを通して作用するこれらのポリ ペプチド成長因子に対して細胞の応答性をＲ−ＰＴＰａｓｅが変えることが予期 される。ＰＴＫではリガンド結合が酵素活性の活性化を導く。これから考えると 、Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−α並びにその類似分子はネガティブな成長調節物質であり 、劣勢がん遺伝子と考えることができる。

例えば、Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−αが位置するマウス染色体２の部分を欠失すると、 Ｓ　Ｊ　Ｌ／Ｊマウスにおける放射線誘導の骨髄白血病（Ｔｒａｃｋｔｅｎｂｒ ｏｔ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　２：５４５−５５０．１９ ８８）の初期症状を呈し、これは劣勢がん遺伝子の概念と一致する。さらに、ヒ トＲ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ−α遺伝子が位置するヒト染色体２ｏに係る再配置は ヒトリンパ球白血病と結び付けられてきた（Ｍｉｔｅｌｍａｎ、Ｆ、（編集）　 Ｃａｔａｌｏｇ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ａｂｅｒｒａｔｆｏｎｓ　ｉｎ 　Ｈｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ、　Ａ、　Ｌｉ５ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。

あるいは、Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−ａは、ＣＤ４５とｃ−１ｃｋとの間の相互作用に 対して提案されたのと同様の方法で作用するのかも知れないＣＯｏｓｔｅｒｇａ ａｒｄ、　Ｈ，Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８６：８９５９−８９６３．１９８９；　Ｍｕｓｔｅｌｉ ｎ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、 　ＵＳＡ　８６：６３０２−６３０６．１９８９）　、この観点からすると、Ｒ −Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ−αは、レセプターではなく、かっｌｃｋよりも広く発現 している膜関連のＰＴＫにおけるネガティブな調節部位（例えば、ｐｐ６０°− °におけるｔｙｒｓ！？など）を脱リン酸化する。このように作用することによ り、Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−αはポジティブな成長コントロールおよび分化に関与す るであろう。

本発明者らは何ら特定の理論に拘泥するつもりはないが、各種レセプター・Ｆ　 Ｔ　Ｐ　ａｇｅの触媒ドメインにおける高い種間保存は、細胞成長のコントロー ルにおけるこれらレセプターの重要な役割を示唆する。

実施例Ｖ ヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ　ｃＤＮＡの単離および特徴（Ｋａｐｌａｎ、　Ｒ。

ｅｔ　ａＪ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８ ７：７０００−７００４．１９９０）Ａ、材料 制限エンドヌクレアーゼおよび修飾酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍｎｎｈｅｉ ｍまたはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。Ｔａｑ　ＤＮ ＡポリメラーゼはＰｅ　ｒｋ　ｉ　ｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓから購入した。

全ての配列決定に用いるプライマー、並びにポリメラーゼ・チェーン・リアクシ ョンに用いるラムダｇｔｌｌ前向きおよび逆向きプライマー（２４−ｍｅｒｓ） は、メトキシまたはβ−シアノエチルホスホアミダイトを用いて、自動ＤＮＡ合 成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、モデル３８０Ａ）で合成した（ Ｈｏｕｓｅ、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２ニ ア７２−７７７、１９８７）　、ラムダｇｔｌｌヒト脳幹ｃＤＮＡライブラリー はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（寄託番号３７４３２）から 得た。ライブラリーのスクリーニング用プローブとして用いるＬＣＡ　（ＣＤ４ ５）クローンはＥ、Ｈ，Ｆｉｓｃｈｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｓ ｈｉｎｇｔｏｎ、　５ｅａｔ　ｌｅ）から恵与された。全ての配列決定反応はシ ーケナーゼキット（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を 用いて行った。

Ｂ、方法 １日齢のヒト幼児脳幹のラムダｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーから得た約３０ ０．０００プラークを、両方の保存ホスファターゼドメインにまたがるニック・ トランスレーションしたＬＣＡプローブを用いて、ゆるやかな緊縮条件でふたつ のニトロセルロースフィルター上でスクリーニングした（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａ ｕ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．前出）。０．２５％無脂肪ドライミルク 、０．１％ＳＤＳ、およびｌＯ’ｃｐｍ／ｍｌの３１ｐ標識ＬＣＡプローブを含 む５ｘ　５ＳＰＥ溶液（ＳＳＰＥは１０　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｈｔ　Ｐ　Ｏ４、ｐ Ｈ７，４１０，１８Ｍ　ＮａＣ！／１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中、５５℃で一部ハイブ リダイゼーションを実施した。フィルターを２ｘ　５ＳＰＥ１０．２Ｎ　ＳＤＳ 中、５５℃”２？２０分間、３回洗浄し、次いでオートラジオグラフィーに付し た。このスクリーニングにより７９個の二重にポジティブなものが得られ、その うちのＬＣＡプローブと種々の程度のハイブリダイゼーションを示した１２個を 、同じプローブを用いて繰り返しスクリーニングすることによってプラーク精製 した。次いでｃＤＮＡ挿入物の大きさを決定するために、ポリメラーゼ・チェー ン・リアクションを用いた（Ｓａｉｋｉ、　Ｒ，に、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉ ｅｎｃｅ　２３０：１３５０−１３５４．１９８５）。

各精製プラークからの溶出物の部分からなるＤＮＡ鋳型を７５℃、１５分間加熱 してＤＮＡを放出させた。鋳型にラムダｇｔｌｌ前向きおよび逆向きプライマー を付けた。反応混合物（０，１ｍ１）を文献記載の方法により調製した（Ｄｉｏ ｎｎｅ、　Ｃ，Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　！１ｆｏｔｅｃｈｎｆｑｕｅｓ　８：１ ９０−１９４．１９９０）　。自動Ｐｅ　ｒｋ　ｉ　ｎ−Ｅ　１ｍｅ　ｒ／Ｃｅ ｔｕｓ　ＤＮＡ熱サイクラ−中で増幅を３０サイクル行い、各サイクルは９４℃ で１．５分変性、６５℃で２分アニーリング、および７２℃で４分伸長した。各 サンプルの一部（１５μｍ）をｌμｇ／ｍｌのエチジウムプロミドを含む１％ア ガロースゲルで電気泳動して分析した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、、前出 ）。ラムダソルブ（ＬａｍｂｄａＳｏｒｂ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて４つの 最大クローンからＤＮＡを調製し、次いでＥｃｏＲＩで消化した。

配列決定のために断片を別々にＭｌ　３ｍｐ　１８のＥｃｏＲ１部位にサブクロ ーニングした。ヌクレオチド配列は、修飾Ｔ７ポリメラーゼ（Ｔａｂｏｒ、　Ｓ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　 ８４：４７６７−４７７１．１９８７）を用いてジデオキシヌクレオチド鎖末端 法で決定した（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６３−５４６７、１９７７）。

配列データに関する全てのコンピューター分析はＩｎｔｅｌ　１ｉＧｅｎｅｔｉ ｃｓの書いたプログラムを用いてＭｉｃｒｏＶＡＸＩＩで行った。ＤＮＡ配列を 分析してＧＥＬプログラムを用いて組み立でた。タンパク質の疎水性分析は、Ｋ ｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのアルゴリズム（Ｋｙｔｅ、　Ｊ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、　１５７：１０５−１３２．１９８２）に基づき、ＰＥＰプログラ ムで行った。タンパク質配列順はＧＥＮＡＬＩＧＮプログラムを用いて行った（ Ｓｏｂｅｌ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　５ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、 、　１４：３６３−３７４゜１９８５；　Ｋａｒｌｉｎ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｍｏ１．　Ｂｊｏｌ、　Ｅｖｏｌ、、　１：３５７−３７０．１９８４；　 ＮｅｅｄＪｅｍａｎ、　Ｓ、Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ 、、　４８：４４３−４５３．１９７０）。

最初の順序付けはＪｉｍｅｎｅｚ−Ｍｏｎｔａｎｏプロティンアルファベットを 用いて行った（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍｏｎｔａｎｏ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ ｒｏｃ、　７ｔｈ　Ｉｎｔ’ｌ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、　 １９８１．　Ｍｅｘｉｃｏ　Ｃ１ｔｙ）。

Ｃ０結果 Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅファミリーの新たなメンバーを同定するために、ラムダｇｔ ｌｌ中のヒト幼児脳幹ｃＤＮＡライブラリーから得た３ｏｏ、ｏｏｏプラークを 、両方の保存ホスファターゼドメインにまたがるニックトランスレーションした ＬＣＡプローブを用いて、非緊縮条件でスクリーニングした。二重ポジティブな 最初の７９個のうちの４個を完全に配列決定した。２つのクローン、３１−４お よび２７−１はαと命名したヒトＲ−ＰＴＰａｇｅ　（ｈｕＲ−ＰＴＰａｓ　ｅ ）の全長コーディング領域のオーバーラツプする部分を含んでいた（図４Ｂ）。

クローン３１−４と２７−１を組み合わせた長さは３６１５ｂｐ（図４Ａ）であ り、８０２アミノ酸のタンパク質をコードしており（図４０）、さらに５′およ び３゜非翻訳領域にそれぞれ６９５ｂｐおよび５１０ｂｐを含む。４個のクロー ンのうちの２個は、βおよびγ（ガンマ）と命名したさらに２つのＲ−ＰＴＰａ ｇｅをコードする遺伝子部分を含む（図５）。

Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ−αと同様、これら２つのタンパク質は典型的な疎水性 トランスメンブラン領域と、別個の細胞外ドメインとを含み、これらが別のＲ− ＰＴＰａｇｅであることを示唆する。

この遺伝子と相同なマウス由来のものをヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−αと同時に配列 決定した（前記実施例１−ＩＶ参照）。マウスとヒトタンパク質の比較を図４０ に示す。いくらかの多様性の存在する細胞外ドメインを除けば、２つの多様性は ５残基が異なるのみである。ヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの構造を検討したところ 、該領域中に１個のシスティンのみをもつ疎水性シグナルペプチドを含む１５０ 残基からなる比較的短い細胞外ドメインが明らかとなった。Ｎ−グリコジル化を 生じ得る部位は８個あり、またＯ−グリコジル化を生じ得る部位は多数存在する （このドメインにはセリンおよびトレオニンに富むので）。Ｒ−ＰＴＰａｓｅ− α、ＬＣＡ、およびＬＡＲは構造的に無関係であるように思われる。両側を荷電 した残基で固着された疎水性トランスメンブラン領域が存在する。これに続いて それぞれ約２３５残基の一列に並んで繰り返す２つの保存性ホスファターゼ・ド メインがあり、この２つのは５７アミノ酸によって隔てられており、これはＬＣ ＡＳＬＡＲのようなＲ−ＰＴＰａｓｅ類、並びに２つのショウジヨウバエＰＴＰ 　ａｓｅであるＤＬＡＲおよびＤＰＴＰに典型的な特徴である。

図５Ａおよび５Ｂは、それぞれＬＣＡ並びにＲ−ＰＴＰａｓｅａ、βおよびγ（ ガンマ）の第１と第２保存性ホスフアターゼ・ドメイン間のアミノ酸配列を示す 。４つのＲ−ＰＴＰａｇｅのうち、βとγが最もよく配列が似ていることが容易 に見て取れる。ＰＴＰａｓｅ　ＩＢ、ＬＣＡ、ＬＡＲ，ＤＬＡＲおよびＤＰＴＰ （７）保存性ホスファターゼ・ドメインの配列のうち、２９残基が不変であるこ とが報告されている（）Ｉｕｎｔｅｒ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、前出）。これら の残基の多くはＲ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ−α、βおよびγの両方のホスファター ゼドメインにも存在するが、βおよびγの第２の保存性ホスファターゼ・ドメイ ンは、ＬＣＡのホスファターゼ・ドメイン２にある１０４および２０１位の２つ のシスティンを含むこれらのアミノ酸の多くを欠いていることは興味深い。

Ｄ、議論 本明細書で同定された３つのヒトＲ−ＰＴＰａｇｅ（α、βおよびγ）の保存性 ホスファターゼ・ドメインの配列をお互いに比較し、またＬＣＡ、ＬＡＲ，並び に２つの可溶性ＰＴＰａｇｅである胎盤ホスファターゼＩＢおよびＴ細胞ＰＴＰ ａｓｅの配列と比較した（表４）。２つの可溶性酵素は７０％の配列同一性を有 していたが、それぞれをＲ−ＰＴＰａｇｅ（ホスファターゼドメインＰＤｌまた はＰＤ２）と比較すると、この数字は２９−４２％に落ちる。全ての場合におい て、可溶性Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅはＲ−ＰＴＰａｓｅのＰＤ２よりもＰＤＩとより 多くの同一性を示した。Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−αは、そのＰＤＩ配列がＬＡＲと５ ６％同一であり、ＰＤ２配列は５２％同一であるので、ＬＡＲと最も関連してい るように思われる。Ｒ−ＰＴＰａｓｅ類およびγの保存性ドメインはお互いに最 も関連しており、２つの可溶性Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅβおよびγがＰＤＩおよびＰ Ｄ２の双方で７５％同一であるよりももっと関連している。一般に、いかなるＲ 　−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅでもそのＰＤＩとＰＤ２の間の配列関連性はそのファミ リーの異なるもの同志の間に見られる関連性よりも高くないのは興味深いことで ある。例えば、高いものでＬＡＲのＰＤＩとＰＤ２領域の間の同一性は４７％で あり、低いものではＲ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅγでは２９％である。

Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−α、βおよびγの細胞質ドメインは高度に保存されているが 、これらレセプターの細胞外ドメインはお互いに関連がなく、またＬＡＲおよび ＬＣＡの細胞外ドメインとも関連がない。このことはこれらレセプターのそれぞ れが別々のリガンドをもっていることを示唆する。これらリガンドのＲ−ＰＴＰ ａｇｅへの結合が、ＰＴＫａｓｅ活性を示す成長因子レセプターとともに、シグ ナルトランスダクションに関与する標的タンパク質のチロシンリン酸化の調節に 決定的な役割を果たしているようである。本明細書に記載するＲ−ＰＴＰａｇｅ の多様性が多重遺伝子ファミリーの存在を明らかにするものである。これらの膜 レセプター間の構造と機能の関係をより理解することが、細胞成長、分化、およ び発癌に関与するメカニズム解明への重要な洞察を提供する。

保存性ホスファターゼドメイン間の同一性（％）−丁Ｆ＋１１１１ 保存性ホスファターゼ・ドメインの並び方は前記の方法で決定した。比較した領 域は図４０および図５に示す。ＰＤはホスファターゼドメインを表す。

実施例ＶＩ ノーザンプロット分析によるヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの発現全ＲＮＡ２０μｇ またはポリ（Ａ）＋ＲＮＡ２μｇを含むサンプルをホルムアルデヒド／アガロー スゲル中に溶解し、ニトロセルロースに移し取った。Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ− αおよびβ−アクチンプローブをランダムプライミングによって標識した（Ｓａ ｍｂｒｏｏｋｅｔ　ａｌ、、前出）。前述したように６５℃でハイブリダイゼー シ諌ンと洗浄を行った（Ｃｈｕｒｃｈ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１：１９９１−１９９５．１９８４　）　、このＲ−ＰＴ Ｐａｓｅ　−ａとハイブリダイズしたプロットを、−８０℃、７２時間、増感板 とともにＸＡＲ−２−Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）にさらした。同じ条件で１５ 時間後にアクチンプローブ・プロットからの結果を得た。

Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−αの発現を種々の細胞系および組織で試験した（図６）。結 果は、それぞれ約４．３ｋｂおよび６．３ｋｂの２つの主要Ｒ−ＰＴＰａｓｅ− 転写物の存在を示唆する。この２つのうちの大きい方は胎児組織により広く存在 し、特にポリ（Ａ）＋胎児肝臓サンプルに顕著であり、ここには４．３ｋｂの転 写物も相対的に最も高い量が存在した。２つの転写物の発現が個別に発生的に調 節されており、また／あるいはＬＣＡで見られるように（Ｒａｌｐｈ、　Ｓ、Ｊ 、前出）、別のスプライシングメカニズムによる結果かも知れない。成人の脳は Ｒ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ−αの発現が相対的に少ない。この結果は、Ｒ−ＰＴＰ ａｓｅ−ａがある程度、多くの組織で発現していることを示唆する。マウスＲ− ＰＴＰａｓｅ−αもまた、多くの組織および細胞系で発現し、脳および腎臓で最 も多く発現することが観察された（Ｓａｐ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｆ、　ＵＳＡ　８７：６１１２−６１１６．１９９０；前述の 実施例ＩＩＩおよびＴＶも参照されたい）。

実施例ＶＩＩ ヒ）Ｒ−ＰＴＰａｇｅ−α遺伝子の染色体局在化本研究で用いた親細胞と体細胞 とのハイブリッドの単離、増殖および性質については既に文献に記載されている （Ｄｕｒｓｔ、　Ｍ、　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４：１０７０−１０７４．１９８７；　Ｋｕ、　Ｄ−Ｈ６Ｉ ！ｔ　ａｔ、、Ｓｏｍａｔｉｔ：　Ｃｃｌｉ　Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅｔ、１５：２ ９？−３０７，１９８９；　Ｊｕａｎ、　Ｃ−Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｅ、 　Ｎａ目、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８５：８９１０−８９１３．　１ ９８８）　、特定のヒＩ−染臼体またはに包体領域の存在は、特定の染色体領域 に帰せられる遺伝子のプローブを用いてＤＮＡハイブリダイゼーションによって 確認した。ハイブリッドＤＮＡを過剰の１１ｉ１７限エンドヌクレアーゼＨｉｎ ｄＩ　Ｉ　ＩまたはＥｅｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲルの電気泳動で 大きさを分け、ナイロンフィルターに移し取って、上記のようにハイブリダイゼ ーションした（Ｄｕｒｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、前出）　ｏ　Ｒ−ＰＴＰａｓｅ　− ａプローブはクローン３１−４の３゛側にある０、８ｋｂからなる（図４Ｂ参照 ）。

サザンプロット分析によって、全ヒトゲノムを表すヒト染色体領域のオーバーラ ンピング・サブセットをもつ１７個のげっし類−ヒト体細胞ハイブリッドからの ＤＮＡにおける、ヒトＲ−ＰＴＰａｇｅ−α遺伝子座の存在を調べた。結果（図 ７）は、ハイブリッド細胞中のヒトＲ−Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ−α遺伝子座の存在 が部分的ヒト染色体２０の存在とのみ相関することを示す。ハイブリッドＰＢ５ −１およびＡＢ３のそれぞれが染色体２ｏの長腕を欠き、がつＲ−ＰＴＰａｓｅ −α遺伝子座を保持しているので、Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−α遺伝子座の領域局在化 もできうろことをデータは示している。したがって、ヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−α 遺伝子は２０ｐｔｅｒ−２０ｑ１２に位置する。

ヒト染色体２０に位置する全てのヒト遺伝子と相同なマウス遺伝子はマウス染色 体２に位置することが観察されている（Ｌａｌｌｅｙ、　Ｐ、Ａ、　ｅｔ　ａｔ 、、　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、　Ｃｅｆｌ　Ｇｅｎｅｔ、　５ｆ：５０３−５３２ ．１９８９）。

これはＲ−ＰＴＰａｓｅ−ａ＋についても同様である。２：思われる（上記実施 例ＩＮ参照）。

骨髄障害および腫瘍における転座および欠失にはヒト染色体２０の長腕が関与す る（Ｔｒｅｎｔ、　Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、　Ｃｅ１ ｌ　Ｇｅｎｅｔ、、　５２：５３３−５６２．１９８９）　、ヒトＲ−ＰＴＰａ ｓｅ　−α遺伝子座は特に２０ｑの欠失に関与するのかも知れない。この場合に は、これかがんサプレッサー遺伝子あるいは抗−がん遺伝子である可能性が強く なる。Ｓ　Ｊ　Ｌ／Ｊ株におけるマウスでも同様に、染色体２の欠失が放射線誘 導の骨髄白血病の進展に関与するようである（Ｔｒａｋｈｔｅｎｂｒｏｔ、　１ ．　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　２：５４５−５５０．１９８８）。

本明細書で引用した全ての文献は、特別に包含したとしないにかかわらず、参照 として本明細書に包含される。

今や本発明を十分に記載したので、本発明の精神および範囲を逸脱することなく 、かつ過度な実験を行うことなく、均等なパラメーター、濃度、および条件の広 範な範囲内で当業者が同じことを実施できることが理解されよう。

本発明はその特定の態様に基づいて記載したが、さらに修飾が可能なことが理解 されるであろう。本出願は、本発明の原理に従う本発明の全ての変更、使用、ま たは応用を含み、また既知あるいは慣用の方法によって本発明が適合する分野内 に含まれるもの、および後述する請求の範囲に示す本発明の本質的特徴に応用で きるものは、たとえ本明細書の記載から逸脱するものであってもこれを含むこと を意図する。

Ｆｌｙ、１ ＦｃメーＹ− 要約 新規なレセプター型タンパク質のチロシンホスファターゼタンパク質または糖タ ンパク質およびそれをコードするＤＮＡが様々な哺乳動物組織において発現され る。このタンパク質ファミリーにはヒトＲ−ＰＴＰａ　ｓ　ｅ−ａ、ヒトＲ−Ｐ ＴＰａｓｅ−βおよびヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−ガンマが含まれる。Ｒ−ＰＴＰａ ｓｅタンパク質または糖タンパク質は組換え手法により生産することができる。

該タンパク質に対する抗体、該タンパク質の量の測定方法、該タンパク質に結合 して、その活性を阻害または刺激し得る化合物（例えば薬物）のスクリーニング 法も提供される。

国際調査報告 １ｍ＃ｌｍ１１＾−ｍ−＋−ｍ、　ＰＣＴ１０５９１１０４８９２Ｉｎｌ＠ｆＭ ＋−−Ａ−ｂａｎ　Ｈａ、ＰＣＴ／ＵＳ９１１０４８９２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．白血球共通抗原（ＣＤ４５）および白血球共通抗原−関連タンパク質（ＬＡ Ｒ）以外のヒトレセプター型タンパク質のチロシンホスファターゼ（Ｒ−ＰＴＰ ａｓｅ）タンパク質または糖タンパク質分子、その機能的誘導体、もしくは他の 哺乳動物におけるその同等物であって、該分子が自然界に存在するものである場 合、該分子は自然界でそれと結合している他のタンパク質または糖タンパク質を 実質的に含まず、自然界に存在する該分子は一般に哺乳動物の肝臓、腎臓および 脳に存在していることを特徴とする上記分子。 自然界に存在していない、請求項１記載の分子。 自然界に存在しており、それが自然界で結合している他のタンパク質または糖タ ンパク質を実質的に含まない、請求項１記載の分子。 ４．図４に示したアミノ酸配列を有するＲ−ＰＴＰａｓｅ−αまたはその機能的 誘導体である、請求項１記載の分子。 ５．図５に示したアミノ酸配列を有するＲ−ＰＴＰａｓｅ−βまたはその機能的 誘導体である、請求項１記載の分子。 ６．配列番号：３のアミノ酸配列を有するＲ−ＰＴＰａｓｅ−ガンマまたはその 機能的誘導体である、請求項１記載の分子。 ７．請求項１記載のＲ−ＰＴＰａｓｅタンパク質をコードするか、またはその機 能的誘導体をコードするＤＮＡ分子であって、該タンパク質または該機能的誘導 体が自然界に存在するものである場合、該ＤＮＡ分子は該タンパク質または該機 能的誘導体と自然界で結合しているタンパク質をコードするヌクレオチド配列を 実質的に含まないことを特徴とする上記ＤＮＡ分子。 ８．ｃＤＮＡ配列である、請求項７記載のＤＮＡ分子。 ９．ゲノムＤＮＡ配列である、請求項７記載のＤＮＡ分子。 １０．配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、または該配列の機能的誘導 体より成る群から選ばれるヌクレオチド配列を有する、請求項７記載のＤＮＡ分 子。 １１．発現ベヒクルである、請求項７記載のＤＮＡ分子。 １２．発現ベヒクルがプラスミドである、請求項１１記載のＤＮＡ分子。 １３．請求項１２のＤＮＡ分子で形質転換された原核細胞宿主。 １４．細菌である、請求項１３記載の宿主。 １５．請求項１１のＤＮＡ分子でトランスフェクトされた真核細胞宿主。 １６．酵母細胞または哺乳動物細胞である、請求項１５記載の宿主。 １７．請求項１記載のＲ−ＰＴＰａｓｅタンパク質または糖タンパク質、もしく はその機能的誘導体の生産方法であって、（ａ）培養条件下で該タンパク質を発 現し得る宿主を培養し；（ｂ）該タンパク質を発現させ；そして（ｃ）培養物か ら該タンパク質を回収する；ことから成る方法。 １８．前記宿主が原核細胞である、請求項１７記載の方法。 １９．前記宿主が真核細胞である、請求項１８記載の方法。 ２０．請求項１記載のタンパク質または糖タンパク質に対して特異的な抗体。 ２１．モノクローナルである、請求項２０記載の抗体。 ２２．被検者における請求項７記載の核酸配列または変異型Ｒ−ＰＴＰａｓｅを コードする核酸配列の存在を検出する方法であって、（ａ）被検者由来の細胞ま たはその抽出物を、正常または変異型Ｒ−ＰＴＰａｓｅの少なくとも一部をコー ドするオリゴヌクレオチドプローブと、ハイブリダイゼーション条件下で接触さ せ；そして （ｂ）該細胞の核酸への該プローブのハイブリダイゼーションを測定し、これに より該核酸配列の存在を検出する；ことから成る方法。 ２３．工程（ａ）の前に、 （ｃ）Ｒ−ＰＴＰａｓｅをコードする該細胞のＤＮＡの量を選択的に増幅する； ことをさらに含む、請求項２２記載の方法。 ２４．細胞におけるＲ−ＰＴＰａｓｅの存在を検出し、またはその量を測定する 方法であって、 （ａ）該細胞またはその抽出物を請求項２０記載の抗体と接触させ；そして （ｂ）該細胞またはその抽出物への該抗体の結合を検出するか、または結合した 抗体の量を測定し、これによりＲ−ＰＴＰａｓｅタンパク質または糖タンパク質 の存在を判定し、またはその量を測定する； ことから成る方法。 ２５．化学的または生物学的調製物において請求項１記載のＲ−ＰＴＰａｓｅタ ンパク質、糖タンパク質または誘導体に結合し得る化合物を同定する方法であっ て、 （ａ）Ｒ−ＰＴＰａｓｅタンパク質、糖タンパク質または誘導体、もしくはその リガンド結合部分を固相マトリックスに付着させ； （ｂ）化学的または生物学的調製物を該固相マトリックスと接触させて該化合物 を結合させ、未結合物質を洗い流し；そして （ｃ）該固相に結合した該化合物の存在を検出する；ことから成る方法。 ２６．請求項１記載のＲ−ＰＴＰａｓｅタンパク質、糖タンパク質または機能的 誘導体に結合し得る化合物を複合混合物から単離する方法であって、 （ａ）Ｒ−ＰＴＰａｓｅタンパク質または機能的誘導体、もしくはそのリガンド 結合部分を固相マトリックスに付着させ；（ｂ）複合混合物と該固相マトリック スとを接触させて該化合物を結合させ、未結合物質を洗い流し；そして（ｃ）結 合した該化合物を溶離し、これにより該化合物を単離する； ことから成る方法。 ２７．Ｒ−ＰＴＰａｓｅの酵素活性を刺激または阻害し得る化合物を同定する方 法であって、 （ａ）純粋な形の、メンブラン調製物中の、または全細胞中のＲ−ＰＴＰａｓｅ と該化合物とを接触させ；（ｂ）工程（ａ）の混合物を十分な時間インキュベー トし；（ｃ）Ｒ−ＰＴＰａｓｃの酵素活性を測定し；（ｄ）その酵素活性を、該 化合物の不在下でインキュベートしたＲ−ＰＴＰａｓｅのそれと比較し、これに より該化合物が酵素活性を刺激するのかまたは阻害するのかを判定する；ことか ら成る方法。