DE69129849T2

DE69129849T2 - Messung der lumineszenz

Info

Publication number: DE69129849T2
Application number: DE69129849T
Authority: DE
Inventors: Christopher Grant 2 Harewood Road Manchester M30 6Dj Morgan
Original assignee: University of Salford
Current assignee: University of Salford
Priority date: 1990-01-12
Filing date: 1991-01-14
Publication date: 1999-04-22
Anticipated expiration: 2011-01-15
Also published as: EP0519930B1; DE69129849D1; GB9000740D0; US5459323A; EP0519930A1; WO1991010897A1; ATE168775T1; JPH05503577A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Messung von Lumineszenz (z. B. die Fluoreszenz von Phosphoreszenz) und insbesondere die Messung von Lumineszenz- Abklingzeiten.
In der folgenden Beschreibung wird auf Fluoreszenz-Abklingzeiten Bezug genommen, aber die Beschreibung ist mutatis mutandis auch auf andere Formen von Lumineszenz anwendbar.
Fluoreszenzmikroskopie wird in der modernen Biologie, der Kriminaltechnik und in Materialanalysen sowie in vielen anderen Bereichen sehr verbreitet eingesetzt. Fluoreszenz ist in zweierlei Hinsicht empfindlich. Sie kann mit sehr großer Empfindlichkeit erfaßt werden, und die Emissionsparameter (und manchmal die Anregungsparameter) sind sehr umweltempfindlich. Die Umweltempfindlichkeit führt zur Verwendung fluoreszenter Fühler zur Überwachung der örtlichen Umwelt (pH-Wert, Sauerstoffspannung, Konzentration wichtiger Ionen, wie zum Beispiel Calcium, etc.). Diese Empfindlichkeit führt jedoch auch zu einer potentiellen Zweideutigkeit, insofern die Fluoreszenzintensität von der Konzentration von Fluorophor, der Anregungsintensität und der Quantenausbeute der genannten Spezies abhängt. Es ist somit selbst bei konstanter Anregungsintensität nicht möglich, die Konzentration von Fluorophor direkt mit der gemessenen Intensität in Beziehung zu setzen, wenn nicht auch bekannt ist, daß die Quantenausbeute in einer Probe konstant ist. Bei vielen fluoreszenten Proben, besonders bei denen, die mittels einer Fluoreszenzabbildung studiert werden (z. B. mittels Mikroskopie), ist eine Schwankung der Quantenausbeute in einer Probe häufig anzutreffen. Idealerweise hätte man gerne ein Mittel zum Messen nicht nur der Fluoreszenzintensität, sondern auch der Quantenausbeute. Im allgemeinen ist dies ein sehr schwieriges Problem. In vielen Fällen läßt sich die Fluoreszenz-Quantenausbeute jedoch aus einer Messung der Fluoreszenz-Abklingzeit ableiten. Wo dies nicht gilt, impliziert das eine Änderung der Strahlungslebensdauer (der Abklingzeit in Abwesenheit jeglicher äußeren Deaktivierungsvorgänge, was eine intrinsische Eigenschaft der fluoreszenten Spezies ist, die mit der Fluoreszenzleistung in Beziehung steht). Solche Änderungen können normalerweise erfaßt werden, da die Störungen, die die Strahlungsabklingzeit ändern, auch die spektroskopischen Eigenschaften der Anregung und/oder der Emission beeinflussen.
Fluoreszenz-Abklingzeiten werden normalerweise unter Verwendung einer von zwei Techniken gemessen. Die verbreitetste ist das zeitkorrelierte Einzelphoton-Zählverfahren, bei dem Fluoreszenz unter Verwendung einer periodischen Quelle kurzer optischer Pulse angeregt wird (1). Ein alternatives Verfahren verwendet Phasenverschiebungs/Demodulationsmessungen von Fluoreszenz, die ansprechend auf eine amplitudenmodulierte Anregungsquelle emittiert wird (2). Bei der letzteren Technik ist es erforderlich, Messungen als eine Funktion der Modulationsfrequenz vorzunehmen, wenn das Abklingen der Fluoreszenz nicht einfach exponentiell ist.
Die Wahl zwischen den Zeit- und Frequenzbereichsansätzen zur Messung des Abklingens von Fluoreszenz wird weitgehend von praktischen Gesichtspunkten bestimmt, wie zum Beispiel von der Verfügbarkeit von Geräten. Es gibt jedoch eindeutige Konstellationen, bei denen das eine bzw. das andere Verfahren bevorzugt wird. Wenn die Fluoreszenz zweckmäßig durch die Ausgabe eines kostengünstigen Lasers (wie zum Beispiel des grünen Helium/Neon- bzw. Argon-Ionenlasers) angeregt werden kann, dann ist der Ansatz der Phasenverschiebung/- Demodulation besonders zweckmäßig, da die Laserausgabe leicht mit einer Pockelszelle moduliert werden kann (3), und bei einigen Lasern ist die Möglichkeit einer Amplitudenmodulation eingebaut. Wenn eine Laseranregung nicht zweckmäßig ist, werden Phasenverfahren schwieriger. Licht von einer Bogenquelle kann unter Verwendung einer Pockelszelle moduliert werden, aber nur auf Kosten eines sehr niedrigen Durchsatzes aufgrund scharfer Kollimationserfordernisse. Wenn ein großes Spektrum von Wellenlängen gewünscht wird, schwächen die nötigen Glan-Taylor-Polarisatoren den Lichtstrahl weiter.
Wenn eine Bogenquelle durch eine Pockelszelle projiziert wird, ist ein charakteristisches Muster zu sehen, das sich aus einem Paar von Spitzen zusammensetzt, die an einem mittleren Punkt zusammenkommen, um ein Kreuz zu bilden. Das Anlegen einer Spannung an die Pockelszelle veranlaßt die Spitzen dazu, sich voneinander weg zu bewegen, so daß durch eine Verwendung einer kleinen mittleren Öffnung als einem räumlichen Filter erreicht werden kann, daß die Intensität von Licht, das durch die Öffnung geht, moduliert wird, wenn eine schwankende Spannung an die Vorrichtung angelegt wird. Die Erscheinung des projizierten Musters ist eine Folge davon, daß Licht achsenverschoben durch die Modulatoreinheit geht, und eine homogene Modulation ist nur für außerordentlich gut kollimiertes Licht möglich, wie für Licht von einem Laser. Die Verwendung einer Bogenquelle ist insbesondere hinsichtlich ihrer kontinuierlichen Ausgabe und ihrer Wellenlängen-Abstimmbarkeit zweckmäßig, was die Schwierigkeit einer Leistungsmodulation einer solchen Quelle sehr bedauerlich macht. Die Wahl zwischen hohem Modulationsgrad und hohem Lichtdurchsatz ist unvermeidlich, wenn ein Pockelsmodulator verwendet wird, und dieser wird wegen der breiten Modulationsbandbreite allgemein gegenüber optischen Alternativen bevorzugt.
Als eine Alternative zur Modulation unter Verwendung eines optischen Elements kann in einigen Fällen die Ausgabe einer Lichtquelle direkt moduliert werden.
Um den Nachteil einer Anregung mit relativ geringer Intensität bei Verwendung einer Pockelszelle mit einer Bogenquelle zu minimieren, muß die Empfindlichkeit der Fluoreszenzerfassung so groß wie möglich sein. Selbst wenn eine adäquate Anregungslichtintensität zur Verfügung steht, ist es normalerweise wünschenswert, die Erfassungsempfindlichkeit zu optimieren, um zum Beispiel eine Photobeschädigung der Probe zu minimieren. Zu diesem Zweck eignet sich besonders die Verwendung einer Einzelphoton-Zählerfassung. In einem früheren Referat (4) haben wird ein Mittel zur Verwendung einer Einzelphoton-Zählerfassung mit Phasen/Modulations-Fluorometrie beschrieben. Dieser Ansatz verwendete eine Analyse eines Histogrammdatensatzes, der sich aus einer Mehrkanalanalyse der Ausgabe von einem Zeit-Pulshöhen-Konverter ergab, mittels der schnellen Fouriertransformation (FFT).
Es ist ferner ein alternativer Ansatz zu Messungen der Phasenverschiebung unter Verwendung einer Photonenzählung beschrieben worden, und zwar auf der Grundlage einer digitalen Korrelation (5). Bei dieser Technik wird ein Rechteckwellen"gatter" bei der Modulationsfrequenz dazu verwendet, Signale zwischen zwei Hochfrequenzzähler zu leiten. Die Phase der Rechteckwellenform kann dazu eingestellt werden, den Zählquotienten zwischen den beiden Zählern zu maximieren, und somit kann die Phase der Emission leicht gemessen werden. Dieser Ansatz ist einfacher und billiger als der in (4) dargestellte, und er kann schneller zählen. In seiner ursprünglichen Form leidet er jedoch unter dem Nachteil, daß Fehler erzeugt werden, wenn die Anregungsquelle nicht rein sinusförmig ist.
Der Review of Scientific Instruments. Bd. 45, Nr. 3, Seiten 364-367, (März 1974), beschreibt die Erfassung von Proben- und Bezugsphotonenpulsen durch jeweilige Photovervielfacher, um Fluoreszenz-Abklingdaten zu bestimmen. Der Probenpuls wird mit einer periodischen Schaltfunktionsphase korreliert, die mit dem Bezugspuls synchronisiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zum Erzeugen abklingzeitgewichteter Informationen bezüglich einer lumineszenten Probe vorgesehen, die folgendes umfaßt:
eine Anregungslichtquelle, die dazu angeordnet ist, die Probe zu beleuchten, ein Mittel zum Modulieren bzw. Pulsen der Intensität des Anregungslichts auf eine vorgegebene periodische Weise,
ein Mittel zum Bereitstellen von Bezugssignalen, die zueinander phasenverschoben sind und die eine vorgegebene Phasenbeziehung zur Modulation bzw. zum Pulsen des Anregungslichts aufweisen,
ein Detektormittel zum Erfassen von Photonen, die von der Probe aufgrund von Lumineszenz emittiert werden,
Mittel zum Erhalten von Daten, die Photonen repräsentieren, die von der Probe emittiert werden,
Mittel zum Speichern der Daten, und
Mittel zum Erzeugen abklingzeitgewichteter Informationen aus den gespeicherten Daten,
dadurch gekennzeichnet, daß das Detektormittel eine elektronische Kamera mit einem Bildverstärker umfaßt, und dadurch, daß das Mittel zum Bereitstellen von Bezugssignalen so mit dem Bildverstärker assoziiert ist, daß die Signale auf den Verstärker angewandt werden, um dessen Verstärkung periodisch zu modulieren.
Die Erfindung ist besonders auf die Produktion abklingzeitgewichteter Bilder anwendbar, kann aber dazu verwendet werden, andere Arten abklingzeitgewichteter Informationen bereitzustellen, z. B. zeitaufgelöste Fluoreszenz-Depolarisationsbilder, Bilder differentieller polarisierter Phasenverschiebung und Messungen zeitabhängiger Änderungen der Fluoreszenz-Abklingparameter. Einige Ausführungsbeispiele der Erfindung (z. B. die unten mit Bezug auf Fig. 1 beschriebenen Abbildungsanordnungen) sind besonders für eine Erfassung spektralzerlegter Anordnungen angepaßt, wie zum Beispiel Messungen von Anregungsemissionsmatrizen, in denen die abklingzeitbezogenen Anregungs- und Emissionsparameter dargestellt sind.
Die Phasenbeziehung zwischen den Signalen und der Modulation der Lichtquelle sollte bekannt sein, und bevorzugt ist eines der Bezugssignale in Phase mit der genannten Modulation (die im Hochfrequenzbereich liegen kann). Die Bezugssignale sind bevorzugt relativ zueinander um 90º phasenverschoben.
Die Bezugssignale und die Modulation der Anregungsquelle sind bevorzugt sinusförmig.
Der Detektor ist bevorzugt dazu in der Lage, einzelne Photonen zu erfassen.
Der Detektor umfaßt einen Bildverstärker, der mit einer elektronischen Kamera assoziiert ist. Bilder können dadurch erhalten werden, daß die Spannung zwischen der Photokathode (des Verstärkers) und der Vorderseite der Mikrokanalplatte moduliert wird, oder es kann alternativ die Verstärkung des Detektors mit Hilfe anderer Mittel variiert werden, wie zum Beispiel Änderungen der Spannung über die Mikrokanalplatte oder an einem geeignet positionierten Gitter bzw. einer geeignet positionierten Elektrode im Verstärker. Es kann auch ein Bildverstärker verwendet werden, der keine Mikrokanalplatte umfaßt, wie zum Beispiel eine Verstärkerdiodenröhre. Er kann dadurch moduliert werden, daß die Beschleunigungsspannung in der Röhre variiert wird. Alternativ kann ein Detektorsystem verwendet werden, das einen Verstärker umfaßt und dem ein optisches Element vorausgeht, dessen optische Durchlässigkeit moduliert werden kann. Ein Bild kann erhalten werden, wenn diese Spannung in Phase mit der Modulation der Anregungsquelle moduliert wird, und ein weiteres Bild kann erhalten werden, wenn diese Spannung um 90º (gegenüber der Modulation der Anregungsquelle) phasenverschoben moduliert wird. In der Praxis ist es zweckmäßig, ferner ein Bild zu erzeugen, wenn die Detektormodulation und die Anregungsmodulation gegenphasig sind, da die nachfolgenden Bildmanipulationen, die für den Abklingzeitkontrast erforderlich sind, bevorzugt nach dem Abziehen einer 'Gleichstrom'-Komponente von dem Bild ausgeführt werden, und diese Komponente des Bilds wird am einfachsten dadurch erzeugt, daß der Durchschnitt über Bilder 'in Phase' und 'in Gegenphase' genommen wird.
Die Lichtquelle wird bevorzugt direkt moduliert, was eine sinusförmig schwankende Emission mit niedriger Oberwelligkeit liefert.
Die Lichtquelle ist bevorzugt eine Deuteriumlampe, die für eine Hochfrequenzmodulation angepaßt ist. Eine solche Quelle liefert eine gute Wellenlängen-Abstimmbarkeit, eine niedrige Oberwelligkeit und eine sehr hohe zeitliche Stabilität.
Die Erfindung wird nun lediglich beispielhaft und mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen näher beschrieben. In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 schematisch ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung: und die Fig. 2(a), 2(b), 3(a) und 3(b) Fotografien von rechnererzeugten Bildern, die unter Verwendung der Vorrichtung aus Fig. 1 erhalten wurden.
Es gibt prinzipiell verschiedene Möglichkeiten, eine abklingzeitgewichtete Abbildung unter Verwendung von Phasen/Demodulationstechniken zu erzielen. Ein Ansatz besteht darin, einen optischen Modulator zu verwenden, der einer Kamera vorausgeht, und Bilder aufzunehmen, wenn der Modulator in Phase mit der Anregungslichtquelle und um 90º dagegen phasenverschoben ist, sowie ein Bild aufzubauen, wenn keine Modulation angewandt wird, um ein Maß der durchschnittlichen Intensität bereitzustellen, die von den modulierten Bildern abgezogen werden muß. Leider ist dieser Ansatz in der Praxis schwierig, da optische Standardmodulatoren in Abbildungssystemen nicht gut arbeiten. Eine Alternative verwendet eine Verstärkungsmodulation bzw. -schaltung mit einem Bildverstärker, der einer elektronischen Kamera vorausgeht. Ein potentielles Problem besteht darin, daß es schwierig ist, gleichzeitig einen guten Modulationsgrad und die Linearität der Modulation zu erreichen. Das ist insofern von Bedeutung, als das Anregungslicht nur selten mit einer oberwellenfreien Sinusform moduliert wird. Das ist besonders bei Pockelszellen schwierig, die mit schlecht kollimierten Lichtquellen arbeiten, wie zum Beispiel Xenon- oder Quecksilber-Bogenlampen. Unter diesen Bedingungen ist das sich ergebende Bild nur dann eine wahre Darstellung der Fluoreszenzabklingung, wenn die Verstärkung des Abbildungssystems sinusförmig variiert wird, so daß der zeitliche Durchschnitt von Oberwellen genommen wird. Wenn die Lichtquelle jedoch bei geringer Oberwelligkeit sinusförmig moduliert wird (wie mit Lasern und direkt modulierten Deuteriumquellen erreicht werden kann), kann der Verstärker wahlweise in einer verstärkungsgeschalteten Betriebsart verwendet werden oder sinusförmig moduliert werden.
In der Anordnung von Fig. 1 wird eine fluoreszente Probe 200 von einer Lichtquelle 201 (z. B. einer Deuteriumlampe) mit einer Hochfrequenz von einer HF-Quelle 202 moduliert. Ein Bild der Probe 200 wird unter Verwendung einer CCD-Kamera 203 erhalten, die mit einem Bildverstärker 204 assoziiert ist, der der eigentlichen Kamera vorausgeht. Ein Signal von der HF-Quelle 202 wird über einen Phasenverschieber 205, der das Signal wahlweise um 0º, 90º und 180º verschieben kann, an die Verstärkersteuerung des Verstärkers geliefert. Das sich ergebende Signal wird dazu verwendet, die Verstärkung des Verstärkers zu modulieren.
Beim Betrieb der Anordnung in Fig. 1 kann der Verstärker 204 für eine vorgegebene Zeitdauer in Phase mit der Lichtquelle 201 moduliert werden (d. h. 0º Verschiebung im Phasenverschieber 205), und unter Verwendung der Kamera 203 kann ein Bild erhalten werden. Dieses Bild wird in einem Rechner gespeichert. Ähnlich können Bilder erhalten werden, wenn der Verstärker mit einer Phasenverschiebung von 90º oder in Gegenphase gegenüber der Modulation der Lichtquelle moduliert wird, und die jeweiligen Bilder können im Rechner 206 gespeichert werden. Beispiele der drei Bilder (in Phase, um 90º phasenverschoben, in Gegenphase), die für Spezies mit kurzer Abklingzeit erhalten wurden, sind schematisch bei (a) in Fig. 1 gezeigt, und die entsprechenden Bilder für eine fluoreszente Spezies mit vergleichsweise langer Abklingzeit sind bei (b) gezeigt. Bei der Spezies mit der kurzen Abklingzeit wird das stärkste Bild erhalten, wenn die Verstärkung in Phase mit der Lichtquelle moduliert wird, ein Bild geringerer Intensität wird erhalten, wenn die Modulation um 90º phasenverschoben ist, und das schwächste Bild wird erhalten, wenn die Verstärkung gegenphasig ist. Was die Spezies mit der langen Abklingzeit betrifft, gilt der gleiche Trend wie zuvor, aber die Unterschiede sind weit weniger deutlich. Bei einer Abklingzeit, die so lang ist, daß die Emission vollständig demoduliert wird, sind theoretisch drei identische Bilder die Folge.
Die Bilder werden wie folgt berechnet: Um Schwankungen der HF-Phasenverschiebung bzw. des Modulationsgrads über die Verstärker-Photokathode auszugleichen (die aufgrund von Inhomogenitäten entstehen können, wie zum Beispiel dem spezifischen Widerstand und der Kapazität der Oberfläche), wird zur bestmöglichen Leistung unter Verwendung einer Bezugsprobe (zum Beispiel einer Streuprobe oder einer Probe bekannter Abklingzeit) ein Korrekturbild berechnet. Dieses Bild wird durch die Messung von Bildern berechnet, die den Verstärker in Phase (P), um 90º phasenverschoben (Q) und in Gegenphase (A) mit der Anregung modulieren, und dadurch, daß die Resultierende als
berechnet wird (wobei der Index (xy) eine Korrespondenz zwischen gegebenen Pixeln in jedem Bild impliziert).
Eine ähnliche Berechnung wird für die Probe ausgeführt, was I'(xy) ergibt. Das sich ergebende korrigierte Bild wird als
berechnet. Dieses Vorgehen liefert Bilder auf der Grundlage der 'ersichtlichen Abklingzeit nach Phasenverschiebung' bei der gewählten Frequenz. Andere Berechnungen können dazu verwendet werden, Bilder zu erzeugen, die durch Demodulation oder durch Kombinationen von Phase. Demodulation, Intensität etc. gewichtet sind.
Beispiele der Verwendung des verstärkten CCD-Systems sind in den Fig. 2a und 2b und in den Fig. 3a und 3b gezeigt. In Fig. 2 ist ein Intensitätsbild einer mit Chinacrinhydrochlorid gefärbten epidermalen Schicht einer Zwiebel gezeigt. Das abklingzeitgewichtete Bild (Fig. 2b) zeigt keinen Kontrast, was eine wahrscheinliche gleichförmige Abklingzeit über die Probe anzeigt. Fig. 3a zeigt dagegen ein ähnliches Bild (bei stärkerer Vergrößerung), bei dem die Zwiebel mit Ethidiumbromid gefärbt ist. In diesem Fall zeigt das abklinggewichtete Bild (Fig. 3b) deutlich einen Kontrast zwischen gefärbten Nuklei (bei denen die Abklingzeit lang ist) und dem Rest der Zelle.
Ein Abbildungsdetektor auf der Grundlage eines Bildverstärkers ist eine echte Mehrkanalvorrichtung und bietet daher einen großen Multiplexvorteil gegenüber jeglicher Einkanalvorrichtung auf der Grundlage der Photovervielfacher-Technologie. Unter Verwendung eines speziell angefertigten Mikrokanalplatten-Bildverstärkers mit einer leitfähigen Kathode zur Beschleunigung des zeitlichen Ansprechens haben wir zeitaufgelöste Bilder erzielt, und die bisherigen Resultate haben den Aufbau von Bildern bei Modulationsfrequenzen über dreißig Megahertz ermöglicht. Es scheint sicher, daß die Konstruktion dazu optimiert werden kann, noch höhere Frequenzen zu erreichen.
Die Fähigkeit, die Fluoreszenz-Abklingzeit in einem Bild zu messen, kann potentiell die quantitative Bestimmung von Fluoreszenzmikroskopbildern verbessern. Wenn ein Fluorophor dynamisch gelöscht wird, so daß seine Abklingzeit verringert wird, dann wird sich auch die gemessene Fluoreszenzintensität verringern. Es ist somit schwierig, Konzentrationsprofile von Fluorophoren in Bildern allein anhand von Intensitätsschwankungen zu messen, da die Löschdynamik von Punkt zu Punkt auf der Probe unterschiedlich sein kann. Die gleichzeitige Messung des abklingzeitgewichteten Bildes kann ggf. solche Schwankungen berichtigen, obgleich sie natürlich nicht die statische Gesamtlöschung von Fluoreszenz berichtigen kann.

QUELLENANGABEN

1. Ware, W. R. 1983. Time Resolved Fluorescence Spectroscopy in Biochemistry and Biology, NATO ASI Series A, Life Sciences. Hrg. R. B. Cundall und R. E. Dale (New York: Plenum) 69A, 23.
2. Teale. F. J. W. 13. Time Resolved Fluorescence Spectroscopy in Biochemistry and Biology, NATO ASI Series A. Life Science. Hrg. R. B. Cundall und R. E. Dale (New York: Plenum) 69A, 59.
3. Schlag, E. W.; Selzle H. L.; Schneider. S. und Larsen, J. G. 1974. Single photon phase fluorometry with nanosecond time resolution. Rev. Sci. Instrum., 45, 364.

Claims

1. Vorrichtung zum Erzeugen abklingzeitgewichteter Informationen bezüglich einer lumineszenten Probe (200), die folgendes umfaßt:

eine Anregungslichtquelle (201), die dazu angeordnet ist, die Probe zu beleuchten, ein Mittel (202) zum Modulieren bzw. Pulsen der Intensität des Anregungslichts auf eine vorgegebene periodische Weise,

ein Mittel (205) zum Bereitstellen von Bezugssignalen, die zueinander phasenverschoben sind und die eine vorgegebene Phasenbeziehung zur Modulation bzw. zum Pulsen des Anregungslichts aufweisen,

ein Detektormittel (203, 204) zum Erfassen von Photonen, die von der Probe aufgrund von Lumineszenz emittiert werden,

Mittel zum Erhalten von Daten, die Photonen repräsentieren, die von der Probe emittiert werden,

Mittel zum Speichern der Daten, und

Mittel zum Erzeugen abklingzeitgewichteter Informationen aus den gespeicherten Daten,

dadurch gekennzeichnet, daß das Detektormittel (203, 204) eine elektronische Kamera (203) mit einem Bildverstärker (204) umfaßt, und dadurch, daß das Mittel (205) zum Bereitstellen von Bezugssignalen somit dem Bildverstärker assoziiert ist, daß die Signale auf den Verstärker angewandt werden, um dessen Verstärkung periodisch zu modulieren.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der das Mittel (205) zum Bereitstellen von Bezugssignalen dazu angepaßt ist, eines der Bezugssignale phasengleich mit der Modulation bzw. mit dem Pulsen der Lichtquelle (201) bereitzustellen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, bei der das Mittel (205) zum Bereitstellen von Bezugssignalen dazu angepaßt ist. Bezugssignale bereitzustellen, die relativ zueinander um 90 Grad phasenverschoben sind.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der das Mittel (205) zum Bereitstellen von Bezugssignalen dazu angepaßt ist, drei Bezugssignale bereitzustellen, die zueinander phasenverschoben sind, wobei eines der Signale in gegenphasiger Beziehung mit der Modulation bzw. mit dem Pulsen des Anregungslichts steht.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der das Mittel (202) zum Modulieren bzw. zum Pulsen der Intensität des Anregungslichts auf das von der Quelle emittierte Licht wirkt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, bei der eine Pockels-Zelle dazu bereitgestellt wird, Licht von der Quelle (201) zu modulieren.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der die Lichtquelle (201) eine Lichtquelle ist, die dazu angepaßt ist, moduliert bzw. gepulst zu werden, um moduliertes bzw. gepulstes Anregungslicht zu emittieren.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, bei der die Lichtquelle eine Deuteriumlampe ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei der das Anregungslicht mit Hochfrequenz gepulst bzw. moduliert wird.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei der das Mittel zum Erzeugen abklingzeitgewichteter Bilder Mittel zur Verwendung eines Bezugsbildes mit bekannten Eigenschaften umfaßt, um die Auswirkung einer räumlichen Inhomogenität der Eigenschaften des Detektormittels zu berichtigen.