DE69325943T2

DE69325943T2 - Synthetische Polypeptide vom Hepatitis C-Virus, verwendbar für den Nachweis des Virus

Info

Publication number: DE69325943T2
Application number: DE69325943T
Authority: DE
Inventors: Pascal Dalbon; Michel Jolivet
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1992-05-06
Filing date: 1993-05-06
Publication date: 1999-12-23
Anticipated expiration: 2013-05-07
Also published as: FR2690921A1; EP0569309B1; DE69325943D1; ES2136653T3; FR2690921B1; US6235284B1; DE69325943T3; ES2136653T5; CA2095693A1; EP0569309A1; EP0569309B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein synthetische, d. h. auf präparativem Wege wie z. B. chemischer Synthese gewonnene Polypeptide, die aus aufeinanderfolgenden Aminosäuren zusammengesetzt sind, die insgesamt mit einem Fragment, einer Sequenz oder einem Bereich des CORE-Protein genannten Strukturproteines des Nukleocapsides des humanen Hepatitis-C-Virus (HCV) identisch sind. Diese Polypeptide können wie synthetische Antigene in verschiedenen Anwendungen, die sich aus ihrem immunogenen Vermögen ergeben und nachstehend genauer bestimmt werden, eingesetzt werden; an erster Stelle dieser Anwendungen steht der Nachweis des HCV in verschiedenen Milieus des Körpers, wie beispielsweise einer Probe oder einer Blutprobe.
Es hat sich etabliert, daß das Protein des Nukleocapsides oder CORE-Proteines von HCV, das sich, wie in Fig. 1 dargelegt, aus 191 Aminosäuren zusammensetzt, dasjenige ist, welches die wichtigste Homologie zwischen den Sequenzen derselben Gruppe von Virusisolaten einerseits und zwischen den verschiedenen Virusgruppen andererseits zeigt. Dieses CORE-Protein wird übrigens durch einen Struktur-Bereich des HCV-Genomes codiert und stellt demnach ein Struktur-Protein dar. Die starke Konservierung der Struktur dieses Proteines macht es zu einem besonders geeigneten Kandidaten für den immunologischen Nachweis von HCV.
So haben es die Arbeiten von Hosein B, Fang CT, Popovsky MA, Ye J, Zhang M, Wang CY, veröffentlicht in "Improved serodiagnosis of hepatitis C virus infection with synthetic peptide antigen from capsid protein", Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 3647-51, erlaubt, einen immundominanten Bereich innerhalb des CORE-Proteines zu bestimmen, der einem Polypeptid entspricht, das durch die Sequenz der N-terminalen Aminosäuren 1 bis 120 des besagten CORE-Proteines gebildet wird.
Gemäß einer bereits zitierten Publikation, nämlich: Hosein B, Fang CT et al., "Improved serodiagnosis of hepatitis C virus infection with synthetic peptide antigen from capsid protein", Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 3647-51, können verschiedene synthetische Peptide, die bestimmten Sequenzen des CORE-Proteines entsprechen, als Antigene in Fest-Phasen-Nachweis-Verfahren verwendet werden, beispielsweise auf immunabsorbierenden Trägern.
Zum selben Zweck des immunologischen Nachweises von HCV beschreibt das Dokument EP-0 442 394 mehrere Polypeptide, die eine Peptid-Sequenz umfassen, die dem oben erwähnten immundominanten Bereich des CORE-Proteines angehört.
Unter den besagten Polypeptiden wurde das durch die Sequenz der N-terminalen Aminosäuren 2 bis 62 des CORE-Proteines gebildete, VIIIE genannte Polypeptid in einem ELISA-Test unter dem Gesichtspunkt seiner Immunreaktivität gegenüber Anti-HCV- Antikörpern getestet, die in Seren von HCV-infizierten Individuen enthalten waren. Dieses Polypeptid hat eine gute Immunreaktivität gegenüber getesteten HCV-infizierten Seren gezeigt.
Der Ersatz von dem CORE-Protein entsprechenden Fusionsproteinen durch aus dem Stand der Technik bekannte, durch chemische Synthese gewonnene Polypeptide ist in den Nachweisverfahren eigentlich vorteilhaft, denn er erlaubt es, die Risiken einer Immunreaktion mit passenden Antikörpern herabzusetzen, die in einer Probe enthalten und von den gegen das HCV gerichteten verschieden sind.
Es erschien der Anmelderin jedoch wesentlich, eine minimale und hinreichende Sequenz für ein Polypeptid bestimmen zu können, die vom Standpunkt ihrer antigenen Eigenschaften mit dem Protein in seiner Gesamtheit gleichwertig sein soll.
Je länger nämlich ein Peptid ist, um so größer sind die Risiken, die Antigenität des besagten Peptides in Anbetracht der größeren Häufigkeit der folgenden Ereignisse möglicherweise zu stören:
- Wechselwirkung zwischen dem Peptid und von den gegen das HCV gerichteten Antikörpern verschiedenen Antikörpern durch Kreuzreaktionen, oder Wechselwirkung zwischen dem Peptid und anderen biologischen Molekülen, die in dem Milieu vorhanden sind,
- Konformationsänderungen im Vergleich zu der Struktur des nativen Proteines, die sich in einem Verschwinden der den Epitopstellen entsprechenden Sekundär- und/oder Tertiärstrukturen oder in einem Auftreten von Sekundär- und/oder Tertiärstrukturen äußern können, die von denjenigen verschieden sind, die das Gesamtprotein annimmt, und die mit anderen Antikörpern als Anti-HCV-Antikörpern wechselwirken können.
Gemäß der EP-0 442 394 haben die Erfinder versucht, die Länge des Polypeptides VIIIE durch Entfernung von 9, 19, 29 bzw. 39 Aminosäuren von seinem N-terminalen Bereich zu verkürzen, um die Polypeptide zu erzeugen, die durch die N-terminalen Aminosäuresequenzen des CORE-Proteines mit der jeweiligen Länge 10 bis 62, 20 bis 62, 30 bis 62 bzw. 40 bis 62 gebildet werden.
Die Immunreaktivität jedes dieser Peptide wurde in ELISA- Tests ermittelt, und man hat festgestellt, daß die Immunreaktivität um so geringer wird, je größer die Zahl der entfernten Aminosäuren ist.
Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid oder dessen Fragmente bereit, das mit der Gesamtheit der Seren von Individuen oder Proben, die mit dem HCV infiziert und Träger von gegen das Nukleocapsid-Protein gerichteten Antikörpern sind, eine Immunreaktivität zeigt, obgleich es sich aus einer viel kürzeren Aminosäuresequenz zusammensetzt, als dasjenige mit der Polypeptidstruktur VIIIE.
Die vorliegende Erfindung basiert auf den folgenden, völlig unerwarteten Ergebnissen, die aus dem nachstehend dargelegten Versuchsprotokoll resultieren:
1. in dem CORE-Protein von HCV gibt es einen immundominanten Bereich, der höchstens von den 45 ersten Aminosäuren repräsentiert wird;
2. dieser immundominante Bereich reicht alleine aus, um dieselbe Empfindlichkeit bezüglich des Nachweises von Anti-HCV-Antikörpern zu erreichen wie mit dem gesamten CORE-Protein;
3. dieser immundominante Bereich muß durchgehend sein, wenn man mit der Gesamtheit der Seren von Individuen oder Blutproben reagieren möchte, die mit HCV infiziert sind und gegen das CORE-Protein gerichtete Antikörper aufweisen;
4. dieser immundominante Bereich weist offensichtlich Epitope des Konformationstyps und Epitope des linearen Typs auf.
Folglich umfaßt das erfindungsgemäß verwendete Polypeptid eine isolierte Peptidsequenz, die sich ungefähr aus den 45 N- terminalen Aminosäuren des CORE-Proteines des HCV-Virus zusammensetzt (vgl. SEQ ID-NO. 1).
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist vorzugsweise einzig und allein entweder aus einer isolierten Peptidsequenz, die sich aus 45 N-terminalen Aminosäuren des besagten Proteines zusammensetzt, oder alternativ aus allen homologen Polypeptiden aufgebaut, die ungefähr 45 Aminosäuren enthalten und eine antigene Reaktivität gegenüber dem HCV aufweisen.
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist vorzugsweise aus einer Peptidsequenz aufgebaut, die sich aus den N-terminalen Aminosäuren 2 bis 45 des CORE-Proteines zusammensetzt (vgl. SEQ ID- NO. 2).
Wie nachstehend beschrieben, leitet sich die vorliegende Erfindung von Versuchsbeobachtungen ab.
Die Erfindung stellt insbesondere in erster Linie eine beliebige der folgenden Polypeptid-Zusammensetzungen oder -Mischungen bereit:
a) einzig und allein eine isolierte Peptidsequenz, die sich aus 45 N-terminalen Aminosäuren des CORE-Proteines (oder Capsides) des humanen Hepatitis-C-Virus (HCV) zusammensetzt, so wie in Fig. 1 dargestellt, wobei von dieser Sequenz ggf. an ihrem N-terminalen und/oder C-terminalen Bereich 1 bis 10 Aminosäuren entfernt sind;
b) einzig und allein eine antigene Sequenz, die zu der Peptidsequenz (a) äquivalent ist und eine immunologische Reaktivität gegenüber Anti-HCV-Antikörpern aufweist;
c) einzig und allein eine zu der Peptidsequenz (a) homologe Sequenz, deren einzelne Aminosäurebestandteile zu denen der homologen Aminosäuren in der Peptidsequenz (a) identische oder analoge chemische Eigenschaften aufweisen;
d) jede geeignete Mischung der Polypeptid-Zusammensetzungen gemäß (a) bis (c).
Unter "isolierter Peptidsequenz" versteht man jedes Polypeptid, das nicht mit einem anderen Protein oder einem anderen Peptid fusioniert ist, egal auf welchem Wege es entstanden ist, beispielsweise durch chemische Synthese, Lyse des CORE-Proteines oder durch die Techniken der genetischen Rekombination. Dieses Polypeptid kann folglich ein synthetisches Peptid oder ein Protein sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Aminosäure als homolog zu einer anderen Aminosäure bezeichnet, wenn deren chemische Eigenschaften wie bspw. Polarität, Hydrophobizität und/oder Basizität und/oder Azidität und/oder Neutralität ungefähr dieselben sind. Somit ist im Sinne der vorstehenden Definition ein Leucin homolog zu einem Isoleucin.
Die erfindungsgemäßen Peptidsequenzen können solche in nativem Zustand oder chemisch modifizerte sein. Unter chemischer Modifikation versteht man jede chemische Veränderung wenigstens einer funktionellen Gruppe der Peptidsequenz, die die biologischen Eigenschaften der besagten Sequenz im wesentlichen bewahrt, ja sogar entwickelt. Zu den zuvor erwogenen chemischen Modifikationen gehören insbesondere der Ersatz einer Aminosäure der L-Serie durch eine Aminosäure der D-Serie, eine Modifikation der Seitenketten der Aminosäuren, wie z. B. eine Acetylierung von Aminogruppen, eine Carboxymethylierung von Thiolgruppen, eine Veresterung von Carboxylgruppen, eine Modifikation der Peptidbindungen, wie z. B. Carba-Bindungen, Retro- Inverso, Reduzierungen und Methylen-Oxy.
Die bevorzugten Kürzungen des erfindungsgemäßen Polypeptides sind die Entfernungen von 6 bzw. 11 Aminosäuren des N- terminalen Endes des CORE-Proteines.
Ausgehend von den zuvor definierten Peptid-Zusammensetzungen oder -Mischungen schlägt die Erfindung ein Reagenz zum Nachweis des humanen Hepatitis-C-Virus (HCV) vor, das als reaktive Substanz irgendeine der vorgenannten Zusammensetzungen oder Mischungen enthält und eventuell jeden beliebigen Zusatz, der mit dem Nachweis des HCV immunologisch vereinbar ist. Somit kann der Nachweis mit Hilfe eines Polypeptides, das mit denjenigen der vorliegenden Erfindung identisch oder zu ihnen analog ist, und ggf. mit einem Anti-Human-Immunglobulin-Antikörper durchgeführt werden, der mit einem beliebigen herkömmlichen Markierungsstoff, wie z. B. einem radioaktiven, fluoreszierenden, enzymatischen oder analogen Markierungsstoff markiert ist. Ein solches Reagenz kann ebenso gut in homogener Phase, beispielsweise in Immun-Präzipitationstests, wie in heterogener Phase, beispielsweise in Immun-Adsorptionstests, eingesetzt werden.
Mit dem vorgenannten Reagenz kann man jedes zu einem Nachweis von HCV geeignete Mittel erhalten, gleich ob es sich um einen Nachweiskit oder um ein ganz anderes System oder eine gleichwertige Kombination handelt. Das vorgenannte Reagenz wird beispielsweise von einem festen Träger getragen, der in seiner Kombination mit dem Reagenz immunologisch vereinbar ist; ohne beschränkend zu wirken, liegt der feste Träger insbesondere in Form einer Mikrotiterplatte, einer Folie, eines Konus, einer Vertiefung, eines Kügelchens oder jedes anderen geeigneten mikro-partikulären Substrates vor.
Der Ausdruck "fester Träger", wie er hier verwendet wird, schließt alle Materialien ein, auf denen die erfindungsgemäßen Polypeptide immobilisiert werden können. Das können chemisch modifizierte oder nicht-modifizierte synthetische Materialien sein, insbesondere Polysaccharide, wie die Zellulose-Materialien, z. B. Papier, Derivate der Zellulose, wie die Nitrozellulose oder Zelluloseacetat, Polymere, wie Vinylchlorid, Polyethylen, Polystyrol, Polyacrylat oder Kopolymere, wie Polymere aus Vinylchlorid und Propylen, Polymere aus Vinylchlorid und Vinylacetat, Kopolymere auf der Grundlage von Styrol, natürliche Fasern wie die Baumwolle und synthetische Fasern wie das Nylon. Vorzugsweise ist der feste Träger ein Polymer aus Polystyrol, ein Butadien-Styrol-Kopolymer oder ein Butadien-Styrol-Kopolymer in einer Mischung mit einem oder mehreren Polymeren oder Kopolymeren, ausgewählt aus dem Polystyrol, den Styrol-Acrylnitril- oder Styrol-Methacrylsäuremethylester-Kopolymeren, den Polypropylenen, den Polycarbonaten oder Analogen.
Anhand der erfindungsgemäßen immunologischen Reagenzien oder Nachweismittel kann man Anti-HCV-Antikörper in jedem Teil oder Milieu des Körpers, wie z. B. einer Blutprobe eines Individuums nachweisen, bei dem Verdacht besteht, mit HCV infiziert zu sein. Dafür genügt es, diesen Teil des Körpers und das vorgenannte Reagenz unter vorbestimmten Bedingungen, wie beispielsweise einer Temperatur, die eine eventuelle Immunreaktion erlaubt, in Kontakt zu bringen und anschließend das Vorhandensein eines Immunkomplexes mit diesem Reagenz nachzuweisen.
Unter "Teil des Körpers" versteht man jede Flüssigkeit, jedes Gewebe oder jedes Organ eines Individuums, die/das Anti- HCV-Antikörper in sich trägt oder in sich tragen könnte. Diese Teile des Körpers könnten eine Blutprobe, eine Plasmaprobe, eine Serumprobe, Proben verschiedener Sekrete etc. sein.
Das zuvor beschriebene Verfahren kann in allen Nachweis- Vorrichtungen oder -Geräten durchgeführt werden, die ein Behältnis aufweisen, um den zu analysierenden Teil des Körpers mit einem Reagenz, wie es zuvor definiert wurde, in Kontakt zu bringen, und das mit Mitteln, die für eine eventuelle Immunreaktion günstige Bedingungen, wie beispielsweise Temperatur, schaffen. Und diese Vorrichtung weist insbesondere optische Mittel zum Nachweis eines mit dem Reagenz erhaltenen Immunkomplexes auf.
Eine andere Art, das HCV-Virus mittels der Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung nachzuweisen, besteht darin, monoklonale oder polyklonale Antikörper mit jeder an sich bekannten Technik zu gewinnen, wobei eine immunologische Reaktion zwischen einem humanen oder tierischen Organismus und einem immunogenen Agens erfolgt, das sich aus einer Polypeptidmischung zusammensetzt, wie sie zuvor definiert wurde. Die so erhaltenen, beispielsweise geeignet markierten Antikörper können verwendet werden, um das HCV nachzuweisen oder um das Fortschreiten des Virus bei einem an der Hepatitis-C erkrankten Kranken zu verfolgen.
Natürlich kann jede der erfindungsgemäßen Polypeptidmischungen den Wirkstoff einer wirksamen immuntherapeutischen Zusammensetzung bilden, wobei er eventuell an einen angepaßten immunologischen Träger konjugiert ist. Ein pharmazeutisch annehmbarer Grundstoff kann die genannte Zusammensetzung vervollständigen. Eine solche Zusammensetzung ist beispielsweise eine Impf-Zubereitung.
Die immundominante Eigenschaft der Peptidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung wurde entsprechend dem folgenden Versuchsprotokoll gezeigt.
Die gewählte Strategie besteht darin, lange Peptidfragmente von ungefähr 40 Aminosäuren aus dem N-terminalen Bereich des CORE-Proteines zu synthetisieren, die der Sequenz der ungefähr 120 ersten Aminosäuren angehören.
Man hat demnach in einem ersten Stadium drei Peptide bestimmt, wobei die Synthese mit Aminosäure Nr. 2 (Serin) beginnt.
Gemäß Fig. 1 wurden drei Peptide synthetisiert, nämlich:
- Peptid S42G, das sich von dem Serin 2 bis zu dem Glycin 45 erstreckt,
- Peptid P42Y, das sich von dem Prolin 39 bis zu dem Tyrosin 82 erstreckt, und
- Peptid R40R, das sich von dem Arginin 75 bis zu dem Arginin 116 erstreckt.
Es ist offensichtlich, daß diese Peptide einige gemeinsame Aminosäuren aufweisen, was es erlaubt, eine in dem Überschneidungsbereich von zwei Peptiden lokalisierte, eventuelle antigene Determinante aufzuzeigen.
Die Peptide wurden durch Festphasensynthese gemäß der Technik von Merrifield (Barany G and Merrifield R. B., 1980, In the Peptides, 2, 1-284, Gross E and Meienhofer J, Eds Academic Press, New York) chemisch synthetisiert. Die Verfahrensweisen sind nachfolgend beschrieben.

Peptidsynthese

Die Peptide werden an einem Phenylacetamidomethyl (PAM)/Polystyrol/Divinylbenzen-Harz (Applied. Biosystems, Inc. Foster City, CA), unter Verwendung einer automatischen Synthesevorrichtung "Applied Biosystems 430A", synthetisiert. Die Aminosäuren werden in Form von Hydroxybenzotriazol(HOBT)-Estern gekoppelt. Die verwendeten Aminosäuren stammen von Novablochem (Laüflerlfingen, Schweiz) oder von BACHEM (Bubendorf, Schweiz).
Die chemische Synthese der Peptide wurde unter Verwendung eines Doppel-Kopplungsprotokolles mit N-Methyl-Pyrrolidon (NMP) als Lösungsmittel durchgeführt. Die Peptide wurden gleichzeitig mit den Seitenschutzgruppen mit Hilfe von Flußsäure (HF) in einer geeigneten Vorrichtung (Spaltungsvorrichtung Typ I, Peptide Institute, Osaka, Japan) von ihrem Harz abgespalten.
Für 1 g Peptidyl-Harz werden 10 ml HF, 1 ml Anisol und 1 ml Dimethylsulfid (DMS) verwendet, und die Mischung wird 45 Minuten lang bei -2ºC bewegt. Das HF wird anschließend unter Vakuum verdampft. Nach gründlichen Waschungen mit Ether wird das Peptid mit 10% Essigsäure von dem Harz eluiert und anschließend lyophilisiert.
Die Peptide werden durch präparative hochauflösende Flüssigkeits-Chromatographie auf einer VYDAC-Säule vom Typ C18 (250 · 21 mm) (The Separation Group, Hesperia, CA, USA) aufgereinigt. Die Elution wird mit einem Acetonitril-Gradienten bei einer Flußgeschwindigkeit von 22 ml/min durchgeführt. Die gesammelten Fraktionen werden durch eine Elution von einer analytischen VYDAC C18-Säule (250 · 4,6 mm) unter isokratischen Bedingungen bei einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min überprüft. Die Fraktionen, die dieselbe Retentionszeit aufweisen, werden vereinigt und lyophilisiert. Die Hauptfraktion wird anschließend durch analytische hochauflösende Flüssigkeits- Chromatographie mit dem zuvor beschriebenen System analysiert. Das Peptid, das von der Reinheit her als annehmbar erachtet wird, zeichnet sich durch einen einzigen Peak aus, der mindestens 95% des Chromatogrammes ausmacht.
Die aufgereinigten Peptide werden zum Zweck der Kontrolle ihrer Aminosäure-Zusammensetzung mit Hilfe eines automatischen Aminosäure-Analysators Applied Biosystems 420 H analysiert. Die Messung der (mittleren) chemischen molekularen Masse der Peptide erfolgt unter Verwendung der L.S.I.M.S.-Massenspektrometrie im Modus für positive Ionen in einer Doppel-Fokussierungs-Vorrichtung VG. ZAB.ZSEQ, die mit einem Erfassungssystem DEC-VAX 2000 (VG analytical Ltd., Manchester, England) verbunden ist.
Die Reaktivität dieser drei Peptide gegenüber Seren von Individuen, die mit dem Hepatitis-C-Virus infiziert sind, (HCV)-Positive genannt, wurde in einem ELISA-Test entsprechend dem nachfolgend beschriebenen Protokoll ermittelt.

Nachweis von Anti-HCV-Antikörpern durch ELISA

Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte der Marke "NUNC maxisorb" werden mit 100 ul einer Lösung, die das Peptid oder eine Mischung der Peptide (10 ug/ml) enthält, 2 Stunden lang bei 37ºC gesättigt. Die Platte wird anschließend ausgeleert und dann mit einem Waschpuffer gewaschen, der 0,05% Tween 20 enthält. Die Vertiefungen werden mit 100 pl Waschpuffer gesättigt, dem 10% Ziegen-Serum (v/v) zugesetzt wurde, dann 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und anschließend erneut wie zuvor gewaschen. Die zu analysierenden Seren werden mit dem Sättigungspuffer auf eine geeignete Verdünnung verdünnt. Die Inkubation der Seren beträgt eine Stunde bei 37ºC. Die Vertiefungen werden erneut gewaschen. Die Konjugationslösung (mit Peroxydase markiertem, gegen humanes IgG gerichtetem Ziegen- IgG) wird anschließend in einer Verdünnung von 1/1000 in dem Sättigungspuffer zugesetzt, und die Inkubation dauert 90 Minuten bei 37ºC. Nach dem Waschen wird die Orthophenylen-Diamin- Substrat-Lösung zugesetzt. Nach 10 Minuten wird die Reaktion durch 50 ul H&sub2;SO&sub4; gestoppt und die optische Dichte bei 492 nm abgelesen. Es ist zu bemerken, daß all die Tests im Doppel ausgeführt wurden.
Die Reaktivität der Peptide S42G, P42Y und R40R wird im ELISA gegenüber HCV-positiven Seren (P 1 bis P 20 und B 1 bis B 16) und Normal-Seren (SN 10, 11, 16, 17, 18, 19) gemessen.
Dafür werden die verschiedenen Peptide in einer Konzentration von 10 ug/ml an die Mikroplatten adsorbiert und die Seren in der Verdünnung 1/100 eingesetzt.
Die in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßten, erhaltenen Werte entsprechen der mit 10³ multiplizierten optischen Dichte (OD) bei 492 nm.
Das Experiment wurde für jedes Serum im Doppel durchgeführt. Die **** sind Werte außerhalb des oberen Meßbereiches. TABELLE 1
Tabelle 1 zeigt, daß die Peptide unterschiedlich mit den Seren reagieren.
Es zeigt sich eindeutig, daß das reaktivste Peptid das Peptid S42G ist, das 31 von 36 Seren nachweist.
Keines dieser Peptide weist die Normal-Seren nach, was ihre Spezifität bestätigt.
Schließlich ist kein mit dem Peptid S42G negatives Serum mit den Peptiden P42Y oder R40R positiv, was zeigt, daß das Peptid S42G allein, ohne die Hilfe der beiden anderen Peptide, die Seren nachweist.
Die Studie wurde dann fortgeführt, um die auf dem Peptid S42G liegende antigene Determinante oder liegenden antigenen Determinanten genauer kennenzulernen.
Zu diesem Zweck sind zwei Peptide unter denselben Bedingungen wie zuvor hergestellt worden.
Diese beiden Peptide sind gemäß der Fig. 1:
1. ein Peptid von 20 Aminosäuren, S18D genannt, das die Sequenz 2 bis 21 des CORE-Proteines abdeckt, und *
2. ein Peptid von 24 Aminosäuren, V22G genannt, das die Sequenz 22 bis 45 des CORE-Proteines abdeckt.
Die Reaktivität dieser beiden Peptide (getrennt und zusammen) im Vergleich mit derjenigen des Peptides S42G wurde, wie zuvor beschrieben, in einem ELISA-Test ermittelt.
Die Reaktivität der Peptide S42G, S18D, V22G, S18D + V22G gegenüber HCV-positiven Seren wird im ELISA gemessen. Die verschiedenen Peptide werden an den Mikroplatten in einer Konzentration von 10 pg/ml adsorbiert, und die Seren werden in der erwähnten Verdünnung eingesetzt.
Die in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellten, erhaltenen Werte entsprechen der optischen Dichte bei 492 nm. Alle Versuche wurden im Doppel durchgeführt. TABELLE 2
Jedes Serum wurde anfangs in der Verdünnung 1/100 getestet. In dem Fall, in dem sich die Reaktion für die Gesamtheit der Peptide (Beispiel: Serum P 5) als gesättigt erwies (Wert 2,500), ist man mit einer Verdünnung von 1/1000 und bei Bedarf mit einer Verdünnung von 1/10000 fortgefahren.
Es zeigt sich für alle HCV-positiven Seren, daß die Reaktivität des Peptides S42G eindeutig über der Reaktivität der Peptide S18D und V22G und über derjenigen von S18D + V22G liegt.
Die Seren P6, P9, P10, P13, P19, P23, P24 sind Seren, die keine Antikörper gegenüber dem CORE-Protein von HCV aufweisen.
Obgleich die Gesamtheit dieser Ergebnisse nicht mehrdeutig ist, kann die Bindung der verschiedenen Peptide in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten die Epitope oder Determinanten der getesteten Peptide verändern. Die verwendeten Platten (NUNC Maxisorb) sind mit Gammastrahlen bestrahlte Polystyrol-Platten, die die Peptide auf nicht-kovalente Weise aufgrund von elektrostatischen Bindungen aber genauso von hydrophoben Bindungen binden. Es kann sein, daß Peptide als Funktion ihrer Sequenz in ausgewählter Weise adsorbieren, wobei somit ein sehr genauer Bereich bevorzugt wird und durch denselben die immunogene Reaktivität gegenüber einem anderen Bereich, der weniger zugänglich geworden wäre, verhindert wird.
Um diese Hypothese zu bewerten, hat man Inhibitionsversuche durchgeführt, deren Vorteil darin besteht, die Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen in flüssigem Milieu zu erlauben, wobei man sich somit von möglichen Artefakten im Zusammenhang mit der Adsorption der Peptide an einen festen Träger befreit.
Das Verfahren ist das nachfolgend beschriebene.

Inhibitionsversuch

Die Inhibitionsexperimente wurden durch Flüssig-Phasen- Reaktion der HCV-Seren mit den Peptiden, gefolgt von der Reaktion der verbleibenden Antikörper mit dem auf der Mikrotiterplatte adsorbiertem Peptid, durchgeführt. Die inhibitorischen Peptide werden in einer Konzentration von 0,1 mg/ml mit den Seren in der geeigneten Verdünnung inkubiert. Die Handlungsabfolge ist mit der für den ELISA-Test beschriebenen identisch.
Das Peptid S18D oder V22G oder die Mischung aus beiden wird in Anwesenheit von zu testendem Serum eine Nacht vorinkubiert. Die Antikörper können sich an die entsprechenden Stellen binden. Die Mischung (Peptid + Serum) wird anschließend mit dem auf den Mikrotiterplatten adsorbierten Peptid S42G inkubiert. Wenn alle Antikörper bei der Inkubation mit den Peptiden S18D, V22G oder mit der Mischung reagiert haben, wird keine Reaktivität beobachtet werden, was zu einer Inhibition von 100% führen wird. Wenn im Gegensatz dazu für das Peptid S42G passende Antikörper verbleiben, werden sie dann reagieren können.
Durch Vorinkubation von jedem Serum mit dem Peptid S42G wird eine Kontrolle durchgeführt, die es erlaubt, die prozentuale Inhibition zu berechnen.
Die Tabelle 3 faßt die Ergebnisse der Inhibition der Anti- HCV-Antikörper-Bindung (Verdünnung 1/10000) an das Peptid S42G durch Vorinkubation der HCV-Seren mit dem Peptid S42G, dem Pep tid S18D, dem Peptid S22G und der Mischung der Peptide S18D + S22G zusammen. TABELLE 3
Wie in Tabelle 3 gezeigt, inhibiert kein Peptid die Reaktivität der Seren gegenüber dem Peptid S42G vollständig.
Anders gesagt, beweist dieses Experiment, daß es für das Peptid S42G spezifische Antikörper gibt, die weder mit dem Peptid S18D noch mit dem Peptid V22G reagieren, die beide zusammen die gesamte Sequenz des Peptides S42G verkörpern.
Eine letzte zu bewertende Hypothese besteht darin, zu überprüfen, ob die für das Peptid S42G spezifischen Antikörper nicht gegen den zentralen Bereich des Peptides S42G, d. h. die Verbindungsstelle der Peptide S18D und V22G, gerichtet sind.
Demzufolge hat man ein Peptid hergestellt (vgl. Fig. 1), dessen Sequenz den C-terminalen Bereich (6 Aminosäuren) des Peptides S18D und den N-terminalen Bereich (6 Aminosäuren) des Peptides V22G umfaßt.
Obgleich dieses Peptid eine Reaktivität mit HCV-positiven Seren aufweist, ist das erreichte Niveau in keinem Fall mit demjenigen vergleichbar, das mit dem Peptid S42G erreicht wurde.
Die Gesamtheit der zuvor dargestellten Ergebnisse erlaubt, die folgenden Schlußfolgerungen zu ziehen.
Von den 120 N-terminalen Aminosäuren des CORE-Proteines und ganz besonders von den 62 ersten Aminosäuren sind die 45 ersten Aminosäuren die reaktivsten gegenüber HCV-positiven Seren.***
Die 21 ersten Aminosäuren (Peptid S18D) reagieren, was die 0Anwesenheit einer antigenen Determinante oder mehrerer antigener Determinanten auf diesem Peptid zeigt.
Die Aminosäuren 22 bis 45 (Peptid V22 G) tragen ebenfalls ein oder mehrere Epitop(e).
Die Verbindungsstelle dieser beiden Sequenzen ist ebenfalls reaktiv.
Folglich ist die Sequenz 1 bis 45 des CORE-Proteines pluriepitopisch.
Darüber hinaus gibt es eine antigene Determinante oder antigene Determinanten, die nur in dem Maß, in dem die Sequenz 2 bis 45 als Ganzes und nicht diskontinuierlich (Peptide S18D + V22G) zur Verfügung steht, reaktiv ist/sind. Diese dem Peptid S42G eigenen Epitope sind ohne jeden Zweifel Epitope vom Konformationstyp, die nur in dem Maß existieren können, in dem diese Sequenz von 44 Aminosäuren (Peptid S42G) eine entsprechende Struktur darstellt, eine Struktur, die nicht mit den in der Größe weiter reduzierten Peptiden erlangt wird.
Wenn die Sequenz der Aminosäuren des Peptides S42G nicht diskontinuierlich sein darf, um alle Epitope zu erhalten, kann man sich fragen, ob die N- und/oder C-terminalen Bereiche des Peptides S42G in die Epitop-Konformationen von S42G eingreifen oder selbst Epitope tragen.
Um zu antworten zu versuchen, hat man fünf von S42G durch N- und/oder C-terminale Kürzungen abgeleitete Peptidfragmente bestimmt.
Gemäß der Fig. 2 wurden die fünf folgenden Fragmente nach dem Verfahren von Merrifield gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll synthetisiert:
- Peptid P37G, das der Aminosäuresequenz 7 bis 45 des CORE- Proteines entspricht und eine Entfernung von 5 Aminosäuren vom N-terminalen Bereich von S42G aufweist,
- Peptid K32G, das der Aminosäuresequenz 12 bis 45 des CORE- Proteines entspricht und eine Entfernung von 10 Aminosäuren vom N-terminalen Bereich von S42G aufweist,
- Peptid S32Y, das der Aminosäuresequenz 2 bis 35 des CORE- Proteines entspricht und eine Entfernung von 10 Aminosäuren vom C-terminalen Bereich von S42G aufweist,
- Peptid P27Y, das der Aminosäuresequenz 7 bis 35 des CORE- Proteines entspricht und eine Entfernung von 5 Aminosäuren vom N-terminalen Bereich und von 10 Aminosäuren vom C-terminalen Bereich von S42G aufweist, und
- Peptid K22Y, das der Aminosäuresequenz 12 bis 35 des CORE- Proteines entspricht und eine Entfernung von 10 Aminosäuren vom N-terminalen Bereich und von 10 Aminosäuren vom C-terminalen Bereich von S42G aufweist.
Die Reaktivität der fünf Peptide gegenüber Seren von Individuen, die durch das HCV infiziert sind, wurde gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll zur Messung der Aktivität der Peptide S42G, P42Y und R40R in ELISA-Tests ermittelt.
Die folgende Tabelle 4 faßt die Ergebnisse zusammen, die für die Peptide S42G, S32Y, P27Y, K22Y erhalten wurden, um den Einfluß einer Kürzung des N-terminalen Bereiches und des C-terminalen Bereiches des Peptides S42G zu untersuchen.
Diese Ergebnisse sind als Werte der optischen Dichte ausgedrückt, die bei 492 nm abgelesen und mit einem Faktor von 10³ multipliziert wurde. TABELLE 4
Die Seren P23 und P10 sind Seren, die keine Antikörper gegenüber dem CORE-Protein von HCV aufweisen.
Aus dieser Tabelle kann man folgern, daß S42G durch das Entfernen von 10 Aminosäuren von seinem C-terminalen Bereich seine Reaktivität verliert, und daß sich darüber hinaus eine Verminderung der Immunreaktivität ergibt, wenn man von seinem N-terminalen Bereich 5 bzw. 10 Aminosäuren entfernt, wobei die Verminderung um so größer ist, je verkürzter die Länge des Peptides ist. (Vgl. Fig. 2 und insbesondere die Seren P2, P5 und P8 in Tabelle 4).
Die Tabelle 5 faßt die Ergebnisse der Immunreaktivitätsuntersuchungen der Peptide S42G, P37G, K32G in ELISA-Tests zur Untersuchung des Einflusses einer Kürzung des N-terminalen Bereiches von Peptid S42G zusammen.
Die angegebenen Werte entsprechen der mit dem Faktor 10³ multiplizierten, bei 492 nm abgelesenen optischen Dichte. TABELLE 5
Diese Ergebnisse stärken uns in der Hypothese, daß das Peptid S42G in seiner gesamten Sequenz von 2 bis 45 vorliegen muß, um eine maximale Immunreaktivität zu zeigen.
In allen Fällen liegt S42G oberhalb von P37G, was zeigt, daß die 5 N-terminalen Aminosäuren eine Rolle bei der Antigenität spielen.
In bestimmten Fällen stellt man jedoch zwischen den Peptiden P37G und K32G einen geringen oder keinen Unterschied in der Reaktivität fest, was ein Beweis dafür sein könnte, daß die Aminosäuren 7 bis 11 nicht von großer Bedeutung für die Antigenität des Peptides S42G sind.
Der Vergleich der Tabellen 4 und 5 erlaubt es übrigens, die Bedeutung der 10 C-terminalen Aminosäuren des Peptides S42G für dessen Immunreaktivität zu zeigen.
Zum Schluß hat man das vollständige CORE-Protein (191 Aminosäuren) durch das Peptid S42G (44 Aminosäuren) ersetzt, um die Anti-HCV-Antikörper nachzuweisen.
Um dies zu tun, hat man sich entschieden, die Empfindlichkeit des Peptides S42G mit derjenigen des ORTHO VHC ELISA-Tests der zweiten Generation zu vergleichen; es handelt sich dabei um einen kommerziellen Test der Firma ORTHO, der ein C&sub2;&sub2;-3 genanntes Fusionsprotein umfaßt, das das CORE-Protein von HCV beinhaltet; vgl. Vanderpoel, C. L., HTM Cuypers, H. W. Reesink et al., 1991, "Confirmation of hepatites C virus infection by new four antigen recombinant immunoblot assay, Lancet 337; 317-319.
Der Vergleich beruhte auf 173 Proben, die mit dem ORTHO HCV ELISA-Test der zweiten Generation positiv waren.
Von 173 Proben hat das Peptid S42G 151 nachgewiesen, was eine Empfindlichkeit von 87,28% ergibt. Die 22 nicht übereinstimmenden Seren sind dann mit Hilfe eines anderen Testes der zweiten Generation, nämlich CHIRON RIBA VHC, untersucht worden. Es handelt sich dabei um einen "Immunoblot", der für den Nachweis von Antikörpern bestimmt ist, die gegen die Antigene des Hepatitis-C-Virus in humanem Serum oder Plasma gerichtet sind. Dieser Test umfaßt fünf rekombinante Antigene (Proteine). Eines davon ist das rekombinante CORE-Protein C22-3, das in Form eines Fusionsproteines mit der humanen Superoxid-Dismutase gewonnen und in einer Hefe exprimiert wird.
Am Ende dieser Bestätigungstests stellt sich heraus, daß keines der 22 Seren Reaktivität gegenüber der Bande C22-3 (CORE) zeigt.
Folglich liegt die Empfindlichkeit des Peptides S42 G im Vergleich zu dem CORE-Protein (C22-3) des CHIRON RIBA VHC- Testes der zweiten Generation bei 100%.
Folglich kann man für den serologischen Nachweis von HCV das CORE-Protein durch das Peptid S42 G ersetzen.
In diesem Stadium der Darlegung der Erfindung ist es angebracht, die vorteilhafte Verwendung der synthetischen Peptide im Vergleich zu derjenigen rekombinanter Proteinfragmente aufzuzeigen. Dazu hat man die Ergebnisse und experimentellen Befunde gemäß der Erfindung mit denjenigen der Publikation verglichen, nämlich:
Nasoff MS, Zebedee SL, Inchauspe G, Prince AM, "Identification of an immunodominant epitope within the capsid protein of hepatis C virus", Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 4641-5. Diese Publikation bezieht sich auf die Gewinnung von in E. coli exprimierten rekombinanten Proteinfragmenten des CORE-Proteines gemäß Fig. 3 und berichtet von Ergebnissen, die den zuvor berichteten zugleich ähnlich sind und von ihnen abweichen.
Tatsächlich haben die Autoren ein rekombinantes Protein exprimiert, das die 74 ersten Aminosäuren des CORE-Proteines umfaßt. Die verwendete Klonierungs-Strategie führt zur Herstellung eines Fusionsproteines. Anders gesagt gehen den 74 CAP-A genannten N-terminalen Aminosäuren des CORE-Proteines von HCV 308 Aminosäuren voraus, deren 221 erste der Glutathion-S-Transferase entsprechen. Die Reaktivität dieses Proteines aus 382 Aminosäuren, von denen nur 20% das CORE-Protein verkörpern, gegenüber HCV-positiven Seren ist nicht so gut wie sie scheint, wenn man die sehr geringe Anzahl getesteter Seren (5 humane Seren) berücksichtigt.
Andererseits zeigt ein CAP-B genanntes Protein, das die Sequenz 69-120 des CORE-Proteines umfaßt, keine Reaktivität gegenüber denselben Seren. Dieses letzte Ergebnis steht in relativem Widerspruch zu denjenigen der vorliegenden Erfindung, da das Peptid R40R, das die Sequenz 75-116 desselben Proteines umfaßt, dennoch mit einigen Seren (ungefähr 10%, vgl. Tabelle 1) reagiert.
Dieselben Autoren haben ihre Arbeit fortgeführt, um andere rekombinante Fusionsproteine mit den jeweils der Sequenz des CORE-Proteines entsprechenden Aminosäuren 1-20, 21-40, 41-60 herzustellen, die CAP-1, CAP-2 bzw. CAP-3 genannt werden.
Ihre immer noch mit einer sehr geringen Anzahl humaner Seren (9 Seren) erzielten Ergebnisse zeigen, daß die Sequenz 21-40 besser reagiert als die Sequenz 1-20. Die Sequenz 41-60 zeigt für sich keine Reaktivität. Dieses letzte Ergebnis steht gleichfalls in relativem Widerspruch zu den erfindungsgemäß gezeigten, da das Peptid P42Y (Aminosäuren 39-82) eine erhöhte Reaktivität zeigt (vgl. Tabelle 1), obgleich sie niedriger ist als die von Peptid S42G.
Außerdem hat eine andere Publikation, nämlich: Okamoto H, Munekata E, Tsuda F, Takahashi K, Yotsumoto C et al., 1990, Jpn, J. Exp Med 60, 223-233, gezeigt, daß ein Peptid von 36 Aminosäuren, das die Sequenz 39-74 des CORE-Proteines umfaßt, mit mindestens 70% der HCV-positiven Seren reagiert.
Diese Autoren behaupten bezüglich der Reaktivität der Sequenz 21-40, daß die Reaktivität dieses rekombinanten Fragmentes des CORE-Proteines in mehreren Fällen höher ist als die desjenigen, das die Sequenz 1-74 umfaßt.
Die erfindungsgemäß gewonnenen Ergebnisse stehen zu den Ergebnissen dieser Autoren im Widerspruch, da man aufgezeigt hat, daß die Reaktivität des Peptides S42G (Sequenz 2-45) in allen Fällen untersuchter HCV-Seren (vgl. Tabelle 2) eindeutig über derjenigen der Peptide S18D (Sequenz 2-21) und V22G (Sequenz 22-45) liegt.
Die vorgeschlagene Erklärung, um diese voneinander abweichenden Ergebnisse zu erklären, betrifft die Gewinnung der verschiedenen Fragmente des CQRE-Proteines in den beiden Fällen.
Gemäß der Erfindung umfassen die durch chemische Synthese gewonnenen Peptide einzig die für jedes von ihnen erwähnte Sequenz, was, wie es oben erklärt wurde, einer der mit diesen synthetischen Peptiden verbundenen Vorteile ist.
Was die von NASOFF et al. gewonnenen rekombinanten Proteine betrifft, handelt es sich um Fusionsproteine, in denen sich an der N-terminalen Position 308 Aminosäuren finden, die dem CORE-Protein vollkommen fremd sind.
Die rekombinanten Proteine, die die Sequenzen 1-20 und 21- 40 des CORE-Proteines umfassen, sind demnach zu über 90% aus einer fremden Sequenz zusammengesetzt.
Obgleich die Autoren mitteilen, daß bei Nachweis-Verfahren der Glutathion-S-Transferase-Anteil des Fusionsproteines die Reaktion nicht behindert, da keines der getesteten Seren mit der isolierten Glutathion-S-Transferase reagiert (demnach nicht falsch-positiv), ist es schwer vorstellbar, daß diese 90% des Fusionsproteines in keiner Weise in die Reaktivität mit den Anti-HCV-Antikörpern eingreifen.
Tatsächlich trägt die Tatsache, daß der N-terminale Bereich der Sequenzen 1-20 oder 21-40 des CORE-Proteines an den C-terminalen Bereich des Fusionsproteines gebunden ist, dazu bei, die Zugänglichkeit dieser N-terminalen Region einzuschränken. Andererseits wird der C-terminale Bereich an sich herausgestellt. Es ist sehr wahrscheinlich, daß es diese strukturellen Zwänge bei der Gewinnung eines rekombinanten Fusionsproteines sind, in dem der immunogene Bereich (der CORE-Bereich) den Minderanteil des Fusionsproteines verkörpert (in diesem Fall weniger als 10%), die zu Ergebnissen führen, die im Gegensatz zu den hier dargestellten stehen.
Die Aminosäuren sind entsprechend den Fig. 1 und 2 gemäß der Konvention der folgenden Tabelle dargestellt: TABELLE 6
Gemäß der Erfindung zeigt das zuvor dargelegte vollständige Versuchsprotokoll durch die entweder in Festphase (direkter ELISA, vgl. Tabelle 2) oder als Inhibition (vgl. Tabelle 3) durchgeführten Antigen-Antikörper-Reaktionsarten deutlich, daß die durch chemische Festphasensynthese gewonnene Sequenz 2-45 des CORE-Proteines des HCV-Virus sich nicht nur den kleineren Sequenzen (S18D oder V22G) als eindeutig überlegen erweist, sondern daß sie gleichfalls eine gleichwertige Empfindlichkeit wie das CORE-Protein selbst zeigt (Protein C&sub2;&sub2;- 3 des CHIRON RIBA VHC-Tests der zweiten Generation), und daß man folglich in serologisch-diagnostischen Tests das synthetische Peptid S42G statt des CORE-Proteines verwenden kann.
Aus all diesen Ergebnissen geht hervor, daß das Peptid S42G die minimale aber hinreichende Struktur zu sein scheint, die vom Standpunkt seiner antigenen Eigenschaften zu dem CORE- Protein in seiner Gesamtheit gleichwertig ist und es demnach in einem Reagenz zum Nachweis von HCV ersetzen kann.

ANZAHL DER SEQUENZEN: 2

1) SEQ-ID NO. 1 BETREFFENDE INFORMATION:
i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
A) LÄNGE: 45 Aminosäuren
B) ART: Aminosäuresequenz
ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
iii) HYPOTHETISCH: nein
v) ART DES FRAGMENTS: N-terminal
vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
A} ORGANISMUS: humaner Hepatitis-C-Virus
B) STAMM: H77, veröffentlicht von Ogata N. et al., "Nucleotide Sequence and Mutation Rate of the H strain of Hepatitis Virus", Proc. Natl. Academ Sci. USA, 88: 3392-6 (1991)
ix) CHARAKTERISTIKA:
A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
B) LAGE: 1..45
D) SONSTIGE ANGABEN:
N-terminale Sequenz des Nukleocapsid-Proteines oder CORE- Proteines des humanen Hepatitis-C-Virus. xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID NO. 1

2) SEQ-ID NO. 2 BETREFFENDE INFORMATION:

i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
A) LÄNGE: 44 Aminosäuren
B) ART: Aminosäuresequenz
ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
iii) HYPOTHETISCH: nein
v) ART DES FRAGMENTS: N-terminal
vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
A) ORGANISMUS: humaner Hepatitis-C-Virus
B) STAMM: H77, veröffentlicht von Ogata N. et al., "Nucleotide Sequence and Mutation Rate of the H strain of Hepatitis Virus", Proc. Natl. Academ Sci. USA, 88: 3392-6 (1991)
ix) CHARAKTERISTIKA:
A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
B) LAGE: 2..45
D) SONSTIGE ANGABEN:
N-terminale Sequenz des Nukleocapsid-Proteines oder CORE- Proteines des humanen Hepatitis-C-Virus. xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID NO. 2

Claims

1. Polypeptid, bestehend aus einer Peptidsequenz, die eine immunologische Reaktivität gegenüber dem HCV aufweist und aus den Sequenzen ausgewählt ist, die durch SEQ ID-NO. 1 und SEQ ID-NO. 2 sowie die homologen Sequenzen von SEQ ID-NO. 1 und SEQ ID-NO. 2 identifiziert sind.

2. Polypeptidmischung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Mischung aus mindestens zwei Polypeptiden aufweist, deren Sequenz ausgewählt ist aus (a) den Sequenzen SEQ ID-NO. 1 und SEQ ID-NO. 2, (b) den Sequenzen, die einer Kürzung von SEQ ID- NO. 1 um 1 bis 10 Aminosäuren in ihrem N-terminalen Bereich oder um 1 bis 10 Aminosäuren in ihrem C-terminalen Bereich entsprechen, und (c) den Sequenzen, die homolog zu den Sequenzen gemäß (a) oder (b) sind.

3. Mischung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Sequenz gemäß (b) aus der um 1 bis 5 Aminosäuren an ihrem N-terminalen Ende gekürzten SEQ ID-NO. 1 zusammensetzt.

4. Mischung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Sequenz gemäß (c) aus der um 1 bis 5 Aminosäuren an ihrem C-terminalen Ende gekürzten SEQ ID-NO. 1 zusammensetzt.

5. Reagenz zum Nachweis von humanem Hepatitis-C-Virus (HCV), dadurch gekennzeichnet, daß es als reaktive Substanz ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder eine Mischung nach einem der Ansprüche 2 bis 4 aufweist.

6. Mittel zum Nachweis des humanen Hepatitis-C-Virus (HCV), dadurch gekennzeichnet, daß ein Reagenz nach Anspruch 5 von einem festen Träger getragen wird, der immunologisch mit dem besagten Reagenz vereinbar ist.

7. Verfahren zum Nachweis von Anti-HCV-Antikörpern in einem Teil des Körpers, wie z. B. einer Blutprobe eines Individuums, das in Verdacht steht, mit HCV infiziert zu sein, dadurch gekennzeichnet, daß man den besagten Teil des Körpers und ein Reagenz nach Anspruch 5 unter Bedingungen in Kontakt bringt, die eine eventuelle immunologische Reaktion erlauben, und daß man anschließend die Anwesenheit eines Immunkomplexes mit dem besagten Reagenz nachweist.

8. Vorrichtung oder Gerät zum Nachweis von Anti-HCV- Antikörpern in einem Teil des Körpers, wie z. B. einer Blutprobe eines Individuums, das in Verdacht steht, mit HCV infiziert zu sein, dadurch gekennzeichnet, daß sie/es ein Behältnis aufweist, um den besagten Teil des Körpers mit einem Reagenz nach Anspruch 5 in Kontakt zu bringen, mit Mitteln, die Bedingungen, wie beispielsweise Temperatur schaffen, die an eine eventuelle immunologische Reaktion angepaßt sind, und Mitteln, insbesondere optischen Mitteln zum Nachweis eines Immunkomplexes mit besagtem Reagenz.

9. Immuntherapeutisch wirksame Zusammensetzung, insbesondere Impf-Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder eine Peptidmischung nach einem der Ansprüche 2 bis 4 und ggf. einen pharmazeutisch annehmbaren Grundstoff aufweist, wobei der Wirkstoff ggf. an einen passenden immunologischen Träger konjugiert ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, als Behandlungsmittel gegen das humane Hepatitis-C-Virus.

11. Monoklonale oder polyklonale gegen das humane Hepatitis-C-Virus gerichtete Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch eine immunologische Reaktion eines humanen oder tierischen Organismus auf ein immunogenes Reagenz gewonnen wurden, das aus einem Polypeptid nach Anspruch 1 aufgebaut ist.

12. Reagenz zum Nachweis des humanen Hepatitis-C-Virus (HCV), dadurch gekennzeichnet, daß es als wirksame Substanz einen Antikörper nach Anspruch 11 aufweist.