DE69111511T2 - Biokatalytisches Verfahren zur Herstellung von L-(-)-Carnitin aus Crotonobetain und Stämme von Proteeae zur Verwendung in diesem Verfahren. - Google Patents

Biokatalytisches Verfahren zur Herstellung von L-(-)-Carnitin aus Crotonobetain und Stämme von Proteeae zur Verwendung in diesem Verfahren.

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-(-)-Carnitin (2) aus Crotonobetain (1) mittels der Wirkung eines durch einen Mikroorganismus hergestellten Enzyms, wobei dieses Enzym die stereospezfisiche Hydratisierung von Crotonobetain zu L-(-)-Carnitin katalysiert.
  • Die Erfindung betritt auf neue Proteeae-Stämme, die zur Verwendung in diesem Verfahren geeignet sind.
  • Man weiß, das Carnitin ein einzelnes Asymmetriezentrum enthält, und es daher zwei Enantiomorphe gibt, bezeichnet als D-(+)-Carnitin und L-(-)-Carnitin. Von diesem wird nur L-(-)-Carnitin in lebenden Organismen gefunden, wo es als Vehikel für den Transport von Fettsäuren über mitochondriale Membranen agiert. Während L-(-)-Carnitin das physiologisch-aktive Enantiomer ist, wurde sei einigen Jahren razemisches DL-Carnitin als therapeutischer Wirkstoff verwendet. Es wurde jedoch nun erkannt, daß D-(+)-Carnitin ein kompetitiver Inhibitor von Carnitinacyltransferasen ist, und das es den Spiegel an L-(-)-Carnitin in Myocardium und im Skelettmuskel vermindern kann.
  • Es ist daher wesentlich, daß nur L-(-)-Carnitin den Patienten, welche sich einer Hämodialysebehandlung oder einer Behandlung von Fehlfunktionen, die das Herz oder den Lipidmetabolismus betreffen, unterziehen, verabreicht wird.
  • Es wurden verschiedene chemische Verfahren für die Herstellung von Carnitin im industriellen Maßstab vorgeschlagen. Diese Verfahren sind nicht spezifisch und führen zu razemischen Mischungen von D-(+)- und L-(-)-Isomeren. Es ist daher notwendig, Verfahren zur Trennung anzuwenden, um die enantiomeren Konstituenten des Razemats voneinander zu trennen. Die zuvor erwähnten synthetischen chemischen Verfahren sind komplex und kostenaufwendig und führen in allen Fällen zur Herstellung von äquimolaren Mengen an D-(+)- Carnitin und L-(-)-Carnitin.
  • Mehrere mikrobiologische Verfahren wurden jüngst für die Herstellung von L-(-)-Carnitin vorgeschlagen, entweder de novo aus üblichen Fermentationsbestandteilen oder über stereospezifische Transformation von achiralen Betainderivaten. Was die ersteren Verfahren betrifft, so beschreibt das japanische Patent 71567/1984 (TAKEDA) die Umwandlung van L-(-)-Carnitin durch den Schimmelpilz Emericella quadrilineata, wenn der Organismus in einem komplexen Medium kultiviert wird. Die meisten der letzteren Verfahren legen einen Schwerpunkt auf die stereospezifische Hydratisierung von Crotonobetain zu L-(-)- Carnitin und unterscheiden sich im Prinzip nur durch den bestimmten Mikroorganismus, der zur Durchführung der fraglichen Biotransformation eingesetzt wird.
  • Die meisten der in der relevanten Patentliteratur beschriebenen Mikroorgansimen gehören zu der Familie Enterobacteriaceae [z. B. EP 121 444 (HAMARI), EP 122 794 (AJINOMOTO), EP 148 132 (SIGMA-TAU), DDRP 221 905 (KARL- MARX-UNIVERSITÄT), JP-Anmeldung 61/234788 (SEITETSU)], einschließlich Proteus mirabilis, obwohl Nicht-Enterobacterien ebenfalls verwendet werden [z. B. EP 158 194 und EP 195 944 (LONZA), wo Stämme von Achromobacter xylosoxydans verwendet werden, und JP-Anmeldung 60/27581 (Biol K.K. & CHO KASEHIN K.K.), für die optimale Ergebnisse unter Verwendung des Schirnmelpilzes Penicillium citrinium berichtet wurden].
  • Andere Substanzen als Crotonobetain, die als Vorläufer für die mikrobielle Produktion von L-(-)-Carnitin versucht wurden, umfassen 3-Deydrocarnitin [z. B. JP 272086/1987 (AJINOMOTO)] und Carnitinnitril [EP 319 344 (KYOWA HAKKO KOGYO)].
  • Jedoch haben sich die bis heute vorgeschlagenen mikrobiellen Verfahren als nicht praktikabel zur Herstellung von L-(-)-Carnitin in einem industriellen Maßstab aus einen oder mehreren der folgenden Gründe erwiesen:
  • (i) die Ausbeute an L-(-)-Carnitin ist äußerst gering;
  • (ii) das Vorläufersubstrat ist extrem instabil;
  • (iii) die Mikroorganismen müssen in einem teuren Nährmedium kultiviert werden;
  • (iv) die Mikroorganismen können nur niedrige Konzentrationen (bis zu 2 bis 3 % (Gewicht/Volumen)] Crotonobetain tolerieren;
  • (v) Nebenreaktionen, wie die Reaktion von Crotonobetain zu gamma-Butyrobetain oder die Oxidation von L-(-)-Carnitin zu 3-Dehydrocarnitin vermindern die Endausbeute an L-(-)-Carnitin.
  • Das im folgenden beschriebene Verfahren verwendete Crotonobetain bestand aus ca. 89 % (Gewicht/Gewicht) innerem Crotonobetainsalz (entsalztes Crotonobetain) + ca. 11 % (Gewicht/Gewicht) Wasser (bestimmt unter Verwendung von Karl-Fischer-Reagens), entsprechend ca. einem Wassermolekül pro Molekül Crotonobetain. Folglich soll dieses Substrat im folgenden als "Crotonobetainmonohydrat" bezeichnet werden, obwohl "Monohydrat" nicht eine definitive Strukturbeziehung zwischen Crotonobetain und Wasser implizieren soll.
  • Wenn anderswo der Begriff "inneres Crotonobetainsalz" verwendet wird, betrifft er 100 % reines inneres Crotonobetainsalz (wasserfreies entsalztes Crotonobetain.
  • Vier neue Stämme von Proteus mirabilis, die zur Hydratisierung von Crotonobetain zu L-(-)-Carnitin in Biotranformationsmedien in der Lage sind, wobei die Konzentration von innerem Crotonobetainsalz ca. 10 bis 12 % (Gewicht/Volumen) ist, wurden isoliert und deren biologische Typen bestimmt (siehe unten). Diese neuen Stämme erfordern keine teuren Nährstoffe oder Zusätze weder für das Wachstum noch für die Biotransformation; vielmehr können sowohl Zellwachstum als auch Biotransformation unter Verwendung einfacher, billiger Medien erreicht werden. Innerhalb der Nachweisgrenzen der eingesetzten analytischen Verfahren katalysieren die neuen erfindungsgemäßen P. mirabilis- Stämme keine Nebenreaktionen, wie solche, die in dem zuvor erwähnten (v) angegeben sind, nämlich die Reduzierung der Endausbeute an L-(-)-Carnitin.
  • Es wurden gefunden, daß vier P. mirabilis-Isolate in der Lage sind, 12 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat (744,4 mM) zu L-(-)-Carnitin in molaren Ausbeuten, die 40 % übersteigen, umzuwandeln.
  • Die vier P. mirabilis-Isolate (inhäusig bezeichnet als Sigma-Tau SP237 Subklon NACit I1, Sigma-Tau BT 1IV, Sigma-Tau GP 1AVI und Sigma-Tau R 2AIX) wurden am 21. April 1989 bei der Agricultural Research Service Culture Collection, Northern Regional Research Centre, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 USA unter den Hinterlegungsnummern NRRL B-18480, NRRL B-18481, NRRL B-18482 und NRRL B- 18483 durch das Agricultural Research Service hinterlegt. Die Isolierverfahren und die morphologischen und physiologischen/biochemischen Eigenschaften der vier Stämme sind im folgenden beschrieben.
    • (i) PROTEUS MIRABILIS NRRL B-18480 (SIGMA-TAU SP237 SUBKLON NACit I1)
  • Der Organismus wurde ursprünglich morphologisch als Verunreinigung auf einer Platte von Acinetobacter lwoffii erkannt. Der Organismus wurde anschließend unter Verwendung eines Mediums (im folgenden als NACit + cb bezeichnet), bestehend aus Nährbrühe + 0,8 % (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid + 0,5 % (Gewicht/Volumen) Zitronensäuremonohydrat + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat + 2 % Agar, pH eingestellt auf 6,8 mit Kaliumhydroxid, gereinigt.
  • Der Organismus wurde durch täglichen Transfer (37ºC) auf NACIT + cb am Leben erhalten, er wurde durch die American Type Culture Collection (ATCC) (Rockvill, Maryland, USA) und durch die Industrial Microbiology Laboratories at Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A. (Pomezia, Italien) unter Einsatz morphologischer Untersuchung in Verbindung mit API 20 E (Version C), API ZYM (Version B) und API 50 CHE (Version D) Streifen (API System S.A., Montalieu-Vercieu, Frankreich) und anderen biochemischen/physiologischen Tests, je nach Notwendigkeit, typisiert.
  • Morphologische Eigenschaften
  • Gramstamm: negativ
  • Form: Bacillus
  • Dimensionen: 0,9 x 4 m
  • Flagella: peritrichös
  • Beweglichkeit: vorhanden, schwärmt
  • Chromogenese: negativ
  • Sporolation: negativ
    • Physiologische/biochemische Eigenschaften
  • Notwendigkeit für > CO&sub2;: negativ
  • Notwendigkeit für ≥ 0,5 % NaCl: negativ
  • Voges-Proskauer (Raumtemperatur): schwach
  • Voges-Proskauer (37ºC): zweifelhaft
  • Methylrot: positiv
  • Herstellung von H&sub2;S (dreifach Zuckerionenagar): negativ
  • Wachstum in Simmons Citratmedium: negativ
  • Verwertung von Citrat: negativ
  • Verwertung von L-Tartrat: negativ
  • Verwertung von Mucat: negativ
  • Wachstum auf Acetat als einzige Kohlenstoffquelle: negativ
  • Wachstum auf Malonat als einzige Kohlenstoffouelle: negativ
  • Wachstum auf MacConkey-Agar: positiv
  • Verflüssigung von Gelatine: negativ
  • Aminosäureauxotrophy: L-Histidin
  • Pectinhydrolyse: negativ
  • Saure Phosphatase (Naphthol AS-BI-Phosphat, pH 5,4): negativ
  • Saure Phosphatase (β-Naphthylphosphat, pH 5,4): positiv
  • Alkalische Phosphatase (β-Naphthylphosphat, pH 8,5): positiv
  • Esterase (β-Naphthylbutyrat): negativ
  • Esterase (β-Naphthylcaprylat): negativ
  • Lipase (β-Naphthylmyristat): negativ
  • Hydrolyse von Tween 20: positiv
  • Hydrolyse von Tween 80: negativ
  • Arginindihydrolase: negativ
  • Argininverwertung (Moller's-Medium): negativ
  • Ornithindecarboxylase: negativ
  • Lysindecarboxylase: negativ
  • Produktion von Indol: negativ
  • Tryptophandeaminase: positiv (schwach)
  • Phenylalanindeaminase: positiv
  • Urease: positiv
  • Trypsin: negativ
  • Chymotrypsin: negativ
  • Cystinarylamidase: negativ
  • Leucinarylamidase: positiv
  • Valinarylamidase: negativ
  • Catalase: positive
  • Oxidase: negativ
  • Reduktion von Nitrat zu Nitrit: positiv
  • Wachstum in Gegenwart von KCN: positiv
  • O-F-Glucose, oxidativ: positiv
  • O-F-Glucose, fermentativ: positiv
  • β-Galactosidase: negativ
  • β-Galactosidase: negativ
  • β-Glucuronidase: negativ
  • β-Glucosidase: negativ
  • β-Glucosidase: negativ
  • N-Acetyl-β-glucosaminidase: negativ
  • α-Fucosidase: negativ
  • α-Mannosidase: negativ Produktion von Säure und Gas aus Kohlenhydraten (24 Stunden, 37ºC) KOHLENHYDRAT* Säure Gas meso-Adonitol Aesculin Amygdalin D-Arabinose L-Arabinose D-Arabitol L-Arabitol Arbutin Cellobiose meso-Dulcitol meso-Erythritol Fructose D-Fucose L-Fucose Galactose Gentiobiose Glucose α-Methylglucosid Gluconat 2-Ketogluconat 5-Ketogluconat N-Acerylglucosamin Glycerol Glycogen myo-Inositol Inulin Lactose Lyxose Maltose Mannitol Mannose α-Methylmannosid Melezitose Melibiose Raffinose (schwach) L-Rhamnose Ribose Salicin Sorbitol L-Sorbose Stärke Saccharose Tagatose Trehalose Turanose meso-Xylitol D-Xylose L-Xylose β-Methyl-D-Xylose (schwach)
  • * Wenn nicht anders angegeben hatten alle in diesen Tests verwendeten asymmetrischen Kohlenhydrate D-Konfiguration.
    • Antibiotische Empfindlichkeit
  • Antibiogramme wurden erhalten auf Mueller-Hinton-Agar [Mueller J.H, und Hinton J., "A protein-free medium for primary isolation of the gonococcus and meningococcus", Proc. Soc. Exp. Bil. Med., 48:330 (1941)] ergänzt mit 0,15 % Stärke (Ohlsen M.A. und Scott W.J., "Influence of starch in media used für the detection of heated bacterial spores", Nature, 157:337 (1946)] (14 Stunden, 37ºC), unter Verwendung von Oxoid-antibiotischer Suszeptibilitätsscheiben nach dem Kirby-Bauer-Verfahren [Bauer A.W., Kirby W.M.M., Sherris K.C. und Turck M., "Antibiotic susceptibilty testing by a standardized single disk method", Amer. J. Clin. Pathol., 45:493 (1966)] Antibiotikum (Menge) Durchmesser (mm) der Inhibierungszone Auswertung Amikacin (30 ug) Ampicillin (10 ug) Benzylpenicillin (10 IE) Cefuroxim (30 um) Cephalothin (30 ug) Chloramphenicol (30 ug) Colistin (10 ug) Gentamicin (10 ug) empfindlich
  • Auf Basis dieser Ergebnisse entspricht das Isolat einem Stamm von Proteus mirabilis nach dem Klassifikationsschema der ATCC; ferner ist gemäß ATCC Proteus mirabilis NRRL B-18480 (Sigma-Tau SP237 Subklon NACit I1) einzigartig und entspricht nicht einem anderen Organismus in ihrer Kultursammlung.
  • Es wurde beobachtet, daß hoch-gereinigte einzelne Klone von P. mirabilis NRRL B-18480, die Urease-positiv sind (Ure&spplus;), Anlaß zur Urease-negativen (Ure&supmin;) Klonen mit einer niedrigen Häufigkeit geben können; das morphologischphysiologisch/biochemische Profil und die Antibiogramme dieser Ure&supmin;-Varianten sind sonst identisch mit solchen ihrer Ure&spplus;-Vorläufer (siehe Farmer J.J. III. Hickman F.W., Brenner D.J., Schreiber M. und Rickenbach D.G., "Unusual Enterobacteriaceae: 'Proteus rettgeri' that 'change' into Providencia stuartii", J. Clin. Microbiol., 6:373 (1977); Collins C.M. und Falkow S., "Genetic analysis of an Escherichia coli urease locus: evidence of DNA rearrangement", J. Bacteriol., 170:1041 (1988)]. Ferner ist die Fähigkeit der Ure&supmin;-Varianten zur Umwandlung von Crotonobetain in L-(-)-Carnitin unverändert. Die umgekehrte phenotyische Transformation, d. h. das spontane Auftreten eines Ure&spplus;-Stammes von P. mirabilis NRRL B-18480 aus einem Ure&supmin;-Vorläufer wurde von uns nicht beobachtet (siehe Lewis A.D. und Rosen I.G., "Characterization of a Proteus rettigeri that transfers genes for urese production and lactose fermentation", American Society for Microbiology Annual Meeting, 1973, Abstract G 218).
    • (ii) PROTEUS MIRABILIS NRRL B-18482 (SIGMA-TAU GP 1AVI)
  • Der Organismus wurde aus den Faekalien eines Meerschweinchens in der Tiersammlung von Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A. gewonnen.
  • Frische Faekalien (0,5 bis 1,0 g) wurden 24 Stunden ohne Rühren in 4 ml steriler Gehirn-Herzinfusion (BHI) (Difco) + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat (ph 6,8, 37ºC) inkubiert. Impfschleifen mit der Nährbrühe wurden gerade unterhalb des Meniskus entnommen und auf Platten aus dem von Xilinas M.E., Papavissiliou J.T. und Legakis N.J. beschriebenem Medium ausgestrichen ["Selective medium for growth of Proteus, J. Clin. Microbiol., 2: 459 (1975)], im folgenden als "griechischer Agar" bezeichnet. Nach 48 Stunden bei 37ºC wurden einzelne Kolonien aufgenommen und durch wiederholtes Ausstreichen einzelner Klone auf Platten von griechischem Agar + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat (pH 6,8, 37ºC, 48 Stunden) und Macconkey-Agar CS (Difco) + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat (ph 6,8, 37ºC, 24 Stunden), gereinigt.
  • Der Organismus wurde durch täglichen Transfer (37ºC) auf griechischem Agar + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat am Leben erhalten. Er wurde in dem Industrial Microbiology Laboratories der Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A. unter Verwendung von morphologischer Überprüfung in Verbindung mit den API 20 E-, API ZYM- und API 50 CHE-Streifen und anderen biochemischen/physiologischen Tests, wo erforderlich, typisiert.
    • Morphologische Eigenschaften
  • Gramstamm: negativ
  • Form: Bacillus
  • Dimensionen: 0,8 x 2 um
  • Beweglichkeit (NACit + cb; BHI + 1,5 % (Gewicht/Volumen Crotonobetainmonohydrat + 2 % Agar, pH 6,8): vorhanden, schwärmt
  • Chromogenese: negativ
  • Sporolation: negativ
    • Physiologische/biochemische Eigenschaften (37ºC)
  • Erfordernis für > CO&sub2;: negativ
  • Voges-Proskauer: schwach
  • Herstellung von H&sub2;S (dreifach Zuckerionenagar): positiv
  • Wachstum in Simmonscitratmedium: negativ
  • Wachstum auf Macconkey-Agar: Positiv
  • Verflüssigung von Gelatine: negativ
  • Aminosäureauxotrophy: keine
  • Saure Phosphatase (Naphthol AS-BI-Phosphat, pH 5,4): positiv (schwach)
  • Saure Phosphatase (β-Naphthylphosphat, pH 5,4): positiv
  • Alkalische Phosphatase (β-Naphthylphosphat, pH 8,5): positiv
  • Esterase (β-Naphthylbutyrat): positiv (schwach)
  • Esterase (β-Naphthylcaprylat): negativ
  • Lipase (β-Naphthylmyristat): negativ
  • Arginindihydrolase: negativ
  • Ornithindecarboxylase: positiv
  • Lysindecarboxylase: negativ
  • Produktion von Indol: negativ
  • Tryptophandeaminase: positiv
  • Phenylalanindeaminase: positiv
  • Urease: positiv
  • Trypsin: negativ
  • Chymotrypsin: negativ
  • Cystinarylamidase: negativ
  • Leucinarylamidase: positiv
  • Valinarylamidase: negativ
  • Oxidase: negativ
  • O-F-Glucose, oxidativ: positiv
  • O-F-Glucose, fermentativ: positiv
  • α-Galactosidase: negativ
  • β-Galactosidase: negativ
  • β-Glucuronidase: negativ
  • α-Glucosidase: negativ
  • β-Glucosidase: negativ
  • N-Acetyl-β-glucosaminidase: negativ
  • α-Fucosidase: negativ
  • α-Mannosidase: negativ Herstellung von Säure und Gas aus Kohlenhydraten (24 Stunden, 37ºC) KOHLENHYDRAT* Säure Gas meso-Adonitol Aesculin Amygdalin D-Arabinose L-Arabinose D-Arabitol L-Arabitol Arbutin Cellobiose meso-Dulcitol meso-Erythritol Fructose D-Fucose L-Fucose Galactose Gentiobiose Glucose α-Methylglucosid Gluconat (schwach) 2-Ketogluconat 5-Ketogluconat N-Acerylglucosamin Glycerol Glycogen myo-Inositol Inulin Lactose Lyxose Maltose Mannitol Mannose α-Methylmannosid Melezitose Melibiose Raffinose L-Rhamnose Ribose Salicin Sorbitol L-Sorbose Stärke Saccharose Tagatose Trehalose Turanose meso-Xylitol D-Xylose L-Xylose β-Methyl-D-Xylose (schwach)
  • * Wenn nicht anders angegeben hatten alle in diesen Tests verwendeten asymmetrischen Kohlenhydrate D-Konfiguration.
    • Antibiotische Empfindlichkeit
  • Antibiogramme wurden genau wie auf dieselbe Weise wie für P. mirabilis NRRL B-18480 (Sigma-Tau SP237 Subklon NACit I1) beschrieben, erhalten. Antibiotikum (Menge) Durchmesser (mm) der Inhibierungszone Auswertung Amikacin (30 ug) Ampicillin (10 ug) Benzylpenicillin (10 IE) Cefuroxim (30 um) Cephalothin (30 ug) Chloramphenicol (30 ug) Colistin (10 ug) Gentamicin (10 ug) empfindlich mittel resistent
  • Auf Basis dieser Ergebnisse entspricht der isolierte Stamm einem Stamm von Proteus mirabilis nach dem Klassifikationsschema des API-Sytems.
    • (iii) PROTEUS MIRABILIS NRRL B-18481 (SIGMA-TAU BT 1IV)
  • Der Organismus wurde aus den Faekalien eines Kaninchens aus der Tiersammlung von Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Ruinite S.p.A., genau wie für Proteus mirabilis NRRL B-18482 (Sigma-Tau GP 1AVI) beschrieben, isoliert. Der Organismus wurde durch täglichen Transfer (37ºC) auf griechischem Agar + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat am Leben gehalten. Er wurde in den Industrial Microbiology Laboratories von Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Ruinite S.p.A. unter Einsatz morphologischer Prüfung in Verbindung mit dem API 20 E-, API ZYM- und API 50 CHE-Streifen und anderen biochemischen/physiologischen Tests, wo notwendig, typisiert.
    • Morphologische Eigenschaften
  • Gramstamm: negativ
  • Form: Bacillus
  • Dimensionen: 0,8 x 2 um
  • Beweglichkeit (NACit + cb; BHI + 1,5 % (Gewicht/Volumen Crotonobetainmonohydrat + 2 % Agar, pH 6,8): vorhanden, schwärmt
  • Chromogenese: negativ
  • Sporolation: negativ
    • Physiologische/biochemische Eigenschaften (37ºC)
  • Erfordernis für > CO&sub2;: negativ
  • Voges-Proskauer: negativ
  • Herstellung von H&sub2;S (dreifach Zuckerionenagar): positiv
  • Wachstum in Simmonscitratmedium: negativ
  • Wachstum auf Macconkey-Agar: positiv
  • Verflüssigung von Gelatine: positiv
  • Aminosäureauxotrophy: keine
  • Saure Phosphatase (Naphthol AS-BI-Phosphat, pH 5,4): positiv (schwach)
  • Saure Phosphatase (β-Naphthylphosphat, pH 5,4): positiv
  • Alkalische Phosphatase (β-Naphthylphosphat, pH 8,5): positiv
  • Esterase (β-Naphthylbutyrat): positiv (schwach)
  • Esterase (β-Naphthylcaprylat): negativ
  • Lipase (β-Naphthylmyristat): negativ
  • Arginindihydrolase: negativ
  • Ornithindecarboxylase: positiv
  • Lysindecarboxylase: negativ
  • Produktion von Indol: negativ
  • Tryptophandeaminase: positiv
  • Phenylalanindeaminase: positiv
  • Urease: positiv
  • Trypsin: positiv
  • Chymotrypsin: negativ
  • Cystinarylamidase: negativ
  • Leucinarylamidase: positiv
  • Valinarylamidase: negativ
  • Oxidase: negativ
  • O-F-Glucose, oxidativ: positiv
  • O-F-Glucose, fermentativ: positiv
  • α-Galactosidase: negativ
  • β-Galactosidase: negativ
  • β-Glucuronidase: negativ
  • α-Glucosidase: negativ
  • β-Glucosidase: negativ
  • N-Acetyl-β-glucosaminidase: negativ
  • α-Fucosidase: negativ
  • α-Mannosidase: negativ Herstellung von Säure und Gas aus Kohlenhydraten (24 Stunden, 37ºC) KOHLENHYDRAT* Säure Gas meso-Adonitol Aesculin Amygdalin D-Arabinose L-Arabinose D-Arabitol L-Arabitol Arbutin Cellobiose meso-Dulcitol meso-Erythritol Fructose D-Fucose L-Fucose Galactose Gentiobiose Glucose α-Methylglucosid Gluconat 2-Ketogluconat 5-Ketogluconat N-Acerylglucosamin Glycerol Glycogen myo-Inositol Inulin Lactose Lyxose Maltose Mannitol Mannose α-Methylmannosid Melezitose Melibiose Raffinose (schwach) L-Rhamnose Ribose Salicin Sorbitol L-Sorbose Stärke Saccharose Tagatose Trehalose Turanose meso-Xylitol D-Xylose L-Xylose β-Methyl-D-Xylose
  • * Wenn nicht anders angegeben hatten alle in diesen Tests verwendeten asymmetrischen Kohlenhydrate D-Konfiguration.
    • Antibiotische Empfindlichkeit
  • Antibiogramme wurden erhalten genau wie auf dieselbe Weise wie für P. mirabilis NRRL B-18480 (Sigma-Tau SP237 Subklon NACit 11) beschrieben. Antibiotikum (Menge) Durchmesser (mm) der Inhibierungszone Auswertung Amikacin (30 ug) Ampicillin (10 ug) Benzylpenicillin (10 IE) Cefuroxim (30 um) Cephalothin (30 ug) Chloramphenicol (30 ug) Colistin (10 ug) Gentamicin (10 ug) empfindlich mittel resistent
  • Auf Basis dieser Ergebnisse entspricht der isolierte Stamm einem Stamm von Proteus mirabilis nach dem Klassifikationsschema des API-Sytems.
    • (iv) PROTEUS MIRABILIS B-18483 (SIGMA-TAU R 2AIX).
  • Der Organismus wurde aus den Faekalien eines Kaninchens aus der Tiersammlung von Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Ruinite S.p.A., genau wie für Proteus mirabilis NRRL B-18482 (Sigma-Tau GP 1AVI) beschrieben, isoliert. Der Organismus wurde durch täglichen Transfer (37ºC) auf griechischem Agar + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat am Leben gehalten. Er wurde in den Industrial Microbiology Laboratories von Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Ruinite S.p.A. unter Einsatz morphologischer Prüfung in Verbindung mit dem API 20 E-, API ZYM- und API 50 CHE-Streifen und anderen biochemischen/physiologischen Tests, wo notwendig, typisiert.
    • Morphologische Eigenschaften
  • Gramstamm: negativ
  • Form: Bacillus
  • Dimensionen: 0,8 x 3 um
  • Beweglichkeit (NACit + cb; BHI + 1,5 % (Gewicht/Volumen Crotonobetainmonohydrat + 2 % Agar, pH 6,8): vorhanden, schwärmt
  • Chromogenese: negativ
  • Sporolation: negativ
    • Physiologische/biochemische Eigenschaften (37ºC)
  • Erfordernis für > CO&sub2;: negativ
  • Voges-Proskauer: negativ
  • Herstellung von H&sub2;S (dreifach Zuckerionenagar): positiv
  • Wachstum in Sirnmonscitratmedium: negativ
  • Wachstum auf Macconkey-Agar: positiv
  • Verflüssigung von Gelatine: positiv
  • Aminosäureauxotrophy: keine
  • Saure Phosphatase (Naphthol AS-BI-Phosphat, pH 5,4): negativ
  • Saure Phosphatase (β-Naphthylphosphat, pH 5,4): positiv
  • Alkalische Phosphatase (β-Naphthylphosphat, pH 8,5): positiv
  • Esterase (β-Naphthylbutyrat): positiv (schwach)
  • Esterase (β-Naphthylcaprylat): negativ
  • Lipase (β-Naphthylmyristat): negativ
  • Arginindihydrolase: negativ
  • Ornithindecarboxylase: positiv
  • Lysindecarboxylase: negativ
  • Produktion von Indol: negativ
  • Tryptophandeaminase: positiv
  • Phenylalanindeaminase: positiv
  • Urease: positiv
  • Trypsin: negativ
  • Chymotrypsin: negativ
  • Cystinarylamidase: negativ
  • Leucinarylamidase: positiv
  • Valinarylamidase: negativ
  • Oxidase: negativ
  • O-F-Glucose, oxidativ: positiv
  • O-F-Glucose, fermentativ: positiv
  • α-Galactosidase: negativ
  • β-Galactosidase: negativ
  • β-Glucuronidase: negativ
  • α-Glucosidase: negativ
  • β-Glucosidase: negativ
  • N-Acetyl-β-glucosaminidase: negativ
  • α-Fucosidase: negativ
  • α-Mannosidase: negativ Herstellung von Säure und Gas aus Kohlenhydraten (24 Stunden, 37ºC) KOHLENHYDRAT* Säure Gas meso-Adonitol Aesculin Amygdalin D-Arabinose L-Arabinose D-Arabitol L-Arabitol Arbutin Cellobiose meso-Dulcitol meso-Erythritol Fructose D-Fucose L-Fucose Galactose Gentiobiose Glucose α-Methylglucosid Gluconat (schwach) 2-Ketogluconat 5-Ketogluconat N-Acerylglucosamin Glycerol Glycogen myo-Inositol Inulin Lactose Lyxose Maltose Mannitol Mannose α-Methylmannosid Melezitose Melibiose Raffinose L-Rhamnose Ribose Salicin Sorbitol L-Sorbose Stärke Saccharose Tagatose Trehalose Turanose meso-Xylitol D-Xylose L-Xylose β-Methyl-D-Xylose (schwach)
  • * Wenn nicht anders angegeben hatten alle in diesen Tests verwendeten asymmetrischen Kohlenhydrate D-Konfiguration.
    • Antibiotische Empfindlichkeit
  • Antibiogramme wurden genau wie auf dieselbe Weise wie für P. mirabilis NRRL B-18480 (Sigma-Tau SP237 Subklon NACit I1) beschrieben, erhalten. Antibiotikum (Menge) Durchmesser (mm) der Inhibierungszone Auswertung Amikacin (30 ug) Ampicillin (10 ug) Benzylpenicillin (10 IE) Cefuroxim (30 um) Cephalothin (30 ug) Chloramphenicol (30 ug) Colistin (10 ug) Gentamicin (10 ug) empfindlich resistent
  • Auf Basis dieser Ergebnisse entspricht der isolierte Stamm einem Stamm von Proteus mirabilis nach dem Klassifikationsschema des API-Sytems.
    • TRANSFORMATIONSVERGLEICHSDATEN FÜR DIE SYNTHESE VON L-(-)-CARNITIN AUS CROTONOBETAIN DURCH PROTEUS MIRABILIS ISOLATE IN GESCHÜTTELTEN KOLBEN
  • Proteus mirabilis NRRL B-18480 (Sigma-Tau SP237) Subklon NACit I1) wurde durch täglichen Transfer auf Platten von NACIT + cb, Inkubationstemperatur 37ºC, aufrechterhalten. Proteus mirabilis NRRL B-18481 (Sigma-Tau BT 1IV), P. mirabilis NRRL B-18482 (Sigma-Tau GP 1AVI) und P. mirabilis NRRL B-18483 (Sigma-Tau R 2AIX) wurden durch täglichen Transfer auf Platten aus griechischem Agar + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat, pH 6,8, Inkubationstemperatur 37ºC, aufrechterhalten.
  • Impfschlaufen mit den vorhergehenden Stämmen wurden in 250-ml-Erlenmeyer- Kolben angeimpft, die jeweils 50 ml von Gehirn-Herzinfusion + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat, pH 6,8, enthielten. Die Kolben wurden geschüttelt (200 Upm, 1-inch orbitale Exzentrizität, 37ºC) für 17 Stunden, dann wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt (10 Minuten, 12000 x g, 4ºC) und einmal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen. Die gewaschenen Zellpellets wurden in nicht-sterilem Biotransformationsmedium (50 ml) aus 25 mM Kaliumphosphat + 1 % (Gewicht/Volumen) Glycerin + 12 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat, pH 6,0, resuspendiert. Die Biotransformationsansätze wurden wie oben bei 33ºC 96 Stunden geschüttelt. Während dieses Zeitraums wurden Aliquots (100 ul) entnommen und enzymatisch auf L-(-)-Carnitin nach dem Verfahren von Pearson D.J., Chase J.F.A. und Tubbs P.K. ["The assay of (-)-carnitine and is O-acyl derivatives", Meth. Enzymol., 9:612 (1966)] getestet.
  • Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten (korrigiert für die Verdunstung über einen Zeitraum von 0 bis 96 Stunden): mM AKKUMULIERTES L-(-)-CARNITIN Stunden P. mirabilis NRRL Subklon Stunden P. mirabilis NRRL 50 % UMWANDLUNG VON EXOGENEM CROTONOBETAIN IN L-(-)-CARNITIN* Stunden P. mirabilis NRRL Subklon Stunden P. mirabilis NRRL
  • * 100 % = 744,4 mM
    • ALTERNATIVE KOMPLEXE MEDIEN, DIE EINE HOHE "CROTONOBETAINHYDRATASE"- AKTIVITÄT BEI PROTEUS MIRABILIS NRRL B-18480 (Sigma-Tau SP237 Subklon NACit I1) UNTERSTÜTZEN
  • Proteus mirabilis NRRL B-18480 (Sigma-Tau SP237 Subklon NACit I1) wurde durch täglichen Transfer auf NACit + cb-Platten, Inkubationstemperatur 37ºC, am Leben erhalten. Impfschlaufen mit diesem Stamm wurden in einen 250-ml-Erlenmeyer-Kolben, der 50 ml verschiedene Medien enthielt, angeimpft:
  • (a) Gehirn-Herzinfusion (Difco) + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat, ph 6,8.
  • (b) 0,9 % Nährbrühe (Difco) + 0,9 % Hefeextrakt (Difco) + 0,9 % Soytone (Difco) + 0,2 % Glucose + 0,5 % Natriumchlorid + 0,25 % dibasisches Natriumphosphat (wasserfrei) + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat, pH 6,8.
  • (c) 1,35 % Nährbrühe + 1,35 % Soytone + 0,2 % Glucose + 0,5 % Natriumchlorid + 0,25 % dibasisches Natriumphosphat (wasserfrei) + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat, pH 6,8.
  • (d) 1,35 % Soytone + 1,35 % Hefeextrakt + 0,2 % Glucose + 0,5 % Natriumchlorid + 0,25 % dibasisches Natriumphosphat (wasserfrei) + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat, pH 6,8.
  • (e) 1,35 % Nährbrühe + 1,35 % Hefeextrakt + 0,2 % Glucose + 0,25 % Natriumchlorid + 0,25 % dibasisches Natriumphosphat (wasserfrei) + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat, pH 6,8.
  • (f) 0,9 % Nährbruhe + 0,9 % Soytone + 0,9 % Hefeextrakt + 0,5 % Natriumchlorid + 0,25 % dibasisches Natriumphosphat (wasserfrei) + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat, pH 6,8.
  • (g) 0,9 % Nährbrühe + 0,9 % Soytone + 0,9 % Hefeextrakt + 0,2 % Glucose + 0,25 % dibasisches Natriumphosphat (wasserfrei) + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat, ph 6,8.
  • (h) 0,9 % Nährbrühe + 0,9 % Soytone + 0,9 % Hefeextrakt + 0,2 % Glucose + 0,5 % Natriumchlorid + 1,5 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat, pH 6,8.
  • (i) Gehirn-Herzinfusion, pH 6,8.
  • Die Kolben wurden 17 Stunden geschüttelt (200 Upm, 1-inch orbitale Exzentrizität, 37ºC), dann wurden die Zellen aus jedem Kolben separat durch Zentrifugation geerntet (10 Minuten, 12000 x g, 4ºC) und einmal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen. Die gewaschenen Zellpellets wurden in nicht-sterilem Biotransformationsmediurn (50 ml), bestehend aus 25 mM Kaliumphosphat + 1 % (Gewicht/Volumen) Glycerin + 12 % (Gewicht/Volumen) Crotonobetainmonohydrat, pH 6,0, resuspendiert. Die Biotransformationsreaktionsmischungen wurden wie oben bei 33ºC 96 Stunden geschüttelt; während dieses Zeitraums wurden Aliquots (100 pl) entnommen und enzymatisch auf L-(-)-Carnitin, wie zuvor beschrieben, getestet.
  • Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten (korrigiert auf Verdunstung über einen Zeitraum von 0 bis 96 Stunden): mm AKKUMULIERTES L-(-)-CARNITIN 50 % UMWANDLUNG VON EXOGENEM CROTONOBETAIN IN L-(-)-CARNITIN*
  • * 100 % = 744,4 mM
    • BIOTRANSFORMATION VON CROTONOBETAIN IN L-(-)-CARNITIN DURCH PROTEUS MIRABILIS NRRL B-18480 IN EINEM LABORBANKFERMENTOR
  • Die Biotransformation von innerem Crotonobetainsalz zu L-(-)-Carnitin erfolgte unter Verwendung von Zellen von P. mirabilis NRRL B-18480 in einem 2- l-Laborbankfermentor wie folgt:
  • Das Bakterium wurde durch täglichen Transfer auf Ausstrichen von Gehirn- Herzinfusion-Agar (Difco) + 1,5 % (Gewicht/Volumen) innerem Crotonobetainsalz, Inkubationstemperatur 37ºC, aufrechterhalten.
  • Der Inhalt eines 24-Stunden-Ausstrichen wurde in mit Schikanen versehenen 1000-ml-Erlenmeyer-Kolben, die 250 ml Gehirn-Herzinfusion (Difco) + 1,5 % (Gewicht/Volumen) inneres Crotonobetainsalz enthielten, geimpft. Die Kolben wurden kontinuierlich geschüttelt (170 Upm, 2-inch orbitale Exzentrizität, 37ºC) für 6 Stunden, worauf die Brühe zur Impfung von sechs Zweistufen-Kulturen, die jeweils 250 ml Gehirn-Herzinfusion + 1,5 % (Gewicht/Volumen) inneres Crotonobetainsalz enthielt, in mit Schikanen versehenen 1000-ml-Erlenmeyer- Kolben verwendet wurden. Die Kolben wurden, wie oben beschrieben, für ca. 15 Stunden geschüttelt. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation (20 Minuten, 8500 x g, 4ºC) gewonnen und in einem Biotransformationsmedium (1 l), bestehend aus 25 mM Kaliumphosphat + 0,5 % (Gewicht/Volumen) Glycerin + 10 % (Gewicht/Volumen) inneren Crotonobetainsalz resuspendiert. Ein 2-l-Biolafitte-Fermentor wurde mit dem zellhaltigen Biotransformationsmedium beladen und 24 Stunden unter den folgenden Bedingungen betrieben:
  • Rührgeschwindigkeit: 150 Upm
  • Luftflußrate: 1 v/v/m
  • Ursprungs-pH: 6,8
  • Arbeitsvolumen: 1 l
  • Temperatur: 35ºC
  • Es wurde eine 10%ige (Gewicht/Volumen) Glycerinlösung kontinuierlich in den Fermentor mit einer Rate von 5 ml/h gepumpt.
  • Nicht-umgesetztes Crotonobetain und L-(-)-Carnitinkonzentrationen wurden durch Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) überwacht:
  • Säule: 10-u-Partisil SCX, 4 mm x 250 mm (PoliConsult Scientifica s.r.l. Rom, Italien)
  • Säulentemperatur: 35ºC
  • Injektionsvolumen: 10 ul
  • mobile Phase: 75 mM KH&sub2;PO&sub4;-CH&sub3;CN (4:6), pH nicht eingestellt
    • Detektor: Refraktionsindex
  • Retentionszeiten (min): L-(-)-Carnitin 8,52
  • Crotonobetain 9,81
  • gamma-Butyrobetain 12 , 08
  • Nach 22 Stunden wurde das Biotransformationsmedium gesammelt und filtriert.
  • Es wurde gefunden, daß das Filtrat, wie zur vor L-(-)-Carnitin beschrieben, enzymatisch analysiert, 48,0 mg/ml L-(-)-Carnitin und 57,3 mg/ml nichtumgesetztes Crotonobetain enthielt.
  • Die molekulare Umsatzrate von Crotonobetain in L-(-)-Carnitin: 43 %. Ausbeute von L-(-)-Carnitin: 100 %.
    • ISOLIERUNG VON L-(-)-CARNITIN AUS DER BIOTRANSFORMATIONSFLÜSSIGKEIT
  • Die filtrierte Biotranformationsflüssigkeit wurde der Reihe nach durch Säulen von Amberlite -Ionenaustauscherharzen, viz. IRA-402 basischem Harz (OH-Form) und IRC-50 saurem Harz (H-Form) unter Entfernung anorganischer Kationen und Anionen geleitet. Das Eluat wurde in Vakuum (50ºC) konzentriert, und das Konzentrat mit Isobutanol dreimal zur azeotopischen Verringerung des Wassergehalts auf 5 bis 10 % (Gewicht/Gewicht) behandelt.
  • Die erhaltene Mischung wurde unter Verwendung von 3 Teilen (Gewicht/Volumen) Isobutanol unter Erhalt eines Präzipitats, das 4 Teile L-(-)-Carnitin und 1 Teil Crotonobetain (Gewicht/Gewicht) [HPLC] enthielt, kristallisiert. Nach drei aufeinanderfolgenden Kristallisation wurde ein Festkörper aus L-(-)-Carnitin mit < 0,5 % (Gewicht/Gewicht) Crotonobetain (HPLC) erhalten.
  • Nach diesem Verfahren wurden ca. 50 % (Gewicht/Gewicht) des im Biotransformationsmedium vorliegenden L-(-)-Carnitins wiedergewonnen [&alpha;]²&sup5; = -31,5º. Die Mutterlaugen wurden gesammelt und in anschließenden Biotransformationen wieder verwendet.

Claims (10)

1. Proteus mirabilis NRRL B-18480 und seine Nachkommen, Mutanten und Derivate, die die Fähigkeit des Vorläufers zur Transformation von Crotonobetain in L-(-)-Carnitin beibehalten haben.
2. Proteus mirabilis NRRL B-18481 und seine Nachkommen, Mutanten und Derivate, die die Fähigkeit des Vorläufers zur Transformation von Crotonobetain in L-(-)-Carnitin beibehalten haben.
3. Proteus mirabilis NRRL B-18482 und seine Nachkommen, Mutanten und Derivate, die die Fähigkeit des Vorläufers zur Transformation von Crotonobetain in L-(-)-Carnitin beibehalten haben.
4. Proteus mirabilis NRRL B-18483 und seine Nachkommen, Mutanten und Derivate, die die Fähigkeit des Vorläufers zur Transformation von Crotonobetain in L-(-)-Carnitin beibehalten haben.
5. Nachkommen, Mutanten und Derivate von Proteus mirabilis-Stämmen der Ansprüche 1, 2, 3 und 4, die ihre Fähigkeit zur Transformation von Crotonobetain in L-(-)-Carnitin entweder als freie Zellen oder als immobilisierte Zellen beibehalten haben.
6. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von L-(-)-Carnitin umfassen:
(a) Herstellen einer Oberflächenkultur auf einem festen Medium eines Mikroorganismus, der zur stereoselektiven Hydratisierung von Crotonobetain in L-(-)-Carnitin in der Lage ist;
(b) Herstellen einer katalytisch-aktiven Biomasse durch Inokulieren eines flüssigen Mediums, das Crotonobetain enthält, mit der in Schritt (a) erhaltenen Kultur;
(c) Abtrennen der Biomasse von dem flüssigen Medium;
(d) Suspendieren der abgetrennten Biomasse in einem Biotransformationsmedium, das mindestens 10 % (Gewicht/Volumen) inneres Crotonobetainsalz enthält;
(e) Gewinnen von L-(-)-Carnitin aus der Biotransformationsflüssigkeit;
worin der Mikroorganismus ausgewählt ist aus Proteus mirabilis NRRL B- 18480, Proteus mirabilis NRRL B-18481, Proteus mirabilis NRRL B-18482, Proteus mirabilis NRRL B-18483.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Biotransformationsmedium 10 bis 12 % (Gewicht/Volumen) inneres Crotonobetainsalz enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 6, worin das feste Medium aus Schritt (a) Crotonobetain enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Abtrennschritt (c) durch Zentrifugation erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Abtrennschritt (c) durch Filtration erfolgt.
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