DE69032324T2

DE69032324T2 - Zusammensetzung und testverfahren eines elementes als antwort auf ein hormon

Info

Publication number: DE69032324T2
Application number: DE69032324T
Authority: DE
Inventors: Ronal Mark La Jolla Ca 92037 Evans; Kazuhiko La Jolla Ca 92037 Omesono
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1989-03-17
Filing date: 1990-03-16
Publication date: 1998-10-08
Anticipated expiration: 2010-03-17
Also published as: US5597693A; EP0463081A4; AU655912B2; EP0463081A1; CA2047752C; ATE166360T1; JPH04505012A; DE69032324D1; AU5342390A; WO1990011273A1; CA2047752A1; EP0463081B1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft im allgemeinen Hormonrezeptorgene und Proteine. Insbesondere betrifft diese Erfindung die Identifizierung und Charakterisierung von Determinanten, die Zielgenspezifität für Mitglieder der Überfamilie der Steroid/Schilddrüsenhormonrezeptoren haben. Zusätzlich betrifft die Erfindung neue Assays zur Identifizierung von Liganden für "Orphan"-Hormonrezeptoren.

Hintergrund der Erfindung

Die Steroid/Schilddrüsenhormonrezeptoren bilden eine Überfamilie von Ligand-abhängigen Transkriptionsfaktoren, die die Zelifunktion und das Schicksal von Eukaryonten beeinflussen. Es ist bekannt, daß diese Rezeptoren extrazelluläre Hormonsignale an Zielgene transduzieren, die spezifische, als Hormon-Response-Elemente (HRE) bezeichnete Enhancersequenzen enthalten (Evans, 1988; Green und Chambon, 1988). Es ist außerdem bekannt, daß jeder Rezeptor seine eigenen HRE erkennt, wodurch sichergestellt wird, daß durch verschiedene Hormone eine bestimmte Response ausgelöst wird.
Sequenzvergleiche und Mutationsanalysen des Glucocorticoidrezeptors (GR) haben für transkriptionale Aktivierung und Repression, nukleare Lokalisierung, DNA- Bindung und Hormonbindung verantwortliche funktionelle Domänen identifiziert (Giguere et al, 1988a, Hollenberg et al, 1987, Rusconi et al., 1987, Picard und Yamamoto, 1987, Hollenberg und Evans, 1988, Oro et al., 1988a). Die DNA- Bindungsdomäne, die für die Aktivierung der Transkription erforderlich ist, besteht aus 66 bis 68 Aminosäuren, von denen ungefähr 20 Stellen, einschließlich 9 Cysteinen (C1 bis C9), bei verschiedenen Rezeptoren unverändert sind (Fig. 1a) Die moduläre Struktur der Mitglieder dieser Rezeptorüberfamilie ermöglicht zur Erzeugung von funktionellen Chimären den Austausch einer Domäne für eine andere. Diese Strategie wurde angewendet, um zu zeigen, daß die DNA-Bindungsdomäne allein für das spezifische Erkennen des HREs in vivo (Green und Chambon, 1987, Giguere et al, 1987, Petkovich et al., 1987, Kumar et al., 1987, Umesono et al., 1988, Thompson et al., 1989) und in vitro (Kumar und Chambon, 1988) verantwortlich ist.
Durch Analogie mit der vorgeschlagenen Struktur für den Xenopus Transkriptionsfaktor TFIIIA (Miller et al., 1985) wird angenommen, daß für spezifische Bindung die unveränderten Cysteine zwei "Zinkfinger" bilden. In einem die DNA-Bindungsdomäne von Ratten GR enthaltenen Polypeptid wurde gezeigt, daß jedes der zwei Zn(II) in einer tetraedrischen Anordnung durch vier Cysteine geordnet ist (Freedman et al., 1988). Die Beteiligung dieser Cysteine an der Zn(II) Lage ist außerdem durch die Tatsache gestützt, daß acht von neun Cysteinen, die zum Chelatieren von zwei Zn(II) ausreichen, für die Rezeptorfunktion erforderlich sind, was durch Punktmutageneseexperimente festgestellt wurde (Hollenberg et al., 1988, Severne et al., 1988).
Funktionelle Modelle sind versuchsweise zum Koordinieren von Forschungsergebnissen über in vivo wirkende Genregulationsmechanismen vorgeschlagen worden. Der Fachmann wird wissen, daß eines dieser Modelle für die DNA- Bindungsdomäne das "Zinkfingermodell" ist. (Eine vorhergesagte "Finger"-Struktur ist in Fig. 1b dargestellt, siehe außerdem Severne et al., 1988). In diesem Modell chelatieren die ersten vier Cysteine (C&sub1; bis C&sub4;) ein Zn(II), um den Finger 1 zu bilden, der eine Schleife von 13 Aminosäuren zwischen C&sub2; und C&sub3; umfaßt. Finger 2 wird durch die nächsten vier Cysteine (C&sub5; bis C&sub8;) gebildet, da die Wirkung erhalten bleibt, wenn das neunte Cystein mit einem Alanin oder Serin ausgetauscht wird (Severne et al., 1988). Der Finger 2 hat eine Schleife von 9 Aminosäuren und ist durch einen "Linker" von 15 bis 17 Aminosäuren vom Finger 1 getrennt. Beide Finger sind funktionell erforderlich, da weder hGR Finger 1 noch 2 selbst ausreichend sind, um DNA- Bindungen und Transaktivierungswirkung zu erhalten (Hollenberg et al., 1988). Dieses Zinkfingermodell ist auf alle Mitglieder der Rezeptorüberfamilie anwendbar, was auf einen allgemeinen Modus der HRE-Erkennung durch eine Rezeptor-DNA-Bindungsdomäne hinweist.
Die HRE sind strukturell verwandt, aber in der Tat funktionell unterschiedlich. Diejenigen für GR (GRE), den östrogenrezeptor (ER) (ERE) und die Schilddrüsenrezeptoren (T&sub3;rS) (TRE) sind im Detail charakterisiert worden; sie bestehen aus einem palindromen Paar von "Halbstellen" (Fig. 1c) (Evans, 1988; Green und Chambon, 1988). Mit optimierten Pseudo- oder Consensus-Response-Elementen sind nur zwei Nukleotide pro Halbstelle in GRE und ERE unterschiedlich (Klock et al., 1987). Auf der anderen Seite können identische Halbstellen in ERE und TRE festgestellt werden, aber ihr Abstand ist unterschiedlich (Glass et al., 1988). Folglich werden zum Erreichen von HRE Verschiedenheit mindestens zwei verschiedene Wege verwendet.
Mader et al. (Nature, Bd. 338 (1989), S. 271-274) offenbart chimäre Östrogenrezeptoren und mutante Östrogenrezeptoren, die auf die Fähigkeit untersucht wurden, Transkription eines Reportergens, enthaltend ein Östrogen-responsives Element oder ein Glucocorticoid-responsives Element, zu aktivieren.
Evans und Hollenberg (Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Bd. 53 (1988), S. 813-818) offenbaren das Vorhandensein von kooperativen und positionsunabhängigen Transaktivierungsdomänen in dem menschlichen Glucocorticoid- Rezeptor.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Wie diese Erfindung offenbart, hat die funktionelle Charakterisierung von mutanten Rezeptoren, die chimäre DNA- Bindungsdomänen tragen, es möglich gemacht, molekulare Determinanten mit Zielgenspezifität für GR, ER und TR zu unterteilen. Wie diese Erfindung offenbart, kann zum Beispiel durch Austauschen von jeweils drei und acht Aminosäuren die Identität der GR-DNA-Bindungsdomäne in solche für ER und TR umgewandelt werden. Diese Erfindung offenbart außerdem, daß ein einzelner Gly-Glu-Austausch in dem ersten "Zinkfinger" des GR-Rezeptors ein Rezeptor mit zweifacher HRE (d.h. GRE und ERE) Sequenz Empfänglichkeit herstellt. Diese Entdeckungen lokalisieren zwei strukturelle Determinanten mit Zielgenspezifität und schlagen einen einfachen Weg für die Co-Evolution der Rezeptor-DNA-Bindungsdomänen und dem regulierenden Netzwerk vor.
Diese Entdeckungen ermöglichen außerdem das Umwandeln eines Rezeptors in einen anderen und das Erzeugen von hergestellten Rezeptoren, die erwünschte HRE-Erkennungsmerkmale aufweisen. Sie ermöglichten zudem die Entwicklung von Assays, die zum Identifizieren von Liganden für "Orphan"-Hormonrezeptoren nützlich sind. Solche Assays sind besonders vorteilhaft, da sie die Notwendigkeit ausschließen, chimäre Gene und Proteine herzustellen, um nach Liganden zu suchen, die die Orphanrezeptoren aktivieren können.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Es folgt eine kurze Beschreibung der Abbildungen. Detaillierte Beschreibungen finden sich in dem Abschnitt der Beschreibung, der mit "detaillierte Beschreibung der Abbildungen" gekennzeichnet ist.
Figur 1 (a-c) ist eine schematische Abbildung. Fig. 1a zeigt einen Aminosäurenvergleich zwischen den DNA-Bindungsdomänen von hGR, hTRβ und hER. Fig. 1b zeigt die vorhergesagten Zinkfinger, basierend auf denen von Ratten GR18. Fig. 1c zeigt die Strukturen der optimierten Hormon- Response-Elemente für GR (GRE), ER (ERE) und T&sub3;R (TRE).
Figur 2 ist eine schematische Abbildung, die die Transaktivierung von Luciferase- Reporterplasmiden durch mutante Rezeptoren darstellt.
Figur 3 ist eine schematische Abbildung, die die Identifizierung von zwei verschiedenen Elementen, die die TREp+ und ERE+ Phenotypen spezifizieren, darstellt.
Figur 4 (a-h) umfaßt die Kombination einer schematischen Abbildung und Fotografien von Blots. Fig. 4 zeigt die Induktion von CAT-Aktivitäten durch mutante Rezeptoren von basalem ΔMTV-CAT (ΔM), T&sub3;-responsivem ΔMTV-TREp-CAT (TREp) und Östrogen-responsivem ΔMTV-ERE-CAT (ERE) Reportern.

Definitionen

In dieser Beschreibung und den Ansprüchen wird Bezug genommen auf Redewendungen und Stand der Technik Ausdrücke, die hier ausdrücklich wie folgt definiert werden:
Arten, die hier verwendet werden, werden wie folgt gekennzeichnet: h: Human, r: Ratte, m: Maus, c: Huhn und d: Drosophilia.
Rezeptoren der "Steroidhormon-Überfamilie" bezieht sich hier auf die Klasse verwandter Rezeptoren, umfassend Glucocorticoid-, Mineralcorticoid-, Progesteron-, Östrogen-, Östrogenverwandte, Vitamin D&sub3;-, Schilddrüsen-, v-erb-A-, Retinsäure- und E75-(Drosophilia) Rezeptoren. Siehe Evans (1988) und die darin zitierten Referenzen.
GR bedeutet hier Glucocorticoidrezeptor. Die als hGR bezeichnete DNA codiert für humanen Glucocorticoidrezeptor GR. hGR wird durch das Plasmid pRShGR codiert, das für Patentzwecke mit der ATCC-Nummer 67200 hinterlegt wurde.
MR bedeutet hier Mineralcorticoidrezeptor. Die als hMR bezeichnete DNA codiert für humanen Mineralcorticoidrezeptor MR. hMR wird durch das Plasmid pRShMR codiert, das für Patentzwecke mit der ATCC-Nummer 67201 hinterlegt wurde.
TR bedeutet hier Schilddrüsenrezeptor und T&sub3;R bedeutet Triiodthyronin(T&sub3;)rezeptor. TRα und TRα bedeuten die Alphaund Beta-Formen des Schilddrüsenrezeptors. Das Plasmid pherb-A 8.7 codiert für hTRα; es wurde für Patentzwecke mit der ATCC-Nummer 40374 hinterlegt. Das Plasmid peA101 codiert für hTRβ; es wurde für Patentzwecke mit der ATCC-Nummer 67244 hinterlegt.
ERR bedeutet hier östrogenverwandter Rezeptor. Die Acronyme hERR1 und hERR2 bezeichnen humane östrogenverwandte Rezeptoren 1 und 2. Diese Rezeptoren sind den Steroidrezeptoren verwandter als die Schilddrüsenrezeptoren, dennoch binden sie keine der Hauptklassen von bekannten Steroidhormonen (Giguere et al., 1988). hERR1 wird durch die Plasmide pE4 und pHKA codiert, die für Patentzwecke jeweils unter den Nummern ATCC 67309 und 67310 hinterlegt wurden. (Weder pE4 noch pHKA sind vollständige Klone); hERR1 wird durch Verbinden von Segmenten zweier Klone hergestellt. hERR2 wird durch das Plasmid phH3 codiert, das für Patentzwecke mit der ATCC-Nummer 40373 hinterlegt wurde.
RAR bedeutet hier Retinsäurerezeptor. Das Acronym, hRARα, bezieht sich auf humanen Retinsäurerezeptor alpha. hRARα wird durch das Plasmid phRARα codiert, das für Patentzwecke mit der ATCC-Nummer 40392 hinterlegt wurde.
VDR bedeutet hier Vitamin D&sub3; Rezeptor.
Ein "Orphan"-Rezeptor bedeutet hier ein Protein, das durch eine DNA-Sequenz codiert wird, die homolog mit DNA-Sequenzen ist, die bekannte Mitglieder der Steroid/Schilddrüsen- Überfamilie von Hormonrezeptoren codieren. Der Ausdruck "Orphan" bezeichnet die Tatsache, daß der Ligand/die Liganden, der/die den mutmaßlichen Rezeptor bindet/binden, bisher nicht bekannt sind.
Das Element P bedeutet hier eine von zwei dicht zusammenliegenden Aminosäureketten in den Steroid/Schilddrüsenrezeptoren, die differentiell die Zielgenspezifität der DNA- Bindungsdomänen steuern kann. Die Aminosäurekette, die das Element P in der GR-Unterfamilie (GR, MR, PR, AR) umfaßt, ist "GSCKV"; die Ketten, die das Element P in der ER Unterfamilie (T&sub3;Rα, T&sub3;α, RARα, RARα, VD&sub3;R, NGFIB, TR&sub2;, v-erbA, ear2, ear3, Knirps, Knirps-verwandte, ERR1, ERR2) umfassen, sind "EGCKG", "EGCKS" und "EACKA". Siehe außerdem Tabelle 2.
Das Element D bedeutet hier eine von zwei dicht zusammenliegenden Aminosäureketten in den Steroid/Schilddrüsenrezeptoren, die differentiell die Zielgenspezifität der DNA- Bindungsdomänen steuern kann. Die Aminosäureketten, die das Element D in der GR-Unterfamilie (GR, MR, PR, AR) umfassen, sind "AGRND" und "ASRND"; die Ketten, die das Element D in der ER Unterfamilie (T&sub3;Rα, T&sub3;α, RARα, RARβ, VD&sub3;R, NGFI-B, TR&sub2;, v-erbA, ear2, ear3, Knirps, Knirps-verwandte, ERR1, ERR2) umfassen, sind "PATNQ", "KYDSC", "KYEGK", "HRDKN", "PFNGD", "LANKD", "RGSKD", "TYDGC", "RSNRD", "RANRN", "KNEGK", "KNNGE", "PASNE" und "PATNE". Siehe außerdem Tabelle 2.
CAT bedeutet hier Chloramphenicolacetyltransferase.
Luciferase bedeutet hier Leuchtfeuerluciferase. Siehe de Wet et al., (1987).
COS bedeutet hier Affennierenzellen, die T Antigen (Tag) exprimieren. Siehe Gluzman, Cell, 23:175 (1981). CV-1 bedeutet hier Affennierenzellen aus der als "CV-1" bezeichneten Zelllinie. CV-1 ist eine parentale COS-Linie. Im Gegensatz zu COS-Zellen, die transformiert worden sind, um SV40 T-Antigen (Tag) zu exprimieren, exprimieren CV-1 Zellen kein T-Antigen. CV-1 sind rezeptor-fehlende Zellen, die auch in den erfindungsgemäßen Assays nützlich sind.
HRE bedeutet hier Hormon-Response-Element. Die HRE sind kurze, cis-wirkende Sequenzen (ungefähr 20 bp lang), die für hormonale (oder Liganden) Transkriptionsaktivierung erforderlich sind. Die Bindung dieser Elemente an ein ansonsten nicht-hormonresponsives Gen sorgt dafür, daß das Gen hormonresponsiv wird. Die HRE wirken in einer positionsund orientierungsabhängigen Weise. Im Gegensatz zu anderen Enhancern sind die HRE-Aktivitäten abhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit des Liganden. Siehe Evans (1988) und die darin zitierten Referenzen.
Hergestellte HRE, wie sie hier verwendet werden, bezeichnen HRE, die rekombinant unter Verwendung von biotechnologischen Verfahren, wie Nucleotidsubstitution, Deletion usw. hergestellt worden sind. Wenn Wildtyp, hergestellte oder synthetische HRE an nicht-hormonresponsive Promotoren gebunden werden, werden diese Promotoren hormonresponsiv. Siehe Evans (1988) und die darin zitierten Referenzen.
Synthetische HRE, wie sie hier verwendet werden, bezeichnen HRE, die in vitro unter Verwendung von automatisierten Nucleotidsynthese-Maschinen synthetisiert wurden. Da die HRE nur 20 bp lang sind, sind sie leicht zu synthetisieren. Wenn Wildtyp oder hergestellte oder synthetische HRE an nichthormonresponsive Promotoren gebunden werden, werden diese Promotoren hormonresponsiv. Siehe Evans (1988) und die darin zitierten Referenzen.
Das Acronym GRE bedeutet hier Glucocorticoid-Response-Element und TRE bedeutet Schilddrüsenrezeptor-Response-Element. Die GRE sind Hormon-Response-Elemente, die Glucocorticoid-Responsefähigkeit über die Wechselwirkung mit GR erreichen. Siehe Payvar et al., Cell, 35:381 (1983) und Schiedereit et al., Nature, 304:749 (1983). GRE können mit jedem Wildtyp oder chimären Rezeptor, dessen DNA-Bindungsdomäne funktionell an den GRE binden kann (d.h. ihn aktivieren kann), verwendet werden. Da zum Beispiel GR, MR und ER Rezeptoren alle GRE aktivieren können, kann ein GRE mit jedem Wildtyp oder chimären Rezeptor, der eine GR, MR oder PR artige DNA- Bindungsdomäne hat, verwendet werden. TRE sind ähnlich wie GRE, außer daß sie Schilddrüsenhormon-Responsefähigkeit über die Wechselwirkung mit TR erreichen. TRE kann mit jedem Wildtyp oder chimären Rezeptor, dessen DNA-Bindungsdomäne funktionell an den TRE binden kann (d.h. ihn aktivieren kann) verwendet werden. Sowohl TR als auch RR Rezeptoren können TRE aktivieren, so daß ein TRE mit jedem Rezeptor verwendet werden kann, der eine TR oder RR artige DNA-Bindungsdomäne aufweist.
Ligand bedeutet hier einen Induzierer, wie eine Hormon- oder Wachstumssubstanz. In der Zelle bindet der Ligand an ein Rezeptorprotein, wodurch ein Ligand/Rezeptor-Komplex gebildet wird, der daraufhin an ein geeignetes Hormon-Response-Element binden kann. Einzelne Liganden können mehrere Rezeptoren haben. Zum Beispiel binden sowohl T&sub3;Rα als auch T&sub3;Rβ an das Schilddrüsenhormon, z.B. T&sub3;.
Das Wort "operativ" in der Redewendung "operatives Hormon- Response-Element, das funktionell an einen Ligand-responsiven Promoter und ein operatives Reportergen gebunden ist" bedeutet hier, daß die entsprechenden DNA-Sequenzen (dargestellt durch die Ausdrücke "Hormon-Response-Element", "Ligand-responsiver Promoter" und "Reportergen") funktionsfähig sind, d.h. das Hormon-Response-Element kann an die DNA- Bindungsdomäne des Rezeptorproteins (entweder Wildtyp oder chimäres) binden, der Ligand-responsive Promoter kann die Transkription des Reportergens steuern (durch geeignete Aktivierung durch einen HRE-Rezeptorprotein/Ligandenkomplex) und das Reportergen kann in der Wirtszelle exprimiert werden. Die Redewendung "funktionell gebunden" bedeutet, daß, wenn die DNA-Segmente verbunden sind, das Reportergen (z.B. CAT oder Luciferase) durch geeignete Aktivierung exprimiert wird. Dieser Ausdruck basiert auf der Tatsache, daß der "Ligandresponsive Promoter" (der stromabwärts vom Hormon-Response- Element liegt und "aktiviert" wird, wenn das HRE an einen geeigneten Liganden/Rezeptorproteinkomplex bindet, der daraufhin die Transkription des Reportergens "steuert") "angeschaltet" oder anders aktiviert wird als Folge der Bindung eines Liganden/Rezeptorproteinkomplexes an das Hormon-Response-Element.
Der Ausdruck "DNA-Bindungsdomäne" von Rezeptoren, wie er hier verwendet wird, bezeichnet diejenigen Teile der Rezeptorproteine (wie Glucocorticoidrezeptor, Schilddrüsenrezeptor, Mineralcorticoidrezeptor, Östrogen-verwandter Rezeptor und Retinsäurerezeptor), die an HRE-Stellen auf der Chromatin-DNA binden. Die Grenzen dieser DNA-Bindungsdomänen wurden identifiziert und für Mitglieder der Steroidhormonüberfamilie charakterisiert. Siehe Evans (1988), siehe auch Giguere et al. (1986), Hollenberg et al. (1987), Green und Chambon (1987), Miesfield et al. (1987) und Evans (1988).
Die DNA-Bindungsdomänen der Mitglieder der Steroidhormonrezeptoren-Überfamilie bestehen aus einem Aminosegment, das 66 bis 88 Aminosäuren lang ist. Dieses Segment enthält 9 Cysteinreste, von denen einer die erste Aminosäure des Segments ist. Dieser erste Cys-Rest beginnt als ein Cys-X&sub2;-Cys-X&sub1;&sub3;&submin;&sub1;&sub5;-Cys-X&sub2;-Cys beschriebenes Motiv, worin X jede Aminosäure ist. Die DNA-Bindungsdomäne endet unverändert mit den Aminosäuren Gly-Met.
Der Ausdruck "Ligand-Bindungsdomänenbereich" von Rezeptoren, wie er hier verwendet wird, bedeutet diejenigen Teile der Rezeptorproteine, die Liganden, wie Wachstumssubstanzen oder Hormone, binden. Die Grenzen der Ligand-Bindungsdomäne für die Steroidrezeptor-Überfamilie wurden identifiziert und charakterisiert. Siehe Evans (1988).
Der Ausdruck "mutieren", wie er hier verwendet wird, bedeutet hier das Verwenden von Gentechniken zur Veränderung von DNA, so daß sie verschieden vom "Wildtyp" oder nicht modifizierten Sequenzen ist. Nützliche Gentechniken zum Verändern von DNA umfassen Insertion von neuen Nucleotiden in die Wildtyp- Sequenzen, Deletion von Nucleotiden aus den Wildtyp-Sequenzen und Substitution von Nucleotiden in Wildtyp-Sequenzen, zum Beispiel durch sequenzspezifische Mutagenese, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Der Ausdruck "mutante" erfindungsgemäße DNA, wie er hier verwendet wird, bedeutet DNA, die gentechnisch hergestellt wurde, um unterschiedlich zu dem "Wildtyp" oder nichtmodifizierten Sequenzen zu sein. Solches gentechnisches Herstellen umfaßt Insertion von neuen Nucleotiden in Wildtyp- Sequenzen, Deletion von Nucleotiden aus Wildtyp-Sequenzen oder Substitution von Nucleotiden in Wildtyp-Sequenzen, zum Beispiel durch sequenzspezifische Mutagenese.
Der in dieser Beschreibung und den Ansprüchen verwendete Ausdruck "wesentliche Sequenzhomologie" bedeutet, daß DNA, RNA oder Aminosäuresequenzen, die leichte Sequenzvariationen ohne Folgen haben, im Vergleich zu den hier tatsächlich offenbarten und beanspruchten Sequenzen innerhalb des Bereichs der Ansprüche liegen. In dieser Hinsicht bedeuten "leichte und Sequenzvariationen ohne Folgen" homologe Sequenzen, die funktionell äquivalent zu erfindungsgemäßen Sequenzen sind, d.h. die homologen Sequenzen wirken im wesentlichen auf die gleiche Weise, um im wesentlichen Zusammensetzungen entsprechend der Nucleinsäure- und Aminosäurezusammensetzungen, die hier offenbarten und beanspruchten, herzustellen.
Der Ausdruck "rekombinant hergestellt", wie er hier verwendet wird, bedeutet hergestellt unter Verwendung von Gentechnologie und nicht nur durch Reinigen aus der Natur.
Die Aminosäuren, die die hier auftretenden verschiedenen Aminosäuresequenzen umfassen, können nach den folgenden dreibuchstabigen oder einbuchstabigen Abkürzungen gekennzeichnet sein:
Die Nucleotide, die die verschiedenen hier auftretenden Nucleotidsequenzen umfassen, haben ihre gewöhnlichen einbuchstabigen Bezeichnungen (A, G, T, C oder U), die routinemäßig im Stand der Technik verwendet werden.
Bp bedeutet hier Basenpaare und kb bedeutet Kilobasenpaare.
In dieser Beschreibung und den Ansprüchen werden griechisches alpha (α), beta (β), gamma (γ) usw. manchmal als a, b, g usw. bezeichnet.
In dieser Beschreibung und den Ansprüchen werden die Temperaturen in Grad Celsius angegeben, wenn nicht anders angegeben.

Hinterlegungen

Die Plasmide pRShGR (hGR), pRShMR (hMR), peA101 (Ht&sub3;β) und GMCAT, von denen alle in E. coli HB101 sind, sowie auch die Plasmide pE4 und pHKA (die zusammen für hERR1, phH3 (hERR2), pherb-A 8.7 (HTRα), phFA 8 (ein Teilklon von hTRα) und das Plasmid phRARα wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA (ATCC) unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung von Hinterlegungen von Mikroorganismen für Zwecke des Patentverfahrens und Bestimmungen, die unter diesem Vertrag verkündet wurden, hinterlegt. Proben der Plasmide sind und werden zur Verfügung gestellt für Behörden des gewerblichen Rechtsschutzes und anderer rechtlich autorisierter Personen, die sie unter den Bedingungen und Bestimmungen dieses Vertrages und andererseits gemäß Patentrechten und Bestimmungen der Vereinigten Staaten von Amerika und aller anderer Nationen oder internationalen Organisationen, in denen diese Anmeldung oder eine Anmeldung, die die Priorität dieser Anmeldung beansprucht, eingereicht ist, oder in der jedes Patent auf eine solche Anmeldung erteilt ist, erhalten.
Die ATCC-Hinterlegungsnummern und Hinterlegungsdaten der Hinterlegungen sind wie folgt:
pRShGR (hGR) 67200 9. September 1986
pRShMR (hMR) 67201 9. September 1986
pE4 (hERR1*) 67309 30. Januar 1986
phHA (hERR1*) 67310 30. Januar 1986
phH3 (hERR2) 40373 29. September 1987
GMCAT (Reporter) 67282 18. Dezember 1986
pherb-A 8.7 (hTRα) 40374 29. September 1987
peA101 (hTRβ) 67244 22. Oktober 1986
phRARα (hRARα) 40392 20. November 1987
(* bedeutet ein Teilklon)
(pE4 & phHKA codieren vollständiges hERR1)

Beschreibung der Erfindung

Eine Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt Zusammensetzungen aus Steroid/Schilddrüsenhormonrezeptor DNA- Bindungsdomänen, die die Zielgenspezifität bestimmen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus GSCKV, EGCKA, EGCKG, EGCKS, EACKA, AGRND, ASRND, PATNQ, KYDSC, KYEGK, HRDKN, PFNGD, LANKD, RGSKD, TYDGC, RSNRD, RANRN, KNEGK, KNNGE, PASNE und PATNE.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist eine Aminosäurekette, bestehend aus EGxxGxxR, worin x ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y und V.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist eine Aminosäurekette, umfassend KVEGK.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform umfaßt mutante Rezeptoren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus GTG8, GTG3A, GTG2, GTG1.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform umfaßt ein Verfahren zum Herstellen eines Rezeptors, der sowohl GRE als auch ERE Sequenzen aktivieren kann Das Verfahren umfaßt das Einführen einer Punktmutation in die Glucocorticoidrezeptor- DNA-Sequenz, so daß das codierte Glycin an der Stelle zwischen C&sub3; und C&sub4; durch Glutaminsäure ersetzt wird. In umgekehrter Weise wird eine Punktmutation in die Östrogenrezeptor-DNA-Sequenz eingeführt, so daß die codierte Glutaminsäure an der Stelle zwischen C&sub3; und C&sub4; durch Glycin ersetzt wird.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform umfaßt ein im wesentlichen reines Rezeptorprotein, das sowohl Glucocorticoid- als auch Östrogen-Response-Elementsequenzen aktivieren kann.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform umfaßt Verfahren zum Umwandeln der Zielgenspezifität eines Rezeptors in die Zielgenspezifität eines anderen. Gemäß dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Zielgenspezifität des Glucocorticoidrezeptors in die des Östrogenrezeptors umgewandelt durch Ersetzen von Aminosäuren, die im ersten Zinkfinger liegen. Ein einzelner Gly zu Glu Austausch ergibt einen Rezeptor mit zweifacher Empfänglichkeit. Ein weiterer Austausch von fünf Aminosäuren im Kern des zweiten Zinkfingers transformiert die Spezifität in die des Schilddrüsenhormons.
Des weiteren umfaßt die Erfindung neue Assays zum Identifizieren funktioneller Liganden für "Orphan"- Hormonrezeptoren. Diese Assays sind besonders nützlich, da sie die Notwendigkeit der Herstellung von chimären Genen und Proteinen vermeiden, um nach Liganden zu suchen, die einen "Orphan"-Rezeptor aktivieren können. Zusätzlich erfordern die erfindungsgemäßen Assays nicht, daß die in Frage stehenden DNA-Sequenzen sequenziert werden müssen, um zu sehen, ob sie zu den GR- oder GR/TR-Unterfamilien gehören (obwohl dies getan werden kann). Des weiteren, wie es in einem bevorzugten erfindungsgemäßen Assay ausgeführt wird, ist durch die Gegenwart von zwei Reportergenen in der Wirtszelle, wobei eines operativ an ein GRE und das andere an ein ERE gebunden ist, die Möglichkeit gegeben, alle unbekannten Mitglieder der Steroid/Schilddrüsenrezeptor- Überfamilie mit einem einzigen Assay-System zu untersuchen. Außerdem kann ein Ligandencocktail auf einmal untersucht werden. Wenn irgendeiner der Liganden einen der Reporter aktiviert, können diese Liganden nochmals untersucht werden, z.B. in kleineren "Cocktail"-Gruppen und anschließend unabhängig voneinander. Dies erhöht bei weitem die Effizienz der Suche nach Liganden für die Orphanrezeptoren.
Gemäß einer erfindungsgemäßen Assay-Ausführungsform werden DNA-Sequenzen isoliert, von denen vermutet wird, daß sie Rezeptorproteine codieren. Diese DNA-Sequenzen werden in eine geeignete Rezeptor-fehlende Wirtszelle transfektiert, die so hergestellt wurde, daß sie mindestens ein Reportergen, das funktionell an mindestens ein operatives Hormon-Response- Element gebunden ist, enthält, worin das Hormon-Response- Element/ die Hormon-Response-Elemente ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, bestehend aus Wildtyp, hergestelltem oder synthetischem Glucocorticoid-Response-Element und Wildtyp, hergestelltem oder synthetischem Östrogen-Response-Element. Die transfektierte Rezeptor-fehlende Wirtszelle (die jetzt den vermuteten oder "Orphan"-Rezeptor enthält) und mindestens ein Reporter/HRE-Komplex) wird mindestens einem Ligandenkandidaten ausgesetzt, der potentiell an den Liganden/Bindungsdomänenbereich des vermuteten Rezeptorproteins, das durch die in Frage stehende DNA-Sequenz codiert wird, binden kann. Die Induktion des Reportergens wird durch Änderung des Proteingehalts des durch das Reportergen codierten Proteins verfolgt. Schließlich wird eine Auswahl an einem Ligand/Liganden getroffen, der/die die Herstellung des Proteinproduktes von dem Reportergen induzieren kann/können.
In bevorzugten erfindungsgemäßen Assays ist die transfektierte Wirtszelle eine CV-1-Zelle, die mindestens zwei Reportergene enthält, wobei jedes an ein unterschiedliches funktionelles HRE-Element gebunden ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein erstes Reportergen operativ an Wildtyp, hergestelltem oder synthetischem Glucocorticoid-Response-Element gebunden und ein zweites wird operativ an Wildtyp, hergestelltem oder synthetischem Östrogen-Response-Element gebunden. In dieser Ausführungsform ist das erste Reportergen bevorzugt Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) und das zweite bevorzugt Leuchtfeuerluciferase.
In einer anderen erfindungsgemäßen Assayausführung wird ein Assay zum Identifizieren eines Liganden/ von Liganden bereitgestellt, das/die ein "Orphan"-Rezeptor aktivieren kann/können. Gemäß dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Rezeptor-fehlende Wirtszellen bereitgestellt mit mindestens einem Reportergen, das funktionell an ein vorbestimmtes Hormon-Response-Element gebunden ist. Außerdem wird mindestens die den P-Bereich der DNA-Bindungsdomäne des "Orphan"-Rezeptors codierende DNA mutiert, bevorzugt durch sequenzspezifische Mutagenese, so daß der mutierte "Orphan"- Rezeptor das vorbestimmte Hormon-Response-Element in Rezeptor-fehlenden Wirtszellen aktivieren kann. Die Wirtszellen, die das vorbestimmte Hormon-Response-Element, das funktionell an mindestens ein Reportergen gebunden ist, enthalten, werden mit dem mutierten "Orphan"-Rezeptor kontaktiert und anschließend (einem) Kandidatliganden ausgesetzt, der/die potentiell an den Ligandenbindungsdomänenbereich des mutierten "Orphan"- Rezeptors binden kann/können. Schließlich kann die Induktion des Reportergens/ der Reportergene als Indikator des Liganden/der Liganden verfolgt werden, der/die den "Orphan"- Rezeptor aktivieren kann/können.
Die Zusammensetzungen, Verfahren und Assays dieser Erfindung sowie die bevorzugten Verfahren zum Herstellen und Verwenden derselben werden durch die folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben.

Beispiele

Beispiel 1: Fingermodul

Frühere Studien über Hormonrezeptoren haben gezeigt, daß Aminosäuren der gesamten DNA-Bindungsdomäne für die DNA- Bindung von Bedeutung sein können (Hollenberg et al., 1987). Dieses Beispiel offenbart, welche Aminosäuren zum Erkennen der Sequenz beitragen und folglich für die Bestimmung der Zielgenspezifität verantwortlich sind. Versuchsmäßig ist es wichtig, zu wissen, welche Änderungen in der DNA- Bindungsdomäne mindestens notwendig sind, damit der Glucocorticoidrezeptor die Schilddrüsenhormon- und Östrogen- Response-Elemente erkennen kann. Zwischen dem humanen Glucocorticoidrezeptor (hGR) und dem humanen Schilddrüsenrezeptor-beta (hTRβ) sind in diesem Bereich weniger als die Hälfte der Aminosäuren konserviert (Fig. 1A). Wenn die gesamte hGR DNA-Bindungsdomäne mit der von hTRβ ausgetauscht wird, wird die Spezifität vollständig umgestellt, so daß Hybrid-GTG nur durch TRE aktiviert wird und nicht länger GRE erkennt (Thompson et al., 1989).
In diesem Versuch wurden mutante GR-Expressionsplasmide in CV-1-Zellen von Affennieren zusammen mit mindestens einem Reporterplasmid (z.B. einem der Leuchtfeuerluciferase- Reporterplasmide) eingeführt, um dessen Zielgenspezifität und Transaktivierungswirkung zu untersuchen. Für die Glucocorticoid-Response wurde die Luciferase-codierende Sequenz an das Glucocorticoid-responsive MTV-LTR (MTV-LUC Plasmid) gebunden (Hollenberg et al., 1988). Für die T&sub3;- Empfänglichkeit wurden GRE aus MTV deletiert und durch ein palindromes-TRE codierendes Oligonucleotid ersetzt, um Reporter Δ-MTV-TREp-LUC herzustellen (Umesono et al., 1988, Giguere et al., 1989). Mit Zugabe von synthetischem Glucocorticoid-Dexamethason riefen die parentalen Rezeptoren hGRnx und GTG eine jeweils ungefähr 2.500- und 200-fache Induktion über dem Hintergrundwert von MTV-LUC und Δ-MTV- TREp-LUC hervor (Fig. 2). Diese Induktionen werden eindeutig durch die verwandten Response-Elemente vermittelt.

Beispiel 2: Rezeptoridentität: TRE-Erkennung

Zum Identifizieren von Aminosäuren, die bei Rezeptoren die Unterscheidung der verwandten HRE ermöglichen, wurden eine Vielfalt von chimären DNA-Bindungsdomänen hergestellt. In den in Figur 2 dargestellten Mutanten wurden Teile der Schleifen und Linker zwischen hGR und hTRβ oder humanem Retinsäurerezeptor-alpha (hRARα) ausgetauscht. Dieses Austauschen umfaßte Änderungen in der Schleife 1 (GTG7 und GTG32), in den meisten Teilen des Linkers (GTGB, GTG8, GTG36B und GTG29) und in der Schleife 2 und anschließend in Teilen stromabwärts (GTG6, GTG33 und GTG28). Alle diese ausgetauschten Mutanten waren aktiv (88 bis 7 % der parentalen Response) durch Induktion von Luciferase- Aktivität.
Die austauschbare Natur dieser Schleifen ist bemerkenswert in Bezug auf dramatische Änderungen in der Ladungsverteilung mit keiner Veränderung in der Zielgenspezifität. Außerdem sind sowohl kleine als auch große Substitutionen in den Linkerbereichen relativ verzeihbar ohne Einfluß auf die Promoter-Spezifität. Verkürzen oder Erweitern des Abstandes zwischen den Fingern durch 15 (Grnx und GTG29), 17 (GTG), 19 (GRsst) und 21 (GRsstG) wird außerdem toleriert. Aufgrund der Phenotypen dieser Mutanten ist ersichtlich, daß Unterschiede in der Primärstruktur oder festgestellten Größe in diesen Bereichen gegenseitig gestattet sind, selbst zwischen zwei der am meisten verwandten Mitglieder der Rezeptor-Überfamilie. Da keine der hier beschriebenen Schleifen oder Linkermutanten außerdem geänderte Spezifität aufweist, kann gefolgert werden, daß diese Aminosäuren vermutlich unkritisch sind für die Unterscheidbarkeit zwischen GRE und TRE oder TREp und GRE, sondern an allgemeinen Aspekten der HRE-Erkennung und Transaktivierung beteiligt sind.
Die modulare oder auswechselbare Natur großer Abschnitte der Fingerbereiche ändert nichts an der fundamentalen Tatsache, daß es Sequenzen geben muß, die die Spezifität bestimmen. Bei der Eliminierung in dieser Reihe von Mutanten wurden neun Aminosäuren in den zwei Ketten nicht geändert und können daher Spezifität verleihen. Der erste unmittelbare (P) Bereich folgt C&sub3; und schließt drei Aminosäureketten GS--V im GR und EG--G im TR ein. Diese sind ein Teil eines Abschnittes von 10 Aminosäuren, der hochkonserviert ist und 6 nicht-variable Aminosäuren einschließt. Wenn diese 3 Aminosäuren ausgetauscht werden (siehe GTG3A in Fig. 2 und GTG36A in Fig. 2), sind die resultierenden Chimäre nicht funktionell in Bezug auf MTV-LUC oder Δ-MTV-TREp-LUC. Der zweite oder entfernte (D) Bereich von potentieller Bedeutung in der Spezifität ist eine Kette von 5 Aminosäuren zwischen C&sub5; und C&sub6;; AGRND in HGR und KYEGK in hTRβ.
Tatsächlich führt die Eliminierung dieser Aminosäuren von GTG21 zum Herstellen von GTG 15 zu einem TRE-inaktiven Phenotyp (Fig. 3). Basierend auf diesen Beobachtungen wurde durch kritischen Doppelaustausch mutantes GTG8 (Fig. 3) hergestellt, das beinahe die vollständige hGR-DNA- Bindungsdomäne mit nur 8 hTRβ-spezifischen Aminosäuren trägt. Bemerkenswert ist, daß dieses Chimär eine vollständige Umwandlung der Zielgenspezifität induziert (Fig. 3 und 4h).
Die Induktion der Luciferaseaktivität des TREp-Reporters durch GTG8 ist so wirksam wie für GTG selbst.
Folglich wurden zwei nicht benachbarte "Elemente" (P und D) in der hTRβ-DNA-Bindungsdomäne lokalisiert, die ausreichen, um TRE-spezifische Erkennung im Zusammenhang mit einem andererseits normalen Glucocorticoidrezeptor zu vermitteln. Beide Elemente sind notwendig, während keines allein ausreichend ist. Außerdem umfaßt der Erwerb der TRE- Spezifität durch diesen Austausch einen vollständigen Verlust der GRE-Empfänglichkeit.

Beispiel 3: Rezeptoridentität: ERE-Erkennung

Obwohl alle HRE ein erkennbares konserviertes Motiv enthalten, unterscheiden sich das TREp und palindrome Vitellogenin ERE (EREp) nur in dem Abstand ansonsten identischer Halbstellen (5'-TGACC-3', Fig. 1c) Außerdem weisen neuere Studien darauf hin, daß endogenes T&sub3;R (Glass et al., 1988) sowie das in vitro translatierte Produkt klonierter α und β TR cDNA (Thompson et al., 1989) mit hoher Affinität sowohl an EREp als auch and TREp binden können. Trotz dieser Beziehung wurde die Möglichkeit, daß das T&sub3;R eine ERE-abhängige Transaktivierung vermitteln kann, nicht eingehend untersucht. Um sich diesem Aspekt zuzuwenden, wurde zur Herstellung der Reporterplasmide Δ-MTV-ERE-LUC und Δ-MTV-ERE-CAT ein ERE-codierendes Oligonucleotid in den basalen ΔMTV Promoter eingeführt (Hollenberg et al., 1988).
Dieser Promoter ist tatsächlich Estradiol (E&sub2;) induzierbar, da in CV-1-Zellen die Stimulierung der CAT-Aktivität sowohl von funktionellem ER als auch dem Liganden E&sub2; abhängt (Fig. 4d). Der transfektierte HER konnte durch das GRE nicht aktivieren (Umesono und Evans, nicht publizierte Daten), aber bleibt ein schwacher Aktivator des TREp-Reporters. Jedoch förderten in dem reziproken Experiment die GTG-Chimäre die Aktivität des ERE-Reporters (Figuren 3a und 4d). Im Gegensatz dazu induziert hGR CAT- oder Luciferaseaktivität von einem EREp oder TREp Rezeptor nicht (Figuren 3a und 4d). Folglich kann die DNA-Bindungsdomäne von hT&sub3;Rβ sowohl das TREp und ERE als Response-Elemente in diesem Assaysystem erkennen.
Aufgrund der engen Beziehung zwischen HER und hTR wurden mutante Rezeptoren auf kombinierte ERE und TRE Empfänglichkeit untersucht, um funktionelle Rollen dieser beiden Spezifitätsbereiche zu beurteilen. Bei Angabe der Aktivität von GTG als 100 % zeigten alle TRE+ Mutanten in Figure 2 und 3 (GTxbaG, GTsstG, GTG32, GTG26B, GTG29, GTG28, GTG21 und GTG8) 70 % bis 650 % Aktivität im Hinblick auf den ERE-Reporter (Fig. 3). Außerdem zeigten Mutanten, die das hTRβ-Element P trugen, aber denen das Element D fehlte (GTG16 und GTG3A) signifikante Induktionen durch ERE, selbst wenn sie durch TREp inaktiv waren (Figuren 3 und 4). Dieses Ergebnis zeigt, daß das hT&sub3;Rβ Element P, nicht aber D, einen positiven Phenotyp durch die allgemeinen TGACC-artigen Halbstellen, die in ERE und TREp festgestellt wurden, bestimmt. Alle das GR-Element P enthaltenden Mutanten (HGRNX, GTG7, GTG2S, GRG8, GTG6, GTG36A, GTG5) sind durchweg nicht empfänglich für den ERE Reporter (Daten sind nicht gezeigt).
Der Phenotyp von GTG3A (Figuren 3c und 49) zeigt eindeutig, daß der Austausch von drei Aminosäuren, die das Element P bilden, ausreichend ist, um die Identität der hGR-DNA- Bindungsdomäne (GRE&spplus;, ERE&supmin;, TRE-) in die von ER (GRE&supmin;, ERE&spplus;, TRE-) umzuwandeln. Es ist bemerkenswert, daß dies eine vollständige Umwandlung ist, das heißt, diese Mutante reagiert negativ auf MTV und nur positiv auf ERE. Die ERE- Empfänglichkeit der Mutante GTG3A ist nicht auf den modifizierten MTV-Promoter beschränkt. Zum Beispiel wird der ERE-TK-LUC Reporter auch durch GTG3A gesteuert, während der parenterale TK-LUC, dem ein ERE codierendes Oligonucleotid fehlt, nicht induziert wird (nicht veröffentlichte Beobachtungen).

Beispiel 4: Rezeptoridentität: Duale Spezifität

Die hier dargestellten Daten haben gezeigt, daß das Element P, das in der Basis des Fingers 1 lokalisiert ist und ein Teil des daneben liegenden Linkers die GRE-ERE Empfänglichkeit spezifiziert. Dieses Element umfaßt drei Aminosäureunterschiede zwischen hGR (GSCKV) und hT&sub3;Rβ. Interessant ist, daß hT&sub3;Rβ und hER (EGCKA), wobei beide in Bezug auf ERE aktiv sind, beinahe identische Strukturen in Bezug auf dieses Element haben (Fig. 1a), was darauf hinweist, daß diese Aminosäuresequenzen für das Erkennen von ERE von Bedeutung sind.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß durch Verleihen einer neuen Spezifität durch eine DNA-Bindungsdomäne, die vorherige Bindungsspezifität gleichzeitig verloren geht. Zum Bestimmen, ob individuelle Aminosäuren verschiedene Rollen in Bezug auf Erwerb oder Unterdrückung von ERE-Spezifität spielen, wurde die Aktivität von einzeln gepaarten und dreifachen Mutanten untersucht. Obgleich die dreifache Mutante (GTG3A) selektiv ERE erkennt, ist die doppelte Mutante (GTG2) sowohl durch MTV als auch ERE-Reporter aktiv (Figuren 3c und 4f). Diese Induktion ist von HRE abhängig, da dieser Reporter weder den ΔMTV noch den TREp Promoter aktiviert (Fig. 4). Eine Untersuchung des Phenotyps dieser Mutante zeigt, daß das letzte Glycin in dem T&sub3;Rβ P Element an einer Unterdrückung der GRE&spplus; beteiligt zu sein scheint, ohne einen wesentlichen Einfluß auf die ERE Erkennung zu nehmen.
Basierend auf diesem Ergebnis wurde die Frage gestellt, ob eine einzelne Aminosäuresubstitution ausreichend sein würde, um eine erkennbare Änderung des Rezeptorphenotyps zu erhalten. Bemerkenswert ist, daß durch Substituieren von Glucocorticoidrezeptorglycin oder einer Östrogenrezeptorglutaminsäure zwischen C&sub3; und C&sub4; (GTG1) ein Rezeptor mit doppelter Spezifität hergestellt wird. Durch diese einzelne Aminosäureänderung bleibt die GRE-Erkennung normal, begünstigt aber eine deutliche Erkennung des EREs. Wie bei der Mutante GTG2 sind diese Induktionen entweder von GRE oder ERE abhängig (Figuren 3c und 4e). Da jedoch bei all diesen Mutanten das T&sub3;Rβ D Element fehlt, sind sie in Bezug auf den TREp vollständig inaktiv.

Beispiel 5: Die P und D Elemente

Der Fachmann wird wissen, daß die in den vorherigen Beispielen dargestellten Ergebnisse eine Zahl von unerwarteten Schlußfolgerungen bereitstellen, betreffend die Mechanismen, durch die die nuklearen Rezeptoren ihre geeigneten Response-Elemente identifizieren. Zunächst können die putativen Schleifen der zwei Zinkfinger zwischen Rezeptoren ausgetauscht werden, ohne daß die Spezifität verändert wird. Zweitens sind zwei verschiedene Bereiche, P und D, außerhalb der Schleifen kritisch für die Sequenzerkennung. Drittens können verschiedene Aminosäuren an dem Erwerb oder Verlust der HRE-Empfänglichkeit beteiligt sein. Daher ist es möglich gewesen, durch einen einzigen Aminosäureaustausch einen Rezeptor mit doppelter GRE- und ERE-Erkennung herzustellen.
Es ist wichtig, zu verstehen, daß diese Ergebnisse nicht besagen, daß die Aminosäuren in den Schleifen nicht kritisch für sequenzspezifisches Binden sind, sondern unsere Ergebnisse zeigen, daß die Aminosäuren in den Schleifen nicht kritisch sind für die Identifizierung der Unterschiede zwischen Response-Elementen. Folglich kann man annehmen, daß die gemeinen Schleifenwirkungen darauf hinweisen, daß sie das Erkennen von allgemeinen Aspekten der HRE-Struktur vermitteln. Im Gegensatz dazu würden die P und D Elemente an dem Erkennen variabler Nucleotide beteiligt sein. Dies steht in Übereinstimmung mit der Beobachtung, daß HRE aus einer allgemeinen Kernsequenz zusammengesetzt sind, die nur in einer eingeschränkten Zahl von Nucleotidpositionen geändert werden kann. Dies würde eine putative topographische Linie zwischen dem HRE und dem Zinkfinger vorschlagen, so daß der variable Bereich von HRE immer mit dem P Element des Fingers in einer Linie steht. Es kann daher angenommen werden, daß Aminosäuren in diesem Element spezifische Kontakte mit mindestens einer der variablen Positionen in dem pentamere HRE macht.
Zusätzlich zur primären Sequenzerkennung besteht die Notwendigkeit, Halbstellenabschnitte zu unterscheiden (ERE vs. TRE, Fig. 1c). Wie in Tabelle 1 zusammengefaßt, zeigen unsere Ergebnisse, daß das erste Element (P) die primäre Nucleotidsequenz der Halbstellen spezifiziert, während das zweite Element (D) wichtig ist für das Bestimmen des Halbstellenabschnittes. Mit anderen Worten beschränkt das zweite Element in dem hGR und hER das Erkennen von hRE mit einem Abstand von drei Nucleotiden.
In Bezug auf die Aminosäuresequenz des ersten Elements können alle Mitglieder dieser Rezeptorüberfamilie entweder der GR oder ER Unterfamilie zugeordnet werden (Tabelle 2). Die GR- Unterfamilie umfaßt vier Mitglieder (GR, MR, PR und AR (Evans, 1988), (Lubahn et al., 1988), (Ham et al., 1988)) und alle davon können GRE erkennen, obgleich die physiologischen Wirkungen jedes Hormons ziemlich unterschiedlich sind (Ham et al., 1988). Die anderen Mitglieder sind der ER/TR- Unterfamilie zuzuordnen (ER, T&sub3;Rα, T&sub3;Rβ,RARα, RARβ, VD&sub3;R, NGFI-B (Milbrandt, 1988), TR-2 (Chang et al., 1988), v-erbA, ear2 (Miyajima et al, 1988), ear3 (Miyajima et al, 1988), knirps (Nauber et al., 1988), knirps-related (Oro et al., 1988b), ERR 1 und ERR2 (zur Referenz siehe Evans, 1988) mit einer kleinen Unterschiedlichkeit. Die Mitglieder dieser Unterfamilie können ERE, TREp oder ein palindromes Paar von TGACC Sequenzen, die durch einen Abstand von fünf oder mehr Nucleotiden getrennt sind, erkennen, da der kritische Glutaminsäurerest C&sub3; folgt. Zur Unterstützung dieses Modells hat unsere Gruppe vom Salk Institute for Biological Studies gezeigt, daß der Retinsäurerezeptor an TREp binden und Transkription aktivieren kann.
Im Vergleich zu der strukturellen Konservierung des ersten Elements ist das zweite Element ziemlich divergierend. Gemäß unserer Hypothese braucht das zweite Element nicht direkt an die DNA zu binden, sondern kann räumliche Konfiguration der Halbstellen über Protein-Protein-Wechselwirkung bestimmen. Eine Möglichkeit ist, daß es eine Dimerisations- Wechselbeziehung darstellt. Diese Annahme steht in Übereinstimmung mit neueren Berichten, daß die Rezeptor-DNA- Bindungsdomäne selbst ein Dimerisationssignal zu enthalten scheint (Kumar et al., 1988, Tsai et al., 1988). Tabelle 1 Phenotypen der Wildtyp und mutanten DNA- Bindungsdomänen
Die Phenotypen der GR-ER Hybride sind von Green et al. (1988). (+) bedeutet, daß ein positiver Phenotyp von dem Konstrukt abhängt. Tabelle 2 Struktur des Elements P und Elements D in GR und ER/TR Unterfamilien

Detaillierte Beschreibung der Abbildungen

Figur 1 a) Vergleich der Aminosäuresequenzen zwischen den DNA-Bindungsdomänen hGR, hT&sub3;Rβ und hER (siehe Referenz Evans, 1988). Die oberen Zahlen (1 bis 9) entsprechen den nicht variablen 9 Cysteinen, die in den Rezeptor-DNA-Bindungsdomänen vorhanden sind. Die Zahlen neben den Sequenzen bedeuten die Aminosäureposition jedes Rezeptors. Doppelpunkte zeigen die Identität der Aminosäuren zwischen hGR und hT&sub3;Rβ oder hT&sub3;Rβ und HER an. Die hT&sub3;Rβ DNA- Bindungsdomäne enthält in der Mitte der Domäne zwei zusätzliche Aminosäuren.
b) Vorhergesagte Zinkfinger basieren auf denjenigen für Ratten GR18. Die Zahlen 1 bis 9 der Cysteine sind wie in Fig. 1a. Konservierte Aminosäuren in hGR, hT&sub3;Rβ und hER sind durch den einbuchstabigen Aminosäurecode gezeigt. Punkte stellen variable Aminosäuren in den Rezeptoren dar. Zwei Zinkionen (Zn) sind in einer tetraedrischen Koordination durch zwei Ketten von vier Cysteinen chelatiert (C&sub1; bis C&sub4; und C&sub5; bis C&sub8;), die zwei "Zinkfinger" bilden (Finger 1 und Finger 2). Die zwei Finger sind durch 15 (hGR und hER) oder 17 (hT&sub3;Rβ) Aminosäuren getrennt, wobei ein Linker zwischen den Fingern liegt.
c) Strukturen optimierter Hormon-Response-Elemente für GR (GRE), ER (ERE) und T&sub3;R (TRE) (Siehe Green und Chambon, 1988, Klock et al., 1987 und Glass et al., 1988). Jeder Pfeil bedeutet eine "Halbstelle" der HRE. Diese HRE bestehen aus einem palindromen Paar von Halbstellen, wie durch die Pfeile angedeutet. Sowohl GRE als auch ERE enthalten einen Abstand von drei Nukleotiden (nnn) zwischen den Halbstellen, aber ein solches Nucleotid wurde nicht in TREp (---) festgestellt. Die Punkte in ERE und TREp bedeuten unterschiedliche Nucleotide zu denen von GRE. Gleichermaßen enthalten ERE und TREp die gleiche Halbstellensequenz.

Figur 2

Transaktivierung der Luciferasereporterplasmide durch mutante Rezeptoren. Die Aminosäuresequenz einer parentalen hGRnx DNA-Bindungsdomäne ist dargestellt. hGRnx enthält die Wildtyp hGR DNA- Bindungsdomäne, die durch NotI und XhoI Stellen in der cDNA flankiert ist. Die Zahlen 1 bis 9 sind wie in Figur 1a. Substituierte oder inserierte Aminosäure in der Mutante Grsst sind gezeigt. Strukturen der chimären GR DNA-Bindungsdomäne, die hT&sub3;Rβ (GTG32, GTG7, GTG3A und GTG6) oder hT&sub3;Rα (GTG8) tragen, sind gezeigt. Geänderte Aminosäuren sind dargestellt. Die Mutanten sind nach der Zusammensetzung ihrer DNA-Bindungsdomäne bezeichnet; GTG32 steht fur eine GR-Mutante, die eine DNA-Bindungsdomäne hat, zusammengesetzt aus sowohl hGR als auch hT&sub3;Rβ Sequenzen, und 32 unterschiedliche Aminosäuren zu der Wildtyp hGR Sequenz enthält. Die Aminosäuresequenz der hT&sub3;Rβ DNA-Bindungsdomäne in einem Hybridrezeptor GTG ist gezeigt. GTG ist ein Hybrid-GR, dessen DNA- Bindungsdomäne durch die von hT&sub3;Rβ ersetzt wurde. Geänderte Aminosäuren sind für GTsstG dargestellt. Chimäre hT&sub3;Rβ DNA-Bindungsdomänen, die hGR Sequenzen tragen, sind durch den einbuchstabigen Aminosäurecode angezeigt. Jedes Rezeptor- Expressionsplasmid wurde in CV-1 Zellen mit entweder Glucocorticoid-(MTV-LUC) oder Schilddrüsenhormon-(ΔMTV-TREp-LUC) responsiven Reporterplasmide cotransfektiert, und die Zellen wurden in Abwesenheit oder Gegenwart von 100 nM Dexamethason 36 Stunden kultiviert. Die Transaktivierungswirkung dieser Rezeptoren wurde durch die induzierte Luciferaseaktivität der Reporterplasmide bewertet, die als Prozentangabe von HGRNK und GTG Aktivitaten in Bezug auf MTV-LUC (MTV) (2.500fach) und ΔMTV-TREp-LUC (TREp) (20º0ach) quantifiziert wurde. Die Aktivität unter dem Hintergrundsinduktionswert (6fach für MTV und 2fach für TREp) ist als - angezeigt. Für die Aktivität von GTG18 auf TREp bedeutet "(2)", daß die Induktion unabhängig von TREp ist.

Figur 2 Verfahren

hGRnx10 und GTG14, hergestellt unter Verwendung von bekannten und zuvor veröffentlichten Methoden. Mutante cDNA, die DNA-Bindungsdomänen von GRxba, GTG7, GTG3B, GRG8, GTG6 und GTG3A codieren, wurden erhalten durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese (Kunkel et al., 1985) des NotI-XhoI DNA-Fragments, das für die hGRnx DNA-Bindungsdomäne codiert. Gleichermaßen wurden diejenigen für GTxbaG, GTG32, GTG36B, GTG2g, GTG33 und GTG36A hergestellt durch Austausch des NotI-XhoI Fragments der hT&sub3;Rβ DNA- Bindungsdomäne. Die Mutanten GRsst und GTsstG CDNA enthalten jeweils einen SstI Linker (8-mer, New England Biolabs) an den eingesetzten XbaII-Stellen von GRxba und GTxbaG. GTG23 und GTGLB wurden durch Austausch kleiner NotI-XhaI Fragmente zwischen GRxba und GTxbaG erhalten. Jedes der NotI-XhoI CDNA Fragmente, die DNA-Bindungsdomäne codieren, wurde mit einen großen NotI-XhoI Fragment, das von pRShGRnx10 erhalten wurde, legiert. Zur Herstellung von GTG28 wurde die ClaI-Stelle in die hT&sub3;Rβnx14 DNA-Bindungsdomänen CDNA eingeführt (entsprechend der Aminosäuren "ID" in der Schleife des Fingers 2). Da die hGRnx CDNA, die ClaI-Stelle an dieser Position hat, wurde das NotI-ClaI Fragment der hGRnx CDNA durch das der hT&sub3;Rβnx CDNA ausgetauscht. Alle Mutationen wurden durch Nukleotidsequenzieren bestätigt. Die Herstellung der Reporterplasmide MTV-LUC7 und ΔMTV-TREp-LUC21 wurde unter Verwendung von zuvor veröffentlichten Verfahren durchgeführt. Das Rezeptor-Expressionsplasmid (1 ug), das Reporterplasmid (5 ug), das β- Galactosidase-Vergleichsplasmid (5 ug) und das Trägerplasmid pGEM4 (9 ug) wurden cotransfektiert. Die Transfektion von CV-1 Zellen (Umesono et al., 1988) und ein Assay für die Luciferaseaktivität wurden unter Verwendung der veröffentlichten Verfahren durchgeführt (de Wet et al., 1987), außer daß das Vergleichsplasmid pRSVβGAL durch das Vergleichsplasmid pRAS-βGAL ausgetauscht wurde, das einen humanen c-Ha-ras Promoter enthält (Ishii et al., 1985), der an die codierende Sequenz von β- Galactosidase in einem PUC-abstammenden Plasmid gebunden ist (pUCGALpA, wurde freundlicherweise von Dr. Richard J. Rickles zur Verfügung gestellt), und kein Phenolrot in das Kulturmedium nach dem Einführen des Plasmids in die Zellen gegeben wird.

Figur 3

Identifizierung zweier unterschiedlicher Elemente, die TREp+ und BRE+ Phenotypen spezifizieren. Zwei parentale DNA-Bindungsdomänen sind durch Fettbuchstaben dargestellt. Aminosäuren von GTG, die identisch zu denen von hGR sind, sind durch Punkte angezeigt. Gleichermaßen sind nur unterschiedliche Aminosäuren in den mutanten DNA-Bindungsdomänen von denen von hGR gezeigt. Die zwei Bereiche (Element P und D) sind durch Kästen gekennzeichnet. Die Nomenklatur der Mutanten und die Zahlen sind die gleichen wie in Fig. 2. Die mutanten Rezeptoren wurden auf Transaktivierungswirkung untersucht in Gegenwart einer der Luciferase-Reporter, der GRE (MTV-LUC), TREp (ΔMTV-TREp-LUC) oder ERE (ΔMTV-ERE- LUC) trägt, nach vorübergehender Expression in CV-1 Zellen (± 100 nM Dexamethason für 36 Stunden). Die schwache Stimulierung (2) durch GTG15 auf TREp ist wegen der höheren Hintergrundaktivität in dieser Mutante, und die zweiprozentige Induktion ist nicht abhängig von TREp. 100 %ige Induktion der Luciferaseaktivität durch GTG auf ΔMTV-ERE-LUC ist zehnfach und - bedeutet keine Induktion. Die relativen Aktivitäten durch TRE+ Mutanten, die in Figur 2 in Bezug auf den ERE-Reporter gezeigt sind, sind wie folgt: GTG32 (90 %), GTG36B (140 %), GTG29 (70 %), GTG33 (380%), GTG28 (650%)

Figur 3 Methoden

Ein Östrogen-responsives Reporterplasmid ΔMTV-ERE- LUC wurde wie folgt hergestellt: ein ein palindromes ERE codierendes Oligonucleotid (5'- TCAGGTCACATGACCTGA-3') (siehe Glass et al., 1988) wurde in die einzige HindIII-Stelle des ΔMTV-CAT Plasmids eingeführt, in dem bedeutende GRE zwischen Positionen -190 und -188 von MTV-LTR deletiert wurden; dadurch wurde ΔMTV-ERE-CAT erzeugt; das CAT-Gen wurde anschließend durch das Luciferasegen, das von pSVO-A/L-A Δ5' (de Wet et al., 1987) erhalten wurde, ausgetauscht unter Erhalt von ΔMTV- ERE-LUC. Die Mutante GTG21 wurde aus GTG23 hergestellt durch Einführen der ClaI-Stelle, wie in GTG28 (Fig. 2d). Ein kleines NotI-ClaI-Fragment von hGRnx wurde durch das von GTG23-ClaI ausgetauscht. GTG15 und GTG8 wurden erhalten durch sequenzspezifische Mutagenese (Kunkel et al., 1985) der cDNA, die jeweils GTG21 und GTG3A DNA- Bindungsdomänen codieren. Gleichermaßen wurden GTG2 und GTG1 aus hGRnx hergestellt. Die Transfektion und ein Assay der Luciferaseaktivität waren wie in Fig. 2.

Figur 4

Induktion der CAT-Aktivitäten durch mutante Rezeptoren von basalem ΔMTV-CAT (ΔM), T3- responsivem ΔMTV-TREp-CAT (TREpI und Östrogenresponsivem ΔMTV-ERE-CAT(ERE) Reportern. Zusammen mit einem der Reporter wurden angezeigte Reporter-Expressionsplasmide aus a) bis h) in CV-1 Zellen transfektiert. Die Rezeptoren wurden aktiviert durch Zugabe von 100 nM Dexamethason (D) oder 17β-Estradiol (E2) 36 Stunden lang. Das "-" Symbol bedeutet, daß Lösungsmittel Ethanol zugegeben wurde. Die Strukturen von hGRnx, GTG, GTG8, GTG3A, GTG2 und GTG1 sind in Fig. 2 und 3 dargestellt. Die Bemerkung "kein Rezeptor" bedeutet, daß ein Expressionsplasmid, das hT&sub3;Rβ codiert, in umgekehrter Orientierung cotransfektiert wurde. hER: humaner Östrogenrezeptor. In e) bis h) sind geänderte Aminosäuren in einer schematischen Figur für hGR Zinkfinger gezeigt. Die berechneten prozentualen Umwandlungen in den CAT Assays sind a) ΔM (-) 0,4, (D) 0,5, TREp (-) 0,4, (D) 0,6, ERE (-) 0,6, (D) 1,0, b) ΔM (-) 0,4, (D) 0,7, TREp (-) 0,3, (D) 0,8, ERE (-) 0,4, (D) 1,2, C) ΔM (-) 1,8, (E&sub2;) 1,6, TREp (-) 1,6, (E&sub2;) 7,0, ERE (-) 1,8, (E&sub2;) 78, d) ΔM (-) 1,4, (D) 4,6, TREp (-) 1,1, (D) 74, ERE (-) 1,9, (D) 72, e) ΔM (-) 0,5, (D) 1,3, TREp (-) 0,6, (D) 1,4, ERE (-) 1,2, (D) 20, f) AM (-) 0,8, (D) 1,8, TREp (-) 0,9, (D) 3,5, ERE (-) 1,3, (D) 96, g) ΔM (-) 0,5, (D) 0,7, TREp (-) 0,5, (D) 0,6, ERE (-) 1,0, (D) 88, h) ΔM (-) 0,7, (D) 4,3, TREp (-) 0,7, (D) 87, ERE (-) 1,0, (D) 95.

Figur 4 Verfahren

Reporterplasmide ΔMTV-CAT (Hollenberg et al., 1988), ΔMTV-TREp-CAT (TRE-P1MCAT) (Umesono et al., 1988, Thompson und Evans, 1989), ΔMTV-ERE-CAT (siehe Legende für Figur 3) und ein Expressionsplasmid für hER35 wurden zuvor beschrieben. CV-1 Zelltransfektion wurde durchgeführt wie in der Legende zu Figur 2 beschrieben, außer daß die Luciferasereporter durch die CAT Reporter ausgetauscht wurden. Für das CAT- Assay (Gorman et al., 1982) wurden Zellextrakte entsprechend 30 Einheiten β-Galactosidaseaktivität (Herbomel et al., 1984) 3 Stunden inkubiert. Die Berechnung der prozentualen Umwandlung für CAT- Aktivität wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Thompson und Evans, 1989).

Veröffentlichungen

Diese Beschreibung nimmt Bezug auf die folgenden Veröffentlichugen, jede davon ist durch Bezugnahme ausdrücklich eingeschlossen.
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18. Ishii, S., et al., Science 230, 1378-1381 (1985).
19. Klock, G., et al., Nature 329, 734-736 (1987).
20. Kumar, V., et al., Cell 51, 941-951 (1987).
21. Kumar, V., et al., Cell 55, 145-156 (1988).
22. Kunkel, T. A., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 82, 488-492 (1985).
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27. Nauber, U., et al., Nature 336, 489-492 (1988).
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29. Oro, A. E., et al., Nature 336, 493-496 (1988b). (1987).
31. Picard, D., et al., EMBO J. 6, 3333-3340 (1987).
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37. Waterman, M. L., et al., Mol. Endocrinol. 2, 14- 21 (1988)
38. de Wet, J. R., et al., Mol. Cell. Biol. 7, 725- 737 (1987).

Claims

1. Element P Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GSCKV, EGCKA, EGCKG, EGCKS und EACKA.

2. Element D Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus AGRND, ASRND, PATNQ, KYDSC, KYEGK, HRDKN, PFNGD, LANKD, RGSKD, TYDGC, RSNRD, RANRN, KNEGK, KNNGE, PASNE und PATNE.

3. Mutante Rezeptoren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GTG8, GTG3A, GTG2, GTG1 wie in Figur 4e bis 4h gezeigt.

4. Verfahren zum Konstruieren eines Rezeptors, der sowohl GRE- als auch ERE-Sequenzen aktivieren kann, wobei das Verfahren das Einführen einer Punktmutation umfaßt: (A) in der DNA-Sequenz des Glucocorticoidrezeptor, so daß an der Stelle zwischen C&sub3; und C&sub4; das codierte Glycin durch Glutaminsäure ersetzt wird oder (B) in der DNA-Sequenz des Östrogenrezeptors, so daß an der Stelle zwischen C&sub3; und C&sub4; die codierte Glutaminsäure durch Glycin ersetzt wird.

5. Ein im wesentlichen reines Rezeptorprotein, das sowohl Glucocorticoid- als auch Östrogen-Response-Elemente aktivieren kann, worin das Protein durch das Verfahren nach Anspruch 1 hergestellt wird.

6. Verfahren zum Identifizieren von einem oder mehreren Liganden, der/die einen Orphanrezeptor aktiviert/aktivieren, umfassend: (A) Bereitstellen mindestens eines Reportergens, das funktionell an ein vorbestimmtes Hormon-Response-Element gebunden ist, in Wirtszellen mit Rezeptormangel; (B) Mutieren mindestens derjenigen DNA, die den P-Bereich der DNA-Bindungsdomäne des Orphanrezeptors codiert, so daß der so hergestellte mutierte Orphanrezeptor das vorbestimmte Hormon- Response-Element aus Schritt (A) aktivieren kann; (C) Kontaktieren der Zellen mit Rezeptormangel aus Schritt (A) mit dem mutierten Orphanrezeptor aus Schritt (B); (D) Reagieren der Zellen aus Schritt (C) mit einem oder mehreren Liganden, der/die potentiell an den Liganden/Bindungsdomänenbereich des mutierten Orphanrezeptors binden kann/können und (E) Aufzeichnen der Induktion des/der Reportergens/Reportergene.

7. Verfahren nach Anspruch 6 (B), worin der P-Bereich durch ortsgerichtete Mutagenese mutiert ist.

8. Verfahren nach Ansprüchen 6 oder 7, worin das Reportergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Gen und einem Leuchtfeuerluciferase-Gen.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin die Zelle eine CV-1 Zelle darstellt.