DE68926905T2

DE68926905T2 - Rezeptoren: ihre Identifizierung, Charakterisierung, Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE68926905T2
Application number: DE68926905T
Authority: DE
Inventors: Ronald Mark Evans; Stanley Mark Hollenberg
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1988-11-30
Filing date: 1989-11-30
Publication date: 1997-01-02
Anticipated expiration: 2009-12-01
Also published as: EP0371820B1; ES2090041T3; ATE140964T1; DK102191A; EP0371820A3; GR3020702T3; US5217867A; AU635726B2; DE68926905D1; EP0716145A1; JPH04501955A; PT92478B; WO1990006318A1; CN1043741A; US5310662A; DK102191D0; AU4751290A; CA2004339A1; EP0371820A2; PT92478A

Description

Die Erfindung betrifft neue Rezeptoren, ihre Identifizierung, Charakterisierung, Herstellung und Verwendung.
Es wird auf die PCT-Anmeldung Nr. WO 88/03168 und auf die offengelegte europäische Patentanmeldung Nr. 0 325 849 verwiesen. Diese offengelegten Anmeldungen betreffen in verschiedenen Aspekten Hormonrezeptoren und ihre Zusammensetzungen und Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung, insbesondere in neuen Testsystemen.
Die Erfindung betrifft allgemein die Identifikation und Charakterisierung bestimmter Polypeptidsequenzen, die als Transkriptions-Transaktivationsdomänen fungieren, und ihre Herstellung und Verwendung insbesondere bei der Herstellung neuer intrazellulärer Hormon- oder Hormon-ähnlicher Rezeptoren, z. B. von Steroidrezeptor-Polypeptiden, Thyroid-Polypeptiden und Retinoid-Polypeptiden, einschließlich solcher aus dem Menschen, wobei ein Vorteil hinsichtlich der Transaktivierungs-Transkriptions-Initiationsaktivität durch Wirkungsverbesserung dieser Domänen bereitgestellt wird.
Die Erfindung betrifft insbesondere solche neue Rezeptor-Polypeptide, worin die Wirkungen der Transkriptions-Transaktivationsdomänen so erhöht wurden, daß sie neue Einheiten produzieren, die eine erhöhte Transkrisptions-Initiationsaktivität zeigen, die überraschend höher als beim Ausgangsmolekül ist.
Neue Aspekte hinsichtlich der Herstellung solcher Transkriptions- Transaktivations-Moleküle, einschließlich neuer DNA-Isolate, die sie und die Transkriptions-Transaktivationsdomänen kodieren, Expressionsvektoren, die operativ diese DNA-Sequenzen enthalten, und Wirte, die mit den Vektoren transfiziert sind, sind von der Erfindung umfaßt.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung des neuen Transkriptions-Transaktivations-Hormons oder Hormon-ähnlichen Rezeptors gemäß der Erfindung in Tests zum Screenen verschiedener möglicher Materialien, die eine operative Bindungsaffinität für die neuen Hormon- oder Hormon-ähnlichen Rezeptor haben. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt dieser Aspekt dieser Erfindung einen Test zum Screenen solcher vermutlicher Materialien zur Verfügung, z. B. Steroidagonisten und -antagonisten in einem verstärkten, sogenannten Transaktivationssystem.
Die oben zitierten Patentanmeldungen offenbaren u. a. die Charakterisierung und Herstellung verschiedener Hormon- und Hormon-ähnlicher Rezeptoren, einschließlich von Steroid-, Thyroid- und Retinoid-Rezeptoren, wie solche, die durch Glucocorticoid-, Mineralcorticoid-, Thyroid-, Östrogen- verwandten und Retinoid-Klassen und spezifisch durch Glucocorticoid-, Östrogen-, Aldosteron- und Retinoinsäure-Rezeptoren selbst repräsentiert werden. Diese spezifischen Rezeptoren sind Gegenstand intensiver Forschung und bilden die besondere Erfindungsbasis, die in diesen Patentanmeldungen offenbart und beansprucht werden. In gleicher Weise hat sich die übrige parallele wissenschaftliche Literatur unter den existierenden Rezeptorklassen auf die oben aufgeführten spezifischen Rezeptoren konzentriert.
Es ist z. B. bekannt, daß der Glucocorticoid-Rezeptor zu einer großen Superfamilie von Ligand-abhängigen Transkriptionsfaktoren gehört, die selbst verschiedene Rollen bei der Homestase, Wachstum und Entwicklung spielen. Vergleich der komplementären DNA, die diese Rezeptoren kodiert, wie auch Mutationsanalysen ihrer kodierenden Sequenzen haben bestimmte funktionale Domänen innerhalb des Moleküls identifiziert, von denen man glaubt, daß sie verantwortlich für die DNA-Bindung, Hormonbindung und nukleare Lokalisierung sind. Siehe Evans et al., Science 240, 889 (1988) für einen Überblick zu diesem Thema. Bei dem Glucocorticoid-Rezeptor überspannt die sogenannte DNA-Bindungsdomäne ca. 66 Aminosäuren und ist bei einer Vielzahl von Spezien hoch konserviert, und es wurde gefunden, daß diese Domäne erforderlich ist, um die Transkription zu aktivieren. Siehe Hollenberg et al., Cell 49, 39 (1987), Miesfeld et al., Science 236, 423 (1987), Danielsen et al., Mol. Endo 1, 816 (1987), Kumar et al., Cell 51, 941 (1987), Gronemeyer, EMBO J. 6, 3985 (1987) und Waterman et al., Mol Endo 2, 14 (1988). Es wurde gefunden, daß diese Region neun invariante Cysteinreste enthält, und obwohl der Beitrag eines jeden Cysteinrests in der Gesamtfunktion sowie auch die tatsächliche durch diese Domäne gebildete Struktur unbekannt ist, wurde vermutet, daß diese Cysteinreste zwei Zinkionen unter Bildung von zwei DNA-Bindungen komplexieren, sogenannter Fingerdomänen, welches zu einer Ternärstruktur führt, von der man glaubt, daß sie für deren Lokalisierung und Bindung der entsprechenden DNA-Stelle verantwortlich ist. Siehe Klug et al., Tr. Biochem. Sci, 12, 464 (1987), Bens et al., Cell 52, 1 (1988) und Evans, supra.
An einer Stelle näher zum Carboxy-terminalen Ende gegenüber von der DNA-Bindungsregion liegt die sogenannte Ligand-Bindungsdomäne, welche die Fähigkeit zur Blockade der Rezeptoraktivität in Abwesenheit des Hormons gezeigt hat. Daher hebt das Vorliegen des entsprechenden Hormons die Inhibierung der Rezeptoraktivität auf. Es wurde gefunden, daß die Deletion dieser Region einen Horman-unabhängigen Transkriptionsaktivator produziert. Siehe Godowski et al., Nature 325, 365 (1987), Hollenberg et al., supra, Kumar et al., supra, Danielsen et al., supra und Adler et al., Cell 52, 685 (1988).
Im Gegensatz zu diesen beiden Domänen sind die Sequenzen, die nahe zur Amino-terminalen Region von der DNA-Bindungsregion liegen, sowohl hinsichtlich der Struktur und insbesondere hinsichtlich ihrer Funktion nur kaum verstanden. Diese Region ist unter den verschiedenen Rezeptoren extrem variabel hinsichtlich der Größe und der Zusammensetzung - siehe Evans, supra - und kann zur Heterogenität der Rezeptorfunktion beitragen. Siehe Kumar et al., supra und Tora et al., 333, 185 (1988).
Trotz intensiver Analysen, von denen einige in der wissenschaftlichen Literatur berichtet wurden, sind die Region(en), die die Transaktivierung der Transkriptionsinitiation bestimmen, kaum charakterisiert. Transaktivierungsdomänen können als Polypeptiddomänen definiert werden, die bei Kombination mit der DNA-Bindungs-funktionalen Domäne die Transkriptionsproduktivität durch RNA-Polymerasen erhöhen. Siehe Sigler, Nature 333, 210 (1988), Brent et al., Cell 43, 729 (1985) Hope et al., Cell 46, 885 (1986), Ma et al., Cell 48, 847 (1987), Ma et al., Cell 51, 113 (1987), Lech et al., Cell 52, 179 (1988) und Hope et al., Nature 333, 635 (1988).
Die frühere Erforschung des Human-Glucocorticoid-Rezeptors durch Linker-Scanning-Mutagenese identifizierte zwei Regionen außerhalb der DNA-Bindungsregion, die eine Rolle bei der Transkriptionsaktivierung spielen. Diese Regionen wurden als τ&sub1; und τ&sub2; definiert. Giguere et al., Cell 46, 645 (1986). Weitere Forschung aus diesen Laboratorien führte zu einem Bericht über eine Co-Lokalisierung von Transaktivierung und DNA-Bindungsfunktionen. Siehe Hollenberg et al., supra, Miesfeld et al., supra, Danielsen et al., supra und Waterman et al., supra. Im Verbund hat diese Forschung lediglich zur Entwicklung einer Vorstellung von einem verstärkt modularen Molekül mit diskreten Domänen geführt, von denen jede zu den identifizierten Eigenschaften der Ligand-Bindung, DNA-Bindung und Transaktivierung der Transkription beiträgt. Jedoch wurden die Region(en), die die Transaktivierungsaktivität bestimmen, bislang so gut wie überhaupt nicht verstanden. Daher fehlt in der Vorstellung, welches auf der vorliegenden Forschung beruht, die Würdigung der dynamischen Natur der Steroidrezeptoren, und wie die verschiedenen Domänen die Aktivitätskaskade bestimmen, die durch Ligand-Bindung eingeleitet wird und durch Promotor-spezifische Transaktivierung vollzogen wird.
Obwohl verschiedene Forschungen funktionale Domänen identifiziert haben, gab es bislang noch wenig systematische Anstrengungen zur Identifizierung der Aminosäuren, die für die spezifischen Aktivitäten des Moleküls selbst beitragen. Daher erfolgte die frühere Identifikation der Steroidrezeptor-Transaktivationsregionen nur aufgrund eines aufgezeigten Aktivitätsverlusts durch Deletion oder Insertionsmutagenese, jedoch wurden in keinem Fall die Eigenschaften der Regionen selbst in Tests bestätigt, die den dominanten Kern dieser Funktion wiederspiegeln.
Daher berichten Godowski et al., Science 241, 812 (1988) über Ergebnisse, die zeigen, daß der Glucocorticoid-Rezeptor mindestens eine andere "Verstärkungsdomäne" enthält als das, welches die Bindungsregion des Glucocorticoid-Response-Elements überspannt, und daß die zweite Domäne eine Region in der Nähe des Rezeptor-Amino-Terminus beansprucht. In ähnlicher Weise berichten Webster et al., Cell 54, 199 (1988) über eine induzierbare Transkriptionsaktivierungsfunktion der Östrogen- und Glucocorticoid-Rezeptoren, und diese Forscher spekulieren, daß die relativen Positionen der Hormonregionen (d. h. Ligand- und DNA-Bindungsdomänen) nicht wichtig für die Transkriptionsinduktionsaktivität des Rezeptors sind. Jedoch geben diese Forscher zu, daß sie keine Definition der exakten Lokalisierung und Natur von dem, was sie die Hormon-induzierbare Aktivierungsdomäne nennen, haben, d. h. nichts über ihre Charakterisierung und ihren Beitrag zum transaktivierenden Potential sagen können.
Als Ausgangspunkt für die Erfindung zeigten Giguere et al., supra, den Aktivitätsverlust auf Basis eines Tests zur Messung der Transkriptionsaktivität, wenn eine Zufalls-ortsgerichtete Mutagenese an verschiedenen Orten des Moleküls durchgeführt wurde. In der Folgezeit deletieren Hollenberg et al. Regionen innerhalb des Moleküls, wobei sie wiederum einen Gesamtverlust der Transkriptionsaktivität, induziert durch eine solche Entfernung von Abschnitten von Animosäuren, zeigten.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung die Domäne(n) zu identifizieren und charakterisieren, die für die Transaktivierungs-Transkriptionsaktivität verantwortlich sind, und die Charakterisierung solcher Domäne(n) hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung und der Sequenz, die Erforschung der funktionalen Interaktion der Domäne(n), falls vorhanden, mit sowohl den DNA-Bindungs- und Ligand-Bindungs-Domänen eines gegebenen Rezeptors, und schließlich der Einsatz dieses Wissens mittels Manipulation solcher identifizierter und charakterisierter Transaktivierungs-Transkriptionsdomäne(n), so daß die Gesamt-Transkriptionsaktivität des so manipulierten Rezeptors erhöht wird.
Die Erfindung stellt daher neue Hormon- oder Hormon-ähnliche Rezeptoren zur Verfügung, die aufgrund der Kenntnis der Identität und der Charakterisierung der Transaktivierungs-Transkriptionsaktivitätsdomäne(n) modifiziert wurden, durch Modifikationen, um so neue heterologe Rezeptoren herzustellen, die eine erhöhte Aktivität im Vergleich zu ihrem Ausgangsmolekül haben. Es ist eine Aufgabe der Erfindung, neue heterologe, optional Hybridrezeptoren mit einer erhöhten Transaktivierungs-Transkriptionsaktivität und außerdem mit DNA-bindenden und Ligand-bindenden Domänen herzustellen, die aus verschiedenen unterschiedlichen Rezeptoren stammen können. Es ist ferner eine Aufgabe der Erfindung neue Test bereitzustellen, womit vermutete Rezeptoragonisten und -antagonisten auf eine potentielle kommerzielle Verwertung gescreent und bewertet werden können. Siehe auch Ptashne, Nature 335, 683 (1988).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung beruht auf der Identifikation, Isolierung und Charakterisierung der Transaktivierungs-Transkriptionsdomänen von intrazellulärer Hormon- oder Hormon-ähnlichen Rezeptorpolypeptiden, die ihrerseits die Unterscheidung der Charakterisierung des Rezeptors selbst ermöglichen, sowohl hinsichtlich der physikalischen Attribute und der biologischen Funktion und Wirkung ihrer verschiedenen Domänen. Diese Information hat ihrerseits die Herstellung verstärkter rekombinanter Systeme ermöglicht, die nützlich zur Herstellung neuer Rezeptoren dafür mit verstärkten Transkriptionsaktivierungseigenschaften sind.
Aufgrund der hier gegebenen Information wurde gefunden, daß Rezeptoren Transaktivierungs-Transkriptionsdomänen enthalten, die Positions-unabhängig und autonom in ihrer Funktion sind. Daher stellt die Erfindung neue Hormon- oder Hormon-ähnliche Rezeptoren zur Verfügung, worin die Transaktivierungs-Transkriptionsdomänen in ihrer Fähigkeit zur Transkriptionsaktivierung verstärkt sind. Solche neuen erfindungsgemäßen Rezeptoren enthalten im Vergleich zum Ausgangsmolekül zusätzlich Transaktivierungs-Transkriptionsdomänen, die in einer Weise angeordnet sind, so daß sie eine weitere Steigerung der Transkriptionsaktivität bewirken. Diese neuen Rezeptoren können Hybride sein, worin die DNA-Bindungs- und Ligand-Bindungs-Domänen von Rezeptoren derselben oder verschiedenen Klassen und/oder Spezies vorhanden sind.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung solcher neuer Rezeptoren für in vitro Biotests zur Bestimmung der Funktionalität eines vermuteten Rezeptors oder eines vermuteten Hormons oder Hormon-ähnlichen Materials. Biotests können z. B. in Form einer Exposition eines neuen Rezeptors davon mit einem oder vielmehr einer ganzen Reihe von Testmaterialien, die eine vermutete Hormon- oder Hormon-ähnliche Aktivität haben, und die möglicherweise die Biofunktion des Rezeptors modulieren können, stattfinden, und die Überwachung der Wirkung des Materials auf den Rezeptor in einem in vitro Testset.
Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung solcher neuer Rezeptoren davon über rekombinante DNA-Technologie in allen relevanten Aspekten, einschließlich eines DNA-Moleküls, welches ein rekombinantes DNA-Molekül ist oder ein cDNA-Molekül, bestehend aus einer Sequenz, die den Rezeptor oder eine Transaktivierungs-Transkriptionsdomäne davon kodiert, und den entsprechenden Expressionsvektoren, die operativ solche DNA umfassen, die Expressions-Kontrollelemente enthält, die im für die Expression ausgewählten Wirt operativ sind, und rekombinante Wirtszellen, die mit solchen operativen Expressionsvektoren transfektiert sind.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Induktion der DNA-Expression, die ein Reportermolekül oder ein anders erwünschtes heterologes Polypeptid exprimiert, umfassend die Induktionstranskription der DNA, die das Polypeptid kodiert, durch einen Komplex aus einem neuen Rezeptor dafür und einem entsprechenden Ligand, der zur Bindung an den Rezeptor in der Lage ist, in einem in vitro Set, worin der Rezeptor und die DNA, die das Polypeptid kodiert, über rekombinante Expression in einem transfektierten Zellwirtsystem hergestellt werden.
Die Erfindung umfaßt daher einen Hormon- oder Hormon-ähnlichen Rezeptor als Polypeptid mit einer erhöhten Transaktivierungs-Transkriptionsaktivität eines Promotors, der damit assoziiert ist, über seine intrinsische Fähigkeit der Bindung an eine DNA-Sequenz-Response-Element des Promotors oder durch seine Fähigkeit zur Assoziation mit einem anderen Polypeptid (Polypeptiden), die an das DNA-Sequenz-Response-Element binden, und mit einer größeren Transaktivierungs-Transkriptionsaktivität als die des entsprechenden Ausgangsrezeptors.
Die Erfindung betrifft die rekombinante DNA-Technologie in all ihren Aspekten hinsichtlich der Verwendung der Charakterisierung der Transaktivierungs-Transkriptionsdomäne eines Hormons oder Hormon-ähnlichen Rezeptors für die DNA-Isolatproduktion, einschließlich Kreuz-hybridisierbarer DNA- Isolate, Entwicklung von Expressionsvektoren dafür, transfizierte Wirten, die damit hergestellt werden und Verfahren, welches ein Verfahren zur Anwendung unter Einsatz solcher Information zur Entwicklung von Zellen oder Zellinien die solche genetische Information enthalten, die ausreichend für solche Zellen oder Zellinien zur Herstellung solcher Rezeptoren ist, so daß sie als solche oder in Expressionssystemen oder im Test zur Bestimmung der Aktivität der entsprechenden vermutlichen Liganden eingesetzt werden können.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

1. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Identität und die Transkriptionsaktivität verschiedener humaner Glucocorticoid-Rezeptor-(hGR) Einheiten hiervon, die aus dem Ausgangsmolekül in der Transaktivierungs-Transkriptionsdomänen (tau&sub1;) modifiziert wurden. Wild-Typ hGR (wt) und tau&sub1;-Mutanten sind schematisch angegeben. Funktionale Regionen sind schraffiert (tau&sub1;), gepunktet (DNA- Bindungsdomäne) oder durch "DEX" gekennzeichnet (Hormonbindungsdomäne). Die Zahlen über jedem Rezeptor definieren die Aminosäurepositionen. Fette senkrechte Balken identifizieren die Grenzen eines eingefügten Fragments. Die relative Luciferase-(Reportermolekül) Aktivität wurde gemessen durch MTV- LUC unter Verwendung von 10&supmin;&sup7; M Dexamethason (entsprechendes Steroid) mit Ausnahme der durch "C" gekennzeichneten Rezeptoren nach der Aktivität, die konstitutiv aktiv sind.
Fig. 2 zeigt die Luciferaseaktivität der verschiedenen tau&sub2;-Rezeptoren. Der Wild-Typ hGR wird oben wiedergegeben. Die tau&sub2;-Region überspannt die Aminosäuren 526 bis 556 und wird durch ein ausgefülltes Rechteck wiedergegeben. Austausch in der tau&sub1;-Region sind durch ein ausgefülltes Rechteck (tau&sub2;) oder durch schraffierte Rechtecke für die amphipathische alpha-Helix ("aah") angegeben. Relative Luciferaseaktivitäten wurden durch MTV-LUC in Gegenwart von 10&supmin;&sup7; Dexamethason gemessen, und ihnen folgt ein "(C)", wenn sie Hormon-unabhängig sind. Sternchen geben die Stellen des Aminosäureendes von verkürzten Molekülen wieder.
Fig. 3 zeigt die Konstruktion des Hybrid-Steroid-Rezeptors von Glucocorticoid-Thyroid-Hormonrezeptoren, deren Transaktivierungs-Transkriptionsaktivität durch Zusatz der tau&sub1;-Domänen erhöht ist. Ein Segment der den Glucocorticoid-Rezeptor-cDNA-kodierenden Aminosäuren 77 bis 262 (kodierend die tau&sub1;-Domäne) wurde in die Ratten-alpha-Thyroid-Hormonrezeptor cDNA in einer Position entsprechend der Aminosäure 21 in einer oder mehrfachen Kopien eingefügt. Der Ausgangsrezeptor ist rTR-alpha mit einem BamHI-Linker, der in die einzelne BstEII-Schnittstelle im Aminoterminus eingefügt ist. Die Konstrukte wurden in CV-1-Zellen mit TRE-CAT und CAT-Aktivität, gemessen in Abwesenheit oder Anwesenheit von T3, transfiziert.
Fig. 4 zeigt die Mutations-Punkt-Analyse der hGR-DNA-bindenden Domäne. Die Aminosäuresequenz der hGR-DNA-Bindungsdomäne ist angegeben. Jede Linie repräsentiert eine Information, von der man glaubt, aß sie durch Teile eines separaten Exons kodiert wird. Die Cosensus-Sequenz (con) für die Steroid-Hormon-Rezeptor-Superfamilie ist unter der hGR-Sequenz angegeben, wobei die unveränderten (durchgezogenen), konservierten (Standardtyp) und nicht-konservierten (Striche) Aminosäuren gekennzeichnet sind. Aminosäuren, die in Lysin umgewandelt wurden, sind durch darüberstehende Kreise angedeutet. Die Transkriptionsaktivität von mit MTV-CAT getesteten und mit hGR-SV verglichenen Mutanten wird größer als 10 % (gefüllte Kreise), 1 bis 10 % (halb-gefüllte Kreise) und weniger als 1 % (offene Kreise) angegeben.

2. ALLGEMEINE VERFAHREN UND DEFINITIONEN

Die Aminosäureidentifikation verwendet das Einzel- und Drei-Buchstaben-Alphabet der Aminosäuren, d. h.:
Asp D Asparaginsäure
Thr T Threonin
Ser S Serin
Glu E Glutaminsäure
Pro P Prolin
Gly G Glycin
Ala A Alanin
Cys C Cystein
Val V Valin
Met M Methionin
Ile I Isoleucin
Leu L Leucin
Tyr Y Tyrosin
Phe F Phenylalanin
His H Histidin
Lys K Lysin
Arg R Arginin
Trp W Tryptophan
Gln Q Glutamin
Asn N Asparagin
Steroidrezeptoren hierfür werden hergestellt 1) mit Methionin als erster Aminosäure (welche aufgrund der ATG-Startsignal-Codoninsertion vor dem Strukturgen vorliegt), oder 2) wo das Methionin intra- oder extrazellulär gespalten wird, mit seiner üblicherweise ersten Aminosäure, oder 3) zusammen mit entweder seinem Signalpeptid oder einem anderen konjugierten Protein als das übliche Signalpeptid, wobei das Signalpolypeptid oder ein Konjugat in einer intra- oder extrazellulären Umgebung spezifisch abspaltbar ist. In allen Fällen wird der so hergestellte Rezeptor in seinen verschiedenen Formen gewonnen und auf ein Maß gereinigt, das für den beabsichtigten Zweck ausreichend ist. Siehe oben.
Die "Hormon- oder Hormon-ähnlichen Rezeptoren" dieser Erfindung umfassen die spezifisch offenbarten Rezeptoren für alle Arten, bei denen Kreuz-Hybridisierung vorkommt, am meisten andere Säurgerrezeptoren, wie auch verwandte (z. B. Genfamilie) Rezeptoren gleicher oder Kreuz-hybridisierbarer Arten, die mittels der DNA-Isolierung möglich ist, und Charakterisierung und Verwendung über Kreuz-Hybridisierungstechniken aus den spezifischen Rezeptoren oder aus der Identifizierung über ein Immunkreuzreaktivität gegen Antikörper, die gegen Determinanten in einer geeigneten Weise nach an sich bekannter Verfahren erzeugt wurden. Sie umfaßt auch funktionale Äquivalente aller obiger Rezeptoren, einschließlich der Interspezies- oder Intraspezies-Rezeptoren, worin DNA-Bindungs- und/oder Ligand-Bindungs- Domänen miteinander ausgetauscht sind, oder die sich sonst in einer oder mehreren Aminosäuren vom entsprechenden Ausgangsmolekül, oder in Glycosilierungs- und/oder Phosphorylierungsmustern, oder in der gebundenen Konformationsstruktur unterscheiden.
Ein "Expressionsvektor" umfaßt Vektoren, die zur Expression von DNA- Sequenzen, die hierin enthalten sind, in der Lage sind, worin solche Sequenzen operativ an andere Sequenzen verknüpft sein können, die ihre Expression bewirken können. Es ist auch vorgesehen, obwohl nicht immer explizit angegeben, daß diese Expressionsvektoren in Wirtsorganismen entweder als Episome oder als integraler Part der chromosomalen DNA replizierbar sind. "Operative" oder grammatikalische Gleichwirkungen bedeuten, daß die entsprechenden DNA-sequenzen operational sind, d. h. für ihren beabsichtigten Zweck funktionieren. Auf das wesentliche gebracht ist ein "Expressionsvektor" eine funktionale Definition, und jede DNA-Sequenz, die zur Bewirkung der Expression in einer spezifischen DNA-Sequenz, die hierin vorliegt, in der Lage ist, wird von diesem Begriff mit umfaßt, wie er auf die spezifische Sequenz angewendet wird. Im allgemeinen liegen Expressionsvektoren zur Verwendung in der rekombinanten DNA-Technik oft in Form von "Plasmiden" vor, welche zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleifen umfassen, die in ihrer Vektorform nicht an das Chromosom gebunden sind. Erfindungsgemäß werden "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet, da das Plasmid die aller häufigste verwendete Form eines Vektors ist. Jedoch soll die Erfindung solch andere Formen von Expressionsvektoren, die äquivalente Funktionen bereitstellen können und die im Stand der Technik erst in der Zukunft bekannt werden, mit umfassen.
Abgesehen von der Neuheit der Erfindung, die die Manipulation mittels Repositionierung oder Vermehrung der Transaktivierungs-Transkriptionsdomänen eines Ausgangs-Steroidrezeptors umfaßt, ist davon auszugehen, daß die erfindungsgemäßen neuen Steroidrezeptoren sich sonst im zulässigen Rahmen von dem Ausgangs-Steroidrezeptor hinsichtlich des Unterschieds in einer oder mehr Aminosäuren von der Ausgangseinheit unterscheiden, insoweit ein solcher Unterschied nicht zur Zerstörung der grundlegenden Steroidrezeptoraktivität oder biologischen Funktionalität führt.
"Rekombinante Wirtszellen" betreffen Zellen, die mit Vektoren transfiziert wurden, die unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken konstruiert wurden.
"Extrinsisches Hilfsmedium" umfaßt solche bekannte oder entwickelten Medien, die die Zellen in der Wachstumsphase unterstützen können, oder sie in einem lebensfähigen Zustand halten können, so daß sie ihre rekombinant verstärkte Funktion ausüben können. Siehe z. B. ATCC Media Handbook, Ed. Cote et al., American Type Culture Collection, Rockville, MD (1984). Ein Wachstumshilfsmedium für Säugerzellen enthält z. B. bevorzugt ein Serumsupplement wie z. B. fetales Kalbsserum oder eine andere ergänzende Komponente, die üblicherweise zur Vermittlung des Zellwachstums und der Teilung eingesetzt wird, wie auch Hydrolysate von Tierfleisch oder Milch, Geweben oder Organextrakten, mazerierte Gerinnsel oder ihre Extrakte, usw. Weiter geeignete Mediumkomponenten umfassen z. B. Transferrin, Insulin und verschiedene Metalle.
Die hier offenbarten Vektoren und Methoden sind geeignet zur Verwendung in Wirtszellen über einen weiten Bereich von prokaryontischen und eukaryontischen Organismen.
Zusätzlich zur obigen Diskussion unter den verschiedenen Referenzen auf existierende Literaturtechniken wird auf Standardbücher der Molekularbiologie verwiesen, die Definitionen und Verfahren und Mittel zur Ausübung der Basistechniken, die von der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, betreffen. Siehe z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982 und verschiedene hierin zitierte Referenzen und insbesondere Colowick et al., Methods in Enzymology, Bd. 152, Academic Press, Inc. (1987). Alle hierin zitierten Publikationen sind hiermit durch Bezugnahme ausdrücklich mit einbezogen.
Die vorhergehende Beschreibung und die folgenden experimentellen Einzelheiten, die im Verfahrensteil angegeben sind, wurden zunächst von den vorliegenden Forschern zur Identifikation und Charakterisierung und Herstellung bestimmter Rezeptoren eingesetzt. Es ist dem Fachmann klar, daß durch Ergänzen der vorliegenden Informationen über die Lokalisierung und Erstellung der Transaktivierungs-transkriptionalen Domäne eines gegebenen Rezeptors, und wie er unter Herstellung neuer Rezeptoren Manipuliert werden kann, es nicht notwendig oder vielleicht sogar wissenschaftlich ratsam ist, diese Details bei ihren Bemühungen zur Reproduktion dieser Arbeit zu wiederholen. Anstelle davon können sie den Einsatz alternativer, verläßlicher und bekannter Verfahren in Erwägung ziehen, sie können z. B. die zugrundeliegenden DNA-Sequenzen, die einen bestimmten neuen Vektor kodieren, zur Entwicklung innerhalb einer ähnlichen oder anderen geeigneten operativen Expressionsvektoren und Kultursystemen einsetzen. Daher dient zusätzlich zur Bereitstellung tatsächlich eingesetzter Details die vorliegende Offenbarung unter Einsatz des Wissens des Fachmanns und der vorliegenden Offenbarung zur Ermöglichung der Reproduktion spezifischer offenbarter Rezeptoren und anderer und Fragmente davon. Alle diese Mittel sind von der Bereitstellung und dem Umfang der Erfindung mit eingeschlossen.

3. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BESONDERS BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Erfindung beruht auf der Verwendung des Glucocorticoid-Rezeptors als Modell zur Herstellung neuer modifizierter Einheiten davon, einschließlich von Hybriden des Glucocorticoid-Rezeptors mit anderen Rezeptoren, wie z. B. dem Thyroid-Rezeptor, insbesondere beim Austausch der DNA-bindenden und Ligand-bindenden Domänen zur Herstellung solcher Hybride. In jedem Fall wird der Kern der Erfindung, nämlich die Repositionierung und/oder Verstärkung der Transaktivierungs-Transkriptionsdomäne (Domänen) unter Erzeugung neuer Rezeptoren, deren Transaktivierungs-transkriptionale Aktivität gegenüber dem Ausgangsrezeptor erhöht ist, unter Verwendung des Glcocorticoid- Rezeptors als Ausgangsrezeptor oder Hybride davon erläutert, worauf Vergleiche gemacht wurden für neue Transaktivierungs-transkriptionale Domän- modifizierte Versionen.
Es ist daher selbstverständlich, daß Rezeptoren, die im Stand der Technik bekannt sind, gleich ob vom Wild-Typ, oder Hybride oder funktionale Äquivalente, wie im folgenden dargelegt, sie als Ausgangsmaterialien für die Transaktivierungs-transkriptionale Domäne (Domänen) modifizierenden Aspekte der Erfindung geeignet sind.

4. BEISPIELE

Die folgenden Beispiele erläutern im einzelnen Materialien und Methoden, die in den folgenden experimentellen Verfahren eingesetzt werden:

Punkt-Mutagenese und transkriptionale Aktivierung

Zur systematischen Definition der Rolle der DNA-bindenden Domäne bei der Funktion des Rezeptors wurde intensive ortsgerichtete Mutagenese der konservierten Region eingesetzt. Durch Testen der Rolle einzelner Aminosäuren ermöglicht dieses Verfahren die Ermittlung, ob Mutanten, die die Transaktivierung beeinflussen, unabhängig von solchen sind, die die DNA-Bindung beeinflussen.
Die Sequenz der hGR-DNA-bindenden Region ist in Fig. 4 angegeben, worauf die Consensus-Sequenz für die Steroid-Hormon-Rezeptor-Superfamilie folgt. Unter den Mitgliedern dieser Superfamilie enthält diese Domäne 20 invariante und 12 konservierte Reste. Alle invarianten Aminosäuren, wie auch die 8 konservierten und die 8 nicht-konservierten Reste, wurden in Glycin verändert. Es wurde die Fähigkeit zur Stimulierung der Transkription von GR-empfindlichen MTV-Promotor und zur spezifischen in vitro Komplexierung mit einem glucocorticoiden Reaktionselement (GRE) -DNA-Fragment gemessen.
Die Steroid-abhängige Verstärkung der Transkription von MTV-CAT für eine jede Mutante ist in Tabelle 1 gegeben und ist jeweils oberhalb jeder veränderten Aminosäure in Fig. 4 angegeben. Alle Aktivitäten sind relativ vom Wild-Typ-Rezeptor hGR-SB, der eine mittlere Induktion von ca. 1000-fach liefert. Daher ist auch eine 1%ige Restaktivität signifikant. Die in Tabelle I aufgeführten Deletionsmutanten delta420-451 und delta450-487 entfernen die erste und die zweite Hälfte der DNA-Bindungsdomäne mit einem Bruchpunkt entsprechend einer Exon-Exon-Grenze innerhalb der humanen Mineralcorticoid und Huhn-Progesteron-Rezeptor-cDNAs. Beide haben keine meßbare Aktivität, was darauf hindeutet, daß keine der beiden "Finger" allein für die Aktivierung ausreichend ist.
Von den Glycin-Punkt-Mutanten zerstören alle diejenigen, die eine der neun invarianten Cysteninreste verändern, die Aktivität, was mit der Idee im Einklang steht, daß sie für die Funktion kritisch sind. Ferner ist das nicht-konservierte Cystein an Position 431 für die Funktion nicht notwendig. Überraschenderweise sind nur fünf der restlichen 24 Glycinmutanten komplett inaktiv. Die fünf nicht-funktionalen Allele sind alles invariante Reste, was darauf hindeutet, daß sie in generellen Aspekten der DNA-Bindung involviert sind, nicht jedoch bei der Festlegung der Sequenzspezifität. Jedoch sind nicht alle invariante Reste kritisch für die Funktion. Z. B. wenn Asparaginsäure 426 in Glycin umgewandelt wird, tritt beinahe kein Aktivitätsverlust auf. Sieben der acht Mutanten mit in Glycin veränderten konservierten Aminosäuren sind funktional, wobei die Hälfte dieser Gruppe mehr als 40 % der Aktivität zurückbehält. In gleicher Weise liefert die Mutation nicht-konservierter Aminosäuren innerhalb der DNA-Bindungsdomäne in keinem Fall einen Rezeptor mit weniger als 10 % Aktivität und verursacht im allgemeinen einen geringen Funktionsverlust. Daher existiert trotz signifikanter Ausnahmen eine gute Korrelation zwischen der Konservierung einer Aminosäure unter dem Ausmaß an Funktionsverlust bei Umwandlung in Glycin, wobei alle invarianten Cysteine eine kritische Rolle für die Funktion spielen. TABELLE 1 Vergleich von transkriptionaler Aktivität und DNA-Bindung für hGR- Glycin-Mutanten
a Die Aktivität wurde mit MTV-CAT in CV-1-Zellen gemessen.
b Der DNA-Bindungstest wird an anderer Stelle beschrieben (Hollenberg et al., 1987). Der gegebene Wert wurde aus den gesamten immunpräzipitierten Zählungen abgeleitet, spiegelt jedoch die spezifische Bindung bestimmt durch Gelelektrophorese wieder.

In vitro DNA-Bindung von Punkt-Mutanten

Die im Transkriptionstest gemessene CAT-Aktivität ist die Summe multipler individueller Funktionen einschließlich der Kern-Lokalisierung, DNA- Bindung, Dimerisation und vielleicht der allosterischen Vorkommnisse und Protein-Protein-Wechselwirkungen, die letztendlich zur Aktivierung führen. Falls mehr als eine der wesentlichen Funktionen durch die DNA-Bindungsdomäne kodiert wird, behalten einige der nicht-funktionalen Mutanten ihre Fähigkeit zur Bindung an DNA, können jedoch nicht mehr aktivieren. Zur Untersuchung dieser Möglichkeit wurde jedes Mutantenprotein durch Transfektion des entsprechenden Expressionsvektors in COS-1-Zellen hergestellt und auf seine Fähigkeit zur Bildung einer spezifischen DNA-Protein-Komplexes mit radiomarkierter DNA im Rohextrakt untersucht. Die Aktivität jeder Mutante in diesem Immunpräzipitations-DNA-Bindungstest ist in Tabelle I angegeben. Der angegebene Wert zeigt die spezifische Bindung des GRE-Fragments. Im allgemeinen besteht eine gute Übereinstimmung zwischen der Fähigkeit zur Aktivierung der Transkription und zur DNA-Bindung in vitro. Mutanten, bei denen die DNA-Binde-Aktivität deutlich niedriger als die transkriptionale Aktivität ist, wie z. B. G446, G455, G467 und G486, können in vitro instabil sein. Die transkriptionale Aktivierung, die für diese Mutanten gemessen wird, ist das Ergebnis der spezifischen Wechselwirkung mit der DNA in vivo, da die Deletion der GRE aus dem MTV-Promotor ihre Aktivität zerstört,
Nur eine einzelne Mutante, G442, die das Lysin, das direkt dem ersten vermutlichen Finger folgt, in Glycin umwandelt, hat ihre Fähigkeit zur effizienten Stimulierung der Transkription vollständig verloren, wogegen sie die Affinität zur DNA in vitro beibehält. Die Spezifität der Bindung an GREs relativ zu nicht-spezifischen Sequenzen wird nur minimal beeinflußt, was darauf hindeutet, daß der dramatische Aktivitätsverlust nicht aufgrund einer Unfähigkeit zur Bindung an Promotorsequenzen in vivo herrührt. Dies ist eine interessante Mutante, da sie zur Vermutung Anlaß gibt, daß die DNA-Bindung nicht ausreichend für die Aktivierung ist. Vielleicht verhindert G442 einen sekundären Vorgang, wie z. B. eine allosterische Veränderung, die der primären Protein-DNA-Wechselwirkung folgt. Trotz dieser Ausnahme zeigen diese Ergebnisse, daß die Cystein-reiche 66-Aminosäurregion die DNA-Bindungsdomäne umfaßt. Obwohl die DNA-Bindung notwendig für die Transaktivierung dieser Funktion ist, muß sie in der Tat in anderen Regionen des Rezeptors angeordnet sein.
Die G442-Spezies hat eine besondere Bedeutung hinsichtlich ihrer Einsetzbarkeit, da sie die einzige hergestellte Spezies ist, die keine Aktivität auslösen kann, jedoch trotzdem nachweislich wesentliche DNA-Bindung zeigt. Es wird z. B. vermutet, daß ein Test entwickelt werden kann, der diese Eigenschaften sowohl der G442- als auch der I550*-Spezies ausnutzt. Der I550*-Spezies fehlt vollständig die Ligand-bindende Domäne und als solche reagiert sie nicht auf das Vorliegen oder Fehlens des Hormons. Das Hormon für eine spezifische Ligand-bindende Stelle hebt die Inhibierung des Moleküls auf unter Wirkung als Transaktivierungs-Transkriptionsfaktor. Das Fehlen dieser Domäne bedeutet, daß die I550*-Spezies immer eine Aktivität in einem Test mit oder ohne Anwesenheit eines Steroids zeigt. Andererseits wird die G442-Spezies im gleichen Test immer mit oder ohne einem Steroid inaktiv sein. Durch Entwicklung eines geeigneten Tests, worin beide Rezeptoren G442 und I550* im System vorliegen, wird zunächst eine 100 %ige Aktivität, beruhend auf das Anteil der I550*-Spezies allein vorliegen. Nach Zugabe des geeigneten Steroids zum System wird man beobachten, daß die Aktivität mit der Zeit abfällt zunehmend auf 0. Die Verabreichung eines vermutlichen Antagonisten zusammen mit einem geeigneten Steroid, falls es als solches aktiv ist, wird die Aktivität wieder herstellen, da der Antagonist mit der Wirkung des Steroids in Wechselwirkung tritt und daher die Gesamtaktivität vermindert und eine Wiederherstellung der Aktivität beobachteten wird.

GAL4/hGR-Chimere

Fall die DNA-Bindung und τ-Funktionen wirklich trennbar sind, besteht die Möglichkeit des Ersatzes der hGR-DNA-Bindungsdomäne mit einer Nicht-Rezeptor-DNA-Bindungsdomäne unter Herstellung eines Hybridaktivatorproteins mit einer neuen Promotorspezifität. Zur Überprüfung dieser Möglichkeit wurde die hGR-Cystein-reiche Region mit ersten 74 Aminosäuren von Hefe-GAL4 ersetzt. Diese GAL4-Aminosäuren sind ausreichend zur Sequenz-spezifischen DNA-Erkennung, haben jedoch keine transkriptionale Aktivierungsfähigkeit. Die Fähigkeit zur Transaktivierung liegt außerhalb der DNA-Bindungsdomäne und wird durch zwei separate Regionen des Proteins kodiert. Daher müssen zur Herstellung eines funktionalen Transkriptionsfaktors die Fusionen zwischen der GAL4-DNA-Bindungsdomäne und hGR, Transaktivierungsfunktionen, die von dem hGR bereitgestellt werden, enthalten.
Zur Überprüfung der Funktion von hGR-GAL4-Hybriden wurde der GAL4- empfindliche Promotor delta MTV-GAL-CAT aus MTV-CAT konstruiert. Dieses Fusionsgen wurde unempfindlich für GR gemacht und GAL4-induzierbar durch Ersatz der GRE-Sequenzen mit einer synthetischen GAL4-Bindungsstelle. Bei Messung der Aktivierung von hGR und GAL4 auf diesen Promotor kann hGR keine meßbare Stimulierung von diesem Promotor liefern, wogegen GAL4 eine Erhöhung der CAT-Expression ca. um 20-fach relativ zu einem Kontroll-Expressionsvektor bewirken kann. Dieses stimmt mit früheren Berichten überein, daß GAL4 in höheren eukaryontischen Zellen Funktionen ausüben kann. Die Stimulierung durch GAL4 wird klar durch die synthetische GAL4-Bindungsstelle vermittelt; Deletion dieser Stelle macht den Promotor unempfindlich gegenüber GAL4.
Fusionen zwischen der GAL4-DNA-Bindungsdomäne und dem potentiellen hGR-Aktivierungsdomänen wurden auf ihre Fähigkeit zur Stimulierung des GAL4-empfindlichen Reporters geprüft. Um zu zeigen, daß die hGR-DNA-Bindungsdomäne nicht für die Aktivität dieses Hybrids erforderlich ist, wurde die GAL4-DNA-Bindungsdomäne durch die hGR-DNA-Bindungsdomäne unter Herstellung des Hybrids GgalG ersetzt. (Die hGR, einschließlich dem Aminoterminus (g-), DNA-Bindungsdomäne (G) und Carboxyterminus (G) wird als G-G-G bezeichnet. Austausch der hGR-DNA-Bindungsdomäne mit der von GAL4 erzeugt G- gal-G.) Das erhaltene Hormon-abhängige Hybrid kann deutlich in Abwesenheit der hGR-DNA-Bindungsdomäne funktionieren und wirkt in der Tat als wirksamerer Transkriptionsfaktor als GAL4 in diesen Testsystemen, wobei es eine 500-fache Steigerung der CAT-Aktivität bei Zugabe des Hormons liefert. Unerwarteterweise kann GgalG auch deltaMTV-CAT ohne eine GAL4-Bindungsstelle stimulieren, jedoch nur ca. 5 % von der gemessen bei einer detlaMTV-GAL- CAT. Das Plasmid deltaMTV-AT kann eine kryptische GAL4-Erkennungsstelle enthalten, die nur mit dem stärkeren GgalG-Aktivator und nicht dem schwächeren GAL4 freigelegt wird. In der Tat ist die Aktivierung von der GAL4- DNA-Bindungsdomäne abhängig; GgalG funktioniert bei deltaMTV-CAT, wogegen GGG es nicht tut.
Die Transaktivierungsfähigkeit von GgalG muß durch die Amino- oder Carboxy-terminalen Regionen von hGR geprüft werden, da die GAL4-DNA-Bindungsdomäne allein inaktiv ist. Folglich wurde jede dieser hGR-Regionen einzeln auf seine Fähigkeit zur Komplimentierung der GAL4-DNA-Bindungsfunktion getestet. Beide Hybride sind mit gGal(delta) funktional, wobei sie eine konstitutive Aktivität zeigen, wogegen (delta)galG voll Hormon-abhängig ist. Daher sind autonome Transaktivierungsfunktionen sowohl in dem N- terminalen als auch C-terminalen Segmenten des hGR umfaßt, obwohl sie unterschiedlichen Anforderungen unterliegen.

Rearrangierte und teilweise duplizierte hGR-Mutanten

Fusion mit der GAL4-DNA-Bindugnsdomäne zeigte das Vorliegen bestimmter Transaktivierungseigenschaften in den hGR-Amino-terminalen 420 Aminosäuren und den Carboxy-terminalen 300 Aminosäuren. Mutanten des hGR mit taul-Duplikationen wurden auf dem Luciferasederivat von MTV-CAT, MTV-LUC getestet. Aktivitätswerte, bestimmt mit dem MTV-Luciferasefusionsgen und MTV-CAT sind äquivalent für die zuvor beschriebenen Deletionsmutanten. Fig. 1 zeigt die Serie der τ&sub1;-Mutantderivate und ihre Luciferaseaktivität relativ zum Wild-Typ-Rezeptor. Fehlen von τ&sub1; reduziert die Aktivität auf 5 %, wogegen die Tandem-Duplikationsmutante GR11 als "Super"-Rezeptor mit 310%iger Aktivität wirkt. Mutanten GR12, GR14, GR17 und GR18 zeigen, daß τ&sub1; zwischen der DNA und Hormon-bindenden Regionen funktionieren kann, wie auch auf der Amino-terminalen Seite der DNA-bindenden Region, was in jedem Fall zu einem Hormon-abhängigen Aktivator Anlaß gibt (Fig. 1). Dies weist auf eine deutliche Flexibilität der Rezeptorstruktur hin. Die Fähigkeit von τ&sub1; zur Aktivitätserhöhung ist unabhängig sowohl von den Amino- als auch Carboxytermini, wie in Fig. 1 durch Vergleich von GR13- und GR14-Aktivitäten, und GR15 mit I515* und GR16 gezeigt. Die τ&sub1;-Region kann nicht für die gesamte Transaktivierungsfähigkeit im Aminoterminus verantwortlich sein, wie durch die 4-fach größere Aktivität von GR18 relativ zu GR15 gezeigt. Ebenfalls zur Unterstützung dieser Vermutung führt die Deletion von sowohl τ&sub1; als auch des Carboxyterminus in GR15 zu 1 % Restaktivität, eine 10-fache Induktion, die durch Deletion des Hauptteils des Aminoterminus (Vergleiche GR15 und GR26, Fig. 2) zerstört werden kann.
Eine zweite Region mit potentiellem Transaktivierungscharakter ist τ&sub2;, die genau am Amino-terminalen Ende der Hormonbindungsdomäne (Aminosäuren 526-556) lokalisiert ist. Diese Region hat fünf negativ geladene Reste in einem Streifen von 18 Aminosäuren und ist in der Rezeptoraktivität durch den 2-fachen Unterschied in der Aktivierung der verkürzten Mutanten I550* und I515* (Fig. 3) beteiligt. Zur Bestimmung, ob τ&sub2; eine Aktivatordomäne bildet, wurde es benachbart oder anstelle von τ&sub1; eingeführt. Fig. 3 zeigt, daß diese Reaktion zu einem 3-fachen Anstieg der Aktivität führt, wenn sie in dem Aminoterminus unabhängig von τ&sub2; eingeführt wird (vergleiche GR20 mit "wt", GR21 mit Δ77-262). Eine zweite Kopie ergibt einen weiteren zweifachen Anstieg, so daß ein Paar von τ&sub2;-Regionen einen Gesamtaktivitätsanstieg von 6-fach liefert (GR22). Daher ist die Position von τ&sub2; in dem Rezeptor flexibel wie bei τ&sub1; seine Aktivität ist kumulativ und seine Funktion kann konstitutiv sein (z. B. GR25).
Als Konstruktionen ähnlich zu τ&sub2; wurden die Mutanten GR21 und GR22 unter Verwendung der synthetischen amphipathischen α-Helix, "aah", enthaltend 20 % saure Reste konstruiert, und es wurde gezeigt, daß sie Transaktivierungseigenschaften im Kontext von Hefe GAL4 besitzen (Gininger et al., Nature 330, 670 (1987). Die Größe und Ladungseigenschaften der "aah"-Sequenz ist ähnlich zu der τ&sub2;-Region, welche uns dazu verleitete, ihre potentielle Aktivität im Kontext von hGR zu untersuchen. In der Tat wird ein ähnlicher Anstieg der Aktivität bei Mutanten mit einzelnen oder mehrfachen Kopien von τ&sub2; und aah beobachtet (Fig. 3; Vergleich GR21 mit GR23, GR22 mit GR24), was darauf hindeutet, daß diese Regionen äquivalente Funktionen ausüben können. Die Ergebnisse unterstützen und erweitern die Vermutung der modularen Natur von Transaktivierungsdomänen.
Transaktivierungs-(τ) Domänen
Wir haben diskrete hGR-Transaktivierungsregionen nach den folgenden beiden Kriterien definiert: Deletion senkt die Aktivität und Duplikation erhöht sie. Nach diesen Standards kodieren zwei Regionen des Rezeptors, je zu 200 und 30 Aminosäuren, die Transaktivierungsfunktionen. Die Lokalisierung dieser beiden Regionen schließt nicht ihre Rolle als zusätzliche Aktivatorsequenz innerhalb des hgrs aus. Überprüfung der Primärsequenzen von τ&sub1; und τ&sub2; liefert keine offensichtliche Homologie mit der Ausnahme, daß beide Regionen einen sauren Charakter zeigen. Diese Eigenschaft ist bemerkenswert, da Aktivierungsdomänen in den Hefe-Transkriptionsfaktoren GAL4 und GCN4, obwohl denen offensichtlich Sequenzidentität fehlt, reich an sauren Resten sind. Diese scheinbare Ähnlichkeit zeigt nicht, daß eine der identifizierten Aktivatorregionen entweder in GAL4, GCN4 oder dem Glucocorticoid- Rezeptor über einen gemeinsamen Mechanismus funktionieren, obwohl dies wahrscheinlich ist. Die Möglichkeit eines gemeinsamen Mechanismuses wird ferner unterstützt durch die Beobachtung, daß die synthetische amphipathische α-Helix ("aah") Sequenz funktional τ&sub2; ersetzen kann, und in einigem Maße auch τ&sub1;. Das Fehlen einer offensichtlichen Sequenz- und Größenverwandtschaft von τ&sub1; und τ&sub2; und den Hefe-Aktivierungssequenzen führt zur Ansicht, daß die Transaktivierungsfunktionen innerhalb des Gesamtkontextes der negativ geladenen Reste auf der Oberfläche des DNA-gebundenen Proteins beruhen könnten.

hGR-Modularität

Die modulare Natur des hGRs ergab sich nicht nur aus Vergleich der Primärsequenz mit der Steroid-Rezeptor-Superfamilie, sondern auch mit der Fähigkeit zum Austausch funktionaler Domänen und der Erzeugung neuer chimärer Aktivatoren. Die DNA-Bindungsdomäne des hGRs wurde durch die des humanen Östrogen-Rezeptors ersetzt (Green et al., Nature 325, 75 und Chambon (1987)) und mit der nicht-verwandten DNA-Bindungsdomäne aus GAL4. Ihre Position ist nicht kritisch, da sie am Aminoterminus funktioniert. Zusätzlich kann die DNA-Bindungsdomäne Amino- oder Carboxy-terminal sowohl zu τ&sub1; und τ&sub2; ohne negative Wirkung auf die Funktion dieser Domänen angeordnet werden. Übereinstimmend mit der modularen Eigenschaft ist die Position von τ&sub1; und τ&sub2; nicht kritisch und ihre Vervielfachung führt zu einer Erhöhung der Rezeptorfunktion. Daher waren wir in der Lage, Rezeptoren mit einer bis zu 4- fachen Aktivität im Vergleich zum Wild-Typ-Rezeptors oder mit geänderter DNA-Bindungsspezifität zu erzeugen. Hybridrezeptoren, die immer noch hormonell induzierbar sind, weisen auf einen nicht-spezifischen Mechanismus hin, wodurch die Hormon-Bindungsdomäne den Rest des Moleküls einen Ligand- abhängigen Effekt verleiht. Experimentelle Details und die Diskussion sind wie folgt:

Plasmid und Punkt-Mutations-Konstruktion

Plasmid hGR-S wurde durch Rekombination an der ClaI-Schnittstelle zwischen den Linker-Scanning-Mutanten I532 und I403S erzeugt (Giguere et al., Cell 46, 645 (1986)). I403S wurde abgeleitet von I403 durch Einführung des SstI-Adaptors 5' GATCGAGCTCGC 3' in die BamHI-Schnittstelle. Dieses hGR-Derivat ist der Ausgang für alle Punkt-Mutanten und ist ununterscheidbar vom Wild-Typ-Rezeptor in der DNA-Bindung und transkriptionalen Aktivierung. Zur Umwandlung des gewünschten Codons von hGR-SB in eines, welches Glycin kodiert, wurde zunächst das SstI/BamHI 400-Nukleotidfragment aus dem Plasmid hGR-SB in das M13mp18 unter Erzeugung einer einzelsträngigen Matrize eingeführt. Dann wurden synthetische Oligonukleotide mit 13 bis 15 Basen unter Veränderung des erwünschten Codons in GGN nach Standardtechniken verwendet, worauf Wiedereinführung des geänderten SstI/BamHI-Fragments in hGR-SB folgte. Die Deletionen Δ420-451 und Δ450-487 wurden mit längeren Oligonukleotiden (20meren) erzeugt; die angegebenen Aminosäurepositionen definieren nicht-deletierte Reste an der Deletionsverknüpfungsstelle. Mutanten-Sequenzen wurden direkt aus der doppelsträngigen Plasmid-DNA unter Einsatz alkalischer Denaturierung (Hattori et al., Anal. Biochem. 152, 232 (1986)), worauf Kettenabbruch der synthetischen hGR-Primer folgte, bestimmt.
Das Reporterplasmid MTV-CAT und sein Deletionsderivat ΔMTV-CAT wurden wie folgt hergestellt. Die HindIII-Schnittstelle von pBLCAT2 (Luckow et al., Nucl. Acids Res. 15, 5490 (1987)) wurde zunächst unter Erzeugung von pTKCAT-H zerstört. Der HSV-Thymidin-Kinase-Promotor von pTKCAT-H wurde dann durch Verdau mit BamHI/BglII ausgeschnitten und durch das BamHI-, MTV-LTR- Fragment von pMTV-TK (Kuhnel et al., J. Mol. Biol. 190, 367 (1986)), pLS-190/-181 oder pLS-96/-88 (Buetti et al., J. Mol Biol. 190, 379 (1986)) unter Erzeugung von MTV-CAT, -190(181 MTV-CAT oder -96/-88 MTV-CAT ersetzt. ΔMTV-CAT wurde aus -190/-181- und -90/-88 MTV-CAT durch Rekombination zwischen den HindIII-Schnittstellen dieser Mutanten konstruiert. ΔMTV-CAT wurde in MTV-GAL-CAT durch Einführung der synthetischen GAL4-Bindungsstelle "17MX" (Webster et al., Cell 52, 169 (1988)) in die einzelne HindIII-Stelle umgewandelt. Plasmid MTV-LUC wurde konstruiert durch Umwandlung der HindIII-Schnittstelle von pSVOA/L-A Δ5' (de Wet et al., Mol Cell. Biol. 7, 725 (1987)) in XhoI und Einführung der Luciferase-kodierenden und SV40-Polyadenylierungssequenzen aus diesem Derivat (erzeugt durch BamHI-Verdau, Klenow-Polymerase I Endaufüllung und XhoI-Verdau) in XhoI/SmaI-verdautem MTV-CAT.
GgalG wurde abgeleitet aus pG525 (Laughon et al., Mol Cell. Biol 4, 260 (1984)). Primer-gerichtete Mutagenese wurde verwendet zur Einführung der NotI- und XhoI-Schnittstellen an den kodierenden Sequenznukleotiden -10 bis -3 und +223 bis +228. Die GAL4-DNA-Bindungsdomäne wurde aus diesem Derivat durch Verdau mit NotI ausgeschnitten und in pRShGR1α (Giguere et al., Nature 330, 624 (1987)) anstelle der Endogen-DNA-Bindungsdomäne eingefügt. GgalΔ und ΔgalΔ wurden hergestellt durch Verdau von GgalG und ΔgalG mit XhoI, worauf Endauffüllen und Ligation folgte. ΔgalG wurde konstruiert durch Einführen eines synthetischen Oligonukleotid-Duplex (ΔAN, 5' GTACCACCATGGGGC 3'), enthaltend eine Consensus-Ribosom-Bindungsstelle (Kozak, Nucl. Acid. Res. 12, 857 (1984)) anstelle der Amino-terminalen Kodierung Asp718/NotI-Framgent von GgalG konstruiert.
Die Herstellung der Mutanten Δ77-262, I515* und Δ9-385 wurde von Hollenberg et al., Cell 49, 39, (1987) beschrieben. τ&sub1;-Mutanten wurden konstruiert unter Verwendung des BglII/BamHI-Fragments aus I262 (Giguere et al., Cell 46, 645 (1986)), kodierend die Aminosäuren 77-262 des hGR. Dieses Fragment wurde in die BamHI-Schnittstellen der hGR-Linker-Scanning-Mutanten I262 und I515 unter Erzeugung von GR11 und GR12 eingefügt. GR13 wurde aus PRShGR1α durch Ersatz der Amino-terminalen kodierenden Sequenzen mit dem ΔAN-Adapter wie oben beschrieben abgeleitet. GR17 wurde erzeugt durch Einfügen des Amino-terminalen kodierenden BamHI-Fragments, erzeugt durch Rekombination zwischen den Linker-Scanner-Mutanten I9 und I384 (Giguere et al., supra) in die BamHI-Schnittstelle von I515. Die Mutante I550* wurde hergestellt durch Rekombination zwischen den BamHI-Schnittstellen der Mutanten I550 und I696, wodurch der Leserahmen nach Aminosäure 550 verschoben wurde. Diese Mutante wurde in einem früheren Bericht inkorrekt als δ532-697 beschrieben (Hollenberg et al., supra). Zur Erzeugung von τ&sub2;-Derivaten wurde ein ausschneidbares τ&sub2;-kodierendes Fragment durch Umwandlung der hGR- Nukleotide 1704-1709 und 1800-1805 erzeugt (Hollenberg et al., Nature 318, 635 (1985)) in die BamHI- und BglII-Schnittstellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichteter Mutagenese. Die Sequenz, kodierend für τ&sub2; wurde dann in die BamHI-Schnittstelle von I262 unter Herstellung von GR20 oder anstelle des BglII/BamHI-Fragments von I262 unter Erzeugung von GR21 eingefügt. GR23 wurde erzeugt durch Austausch des BglII/BamHI-Fragments von I262 mit einem synthetischen Oligonukleotid-Duplex (5'GATCT GGAAT TACAA GAGCT GCAGG AACTA CAAGC ATTGT TACAA CAGCA AGAG 3') kodierend die "aah"-Sequenz (Giniger und Ptashne, 1987). Mutantenmit Tandem-Kopien dieser Sequenz und τ&sub2; (GR24 und GR22) wurden nach Standardtechniken (Rosenfeld und Kelly, 1986) erzeugt. Doppel-Mutant-Derivate der oben beschriebenen Konstruktionen wurden erzeugt durch Rekombination an ihren ClaI-Schnittstellen: GR14 nach GR12 und GR13; GR15 nach Δ77-262 und I515*; GR16 aus GR11 und I515*; GR18 aus GR13 und GR17; GR25 aus GR22 und I515*; GR26 aus Δ9-385 und I515*.

Immunpräzipitations-DNA-Bindung

DNA-Bindung wurde gemessen wie zuvor beschrieben (Hollenberg et al., supra). Mutant-Rezeptor, erhalten in einem rohen COS-1-Zellextrakt nach Transfektion, wurde mit einer Mischung von radiomarkierten DNA-Fragmenten inkubiert, von denen einer GREs enthielt. Rezeptor-DNA-Komplexe wurden mit Rezeptor-spezifischem Antiserum und Staph A immunpräzipitiert, vom Protein befreit, Cerenkov-gefällt und dann einer Elektrophorese mit einem denaturierenden Polyacrylamidgel unter Bestätigung der spezifischen Bindung unterzogen. Die totalen immunpräzipitierten Zählungen wurden verglichen. Das Vorliegen von Mutanten-hBR-Protein in jedem COS-1-Zellextrakt wurde durch Western-Blot-Analyse bestätigt.

Transfektion und Luciferasetests

Transfektion von CV-1- und COS-1-Zellen war wie zuvor beschrieben (Giguere et al. und Hollenberg et al., supra) unter Verwendung von 5 µg eines jeden Plasmids pro 10 cm Schale. Luciferasetests erfolgten wie beschrieben (de Wet et al., supra).

Zellkultur und Transfektion

Die Bedingungen für das Wachstum und die Transfektion von CV-1 (afrikanische Meerkatzennieren) Zellen waren wie zuvor beschrieben (Giguere et al., Cell 46, 645 (1986)) mit der Ausnahme, daß das Kalziumphosphat-Präzipitat auf den Zellen 4 bis 8 Stunden stehengelassen wurde, wonach das Medium mit DMEM mit 5 % T&sub3; freiem Rinderserum minus oder plus 10-&sup7; M T&sub3; (Sigma) ausgetauscht wurde. Die Zellen wurden 36 Stunden nach Zugabe von T&sub3; geerntet, und CAT-Tests erfolgten wie beschrieben (Gorman et al., Mol. Cell. Biol. 2, 1044 (1982); Hollenberg et al., Cell 49, 39 (1987)). Typischerweise wurden 5 µg Reporter- und 1 µg Expressionsvektor co-transfiziert zusammen mit 2,5 µg RSV-βgal als Kontrolle für die Transfektionseffizienz. Acetylierte und nicht-acetylierte Formen von [¹&sup4;C]Chloramphenicol wurden durch Dünnschichtchromatographie abgetrennt, ausgeschnitten und mit Flüssig-Szintillationszählung in ein Econofluor (DuPont) mit 5 % DMSO quantifiziert. β-Galaktosidasetests erfolgten wie beschrieben (Herbomel et al., Cell 39, 653 (1984)). Die CAT-Aktivität wird ausgedrückt als Prozent der Umwandlung geteilt durch β-Galaktosidaseaktivität.

Konstruktion von Reporter- und Expressionsplasmiden

Synthetische Oligonukleotide, entsprechend dem -169 bis -200 des Rattenwachstums-Hormongens oder einem palindromischen TRE (TCAGGTCATGACCTGA) (Glass et al., Cell 54, 313 (1988)), wurden in eine Linker-Scanning-Mutante von MTV-CAT enthielt eingeführt, die eine HindIII-Schnittstelle an Position -190/-181 (Buetti et al., J. Mol Biol. 190, 379 (1986)) oder -190/-88 MTV- CAT hatte, welche eine HindIII-Schnittstelle hatte, die die Nukleotide zwischen -88 und -190 ersetzte. Die Expressionsvektoren wurden für die Thyroid-Hormon-Rezeptoren durch Einfügen der gesamten Länge der cDNAs von pheA12 (Weinberger et al., Nature 324, 641 (1986)) und rbeA12 (Thompson et al., Science 237, 1610 (1987)) zwischen den KpnI- und BamHI-Schnittstellen des pRS-Vektors (Giguere et al., Cell 46, 645 (1986) und Nature 330, 124 (1987)) konstruiert.

Konstruktion der chimären Rezeptoren.

Die Konstruktion von hGR1α ist beschrieben (Giguere, Nature supra). Zur Konstruktion von hTRβ1α wurde das cDNA-Insert von pheA12 (Weinberger, Nature, supra) zwischen die KpnI- und BamHI-Schnittstellen von M13mp19 subkloniert und nach dem Verfahren von Kunkel, PNAS 82, 488 (1985) mutagenisiert. Die zur Erzeugung der NotI-Schnittstelle verwendeten Oligonukleotide veränderten drei Aminosäuren: Asp97 in Agr, Lys98 in Pro, Asp99 in Pro. Die zur Erzeugung der XhoI-Schnittstelle verwendeten Oligonukleotide veränderten zwei Aminosäuren: Thr171 in Leu, Asp172 in Gly. Die mutierte Rezeptor- cDNA wurde dann in den Expressionsvektor pRS (Giguere, Cell, Nature supra) überführt; Hybride wurden konstruiert durch Austausch der KpnI-NotI-, KpnI- XhoI- oder NotI-XhoI-Restriktionsfragmente zwischen RShGR1α und RShTRβ1α. RShGR1α hatte ca. 75 % der Wild-Typ-Aktivität und RShTR1α hatte ca. 60 % der Wild-Typ-Aktivität. Für die Addition von τ&sub1; an rTRα wurde die einzelne BstEII-Schnittstelle an der Aminosäure 21 in eine BamHI-Schnittstelle durch Einfügen eines Oligonukleotid-Adaptors, der eine mit BstEII Enden flankierte BamHI-Schnittstelle kodierte, verändert. Dies erlaubte die In-Rahmen-Insertion des BamHI-BglII-Fragments, welches die Aminosäuren 77-262 des hGR kodierte, in diese Stelle. ΔTT und ΔGG wurden konstruiert durch Deletion des Asp718-NotI-Fragments von RShTR1α und RShGR1α und Ersatz mit einem Ohgonukleotid-Adapter einer Consensus-Ribosom-Bindungstelle (Kozak, Nucl. Acids Res. 12, 857 (1984)).
Die Aminosäuren 77 bis 262 des hGRs, bezeichnet als τ&sub1; wurden im Rahmen nach der Aminosäure 21 von rTRα in einer einzelnen oder Mehrfach-Kopien eingefügt, und die erhaltenen Hybridrezpetoren wurden auf Transaktivierung getestet. Tabelle 1 zeigt, daß eine zusätzliche τ&sub1;-Domäne die Aktivität um mindestens 4-fach erhöhte, wogegen das Vorliegen einer Vielzahl solcher Domänen die Aktivität weiter erhöhte. Dies stimmt überein mit der modularen Natur dieser Domäne und zeigt, daß die Aktivität des Thyroid-Hormon-Rezeptors durch den Zusatz der Transaktivierungsdomäne aus einem unterschiedlichen Rezeptor verstärkt werden kann. TABELLE 2 Aktivität von Thyroid-Hormon-Rezeptor/τ&sub1;-Hybriden
aCAT-Aktivität ist relativ zur induzierten Aktivität des RSrTR-Bm+, welcher der Ratten-alpha-Thyroid-Hormon-Rezeptor mit der BstEII-Schnittstelle an der Aminosäure 21, verändert in eine BamHI-Schnittstelle, ist.
In bestimmten Experimenten, worin die Menge des Rezeptor-Expressionsvektors von 1 µg auf 5 µg erhöht wurde, wurde gezeigt, daß die relative CAT-Aktivität 7-fach ansteigt.
Die vorhergehende Beschreibung gibt in Einzelheiten spezifische Verfahren wieder, die zur Ausübung der Erfindung eingesetzt werden können. Mit dem detaillierten spezifischen Verfahren, die ursprünglich zur Identifizierung, Isolierung, Charakterisierung, Herstellung und Verwendung der Rezeptoren verwendet wurden, und eine weitere Offenbarung hinsichtlich spezifischer Einheiten und Sequenzen davon ist der Fachmann im Besitz von ausreichendem Wissen zur Entwicklung alternativer verläßlicher Verfahren zu Erlangung der gleichen Information und zur Ausdehnung dieser Kenntnisse auf andere Intraspezies- und Interspezies-verwandten Rezeptoren. Daher, obwohl das Vorstehende nicht im Text auf scheint, sollte es nicht als ihren Umfang beschränkend ausgelegt werden; vielmehr ergibt sich der Umfang der Erfindung nur allein durch eine gesetzmäßige Auslegung der anhängenden Ansprüche.

Claims

1. Test zum Screenen und Identifizieren von Materialien mit einem vermutlichen Potential zur Bindung an ein Mitglied der Steroid-, Thyroid- und der Retinoid-Superfamilie von Hormonrezeptoren umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen eines Mitglieds der Seroid-Hormon-Superfamilie von Rezeptoren in einer Form mit einer verbesserten Transkativierungs- Transkriptionsaktivität, worin der Rezeptor mindestens eine Transaktivierungs-Transkriptionsdomäne zusätzlich zum Ausgangsmolekül enthält, ausgewählt aus τ&sub1;, τ&sub2; und funktionalen Fragmenten davon, und die außerhalb der DNA-Bindung und Ligand-Bindungsdomäne(n) des (der) Rezeptorprotein(e) lokalisiert ist,

(b) Exponieren der Form der Rezeptorspezies mit einer oder mehreren Reihen an Testmaterialien mit vermutetem Potential zur Bindung an ein Hormon oder Hormon-ähnlichen Rezeptor,

(c) Überwachen der Wirkung des Testmaterials durch Messen der durch die Rezeptorspezies induzierten Transkriptionsmenge und

(d) Auswählen von Kandidaten aus den Testreihenmaterialien, die eine Wirkung auf die Transaktivierungs-Transkriptionsaktivität der Rezeptorspezies haben können.

2. Test nach Anspruch 1, der ferner den zusätzlichen Schritt (d) umfaßt:

(e) Einsetzen des Kandidaten zur Herstellung einer Zusammensetzung, enthaltend den Kandidaten als wesentlichen Bestandteil, wobei die Zusammensetzung geeignet zur Verleihung von Biofunktionseigenschaften für einen entsprechenden Rezeptor ist, wenn sie mit dem Rezeptor in Kontakt gebracht wird.

3. Test nach Anspruch 2, der ferner den zusätzlichen Schritt (e) enthält:

(f) in Kontakt bringen der Zusammensetzung mit biologischem Material, erhältlich aus einem Menschen.

4. Mitglied der Steroid-, Thyroid- und Retinoid-Hormon-Superfamilie von Rezeptoren als ein Polypeptid mit erhöhter Transaktivierungs-Transkriptionsaktivität eines Promotors, mit dem dies verbunden ist, aufgrund seiner intrinsischen Aktivität an ein DNA-Sequenz-Response-Elements des Promotors oder durch seine Fähigkeit zur Assoziierung mit anderen Polypeptiden, die an das DNA-Sequenz-Response-Element binden, worin der Rezeptor mindestens eine Transaktivierungs-Transkriptionsdomäne zusätzlich zu dem Ausgangsmolekül enthält, ausgewählt aus τ&sub1;, τ&sub2; und funktionellen Fragmenten davon, lokalisiert innerhalb des Moleküls an einem Ort außerhalb seiner DNA-Bindungs- und Ligand-Bindungs-Domänen.

5. Rezeptor nach Anspruch 4, worin der Rezeptor auf einem humanen Glucocorticoid-Rezeptor beruht.

6. Rezeptor nach Anspruch 4, worin die Transaktivierungs-Transkriptionsdomäne die τ&sub1;-Domäne ist.

7. Rezeptor nach Anspruch 6, worin der Rezeptor zwei der τ&sub1;-Domänen enthält.

8. Rezeptor nach Anspruch 7, worin die zweite der τ&sub1;-Domänen zur ersten benachbart angeordnet ist.

9. Rezeptor nach Anspruch 7, worin die zweite der τ&sub1;-Domänen distal zum C-Terminus entfernt von der ersten τ&sub1;-Sequenz angeordnet ist.

10. Rezeptor nach Ansprüche 4 bis 9, dem eine Ligand-Bindungsdomäne fehlt.

11. Rezeptorspezies nach Anspruch 4, die der humane G442-Glucocorticoid-Rezeptor ist, worin durch Punkt-Mutation ein Glycin das native Lysin an Position 442 ersetzt hat.

12. Mitglied der Steroid-, Thyroid- und Retinoid-Hormon-Superfamilie von Rezeptoren mit Transaktivierungs-Transkriptionsdomänen zusätzlich zu dem Ausgangsrezeptor, ausgewählt aus τ&sub1;, τ&sub2; und funktionalen Fragmenten davon, die autonom sowohl mit der DNA-Bindungs- und den Ligand-Bindungs-Domänen des Ausgangsrezeptors sind, wobei die zusätzlichen Transaktivierungs- Transkriptionsdomänen an einer Stelle außerhalb jeweils der DNA-Bindungs- und Ligand-Bindungs-Domänen, falls vorhanden, lokalisiert sind, und mit einer DNA-Bindungs-Bifunktionalität.

13. DNA-Molekül, welches ein rekombinantes DNA-Molekül oder ein cDNA-Molekül ist, das einen Rezeptor nach Anspruch 12 kodiert.

14. Expressionsvektor der operativ DNA enthält, welcher einen Rezeptor nach Anspruch 13 kodiert.

15. Rekombinante Wirtszelle transfiziert mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 14.

16. Zellkultur, umfassend Zellen nach Anspruch 15 und ein extrinsisches Trägermedium, das die Lebensfähigkeit der Zellen sicherstellt.

17. Verfahren zur Herstellung eines humanen Rezeptors nach Anspruch 12, welches die Expression in einem rekombinanten Wirt die den Zell-transfizierende DNA-kodierenden Rezeptor umfaßt.

18. Verfahren, welches die Gewinnung und Reinigung eines Rezeptors nach Anspruch 12 in einer Form mit einer Qualität und Quantität umfaßt, die ausreichend zu seiner Befähigung bei der Verwendung in Tests ist, und die Messung von extrinsisch induzierter Biofunktionalität des Rezeptors ermöglicht.

19. Biotest zur Bestimmung der Funktionalität eines Mitglieds der Steroid-, Thyroid- und Retionoid-Hormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei der Biotest umfaßt:

(a) Transfektion von Rezeptor negative Zellen von einem oder mehreren Expressionsvektoren, die ein operatives Hormon-responsives Promotor/Enhancer-Element enthalten das funktional an einen operativen Reporter oder eine andere erwünschte DNA gebunden ist, und eine operative DNA-Sequenz kodierend den Rezeptor,

(b) Kultivieren der transfizierten Zellen aus Schritt (a) in Gegenwart oder Fehlen des extrinsischen Materials mit der vermuteten Fähigkeit zur Aktivierung des Hormon-responsiven Promotor/Enhancer-Elements,

(c) Überwachung der Zellinduktion des Produkts der Reporter oder erwünschten DNA-Sequenz, und

(d) Messen der Expression in den Zellen der Reporter oder der anderen erwünschten DNA, wobei die Verbesserung des Rezeptors eine mit erhöhter Transaktivierungs-Transkriptionsaktivität ist, im Vergleich zum Ausgangsrezeptor, wobei die Aktivität zusätzlich zum Ausgangsrezeptor aufgrund der Domänen, ausgewählt aus τ&sub1;, τ&sub2; oder funktionalen Fragmenten davon, innerhalb des Moleküls an einer Position außerhalb einer jeden DNA-Bindungs- und Ligand-Bindungs-Domäne des Rezeptors lokalisiert ist.