JPH04505012A

JPH04505012A - ホルモン応答要素組成物およびアッセイ

Info

Publication number: JPH04505012A
Application number: JP2505257A
Authority: JP
Inventors: エバンス，ロナルド・マーク; 梅園　和彦
Original assignee: ザ・ソーク・インスティチュート・フォー・バイオロジカル・スタディーズ
Priority date: 1989-03-17
Filing date: 1990-03-16
Publication date: 1992-09-03
Also published as: US5597693A; EP0463081A4; AU655912B2; EP0463081A1; CA2047752C; ATE166360T1; DE69032324T2; DE69032324D1; AU5342390A; WO1990011273A1; CA2047752A1; EP0463081B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の名称〕ホルモン応答要素組成物およびアッセイ〔技術分野〕本発明は一般的にはホルモン受容体遺伝子および蛋白質に関する。特に、本発明はステロイド／甲状腺ホルモン受容体のスーパーファミリーに対して特異的な標的遺伝子を支配する決定因子の同定および特徴付けに間する。加えて本発明は“ オーファン”ホルモン受容体ミ対するリガンド同定のための新規アッセイに関する。〔背景技１１ステロイド／甲状腺ホルモン受容体は真植生物において細胞機能および運命に影響を及ぼすリガンド依存性転写因子のスーパーファミリーを形成している。これらの受容体はホルモン一応答要素（ＨＲＥ）　（Ｅｖａｎｓ　１９８８　ｉ　ＧｒｅｅｎおよびＣｈａｓｂｏｎ１９８Ｂ）と称される特異的エンハンサ−配列を含む標的遺伝子へ細胞外ホルモン信号を導入することが知られている。また、各々の受容体はそれ自身のＨＲＥを認識することも知られており、異なった応答は異なったホルモンにより引き金をひかれることが確かである。グルココルチコイド受容体（ＧＲ）の配列比較および突然変異分析により転写活性化および抑制、核局在化、［ｌＮＡ結合およびホルモン結合に関与する機能的ドメインが同定されている（Ｇｒｇｕｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６　；　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　ａｔ　ａｌ。＋　１９８７　；　Ｒｕ５ｃ盾獅堰B ｅｔ　ａｌ　、、１９８７；　ＰｉｃａｒｄおよびＹａｍａ＊ｏｔｏ、　１９８７　；　ＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇおよびＥｖａｎｓ　、　１９W８；Ｏｒｏ　、　ｅｔ　ａｌ　、、１９８８ａ　）　ａ転写を活性化するのに必要とされるＤＮＡ結合ドメインは６６−６８のアミノ酸から成っており、そのうちの約２０部位〔９つのシスティン（Ｃ５からｃＪを含む〕は異なった受容体間で不変であった（図１ａ）、この受容体スーパーファミリーの構成物の分子構造は１つのドメインを他のものへ変換して機能性キメラを創造することを可能にしている。この戦略はインビボ（ＧｒｅｅｎおよびＣｈａ＠ｂｏｎ＋　１９８７　ｉ　Ｇｉｇｕｅｕｅ　ｅｔ　ａｌ　、　、　１９Ｂ７　；　Ｐｅｔｋｏｖｉｃｈ　＠ｔ　ａｌ　、　１X８７　；　Ｋｕｍａｒ。ｅｔ　ａｔ　、＋１９８７　；　Ｌｌｗｅｓｏｎｏ　、　ｅｔ　ａｌ　、、１９８８　；　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ　、＋１９８９jおよびインビトロ（ＫｕｍａｒおよびＣｈａｍｂｏｎ、　１９８８）で０１１１４結合ドメインは単にＦＩＩ？Ｉｌｌの特異的認識に関与することを示すために使用されてきた。アフカツメガエル転写囚子ＴＰｒｌｌＡ（Ｍｔｌｌｅｒ、ａｔ　ａｌ　、、１９８５）に提出された構造との類推から、不変のシスティンは特異的ＤＮＡ結合のための２つの１亜鉛フインガー”を形成すると考えられている。ラットＧＲのＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドにおいては、２つのＺｎ（ＩＩ）各々は４つのシスティンにより４面体起重に配位していることが示されている（ＦｒｅｅｄＩｌａｎ、　ａｔ　ａｌ　、、１９８８）　、　Ｚｎ　（ＩＩ）配位にこれらのシスティンが含まれていることはまた、点突然変異実験により明らかにされたごと＜　（ｌ（ｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　ｅｔ　ａｌ　、＋１９８８　；　５ｅｖｅｒｎｅ　、　ｅｔ　ａｌ　、、１９ｇｇ）　９つのシX ティンの内の８つが受容体機能に必要とされている事実からも支持される。インビボで機能する遺伝子制御機能の研究結果と整合させることを試みる機能性モデルが提案されてきた。当業者はＤＮＡ結合ドメインの１つのそのようなモデルは“亜鉛フィンガーモデル”であることを知るであろう、（予想された“フィンガー”構造は図１ｂに示されている；　５ｅｖｅｒａｓ、ｅｔ　ａｌ　、、１９８８を参照されたい、）このモデルにおいて、最初の４つのシスティン（Ｃ＋からＣ４）は１つのＺｎ（■）にキレートしてフィンガー１を形成し、それはＣ８およびＣ８間の１３のアミノ酸のループを含んでいる。第９番目のシスティンをアラニンまたはセリンに変化させても機能は保持されているので（Ｓｅｖｅｒｎｅ、ｅｔ　ａｌ　、＋１９８８）フィンガー２は次の４のシスティン（ＣＳおよびＣＩ）により形成されている。フィンガー２は９つのアミノ酸のループを持っており、フィンガーｌから１５−１７のアミノ酸の“リンカ−”により隔てられている。　ｈに１１フィンガー１またば２それ自身ではＤＮＡ結合およびトランス活性化機能の保持には十分でなく　（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｎｇ、鮎ａｌ　、、１９８８）両方のフィンガーが機能には必要とされる。このフィンガーモデルは受容体スーパーファミリーの全ての構成物に適用可能であり、受容体ＤＮＡ結合ドメインによるＩＲＥ認識の共通様式であることを示している。ＨＲＥは構造的には相関しているが、機能的には実際はっきり異なっている。Ｇ１１（ＧＲ［り　、エストロゲン受容体（ＥＲ）　（ＥＲＥ）および甲状腺受容体（ＴｆｆＲ）　（ＴＨＥ）に対する１ｆＲＥは詳細に特徴付けられている；それは“半部位”のパリンドローム対から構成されている（図１ｃ）　ＣＥｖａｎｓ、　１９８８　；　ＧｒｅｅｎおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９８８）　、最適化された偽−または共通応答要素では、ＧＲＥおよびＥＥＥでは半部位当り２つのヌクレオチドのみが興なっている（Ｋｌｏｃｋ、ｅｔユＩ　、、１９８７）　、一方、ＥＩＩＥおよびＴＲＥにおいては同一の半部位を見ることができるが、ただしそれらの間隔は異なっている（Ｇｌａｓｓ、旺、、１９８Ｂ）、それ故、ＩＩＲＨの多様性を達成するのに少くとも２つの異なった方法が使用される。本発明はキメラＤＮＡ結合ドメインを運ぶ突然変異受容体の機能的特性付けがＧＲ。ＥＲおよびＴＲに特異的な標的遺伝子の分子決定因子の詳細な分析を可能にしたこと体を産生ずることを開示している。これらの発見は標的遺伝子特異性の２つの構造的決定因子に注意を集中させ、受容体ＤＮＡ結合ドメインおよび制御ネットワークを一緒に評価するための簡単な進路を示唆している。これらの発見はまた１つの受容体を別の受容体へ変換することを可能にし、所望のＨＲＥ認識特性を持つ遺伝子操作された受容体の創造を可能にする。それは“ オーファン”ホルモン受容体のためのリガンドを同定するのに有用なアッセイの開発も可能した。そのようなアッセイはオーファン受容体を活性化できるリガンどの探索のためのキメラ遺伝子および蛋白質を構成する必要性をな（すので特に好都合である。に基づいて予想される亜鉛フィンガーを示している。　ｌｆｆ１ｌｃはＧＲ（ＧＩＩＥ）　、ＥＩ？（ＥＩ？Ｅ）およびＴ３Ｒ（ＴＨＥ）の最適化されたホルモン応答要素の構造を示している。図２（ａおよびｂ）は突然変異受容体によるルシフエラーゼリポータープラス例示している模式図である。図４（ａ−ｆ）は模式図およびプロットの写真の組合せを含んでいる０図４は基本Δ？ｔＴＶ−ＣＡＴ（ΔＭ）、丁、一応答性ＡＭＴＶ　−ＴＲＥＰ−ＣＡＴ（ＴＲＥｐ）　、ｘｘ　）　ＯＪＦ’　７応答性ΔＭＴＶ　−ＥＲＥ−ＣＡＴ（ＥＲＲ）リポータ−からの突然変異受容体によるＣＴ＾活性の誘導を示している。定−鳳本明細書および請求の範囲においては、以下のように、ここで使用する為に明白に定義されている技術的慣用句および術語を参照されたい：ここで使用されるとき、種は以下のごとく同定されている：ｈ、ヒト；ｒ、ラット；ｍ、マウスＨｃ、ニワトリ；およびｄ、シテジツウバエ。ここで使用されるとき、１受容体のステロイドホルモンスパーファミリー”とはグルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、プロゲステロン、エストロゲン− 関連、ビタミンｎｏ、甲状腺、ｖ−ｅｒｂ−＾、レチノイン産および［！７５　（ショウジ！ウバエ）受容体から成る関連受容体の組を示す、　Ｅｖａｎｓ（１９８Ｂ）およびそこに引用されている文献を参照されたい、　゛ここで使用されるとき、ＧＲはグルココルチコイド受容体を意味する。ｈＧＲで示されるＤＮＡはヒトグルココルチコイド受容体ＧＲをコードしている。　ｈＧＲは特許出願の目的で供託されＡＴＣＣ番号第６７２００号を与えられたプラスミドｐＲ５ｈＧＲによりコード化されている。ここで使用されるとき、朋はミネラルコルチコイド受容体を意味する。　ｈＭＲで示されるＤＮＡはヒトミネラルコルチコイド受容体順をコードしている。　ｈＭＲは特許出願の目的で供託され、ＡＴＣＣ番号第６７２０１号を与えられているプラスミドルＲ５ｈ腑によりコード化されている。ここで使用されるとき、ＴＲは甲状腺受容体を意味し、Ｔ、Ｒはトリョードチロニン（Ｔ３）受容体を意味する。　ＴＲαおよびＴＲｇは甲状腺受容体のアルファおよびベータ型を示している。プラスミドｐｈｅｒｂ−Ａ８．７はｈＴＲαをコード化しており；それは特許出願の目的で供託され、ＡＴＣＣ番号第４０３７４号を与えられている。プラスミドｐｅＡｌｏ１はｈＴＲβをコード化しており；それは特許出願の目的で供託されており、ＡＴＣＣ番号第６７２４４号を与えられている。二二で使用されるとき、ＥＲＲはエストロゲン−関連受容体を意味する。！Ｉ字語ｈｉ！ｍおよびｈＢｍはヒトエストロゲン−関連受容体ｌ＃よび２を示している。これらの受容体は甲状腺受容体よりもステロイド受容体により相関が強いが、しかし、既知のステロイドホルモンの主たる組のいずれとも結合しない（Ｇ４ａ＊ｒ・。蛙ａｌ　、、１９８Ｂ）　、　ｂＥＲＲｌは特許出願の目的で供託され、ＡＴ印１４ｔ６７３０９号および６７３１０号を与えられたプラスミドｐａ４およびｐＢＩＡによりコード化されている。（ｐＨ４またはｐＢＩＡのどちらも完全なりローンではないｉ　ｈＥＲＲｌは両方のクローンからのセグメントを結合させることにより構成される）　ｈＥＲＲ２は特許出願の目的で供託され、Ａτｃｃｔ号第４０３７３号を与えられているプラスミドｐｈＨ３によりコード化されている。ここで使用されるとき、ＭＡＲはレチノイン酸受容体を意味する。Ｈ字語ｂＲＡＲαはヒトレチノイン酸受容体アルファを示す、　ｈＲＡＲαは特許出願の目的で供託され、＾ＴＣＣＩ号第４０３９２号を与えられているプラスミドｐｈｉｌＡｉｌαによりコード化されている。ここで使用されるとき、ＶＤＲはビタミン０．受容体を意味する。ここで使用されるとき、１オーフアン”受容体はホルモン受容体のステロイド／甲状腺スーパーフッミリの既知の構成物をコードしているＤＮＡ配列と相同であるＤＮＡ配列によりコードされている蛋白質である。術語“オーファン”は推定されている受容体へ結合するりガントがまだ知られていないことを表わしている。ここで使用されるとき、要素ＰはＤＮＡ結合ドメインの標的遺伝子特異性を区別をつけて制御できるステロイド／甲状腺受容体中のアミノ酸の２つの群の１つを意味する。ＧＲサブファミリー（Ｇ１１．？ｌＲ，ＰＲ，ＡＲ）に対する要素Ｐを含むアミノ酸の群番よ“ＧＳＣＫＶ　”であり、ＥＩｌサブファミリー（Ｔ、Ｒａ、丁、α、ＲＡＲａｔ、ＲＡＩＩβ、ｖｏｓＲ。ＮＧＦＩＢ　、　ＴＲｇ、ｖ　−ｏｒｂ　Ａ　、　ｅａｒ２．　ｅａｒ＆　堕■ 匹、ＫａＬｘ−関連、ＥＲＲＩ、ＥＲＥ２）に対する要素を含む群はＥＧＣＩ［Ａ　”　“ＥＧＣＫＧ″、−ＥＧＣＫＳ″および”ｌＨＡＣＩ［Ａ″である０表２も参照されたい。ここで使用されるとき、要素りはＤＮＡ結合ドメインの標的遺伝子特異性を区別をつけて制御できるステロイド／甲状腺受容体中のアミノ酸の２つの群の１つを意味する。ＧＲサブファミリー（ＧＲ，袖、ＰＲ，ＡＲ）に対する要素りを含む群はＡＧＲＮ［ｌ　”および”　ＡＳＲＮＤ″である。ＥＲサブファミリー（ＴｓＲα、Ｔツα、ＲＡＩＩα、ＲＡＲβ、ＶＤＪ、ＮＧＦｆ　−８＋ＴＲｔ＋Ｖ　−ｏｒｂ　Ａ＋ｅａｒ２．ｅａｒ３．仏Ｅ匹、　」框圧り一関連、ＥＲＦｌｌ、ＥＲＥ２）に対する要素Ｐを含む群はＰＡＴＮＱ″″、“ＫＹＤＳＣ”　、“ ＫＹＥＩＪ″、”ＨＲＤＫＮ”。 “ＰＦＮＧＤ　”　、”ＬＡＮＫＤ″、”ＲＧＳＫＤ　”　、“ＴＹ［ｌＧＣ” 　、”Ｒ３ＮＲＤ　”　、“ＲＡＮＲＮ　”　。 ”ＫＷＥＧＫ“、　“ＫＮＮＧＥ”、”ＰＡＳＮＥ”および”ＰＡＴＨＥ″である０表２も参照さたい。ここで使用されるとき、ＣＡＴはクロラムフェニコール　アセチルトランスフェラーゼを意味する。ここで使用されるとき、ルシフェラーゼはホタル　ルシフェラーゼを意味する。ｄｅ　Ｗｅｔ　、　ｅｔ　ａｌ、　、　（１９８７）を参照されたい。ここで使用されるとき、ＣＯＳはＴ抗原（Ｔａｇ）を発見するサル腎臓細胞を意味する。　Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｃｅ旦　２３　：　１７５（１９８１）を参照されたい、ここで使用されるとき、ｃｖ−１は“ＣＶ−１”と称される細胞株からのサル腎臓細胞を意味する。ＣＶ−１はＣＯ５の親株である。　ＣＯＳ細胞と異なり、それはＳＶ　４０　Ｔ抗原（Ｔａｇ）を発言するように形質転換されており、ＣＶ−１細胞はＴ抗原を発現しない、ＣＶ−１細胞は受容体欠損細胞であり、本発明のアッセイにおいても有用である。ここで使用されるとき、ＨＲＥはホルモン応答要素を意味する。　ＨＩ？Ｅは短いシス作用性配列（約２０ｂρの大きさ）であり、転写のホルモン（またはリガンド）による活性化に必要とされている。ホルモン非応答性遺伝子へのこれらの要素の結合によりその遺伝子はホルモン応答性となる。　ｌＩＩ？Ｅは位置および配位に依存しない様式で機能する。他のエンハンサ−と異なり、Ｈ［ｌＨの活性はリガンドの存在または不在に依存する。　Ｅｖａｎｓ（１９８８）およびそこに引用されている文献を参照されたい、゛ここで使用されるとき、遺伝子工学による）ＩＭＥとはヌクレオチド置換欠損その他のごとき遺伝子工学技術を用いて組換え産生された１ｔ）ＩＥを意味する。もし、野生型、遺伝子工学によるまたは合成ＨＲＥがホルモン非応答性プロモーターに結合されるとこれらのプロモーター類はホルモン応答性となる。　Ｆ−ｖａｎｓ　（１９８Ｂ）およびそこに引用されている文献を参照されたい。ここで使用されるとき、合成ＨＲＥは自動ヌクレオチド合成機を用いてインビトロで合成されたＢ［１ｇを意味する。　ＯＲＥはただの２０ｂｐの大きさであるのでこの方法で容易に合成される。もし、野生型、遺伝子工学による、または合成ＨＲＥがホルモン非応答性プロモーターに結合されると、これらのプロモーター類はホルモン応答性となる。　Ｅｖａｎｓ（１９８８）およびそこに引用されている文献を参照されたい。ここで使用されにとき、頭字語ＧＲＥはグルココルチコイド応答要素を意味し、ＴＲＥは甲状腺受容体応答要素を意味する。　Ｇ＄ｌＥはホルモン応答要素であり、ＧＲとの相互作用を通してグルココルチコイド応答性を与える。Ｒａｙｖａｒ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１３５　：　３８１（１９８３）および５ｒｈｉｅｄｅｒｅｉｔ、ｅｔ　ａｌ　、、Ｎａｔｕｒｅ、３０４　：　７４９　（１９８３）を参照■■ たい、　ＧＲＥはＤＮＡ結合ドメインがＧＲＩ！と機能的に結合できる（即ち、活性化する）野生型またはキメラ受容体とともに使用できる０例えは、ＧＲ，ＭＲおよびＰＲ受容体はすべてＧＲＢを活性化できるので、ＧＲ，ＭＲまたはＰＲ型のＤＮ＾結合ドメインを持つ任意の野生型またはキメラ受容体とともにＧＲＥが使用できる。　ＴＲＥはＴＲとの相互作用を通して、甲状腺ホルモン応答性を与える点を除いてＧＲＥと類似している。ＴＨＥはＤＮＡ結合ドメインがＴＲＥと機能的に結合できる（即ち、活性化する）野生型またはキメラ受容体とともに使用できる。ＴＲおよびＲＲ受容体の両方がＴＲＥを活性化できるので、ＴＲＥはＴＲまたはＲＲ型ＤＮ＾結合ドメインを持つ任意の受容体とともに使用できる。ここで使用されるとき、リガンドはホルモンまたは成長勧賞のごとき誘導剤を意味する。細胞内部においてリガンドは受容体蛋白に結合し、それによりリガンド／受容体複合体を形成し、順に適当なホルモン応答要素に結合できる。１つのリガンドは多数の受容体を持っている０例えばＴ、ｌｌαおよびＴ、βの両方ともＴ、のごとき甲状腺ホルモンと結合する。ここでイ吏用されるとき、句゛″リガンド応答性プロモーターおよび作用可能なポーター遺伝子に機能的に結合した作用可能なホルモン応答要素”中の語“作用可能な”とは各々のＤＮＡ配列（術語“ホルモン応答要素”、“リガンド応答性プロモーター”および“リポータ−遺伝子”により表わされる〕が機能的に作用することであり、即ち、ホルモン応答要素は受容体蛋白（野生型またはキメラの両方）のＤＮＡ結合ドメインと結合でき、リガンド応答性プロモーターがリポータ−遺伝子の転写を制御でき（ＨＲＥ／受容体蛋白／リガンド複合体による適当な活性化による）、およびリポータ−遺伝子が宿主細胞中で発現されていることができる０句“機能的に結合した“とは、ＤＮＡセグメントが結合された時、適当な活性化により、リポータ−遺伝子（例えばＣＡＴまたはルシフェラーゼ）が発現されるであろうことを意味している。この発現は“リガンド応答性プロモーター”　（ホルモン応答要素の下流にあり、Ｉ’ｌＲＥが適当なリガンド／受容体蛋白複合体へ結合した時に“活性化され”、それは順にリポータ−遺伝子の転写を“制御する”）が“スイッチを入れられた”かまたはさもな（ぼりガント／受容体蛋白複合体のホルモン応答要素への結合の結果として活性化されたという事実の結果として起こる。ここで使用されるとき、句、受容体の”　ＤＮＡ結合ドメイン”はクロマチンＤＮＡ上のＨＲＥ部位へ結合する受容体蛋白（グルココルチコイド受容体、甲状腺受容体、ミネラルコルチコイド受容体、エストロゲン関連受容体およびレチノイン酸受容体のごとき）の一部を意味する。これらのＤＮＡ結合ドメインの境界はステロイドホルモンスーパーファミリーに対しては同定および特性付けがなされている。Ｅｖａｎｓ　（１９８８ンを参照されたい、またＧｉｇｕｅｒｅ、ｅｔ　ａｌ　（１９８６）　；　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　ｅｔ　ａｌ、{ （１９８７ンｉ　ＧｒｅｅｎおよびＣｈａｓｂｏｎ（１９８７）　；　Ｍｉｅｓｆｉｅ’ｌｄ、ｅｔ　ａｌ　、、（１９８７）およびＥｖａ獅■ （１９８Ｂ）も参照されたい。ステロイドホルモンスーパーファミリーの受容体のＤＮＡ結合ドメインは６６から６８のアミノ酸の長さで変化しているアミンセグメントから成りでいる。このセグメントは９つのシスティン残基を含んでおり、その１つはセグメントの最初のアミノ酸である。この最初のＣｙｓ残基はＣｙｓ　−Ｘｔ−Ｃｙｓ　−Ｌｘ− ＋ｓ　Ｃｙｓ　−Ｘｚ−Ｃｙｓ（式中には任意のアミノ酸である）で記述されるモチーフで始ま、ている、　ＤＮＡ結合ドメインは必ずアミノ酸Ｃ１ｙ−Ｍｅｅで終わっている。ここで使用されるとき、句、受容体の“リガンド結合ドメイン領域“は成長物質またはホルモンのごときリガンドへ結合する受容体蛋白の一部を意味する。ステロイド受容体スーパーファミリーのリガンド結合ドメインの境界は同定さ名へ特性付けされている。　Ｅｖａｎｓ（１９８８）を参照されたい。ここで使用されるとき、“突然変異させる“とは遺伝子工学技術を用いてＤＮＡを変化させることを意味し、そのためそれは“野生型７または非改変配列とは興なっている。　ＤＮＡを改変するために育用な遺伝子工学技術としては、野生型配列中への新規ヌクレオチドの挿入、野生型配列からのヌクレオチドの欠失および野生型配列中のヌクレオチドの置換（例えば部位指向性突然変異誘発による）などが挙げられるがそれらに制限されるわけではない。ここで使用されるとき、本発明の“突然変異体”ＤＮＡとは０野生型”または非改変配列と異なっているように遺伝子工学の操作を受けているＤＮＡを意味する。そのような遺伝子工学には野生型配列中への新規ヌクレオチドの挿入、野生型配列からのヌクレオチドの欠失または野生型配列中のヌクレオチドの置換（例えば部位指向性突然変異誘発による）などが挙げられる。本明細書および請求の範囲においての術語“本質的な配列相同性”の使用は、ここに記載され特許請求されている実際の配列と比べて、わずかなおよび重大でない配列変異を持つＤＮＡ、ＲＮＡまたはアミノ配列が付随する請求の範囲内であることを意図することを意味している。この事については、′わずかなおよび重大でない”配列変異は、相同配列が本発明の配列と機能的に均等であろうことを意味しており、即ち、相同配列は本質的に同一の様式で機能し、ここに記載および特許請求されている核酸およびアミノ酸組成物と本質的に同一の組成物を産生ずる。ここで使用されるとき、術語“組換えにより産生された”とは、単に天然から精製されたのではなく遺伝子工学技術を用いて作られたことを意味している。ここに出てくる種々のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸は以下の３文字または１文字略号に従って同定されるであろう：Ｌ−アスパラギンａｉ　Ａｓｐ　Ｄし一グルタミンＩＩＩ　Ｇｉｕ　ＥＬ−グリシン　ｃｔｙ　’　ＧＬ−ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｒニジ１　上窮邊還　Ｌだ１号し一メチオニン　Ｍｅｔ　ＭＬ−フェニルアラニン　Ｐｈｅ　ＦＬ−１−リブトファン　Ｔｒｐ　Ｈここで出てくる種々のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドは本分野で日常的に使用されている通常の１文字呼称（Ａ、Ｇ、Ｔ、ＣまたはＵ）を持っている。ここで使用されるとき、ｂｐは塩基対を意味し、にｂはキロ塩基対を意味している。本明細書および請求の範囲において、ギリシャ文字アルファ（α）、ベータ（β ）、ガンマ（ｒ）等は時々ａ、ｂ、ｇ等と呼ばれる。本明細書および請求の範囲において、特に指示しないかぎり、温度は摂氏度で表わされる。供−一部プラスミドｐＲ５ｈＧＲ（ｈＧＲ）　、ｐＲＳｈＭＲ（ｈＭＲ）　、四Ａｌ０Ｉ（Ｈｔｓβ）およびＧＭＣＩＩＴ　（これらのすべては大腸１１１１１８１０１中にある）、プラスミドｐＨ４およびｐＨＫＡを加えたもの（−緒になってｂＥＲＰｌをコード化しており）　、ｐｈＨ，（ｈ［！ＲＲ２）　、ｐｈ畦−４８，７（ｈＴＲα）。 ρｈＦＡ８　（ｈＴＲαの部分クローン）およびプラスミドｐｈ　ＲＡＲαは特許手続の目的の為にＩａ止物の供託の国際認可についてのブタベスト条約事項およびこの条約のもと発布された規定によりアメリカン　タイプ　カルチャーコレクシテン、ロックビル、メリーランド、Ｕ、Ｓ、Ａ、　（ＡＴＣＣ）に供託されている。プラスミドの試料は前記条約および規定のもと、およびさもなくばこの出願またはこの出願の出願請求優先権がｆｌｉ（＃されるまたはそのような出願に特許が付与される米国およびすべての他の国または国際機構の特許法および規定に従ってそれらを受けると合法的権利を与えられた工業所存権事務所および他の個人で入手可能である、およびあろう。供託物のＡＴＣＣ供託番号および供託日付は以下の通りである：ｐＲ５ｈＧＲ（ｈＧＩｌ）　６７２００　１９１１１６年９月９日ｐＲ５ｈＭＲ（ｈ順）　６７２０１　１９８６年９月９日ρＢ４　（ｈＥＲＲｌ”）　６７３０９　１９８７年１月３０日ｐｈＨＫＡ　（ｈｆｔＲ［？１傘）　６７３１０　１９８７年１月３０日ｐｈＥ３（ｂＥＲ＋＋２）　４０３７３　１９８７年９月２９ＥＧＭＣＡ丁（リポータ−）６７２８２　１９８６年１２月１８日ｐｈｅｒｂ−Ａ８．７（ｈＴＲα）　４０３７４　１９８７年９月２９日ｐｅＡ１０１　（ｈＴＲβ）　６７２４４　１９８１１０月２２日ｐｈ　ＲＡＲα（ｈＲＡＲα）　４０３９２　１９８７年１１月２０日（”は部分クローンを意味する）（ｐＥ４およびｐｈＨＫＡは一緒になって完全ｈＥＲＲ１をコード化している）〔発明の開示〕１つの態様において、本発明は標的遺伝子特異性を決定するステロイド／甲状腺ホルモン受容体ＤＮＡ結合ドメイン組成物を特色とする９本発明の組成物はＧＳ（ＪＶ。［！ＧＣＫＡ　、　［！ＧＣＫＧ　、　ＥＧＣＫＳ　、！！ＡＣＫＡ、　ＡＧＲＮＩＩ、　ＡＳＲＮＤ、　ＰＡＴＮＱ、　ＫＹＤＳＣ，ＫＹm！ＧＫ、　ＨＲＤにＮ。ＰＦＮＧＤ　、　ＬＡＮＫＤ　、　ＲＧＳＫＤ、　ＴＹＤＧＣ，Ｒ５ＮＲＤ、　ＩＩＡＮＲＮ、にＮＥＧに、　ＫＮＮＧ［！、　ＰＩＩＳＮdおよびＰＡＴＮＥから成る群より選択される。他の態様において、本発明はＥＧｘｘＧｘｘＲ（式中ＸはＡ、　Ｒ，Ｎ、　Ｄ、　Ｃ，Ｑ、　ＩＩ！、　！１．１ル。Ｋ、　Ｍ、　Ｆ、　Ｐ、　Ｓ、　Ｔ、　Ｗ、　ＹおよびＶから成る群より選択される）を特色とするアミノ酸の群である。さらに別の態様においては、本発明はＫＶＥＧＫを特色とするアミノ酸の群である。さらに別の１１様においては、本発明はＧＴＧ８．　ＧＴＧ３Ａ、　ＧＴＧ２．　ＧＴＧＩから成る群より選択される突然変異体受容体を特色とする。さらに別の態様において、本発明はＧＲＥおよびＥＲＩｌ：の両方の配列を活性化できる受容体の構築の方法を特色としている０本方法はＣ１および０４間の部位にコード化されていたグリシンがグルタミン酸にｆ換されるようにグルココルチコイド受容１）Ｎ＾配配列へ点突然変異を導入することを特色とする６反対に点突然変異がエストロゲン受容体ＤＮＡ配列中に導入されると、Ｃ８およびＣ４間の部位でコード化されていたグルタミン酸がグリシンに置換される。さらに別の態様において、本発明はグルココルチコイドおよびエストロゲンの両方の応答要素を活性化できる木賃的に純粋な受容体蛋白を特色としている。さらに別のａｍにおいて、本発明は１つの受容体の標的遺伝子特異性を他の標的遺伝子特異性へ変換する方法を特色とする０本発明のこの態様に従うと、グルココルチコイド受容体の標的遺伝子特異性を第１の亜鉛フィンガー中に群になっている３つのアミノ酸を変更することによりエストロゲン受容体のそれに変換される。この領域における１つのｃｌｙのＧｌｕへの変化は２つの配列に応答性の受容体を生み出す、さらに第２の亜鉛フィンガーの幹中０５つのアミノ酸の置換は特異性を甲状腺ホルモンの特異性へ変換させる。さらに本発明はオーファンホルモン受容体に対する機能性リガンドの同定のための新規アッセイを特色する。これらのアッセイはオーファン受容体を活性化できるリガンドの探索のためキメラ遺伝子および蓋白質を構築する必要がないので特に有用である。加えて、本発明のアッセイは問題としているＤＮ＾配列を配列決定してそれらがＧＲまたはＥＲ／ＴＲサブファミリーに属しているかを見る（このことはやればできるが）必要がない、さらに、本発明の好適なアッセイ中で行われるごとく、宿主中の２つのリポータ−遺伝子の存在は（１つは作用可能な状１１ＧＲＥへ、他のものはＥＲＥへ結合されている）、１つのアッセイ系でのステロイド／甲状腺受容体スーパーファミリーのすべての未知のメンバーの検定を可能にしている。さらに、リガンドのカクテルが１度に試験できる。もしどれかのりガントがリポータ−のどれかを活性化したら、これらのりガントは例えばより小さな“カクテル”群で続いて別々に再試験することができる。このことはオーファン受容体のためのリガンドの探索の効率を非常に高める。本発明の１つのアッセイｍ欅に従うと、受容体蛋白質をコード化していると疑われるＤＮＡ配列が単離される。これらのＤＮＡ配列は、少くとも１つの作用可能なホルモン応答性要素（ホルモン応答性要素は野生型、遺伝子工学による、または合成グルココルチコイド応答要素および野生型、遺伝子工学による、または合成エストロゲン応答要素から成る群より選択される）に機能的に結合された少くとも１つのリポータ−遺伝子を含むように遺伝子工学で処理された適当な受容体欠損宿主細胞中へトランスフェクトされる。トランスフェクトされた受容体〜欠損宿主細胞（ここでは疑われるまたは“オーファン”受容体および少くとも１つの受容体／ＩＩＲＥ複合体を含んでいる）は問題とするＤＮＡ配列によりコード化されている推定受容体蛋白のりガント結合ドメイン蹟域と結合できるかもしれない少くとも１つの候補リガンドと試験する。リポータ−遺伝子の誘導はリポータ−遺伝子によりコード化されている蛋白質の蛋白濃度の変化によりモニターされる。最終的にリポータ−遺伝子の蛋白産物の産生を誘導できるリガンドが選択される。本発明の好適なアッセイにおいて、トランスフェクトされる宿主細胞はＣＶ−１細胞であり、それは異なった機能性ＯＲＥ要素に各々作用可能なように結合された少くとも２つのリポータ−遺伝子を含むであろう、特に好適な形態においては、第１のリポータ−遺伝子は野生型、遺伝子工学による、または合成グルココルチコイド応答要素に作用可能に結合されるであろうし、第２のリポータ−は野生型、遺伝子工学によるまたは合成エストロゲン応答要素に作用可能なように結合されるであろう、この形態において、第１のリポータ−遺伝子は好適にはクロラムフェニコール　アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）であろうし、第２のものは好適にはホタル　ルシフェラーゼであろう。本発明の別のアッセイｍｔ欅において、オーファン受容体を活性化するりガントの同定のために提供される０本発明のこの態様に従うと、前もって選択されたホルモン応答要素に機能的に結合された少くとも１つのリポータ−遺伝子を持つ受容体欠損宿主細胞が提供される。さらに、少くともオーファン受容体のＤＮＡ結合ドメインの１Ｍ域をコード化しているＤＮＡが突然変異を受け（好適には部位指向性突然変異誘発により）そのため突然変異を受けたオーファン受容体は受容体欠損宿主細胞において前もって選択されたホルモン応答要素を活性化することができる。少くとも１つの受容体遺伝子に機能的に結合された前もって選択されたホルモン応答要素を含む宿主細胞を突然変異を受けたオーファン受容体と接触させ、次に突然変異を受けたオーファン受容体のリガンド結合トメチン領域と結合できるかもしれない候補リガンドで試験する。最後に、オーファン受容体を活性化できるリガンどの指標としてリポータ−遺伝子の誘導をモニターする。本発明の組成物、方法およびアッセイ、加えてそれらを製作および使用するための好適な方法が以下の実施例により詳しく説明されている。叉−一施一一信実施例−１フィンガーモジュールホルモン受容体に関するこれまでの研究は全ＤＮＡ結合ドメインを通してのアミノ酸がＤＮＡ結合に重要であろうことを示している（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　ｅｔ　ａｌ　、、１９Ｂ？）　。この実施例はどのアミノ酸が配列認識に寄与し、それ故標的遺伝子特異性の決定に関与するかを説明している。実験的に、グルココルチコイド受容体が甲状腺ホルモンおよびエストロゲン応答要素を認識させるにはＤＮＡ結合ドメインの何なる変化が必要とされるか（最小限で）を知ることが重要である。ヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）およびヒト甲状腺受容体ベータ（ｈＴＲβ）の間ではこの領域中の半分未満のアミノ酸しか共通でない１図１ａ）、もし全ｈＧＲＤＮＡ結合ドメインがｈＴＲβからのものに置換されるとすると、特異性は完全に切替わり、ハイブリッドＧＴＧはＴＨＥを通してのみ活性化され、もはやＧＲＥを認識しない（丁ｈｏｓｐｓｏｎ、　５ｔａ１．．１９８９）。本実験においては突然変異体ＧＲ発現プラスミドが少くとも１つのリポータ−プラスミド（例えばホタルルシフェラーゼリポータ−プラスミドの１つ）と−緒にサル腎＠ＣＶ−１１１１胞内へ導入され、この標的遺伝子持異性およびトランス活性化機能が試験された。グルココルチコイド応答の為、ルシフェラーゼをコードしている配列を応答性ＭＴＶ　−ＬＴＲ（ＭＴＶ−ＬＬＩＣプラスミド）に結合させた＊　（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ。ｅｔ　ａｌ　、、２９８１？）　、ち一応答性の為、Ｇｌ？εをＭＴＶがら切り取り、パリンドロームＴＲεをコード化しているオリゴヌクセオチドと置換してリポータ−ΔＭＴＶ　−ＴＲＥｐ−ＬＵＣを生しさせた（Ｕｓ＋ｅｓｏｎｏ、　ｅｔ　ａｌ　、、１９８８　；　Ｇｉｇｕｅｒｅ＋　ａｔ　ａｌ、、１９８９）　、合成グルココルチコイド　デキサメサゾンの転化により、収受容体ｈＧＲｎｘおよびＧＴＧはＭＴＶ　−ＬＵＣおよびΔＭＴＶ　−ＴＲＥｐ−ＬＵＣからのパックグラウンド量の各々約２．５００および２００倍の誘導を引き出した（図２）、これらの誘導は祖先を同じくする応答要素により明瞭に開始される。実施例−」。一：ＴＲ１！蕾祖先を同じくするＨＲＥの識別を受容体に可能にさせるアミノ酸を同定するために、種々のキメラＤＮＡ結合ドメインが構成された０図２に示した突然変異体においては、ループおよびリンカ−の一部がｈＧＲおよびｈＴＲβまたはヒトレチノイン酸受容体アルファ（ｈＲＡＲα）間で交換された。これらはループ１　（ＧＲＧ７およびＧＴＧ　３２）　、リンカ−のほとんどすべての部分（にＴに３８　、ＧＲＧＳ％ＧＴに３６ＢおよびＧＴＧ２９）、およびループ２および隣接する下流部分（ＧＴＧ６、ＧＴＧ３３およびＧＴＧ２８）を切替えた。これらの切替え突然変異体のすべてはルシフェラーゼ活性の誘導では活性を示した（親の応答の８８％から７％）。荷電分布の劇的な変化にもかかわらず標的遺伝子特異性に変化がなかったというループの交換可能な性賀は注目すべきものである。さらに、リンカ−領域中の小さなおよび大きな置換は全く許されることでありプロモーター特異性に何の衝撃も与えなかった。　１５　（ＧＲｎｘおよびＧＴＧ２９）、１７（ＧＴＧ）　、１９（ＧＲｓｓｔ）および２１（ＧＲｓｓｔＧ）からのフィンガー間の間隔の減少または拡張に対しても再び大きな許容性を示した。これらの突然変異体の表現型から、これらの領域に観察される一次構造または大きさの相異は、受容体スーパーファミリーの最も距離的に近いものから２つのメンバーの間で突然変異的には許容されていることは明らかである。さらに、ここに記載したループまたはリンカ−変異体は特異性が変化しなかったので、これらのアミノ酸はＧＲＥおよびＴＲｆｌまたはＧＲＥからの丁ＲＥ、間の！＋１には明らかに決定的ではなく、むしろＩＩＲＥ認識およびトランス活性化の共通の様式に関与しているであろうことが結論される。フィンガーＮ域のラージセグメントのモジエールまたは交換可能性は特異性を決定する配列が存在するはずであるという基本的事実が偽りであることを示すわけではない、この一連の突然変異体からの除去によっても２つの群の９つのアミノ酸は変化を受けていす、それ故に特異性を分は与えているのであろう、第４の先端（Ｐ）　Ｎ域はＣ３に続きＧＲでは３つのアミノ酸群ＧＲ−−ＶおよびＴＲではＥＧ−−Ｇを含んでいる。これらは高度に保持された１０のアミノ酸セグメントの一部であり、６つの不変のアミノ酸を含んでいる。これらの３つのアミノ酸が切替えられた場合（図２ａのＧ７Ｇ３Ａおよび図２ｂのＧＴＧ３６Ａ）生じるキメラは酊Ｖ−ＬＩＪＣまたはΔＭ丁Ｖ　−ＰＲＥｐ−ＬＩＩＣの両方に対して機能しない、特異性に潜在的に重要な第２のまたは末＃ＣＤ＞ｔｊＩ域はＣｓおよびＣ６間の５つのアミノ酸の群であるＣ　ｈＧＲ中のＡＧＲＮＤおよびｈＴＩ＋θ中のに’ｆＥＧＫ　。実際、ＧＴＧ２１からの３つのアミノ酸の除去でＧＴＧ１５が生成さｉｔ、　ＴＲＥ不活性表！ｊ！型を得る０図３）、これらの観察に基づき、決定的な二重のスイッチおよび８つのｈｒＲβ−特異性アミノ酸のみを持つホトンド完全なｈＧＲｆｌＮＡ結合ドメインを運ぶ突然変異体ＧＴＧ８（図３）が構築された。注目すべきは、このキメラは標的遺伝子特異性の完全な変換を誘導する（図３および４１１＞、　ＧＴＧ８による丁ＲＥｐリポーター上のルシフェラーゼ活性の誘導はＧＴＧそれ自身と同じくらい有効である。それ故２つの隣接しない“要素″　（ＰおよびＤ）はｈＴＩＩＩ９ＤＮＡ結合ドメイン内に周在し、それはさもなくば正常のグルココルチコイド受容体に対しＴＨＥ特異性認識を分は与えるのに十分である０両方の要素が必要とされ、一方単独では十分でない、さらに、この変化におけるＴＲＥ特異性の獲得はＧＲＦ！応答性の完全なそう失を含んでいる。憲施桝−ユ７−−：ＥＲＥ誓゛すべてのＩ（ＲＥは認識可能な保存モチーフを含んでいるが、ＴＲＥｐおよびパリンドローム　ビテロゲニンＥＲＥ　（ＥＲＥｐ）は同一の半部位（５’　−ＴＧＡＣＣ−３’　、Ｆｊ！Ｊｌｃ）の間隔のみが異なっている。さらに、最近の研究は外来性ＴｓＲＣＧＩａｓｓ、ｅｔ　ａｌ　、。１９８８）ならびにインビトロで翻訳されたクローンαおよびβＴＲｃＤＮＡ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ。ａｔ　ａｌ　、、１９８９）はＥＲＥｐならびに丁ＲＥ９の両方に対し高い親和性で結合できることを示している。この関係にもかかわらず、ＴｓＲがＥＲＥ依存性トランス活性化を開始させる可能性については注意深く評価されていない、この出願に向けて、ＥＲＥをコード化しているオリゴヌクレオチドが基本ΔＭＴＶプロモーター（ｆｆｏｌｌｅｎｂｅｖｇ、ｅｔａｌ、、（１９８８））　ニ挿入され、リボ−ターフラスミドΔＨＴＶ　−ＥＩＩＥ−［、（ＩＧおよびＡ？１ＴＶ−ＥＲＲ−ＣＡＴが作作製れた。このプロモーターは本当にエストラジオール（Ｅ８）注入可能であり、なぜならＣｖ−１細胞においては効率的なＣＡＴ活性の刺激は機能性ＥＲおよびリガンドＥ２の両方に依存している（図４ｄ）、）ランスフエクトされた１（ＩＥＲはＧＲＥを通して活性化されないが（ＬｌｓｅｓｏｎｏおよびＥＶａｎ！！＋未発表データ）　、ＴＲＥｐ’！容体の弱い活性化剤を保持している。しかしながら、逆実験においてＧＴＧキメラはＥＲＥリポータ−の活性を促進する（図３８および４ｄ）６反対にｈＧＲはＥＲＥｐまたはＴＲＩ！４容体からのＣＡＴまたはルシフェラーゼ活性を誘導しない（図３ａおよび４ｂ）、それ故、ｈＴｓＲβのＤＮＡ結合ドメインは本アッセイ系における応答要素としてＴＲＥ、およびＥＲＥの両方を認識することができる。このｈＥＲおよびｈＴＲ突然変異受容体間の近い関係のため、２つの特異的領域の機能的役割を評価するために合わせたＥＲＲおよびＴＲＥ応答性が試験された。　ＧＴＧの活性を１００％とすると、図２および３のすべての丁ＲＥ十突然変異体（ＧＴｘｂａＧ　。ＧＴｓｓｔＧ、　ＧＴＧ３２　、　ＧＴＧ３６Ｂ、　ＧＴＧ２９．　ＧＴＧ２Ｂ、　ＧＴＧ２１およびＧＴＧ８）　［！ＨＥリポーターに対し７０％から６５０％の活性を示した（図３）。さらに、ｈＴＲβ要素Ｐを運ぶが要素りを欠く突然変異体（ＧＴＧ１６およびＧＴＧ３Ａ）はまたＥＲＩ！による著しい誘導を示したがＴＲＦ！ｐに対しては不活性であった０図３および４）、これらの結果はｂＴＪβ要素Ｐ（Ｄではない）がＥＲＲおよびＴＦＩＢ、中に観察される共通ＴＧＡＣＣ型半部位による陽性表現型を決定することを示している。−貫して、ＧＲ要素Ｐを含むすべての突然変異体（ＩＩＧＩ？ｌＩＸ、　ＧＴＧ７．　ＧＴＧ３５．　ＧＲＧ８．　ＧＴＧ６．　Ｇ丁Ｇ３６Ａ、　ＧＴＧ５）はＥＲＥＩＪポーターニハ■ 答しない（データは示されていない）。要素Ｐを形成する３つのアミノ酸の置換がｈに１１　ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＲＥ”　、Ｅｌ？Ｅ　−。ＴＲＥ−）　ノ本体をＥＲ（Ｄそれ（ＧＲｉ’−、ＥＲＥ”　、ＴＲＥ−）に変換するのに十分であることをＧＴＧ３Ａ　（図３０および４ｇ）が明白に示した。これは完全な変換であることに注目されたい；即ち、この突然変異体は？ｌＴＶに対して陰性であり、ＥＲＨに対してのみ陽　−性である。突然変異体ＧＴＧ３ＡのＥＲε応答性は改変ＭＴジブロモーターにＩＩＪ御されない０例えばＥｌ？Ｅ−ＴＫ−ＬＩＩＣリポータ−はまたＧＴＧ３Ａにより制限されるが一万ＥＲＲをコード化しているオリゴヌクレオチドを欠＜１！７に−ＬＵＣは誘導されない（未発表の観察データ〕。実施医−１である重要ＰがＧＲ［！−ＥＲ［！応答性を特定することあ示している。この要素はｈＧＲ（ＧＳＣＫＶ）およびｈＴ、Ｒ３間で３つのアミノ酸が異なっている。興味あることに、ｈＴ。ＰＲおよびｈ［ＥＲ（ＢＧＣＫＡ）の両方とも［ＥＲＥにより活性であり、この要素にきた場合はほとんど同一の構造を共有することは（図１８）、これらのアミノ酸配列がＥＲＥの認識に重要であることを示している。これらの結果の１つの傾向は、ＤＮＡ結合ドメインへ新しい特異性を与えることにより、従前の特異性は同時に失われるということである。　ＩＩＲＥ特異性の獲得または抑制に関して個々のアミノ酸が果たす異なった役割を決定するため、二重および三重突然変異体の活性が調べられた。三重突然変異体（ＧＴＧ３Ａ）は選択的にＥＲＥを認識するが、二重突然変異体（ＧＴＧ２）はＭＴＶおよびＥＲＥリポータ−の両方とともで活性である（図３ｃおよび４ｆ）、この誘導はＯＲＨに依存している、なぜならこの受容体はΔＭＴＶまたはＴＲＥｐプロモーターを活性化しないからである（図４）、この突然変異体の表現型の実験は↑ｓＲ β要素の最後のグリシンが、ＴＩＲＥ認識へは両賞的影響を与えずにＧＲＥ　” の抑制に関与すると思わせる。これらの結果に基づくと、１つのアミノ酸置換が受容体表現型の認識可能な変化を与えるのに十分であろうかという疑問が起こった。驚くべきことに、Ｃ１およびＣ４間のグルココルチコイド受容体グリシンまたはエストロゲン受容体グルタミン酸の置換により（Ｇ丁Ｇｌ）二重の特異性を持つ受容体が産生された。この単一アミノ酸変化はＧＲＥ認識を正常に残し、ＥＲＥの明瞭な認識を育てた。　ＧＴＧ２突然変異体のごとく、これらの誘導はＧＲＥかまたはＥＲＦ！に依存している（図３Ｃおよび４ｅ）。しかしながら、これらの突？８変異体のすべてが丁、ＲβＤ要素を欠いているのでそれらはＴＲ釦に対しては完全に不活性である。亙施伍−五二股よ堕旦！！当業者はこれまでの実施例に示された結果が、核受容体がそれらの適当な応答要素を同定する機構に関して多数の予期されなかった結論を与えることを評価するであろう、第１に、２つの亜鉛フィンガーの推定ループは特異性を変えることなく受容体間で交換可能である。第２に、ループの外側の２つの異なったＮ域（ＰおよびＤ）は配列認識に決定的である。第３に、ＩＩＩＩＥ応答生の獲得およびそう失に異なったアミノ酸が関与するであろう、このため、単一のアミノ酸変化によりＧＲＥおよびＥＲＥの二重の認識力を持つ受容体の創造が可能であった。これらの結果はループ中のアミノ酸が配列特異的結合に決定的ではないことを意味しているわけではないことを理解することが重要である；むしろ我々の結果はループ中のアミノ酸は応答要素間の差異の同定に決定的ではないことを示している。それ故、ループ機能の共通性はそれらはＨＲＥ構造の共通の様式の認識を媒介することを示していることが過程されるであろう０反対に、ＰおよびＤ要素は変異ヌクレオチドの認識に関与するであろう、これはＨＲＥが共通コア配列から成っており、それはヌクレオチド位置の制限された番号だけ変更できるという観察と一致している。このことはＨＲＥおよび亜鉛フィンガー間の推定の分布地図ではＨ９ｌｌの可変領域はいつもフィンガーのＰ要素内に位置しているであろうことを示唆するであろう、それ故この要素中のアミノ酸はベントメリックｕＲＥ中の可変の位置の少くとも１つと特異的に接触することが仮定できる。 −次配列認識に加えて、半一部位間隔（ＥＲＡ！対ＴＨＥ　、図１ｃ）を識別する必要がある０表１に要約したごとく、我々の結果は第１の要素（Ｐ）が半一部位の一次ヌクレオチド配列を特定し、一方第２の要素（Ｄ）は半部位間隔の決定に重要であることを示している。言葉を変えれば、ｈＧＲおよびｈＥＲ中の第２の要素は３つのギャップヌクレオチドを持つ１（ＲＥの認識を制限する。第１の要素のアミノ酸配列に関しては、この受容体スーパーファミリーのすべてのメンバーはＧＲまたはＥＲサブファミリー内へ分類できる（表２）、ＧＲサブファミリーは４つのヘンバーを含んでいる（ＧＲ，ＭＲ，ＰＲおよび＾Ｐ、　Ｉ！ｖａｎｓ、１９８８；Ｌｕｂａｈｎ。ａｔ　ａｌ、、１９８８；Ｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８）　；これらのすべてはＧＲ［！を認識できるが、各々のホルモンの生理学的効果は全く異なっている（Ｉ（ａｍ、　ａｔ　ａｌ、、１９８８）、他のメンバーはＥ！？／ＴＲサブファミリーを構成する（ＥＲ，↑、Ｒβ、Ｔ３１１β、ＲＡＲｃｒ、ＲＡＲβ、ＶＤｓＲ，ＮＧＦ■−Ｂ（Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ、　１９８８）、ＴＲ−２（Ｃｈａｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、１９８Ｂ）　、ｖ　−ｅｒｂ　Ａ　％　ｅａｒ２（Ｍｉｙｎｊｉｍ、ｅｔ　ａｌ、、１９８８）、　ｅａｒ３　（Ｍｉｙａｊｉｍａ、ｅｔ　ａｌ、、１９８Ｂ）、　ＫユＬＬ２！　（Ｎａｕｂ■秩B ｅｔ　ａｌ、、１９８Ｂ）、紐江匹関連（Ｏｒｏ、ｅｔ　ａｌ、、１９８８ｂ）　、わずかに変化させたＥＲＲＩおよびｒＪＲ２（参考のため、Ｅｖａｎｓ　１９８８を参照されたい）〕、このサブフコアリーのメンバーはＥＲＥ、丁ＲＥｐまたはＣ５に続く決定的なグルタミン酸残基のため５またはそれ以上の間隙ヌクレオチドにより分離されたＴＧＡＣＣ配列のパリンドローム対を認識するであろう、コノモデルを支持するため、５ａｌｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｔｕｄｉｅｓの我々のグループはレチノイン酸受容体は丁ＲＩ！と結合でき転写を活性化させることを示した。第１の要素の構造保存性と比較して、第２の要素は全く発散している。我々の仮説に従うと、第２の要素は［ｌＮＡへ直接結合する必要はなくむしろ蛋白質−蛋白質相互作用を通して半一部位の空間配置を決定するものであろう、１つの可能性はそれが二重化界面を表わすであろうことである。この仮定は、受容体ＤＮＡ結合ドメインはそれ自身二重化信号を含んでいるように思われるという最近の報告（Ｋｕｍａｒ、　ｅｔ　ａｌ、、１９８８　；　Ｔｓａｉ、　ａｔ　ａｌ−＋　１９８８　）と矛盾しない。表−一１および　炊・　ＤＮＡ　ムドメインのＰ　Ｄ　ＧＲＥ　ＥＲＲＴＲＦ！ＧＲＧＲ十−− ＴｓＲβ　Ｔ、ＲＲ−＋　＋ＧＱ　Ｔ、ＲＲ（＋）　−− ＴＪβ　ＧＲ−＋　− ＲＲ［！ρ　−＋　− ＧＲＥＲ＋　− ＥＲＧＲ−＋ＧＲ−ＥＲハイブリッドの表現型はＧｒｅｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８８）から。（＋）は陽性表現型は構成物に依存することを示している。え−一１ＧＲおよびＥＲＴＲサプフ　ミ盲−の　Ｐ　よび　Ｄの　Ｐ　Ｄａ）　ＧＲサブファミリーＧＲ，Ｎｉ１．　Ｐａｌ、　Ａｌｌ　ＧＳＣＫＶ　ＡＧＲＩＩＯＧＳＣＫＶ　ＡＳＲＮＤｂ）　ＥＲサブファミリー鵠　鴎ＣＫＡ　ＰＡＴＨＱＴ、Ｒａ　ＥＧＣＫＧ　Ｋ’１ＤＳＣｂＲβ　ＥＧＣＫＧ　ＫＹＥＧＫＲＡＲａ　、　ＲＡＲβ　［！ＧＣＫＧ　ＩＩＲＤＫＮｖｏ、ＩＩ！！ＧＣＫＧ　ＰＦＮＧＤＮＧＦＩ−Ｂ　ＥＧｆＪＧ　ＬＡＮＫＤＴＲ２ＥＧＣＫＧ　圓５ＫＤｖ　−５ｒｂＡ　ＥＧＣＫＳ　ＴＹＤＧＣｅａｒ２　ＥＧＣＫＳ　Ｒ３ＮＲＤｋｎ　ｉ　ｒｐｓ　ＥＧＣＫＳ　ＫＮＥＧＫｋｎｉｅｐｓ−関連　ＥＧＣＫＳ　ＫＮＮＧＥＥＲＲＩ　ＥＡＣＫＡ　ＰＡＳＮＥＥＲ１１２１！ＡＣＫＡ　ＰＡＴＮＥ阻ｌＪ１嗅１里図１　、ａ）ｈＧＲ，ｈＴｓＲβおよびｈＥｌｌのＤＮＡ結合ドメイン中のアミノ酸配列の比較（参考のために、Ｅｖａｎｓ、　１９８８を参照されたい）、上方の番号（１から９）は受容体ＤＮＡ結合ドメイン中に観察される不変の９つのシスティンに対応する。配列に隣接する番号は各々の受容体のアミノ酸位置を示している。コロンはｈＧＲおよびｈ丁ｓＲβまたはｈＴｊｌｌβおよびｈＥＲ間で同一のアミノ酸を示している。　ｈＴｆｆｌ？ｊ９　ＤＮＡ結合ドメインはドメインの中間に２つの追加のアミノ酸を含んでいる。　ｂ）ラットＧＲ１８のものに基づいて予想される亜鉛フィンガー、システィンのための番号１から９は図１ａと同じである。　ｈＧＲ，ｈＴ３ＲβおよびｈＥＲ中の保存アミノ酸は１文字アミノ酸コードで示されている６点はこれらの受容体中の可変アミノ酸を表わしている。２つの亜鉛イオン（Ｚｎ）は４つのシスティンの２つの群（Ｃ１からＣ１およびＣ＄からＣｓ）により四面体配位でキレートされており２つの“亜鉛フィンガー”を形成している（図１および図２）、２つのフィンガーはフィンガー間のリンカ−から成る１５（ｈＧＲおよびｈＥＲ）または１７（６丁、ＲＲ）のアミノ酸により分離されている。ｃ）ＧＲ（ＧＲＥ）　、　ＥＲ（ＥＲＲ）、およびＴ、Ｒ（ＴＩＩＥ）に対する最適化されたホルモン応答要素の構造（ＧｒｅｅｎおよびＣｈａｓｂｏｎ、　１９８８；Ｋｌｏｃｋ、ａｔ　ａｌ、＋　１９８７；およびＧｌａｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８をQ 照されたい）、各々の矢印はＨＲＥの“半部位”を示している。これらのＩ（ＲＥは矢印で示されたごとき半部位のバリドローム対から成っている。ＧＲＥおよびＥＲＡ！の両方とも半部位間に３つのギャップヌクレオチド（ｎｎｎ）を含んでいるがＴＨＥ、ではそのようなヌクレオチドは観察されない、　Ｅ［ＩＢおよびＴＦＩＢＰ中の点はＧＲＥのものから異なったヌクレオチドを示している。従って、ＥＲＥおよびＴｌ１Ｅ９は同一の半部位記列を含んでいる。図２．突然変異体受容体によるルシフェラーゼリポータ−プラスミドのトランス活性化、ａ）親ｈＧｌｌｎｘ　ＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列が示されている。　ｈＧＲｎｘはｃＤＮＡ中のＮｏｔ　ＩおよびＸｈｏ　Ｅ部位が隣接する野生型ｈＧＲ［１ＩＩＡ結合ドメインを含んでいる０番号１から９は図１ａのとうりである。突然変異体ＧＲｘｂａおよびＧＲｓｓ　を中の置換または挿入されたアミノ酸が示されている。　ｂ）局部的ｈＴ３Ｒβ（ＧＴＧ２３．ＧＴＧ７、ＧＴＧ３ＡおよびＧＴＧ６）またはｈＲＡＲβ（ＧＲＧ８）配列を運ぶキメラＧＲＤＮＡ１１合ドメインの構造、変わったアミノ酸が示されている。突然変異体はそのＤＮＡ結合ドメインの組成によって称されている；　ＧＴＧ２３はｈＧＩｌおよびｈＴ３１１β配列の両方から成るＤＮＡ結合ドメインを持ち、野生型ｈＧＲ配列に比べて２３の異なったアミノ酸を含む突然変異体ＧＲを表わしている。Ｃ）ハイブリッド受容体ＧＴＧ中の６丁、Ｒβ口ＮＡ結合ドメインのアミノの酸配列が示されている。　ＧＴＧはそのＤＮＡ結合ドメインがｈＴｓＲβのものに置換されているハイブリッドＧＲである。　ａ）のごと＜　ＧＴｘｂａＧおよびＧＴｓｓｔＧに対し変化したアミノ酸が示されている。ｂ）１文字アミノ酸コードにより示されているｈＧＲ配列を運ぶキメラｈＴｚＲ９ＤＮＡ結合ドメイン、各々の受容体発現プラスミドはグルココルチコイド（ＭＴＶ−ＬｔｌＣ）または甲状腺ホルモン（ＡＭＴＶ　−ＴＲＥｐ−ＬＵＣ）応答リポータ−プラスミドと共にｃｖ−ｉ細胞中へ同時トランスフェクトされ、細胞は１００　ｎＨのデキサメサゾン存在または不在下３６時間培養された。これらの受容体のトランス活性化機能はリポータ−プラスミドから誘導されたルシフェラーゼ活性により判断さＬ　ＭＴＶ（ＵＣ（？１ＴＶ）およびＡＭＴＶ−丁ＲＥｐ−ＬＵＣ（ＴＲＥｐ）関して、ＨＧＲｎｘ　（２５０婦）およびＧＴＧ　（２喘）活性に対するパーセントで定量化した。バックグラウンド誘導水準より以下の活性は（ＭＴＶに対し６倍およびＴＲＥｐに対して２倍）−で示されている。　ＴＲＥ、に対するＧＴＧｌＨの活性において“（２）”は誘導が↑’［ｌＥｐに依存しないことを示している。図２方法、　ｈＧＲｎｘ１０およびＧＴＧ１４は既知の以前に発表されている方法を用いて構築された。　ＧＲｘｂａ、　ＧＴＧ７．　ＧＴＧ３Ｂ、　ＧＲＧ８．　ＧＴＧ６およびＧＴＧ３＾のＤＮＡ結合ドメインをコード化している突然変異体ｃＤＮＡはｈＧＲｎｘ　ＤＮ＾結合ドメインをコードしているＮｏｔ　Ｔ　 −Ｘｈｏ　Ｉ　ＯＮ＾断片のオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発０［ｏｎＮｅｔ、　ａｔａｌ　、　、　１９８５）により得られた。同様に、ＧＴｘｂａＧ、　ＧＴＧ３２．　ＧＴＧ３６Ｂ、　ＧＴＧ２９．　ＧＴＧ３３およびＧＴＧ３６ＡのものはＮｏｔ　ｒ　−Ｘｈｏ　Ｔ断片のｂＴｓＲβＤＮＡ結合ドメインへの交換により作製された。突然変異体ＧＲｓｓｔおよびＧＲｓｓｔＧ　ｃＤＮＡは各々ＧＲｘｂａおよびＧＴｘｂａの埋められたＸｂａ　１１部位に５ｓｔＩリンカ−（８−（社）ｒ、ニエーイングランド　バイオラボ）を含んでいる。ＧＴＧ２３およびＧＴＧ１８はＧＲｘｂａおよびＧＴｘｂａＧ間のスモールＮｏｔ　１−４ｈａ　！断片を交換することにより得られた。突然変異体ＤＮＡ結合ドメインをコード化している各々のＮｏｔ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ　ｃＤＮ＾ＤＮＡｐＲ５ｈＧＲｎｘｌＯから得られるラージＮｏｔ　ｒ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片と結合された。　ＧＴＧ２８を作る為には、ｈＴ、ＲβｌｌＸ１４ＤＮ＾結合ドメインｃＤＮＡ中へＣ１ａ　１部位が導入された（フィンガー２のループ中のアミノ＃″１０”に相当する）　、　ｈＧＲｎｘ　ｃＤＮＡはこの位置に虹！部位を持っているので、ｈＧＲｎｘ　ｃＤＮＡのＮｏｔ　Ｉ　−Ｃ１ａ　Ｉ断片はｈＴ３Ｒβｎｘ　ｃＤＮＡのそれにより置換された。すべての突然変異体はヌクレオチド配列決定により確認された。リポータープラスミ）”ＭＴＶ　−ＬｔｌＣ７およびＡＭＴＶ　−Ｔｌｌ［！ｐ−ＬｔｌＣ２１の構築は以前に公表されティる方法を用いて行われた。受容体発現プラスミド（１ｐｇ）、リポータ−プラスミド（５ａｇ）、β−ガラクトンダーゼ対照プラスミド（５ａｇ）および担体プラスミド− ＥＭ４（９ｐｇ）が同時トランスフェクトされた。ＣＶ−１のトランスフェクション（Ｕｍｅｓｏｎｏ、　ｅｔａｌ、、１．９８７）およびルシフェラーゼ活性のためのアッセイは公表されている方法（ｄｅ　Ｗｅｔ、ａｔ　ａｌ、、１９８７）を用いて行われたが、ただし、対照プラスミドＧＩＲ５ＶＩ９ＧＡＬはｐｕＣ−誘導プラスミド中のβ−ガラクトシダーゼのコード配列（ｐＨｃＧＡＬｐＡ　。Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｊ、Ｒｉｃｋｌｅｓ博士から親切にも提供された）へ結合されているヒ）Ｃ−Ｒａ−ｒａｓプロモーター（ＩｓｈｉＬｅｔ　ａｌ、、１９８５　）を含むｐＲＡＳ−βＧＡＬにより置換され、プラスミドの細胞への導入後培養培地中のフェノールレッドは除かれた。図３、ＴＲＥｐ＋およびＴＲＥ十表現型を特定する２つの異なった要素の同定、２つのｈＧＲと異なるアミノ酸のみが示されている。２つの領域（要素ＰおよびＤ）は箱型に印を付けである。突然変異体の命名法および番号は図２と同じである。突然変異受容体はＧＲＥ（ＭＴＶ−ＬＵＣ）、ＴＲ［！１１（ＡＭＴＶ　− ＴＲＥｐ−Ｌ［ＩＣ）またはＥＲＥ（ＡＭＴＶ−εＲε−ＬＵＣ）を運ぶルシフェラーゼリポータ−の１つの存在下ｃｖ−ｉ細胞中で過渡的に発現させた後（± １１００ｎデキサメサゾン、３６時間）トランス活性化機能を試験した。　ＴＲＥｐ上のＧＴＣＩ５による弱い促進（２）はこの突然変異体のより高いバックグラウンド活性によるものであり、２％誘導はＴＲＥｐには依存しない、ＡＭＴＶ　−ＥＲＥ　−ＬＵＣ（ＥＲＥ）においてのＧＴＧによるルシフェラーゼ活性の１００％誘導は１０倍であり、−は誘導なしを示している。　ＥＲＥリポータ− に対し、図２に示されたＴＲｌ１十変異体による相対的活性は以下のごとくである：　ＧＴＧ３２（９０％）　、ＧＴＧ３６１１（１４０％）　、ＧＴＧ（Ｇｌａｓｓ、ｅｔ　ａｌ、、１９８Ｂを参照されたい）をコードしているオリゴヌクレオチドが１’ｒＴＶ　−ＬＴＲ（７）位置−１９０から−８８ノ間の主たるＧＲＩ！が欠失されティるＡＭＴＶ　−ＣＡＴプラスミドの独特のＢｉｎｄｌ１１部位中へ挿入された；これによりＡＭＴＶ　−ＥＲＥ　−ＣＡＴが生じる；ＣＡ丁遺伝子は続いてｐｓＶｏ−＾ルーＡΔ５′から得られるルシフェラーゼ遺伝子（ｄｏ　ｌ１ｅｔ、ｅｆａｌ、、１９８７）で置換されるとＡＭＴＶ　−ＥＲＥ −ＬＵＣを与える。突然変異体ＧＴＧ２１はＧＴＧ２８のごと＜Ｃｌａｌ部位を導入することによりＧＴＧ３２から作製される（図２ｄ）　、　ｈＧＲｎｘのスモールｒｉｏｔ　ｒ　−Ｃ１ａ　Ｉ断片がＧＴＧ３２−Ｃ１ａ　Ｉのものと交換された。　ＧＴＣＩ５およびＧＴＧ８ば各々ＧＴＧ２１およびＧＴＧ３Ａ　ＤＮＡ結合ドメインをコード化しているｃＤＮＡの部位−指向性突然変異誘発（ＩｌｕｎＫｅｌ、ａｔ　ａｌ、、１９８５）を経て得られた。同様にＧＴΩおよびＧＴＧＩはｈＧＲｒ＋ｘから作製された。トランスフェクションおよびルシフェラーゼ活性のアッセイは図２と同様である。図４．基本ΔＭＴＶ−ＣＡＴ（ＡＭ）、Ｔ３応答性ＡＭＴＶ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ（丁Ｒｆ！ｐ）およびエストロゲン応答性ΔＭＴＶ−ＥＲＩ！−ＣＡＴ（ＥＲＲ）リポータ−からの突然変異体受容体によるＣＡＴ活性の誘導、リポータ−の１つと一緒にａ）からｈ）の示された受容体発現プラスミドがＣＶ−１細胞にトランスフェクトされた。受容体は１００ｎＨのテキサメサゾン（Ｄ）または１７β −エーストラジオール（Ｃ２）を添加し、３６時間活性化させた。記号“−”は溶媒エタノールが添加されたことを示している。ｈＧＲｎｘ、　ＧＴＧ、　ＧＴＧ８゜ＧＴＧ３Ａ、　ＧＴＧ２およびＧＴＣＩの構造は図２および３に示されている１表示“受容体ナシ”はｈＴＪβをコード化している発現プラスミドが逆の配向で同時トランスフェクトされたことを示している。　ｈＥＲ：ヒトエストロゲン受容体、　ｅ）からｈ）の変化したアミノ酸はｈＧＲ亜鉛フィンガーの模式的図に示されている。　ＣＡＴアフセイにおいての計夏された％変換はａ）　ＡＭ（−）０．４．　（Ｄ）０．５．　ＴＲＥｐ　（−）０．４．　（Ｄ）０．６．　ＥＲＥ（−）０．６．　（Ｄ）１．０．　ｂ）６Ｍ（−）０．４．　（Ｄ）０．７．　ＴＲＥｐ　（−）０．３．　（Ｄ）０．８．　ＥＲＥ（−）０．４．　（Ｄ）１．２．　ｃ）Δ阿（|）１．８．（Ｅｌ）１．６．　ＴＲＥｐ　（）１．６．　（［！ｉ）？、０．　ＥＲＲ（−）１．８．　（Ｅ意）７８．ｄ）Δ旧−）１．４゜（Ｄ）　４．６．　ＴＲＥｐ（−）１．１．　（Ｄ）７４．　ＥＲｉ！　（−）１．９．　（Ｄ）７２．　ｅ）　ＡＭ（−）０．５．　（ロj１．３゜ＴＲＥｐ　（−）０．６．　（Ｄ）１．４．　ＥＲＩ！（−）１．２．　（Ｄ）２０．　ｆ　）６Ｍ＜−）０．８．　（［１）１．８．　ＴqＥｐ（−）０．９．　（［１）３．５．　ＥＲＥ（−）１．３．　（Ｄ）９６．　ｇ）　ＡＭ（−）（＋、５．　（１））０．７．ＴＲｌ１ｐ（|）０．５゜（Ｄ）０．６．Ｅｌ？Ｅ（−）１．０．（１）ン１１１８．ｈ）６Ｍ（−）０．７．（Ｄ）４．３．丁ＲＥｐ（−）０．７．（Ｄ）８７゜ＥＲＥ（−）１．０．　ＣＤ）９５よびＥｖａｎｓ、　１９８９）実施された。２、　Ｃｈａｎｇ、Ｃ，、ａｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０．３２４−３２６（１９８８）。３、　ｄｅ　Ｗｅｔ、Ｊ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．ｆｌｉｏｌ、７．７２５−７３７（１９８７）。４、　Ｅｖａｎｓ、Ｒ，阿、、５ｃｆｓｎｃｅ　２４０．８８９−８９５（１９８Ｂ）。５、Ｆｔｅｅｄｍａｎ、Ｌ、Ｐ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３４．　５４３−５４６（１９８Ｂ）。６、　Ｇｉｇｕａｒｅ、Ｖ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅｌ！　４６．６４５−６５２（１９８６）。７、　Ｇｉｇｕｅｒｅ、Ｖ、、ａｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３０＋　６２４ −６２９（１９Ｂ？）。１３、　Ｇｉｇｕｅｒｅ、シ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３７．５６６ −５６９（１９８９）。９、　Ｇ１ａｓｓ＋Ｃ，に、、ｅｔ　ａｌ、＋ｃｅｌｌ　５４．３１計３２３（１９８８）。１０、　Ｇｏｒｗａｎ、Ｃ，Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、Ｊｏｌ、ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ、　２．１０４４−１０５Ｈ１９Ｂ２）。１１、　Ｇｒｅｅｎ　５．、ａｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２５＋　７５−７８（１９８７）。１２、　Ｇｒｅｅｎ　５．、ａｔ　ａｌ、４ｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｊｃｓ　４．３０９　３１４（１９８８）。１３、　Ｇｒｅｅｎ、　Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、　７．３０３７−３０４４（１９羽）。１４、Ｈａｍ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、１６．　５２６３　５２７６（１９８Ｂ）。１５、　［ｅｒｂｏｓｅｌ、　Ｐ、、ｅｔ　ａｌ、、ｃｅｌｌ　３９．６５３　６６２（１９８４）。１６、　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　４９．３９−４６（１９８７）。１７、　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、Ｍ、＋ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５５．８９９−９０６（１９８８）。１８、１ｓｈｉｉ、　Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０．１３７８　１３８０１９８５）。１９、Ｋｌｏｃｋ、　Ｇ、、ａｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｔｅ　３２９．７３４　７３６（１９８７）。２０、　Ｋｕｍａｒ、　Ｖ、、ａｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１５１．９４１　９５１（１９８７）。２１、　Ｋｕａａｒ、　Ｖ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５５．１４５−１５６（１９８Ｂ）。２２、　Ｋｕｎｋｅｌ、Ｔ、Ａ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ＳＣｔ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２．４８８−４９２（１９８５）。２３、　Ｌｕｂａｂｎ、　Ｄ、Ｂ、、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｔｅｎｃｅ　２４０．３２７　３３０（１９８８）。２４、　Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ、Ｊ、、Ｎｅｕｒｏｎ　１．１８３−１８８（１９８Ｂ）。２５、　Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ、、ｅｔ、ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、　４．１６０９　１６１４（１９８５）。２６、　Ｍｉｙａｊｉａ＋ａ、　Ｎ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６．１１０５７−１１０７４（１９８８）。２７、　Ｎａｕｂｅｒ、　ｕ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３６．４８９ −４９２（１９８８）。２８、　Ｏｒｏ、　Ａ、Ｅ、、ａｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５５．１１０９−１１１４（１９８８ａ）。２９、０ｒｏ、　Ａ、Ｅ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３６．４９３−４９６（１９８８ｂ）。３０、　Ｐｅｔｋｏｖｊｃｈ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３０．４４４−４５０（１９８７）。３１、　ＰＩｃａｒｄ、　Ｉ）、、ａｔ　ａｌ、、ｆ’ＭＢＯＪ、　６．３３３３−３３４０（１９８７）。３２、　Ｒｕ５ｃｏｎｊ、　Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　６．１３０９−１３１５（１９８７）。羽、　５ｅｖｅｒｎｅ、　Ｙ、、ｅｔ　ａｌ、、！！ＭＢＯＪ、　７．２５０３　２５０８（１９８Ｂ）。３４、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｃ，Ｃ，、ａｔ　ａｌ、＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、８６．　３４９４　−３４９W（１９８９）。３５、　Ｔｓａｉ、　Ｓ、Ｙ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１５５．３６１−３６（１９８Ｂ）。３６、Ｕｗｅｓｏｎｏ、Ｋ、、ａｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３６．　２６２ −２６５（１９８８）。３７、Ｗａｔｅｒｍａｎｔ　Ｍ、Ｌ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２．　１４　２１（１９８８）。３８、　ｄｅ　Ｗｅｔ、　Ｊ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７．７２５−７３７（１９８７）。手続補正書平成　４年８月１１８１、事件の表示３、補正をする者名　称　ザ・ソーク・インステイチュート・フォー・バイオロジカル・スタディーズ４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正の対象（１）特許出願人の名称及び発明者氏名を正確に記載した国内書面（２）タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文６、補正の内容（１）　国内書面の特許出願人「ザ・サルク・インスティチュ゛−ト・フォー・バイオロジカル・スタディーズ」の記載を「ザ・ソーク・インスティチュート・フォー・バイオロジカル・スタディーズ」に補正する。（２）　国内書面記載の発明者の１人である［カズヒコ。ウメソノ」を「梅園　相席」と訂正する。（３）　明細書及び請求の範囲の翻訳文を別紙の如く浄書したものを提出する。（尚、書面の内容には変更なし）７、添付書類の目録（１）　出願人名称訂正に関する理由書　１通（２）参考資料　１通（３）　発明者氏名訂正に関する理由書　１通（４）訂正国内書面　１通（５）　正しい名称を記載した委任状訳文　１通（６）　タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文　１通国際調査報告１Ｍ舎＋＋ｓｗｐ−ム”””””’Ｉｌ’ｌ’ｆｆ／Ｉ＋ＱＱｎ／＋１１ムフ８

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＧＳＣＫＶ，ＥＧＣＫＡ，ＥＧＣＫＧ，ＥＧＣＫＳおよびＥＡＣＫＡから成る群より選択される要素Ｐアミノ酸。
２．【配列があります】およびＰＡＴＮＥから成る群より選択される要素Ｄアミノ酸。
３．ＧＴＧ８，ＧＴＧ３Ａ，ＧＴＧ２，ＧＴＧ１から成る群より選択される突然変異受容体。
４．ＧＲＥおよびＥＲＥの両方の配列を活性化できる受容体を構築する方法で、該方法は（Ａ）Ｃ３およびＣ４間の部位にコード化されているグリシンがグルタミン酸で置換されるようにグルココルチコイド受容体ＤＮＡ配列、または（Ｂ）Ｃ３およびＣ４間の部位にコード化されているグルタミン酸がグリシンで置換されるようにエストロゲン受容体ＮＡ配列内へ点突然変異を導入することを特徴としている。
５．グルココルチコイドおよびエストロゲン応答要素の両方を活性化できる本質的に純粋な受容体蛋白質。
６．該蛋白質が請求項４の方法により産生される請求項５に記載の本質的に純粋な受容体蛋白質。
７．オーファン受容体蛋白質に対する機能性リガンドを同定するための方法で、該方法；（Ａ）受容体蛋白質コード化していると疑わるＤＮＡ配列を単離し；（Ｂ）適当な受容体欠損宿主細胞内へトランスフェクトし；（１）工程ＡからのＤＮＡ配列、および（２）少くとも１つの作用可能なホルモン応答要素に機能的に結合されている少くとも１つのリポーター遺伝子、ここで該ホルモン応答要素は野生型、遺伝子工学による、または合成グルココルチコイド応答要素および野生型、遺伝子工学による、または合成エストロゲン応答要素から成る群より選択される；（Ｃ）工程Ｂからのトランスフェクトされた宿主細胞に工程ＡのＤＮＡ配列によりコード化されているオーファン受容体蛋白質のリガンド結合ドメイン領域と潜在的に結合できる候補リガンドを作用させ；および（Ｄ）リポーター遺伝子の誘導をモニターすることを特徴とする。
８．オーファン受容体蛋白質に対する機能性リガンドを同定するための方法で、該方法は：（Ａ）受容体蛋白質をコード化していると疑われるＤＮＡ配列を単離し；（Ｂ）適当な受容体欠損宿主細胞内へトランスフェクトし：（１）工程ＡからのＤＮＡ配列、（２）少くとも１つの作用可能なホルモン応答要素に機能的に結合された少なくとも１つのリポーター遺伝子、ここでホルモン応答要素は野生型、遺伝子工学による、または合成グルココルチコイド応答要素から成る群より選択される、および（３）少くとも１つの作用可能なホルモン応答要素に機能的に結合された少なくとも１つのリポーター遺伝子、ここでホモン応答要素は野生型、遺伝子工学による、または合成エストロゲン応答要素、から成る群より選択される；（Ｃ）工程Ｂからのトランスフェクトされた宿主細胞に工程ＡのＤＮＡ配列によりコード化されたオーファン受容体蛋白質のリガンド結合ドメイン領域と潜在的に結合できる候補リガンドを作用させ；および（Ｄ）リポーター遺伝子の誘導をモニターすることを特徴とする。
９．オーファン受容体蛋白質（ＯＲＰ）に対する機能性リガンドを同定するための方法で、該方法は：（Ａ）オーファン受容体蛋白質（ＯＲＰ）により活性化される少くとも１つの機能性ホルモン応答要素を同定し；（Ｂ）該オーファン受容体蛋白質（ＯＲＰ）を受容体欠損宿主細胞中で工程Ａで同定された該機能性ホルモン応答要素と作用可能なごとく結合された少くとも１つのリポーター遺伝子と接触させ；（Ｃ）該オーファン受容体蛋白質（ＯＲＰ）のリガンド結合ドメイン領域と潜在的に結合できる候補リガンドを作用させ；および（Ｄ）リポーター遺伝子の誘導をモニターすることを特徴とする。
１０．該機能性ホルモン応答要素が（Ａ）該オーファン受容体蛋白質のＤＮＡ結合ドメインの一部を決定する少くともホルモン応答要素のアミノ酸配列を決定し、および（Ｂ）工程Ａで決定されたアミノ酸により活性化されるホルモン応答要素を同定することにより同定される請求項９Ａに記載の方法。
１１．細胞中のオーファン受容体蛋白質に対する機能性リガンドを同定するための方法で、該細胞は（Ａ）オーファン受容体蛋白質をコードしていると疑われるＤＮＡ配列、（Ｂ）作用可能なホルモン応答要素に機能的に結合されている少くとも１つのリポーター核酸配列、ここでホルモン応答要素は野生型、遺伝子工学による、および合成グルココルチコイド応答要素から成る群より選択される、および（Ｃ）作用可能なホルモン応答要素に機能的に結合された少くとも１つのリポーター核酸配列、ここでホルモン応答要素は野生型、遺伝子工学による、および合成エストロゲン応答要素から成る群より選択される；を含んでおり；該方法は少くとも１つの候補リガンドを受容体欠損細胞に作用させ、リポーター核酸配列の誘導をモニターすることを特徴としている。
１２．該細胞がＣＶ−１細胞である請求項７−１１の任意の項に記載の方法。
１３．リポーター遺伝子がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子およびホタルルシフェラーゼ遺伝子から成る群より選択される請求項７−１１の任意の項に記載の方法。
１４．オーファン受容体を活性化するリガンドの同定方法で：（Ａ）前もって選択されたホルモン応答要素に機能的に結合された少くとも１つのリポーター遺伝子を受容体欠損宿主細胞中に提供し；（Ｂ）産生される突然変異オーファン受容体が工程Ａからの前もって選択されたホルモン応答要素を活性化できるように、少くともオーファン受容体のＤＮＡ結合ドメインのＰ領域をコード化しているＤＮＡに突然変異を起こさせ；（Ｃ）工程Ａからの受容体欠損細胞と工程Ｂからの突然変異オーファン受容体を接触させ；（Ｄ）工程Ｃからの該細胞に該突然変異オーファン受容体のリガンド結合ドメイン領域と潜在的に結合できる候補リガンドを作用させ；および（Ｅ）リポーター遺伝子の誘導をモニターすることを特徴とする。
１５．該Ｐ領域が部位指向性突然変異誘発により突然変異を受ける請求項１４Ｂに記載の方法。