DE69030697T2

DE69030697T2 - Bildverarbeitungseinrichtung

Info

Publication number: DE69030697T2
Application number: DE69030697T
Authority: DE
Inventors: Hideji Fujiwake; Masahiko Hirano; Yoshinori Mizuguchi; Iwayo Nakagawa; Hideshi Oishi; Norikazu Sugiyama; Shigeru Uchiyama
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 1989-08-25
Filing date: 1990-08-22
Publication date: 1998-01-02
Anticipated expiration: 2010-08-23
Also published as: JPH0383174A; EP0414237A3; DE69030697D1; ATE153156T1; JP2864130B2; EP0414237B1; EP0414237A2; US5047846A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Bildverarbeitungsvorrichtung, wobei eine Probe, wie etwa eine Herzmuskelzellenprobe, einem Reiz ausgesetzt wird, so daß die Änderung der Fluoreszenz über die Zeit mit hoher zeitlicher Auflösung gemessen werden kann.
Die europäische Patentanmeldung EP-A-0 207 485 zeigt ein Fluorometer zur Messung einer bestimmten Fluoreszenz, die von einer Probe ausgeht, nachdem die Probe einem Lichtimpuls ausgesetzt worden ist. Die Messung der Fluoreszenz wird zu einem Zeitpunkt innerhalb eines bestimmten Zeitraums nach Einkopplung des Lichtimpulses durchgeführt. Die gemessene Fluoreszenz der Probe wird abgetastet, um Signale zu erzeugen, die durch Verstärken eines bestimmten Bereichs des interessierenden Fluoreszenzsignals analysiert werden.
Bei einem herkömmlichen Bildaufnahmeverfahren unter Verwendung einer Fernsehkamera wird eine Probe einem ununterbrochenen Licht ausgesetzt, das von einer kontinuierlich leuchtenden Lichtquellenlampe ausgeht; die zeitliche Auflösung zum Erhalt von Daten kann nicht höher als 1/30 s gemacht werden, was die für einen Rahmen benötigte Zeit ist, und daher ist eine höhere zeitliche Auflösung nicht zu erzielen. Es können keine Daten erhalten werden, die die Änderung über die Zeit repräsentieren, die der Dauer des Reizes entspricht, weil die Einrichtung zur Abgabe des Reizes an die Probe nicht mit der Fernsehkamera synchronisiert werden kann. Beispielsweise kann die Änderung der Ca²&spplus;-Konzentration, die aus der Kontraktion der Herzmuskelzelle resultiert, durch die Intensität der Fluoreszenz des in die Zellen eingebrachten Reagens gemessen werden. Der Vorgang (der Änderung der Ca²&spplus;-Konzentration) kann jedoch mit dem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung der Fernsehkamere nicht im einzelnen beobachtet werden, weil die Änderung der Kontraktion des Herzens mit einer Rate in der Größenordnung von Millisekunden erfolgt.
Es gibt ein anderes Verfahren unter Verwendung eines Photovervielfachers anstelle der Fernsehkamere, wobei die Fluoreszenz an einem Punkt innerhalb des Sichtfelds des Mikroskops oder die Fluoreszenz von vielen Proben, die in eine Küvette eingebracht sind, gemessen wird. Dieses Verfahren unter Anwendung eines Photovervielfachers erlaubt es uns, die Intensität der Fluoreszenz mit hoher zeitlicher Auflösung zu messen, aber aufgrund der Punktdetektierung ist eine zweidimensionale Analyse der Fluoreszenz der Probe nicht möglich.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung anzugeben, die imstande ist, die Änderung der Fluores zenz mit einer zeitlichen Auflösung in der Größenordnung von einer Millisekunde oder weniger zu analysieren.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung anzugeben, die imstande ist, die Änderung der Gestalt einer einzelnen Herzmuskelzelle infolge der Kontraktion und des dynamischen Verhaltens der intrazellulären Ca²&spplus;-Konzentration über die Zeit zu analysieren, indem ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Fernsehkamera kombiniert wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Bildverarbeitungsvorrichtung gemäß der Definition in Anspruch 1 bereitgestellt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein fluoreszierendes Reagens in eine Probe von Herzmuskelzellen geladen, um die intrazellulären Carboxylgruppen zu veranlassen, an das Ca²&spplus; gebunden zu werden; der äußere Reiz wird an die Herzmuskelzelle angelegt; die zwei Impulse des gepulsten Anregungslichts, die unterschiedliche Wellenlängen haben, werden an die Herzmuskelzelle angelegt; und das Bild der Herzmuskelzelle wird von der hochempfindlichen Fernsehkamera aufgenommen. Bei diesem System ist das impulsförmige Licht mit der Austastperiode der Fernsehkamera komzident; der Zeitpunkt des Reizes wird entsprechend der Emissionsdauer der Impulse des gepulsten Anregungslichts vorgegeben; die Fernsehkamera ist dazu ausgebildet, das Bild der Probe durch Abtastung über wenigstens einen Rahmen der Austastperiode aufzunehmen, wohingegen das Bild nicht aufgenommen wird, während die Probe dem impulsförmigen Anregungslicht ausgesetzt ist. Diese Bildverarbeitungsvorrichtung ermöglicht eine Änderung des Zeitpunkts des Reizes in Abhängigkeit von verschiedenen Meßanforderungen, von der Vielzahl von Bilddaten, die in dem Speicher zu speichern sind, wobei diese Bilddaten erneut synthetisiert werden, um die Änderung des Bilds und die Änderung der Gestalt einer einzelnen Herzmuskelzelle, die mit der Rate in der Größenordnung von einer Millisekunde auftritt, infolge der Kontraktion der Herzmuskelzelle und der gleichzeitigen dynamischen Änderung der intrazellulären Ca²&spplus;-Konzentration zu beobachten, die zweidimensional zu analysieren sind.
Nachstehendwerden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung im einzelnen erläutert.
Fig. 1 ist ein Blockbild, das eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in bezug auf eine Bildverarbeitungsvorrichtung zeigt;
Fig. 2 ist ein Zeitdiagramm, das Operationen der Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung zeigt;
Fig. 3 ist ein Ablaufdiagramm, das den Ablauf der Operationen der Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung zeigt.
In Fig. 1 bezeichnet 1 ein Fluoreszenzmikroskop, wobei die Probe 3, wie etwa Herzmuskelzellen, die mit einem fluoreszierenden Reagens beladen sind, auf der Seite einer Objektivlinse 2 des Mikroskps 1 angeordnet ist. Die Leuchtimpuls- Lichtquelle 4 ist vorgesehen, um die Probe 3 mit impulsförmigen Anregungslichtimpulsen einer einzigen Wellenlänge oder verschiedener Wellenlängen zu bestrahlen. Eine hochempfindliche Fernsehkamera 5 ist auf der Ausgangsseite des Fluoreszenzmikroskops 1 angebracht.
Eine CPU 6, die einen Bildprozessor aufweist, ist mit der Ausgangsseite der hochempfindlichen Fernsehkamera 5 verbunden. Diese CPU 6 ist mit einer Tastatur 7 zur Eingabe von Daten für die Verarbeitung, eines Befehls für die Analyse und weiterer Daten verbunden. Ein Farbmonitor 8 ist vorgesehen, um ein Bildanalysemenü und die Daten anzuzeigen. Ein RAM 9 ist vorgesehen, um Bilddaten vorübergehend zu speichern. Ein ROM 10 ist vorgesehen, um Programme für die Analyse, für die Verarbeitung, zum Lesen und Speichern der Daten zu speichern.
Einbildspeicher 11 zum Speichern der Bilddaten und ein Drucker 12 sind vorgesehen, um die Meßdaten auszudrucken. Ein Zeitsteuerungssignalgenerator 13 ist vorgesehen, um ein Zeitsteuerungssignal zu erzeugen. Der Zeitsteuerungssignal generator 13 erzeugt ein Treibersignal für die hochempfindliche Zeilenfolge-Fernsehkamera 5, das Zeitsteuerungssignal zum Schreiben in den Bildspeicher 11, ein Zeitsteuerungssignal für eine Reizimpulserzeugungseinrichtung 15 und ein Leuchtimpuls-Zeitsteuerungssignal für eine Lichtquellensteuereinheit 14.
Der Betrieb dieser Ausführungsform, die wie oben beschrieben aufgebaut ist, wird als nächstes unter Bezugnahme auf die zeichnungen erläutert.
Das Beladen der Probe aus Herzmuskelzellen 3 mit dem fluoreszierenden Reagens bewirkt, daß sich die intrazelluläre Carboxylgruppe an das Ca²&spplus; in den Herzmuskelzellen 3 bindet. Die Herzmuskelzellen 3, in die das fluoreszierende Reagens injiziert wird, werden auf der Seite der Objektivlinse 2 des Fluoreszenzmikroskops 1 plaziert. Die Messung beginnt zu einem Zeitpunkt t&sub1;, der in Fig. 2 gezeigt ist. Nach dem Beginn der Messung wartet die Vorrichtung, bis das erste Vertikalsynchronisiersignal detektiert wird. Wenn das erste Vertikalsynchronisiersignal zu einem Zeitpunkt t&sub2; empfangen wird, wird das Zeitsteuerungssignal von dem Zeitsteuerungssignalgenerator 13 zu einem Zeitpunkt t&sub3; nach einer vorbestimmten Dauer (A-F) ab dem Zeitpunkt t&sub2; erzeugt.
Die Erzeugung dieses Zeitsteuerungssignals bewirkt, daß das Reizsignal von der Reizimpulserzeugungseinrichtung 15 abgegeben wird. Dabei bezeichnet A die Periode eines Vertikalsynchronisiersignals, während F das Zeitintervall von t&sub3; bis zu der nächsten Vertikalaustastperiode bezeichnet. Das Reizsignal wird zum Zeitpunkt t&sub3; abgegeben. Dadurch wird eine Mikroelektrode 16 veranlaßt, einen Reizstrom an die Herzmuskelzellen 3 anzulegen. Das Zeitsteuerungssignal wird von dem Zeitsteuerungssignalgenerator 13 zu einem Zeitpunkt t&sub4; abgegeben, der in der nächsten Vertikalaustastperiode und nach der vorbestimmten Zeitdauer F ab dem Zeitpunkt t&sub3; für die Abgabe des Reizsignals liegt.
Das bewirkt über die Lichtquellensteuereinheit 14, daß der impulsförmige Erregungslichtimpuls von der Leuchtimpuls- Lichtquelle 4 auf die Herzmuskelzellen 3 projiziert wird. Dabei ist es wesentlich, daß der impulsförmige Erregungslichtimpuls während der Vertikalaustastperiode D auftritt, und das ermöglicht die Abgabe des Reizimpuls-Zeitsteuerungssignals vor dem vorbestimmten Zeitpunkt der Abgabe des impulsförmigen Erregungslichtimpulses. Bei der oben beschriebenen Ausführungsform ist der Zeitpunkt t&sub3; für die Abgabe des Reizimpuls-Zeitsteuerungssignals in einem Rahmen (c) des Zeitpunkts t&sub4; (vor dem Zeitpunkt t&sub4;) für die Zeitsteuerung des impulsförmigen Erregungslichts vorgegeben, aber der Abgabezeitpunkt t&sub3; ist nicht innerhalb dieses einen Rahmens begrenzt und kann daher so vorgegeben werden, daß er mehr als einen Rahmen, d. h. eine Vielzahl von Rahmen (B = nA), einnimmt.
Die Herzmuskelzelle 3 wird mit dem Anregungslicht bestrahlt, das unterschiedliche Wellenlängen hat, beispielsweise mit impulsförmigem Anregungslicht (G) von 340 nm und 360 nm oder von 340 nm und 380 nm, und von der Leuchtimpuls-Lichtquelle 4 kommt. Das hat zur Folge, daß die Fluoreszenzbilder, die in Abhängigkeit von der Lichtwellenlänge unterschiedliche Fluoreszenz-Intensität haben, von der Herzmuskelzelle 3 erzeugt werden, und diese Fluoreszenzbilder werden von der hochempfindlichen Fernsehkamera 5 aufgenommen.
Das Bildsignal von der Fernsehkamera wird in dem Bildspeicher 11 durch die CPU 6 gespeichert und auf dem Femsehmonitor 8 angezeigt oder von dem Drucker 12 ausgedruckt. Wenn daher zum Zeitpunkt t&sub3; der Reizimpuls gegeben wird, kann das Bild nach einer bestimmten Zeitdauer E oder zum Zeitpunkt t&sub4; erhalten werden. Das heißt also, der Reizimpuls wird zum Zeitpunkt t&sub3; gegeben, der dem Zeitpunkt t&sub4; für das Aufleuchten oder den Lichtimpuls der gepulsten Lichtquelle vorhergeht, und nach einer bestimmten Zeitdauer F kann das Fluoreszenzbild während der Dauer C zwischen dem Zeitpunkt t&sub5; und dem Zeitpunkt t&sub6; durch Abtasten mit der Fernsehkamera erhalten werden. Die verschiedenen Bilder können durch Ändern des Zeitpunkts t&sub3; für die Zeitsteuerung des Reizimpulses erhalten werden.
Die Vielzahl von Bilddaten wird in dem Bildspeicher 11 gespeichert, und die CPU 6 hat Zugriff auf die gespeicherten Daten für die Analyse. Insbesondere wird die Ca²&spplus;-Konzentration unter Nutzung eines Kalibrierdiagramms des Fluoreszenz verhältnisses und von Ca²&spplus; (Konzentration) errechnet. Um dieses Kalibrierdiagramm zu erhalten, werden vorher bekannte Ca²&spplus;-Konzentrationen einiger Proben in dem ROM 10 gespeichert, und die Intensität der Fluoreszenz der Probe wird von der CPU 6 nach Verarbeitung der Probe mit dem fluoreszieren den Reagens und zwei verschiedenen impulsförmigen Anregungslichtimpulsen gemessen.
Bei der oben beschriebenen Ausführungsform wird das impulsförmige Anregungslicht während der Vertikalaustastperiode D des Rahmens von 1/30 s erzeugt, aber wenn eine raschere Analyse verlangt wird, kann der impulsförmige Anregungslichtimpuls auch während der Horizontalaustastperiode erzeugt werden.

Claims

1. Bildverarbeitungsvorrichtung, um die Änderung eines Zustand einer Probe (3) über die Zeit zu messen, wobei die Vorrichtung folgendes aufweist:

eine Kamera (5), um die Probe (3) zu beobachten; eine gepulste Lichtquelle (4), um impulsförmiges Anregungslicht zu einer vorgegebenen Zeit t&sub4; auszusenden;

einen Zeitsteuerungssignalgenerator (13), um Zeitsteuerungssignale für die Kamera (5) und die gepulste Lichtquelle (4) zu erzeugen;

dadurch gekennzeichnet,

daß die Kamera (5) Fernsehkamera hoher Empfindlichkeit ist und die vorgegebene Zeit t&sub4; der Impulslichtemission von der gepulsten Lichtquelle so vorgegeben ist, daß sie in der Austastperiode der Fernsehkamera (5) liegt;

daß eine Reizimpulserzeugungseinrichtung (15, 16) vorgesehen ist, um an die Probe (3) zu einer Zeit t&sub3;, die der vorgegebenen Zeit t&sub4; der Impulslichtemission um eine vorgegebene Zeitdauer (F) vorausgeht, einen Reiz anzulegen, wobei der Zeitsteuerungssignalgenerator (13) so ausgebildet ist, daß er ein Zeitsteuerungssignal für die Reizimpulserzeugungseinrichtung (15, 16) erzeugt;

und daß eine Steuereinrichtung (6) für die Bildverarbeitung vorgesehen ist, so daß eine Vielzahl von Bildern zu variablen Zeiten t&sub3; der Reizimpulsaufbringung in bezug auf die vorgegebene Zeit t&sub4; der Impulslichtemission aufgenommen wird und daß die Änderung des Zustand der Probe (3) durch erneutes Synthetisieren des Gesamtbilds beobachtet wird.

2. Bildverarbeitungsvorrichtung nach Anspruch 1, wobei das impulsförmige Anregungslicht von der gepulsten Lichtquelle (4) während der Vertikal- oder der Horizontal-Austastperiode (D) der Fernsehkamera (5) ausgesandt wird.