DE69025629T2

DE69025629T2 - Arzneimittel und verfahren zur behandlung von erworbenem immundefizienzsyndrom (aids) und aids-verwandtem komplex unter verwendung von karbohydratspezifischen antikörpern

Info

Publication number: DE69025629T2
Application number: DE69025629T
Authority: DE
Inventors: Henrik Clausen; John-Erik Hansen
Original assignee: Bay Development Corp SA
Current assignee: Bay Development Corp SA
Priority date: 1990-01-26
Filing date: 1990-12-13
Publication date: 1996-07-04
Anticipated expiration: 2010-12-14
Also published as: WO1991011528A1; WO1991011199A1; CA2073459A1; NO922941D0; CA2074512A1; EP0512023A4; ES2082962T3; EP0511967B1; NO922941L; DE69025629D1; FI923348A; ATE134649T1; AU653141B2; FI923348A0; JPH05506843A; EP0511967A1; JPH05506565A; AU6961491A; EP0512023A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von erworbenem Immunschwäche-Syndrom (AIDS) und AIDS-verwandtem Komplex (ARC) und insbesondere Arzneimittel zur Behandlung von AIDS und ARC unter Verwendung von Anti-Kohlenhydrat-Antikörpern.

Hintergrund der Erfindung

Über veränderte, mit viraler Infektion assoziierte Glycosylierung in Wirtszellen ist berichtet worden (Ray et al. (1978), Virology 88:118; Kumarasamy et al. (1985), Arch. Biochem. Biophys. 236:593). Wie Onkogenese verursacht die durch Cytomegalovirus oder HIV induzierte abweichende Glycosylierung die Bildung von neuen Antigenen, die in den ursprünglichen Wirtszellen nicht vorhanden sind (Andrews et al. (1989), J. Exp. Med. 169:1347; Adachi et al. (1988), J. Exp. Med. 167:323). Durch die Verwendung monoklonaler Antikörper, die Oligosaccharid-Epitope definieren, ist das Auftreten von Leγ- und Lex-Antigenen nach viraler Infektion nachgewiesen worden.
Mehrere Studien haben die Beteiligung des Kohlenhydrat-Anteils an der HIV-Infektion in vitro angezeigt. So verringert die Hemmung der frühen Schritte bei der Golgi-Glycosylierung in infizierten Zellen die Infektionsfähigkeit des gebildeten Virus (Gruters et al. (1987), Nature 330:74; Montefiori et al. (1988), PNAS 85:9248). Ferner blockieren Lektine die Syncytien-Bildung, mutmaßlich durch eine spezifische Wechselwirkung mit gp120-Glycanen infizierter Zellen, und neutralisieren auch die Infektionsfähigkeit von zellfreiem Virus (Lifson et al. (1986), J. Exp. Med. 164:2101). Eine Veränderung in der N-Glycosylierung von T4-Zielzellen scheint jedoch die HIV-Infektion nicht zu beeinflussen (Montefiori et al. (1988), supra). Gp120 enthält mehrere verschiedene Glycan-Strukturen und Kohlenhydrat macht 50% der Gesamtmasse von gp120 aus (Matthews et al. (1987), PNAS 84:5424). Es sind überwiegend N-verknüpfte Glycane auf gp120 gefunden worden (Kozaraky et al. (1989), J. Acq. Imm. Def. Syndr. 2:163). Die Bindungsstelle auf gp120 für den T4-Rezeptor scheint in einem nichtlinearen C-terminalen Teil des Moleküls lokalisiert zu sein (Lasky et al. (1987), Cell 50:597). Es ist nicht klar, ob Glycane direkt an der Virusbindung beteiligt sind. So können hemmende Lektine an Glycane gegenüber der Bindungsstelle binden und dadurch die T4- gp120-Bindung sterisch stören, wie für neutralisierende Antikörper festgestellt wurde (Bahraoui et al. (1988), AIDS 2:165-169; Linsley et al. (1988), J. Virol. 62:3695). Die bisher durch Lektin-Studien auf gp120 identifizierten Glycane sind überall zu finden, und so schien das therapeutische Potential für eine Behandlung auf Lektin- Basis gering.
In einem Artikel, der nach dem für diese Anmeldung beanspruchten Prioritätsdatum veröffentlicht wurde, offenbaren Hansen et al. (1990), J. Virol. 64: 2833, daß drei Kohlenhydrat-Epitope (A&sub1;, Leγ und Sialosyl-Tn) nach einer HIV-Infektion vorzugsweise oder ausschließlich auf T-Lymphoid-Zellen exprimiert wurden. Die einfache Struktur Sialosyl-Tn vom Mucin-Typ sowie die verwandten Tn- und T- Antigene werden gewöhnlich nicht auf der Zelloberfläche von normalen adulten Zellen exprimiert. Eine humorale Immunantwort, die gegen diese Antigene gerichtet ist, wird bei Krebspatienten gefunden, da Krebszellen diese Antigene exprimieren können und das Immunsystem sensibilisieren (Springer et al. (1979), Prog. Allergy 26:42). Hansen et al. (1990) supra, offenbaren, daß gegen Tn und T gerichtete Antikörper die Anwesenheit dieser Antigene auf HIV nicht zeigten. Dies war das Ergebnis eines in vitro Immunneutralisations-Assays, der von den speziellen Eigenschaften der verwendeten monoklonalen Antikörper abhängig ist.
AIDS ist als eine besondere neue Krankheit anerkannt, bezüglich deren Ätiologie festgestellt wurde, daß sie mit der Infektion einer neuen Klasse von lymphotropen Retroviren mit der Bezeichnung HIV verbunden ist. Die Krankheit ist gekennzeichnet durch eine Störung, die mit einer beeinträchtigten zeilvermittelten Immunität und absoluter Lymphopenie, insbesondere verringerten T-Helferlymphozyten (T4 oder CD4), verbunden ist. Dies ist darauf zurückzuführen, daß HIV vorwiegend die CD4-Lymphozyten-Population infiziert. ARC, ein Präsyndrom, das sich gewöhnlich durch einen Komplex bestimmter klinischer Merkmale und Helfer-T-Lymphopenie manifestiert, kann AIDS vorangehen.
Die Diagnose einer Infektion mit HIV erfolgt gewöhnlich auf der Grundlage eines Nachweises von Antikörpern, die gegen HIV gerichtet sind. Das exakte Antikörper-Profil kann mit dem Stadium der Krankheit variieren (Gallo et al. (1986), Prog. Allergy 37:1).
Trotz der beachtlichen Fortschritte, die hinsichtlich ihrer Charakterisierung erreicht wurden, sind die Verfahren zur Behandlung und Vorbeugung von AIDS und ARC immer noch schlecht entwickelt. Es besteht ein großes Bedürfnis, bessere Verfahren zu deren Behandlung und Prävention zu entwickeln.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß ein Antikörper gegen Tn zur Hemmung oder Verlangsamung des Fortschritts von AIDS oder ARC verwendet werden kann. Ein Arzneimittel für diesen Zweck umfaßt eine pharmazeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer Antikörper(s), der oder die aus Anti-Tn besteht(en), und ein(en) pharmazeutisch annehmbaren(s) Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipienten.
Ein monoklonaler Anti-Tn-Antikörper kann in vitro die HIV- Infektionsfähigkeit und die Syncytien-Bildung hemmen, entweder durch Bindung an den Virus oder an die verwendeten Zielzellen. Er kann deshalb auch eingesetzt werden, um Kohlenhydrat-Strukturen zu definieren, die als virale Glycoproteine und mit dem Virus assozijerte Glycosphingolipide exprimiert werden, und dadurch Glycane der Virushülle als Ziele zu identifizieren, von denen angenommen wird, daß sie für die Immuntherapie und/oder Impfstoffentwicklung geeignet sind.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Kohlenhydrat-Strukturen sind oft bei der anfänglichen Adhäsion von Pathogenen an Zielzellen beteiligt. Bei der Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurde eine Gruppe von monoklonalen Anti- Kohlenhydrat-Antikörpern auf deren Fähigkeit getestet, in vitro die HIV-Infektionsfähigkeit zu hemmen, entweder durch Bindung an den Virus oder an die verwendeten Zielzellen. Monoklonale Antikörper gegen das Kohlenhydrat-Antigen waren imstande, sowohl die Virusinfektion zu blockieren als auch die Syncytien-Bildung zu hemmen. Die Hemmung der Virus-Infektionsfähigkeit war unabhängig von dem Virusstamm (HTLVIIIB und ein Patientenisolat SSI-002), der für die Virusvermehrung verwendeten Zellinie (H9 und MT4) oder dem als Infektionsziel eingesetzten Zelltyp (Lymphozyten oder Monozyten). Eine Hemmung wurde beobachtet, wenn monoklonale Antikörper mit Virus vorinkubiert wurden, jedoch nicht, wenn Zellen so vor der Infektion vorinkubiert wurden. Demgemäß wird angenommen, daß die monoklonalen Antikörper Kohlenhydrat-Strukturen definieren, die als virale Glycoproteine exprimiert werden, und es steht zu erwarten, daß Glycane der Virushülle geeignete Ziele für die Immuntherapie und/oder Impfstoffentwicklung sind.
Der Anti-Tn-Antikörper sollte gegen das Tn-Kohlenhydrat-Antigen mit der folgenden Struktur spezifisch sein:
GalNacα1-O-Ser/Thr
Der Anti-Tn-MAb kann mit dem Sialosyl-Tn-Kohlenhydrat-Antigen mit der folgenden Struktur kreuzreagieren:
NeuAcα2-6GalNacα1-O-Ser/Thr
Die Isotypen und Affinitäten geeigneter Anti-Tn-Antikörper für das Antigen variieren in großem Umfang von einem Antikörper zum nächsten und so ist die Spezifität für Tn das kritische identifizierende Merkmal dieser Antikörper.
Beispiele bevorzugter monoklonaler Maus-Antikörper umfassen diejenigen, welche durch die neuen Hybridome KTH1, KTH2 und KTH3, alle am 14. November 1990 beim PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, England, hinterlegt, gebildet werden. Diese drei Hinterlegungen haben die Hinterlegungs-Nummern 90111401, 90111402 bzw. 90111403. Jedoch können beliebige andere monoklonale Antikörper mit den identifizierenden Merkmalen der monoklonalen Antikörper KTH1, KTH2 und KTH3 eingesetzt werden.
Neben der spezifischen Bindung an das Kohlenhydrat-Antigen Tn besteht ein weiteres identifizierendes Merkmal der monoklonalen Antikörper KTH1, KTH2 und KTH3 in deren Isotypen, die IGG&sub1;, IgM bzw. IgM sind.
Polyklonale Antikörper gegen das Kohlenhydrat-Antigen Tn können nach bekannten Verfahren hergestellt werden.
Das Immunogen, welches eingesetzt wird, um den Antikörper gegen Tn- Antigen zu erhalten, ist eine Kernstruktur vieler Glycoproteine vom Mucin-Typ. "Glycoprotein vom Mucin-TYP", wie hier verwendet, bedeutet ein Protein von hohem Molekulargewicht mit einem hohen Grad O-verknüpfter Glycosylierung an Serin- oder Threoninresten. Glycoproteine vom Mucin-Typ werden durch S-S-abhängige Verknüpfung weiter polymerisiert und sind die Hauptkomponenten von Epithel-Sekretionen. "Kernstruktur eines Glycoproteins vom Mucin-Typ", wie hier verwendet, bedeutet eine Kohlenhydrat-Grundstruktur ohne periphere Substitution, die direkt mit der Proteingruppierung eines Glycoproteins vom Mucin- Typ verknüpft ist. In der vorliegenden Erfindung kann jede Tn- Kernstruktur eines Glycoproteins vom Mucin-Typ als Immunogen eingesetzt werden, solange das Glycoprotein ein hohes Molekulargewicht (relatives Molekulargewicht > 10&sup6; Dalton) aufweist und im selben Grad wie Mucin glycosyliert ist, d.h. mehr als 50% des Gesamtgewichts glycosyliert ist. Tierische Mucine, die das Tn- Antigen enthalten, können ebenfalls als Immunogen eingesetzt werden.
Das Tn-Antigen-Immunogen kann erhalten werden durch enzymatische oder chemische Modifizierung eines Glycoproteins vom Mucin-Typ, um die Tn-Antigen-Kernstruktur freizulegen oder durch Isolierung von Mucinen, die Tn-Kernstrukturen aufweisen. Diese Mucine sind in einigen Tierspezies vorhanden. Das Tn-Antigen-Immunogen kann nach üblichen Verfahren isoliert und gereinigt werden.
Beispielsweise können Glycoproteine vom Mucin-Typ, die zur Erzeugung einer Sialyl-Tn-Kernstruktur enzymatisch oder chemisch modifiziert werden sollen, mittels Gelfiltration durch Sepharose 48 oder Sephacryl 200S isoliert werden. Das isolierte Glycoprotein wird dann enzymatisch oder chemisch nach im folgenden beschriebenen Verfahren modifiziert, um die Tn-Kernstruktur freizulegen, und die Tn-Kernstruktur wird zur Verwendung als Immunogen gereinigt.
Zur Reinigung kann das modifizierte Mucin mittels Gelfiltration, z.B. durch Sepharose 4B oder Sephacryl 200, abgetrennt werden. Hochdruckchromatographie auf einer synthetischen Molekularfiltersäule (schnelle Flüssigchromatographie; Pharmacia) ist zur Abtrennung von enzymatisch oder chemisch modifizierten Mucinen ebenfalls geeignet. Als Immunogen zur Herstellung monoklonaler Antikörper braucht das modifizierte Mucin jedoch nicht gereinigt sein. Die Gegenwart einer kleinen Menge unmodifizierten Mucins wird der Verwendung als Immunogen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung nicht schaden. Ferner ist die Modifizierung gewöhnlich quantitativ, falls geeignete Routinevorsorgemaßnahmen getroffen werden.
Mucine, die von Tierspezies stammen und Glycoproteine bereits in Form einer Sialyl-Tn-Kernstruktur enthalten, werden durch übliche Verfahren erhalten, z.B. mittels Gelfiltration durch Sepharose 4B, Sephacryl 200 oder FPLC, wie oben beschrieben.
Beispielhafte Typen enzymatischer Modifizierung, die zur Freilegung der Tn-Struktur verschiedener Glycoproteine vom Mucin-Typ verwendet werden können, umfassen die Eliminierung des endständigen α2-3- Sialyl-Rests und α2-6-Sialyl-Rests, verknüpft mit dem GalNAc, durch spezielle Sialidasen oder die vollständige Eliminierung aller Sialsäurereste durch Clostridium perfringens-Sialidase. Die enzymatische Modifizierung kann auch die Behandlung mit ß- Galactosidase (vorzugsweise aus Charonia lampas), α-Fucosidase und N-Acetylhexosaminidase umfassen. Die enzymatische Hydrolyse von Mucin-Glycoprotein wird von Hirohashi et al. (1985), PNAS 82: 7039- 7043, und Kjeldsen et al. (1988), Cancer Res. 48: 2214, beschrieben.
Beispiele von chemischen Reaktionen, die zur Freilegung der Tn- Kernstruktur von Glycoproteinen vom Mucin-Typ eingesetzt werden können, umfassen die Periodat-Oxidation, gefolgt von einer Reduktion mit Natriumborhydrid und einer Behandlung mit schwacher Säure. Das Verfahren wird Smith-Abbau genannt (Sprio, Methods Enzymol. (1972) 28: 3-43). Diese chemische Behandlung eliminiert nicht-reduzierende Enden von Kohlenhydratresten, außer Sialsäure, die durch Sialidase- Behandlung wie oben beschrieben eliminiert werden kann.
Beispiele von aus Tieren isolierten Mucinen, die als Immunogene eingesetzt werden können, umfassen Schafsunterkiefer-Mucin (OSM), in dem 90% der Kohlenhydratketten aus dem Tn-Antigen besteht, und Rinderunterkiefer-Mucin (BSM), in dem 50% der Kohlenhydratketten aus dem Tn-Antigen besteht und 20% der Kohlenhydratketten aus T-Antigen und anderen nicht identifizierten Resten besteht. Das Tn-Antigen wird aus den Sialosyl-Tn-Mucinen durch Eliminierung von Sialosyl-Resten unter Verwendung von Sialidasen hergestellt.
Diese so abgeleiteten tierischen Mucine können zur Verwendung als Immunogene nach denselben Verfahren wie oben beschrieben, z.B. übliche Gelfiltration oder FPLC, gereinigt werden. Die Reinheit des Immunogens ist jedoch für die Herstellung eines monoklonalen Antikörpers nicht kritisch.
Human-Erythrozyten-Glycophorin kann aus Human-Erythrozyten-Membranen durch das ursprünglich von Marchesi und Andrews, Science (1971) 174:1247-1248, beschriebene Verfahren erhalten werden.
Ob ein Glycoprotein die Tn-Kernstruktur aufweist, kann durch Affinitätschromatographie mit einer Helix pomatia-Säule bestimmt werden (Carter und Sharon (1977), Arch. Biochem. Biophys. 180: 570- 582) oder durch "Immunoblotting" von Glycoproteinen mit Anti-Tn- Antikörper (erhältlich von Chembuimed, Edmonton, Alberta, Kanada).
Die Verbreitung des Antigens ist ziemlich beschränkt. Eine für die vorliegende Erfindung geeignete Quelle des Tn-Antigens sind jedoch die Kulturüberstände der Plattenepithel ("squamous")-Lungenkarzinom- Zellinien QG 56 und LU-65 (Hirohashi et al. (1985), supra, und Takahashi et al. (1988), Cancer Res. 48:4361).
Eine zweite Quelle ist wiederum Schafsunterkiefer-Mucin, welches eine hohe Dichte von Sialyl-Tn enthält, das chemisch oder enzymatisch zu Tn überführt werden kann.
Biosynthetisch hergestelltes Tn-Protein stellt eine dritte Quelle dar. Synthetische Peptide oder rekombinante Proteine, die Serin- und/oder Threonin-Aminosäurereste enthalten, können in vitro mit einer in der Natur vorkommenden Glycosyltransferase (UDP-GalNAc: Serin/Threonin-Peptid-N-Acetylgalactosaminyltransferase) glycosyliert werden; siehe Elhammer et al. (1982), J. Biol. Chem.
Eine vierte Quelle ist chemisch synthetisiertes GalNAc α1-O-Ser oder GalNAc α1-O-Thr (im Handel von Biocarb, Schweden, erhältlich).
Um Tn-Antigen in einer als Immunogen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeigneten Form aus dem Kulturüberstand zu erhalten, werden die verschiedenen oben genannten Zellinien nach bekannten Verfahren kultiviert. Die Kulturüberstände werden dann behandelt, um Sialyl- Tn-Antigen wie folgt zu erhalten.
Beispielsweise wird die folgende Behandlung durchgeführt: das verbrauchte Kulturmedium von in Suspension kultivierten Zellen wird lyophilisiert, um dessen Volumen auf 1/50 des ursprünglichen Volumens zu verringern. Das konzentrierte verbrauchte Medium wird dann bei 4ºC ausgiebig gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung dialysiert, die 0,01% Natriumazid enthält. Das dialysierte Material wird auf Sepharose 4B aufgebracht und gelfiltriert. Das Leervolumen wird gepoolt, weiter konzentriert und auf Sephacryl 200 erneut einer Chromatographie unterzogen. Die Glycoprotein-Fraktion im Leervolumen wird als Immunogen eingesetzt. Alle Verfahren müssen innerhalb einer begrenzten Zeit und bei niedriger Temperatur (4ºC) abgeschlossen werden, da die Sialyl-Verknüpfung instabil ist.
Das Immunogen kann dann für die Immunisierung behandelt werden. Beispielsweise wird das Tn-Antigen (z.B. 4,0 mg) in destilliertem Wasser (z.B. 4 ml) gelöst, sorgfältig mit einer geeigneten Menge an säurebehandelten Salmonella minnesota (z.B. 16 mg) gemischt und lyophilisiert. Die getrocknete Mischung wird in einem geeigneten Volumen (z.B. 4,0 ml) eines geeigneten Trägers (z.B. 140 mM NaCl mit 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,0) suspendiert, und Aliquots von etwa 100 µg Mucin und 400 µg Bakterien werden intravenös injiziert.
Die Immunisierung kann auch mit vollständigem Freundschen Adjuvans statt einer Absorption auf Bakterien durchgeführt werden und das Verhältnis zwischen der Menge an Mucin und Salmonella minnesota kann variiert werden. Die besten Ergebnisse wurden beobachtet, wenn Salmonella minnesota mit Essigsäure behandelt wird, wie früher von Young et al. (1979), J. Exp. Med. 150:1008-1019, beschrieben.
Der für die Immunisierung verwendete Wirt kann eine Maus oder Ratte eines beliebigen Stammes oder jede andere Art von Tier sein, dessen Splenocyten für die Herstellung von Hybridomen geeignet sind, d.h. empfänglich für die Zellfusion mit HAT-sensitiven Myelom-Zellinien, um stabile Hybridome zu etablieren.
Der Immunisierungsablauf hängt von der Empfänglichkeit des Wirtstieres gegenüber Mucin-Immunisierung ab, jedoch ist das oben beschriebene Versuchsprotokoll für Mäuse geeignet. Alternative Bedingungen können ebenfalls angewandt werden. Geeignete Immunisierungsabläufe können durch den Fachmann bestimmt werden.
Beispielsweise besteht ein geeigneter Immunisierungsablauf für Balb/c-Mäuse darin, die Immunogenpräparation intravenös durch die Schwanzvene einmal wöchentlich 5 Wochen lang zu injizieren und dann nach 1-monatiger Unterbrechung eine Wiederholungs ("Booster")- Injektion mit der Immunogenpräparation durchzuführen.
Die Menge der an den Wirt verabreichten Immunogenpräparation hängt vom Molekulargewicht des Mucins, dem Freiliegen des Kohlenhydrat- Epitops, und der Neuheit und Dichte des Epitops ab, das mit Glycoproteinen vom Mucin-Typ assoziiert ist. Der Bereich des in Mäuse injizierten Glycoproteins beträgt 3 bis 5 µg als Überzug in 100 µl Salzlösung, intravenös in jede einzelne Maus injiziert, deren Körpergewicht im Bereich von 100 - 150 g liegt.
Wird vollständiges Freundsches Adjuvans eingesetzt, so werden etwa 20 µl Glycoprotein in 500 µl Salzlösung mit 500 µl vollständigem Freundschen Adjuvans emulgiert und etwa 200 µl subkutan an mehreren Stellen injiziert (etwa 50 µl pro Stelle). Ähnliche Antigen-Mengen, entweder als Überzug auf Salmonella minnesota oder mit vollständigem Freundschen Adjuvans gemischt, werden für andere Wirte wie Ratten, Hamster oder Meerschweinchen verwendet, und mehrfach größere Mengen werden für andere Wirte wie Kaninchen eingesetzt. Es ist nicht nötig, die Menge des Antigens proportional zum Körpergewicht des Tiers zu erhöhen.
Die Immunisierung wird wiederholt, bis ausreichend Antikörper im Gesamtserum nachweisbar ist. Die Milzzellen des Wirts werden entfernt und Splenocyten mit HAT-sensitiven Myelomzellen durch die gut etablierte Technik (Köhler und Milstein (1975), Nature 256:495- 497, und Young et al. (1979), sudra), fusioniert.
HAT-sensitive Myelomzellen können z.B. NS-1, SP-1 oder (vorzugsweise) SP-2 sein, aber es kann jeder Typ von HAT-sensitiven Myelomzellen verwendet werden. Gelegentlich können Hybridome nach der Fusion von Wirts-Splenocyten mit Myelomzellen etabliert werden, obwohl kein Antikörper im Wirtserum nachweisbar war. Deshalb ist es nicht essentiell, Antikörper vor der Zellfusion nachzuweisen. Die Fusionen werden gewöhnlich in Polyethylenglykol durchgeführt, wie von Young et al. (1979), supra, beschrieben.
Die fusionierten Zellen werden in Platten mit 96 Vertiefungen kultiviert, bis Miniklone gebildet werden. Es ist wichtig, Splenocyten 48-72 Stunden nach der letzten Wiederholungs ("Booster")- Injektion zu verwenden und mit gut proliferierenden Myelomzellen zu fusionieren, um eine Anzahl überlebender fusionierter Zellen zu erhalten, die wachsen werden. Die Feuchtigkeit und CO&sub2;-Konzentration im Inkubator muß im Anfangsstadium der Kultivierung der fusionierten Zellen sorgfältig kontrolliert werden.
Ein Fachmann kann ohne weiteres geeignete Kulturbedingungen bestimmen. Es sind keine Nahrungszellen ("feeder cells") erforderlich, um die fusionierten Zellen gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zu züchten.
Nach einer geeigneten Kulturperiode werden Hybridome, welche Antikörper sekretieren, die mit dem zur Immunisierung verwendeten Sialyl-Tn-Antigen reagieren, kloniert und durch Grenzverdünnung, d.h. durch Verdünnung auf einen Punkt, an dem weniger als eine Zelle pro neue Kultur zu erwarten ist, subkloniert und dann in die Vertiefungen ausplattiert.
Im allgemeinen wird jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen mit Mucin-Glycoprotein, das die als Immunogen verwendete Tn-Kernstruktur enthält, durch Inkubation jeder Vertiefung mit Glycoprotein- Lösung in PBS beschichtet, z.B. werden 100 µl einer 0,1-10 µg/ml- Lösung zugegeben und über Nacht inkubiert. Die Glycoprotein-Lösung wird entfernt, es wird gewaschen und weiter mit 5% Rinderserumalbumin inkubiert, um die Platte zu blockieren, bevor sie zum Screenen von Antikörpern verwendet wird. Dieses Verfahren wird von Hirohashi et al. (1985), supra, beschrieben.
Die Hybridome, welche die Antikörper sekretieren, die mit den speziellen Antigenen reagieren, werden folgendermaßen gescreent: Antikörper, der an eine Antigen-beschichtete Vertiefung gebunden ist, wird üblicherweise nachgewiesen durch einen sekundären Antikörper (gegen Maus-IgM und -IgG gerichtete Ziegen- oder Kaninchen- Antikörper), gefolgt von ¹²&sup5;I-markiertem Protein A, wie ursprünglich von Young et al. (1979), supra, beschrieben. Dieses Verfahren ist noch empfindlicher als verfügbare ELISA-Assays, obwohl ein ELISA ebenfalls eingesetzt werden kann. ELISA's können durch den Einsatz automatisierter Ablesegeräte und im Handel erhältlicher ELISA-Kits bequemer durchgeführt werden.
Monoklonale Antikörper gegen Tn-Antigen, sekretiert von so isolierten Hybridomen, können in Mengen hergestellt werden durch die Züchtung großer Ansätze von Hybridom-Zellkulturen und die Reinigung des Antikörpers aus dem Überstand oder durch Injizieren der Hybridom- Linie in Mäuse, um die Produktion von Asciten-Flüssigkeit zu stimulieren. Beide Verfahren sind auf diesem Gebiet wohlbekannt.
Verfahren zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers in Mengen entsprechend der vorliegenden Erfindung werden von Young et al. (1979), supra, beschrieben.
Die erfindungsgemäß isolierten Hybridome können in großen Ansätzen in Suspensionskultur gezüchtet werden, oder noch bequemer in einem Fiberglasbehälter, in dem Zellen in hoher Dichte gepackt und gezüchtet werden, worin Antikörper in das Kulturmedium diffundieren können.
Die monoklonalen Antikörper können durch bekannte Verfahren gereinigt werden, z.B. durch Affinitätstrennung unter Verwendung von Protein A oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf alkyliertem "reversed phase"-Silicagel oder unter Verwendung einer synthetischen Polystyrol-Gelfiltrationssäule.
Geeignete Dosen eines Arzneimittels können abhängig von der Verabreichungsweise durch den geschulten Fachmann leicht bestimmt werden. Konkreter sollte eine geeignete Dosierung zur intravenösen Verabreichung von Antikörpern, um die AIDS-Infektionsfähigkeit weiter zu unterdrücken, durch verschiedene übliche Versuche bestimmt werden. Beispielsweise können KTH1-, KTH2- und KTH3-Antikörper die HIV- Infektion in vitro bei einer Konzentration von 2 µg/ml zu hemmen. 15,6 mg KTH-1 werden für ausreichend gehalten, um die HIV- Infektionsfähigkeit zu verhindern, wenn sie einem Mann von 60 kg Gewicht mit etwa 7,8 l Blut verabreicht werden. Human-Antikörper sind zur Durchführung dieser in vivo-Hemmung stark bevorzugt.
Geeignete Verfahren zur Verabreichung des Arzneimittels können durch Fachleute bestimmt werden. Antikörper können intravenös verabreicht werden, aber andere Formen der Verabreichung sind ebenfalls möglich.
Geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel und Exzipienten werden durch den Fachmann leicht bestimmt. Beispielsweise können die Antikörper in einer physiologischen Pufferlösung solubilisiert verabreicht werden. Es wird jedoch kein Träger als besonders bevorzugt betrachtet.
Das Antigen Tn, dessen Struktur oben angegeben ist, kann aus natürlichen Quellen durch bekannte Verfahren isoliert werden, z.B. dem von Kjeldsen et al. (1988), Cancer Res. 48:2214, beschriebenen, oder dem oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Immunogen, welches das Tn-Antigen oder biosynthetisch produziertes Tn-Glycopeptid umfaßt.
Die folgenden Beispiele erläutern, wie Antikörper der Erfindung hergestellt werden können und die Tests erläutern deren Brauchbarkeit. Alle Prozentangaben, Verhältnisse, Teile, etc. sind auf das Gewicht bezogen, soweit nicht anders angegeben. FCS = fötales Kalbserum.

Monoklonale Anti-Kohlenhydrat -Antikörper

Getestete Antikörper, deren Spezifität, Isotyp und Referenz für die Herstellung sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die verschiedenen in Tabelle 1 gezeigten monoklonalen Antikörper definieren Kohlenhydrat- Strukturen, die an der Peripherie von O-verknüpften Glycoprotein- Ketten gefunden werden (siehe Clausen und Hakomori (1989), Vox Sang. 56:1, bezüglich einer Übersicht).
Alle Zellen wurden in RPMI 1640 mit 5-15% FCS, 2 mM Glutamin und 1 mM Pyruvat gezüchtet und bei 4ºC mit 0,02% NaN&sub3; gelagert.
Zunächst wurden alle aufgeführten monoklonalen Antikörper als sterile Hybridom-Kulturüberstände, die etwa 10-50 µg Immunglobulin (Ig)/ml enthielten, auf HIV-Hemmung getestet .
Schließlich wurden die monoklonalen Antikörper KTH1, KTH2 und KTH3 nach der Reinigung aus dem Kulturüberstand eingesetzt (siehe unten; Fig. 2 und 3). KTH1 (IgG&sub1;) wurde durch Protein-A-Sepharose- Chromatographie und KTH2 (IgM) und KTH3 (IgM) durch Ionenaustauschchromatographie wie vom Hersteller beschrieben (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gereinigt.
Die Artikel, auf die sich Tabelle 1 bezieht, sind:
1) Hirohashi (1985), PNAS 82: 7039
2) Clausen et al., unveröffentlicht
3) Clausen et al. (1988), Molec. Immunol. 25:199
4) Kjeldsen et al. (1988), Cancer Res. 48:22 TABELLE 1 Antigen Antikörper Sialosyl-Tn

Zellen

Für HIV-Infektionsversuche wurden die T4-Lymphozyten-Zellinien H9 (Popovic et al. (1984), Science 224:497), CEM (Foley et al. (1965), Cancer 18:522) und MT4 (Harada et al. (1985), Science 229:563) bei 37ºC und 5% CO&sub2; unter Verwendung von RPMI 1640 mit 10% FCS (5% für CEM-Zellen), 100 IU/ml Penicillin, 20 µg/ml Gentamicin und 100 IU/ml Streptomycin (Wachstumsmedium) in Kultur gezüchtet. Die Zellen wurden bei einer Konzentration von 2-10 x 10&sup5; Zellen/ml gehalten und das Medium zweimal wöchentlich gewechselt.
Für HIV-Infektionsversuche bei Monozyten wurde die Zellinie U937 (Levy et al. (1985), Virology 147:441) nach einer Kultur wie oben beschrieben eingesetzt.

Virus-Quelle

Der Überstand von chronisch mit dem HIV-1-Referenzstamm HTLVIIIB (Popovic et al. (1984), Science 224:497) infizierten H9-Zellen wurde steril filtriert, in Aliquots aufgeteilt und bis zur Verwendung bei -80ºC gelagert. Der HIV-1-Stamm SSI-002 wurde aus einem mit HIV infizierten Patienten (CDC II) wie oben beschrieben isoliert (Nara et al. (1989), PNAS 86:7139-43). Der Virus wurde dann drei Passagen in MT4-Zellen unterzogen und wie oben gelagert. Vor der Verwendung wurde der TCID&sub5;&sub0;-Wert der Viruspräparate in MT4-Zellen und U937- Zellen bestimmt.

Toxizität

Die Toxizität der monoklonalen Antikörperpräparate wurde überprüft, indem 0,5 x 10&sup6; MT4-Zellen in Zellkulturplatten mit 24 Vertiefungen in Wachstumsmedium, das 20 bis 0 µg/ml gereinigten Antikörper enthielt, inkubiert wurden und die Überstände nach 4 Tagen Kultur gegen frisches Medium ausgetauscht wurden, das geeignete Konzentrationen an Antikörper enthielt. Zählungen lebender Zellen wurden nach 0, 4 und 7 Tagen mittels Trypanblau-Ausschluß erhalten.

ELISA

Zellfreie Überstände wurden auf das HIV-Antigen unter Verwendung eines Doppel-Antikörper-Sandwich-ELISA überprüft; siehe Nielsen et al. (1987), Lancet 8532:566. Jede Platte umfaßte eine Verdünnungsreihe eines HIV-Antigen-Standardpräparats und die optischen Dichten (490 nm) wurden auf dieses Standardpräparat bezogen (geschätzte Einheiten) . Alle Infektionsversuche in vitro beinhalteten eine Kontrolle unter Verwendung von unbehandelten HTLVIIIB. Nach 4 Tagen Kultur wurden die Überstände verdünnt, um eine 0D490 dieser Kontrolle von etwa 2 zu ergeben. Alle auf Infektionshemmung getesteten Antikörper wurden auch auf eine Störung des ELISA-Nachweises getestet und es wurde keine solche Störung festgestellt.

Screening

Die Überstände der neu entwickelten Hybridome, die durch Immunisierung mit Tn, d.h. KTH1-3, stimulierte monoklonale Antikörper enthielten, wurden sowohl durch die Antigen-Spezifität unter Verwendung von Tn-Antigen als auch den Virushemmungs-Assay wie nachfolgend beschrieben gescreent. Etablierte Kontroll-Antikörper umfaßten den Anti-Tn-Antikörper Lu35, der früher als nicht-hemmend befunden worden war (Hansen et al. (1990), supra), und den monoklonalen IgG2A-Anti-Tn-Antikörper 1E3 (Clausen et al., unveröffentlicht). Ferner waren gegen Sialosyl-Tn gerichtete Antikörper, die früher als hemmend befunden worden waren, TKH2 und B72.3 (Kjeldsen et al. (1988), supra) als positive Kontrollen eingeschlossen. Ein Anti-T-Antikörper, HH8 (Clausen et al., supra) war ebenfalls als negative Kontrolle eingeschlossen (siehe Tabelle 1).

Virushemmungs-Assay

Fünfundzwanzig TCID&sub5;&sub0; HTLVIIIB wurden mit 0,5 ml Hybridom- Überstand gemischt und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. MT4-Zellen (1x10&sup6;) wurden in dieser Mischung suspendiert und 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Nach ausgiebigem Waschen wurden die Zellen in Wachstumsmedium resuspendiert (4 ml), das 10% v/v des entsprechenden MAb enthielt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. In Fig. 1 stellt die Ordinate die Antigen-Produktion in geschätzten Einheiten nach 4 Tagen (ausgefüllte Säule) und nach 7 Tagen (schraffiert) dar; die Abszisse repräsentiert eine Kontrolle mit unbehandeltem Virus ("o MAb"), Kontrolle ohne Virus ("o HIV") oder Hybridom-Überstand, der den genannten MAb enthält.

Infektionshemmung

Um die Hemmungswirkung der MAb auf die HIV-Infektion in verschiedenen Zellsystemen zu bestimmen, wurden Lymphozyten-Zellen der MT4-Zellinie und Monozyten-Zellen der U937-Zellinie als Zielzellen für die Infektion mit den HIV-1-Virusstämmen HTLVIIIB bzw. SSI-002 eingesetzt.
10&sup6; MT4-Zellen in 500 µl Wachstumsmedium wurden 2 Stunden lang mit 25 CCID&sub5;&sub0; HIV-1 beimpft. Vor der Beimpfung wurden entweder die Zellen oder das virale Impfgut 1 Stunde lang mit einer Verdünnungsreihe von MAb vorinkubiert. MAb-vorinkubierte Zellen wurden vor der Beimpfung gewaschen. Nach der Beimpfung wurden die Zellen gewaschen und vier Parallelansätze von 200.000 Zellen in Wachstumsmedium ohne MAb in NUNC-Platten mit 24 Vertiefungen 7 Tage lang in Kultur gezüchtet. Nach 4 Tagen Kultur wurde das HIV-Antigen im Kulturmedium unter Verwendung eines Doppel-Sandwich-ELISA (Hansen et al. (1990), supra) gemessen. Die Antigen-Konzentration wurde bezogen auf die Antigen-Konzentration an entsprechenden Tagen bei Kontrollkulturen von scheinbehandelten Zellen, die mit scheinbehandeltem HIV beimpft wurden. Die Infektionshemmung in U937-Zellen wurde auf ähnliche Weise nachgewiesen: 2 x 10&sup6; U937-Zellen wurden mit 25 CCID&sub5;&sub0; SSI-002 beimpft und anschließend in vier Parallelansätzen zwei Wochen lang kultiviert. Die Infektion von U937-Kulturen wurde am Tage 10 bewertet.
Die Ergebnisse sind in den Figuren 2 und 3 dargestellt. In Fig. 2 repräsentiert die Ordinate die HIV-Antigen-Produktion (% der Kontrolle) 4 Tage nach einer Infektion von MT4-Zellen mit HTLVIIIB, der mit MAb behandelt worden war. In Fig. 3 repräsentiert die Ordinate die HIV-Antigen-Produktion (% der Kontrolle) 10 Tage nach der Infektion von U937-Zellen mit dem MAb-behandelten HIV-1-Isolat SSI-002. In jeder der Figuren 2 und 3 repräsentiert die Abszisse die MAb-Konzentration bezogen auf das Virus-Impfgut (Nanogramm pro 50%- Zellkultur-Infektionsdosis).
Fig. 2 und 3 zeigen, daß gereinigter MAb KTH1-3 eine konzentrationsabhängige Hemmung der HIV-Infektion sowohl in Lymphozyten- als auch in Monozyten-Zellen bei Verwendung zwei verschiedener HIV-1-Stämme bewirkte. Die 80%-Wirkungsdosen der MAb KTH1-3 in den Lymphozyten- bzw. Monozyten-Zellsystemen betrugen 10-15 bzw. 40-500 ng pro 50%- Zellkultur-Infektionsdosis.

Spezifität der Hemmung

Ein Infektionsfähigkeits-Assay wurde wie oben durchgeführt nach einer Vorinkubation von entweder Virus oder Zellen mit MAb oder nach einer Vorinkubation von Virus oder Zellen mit MAb plus dem synthetisch hergestellten Tn-Antigen GalNAc-Ser (Biocarb, Lund, Schweden).
MT4-Zellen oder HTLVIIIB wurden mit 20 und 4 Nanogramm MAb KTH1 pro CCID&sub5;&sub0; oder PBS vorinkubiert. Vor der Beimpfung mit 25 CCID&sub5;&sub0; HTLVIIIB wurden die vorinkubierten Zellen sorgfältig gewaschen. Die Infektion am Tag 4 wurde ausgedrückt als HIV-Antigen-Konzentration in Kulturüberständen bezogen auf eine scheinbehandelte Kontrollkultur (%). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 als Mittelwerte von Vierfach- Bestimmungen dargestellt. TABELLE 2 Vorinkubation von Zellen
Tabelle 2 zeigt, daß die Hemmung der HIV-Infektion durch Anti-Tn- Antikörper (MAb KTH1) das Ergebnis einer Antikörperbindung an den Virus und nicht an Zellen war. Die Infektionshemmung wurde durch GalNAc-Ser (Tn-Antigen) aufgehoben. Dies bestätigt, daß die Infektionshemmung ein Ergebnis einer spezifischen Wechselwirkung von MAb mit Virus war.

Hemmung der Syncytien-Bildung

HTLVIIIB-infizierte H9-Zellen (2x10&sup4;) wurden 1 Stunde lang in 50 µl Wachstumsmedium, das 0, 5 oder 50 ng KTH1 enthielt, in einer Vertiefung einer Zellkulturpiatte mit 96 Vertiefungen vorinkubiert. Die 10&sup5; CEM-Zellen in 50 µl Wachstumsmedium wurden zugegeben. Nach einer gemeinsamen Kultur für 24 Stunden wurde die Gesamtzahl an Syncytien (vielkernige Riesenzellen mit "aufgeblähtem" Cytoplasma) mikroskopisch gezählt.
Die Ergebnisse, welche die Verringerung der Syncytien-Aktivität von HIV-infizierten und nicht-infizierten Lymphozyten durch Anti-Tn- MAb KTH1 zeigen, sind in Tabelle 3 dargestellt. TABELLE 3 Syncytien pro Vertiefung
Die Ergebnisse stützen die Erwartung, daß Tn-Antigene als Ziele für passive Immuntherapie unter Verwendung von Anti-Tn-Antikörpern dienen können.
Zwei erfindungsgemäße MAb, d.h. KTH1 (IgG) und KTH2 (IgM), sind für das Tn-Antigen spezifisch, während MAb KTH3 (IgM) ein Antikörper gegen das Tn-Antigen und das Sialosyl-Tn-Antigen ist. Für Immunisierungszwecke ist jedoch sialiertes Tn (NeuAcα2-6GalNAcα1-O- Ser/Thr) synthetisch viel schwieriger herzustellen als der unmittelbare Vorläufer Tn (GalNAca1-O-Ser/Thr). Es wurde festgestellt, daß alle drei MAb die HIV-Infektion in vitro hemmen. Die Hemmung wurde als konzentrationsabhängig befunden und war das Ergebnis einer epitopen-spezifischen (GalNAc-Serin) -Wechselwirkung mit Virus und nicht mit uninfizierten Zellen. Es wurde auch festgestellt, daß Anti-Tn-MAb die Syncytien-Bildung zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen hemmt.
Die antikörper-vermittelte Hemmung von HIV ist kürzlich durch Beobachtungen in Frage gestellt worden, daß einige Antikörper die Infektion von Monozyten/Makrophagen verstärken können (Matsuda et al. (1989), Scand. J. Immunol. 30:425; Robinson et al. (1989), PNAS 86:4710). Es ist jedoch festgestellt worden, daß die bei dieser Erfindung eingesetzten Anti-Tn-Antikörper nicht nur die Infektion von Lymphozyten (MT4-Zellen), sondern auch die Infektion von Monozyten (U937-Zellen) hemmten.
HIV-neutralisierende Antikörper werden bei HIV-infizierten Patienten gefunden und sind auch in vitro unter Verwendung ausgewählter synthetischer Peptide von gp120 und gp41 (Weber et al. (1989), Lancet i:119; Chanh et al. (1986), EMBO J. 5:3065; Lasky et al. (1986), Science 233:209) gebildet worden. Diese scheinen gegen das Fortschreiten der Krankheit nicht zu schützen und sind typenspezifisch. Es ist gezeigt worden, daß "Flucht"-Mutanten von HIV, die Mutationen im env-Gen enthalten, in vitro auftreten, wodurch der Virus der Wirkung von früher neutralisierenden Antikörper entkommen kann (Weiss (1988), J. Acq. Imm. Def. Syn. 1:536).
Die Anti-HIV-Reaktivität von Antiseren gegen infektiösen Pferdeanämie-Virus gegen einen Kohlenhydrat-Anteil der HIV-Hülle ist beschrieben worden (Montelaro et al. (1988), J. Gen Virol. 69:1711), aber die HIV-Neutralisierung durch Kohlenhydrat-spezifische Antikorper ist vorher nicht beschrieben worden. Es steht zu erwarten, daß Kohlenhydrat-Epitope durch Mutationen in dem für den Peptid- Anteil der HIV-Hülle kodierenden Genom nicht so leicht beeinflußt werden. So deuten die vorliegenden Ergebnisse darauf hin, daß virale Glycane als Ziele für die antivirale Immuntherapie und/oder Impfstoffentwicklung betrachtet werden können.

BEISPIEL 1 Anti-Tn-MAb und Hybridome

Isolierung von Immunogen

Sialidase-behandeltes Schafsunterkiefer-Mucin (OSM) wurde als Quelle des Tn-Antigens verwendet. Etwa 90% der Kohlenhydratkette auf OSM besteht aus dem Sialyl-Tn-Antigen, welches nach Sialidase- Behandlung in Tn-Antigen überführt wird.
OSM wurde aus Schafsunterkieferdrüsen durch übliche Methoden isoliert (Tettamanti und Pigman (1968), Arch. Biochem. Biophys. 124:45-50). Kurz gesagt, wurde ein wäßriger Extrakt von Unterkieferdrüsen bei saurem pH (z.B. 3,5) gefällt. Dies wird als Mucin-Klumpen bezeichnet. Der Mucin-Klumpen wurde zentrifugiert und in Wasser gelöst, der pH neutral eingestellt und eine fraktionierte Ethanolfällung in Natriumacetat durchgeführt.

Immunisierung und Etablierung von monoklonalen Antikördern

Das wie oben beschrieben isolierte Tn-Antigen mit höherem Molekulargewicht wurde in destilliertem Wasser in einer Menge von 1,0 mg Protein/4 ml Wasser gelöst und mit gleichen Volumina von Freundschem vollständigen und unvollständigen Adjuvans gemischt. Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 37ºC sorgfältig gemischt.
Aliquots von 200 µl (d.h. 200 µg des Glycoproteins und 400 µg Bakterien) wurden intraperitoneal in Balb/c-Mäuse injiziert. Einer ersten Injektion mit Freundschem vollständigen Adjuvans folgte zwei Wochen später eine Injektion von Freundschem unvollständigen Adjuvans. Eine letzte Wiederholung ("Boost") wurde intravenös ohne Adjuvans gegeben (100 µg in 200 µl Salzlösung).
Drei Tage nach der Wiederholungsinjektion wurden die Tiere getötet, die Milzzellen entfernt und Splenozyten mit Maus-Myelom-NS-1-Zellen durch übliche Verfahren fusioniert (Köhler et al., supra).
Hybridome, die auf selektiven Medien wuchsen, wurden durch übliche Verfahren für monoklonale Antikörper-Reaktivität mit dem oben beschriebenen OSM, desialiertem OSM und Glycophorin A gescreent. Glycophorin A wurde von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, bezogen.
OSM wurde durch Behandlung mit 0,1 Einheit/ml Neuraminidase aus Clostridium perfringens Typ X (Sigma) durch übliche Verfahren (Kjeldsen et al. (1988), supra) desialiert.
Es wurden etwa 40 Hybridome gefunden, die monoklonalen Antikörper sekretierten, der eine positive Reaktion mit desialiertem OSM ergab. Von diesen reagierten 32 auch mit OSM. Eine Kreuzreaktion zwischen desialiertem OSM (Tn-Antigen) und OSM (Sialosyl-Tn) wurde als überwiegend auftretendes Phänomen bei der Immunantwort der Maus (sowie des Kaninchens, siehe unten) auf die Immunisierung mit Tn- Antigen (desialiertem OSM) festgestellt. Fast alle Hybridome, die ausschließlich an desialiertes OSM binden oder mit OSM kreuzreagieren, waren in der Lage, in vitro die HIV-Infektion in dem Standard- Assay, wie detailliert beschrieben von Hansen et al. (1990), supra, zu neutralisieren. Darüber hinaus wurde die Tn-Antigen-Spezifität der MAb bestätigt durch Immunfluoreszenz-Histologie auf verschiedenen Schnitten mit bekannter Tn- und Sialosyl-Tn-Antigen-Verteilung (Hirohashi et al. (1985), supra). Diese Hybridome wurden in größerem Maßstab hergestellt und die Reaktivität der monoklonalen Antikörper erneut mit OSM, desialiertem OSM und Glycophorin A überprüft. Es wurden Hybridome gefunden, die monoklonale Antikörper mit starker Reaktivität gegen desialiertes OSM und keiner Reaktivität gegen Glycophorin A oder OSM sekretieren, sowie Antikörper, die Reaktivität sowohl gegen OSM als auch gegen desialiertes OSM zeigen.
Die Antigen-Quelle bei den ersten Studien waren Schaf-Mucine, die 90% Tn als antigenes Haupt-Epitop tragen. Mucine sind nicht nur große Glycoproteine, sondern es ist auch schwierig, sie bis zur Homogenität zu reinigen und über sie Strukturinformationen zu erhalten. Ferner verursacht der Schafsursprung Probleme für die Verwendung bei Human- Impfstoffen. Um diese Hindernisse zu beseitigen, wurde ein halbbiosynthetischer Weg zur Herstellung dieser Antigene entwickelt, wie im folgenden Beispiel beschrieben.

BEISPIEL 2 Biosynthetisches Tn-Antigen

Pedtidsynthese

In der Natur vorkommende Aminosäuresequenzen bis zu etwa 40 Aminosäurereste können aus den Aminosäurebestandteilen durch Standardverfahren synthetisiert werden. Bei diesem Beispiel wurden Sequenzen des OSM-Proteinkerns oder des GP120-HIV-Hüllproteins verwendet. Um das synthetisierte Peptid reversibel immobilisieren zu können, entschlossen wir uns, einen N&sub2;-terminalen Cysteinrest mit einer reaktiven SH-Gruppe einzuschließen, durch die das Peptid reversibel an z.B. TNB-Thiol-Agarose (Pierce, Illinois, USA) gekoppelt werden kann. Das Peptid enthält in diesem Fall Ser und Thr.
Solubilisierung und Isolierung von UDP-GalNAc: Polypedtid-α-N- acetylgalactosaminyltransferase
Eine geeignete Quelle der Transferase ist Rindervormilch oder Rinderthymus, diese Transferase ist jedoch in vielen tierischen und menschlichen Geweben sowie Zellinien (Elhammer et al. (1986) , J. Biol. Chem. 260:5249) vorhanden. Die Transferase kann mit Triton X- 100 solubilisiert und durch Affinitätschromatographie auf deglycosylierter-OSM-Sepharose wie von Elhammer et al. (1982), supra, beschrieben gereinigt werden. Als Alternative wurde festgestellt, daß z.B. Cibacron-Blau-Agarose (Sigma Chemicals) das aus Rinderthymus solubilisierte Enzym bindet und die Transferase mittels KCL eluiert werden kann. Ferner kann die Transferase an ein Serin/Threoninenthaltendes synthetisches Peptid gebunden werden, das über einen N-terminalen Cysteinrest an TNB-Thiol-Agarose gekoppelt ist, und mit EDTA und Salzen oder UDP eluiert werden. Eine Reinigung der Transferase und Aminosäuresequenzierung wird die cDNA-Klonierung des Transferasegens erlauben mit der anschließenden Möglichkeit, das rekombinante Transferaseprotein zu verwenden. Ferner wird die Klonierung des Gens die Transfektion und Expression der Transferase in einer Zelle zu erlauben, was es möglich macht, die Glycosylierung anderer rekombinanter Proteine, die durch Transfektion von cDNA exprimiert wurden, zu gestalten.

Glycosylierung eines synthetischen Pedtids. das Serin/Threonin- Reste enthält

Das immobilisierte Peptid (TNB-Thiol-Agarose) kann durch die Addition von α-N-Acetylgalactosamin aus UDP-GalNAc glycosyliert werden, katalysiert durch die UDP-GalNAc: Polypeptid-α-N-acetylgalactosaminyltransferase in Gegenwart von MnCl&sub2;. Für die vorliegenden Zwecke kann die Transferase bis zur Homogenität gereinigt werden oder in einem weniger reinen Zustand eingesetzt werden. Durch Inkubation der Peptid-Agarose mit der Transferase und UDP-GalNAc werden etwa 80% der Serin- und Threoninreste glycosyliert, wie durch Inkorporierung von [¹&sup4;C]GalNAc nachgewiesen. Nach der Glycosylierung kann die Agarose ausgiebig gewaschen werden und das gebildete Glycoprotein durch Reduktionsmittel (2-Mercaptoethanol oder DTT) freigesetzt werden: das Glycoprotein wird in homogener Form erhalten und kann einer Analyse zur Strukturbestätigung unterworfen werden, wie sie durch den Fachmann leicht bestimmt werden kann.

Herstellung von biosynthetischem Tn-Immunogen

Das hergestellte Tn-Glycopeptid kann an ein geeignetes Trägerprotein gekoppelt werden, indem die reaktive SH-Gruppe einer potentiellen N&sub2;-terminalen Cysteingruppe eingesetzt wird, wie z.B. von Pierce, Illinois, USA, beschrieben, unter Verwendung von Maleimid-aktiviertem Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin oder durch ein anderes verfügbares Verfahren, das durch den Fachmann leicht bestimmt werden kann.

Zusammenfassung

Es sind mit dem HIV-Hüllprotein GP120 assoziierte Kohlenhydrat- Epitope identifiziert worden, die normalerweise im menschlichen Organismus nicht exprimiert werden. Monoklonale Antikörper gegen diese Kohlenhydrat-Epitope neutralisieren in vitro sowohl die HIV- Infektion als auch die Syncytien-Bildung, was nahelegt, daß ein Impfstoff zumindest teilweise auf HIV-exprimierten Kohlenhydraten basieren könnte. Vorläufige Impfstoffuntersuchungen bei Kaninchen unter Verwendung dieser Kohlenhydrate stützen diese Idee.
Während Untersuchungen ursprünglich drei Kohlenhydrat-Epitope (Histo- Blutgruppe A, Leγ, und Sialosyl-Tn) identifizierten, legen die Daten nun nahe, daß das Kohlenhydrat-Antigen Tn ein äquivalentes oder besseres immunneutralisierendes Epitop ist.
Insbesondere neutralisieren die Anti-Tn-MAb KTH1 (IgG1) und KTH2 (IgM) die in vitro-HIV-Infektion und die Synctien-Bildung, während Anti-Tn-MAb KTH3 (IgM) mit Sialosyl-Tn kreuzreagiert und die HIV- Infekt ion und Syncytien-Bildung neutralisiert. Die Immunisierung von Kaninchen mit Tn-Antigen erzeugt einen HIV-immunneutralisierenden Effekt, wie durch den in vitro HIV-Infektionsassay bestimmt.
Das in Beispiel 2 beschriebene Konjugat sollte ähnliche Eigenschaften wie native Tn-Mucin-Antigene haben und sollte dieselbe humorale (Antikörper-) Antwort bei Tieren und Menschen hervorrufen. Es kann angenommen werden, daß bei Verwendung einer Peptid-Sequenz aus dem HIV-Hüllglycoprotein ebenfalls eine humorale und möglicherweise zelluläre Immunantwort gegen das HIV-Protein hervorgerufen werden wird.

Claims

1. Verwendung eines Antikörpers gegen das Kohlenhydrat- Antigen Tn zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Hemmung oder Verlangsamung des Fortschritts von AIDS oder ARC.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

3. Verwendung nach Anspruch 2, worin der Antikörper erhältlich ist aus einem Hybridom mit den charakteristischen Merkmalen des unter der Hinterlegungsnummer ECACC 90111401 hinterlegten.

4. Verwendung nach Anspruch 2, worin der Antikörper erhältlich ist aus einem Hybridom mit den charakteristischen Merkmalen des unter der Hinterlegungsnummer ECACC 90111402 hinterlegten.

5. Verwendung nach Anspruch 2, worin der Antikörper erhältlich ist aus einem Hybridom mit den charakteristischen Merkmalen des unter der Hinterlegungsnummer ECACC 90111403 hinterlegten.