DE69023648T2

DE69023648T2 - Herstellung eines virus und reinigung von virenüberzugsproteinen zur impfstoffverwendung.

Info

Publication number: DE69023648T2
Application number: DE69023648T
Authority: DE
Inventors: Anne-Marie Toronto On M4A 2T3 Bonneau; Barry Ian Thornhill On L4J 6J2 Caplan; Mary Elizabeth Willowdale On M2R 3N7 Ewasyshyn; Michel Henri Willowdale On M5A 3M2 Klein
Original assignee: Connaught Laboratories Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1990-06-28
Publication date: 1996-05-02
Anticipated expiration: 2010-06-29
Also published as: CA2056437A1; DK0480949T3; DE69023648T3; ATE130198T1; DK0480949T4; DE69023648D1; US6306637B1; JP2599503B2; ES2078971T3; EP0480949B2; JPH04502410A; CA2056437C; US6455050B1; GB8914968D0; EP0480949B1; WO1991000104A1; ES2078971T5; EP0480949A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und Reinigung von Hüll-Glycoproteinen, insbesondere dus der Familie der Paramyxoviridaefamilie von humanpathogenen Viren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Formulierung eines Gemisches der gereinigten Glycoproteine unter Bildung eines wirksamen und sicheren Impfstoffes zur Verwendung bei Babies und kleinen Kindern zum Schutz gegen die durch die Viren verursachten Krankheiten.

Hintergrund der Erfindung

Viren vom humanen Parainfluenzatyp 3 (PIV-3) und der Respiratory Syncytial Untergruppen A und B (RSV-A, B), die Vertreter der Paramyxoviridae sind, wurden als die hauptsächlichen Pathogenen identifiziert, die für schwere Atemwegserkrankungen bei Babies und kleinen Kindern verantwortlich sind. Es wurde gezeigt, daß sowohl Formaldehyd-inaktivierte und Lebend-attenuierte Impfstoffe keinen geeigneten Schutz gegen diese Erkrankungen in klinischen Versuchen geben können. Derzeit sind keine sicheren und wirksamen Impfstoffe für den Schutz gegen diese viralen Infektionen verfügbar. Daher ist die Entwicklung von wirksamen PIV-3 und RSV Impfstoffen dringend erforderlich.
Die hauptsächlich immunogenen Proteine von RSV und PIV-3 wurden identifiziert und gaben so einen wissenschaftlichen Ansatzpunkt für einen Versuch, auf der Basis von Untereinheiten einen Impfstoff zu entwickeln. Es wurde gezeigt, daß eine schützende in vivo Reaktion von der Induktion neutralisierender Antikörper gegen die hauptsächlichen viralen Oberflächenglycoproteine abhängt. Für PIV-3 sind diese schützenden Immunogene das HN Protein, das ein Molekulargewicht von 72 kDa aufweist und sowohl Hämagglutinin- als auch Neuraminidaseaktivität besitzt, und das F-Protein (Fusionsprotein), das ein Molekulargewicht von 65 kDa aufweist und sowohl für die Fusion des Virus mit der Wirtszellmembran als auch für die Weitergabe des Virus von Zelle zu Zelle verantwortlich ist. Immunogenitätsuntersuchungen in Hamstern zeigten, daß Antikörper sowohl gegen das HN-Protein als auch gegen das F-Protein für einen Schutz gegen einen Befall mit PIV-3 essentiell sind. Zusätzlich wurde berichtet, daß das Vorkommen der Antikörper gegen beide Hüll-Glycoproteine mit dem Schutz von Kindern zusammenhängt, die auf natürliche Weise mit PIV-3 infiziert wurden. R. Ray und R.W. Compans, J. Gen. Virol. (1987) 68: 409-418 isolierten und reinigten die HN- und F-Glycoproteine des humanen PIV-3. Die Reinigung der Glycoproteine wurde mit einer Immunaffinitätssäule erreicht. Die Antikörper auf den Säulen waren monoklonale Antikörper, die gegen die Glycoproteine erzeugt wurden. Die Viruspartikel für die Reinigung wurden in Nierenzellen vom Rhesusaffen (LLC-MK&sub2;) hergestellt, die in Dulbecco's Medium angezogen wurden, das 10 % hitzeinaktiviertes Serum von neugeborenen Kälbern enthielt. Das Antiserum wurde in Kaninchen gegen die immunaffinitätsgereinigten Glycoproteine HN und F erzeugt. Die Antiseren waren zur Hemmung der biologischen Aktivitäten des Virus fähig.
Bei RSV sind die zwei immunogenen Oberflächenglycoproteine das 80-90 kDa Glycoprotein (G) und das 70 kDa Fusionsprotein (F). Die G-und F-Proteine dürften jeweils zu den HN- und F-Proteinen von PIV-3 funktionell analog sein. Beim Menschen sind Antikörper gegen beide virale Oberflächenglycoproteine von PIV-3 zum Schutz gegen die PIV-3 Infektion notwendig, während anti-Fusionsproteinantikörper ausreichen, um eine über Kreuz schützende Reaktion gegen eine RSV Infektion hervorzurufen.
Eine detaillierte Diskussion über das Gebiet der Erfindung findet man im Lehrbuch Virology, B.N. Fields et al., Raven Press N.Y. (1985). Insbesondere Kapitel 52 Seiten 1241-1253 "Parainfluenza Viruses" von R.M. Chanock und K. McIntosh und Kapitel 54 Seiten 1285-1305 "Respiratory Syncytial Virus" von K. McIntosh und R.M. Chanock.
Gemäß der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung der PIV-3 und RSV Viren wie auch ein allgemeines Verfahren zur Reinigung von viralen Hüll-Oberflächenglycoproteinen entwickelt. Dieses Verfahren führt zu Präparationen, die potente PIV-3 Immunogene in Versuchstieren sind und könnten zur Verwendung als Impfstoffe bei Kindern annehmbar sein. Dieses Verfahren ist auch direkt auf die Herstellung von Viren und die Reinigung von Oberflächenglycoproteinen jedes Hüllvirus, wie Infuenza, anwendbar, bei dem die Haupthüllproteine beim Hervorrufen einer Immunantwort wichtig sind. Die Erfindung beinhaltet auch die hochgereinigten immunogenen Glycoproteine.
Bei der vorliegenden Erfindung werden Hüllviren, wie PIV-3 und RSV Viren in einer Gewebekultur auf Zellsubstraten angezogen, die leicht zur Verwendung bei der humanen Impfstoffherstellung annehmbar sind, wie die humane diploide Zellinie MRC-5 in einem Medium, das im wesentlichen frei ist von exogenen Serumproteinen. Überraschenderweise setzen die Zellen unter diesen Bedingungen die Bildung von PIV-3 für mehr als drei Wochen fort, wobei exogen zugegebene Faktoren gänzlich abwesend sind. Dieses Verfahren ermöglicht mehrfache Virusgewinnungen mit ähnlicher Antigenzusammensetzung, welche aus der selben Zellgruppe gewonnen werden können. Die Abwesenheit von exogenen Serumproteinen erleichtert das Reinigungsverfahren stark.
Virale Überstände werden entweder filtriert oder bei niedrigen Drehzahlen zentrifugiert, um den Zelldebris zu entfernen und erforderlichenfalls durch Ultrafiltration konzentriert. Das Virus wird dann durch Ultrazentrifugation pelletiert. Das Virus kann auch isoliert werden, indem man das Ultrafiltrationsretentat über eine Affinitätsmatrix führt, wie Cellufine-Sulfat. Die viralen Hüllglycoproteine werden dann mit einem geeigneten Detergenz aufgelöst (beispielsweise Triton X-100 oder Octylglycosid). Unlösliche virale Nukleokapside werden aus dem gelösten Material durch Zentrifugation entfernt. Wir zeigten, daß dieser Schritt, obwohl er brauchbar ist, nicht durchgeführt werden muß. Die viralen Oberflächenglycoproteine werden aus der Glycoprotein-angereicherten Fraktion durch Affinitätschromatographie gereinigt. Mögliche Affinitätsmatrizes beinhalten Linsenlektin und Concanavalin A, das kovalent an quevernetzte Sepharose oder celluloseartige mikroporöse Membranen gebunden ist. Kontaminierende zelluläre und verbleibende virale Matrixproteine werden im Durchfluß und in Waschschritten mit hohem Salzgehalt eliminiert. Die viralen Oberflächenglycoproteine werden dann von der Säule in Gegenwart eines geeigneten konkurrierenden Zuckers, wie Methyl-α-D-Mannopyranosid in Gegenwart oder Abwesenheit von Salz eluiert. Hochgereinigte Glycoproteinpräparationen (Beurteilt durch SDS Polyacrylamidgele, die mit Coomassie-Blau oder Silber gefärbt sind) werden in diesem Verfahren erhalten. Virale Oberflächenglycoproteine können auch durch Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von Glycoprotein-spezifischen monoklonalen Antikörpern gereinigt werden.
Gemäß dem vorliegenden Verfahren werden HN und F aus PIV-3 und F und G Proteine aus RSV affinitätsgereinigt. Die PIV-3 HN- und F-Proteine sind hochimmunogen, wenn sie in drei getrennten Tiermodellen, nämlich Meerschweinchen, Hamster und Baumwollratte getestet werden. Die Immunisierung von Tieren mit variierenden Dosen von MN und F rief eine starke anti-Glycoprotein-Antikörperreaktion hervor. Wenn sie mit den geeigneten Adjuvantien verabreicht werden, wie Freund's oder Aluminiumphosphat, kann die minimale immunschützende Dosis signifikant reduziert werden. Daher kann die schließliche Impfstoffpräparation, wenn sie mit Aluminiumphosphat als Adjuvans formuliert wird, als leicht injizierbare Präparation zur Verwendung beim Menschen verwendet werden.
Die Effektivität der Erfindung ist nicht nur auf die Präparation der von PIV-3 und RSV erhaltenen Glycoproteine beschränkt, sondern ist auf Hüllproteine von allen Paramyxoviridae und anderen Viren anwendbar. Unsere Erfindung umfaßt auch die Verwendung von ähnlichen Isolierungsverfahren und die Verwendung von anderen Adjuvantien, als die, die erwähnt werden.

BEISPIELE

Verfahren zur Bestimmung der Hämagglutination (HA), der Infektionsdosis&sub5;&sub0; für die Gewebekultur (TCID&sub5;&sub0;), der Hämagglutinationshemmung (HAI), der Neutralisations- und Antifusionstiter, welche in dieser Beschreibung nicht explizit beschrieben sind, sind ausführlich in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben und sind dem Fachmann bekannt.

Beispiel I:

Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von PIV-3 durch eine Säugerzellinie.
Eine Stammlösung des humanen PIV-3 Virus wird zur Infektion von MRC-5 Zellen verwendet, die auf Mikroträgerkügelchen in einer Bellco Kulturflasche angezogen werden. Eine 35 Liter Kultur von konfluent-wachsenden MRC-5 Zellen, die in einem Medium angezogen wurden, das 10 % fetales Rinderserum enthält, wurde abgekippt und die MRC-5 Zellen wurden dreimal jeweils mit 15 Litern CMRL 1969 Medium gewaschen, das 0,14 % NaHCO&sub3; enthielt. Die Zellen wurden dann mit PIV-3 Virus in einem Endvolumen von 10 Litern CMRL 1969 infiziert, das 0,14 % NaHCO&sub3; enthielt und das Virus konnte für 2 Stunden bei 37ºC unter Rühren an die Zellen adsorbieren. Nach der Adsorption wurden 25 Liter Medium in die Kulturflasche gegeben. Diese Bedingungen reduzierten die Serumproteine um das etwa 5 000fache, was zu einer Endkonzentration von weniger als 0,002 % führte. Die Zellen wurden bei 37ºC für 5 Tage inkubiert und der Virusüberstand wurde gewonnen. Etwa 35 Liter Medium CMRL 1969, das 0,2 % NaHCO&sub3; enthielt, wurde zu den Zellen gegeben und die Kultur wurde für weitere 3 Tage inkubiert und es wurde eine zweite Virusgewinnung erhalten. Dann wurden zusätzliche 35 Liter Medium zugegeben und die Zellen wurden für weitere 4 Tage vor der letzten Gewinnung inkubiert. Aliquots aller drei Virusüberstände wurden auf Infektiosität und HA Aktivität getestet. Die Infektiosität wurde in einem Standard-TCID&sub5;&sub0;-Test mittels VERO-Zellen bestimmt, während die HA Aktivität mittels roter Blutkörperchen vom Meerschweinchen bei 37ºC bestimmt wurde. Die Ergebnisse, in Tabelle 1 zusammengefaßt, zeigen deutlich, daß MRC-5 Zellen wesentliche Mengen an Virus bilden, wenn sie in relativer Anwesenheit von exogenen Serumproteinen kultiviert werden und daß dieselbe Gruppe der MRC-5 Zellen fähig ist, drei Virusgewinnungen zu liefern, wobei jede beträchtliche Virusmengen enthält. Das Verfahren wurde auch erfolgreich auf 150 Liter Bioreaktoren übertragen.

BEISPIEL II:

Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von gereinigtem PIV-3.
Der PIV-3 Überstand Nr. 2, der wie oben beschrieben erhalten wurde, wurde mittels Techniken verarbeitet, die leicht auf die Impfstoffproduktion in großem Maßstab anwendbar sind. Der Virusüberstand wurde zuerst durch Filtration geklärt. Es wurde eine Tangentialflußfiltration mit einer Sartorius Sartocon Mini Einheit verwendet, in die 0,3 m² einer 0,45 um Celluloseacetatmembran eingebaut waren. Nach der Klärung wurde das Virus durch Tangentialflußultrafiltration mittels eines Millipore Pellicon Systems konzentriert, worin 4 ft² einer PTHK Membran mit einer nominalen Molekulargewichtsausschlußgrenze von 100 000 eingebaut war. Das Pellicon-Retentat wurde dann durch eine 0,22 um Millipore Millipak 20 Einheit filtriert und das Virus wurde durch Ultrazentrifugation bei 100 000 x g für 1 Stunde bei 4ºC pelletiert. Das gereinigte Virus wurde in Puffer resuspendiert. Die HA und Infektiositätsergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Es wurde eine im wensentlichen vollständige Gewinnung der HA Aktivität und wesentliche Gewinnung der Virusinfektiosität während der anschließenden Verarbeitung erhalten. Die Ergebnisse zeigen die Tauglichkeit dieses Verfahrens für die PIV-3 Reinigung.

BEISPIEL III:

Dieses Beispiel erläutert die Reinigung der HN- und F-Proteine von PIV-3 durch Linsenlektin- oder Concanavalin-A-Sepharose-4B-Affinitätschromatographie.
Das pelletierte Virus wurde bei einer Proteinkonzentration von 1,5 mg/ml bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden mit 2 % V/V Triton X-100 behandelt. Alternativ dazu können andere Detergenzien, wie Octylglucosid oder eine Detergenzienkombination (2 % Triton X-100 + 2 % G/V Octylglucosid) zur Proteinextraktion verwendet werden. Falls erforderlich werden diese Präparationen anschließend gegen 0,02 % Triton X-100 dialysiert. Die unlöslichen Nukleokapsidkerne wurden dann durch Zentrifugation bei 15000 x g für 1 Stunde bei 4ºC entfernt. Die HN- und F-Proteine wurden aus dem Glycoprotein-angereicherten Überstand durch Affinitätschromatographie entweder auf einer Linsenlektin- oder Concanavalin-A-Sepharose -Säule gereinigt. Die Säule wurde dann zuerst mit 10 Bettvolumina PBS gewaschen, worin 0,02 % V/V Triton X-100 enthalten waren. Nach dem Auftragen der Probe wurde die Säule mit 10 Volumina PBS gewaschen, worin 0,02 % Triton X-100 enthalten waren. Danach folgte ein Hochsalzwaschschritt, der aus 10 Bettvolumina 0,35 M NaCl in PBS bestand, worin 0,02 % V/V Triton X-100 enthalten waren. Die HN- und F- Proteine wurden mit 5 Bettvolumina PBS eluiert, worin 0,02 % V/V Triton X-100 und 0,3 M Methyl-α-D-Mannopyranosid enthalten waren. Die eluierten Oberflächenglycoproteine wurden durch SDS-PAGE analysiert und durch Färben der Polyacrylamidgele mit Coomassie -Blau und Silber und Densitometrie zu mehr als 95 % sauber befunden.

BEISPIEL IV:

Dieses Beispiel erläutert die Reinigung der F- und G-Proteine von RSV unter Verwendung von Linsenlektin- oder Concanavalin-A-Sepharose-4B.
Pelletierte RSV (langer Stamm) wurden bei einer Proteinkonzentration von etwa 800 ug/ml bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden mit 2 % V/V Triton X-100 behandelt. Die unlöslichen Nukleokapsidkerne wurden dann durch Zentrifugation bei 15000 x g für 1 Stunde bei 4ºC entfernt. Die F- und G-Proteine wurden aus dem Glycoprotein-angereicherten Überstand durch Affinitätschromatographie entweder auf einer Linsenlektin- oder Concanavalin-A-Sepharose -Säule gereinigt. Das zur Proteinreinigung verwendete Verfahren war im wesentlichen zu dem identisch, was zur Reinigung der HN- und F-Proteine von PIV-3 verwendet wurde, wie dies in Beispiel III beschrieben wurde.
Die eluierten Oberflächenglycoproteine wurden durch SDS-PAGE analysiert und durch Färben der Polyacrylamidgele mit Silber zu mehr als 80 % sauber befunden.

BEISPIEL V:

Dieses Beispiel erläutert die Immunogenität der Linsenlektin-gereinigten PIV-3 Glycoproteine in Hamstern.
Vier Wochen alten weiblichen Hamstern (speziell pathogenfrei) wurden 1,0, 0,5 oder 0,1 ug der Linsenlektin-gereinigten HN- und F-Proteine intramuskulär injiziert, die wie in Beispiel III beschrieben präpariert wurden, und entweder alleine oder in Kombination mit Aluminiumphosphat oder Freund's Adjuvans verabreicht wurden. Unmittelbar nach der Blutentnahme nach 4 Wochen wurden die Tiere mit einer äquivalenten Dosis der Antigenformulierung nochmals immunisiert. Es wurden auch Serumproben 6 und 8 Wochen nach der ersten Injektion entnommen. HAI, Neutralisations- und Anti-Fusions-Titer wurden bestimmt (zusammengefaßt in Tabelle 3). Die Daten aus der ersten Blutentnahme (4 Wochen nach der ersten Dosis entnommen) zeigten, daß alle getesteten HN- und F-Formulierungen eine primäre Immunreaktion auslösen können. Die Einarbeitung von Aluminiumphosphat oder Freund's Adjuvans erhöhte die HAI und Neutralisationsantikörperreaktionen jeweils etwa 10 und 30fach. Die Tiere reagierten auf eine Dosis-abhängige Weise auf die Immunisierung mit 1,0, 0,5 oder 0,1 ug Antigen im Adjuvans. Die erneute Immunisierung zur Reaktionsverstärkung der Tiere nach 4 Wochen mit einer äqivalenten Dosis der Antigenformulierung führte zu einem deutlichen Anstieg der HAI, Neutralisations- und anti-Fusionstiter. Bei der Dosis von 1 ug Antigen waren die immunpotentierenden Effekte des Aluminiumphosphats und des Freund's Adjuvans deutlich. Daher wurde die Immunogenität der Linsenlektin-gereinigten HN- und F- Proteine deutlich gezeigt. Die Antikörperreaktionen in Meerschweinchen und Baumwollratten waren ähnlich.

BEISPIEL VI:

Dieses Beispiel erläutert die Immunogenität von Concanavalin A-gereinigten PIV-3 Glycoproteinen in Hamstern.
Hamstern (speziell pathogenfrei) wurden 1,0, 0,1, 0,05 oder 0,01 ug Concanavalin-gereinigte HN- und F-Proteine, wie in Beispiel III beschrieben hergestellt, in Gegenwart von Aluminiumphosphat injiziert. Die Tiere wurden gemäß dem in Beispiel IV dargelegten Plan immunisiert. Die Tiere, die mit Adjuvans- versetztem Concanavalin A-gereinigten Proteinen immunisiert wurden (die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt) reagierten auf eine Dosis-abhängige Weise auf die Primärinjektion von 1,0, 0,1, 0,05 oder 0,01 ug Antigen. Die minmal immunogene Dosis von mit Adjuvans-versetztem Concanavalin A-gereinigten Proteinen betrug 0,01 ug. Diese Ergebnisse betätigen die Immunogenität der Concanavalin A- gereinigten HN- und F-Proteine.

BEISPIEL VII:

Dieses Beispiel erläutert die Fähigkeit der verschiedneen HN- und F- Formulierungen zur Auslösung einer schützenden Reaktion bei immunisierten Hamstern und Baumwollratten.
Hamster, die mit 1,0, 0,5, 0,1 oder 0,01 ug der Linsenlektin-gereinigten HN- und F-Präparationen, wie sie in Beispiel III beschrieben wurden, immunisiert wurden, wurden mit lebenden PIV-3 Viren unmittelbar nach der Blutentnahme der achten Woche provoziert, um die Fähigkeit der verschiedenen HN- und F-Formulierungen zur Verleihung einer schützenden Immunität auszutesten. Die Hamster wurden 3 Tage nach der Provokation getötet und ihre Lungen wurden entnommen und homogenisiert. Die Viruslungentiter sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Kontrolltiere, verdünnter Elutionspuffer injiziert wurde, wiesen 5,0 log&sub1;&sub0; TCID&sub5;&sub0; Einheiten Virus pro Gramm Lungengewebe auf. Bei Abwesenheit von Adjuvans wiesen 75 % der Tiere, die mit 1 ug HN- und F-Proteinen immunisiert wurden, eine detektierbare Virusmenge in ihren Lungen auf. Wenn HN und F mit Aluminiumphosphat oder Freund's Adjuvans verabreicht wurden, schützten zwei 0,1 ug Antigendosen alle Hamster gegen die Provokation mit dem lebenden Virus. Es wurde kein Virus in den Lungenhomogenaten detektiert. Ähnliche Ergebnisse wurden in Baumwollratten erhalten.
Concanavalin A-gereinigte HN- und F-Proteine waren ebenfalls zur Auslösung einer schützenden Reaktion in immunisierten Hamstern fähig. Zwei 0,01 ug Dosen von Concanavalin A-gereinigten Proteinen, hergestellt wie in Beispiel III beschrieben, kombiniert mit Aluminiumphosphat) schützten 80 % der Tiere gegen die Provokation mit dem lebenden Virus. Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit sowohl von Linsenlektin-gereinigten als auch Concanavalin A-gereinigten HN- und F-Proteinen den unteren Respirationstrakt der Tiere gegen eine Provokation mit lebendem Virus zu schützen.
Die Fähigkeit der Affinitäts-gereinigten HN- und F-Proteine, den oberen Respirationstrakt immunisierter Tiere gegen eine Provokation mit einem lebenden Virus zu schützen, wurde ebenfalls getestet. Die Virustiter aus nasalen Waschungen sind in Tabelle 6 gezeigt. Der obere Respirationstrakt von Tieren, die mit 1 ug Dosen der mit Adjuvans-versetzten Concanavalin A-gereinigten Proteine, hergestellt wie in Beispiel III beschrieben, immunisiert wurden, war gegen die PIV-3 Infektion geschützt. Es wurde kein Virus in nasalen Waschungen von dieser Tiergruppe detektiert. Dies war die einzige getestete Tiergruppe, die einen signifikanten Schutz im oberen Respirationstrakt nach einer Provokation mit einem lebenden Virus zeigte. Daher können Concanavalin A-gereinigte HN- und F-Proteine, die in einer Dosis von 1 ug mit Aluminiumphosphat verabreicht werden, eine immunologische Reaktion hervorrufen, die zum Schutz sowohl des oberen als auch des unteren Respirationstrakts von Hamstern gegen eine Provokation mit lebendem Virus fähig ist.

BEISPIEL VIII:

Dieses Beispiel erläutert, daß die verschiedenen HN- und F-Formulierungen keine "verstärkte" Histopathologie in den Lungen von immunisierten Baumwollratten nach einer PIV-3 Provokation verursachen.
Baumwollratten wurden mit 1,0 oder 0,1 ug Linsenlektin-gereinigten HN- und F-Proteinen, hergestellt wie in Beispiel III beschrieben, entweder alleine oder mit Aluminiumphosphat immunisiert. Die Tiere wurden intranasal mit 100 mittelinfektiösen Dosen PIV-3 direkt nach der Blutentnahme der achten Woche provoziert. Vier Tage nach der Virusprovokation wurden die Baumwollratten getötet und die Lungenschnitte wurden zur histopathologischen Analyse präpariert. Die Lungenschnitte aus immunisierten Tieren und Kontrolltieren wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, durch Doppelblindtechnik untersucht und auf Histopathologie geprüft. Die beobachteten histopathologischen Veränderungen korrelierten im allgemeinen mit den Lungenvirustitern und variierten entgegengesetzt zu HAI und neutralisierenden Antikörpermengen. Tiere, die mit einem Plazebo immunisiert wurden und dann mit PIV-3 provoziert wurden, hatten die erwähnenswertesten histopathologischen Veränderungen. Schnitte der Lungen aus diesen Tieren zeigten moderate bis deutliche peribronchiale und peribronchioläre Lymphozyteninfiltration, die mit polymorphnukleären Leukozyten und Makrophagen durchsetzt waren. Viele der untersuchten Bronchien und Bronchiolen waren teilweise enthäutet und das Lumen dieser Luftwege enthielt oft ein Gemisch aus Debris, Leukozyten und serösem Exsudat. Teilweise wurden vereinzelte Mikroareale an interstitieller Pneumonie und perivaskulärer Auskleidung beobachtet. Im Gegensatz dazu waren die pathologischen Veränderungen bei Tieren minimal, die mit schützenden Antigendosen immunisiert wurden. Am wichtigsten war, daß keine Evidenz für eine verstärkte Pathologie in Lungenschnitten aller immunisierter Tiergruppen gegeben war, wenn sie vier Tage nach der Virusprovokation untersucht wurde. In keinem Fall war die Histopathologie größer in immunisierten, provozierten Tieren, als in Kontrolltieren, die mit Plazebo immunisiert und dann mit PIV-3 provoziert wurden. Es kann daher gefolgert werden, daß der Impfstoff der Affinitäts-gereinigten HN- und F-Untereinheiten keine kurzzeitigen immunpathologischen Effekte hat. Tabelle 1 PI-3 Virusproduktion HA AKTIVITÄT TCID&sub5;&sub0; AKTIVITÄT PROBE VOLUMEN (ml) HAU/ 0,5 ml Gesamt Titer/ml Überstand Nr. Tabelle 2 Reinigung des PI-3 Virus HA AKTIVITÄT TCID&sub5;&sub0; AKTIVITÄT PROBE Gesamteinheiten % Ausbeute Gesamt Überstand Geklärt Retentat Filtriertes Retentat k Pellet TABELLE 3 Serumantikörperreaktion bei Hamstern, die mit verschiedenen Linsenlektin-affinitätsgereinigten HN- und F-Formulierungena immunisiert wurden Neutralisationc Anti-Fusiond Primär Sekundär Antigen Formulierung Dosis Wochen Blutung Kontrolle alleine Freund's a = Jeder Wert stellt das reziproke geometrische Mittel des Titers aus 6 Tieren dar. b = Serumverdünnung, die die Erythrozytenagglutination um 4 Hämagglutinationseinheiten von PIV-3 hemmt. c = Serumverdünnung, die die Hämadsorption von 100 TCID&sub5;&sub0; Einheiten von PIV-3 blockiert. d = Serumverdünnung, die die Syncytienbildung von 100 TCID&sub5;&sub0; Einheiten von PIV-3 blockiert. TABELLE 4 Serumantikörperreaktion von Hamstern, die mit verschiedenen Linsenlektin-affinitätsgereinigten HN- und F-Formulierungen immunisiert wurden Neutralisationb Primär Sekundär Antigen Formulierung Dosis Wochen Blutung Kontrolle alleine a = Serumverdünnung, die die Erythrozytenagglutination um 4 Hämagglutinationseinheiten Para-3 Virushemmt. b = Serumverdünnung, die die Hämadsorption von 100 TCID&sub5;&sub0; Einheiten des Para-3 Virus blockiert. Tabelle 5 Reaktion von immunisierten Hamstern auf die PIV-3 Provokationa (unterer Respirationstrakt) HN und F Formulierung Antigendosis (ug) % Tiere mit Virus (b) Mittlerer Titer ± SEM log&sub1;&sub0; TCID&sub5;&sub0; Elutionspuffer HN und F alleine HN und F + Aluminiumphosphat HN und F + Freund's Linsenlektin-gereinigt Concanavalin A-gereinigt a = Die Tiere wurden mit 10&sup6; TCID&sub5;&sub0; Einheiten PIV-3 provoziert und 3 Tage später getötet b = Minimale Menge der Detektierbarkeit war 101,9 TCID50/g Lungengewebe. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert von 6 Tieren. Tabelle 6 Reaktion von immunisierten Hamstern auf die PIV-3 Provokationa (oberer Respirationstrakt) HN und F Formulierung Antigendosis (ug) % Tiere mit Virus (b) Mittlerer Titer ± SEM log&sub1;&sub0; TCID&sub5;&sub0; Elutionspuffer HN und F alleine HN und F + Aluminiumphosphat HN und F + Freund's Linsenlektin-gereinigt Concanavalin A-gereinigt a = Die Tiere wurden mit 10&sup6; TCID&sub5;&sub0; Einheiten PIV-3 provoziert und 3 Tage später getötet b = Minimale Menge der Detektierbarkeit war 101,9 TCID50/ml nasaler Waschung. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert von 6 Tieren.

Claims

1. Verfahren zum Isolieren eines immunogenen Glycoproteins, umfassend das Züchten eines komplexen Virus, bei dem mindestens ein Hüll-Glycoprotein in der Lage ist, eine immunogene Antwort hervorzurufen, in einer Gewebekultur, die im wesentlichen frei ist von exogenen Wachstumsfaktoren und Serumproteinen, auf einem Zellsubstrat, das geeignet ist zur Bildung eines Humanimpfstoffs, Isolieren des Virus von der Gewebekultur, Löslichmachen des mindestens einen Hüll-Glycoproteins von dem Virus und Isolieren des mindestens einen Hüll-Glycoproteins.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zellsubstrat eine diploide Zellinie ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Zellsubstrat die menschliche diploide Zellinie MRC-5 ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Virus PIV-3 ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das mindestens eine Hüll-Glycoprotein Glycoprotein HN und Glycoprotein F ist, die getrennt isoliert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Virus RSV ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das mindestens eine Hüll-Glycoprotein Glycoprotein F und Glycoprotein G ist, die getrennt isoliert werden.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine virale Hüll-Glycoprotein in einer immunogen-aktiven Form isoliert wird durch Affinitätschromatographie.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das mindestens eine virale Hüll-Glycoprotein in immunogen-aktiver Form isoliert wird durch Immuno-Affinitätschromatographie.

10. Immunogen-aktiv gereinigtes virales Hüll-Glycoprotein, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 1.

11. Verfahren zum Züchten eines komplexen Virus, bei dem mindestens ein Hüll-Glycoprotein in der Lage ist, eine immunogene Antwort hervorzurufen, umfassend das Züchten des Virus in einer Gewebekultur, die im wesentlichen frei ist von exogenen Wachstumsfaktoren und Serumproteinen auf einem Zellsubstrat, das geeignet ist zur Verwendung bei der Erzeugung eines Humanimpfstoffs.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Zellsubstrat eine diploide Zellinie ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die diploide Zellinie eine menschliche diploide Zellinie ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die menschliche diploide Zellinie MRC-5 ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das Virus eines aus der Paramyxoviridae-Familie ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das Virus PIV-3 ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das Virus RSV ist.

18. Verfahren zur Erzeugung eines Impfstoffs gegen ein komplexes Virus, umfassend das Züchten eines komplexen Virus, bei dem mindestens ein Hüll-Glycoprotein in der Lage ist, eine immunogene Antwort hervorzurufen, in einer Gewebekultur, die im wesentlichen frei ist von exogenen Wachstumsfaktoren und Serumproteinen, auf einem Zellsubstrat, das geeignet ist zur Verwendung bei der Bildung eines Humanimpfstoffs, Isolieren des Virus von der Gewebekultur, Löslichmachen des mindestens einen Hüll- Glycoproteins von dem Virus und Isolieren des mindestens einen Hüll-Glycoproteins und Zubereiten des Glycoproteins zu einem Impfstoff.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Zellsubstrat eine diploide Zellinie ist.