DE69021725T2

DE69021725T2 - Zusammensetzung auf der basis von proanthocyanidolen und ihre pharmazeutische anwendung.

Info

Publication number: DE69021725T2
Application number: DE69021725T
Authority: DE
Inventors: Daniel Jean
Original assignee: INST SUBSTANCES VEGETALES
Current assignee: INST SUBSTANCES VEGETALES
Priority date: 1989-05-12
Filing date: 1990-03-23
Publication date: 1996-04-18
Anticipated expiration: 2010-03-24
Also published as: EP0472531A1; DE69021725D1; EP0472531B1; ES2078339T3; JPH05504937A; CA2057023A1; AU648754B2; OA09558A; DK0472531T3; WO1990013304A1; ATE126439T1; AU5400090A

Description

Die Erfindung betrifft Zusmmensetzungen auf Basis von Proanthocyanidolen und auch deren Verwendung in pharmazeutischen Zuammensetzungen.
Die Proanthocyanidole gehören zur Familie der Polyphenole, die dafür bekannt sind, daß sie sich in sehr unterschiedlichem Ausmaß an Proteine binden können.
Die Polyphenole tragen allgemein zur Bildung von Tanninen bei, welche insbesondere bei gewissen Pflanzen vorkommen.
Die Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen, welche bestimmte Tanninklassen, genannt Katechin-Tannine (Synonym von Proanthocyanidolen oder Procyanidolen), enthalten. Sie bezieht sich genauer auf Polymere von Katechin-Tannin.
Bis jetzt war im allgemeinen die Fähigkeit bestimmter pflanzlicher Rohextrakte, enthaltend verschiedene Tannine, bekannt, eine antiseptische, ja sogar zuweilen antivirale Wirkung zu zeigen.
Gewisse, in oligomerer Form vorliegende Tannine wurden wegen ihrer venotonischen Eigenschaften verwendet. Bis jetzt bestanden die Katechin- oder anderen pharmazeutisch verwendbaren Tannine im allgemeinen aus Oligomeren (mit Molekulargewichten von allgemein weniger als 1000). Man entfernte systematisch die Tannine mit höheren Molekulargewichten (MG), insbesondere die Polymere. Man bedenke, daß beispielsweise bei den Gal lotanninen (eine weitere, beispielsweise bei Pflanzen vorkommende Tanninfamilie) die Zytotoxizität mit dem Molekulargewicht zunimmt, was ihre Verwendung nicht begünstigt.
Die Erfinder haben nun festgestellt, daß Katechin-Tannine mit höherem Molekulargewicht, welche in Form von Polymeren vorliegen, sich wegen ihrer pharmakologischen Eigenschaften als interessant erweisen können.
In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung auf Basis von Proanthocyanidolen, insbesondere aus pflanzlicher Herkunft, gekennzeichnet dadurch, daß ein Gewichtsanteil von mindestens 50 % der Moleküle ein scheinbares Molekulargewicht von größer als 2000 hat, wobei dieser Anteil zumindest aus 40 % Proanthocyanidolen besteht und der Prozentsatz in Abhängigkeit von der Gerbung ausgedrückt wird und wobei diese Zusammensetzung im wesentlichen frei ist von:
- aromatischen Essenzen und insbesondere essentiellen Ölen, Harzen und anderen lipophilen Substanzen,
- polymerisierten Zuckern, wie beispielsweise Stärke, den Gummis, den Cellulosederivaten,
- oligomeren Zuckern, wie beispielsweise die Saccharose, die Glucose, die Levulose.
Methoden, die insbesondere zur Auswahl von Zusammensetzungen, welche Proanthocyanidole enthalten und der obigen Definition entsprechen, verwendet werden, sind beispielsweise folgende:
a/ Zur Bestimmung des Grades der Gerbwirkung von Proanthocyanidolen der obigen Verbindungen könnte man die folgende quantitative Bestimmung durchführen, welche einerseits aus einer quantitativen Bestimmung der Polyphenolwirkung und andererseits aus einer quantitativen Bestimmung der Gerbwirkung besteht.

1. - Quantitative Bestimmung der Polyphenolwirkung:

Bei dieser quantitativen Bestimmung macht man sich die Eigenschaft der Polyphenole, Phosphorwolframsäure zu reduzieren, zunutze. Die quantitative Bestimmung wird gemäß den Normen der französischen pharmakopöe, 9. Ausgabe, durchgeführt.

Phosphorwolframsäurereagens (A):

10 g Natriumwolframat werden mit 8 ml Orthophosphorsäure und 75 ml entionisiertem Wasser während 3 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Man läßt es abkühlen und füllt mit entionisiertem Wasser auf 100 ml auf. 15% Natriumcarbonatlösung in entionisiertem Wasser: Reagens B.
50 mg der Probe, welche das zu bestimmende Proanthocyanidol enthält, werden abgewogen und in genau abgemessenen 10 ml Wasser gelöst.
2 ml werden dieser Lösung entnommen und in einem geeichten Becherglas auf 25 ml verdünnt, (Lösung C).
In einem auf 50 ml geeichten Becherglas werden eingefüllt:
Lösung C: 5 ml
Reagens A: 1 ml
Reagens B: q.s. 50 ml.
Die optische Dichte (O.D.) bei 715 nm wird genau 2 Minuten nach der Beimischung des letzten Reagens abgelesen. In gleicher Weise wird mit einer Reihe steigender Mengen an Pyrogallol (0 bis 50 mg) als Bezugssubstanzen verfahren und die optische Dichte, welche mit jeder dieser erhalten wird, gemessen. Der Proanthocyanidolgehalt der untersuchten Probe wird unter Bezug auf die Menge Pyrogallol (gemessene Menge) ausgedrückt, welche unter denselben Analysebedingungen zur selben Messung der O.D. führen würde. Die Bestimmung dieser Pyrogallolmenge wird unter Bezugnahme auf die Meßergebnisse gemacht, welche unter den obgenannten Bedingungen mit zur Bezugnahme verwendeten ansteigenden Pyrogallolmengen gemacht wurden.

2. - Quantitative Bestimmung der Gerbwirkung:

Eine wässerige Lösung von Proanthocyanidol, hergestellt wie die Lösung C oben. Sodann wird die quantitative Bestimmung der Polyphenolwirkung wie oben angegeben durchgeführt. Daraufhin werden 5 ml der Lösung während einer Stunde bei Raumtemperatur mit 1 g Pulver von mit Chrom vorbehandelter Haut (Merck Bez. 4332) gerührt; dann wird die Lösung durch Papier filtriert.
Sodann wird eine quantitative Bestimmung der gesamten Poiyphenolwirkung auf dem Filtrat wie oben durchgeführt. Die Gerbwirkung stellt die Differenz zwischen dem für die gesamten Polyphenole gefundenen Wert und dem auf dem Filtrat, welches durch das Hautpulver abgetrennt wurde, gefundenen Wert dar.
b) Zur Bestimmung der Fraktion der Proanthocyanidole, von welchen das scheinbare Molekulargewicht oberhalb 2000 liegt, könnte man folgende Methode zur Bestimmung des Molekulargewichts benützen:
Man führt zuerst eine Hochleistungs-Ausschlußchromatographie auf Gel uBondagel 125 (Waters) in einem aprotischen Lösungsmittel gegen Polystyrolbezugsproben (Aidrich) durch.
Ausstrom: isokratisch 0,5 ml/Minute
Lösungsmittel: Chloroform-Dimethylsulfoxid 50-50 (V/V)
Bestimmung: O.D. bei 283 nm
Konzentration der Bezugsproben: 1 mg/ml im gleichen Lösungsmittel; Konzentration von Proanthocyanidol: 0,05 mg/ml im gleichen Lösungsmittel
Molekulargewicht der Bezugsproben: 184.200, 50.000, 24.150, 7.025, 4.136 und 2000
Die Bezugsprobe mit dem Molekulargewicht von 184.200 wird als Bezugsprobe zum vollständigen Ausschluß auf dem Gel verwendet. Diese Gelart hält tatsächlich keine Molekulargewichte oberhalb 50.000 zurück. Sodann wird die relative Retentionszeit jeder Probe in Bezug auf die vollständig ausgeschlossene Bezugsprobe berechnet.
Man zieht die Verbindungskurve zwischen den Zehnerlogarithmen der Molekulargewichte der Bezugsproben und den entsprechenden relativen Retentionszeiten. Das Molekulargewicht der vorliegenden Proanthocyanidole wird durch Vergleich der für sie gemessenen Retentionszeit und der Retentionszeit der Bezugsproben gemessen. Diese Methoden werden lediglich beispielhaft angeführt.
Andere Methoden, welche die Bestimmung des Verhältnisses von Proanthocyanidolen in einer gegebenen Verbindung erlauben und auch zu einer Angabe des Gewichtsverhältnisses der vorliegenden Proanthocyanidole führen, werden natürlich zur Durchführung der Erfindung verwendet.
Ziel der Erfindung ist auch eine Zusammensetzung auf Basis von Proanthocyanidolen, entsprechend den obigen Definitionen, dadurch gekennzeichnet, daß sie unter anderem im wesentlichen frei ist von:
- pflanzlichen Proteinen,
- Gal lussäuren und Gallotanninen,
- Flavonoiden, soweit sie nicht zur Familie der Flavan- Diole gehören
- Flavandiole-Oligomere
- Phenolsäuren.
Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 95 Trockengewichts-% proanthocyanidole enthalten.
Nach einem weiteren bevorzugten Aspekt der Erfindung sind die Zusammensetzungen auf Basis von Proanthocyanidolen dadurch gekennzeichnet, daß die Proanthocyanidole ein Molekulargewicht zwischen etwa 2000 ± 500 und etwa 55000 ± 5000 haben.
Eine besonders interessante Zusammensetzung enthält vorzugsweise Proanthocyanidole eines Molekulargewichts von etwa 45000 ± 5000.
Andere besonders interessante Zusammensetzungen sind Zusammensetzungen enthaltend Proanthocyanidole mit einem Molekulargewicht von etwa 5000 ± 500 oder Zusammensetzungen enthaltend Proanthocyanidole mit einem Molekulargewicht von etwa 3000 ± 300.
Die Reinheitsbestimmung des Proanthocyanidolpolymers in einem gewählten Molekulargewichtsbereich kann unter Anwendung einer Gelchromatographie mit Hilfe einer organischen Membran mit einer festgelegten Ausschlußgrenze, beispielsweise einer Membran aus Polyethersulfon oder Polyvinylidendifluorid, durchgeführt werden. Die das Durchführungsprotokoll betreffenden Details sind in den Beispielen angeführt.
Die zur Durchführung der Erfindung verwendeten Zusammensetzungen sind nach einer anderen Definition dadurch gekennzeichnet, daß sie Proanthocyanidole in polymerer Form entsprechend der folgenden Formel umfassen:
worin n eine ganze Zahl oberhalb oder gleich 3 ist und vorzugsweise zwischen 3 und 350 liegt,
R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; sind jeweils oder unabhängig voneinander Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Methoxygruppe und wobei es sich bevorzugterweise um Polymere von Proanthocyanidol handelt, in denen R&sub1;, R&sub2;, R&sub4; und R&sub5; Hydroxylgruppen sind und R&sub3; Wasserstoff ist, oder wobei es sich um Polymere von Prodelphinidol handelt, bei dem R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; Hydroxylgruppen sind, oder wobei es sich um Polymere von Promalvidol handelt, bei dem R&sub1; und R&sub3; Nethoxygruppen und R&sub2;, R&sub4; und R&sub5; Hydroxylgruppen sind.
Die erfindungsgemäßen Proanthocyanidolpolymere können entweder in linearer Form vorliegen oder noch vernetzt angeordnet sein. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können aus einer oder mehreren Arten Proanthocyanidolen gebildet werden, insbesondere da diese Zusammensetzungen Extrakte sind, die ausgehend von einem pflanzlichen Material erhalten wurden, es können mehrere Arten an Polymeren in der Zusammensetzung vorliegen und ihre Verteilung ist nicht notwendigerweise konstant, je nach verwendetem pflanzlichen Ausgangsmateial.
Auf eine besonders interessante Weise beinhalten die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen Proanthocyanidole, welche abhängig vom Molekulargewicht und der Molekülart eine gewisse Wasserlöslichkeit aufweisen.
Da diese Zusammensetzungen pflanzliche Extrakte sind, können sie ausgehend von jedem Pflanzenmaterial von pflanzen, welche reich an Proanthocyanidolen mit einem Molekulargewicht von mehr als 2000 sind, und welche in Hinblick auf die Durchführung der quantitative Bestimmungsverfahren der polyphenol ischen und gerbenden Wirkungen geeignet sind, Zusammensetzungen mit den obgenannten Eigenschaften zu ergeben.
Man kann daher beispielsweise für als Proanthocyanidolquelle verwendbare Pflanzenarten die Koniferen, wie Cupressus sempervirens, Pinus maritima, die Zingiberaceen, wie Alpinia galanga, die Pflanzen mit Procyanidolen, Pflanzen mit Prodelphinidolen, wie Vitis vinifera, Vaccinum myrtillus, Fragraria vesca und seltenere Pflanzen mit Proanthocyanidolen, wie die Pflanzen mit Prosetinidol der Gattung Schinopsis und mit Proguibourtinidolen, Extrakte aus verschiedenen Akazien.
Es können auch Pflanzen aus der Familie der Mimosacaeen angeführt werden.
Ziel der Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform sind natürlich die Zusammensetzungen, welche mehrere Pflanzenextraktarten entsprechend den angeführten Definitionen enthalten.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung aus Proanthocyanidolen ausgehend von einem Pflanzenteil, das Proanthocyanidole mit einem Molekulargewicht größer als 2000 enthält, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß es die folgenden Schritte umfaßt:
- Abkochen oder Auslaugen in einem Alkohol, insbesondere Methanol oder Ethanol, um Polysaccharide, insbesondere Stärke zu eliminieren,
- Gewinnung der wässerig-alkoholischen Extrakte und Eindampfen zur Trockene unter vermindertem Druck, gegebenenfalls gefolgt von Waschen und Gewinnung des trockenen Rückstandes,
- Aufnehmen des trockenen Rückstandes und Filtration, um einen Teil der aromatischen Fraktion des Extrakts zu eliminieren,
- Extraktion im Gegenstrom mittels aufeinanderfolgend mindestens drei Lösungsmitteln zunehmender Polarität, insbesondere Ethylether, Ethylacetat, Butanol oder Methanol, insbesondere um verbleibende aromatische Essenzen, den größten möglichen Teil der Oligomere mit einem MG unterhalb von 2000 und der Monomere des Proanthocyanidols zu eliminieren und um in der alkoholischen Phase einen pflanzlichen Extrakt zu gewinnen, der Proanthocyanidole mit einem Molekulargewicht oberhalb von 2000 enthält,
gegebenenfalls Reinigung des erhaltenen Extrakts, um verbleibende Lösungsmittel zu eliminieren.
Der Reinigungsschritt kann aus einer Dyafiltration mit entionisiertem Wasser bestehen, um den größten Teil des Lösungsmittels zu eliminieren. Diese Arbeitsweise wird beispielsweise durchgeführt, indem man die Flüssigkeit kontinuierlich bei niedriger Temperatur, insbesondere bei 4ºC, abkühlt.
Zur Produktkonservierung nach Entfernen des Lösungsmitteis bietet sich eine Möglichkeit an, welche darin besteht, daß man die wässerige Lösung-Suspension von Proanthocyanidolpolymeren so weit wie möglich einengt und dann lyophilisiert. Die Konservierung kann auch in Form eines kristallisierten Produkts, ausgehend von der wässerigen Lösung-Suspension, erzielt werden.
Die Extraktion wird vorzugsweise solcherart durchgeführt, daß der Abbau der Proanthocyanidole vermieden wird. Um dies zu erreichen, ist es vorteilhaft, zu hohe Temperaturen zu vermeiden und die mit den Proanthocyanidolverbindungen in Berührung kommende Sauerstoffmenge zu verringern. Die Extraktion und die weiteren Schritte können somit unter Inertatmosphäre, beispielsweise unter Stickstoff, durchgeführt werden.
Zur Entfernung der Proanthocyanidole mit einem Molekulargewicht von weniger als 2000 kann man folgende Methode anwenden: die mittels verschiedener verwendeter Lösungsmittel extrahierte Fraktion wird auf einer organischen Membran und insbesondere einer Membran der Polyethersulfonart oder einer Membran aus Polyvinylidendifluorid, deren Ausschlußgrenze in Abhängigkeit von der Proanthocyanidolfraktion, die man zu eliminieren wünscht, ausgewählt ist, ultrafiltriert. Am Ende der Durchführung erhält man eine konzentrierte Lösung von auf der Membran zurückgehaltenen Polymeren und eine verdünnte Lösung der Produkte mit niedrigerem Molekulargewicht als jenes der Ausschlußgrenze.
Diese Schritte können gegebenenfalls von einem Schritt des Waschens gefolgt sein, bis man einen Gehalt an leichten Produkten von weniger als 10%, vorteilhaft weniger als 5% und vorzugsweise weniger als 1% in Bezug auf die erhaltene trockene Endsubstanz erhält.
Ein anderes besonders vorteilhaftes Verfahren zur Herstel lung von Proanthocyanidolzusammensetzungen ausgehend von einem Pflanzenteil, enthaltend Proanthocyanidole mit einem Nolekulargewicht oberhalb von 2000, umfaßt die folgenden Schritte:
- Abkochen oder Auslaugen in einem Alkohol, insbesondere Methanol oder Ethanol, um Polysaccharide, insbesondere Stärke zu eliminieren,
- Ultrafiltration der wässerig-alkoholischen Lösungen durch eine organische Membran, die eine Porosität aufweist, welche eine Ausschlußgrenze oberhalb 2000 Dalton hat für ein globuläres Protein, das in einer wässerigen Lösung ultrafiltriert wird,
- Gewinnung der wässerig-alkoholischen Extrakte und Eindampfen zur Trockene unter vermindertem Druck, gegebenenfalls gefolgt von Waschen und Gewinnen des trockenen Rückstandes.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann das oben beschriebene Verfahren, ausgehend von einem pflanzlichen Ausgangsmaterial bestehend aus Zapfen von Cupressus sempervirens oder ausgehend von frischen Rhizomen von Alpinia galanga, durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind in dem Maße besonders interessant, wo sie der Zytotoxizität beraubt sind und daher in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können. Darüberhinaus haben die Erfinder die Fähigkeit der Proanthocyanidole dieser Zusammensetzungen festgestellt, sich an die zellulären Rezeptoren von Viren zu binden. In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, welche eine als Wirksubstanz wirksame Menge mindestens einer Zusammensetzung von Proanthocyanidolen, wie oben definiert, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfassen.
Solche Zusammensetzungen können unter verschiedenen Verabreichungsarten verwendet werden.
Als gebräuchliche Verabreichungswege kann man beispielsweise den lokalen Weg (über die Haut oder das Auge), den rektalen Weg, den oralen Weg nennen.
Besonders vorteilhaft werden sie in topischer Form angewendet, in diesem Fall enthalten sie Hilfsstoffe oder Adjuvantien, die gewöhnlich für diese Verabreichungsform verwendet werden.
Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten vorteilhafterweise zwischen etwa 0,1% und etwa 5% Wirksubstanzen.
Die Verwendung von erfindungsgemäßen Proanthocyanidolen in pharmazeutischen Zusammensetzungen ist wegen der antiviralen Eigenschaften dieser Moleküle interessant. Solche Zusammensetzungen werden insbesondere zur Bekämpfung von Viren, wie jenem des Herpes Typ I, Herpes Typ II, der Varicella- Zosta, der Influenza A, des Echo 25-Virus und des HIV-Virus, des Rotavirus, des Cytomegalievirus und des Hepatitis-A-Virus eingesetzt.
Weiters ist von Interesse an den erfindungsgemäßen Proanthocyanidolen in pharmazeutischen Zusammensetzungen, daß sie als Antiproteasen, insbesondere als Antielastasen und Anticollagenasen verwendet werden können. In der Tat haben die Erfinder gezeigt, daß sie die Eigenschaft besitzen, das Bindegewebe in vivo gegen die Enzyme zu schützen, die es auf natürliche Weise abbauen. Auf Grund dessen können sie als Antiemphysemmittel, als venotonische und vasoprotektive Mittel, als Mittel zum Kampf gegen die Auswirkungen der Alterung des Bindegewebes, wie jenes des cardiovasculären Systems, der Haut, der Schleimhäute, des Pancreas, des Zahnfleischs usw... verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Proanthocyanidole haben auch die Eigenschaft, die Bindung der interzeilulären Matrix an die Fibroblasten zu festigen, die Fibrillogenese des Collagens anzuregen und die Synthese von Proteinen des Leberparenchyms anzuregen.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen liegt in der Tatsache, daß sie wenige ungünstige Nebenwirkungen mit sich ziehen und von sehr schwacher Toxizität sind.
Eine zur oralen Verabreichung verwendete Dosierung umfaßt eine Verabreichung von 0,01/kg/24Stunden Zusammensetzung bis 0,2/kg/24Stunden Zusammensetzung und vorzugsweise etwa 0,19/kg/24Stunden.
Ziel der Erfindung sind auch pharmazeutische Zusammensetzungen, welche als Wirksubstanz Proanthocyanidole zusammen mit einer oder mehreren Substanz(en), ausgewählt aus den Antibiotika, den Antiseptika, den entzündungshemmenden Mitteln und den Antipyretika, da diese Substanzen mit den Proanthocyanidolen chemisch verträglich sind, enthalten.
Ziei der Erfindung ist weiters die Verwendung der obigen Zusammensetzungen von Proanthocyanidolen zur Herstellung eines Medikaments mit antiviraler Wirkung.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus den foigenden Beispielen hervor, welche in keiner Weise einschränkend wirken sollen. In diesen Beispielen wird der Ausdruck "Procyanidol" auch zur Bezeichnung der Proanthocyanidole verwendet.

Beispiel 1

Wässerig-methanolischer Extrakt von Zapfen von Cupressus sempervirens

200 g trockene, zerkleinerte Zapfen von Cupressus sempervirens werden drei Mal aufeinanderfolgend während einer halben Stunde mit 2000 ml 80% Methanol abgekocht. Die wässerig-methanol ischen Extrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit 200 ml destilliertem Wasser bei etwa 20ºC aufgenommen. Man filtriert. Der unlösliche Rückstand wird in 200 ml destilliertem Wasser bei etwa 20ºC aufgenommen. Man filtriert. Die Filtrate werden vereinigt. Der Rückstand dieser Lösung ist etwa 33 g, das ist eine Ausbeute von 16,5%.

1.2 - Procyanidolfraktion

Die vorher erhaltene wässerige Lösung wird mit destilliertem Wasser auf 400 ml gebracht und im Gegenstrom mit 5 mal 100 ml Ethylether extrahiert. Die Etherphase wird entfernt, der Ethylether wird durch Eindampfen unter vermindertem Druck aus der wässerigen Phase ausgetrieben. Man füllt das Volumen der wässerigen Lösung mit destilliertem Wasser auf 400 ml auf, dann extrahiert man im Gegenstrom mit 5 mal 100 ml Ethylacetat.
Die organische Phase wird entfernt. Man treibt das Ethylacetat aus der wässerigen Lösung durch Eindampfen unter vermindertem Druck aus. Man füllt das Volumen der wässerigen Lösung mit destilliertem Wasser auf 400 ml auf, dann extrahiert man im Gegenstrom mit 5 mal 100 ml n-Butanol. Die butanolische Phase wird mit 2 mal 100 ml destilliertem Wasser gewaschen, dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Dieser Rückstand wird in 20 ml Methanol gelöst und die methanolische Lösung filtriert und dann zur Trockene eingedampft. Der Rückstand beträgt 780 mg, das ist eine Ausbeute von 0,39%. Das auf diese Weise erhaltene, auf einer Kieselgelplatte chromatographierte Produkt zeigt das Fehlen von Substanzen, die leicht in das Lösungsmittel aus Ethylacetat, Ameisensäure, Wasser (8-1-1 V/V) wandern, was die Abwesenheit von Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht (< 10³) anzeigt. Diese Technik erlaubt die Reinigung des Produkts durchzuführen. Andererseits führt dieser in einem Alkohol gelöste und in der Wärme mit Salzsäure behandelte Rückstand zur Bildung einer roten Färbung. Eine Plattenchromatographie gegen eine Bezugsprobe zeigt die Bildung von Cyanidin bei Ausschluß von anderem Anthocyan. Die Bestimmung des Molekulargewichtes dieses Rückstandes durch Gelpermeation in nicht wässerigem Lösungsmittel zeigt eine Molekulargewichtsverteilung von etwa 1000 bis 5000 bei einem geringem Vorliegen von Polymeren mit hohem Molekulargewicht (> 5.10³).

Beispiel 2

Wässerig-ethanolischer Extrakt von Rhizomen von Alpinia galanga

2.1 - Löslicher Rohextrakt

1 kg frische Rhizome von Alpina galanga enthaltend 88% Wasser werden zerrieben, dann einer ersten Abkochung von einer halben Stunde in 9,2 Litern 65,8% Ethanol unterworfen, um tatsächlich eine Abkochung des Aquivalents von 220 g trockenen Rhizomen durch 10 Liter 60% Ethanol zu erzielen. Sodann werden die Rhizome zwei Mal hintereinander mit 10 Liter 60% Ethanol während einer halben Stunde abgekocht. Die Extrakte werden vereint und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Daraufhin nimmt man diesen Rückstand mit 220 ml destilliertem Wasser bei etwa 20ºC auf und filtriert. Der unlösliche Teil wird mit 220 ml destilliertem Wasser bei 20ºC aufgenommen. Die Filtrate werden vereinigt. Der Rückstand dieser wässerigen Lösung beträgt 38,4 g, das ist eine Ausbeute von 3,84% in Bezug auf die frischen Rhizome und von 17,45% in Bezug auf die trockenen Rhizome.

2.2 - Procyanidolfraktion

Die vorige wässerige Lösung wird bis zum Eindampfen der butanolischen Phase auf dieselbe Art wie im Falle von Beispiel 1.2 behandelt. Der Rückstand wird sodann bei etwa 20ºC mit zwei mal 20 ml destilliertem Wasser gewaschen. Der endgültige Rückstand beträgt 104 mg, das ist eine Ausbeute von 0,01% in Bezug auf die frischen Rhizome und von 0,4% in Bezug auf die trockenen Rhizome. Diese Fraktion weist dieselben qualitativen Merkmale auf wie jene der Zapfen von Cupressus sempervirens. Die Messung des Molekulargewichtes zeigt ein mittleres Gewicht von 4000.

Beispiel 3

Unlösliche Procyanidolfraktion von Cupressus sempervirens

200 g trockene, zerkleinerte Zapfen von Cupressus sempervirens werden während einer halben Stunde drei Mal aufeinanderfolgend mit 2000 ml 80% Methanol abgekocht. Die wässerig-methanol ischen Extrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Man wäscht diesen Rückstand mit zwei Mal 200 ml destilliertem Wasser bei etwa 20ºC. Die Waschwasser werden eliminiert. Der Rückstand wird im Exsikkator unter Vakuum getrocknet, dann unter Rückfluß mit zwei mal 200 ml Ethylether gewaschen. Die Etherphase wird verworfen. Der Rückstand wird sodann mit zwei mal 200 ml Ethylacetat gewaschen. Die in Ethylacetat lösliche Phase wird verworfen. Dann wird der Rückstand mit 20 ml Methanol bei etwa 20ºC aufgenommen. Die methanolische Lösung wird filtriert. Der Rückstand dieser methanolischen Lösung ist 1,74 g, das ist eine Ausbeute von 0,87%. Diese in Wasser unlösliche Fraktion weist dieselben qualitativen Merkmale auf wie die in Beispiel 1 erhaltene lösliche Fraktion. Die Bestimmug der Molekulargewichte zeigt das sehr überwiegende Vorhandensein von Molekülen mit hohen Molekulargewichten (5.10&sup4;) an.
Es kann ein zusätzlicher Schritt nach der abschließenden Dyafiltration mit 80% Methanol angeschlossen werden: man führt eine weitere Dyafiltration mit entionisiertem Wasser durch, um das Methanol vollständig oder beinahe zu entfernen. Diese Arbeitsweise wird ausgeführt, indem die Flüssigkeit kontinuierlich auf +4ºC abgekühlt wird. Wenn das Methanol einmal entfernt ist, engt man die wässerige Lösung-Suspension des Procyanidolpolymers so weit wie möglich ein und lyophilisiert sie.
Man kann in diesem Stadium auch eine Kristallisation, ausgehend von der wässerigen Lösung-Suspension, durchführen. Das Procyanidolpolymer kristallisiert in dunkelmahagonifarbenen Nadeln aus.

Beispiel 4

Herstellung einer Fraktion mit einem Molekulargewicht von 45000 Dalton von Procyanidolen aus Zapfen von Cupressus sempervirens

20 kg Zapfen von Copressus sempervirens werden während 3 Tagen drei Mal aufeinanderfolgend in 300 Liter 80% Methanol (20 Volums-% Wasser) ausgelaugt. Die Extraktlösungen werden vereinigt, um etwa 850 Liter zu ergeben.
Die Lösung wird durch röhrenförmige Membranen aus Polyethersulfon, welche eine Ausschlußgrenze von 50000 Dalton aufweisen, ultrafi 1 triert, um die sehr hochpolymerisierten Polymere von oberhalb etwa 5.10&sup4; zu eliminieren.
Das Filtrat wird sodann durch Membranen deselben Typs, welche aber. eine Ausschlußgrenze von 20000 Dalton aufweisen, ultrafiltriert. Das auf diesen Membranen zurückgehaltene Produkt wird durch Dyafiltration gewaschen, bis die niedrigen Molekulargewichte nicht mehr als 1% des Gesamtgewichts der Trockensubstanz ausmachen.

Beispiel 5

Hestellung von Proanthocyanidolen aus Cupressus sempervirens mit einem Moelkulargewicht von 3000

20 kg Zapfen von Copressus sempervirens werden bei Raumtemperatur während 24 Stunden drei Mal aufeinanderfolgend einem Auslaugen in 300 Litern 80% Methanol unterworfen.
Die Filtrate werden vereinigt und durch eine Polyethersulfonmembran, welche eine Ausschlußgrenze von 5000 Dalton gegenüber kugelförmige Proteine aufweist, ultrafiltriert.
Das Retentat wird sodann mit 80% Methanol dyafiltriert, bis der trockene Rückstand des Permeats unter 0,1% ist.
Das Retentat wird sodann durch eine Polyethersulfonmembran, welche eine Ausschlußgrenze von 20000 Dalton gegenüber kugelförmige Proteine aufweist, uitrafiltriert.
Dieses letzte Retentat wird sodann mit 80% Methanol, dann mit reinem Methanol dyafiltriert, bis der trockene Rückstand des Filtrats unter 0,1% ist und der Titer dieses Filtrats in Methanol über 97% ist.
Das endgültige Retentat wird sodann unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 50ºC getrocknet. Die erhaltene Proanthocyanidolmenge ist 147 g.

Beispiel

Methoden zur quantitativen Bestimmung und Reinheitsbestimmung

Die quantitative Bestimmung der ausgehend von Cupressus sempervirens erhaltenen Procaynidole kann sich auf ihre polyphenol ische Struktur beziehen und daher auf ihre reduzierende Eigenschaft von Phosphorwolframsäure (wenig spezifisch) oder auf ihre Proanthocyanidolnatur, das heißt ihre Eigenschaft, durch Wärmebehandlung mit starken Säuren ein Anthocyan zu ergeben.
In beiden Fällen erhält man einen zu einer Bezugsprobe, die vom Molekül selbst mehr oder weniger entfernt ist, relativen Wert.
Man kann sich auch auf die Gerbeigenschaft von Procyanidolen in wässeriger Lösung beziehen: in diesem Fall handelt es sich darum, die Bindung auf dem Pulver aus mit Chrom vorbehandelter Haut zu bestimmen.

1. - Quantitative Bestimmung der Polyphenolwirkung:

Während 3 Stunden erhitzt man unter Rückfluß 10 g Natriumwolframat mit 8 ml Orthophosphorsäure und 75 ml entionisiertem Wasser. Man läßt abkühlen und füllt mit entionisiertem Wasser auf 100 ml auf. 15% Natriumcarbonatlösung in entionisiertem Wasser : Reagens B.
Man wiegt 50 mg Procyanidol ab und löst sie in genau abgemessenen 10 ml Wasser auf.
Man entnimmt 2 ml dieser Lösung und verdünnt sie in einem geeichten Becherglas auf 25 ml, (Lösung C). In ein auf 50 ml geeichtes Becherglas füllt man ein:
Lösung C: 5 ml
Reagens A: 1 ml
Reagens B: g.s. 50 ml
Man liest die O.D. bei 715 nm genau 2 Minuten nach Beimischen des letzten Reagens ab. Man verfährt in gleicher Weise mit einer Serie von Pyrogallol (0 bis 50 mg) als Bezugsverbindung.
Das Resultat für das Procyanidolpolymer beträgt 43,5% der gesamten Polyphenole, ausgedrückt in Pyrogallol.

2. - Quantitative Bestimmung der Gerbwirkung

Eine wie obige Lösung C hegestellte Procyanidollösung wird während einer Stunde mit 1 g Pulver aus mit Chrom vorbehandelter Haut (Merck Bez.4332) bei Raumtemperatur gerührt.
Daraufhin führt man eine quantitative Bestimmung der gesamten Polyphenolwirkung wie oben durch. Die Gerbwirkung entspricht der Differenz zwischen dem für die gesamten Polyphenole gefundenen Wert und dem nach der Behandlung mit dem Hautpulver gefundenen Wert.
Das Ergebnis für das Procyanidolpolymer beträgt 80%, ausgedrückt als Gerbwirkung.

3. - Quantitative Bestimmung der eigentlichen Procyanidol wirkung:

10 mg Procyanidolpolymer, ungefähr genau abgemessen, werden in 20 ml 75% Ethanol gelöst.
Man füllt ein Reagensglas mit 1 ml dieser Lösung, 5 ml 75% Ethanol und 1 ml konzentrierte Salzsäure. Man bringt es während 30 Mnuten ins kochende Wasserbad.
Man füllt das Bezugsglas, indem man dieselben Bestandteile zu denselben Anteilen, jedoch bei Raumtemperatur und unmittelbar vor dem Ablesen am Spektrophotometer, mischt.
Man liest die O.D. der Versuchslösung bei 540 nm gegen die Bezugslösung ab.
Das Ergebnis für das Procyanidolpolymer ist 0,60.

4. - Molekulargewichtsbestimmung des Procyanidolpolymers:

Man führt eine Hochleistungs-Ausschlußchromatographie auf Gel ubondagel 125 (Waters) in einem aprotischen Lösungsmittel gegen Polystyrolbezugssubstanzen (Aldrich) durch. Ausstrom: 0,5 ml/Minute isokratisch
Lösungsmittel: Chloroform-Dimethylsulfoxid 50-50 (V/V)
Bestimmung: O.D. bei 283 nm
Konzentration der Bezugsproben: 1 mg/ml im gleichen Lösungsmittel
Konzentration von Proanthocyanidol: 0,05 mg/ml im gleichen Lösungsmittel
Molekulargewichte der Bezugsproben: 184.200, 50.000, 24.150, 7.025, 4.136 und 2.000.
Die Bezugsprobe mit einem Molekulargewicht von 184.200 wird als Bezugsverbindung zum vollständigen Ausschluß auf dem Gel verwendet. In der Tat hält diese Gelart keine Molekulargewichte oberhalb von 50.000 zurück. Man berechnet sodann die relative Retentionszeit jeder Probe im Verhältnis zur vollständig ausgeschlossenen Bezugsverbindung.
Man zieht die Verbindungskurve zwischen dein Zehnerlogarithmus des Molekulargewichtes und der relativen Retentionszeit.
Das Ergebnis für das Procyanidolpolymer, welches unter Anwendung der vorher beschriebenen Technik erhalten wurde, beträgt 45.000.

5. - Reinheitsbestimmung des Procyanidolpolymers durch Gelchromatographie:

Die obige Chromatographietechnik führt zu einer Linie, welche zwei Peaks umfaßt. Der eine entspricht den Verunreinigungen mit einem Molekulargewicht unterhalb 5000. Mit dieser Chromatographietechnik stellt man tatsächlich fest, daß die Molekulargewichte von unterhalb 5000 in einem einzigen Peak am Chromatogrammende gesammelt sind.
Die Herstellungsmethode, welche eine abschließende Ultrafi 1 tration durch eine Membran mit einer Ausschlußgrenze von etwa 20.000 einschaltet, erlaubt es, am Verfahrensende eine konzentrierte, auf der Membran zurückgehal tene Polymerlösung und eine verdünnte Lösung der Produkte mit Molekulargewichten unterhalb 20.000, die kein Procyanidol enthält (bestätigt durch die Methode aus 3.), zu erhalten.
Man bestimmt sodann die Konzentration des gesamten Trokkenmaterials der zwei Lösungen. Dann bestimmt man ihre U.V.- Absorption bei 283 nm. Man kann auf diese Weise die E% 1 cm berechnen: Lichtabsorptionsvermögen des Produkts in 1% Lösung auf 1 cm optischem Durchgang von jedem Produkt.
Man berechnet dann auf dem Chromatogramm das Flächenverhältnis der zwei Peaks und schließt daraus auf die Reinheit des Procyanidolpolymers.
Das nach dieser Methode erhaltene Ergebnis ist 98%.

Beispiel 7

Antivirenversuche in vitro

Die Antivirenversuche wurden am Herpes simplex-Virus Typ I (HVS 1), welcher auf menschliche, embryonale Lungenfibroblasten implantiert wurde, durchgeführt.
Man hat die antivirale Wirkung der verschiedenen erhaltenen Produkte von Proanthocyanidolen auf derselben Teilmenge viraler Verdünnung, entsprechend einer infektionserzeugenden Dosis von 50(DI 50)105,7 Viren pro Vertiefung, bestimmt, das heißt, die Produktmenge pro Vertiefung, das heißt 100 ul Milieu, welches eine Verminderung um die Hälfte der DI 50 bewirkt.
Zum Vergleich wurde auch das Procyanidin A2, aus der Roßkastanie extrahiertes Procyanidoldimer mit dem Molekulargewicht von 546, getestet. EXTRAKT MENGE HERVORRUFEND DIE VERMINDERUNG UM DIE HÄLFTE DER DI 50 lösliche Procyanidole von Cupressus sempervirens unlösliche Procyanidole von Cupressus sempervirens lösliche Procyanidole von Alpinia galanga Procyanidin A2
Ein weiterer Versuch am HVS 1 - Virus wurde mit einer Zusammensetzung aus Proanthocyanidolen vom Molekulargewicht 3000, wie in Beispiel 5 hergestellt, unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
- Eine Suspension menschlicher, diploider Fibroblastenzellen (MRC5 Biomerieux) wird mit MEM-Milieu (Gilbco, Bez. 041-02565), ergänzt mit 10% fötalem Kalbsserum, 1% Lösung von Vitaminen (Gibco, Bez.043-01120), 1% Lösung von 200mM Glutamin, 1% Lösung von Antibiotika (Penicillin zu 200 U/ml, Streptomycin zu 50 ug/ml, Amphotericin B zu 2 ug/ml) auf 1/15 verdünnt. Diese Suspension wird zu 100 ul pro Vertiefung auf Platten von 96 Vertiefungen implantiert. Man inkubiert während 48 Stunden bei 37ºC unter einer Atmosphäre, welche 5% CO&sub2; enthält.
- Man bereitet eine Mutter lösung zu 0,5% Proanthocyanidolen entsprechend der obigen Definitionen. Daraufhin bereitet man aufeinanderfolgende Verdünnungen im Verhältnis 2 bis 1/512 dieser Mutterlösung im gleichen Milieu wie oben, welches aber 2% fötales Kalbsserum enthält. Man verwirft die Verdünnungen von weniger als 1/16.
- Die Suspension von HSV 1, typisiert, gefroren und titriert, wird von 10 auf 10 bis 10&supmin;&sup7; in dem obigen Milieu, welches jedoch nur 2% fötales Kalbsserum enthält, verdünnt. Man verteilt in verschiedene Röhrchen 1 ml jeder Verdünnung, welchen man für die Versuche 1 ml jeder Proanthocyanidolverdünnung und für die Bezugsproben 1 ml des Milieus, enthaltend 2% fötales Kalbsserum, hinzufügt. Man läßt während 1 Stunde bei 37ºC in Berührung.
- Man entfernt den Ljberstand der Vertiefungen, wo die Zeilen kultiviert wurden, und bringt in jeder Vertiefung 200 ul jeder Verdünnung ein.
- Man läßt 1 Stunde bei 37ºC mit 5% CO&sub2; inkubieren. Man spült zwei Mal mit 200 ul des Milieus mit 2% fötalem Kalbsserum, fügt dann 200 ul desselben Milieus hinzu und läßt 5 Tage bei denselben atmosphärischen Bedingungen inkubieren.
- Daraufhin liest man die cytopathogenen Wirkungen in jeder Vertiefung direkt ab.
Es wurde beobachtet, daß die Verminderung um 50% des viralen Titers für eine Konzentration von etwa 25 kg/ml erhalten wurde.

Beispiel 8

Untersuchung von wasserlöslichen Procyanidolen aus Cupressus sempervirens am Virus des erworbenen menschlichen Immundefektsyndroms (HIV-1)

(a) Antivirale Wirkung

Der Versuch wird auf H9-Zellen, welche mit aufeinanderfolgenden Dezimalverdünnungen von HIV-1 währnd 90 Minuten inf iziert wurden, durchgeführt.
Nach der Infizierung der Zellen werden diese mit abnehmenden Procyanidolkonzentrationen mit Dosen, welche unterhalb der für diese Zellinie festgesteilte Zytotoxizität liegen (150 ug/ml), behandelt.
Nach 10 Kulturtagen werden die Zellen zentrifugiert und die Viren mit einer radioimmunologischen Prüfung (Suche des Proteins p24) auf dem Überstand herausgesucht.

Ergebnisse:

Die löslichen, nach Beispiel 1 erhaltenen Procyanidole der Zypresse verursachen eine Hemmung der viralen Expression um 97% bei einer Konzentration von 50ug/ml.

b) Viruzide Wirkung

Die Virussuspension (HIV1) wird während 30 Minuten bei 37ºC mit abnehmenden Konzentrationen von löslichen Procyanidolen der Zypresse behandelt. Dann werden die H9-Zellen mit aufeinanderfolgenden Dezimalverdünnungen der vorhergehenden Suspension infiziert.

Ergebnisse:

Die löslichen Procyanidole der Zypresse verursachen eine Verminderung des viralen Titers um 1,5 log (Anfangstiter: 3.10&sup4;) bei der Konzentration von 50 ug/ml und eine Verminderung um 2,5 log bei der Konzentration von 150 ug/ml.

Beispiel 9

Untersuchung von wasserlöslichen Procyanidolen aus Cupressus sempervirens an dem Virus von Herpes simplex Typ II.

Die antiviralen Untersuchungen wurden an dem Virus von Herpes simplex Typ II, welcher auf menschlichen, embryonalen Lungenfibroblasten implantiert wurde, durchgeführt.
Man hat die antivirale Wirkung von löslichen Procyanidolen aus Cupressus sempervirens an einem Teil der Virussuspension, entsprechend einer infektionserzeugenden Dosis von 50(DI 50)2,5.10&sup4; Viren pro Vertiefung, das heißt die Produktmenge pro Vertiefung (das heißt in 100 ul Milieu), welche eine Verminderung um die Hälfte der D150 hervorruft, bestimmt.
Der gefundene Wert ist 3,2ug/100ul.

Beispiel 10

Untersuchung von wasserlöslichen Procyanidolen aus Cupressus sempervirens am Varicella-Zosta-Virus

Die antiviralen Untersuchungen wurden am Virus der Varicella und des Zosta, implantiert auf menschliche, embryonale Lungenfibroblasten, durchgeführt.
Man hat die antivirale Wirkung von löslichen Procyanidolen aus Cupressus sempervirens an einem Teil der Virussuspension, entsprechend einer infektionserzeugenden Dosis von 50(DI 50)5.10³ Viren pro Vertiefung, das heißt die Produktmenge pro Vertiefung (das heißt in 100 ul Milieu), welche eine Verminderung um die Hälfte der DI50 hervorruft, bestimmt.
Der gefundene Wert ist 6ug/100ul.
Ein zweiter Test, der mit einer Proanthocyanidolzusammensetzung mit einem Molekulargewicht von 3000 durchgeführt wurde, hat gezeigt, daß die viruzide Wirkung dieser Zusammensetzung für einen viralen Anfangstiter von 3.10³ und für eine Konzentration von 312,5 ug/ml unter den für den zweiten Test, der in Beispiel 5 für den HVS 1 - Virus beschrieben wurde, im Detail angeführten operativen Bedingungen 100% ist.

Beispiel 11

Untersuchung von wasser löslichen Procyanidolen aus Cupressus sempervirens am Influenza A-Virus

Die antiviralen Untersuchungen wurden am Influenza A- Virus, der auf Adenocarzinomzellen des menschlichen Dickdarms implantiert wurde, durchgeführt.
Man hat die antivirale Wirkung von löslichen Procyanidolen aus Cupressus sempervirens an einem Teil der Virussuspension, entsprechend einer infektionserzeugenden Dosis von 50 (DI 50) 7.10³ Viren pro Vertiefung, das heißt die Produktmenge pro Vertiefung (das heißt in 100 ul Milieu), welche eine Verminderung um die Hälfte der DI50 hervorruft, bestimmt.
Der gefundene Wert ist 12ug/100ul.
Ein zweiter Test wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
- Eine Suspension von Adenocarzinomzellen des menschlichen Dickdarms (HT 29 Bimerieux) wird mit MEM-Milieu (Gibco, Bez.041-02565), ergänzt mit 10% fötalem Kalbsserum, 1% Lösung von Vitaminen (Gibco, Bez.043-01120), 1% Lösung von 200mm Glutamin, 1% Lösung nicht essentieller Aminosäuren (Gibco, Bez.043-01140), 0,1% Lösung von menschlichem Transferin zu 1 mg/100 ml, 1% Lösung von Antibiotika (Penicillin zu 200 U/ml, Streptomycin zu 50 ug/ml, Amphotericin B zu 2 ug/ml) auf 1/15 verdünnt. Diese Suspension wird zu 100 ul pro Vertiefung auf Platten von 96 Vertiefungen implantiert. Man inkubiert während 48 Stunden bei 37ºC unter einer Atmosphäre, welche 5% CO&sub2; enthält.
- Man bereitet eine Mutter lösung zu 0,5% Proanthocyanidolen von Zusammensetzung mit einem Molekulargewicht von 3000. Daraufhin bereitet man aufeinanderfolgende Verdünnungen im Verhältnis 2 bis 1/16 dieser Mutterlösung im gleichen Milieu wie oben, welches aber 2% fötales Kalbsserum enthält.
- Die Suspension des Influenza A-Virus, typisiert, gefroren und titriert, wird von 10 auf 10 bis 10&supmin;&sup7; in dem obigen Milieu, welches jedoch nur 2% fötales Kalbsserum enthält, verdünnt. Man verteilt in verschiedene Röhrchen 1 ml jeder Verdünnung, welchen man für die Versuche 1 ml jeder Proanthocyanidolverdünnung und für die Bezugsproben 1 ml des Milieus, enthaltend 2% fötales Kalbsserum, hinzufügt. Man läßt während 1 Stunde bei 37ºC in Berührung. Man entfernt den Überstand der Vertiefungen, wo die Zellen kultiviert wurden, und bringt in jede Vertiefung 200 ml jeder Verdünnung ein.
- Man läßt 1 Stunde bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubieren. Man spült zwei Mal mit 200 ul des Milieus mit 2% fötalem Kalbsserum, fügt dann 200 ul deselben Milieus hinzu und läßt 24 Stunden bei denselben atmosphärischen Bedingungen inkubieren.
- Das Ablesen der Resultate wird mit einer Immunofluoreszenztechnik durchgeführt.
- Man gefriert die Platte während zumindest einer halben Stunde bei -20ºC nachdem das Milieu entfernt wurde und fixiert die Zellen mit 100 ul 96% Ethanol. Man spült drei Mal mit 100 ul PBS-Puffer und fügt 100 ul Antigrippeserum A vom Hasen, verdünnt auf 1/100 in PBS-Puffer, hinzu. Man läßt während 30 bis 40 Minuten bei 37ºC inkubieren, spült drei Mal mit 100 ul PBS-Puffer und setzt dann 100 ul einer Lösung von 1/100 Antikörper vom Hasen zu, welche mit Fluorescein-Anti- IGG (H + L) markiert sind.
- Man läßt während 45 Minuten bei 37ºC rühren, spült mit drei Mal 100 ul PBS-Puffer. Dann zählt man die fluoreszierenden Zellen pro Vertiefung.
Unter diesen Bedingungen ist die viruzide Wirkung der verwendeten Proanthocyanidole für einen viralen Anfangstiter von 5.10³ und für eine Konzentration von 312,5 u/ml 85%

Beispiel 12

Untersuchung von wasserlöslichen Procyanidolen aus Cupressus sempervirens am ECHO 25-Virus

Die antiviralen Untersuchungen wurden am Virus ECHO 25- Virus, welcher auf menschlichen, embryonalen Lungenfibroblasten implantiert wurde, durchgeführt.
Man hat die antivirale Wirkung von löslichen Procyanidolen aus Cupressus sempervirens an einem Teil der Virussuspension, entsprechend einer infektionserzeugenden Dosis von 50 (DI 50) 10&sup4; Viren pro Vertiefung, das heißt die Produktmenge pro Vertiefung (das heißt in 100 ul Milieu), welche eine Verminderung um die Hälfte der DI50 hervorruft, bestimmt.
Der gefundene Wert ist 31ug/100ul.

Beispiel 13

Wirkung einer Zusammensetzung von Proanthocyanidolen auf den Cytomegalievirus

Eine Suspension menschlicher, diploider Fibroblastenzellen (MRC5 Biomerieux) wird mit MEM-Milieu (Gibco, Bez.041- 02565), ergänzt mit 10% fötalem Kalbsserum, 1% Lösung von Vitaminen (Gibco, Bez.043-01120), 1% Lösung von 200mM Glutamin, 1% Lösung von Antibiotika (Penicillin zu 200 U/ml, Streptomycin zu 50 ug/ml, Amphotericin B zu 2 ug/ml) auf 1/15 verdünnt. Diese Suspension wird zu 100 ul pro Vertiefung auf Platten von 96 Vertiefungen implantiert. Man inkubiert während 48 Stunden bei 37ºC unter einer Atmosphäre, welche 5% CO&sub2; enthält.
Man bereitet eine Mutterlösung zu 0,5% Proanthocyanidolen mit einem Molekulargewicht von 3000. Daraufhin bereitet man aufeinanderfolgende Verdunnungen im Verhältnis 2 bis 1/16 dieser Mutter lösung im gleichen Milieu wie oben, welches aber 2% fötales Kalbsserum enthält.
Die Suspension von CMV, typisiert, gefroren und titriert, wird auf 1/10, dann 2 auf 2 bis 10&supmin;² in dem obigen Milieu, welches jedoch nur 2% fötales Kalbsserum enthält, verdünnt. Man verteilt in verschiedene Röhrchen 1 ml jeder Verdünnung, welchen man für die Versuche 1 ml jeder Proanthocyanidolverdünnung mit obiger Zuasmmensetzung und für die Bezugsproben 1 ml des Milieus, enthaltend 2% fötales Kalbsserum, hinzufugt. Man läßt während 1 Stunde bei 37ºC in Berührung.
Man entfernt den Überstand der Vertiefungen, wo die Zellen kultiviert wurden, und bringt in jede Vertiefung 200 ul jeder Verdünnung ein.
Man läßt 2 Stunden bei 37ºC mit 5% CO&sub2; inkubieren. Man spült zwei Mal mit 200 ul des Milieus mit 2% fötalem Kalbsserum, fügt dann 200 ul desselben Milieus hinzu und läßt 12 Stunden bei denselben atmosphärischen Bedingungen inkubieren.
Daraufhin liest man die zytopathogenen Wirkungen in jedem Vertiefung mit einer ELISA-Technik ab.
Unter diesen Bedingungen ist die viruzide Wirkung der verwendeten Proanthocyanidole für einen Anfangstiter von 5,55.10² und für eine Konzentration von 312,5 u/ml 100%.

Beispiel 14

Aktivität der Procyanidolfraktion mit einem Molekulargewicht von 45000 auf die Rotaviren

Die antiviralen Untersuchungen wurden an einem wilden Rotavirusstamm, der auf embryonalen Nierenzellen von Rhesusaffen MA104 implantiert wurden, durchgeführt.
Man hat die antivirale Wirkung dieser Procyanidolfraktion an einem Teil der Virussuspension, entsprechend einer infektionserzeugenden Dosis von 50 (DI50) 2.10³ Viren pro Vertiefung, das heißt die Produktmenge pro Vertiefung (das heißt in 100 ul Milieu), welche eine Verminderung um die Hälfte der DI50 hervorruft, bestimmt. Der gefundene Wert ist 8ug/100ul.

Beispiel 15

Untersuchung von Proanthocyanidolen mit einem Molekulargewicht von 3000 am Hepatitis A-Virus

Dec Hepatitis A-Virus wird auf Hepatomen, welche bei 32ºC am Leben gehalten werden, gezüchtet. Die Procyanidole werden direkt im Kulturmedium gelöst.
Man stellt fest, daß die Antigenproduktion für eine Procyanidolkonzentration von 5 ug/ml zu 20%, für eine Procyanidolkonzentration von 10 ug/ml zu 34%, für eine Procyanidolkonzentration von 20 ug/ml zu 96% gehemmt wird.

Beispiel 16

Wirkung von Proanthocyanidolen mit einem Molekulargewicht von 3000 auf die Aktivität einer Collagenase

Man stellt ein Gel aus Agarose, gemischt mit säurelöslichem Collagen aus Rinderhaut her.
Dieses Gel wird in Petrischalen gegossen. In mit der Lochstanze ausgehöhlten Vertiefungen im Gel bringt man steigende Konzentrationen einer Collagenaselösung ein. Das Enzym diffundiert rund um die Vertiefungen und baut das Collagen in Funktion der Enzymkonzentration ab.
Nach Färbung der Behälter mit Siriusrot unterscheidet man die Zonen der Collagenolyse in hellgelb auf einem roten Grund aus nicht abgebautem Collagen. Der Durchmesser der Lysebereiche ist proportional zur in eine gegebene Vertiefung eingebrachte Enzymkonzentration. Man inkubiert zuerst das Collagen mit einer wie oben bereiteten Proanthocyanidollösung mit Konzentrationen von 1% bis 5% und bereitet Petrischalen wie für die Bezugsproben. Man stellt nun fest, daß sich die Lysebereiche in bedeutendem Maße vermindert haben.

Beispiel 17

Wirkungen von Proanthocyanidolen mit einem Molekulargewicht von 3000 auf die Aktivität einer Elastase

Die Proanthocyanidole werden wie in Beispiel 5 hergestellt.
Für den Test verfährt man genauso wie für Beispiel 16, man ersetzt jedoch das Collagen durch mikronisiertes, faseriges Elastin und die Collagenase durch die Elastase.
Das faserige Elastin macht das Gel undurchsichtig und eine Färbung ist nicht notwendig.
Man stellt fest, daß, wenn eine Schale mit dem Elastin, welches mit den Proanthocyanidolen vorher inkubierten wurde, vorbereitet ist, die Lysebereiche in bedeutender Weise verringert sind.

Beispiel 18

Wirkungen von Proanthocyanidolen mit einem Molekulargewicht von 3000 auf eine "ex vivo" angewendete Collagenase

Die Procyanidole werden wie in Beispiel 5 hergestellt.
Man färbt das Collagen eines Schnitts menschlicher Haut mit Picro-Indigocarmin. Die Bezugsschnitte zeigen, daß das Collagen in einem normalen Zustand ist.
Man setzt gewisse dieser Schnitte der Wirkung einer Collagenase aus und beobachtet sodann den teilweisen Abbau des Collagens.
Andere Platten werden vorher mit den Procyanidolen inkubiert und danach der Aktivität der Collagenase unterworfen. Man stellt eine deutliche Verminderung des Collagenabbaus in diesen Schnitten im Vergleich zu den Bezugsschnitten fest.

Beispiel 19

Wirkungen von Proanthocyanidolen mit einem Molekulargewicht von 3000 auf eine "ex vivo" angewendete Elastase

Man verfährt wie für Beispiel 18, färbt jedoch das Elastin mit Fuchsin-(+)Katechin und das verwendete Enzym ist hier eine Elastase. Man stellt, wie bei Beispiel 18, eine Verringerung des Enzymangriffs auf sein Substrat fest.

Beispiel 20

Stimulierung der Fibrillogenese des Collagens durch Proanthocyanidole mit einem Molekulargewicht von 3000

Die Procyanidole werden wie in Beispiel 19 hergestellt.
Säurelösliches Collagen aus Rinderhaut wird mit Agarosegel vermischt. Dieses Collagen enthält vor allem isolierte Moleküle, die eine schwache Neigung zur Aggregation haben. Diese Aggregation kann nach Färbung des Collagens mit Siriusrot im optischen Mikroskop beobachtet und durch Bildanalyse quantifiziert werden.
Man inkubiert vorher das Collagen mit den Procyanidolen und stellt sodann die Aggregatbildung von eindeutig größerem Ausmaß fest. Die von diesen Aggregaten eingenommene Oberfläche ist deutlich größer als die der Bezugsprobe.
Zur Überprüfung, daß diese Aggregate nicht bloße amorphe Fällungen sind, untersucht man die gebildeten Aggregate im Elektronenmikroskop. Man stellt sodann fest, daß das behandelte Collagen regelmäßige und die für den interstitiellen Typus charakteristische Striation tragende Faserformationen aufweist.

Beispiel 21

Stimulierung der Bindung der elastischen Fasern an die Fibroblasten durch Proanthocyanidolpolymere mit einem Molekulargewicht von 3000

Die Procyanidole werden wie in Beispiel 19 hergestellt.
Fibroblasten der menschlichen Haut werden auf DMEM- Milieu, dem 10% fötales Kalbsserum und Procyanidole mit Koncentrationen von 1-0,1-0,01-0,001 mg/ml zugesetzt werden, kultiviert.
Eine Kultur erhält kein Produkt und wird als Bezugskultur verwendet.
Man setzt den verfließenden Kulturen faseriges, mikronisiertes Elastin mit der Konzentration von 0,2 mg/ml zu und läßt sie 48 Stunden unter Kulturbedingungen inkubieren.
Am Ende der Inkubation werden die Zellen gespült und das Elastin nach der durch Godeau modifizierten Verhoeff-Methode gefärbt ("Selective staining technique for the identification of human skin elastic fiber" Pathol. Biol., (1984), 32, S.215-216).
Man wertet nun quantitativ das zellgebundene Elastin durch Bildanalyse aus: Procyanidolkonzentration Fläche des gebundenen Elastins
Man stellt fest, daß das Vorliegen von Procyanidolen in den Kulturmilieus der verfließenden Fibroblaste die zellgebundene Elastinmenge erhöht. Die optimale Konzentration ist 0,01 mg/ml.

Beispiel 22

Wirkung der Procyanidole mit einem Molekulargewicht von 3000 auf die zentrale und periphere Gefäßpermeabilität

Die Untersuchungen wurden an 4 Gruppen zu 5 weißen Witsar-Ratten mit einem mittleren Anfangsgewicht von jeweils 250 bis 3009 durchgeführt.
Das Testprinzip besteht darin, daß die Gefäßpermeabilität sowohl in den großen Stämmen als auch in den Kapillaren durch intravenöse Verabreichung von Collagenase künstlich erhöht wird und dar die Schutzwirkung des täglich während drei Wochen auf oralem Weg verabreichten Produkts notiert wird. Diese Proteaseverabreichung reproduziert einen pathologischen Mechanismus, der in Form entzündlicher Prozesse, Diabetes, Arthereosklerose und auch Alterung beobachtet wird. Dieser Zustand kann auch in Fällen viraler Infektion bei der Lyse des Bindegewebes infolge der durch den Virus verursachten Zellzerstörung beobachtet werden.
Gruppe 1: negative Bezugstiere: diese Ratten erhalten anstelle der Behandlung physiologisches Serum auf oralem Weg am Ende der Behandlung eine intravenöse Injektion von physiologischem Serum und eine halbe Stunde später eine intravenöse Injektion eines Permeabilitätsmarkers (Rettichperoxidase des Typs VI Sigma zu 100 mg/kg).
Gruppe 2: positive Bezugstiere: diese Ratten erhalten ebenfal Is physiologisches Serum auf oralem Weg anstelle der Behandlung, aber am Ende davon erhalten sie Collagenase aufintravenosem Weg (270 Einheiten bakterielle Collagenase), dann 30 Minuten später den Permeabilitätsmarker. Die Ergebnisse dieser Gruppe, verglichen mit denen der Gruppe 1, erlauben es, die permeabilitätsfördernde Wirkung der verabreichten Protease auszuwerten.
Gruppe 3: Wirkung des Produkts ohne Collagenase: die Ratten erhalten täglich während 21 Tagen eine perorale Verabreichung von Procyanidolen mit einer dosis von 50 mg/kg in physiologischem Serum. Am Ende der Behandlung erhalten sie eine intravenöse Injektion physiologischen Serums und 30 Minuten später den Permeabilitätsmarker auf demselben Weg. Die Ergebnisse dieser Gruppe müssen anzeigen, ob das Produkt eine Veränderung der Gefäßpermeabilität induziert oder nicht.
Gruppe 4: Eigentliche Versuchsgruppe: die Ratten erhalten die 21 Procyanidolverabreichungen wie die Gruppe 3. Am Ende der Behandlung jedoch erhalten sie eine Collagenaseinjektion, dann 30 Minuten später den Permeabilitätsmarker. Die Ergebnisse dieser Gruppe, verglichen mit jenen der Gruppe 2, zeigen, ob die Behandlung die permeabilitätsfördernde Wirkung der Collagenase verringert hat oder nicht.
Alle Ratten werden sodann getötet und histologische Schnitte von gewissen Geweben von ihnen gemacht.
Man stellt fest, daß keine Veränderung der normalen Gefäßpermeabilität unter der Wirkung der Behandlung der Ratten mit dem untersuchten Produkt während einem Monat auftritt.
Aus dieser Studie geht hervor, daß die Procyanidole eine sehr deutlich Wirkung auf die Wände der großen Gefäße und auch auf die kleinen Gefäße und die Kapillaren des Gehirns (Blut-Hirnschranke) ausüben.
Bei der Aorta war die Aufhebung der Collagenasewirkungen beachtlich, sie ist jedoch noch intensiver bei der Vena cava und dem Frontalhirnlappen. In diesen zwei Organen blieben die Permeabilitätsbedingungen trotz der Collagenaseinjektion im normalen Bereich.

Beispiel 23

Wirkung der Procyanidole mit einem Molekulargewicht von 3000 auf den experimentellen Lathyrismus der Maus

Bei einigen Krankheiten erleidet das Bindegewebe Läsionen und Strukturveränderungen. Mit dem Ziel, die Wirkung von Proanthocyanidolen mit einem Molekulargewicht von 3000 auf das Bindegewebe zu beobachten, haben wir Mäuse mit einem bekannten Mittel behandelt, um einen experimentellen Lathyrismus hervorzurufen: das β-Aminopropionitril (BAPN).
Die Mäuse werden in drei Gruppen aufgeteilt:
Gruppe 1: negative Bezugsgruppe: diese Tiere erhalten täglich während 11 Wochen 100ml/kg physiologisches Serum auf intraperitonealem Weg.
Gruppe 2: positive Bezugsgruppe: diese Mäuse erhalten täglich während 11 Wochen 1000 mg/kg β-Aminopropionitril (BAPN), bekanntes Produkt zur Induktion eines Lathyrismus, gelöst zu 100 mg/ml in physiologischem Serum zu 100 mg/ml für das BAPN und 5 mg/ml für die Procyanidole.
Gruppe 3: Versuchsgruppe: die Mäuse erhalten täglich während 11 Wochen 1000 mg/kg BApN und 50 mg/kg Procyanidole wie in Beispiel 18. Die zwei produkte werden in physiologischem Serum zu 100 mg/ml für das BAPN und 5 mg/ml für die Procyanidole gelöst.
Am Ende der Behandlung werden die Mäuse getötet und die Aortahaut wird entnommen.
Die Organe werden dann für die histologische Untersuchung fixiert.
Betreffend die Aorta findet man eine tiefe Zerstörung der elastischen Fasern in der Gruppe 2 im Verhältnis zur Gruppe 1. Die Gruppe 3 erscheint völlig gleich wie die Gruppe 1 und man beobachtet daher die Schutzwirkung von Proanthocyanidolen gegen mit BAPN hervorgerufenen Lathyrismus.
Betreffend die Haut beobachtet man, daß die Gruppe 2 Collagenbündel, die in ungeordneter Weise positioniert sind, aufweist. was bei der Gruppe 1 nicht der Fall ist. Die Gruppe 3 weist eine bessere Anordnung der Collagenbündel auf.

Beispiel 24

Stimulierung der Synthese von Hepatomproteinen durch Proanthocyanidole mit Molekulargewichten von 3000

Die Procyanidole werden wie in Beispiel 19 hergestellt.
Das Kulturmilieu der Hepatome, die bei 32ºC am Leben gehalten werden, wird mit ansteigenden Mengen Procyanidolen vesetzt. Man mißt den Einfluß der Konzentration dieses Produkts auf die Synthese von Proteinen dieser zusammenhängenden Zellinie.
Man stellt fest, daß 10 kg/ml Procyanidole die Proteinsynthese um 130%, 40 ug/ml um 180% und 160 ug/ml um 250% steigern.

Beispiel 25

Untersuchung der Toxizität von in den vorangehenden Beispielen erhaltenen Proanthocyanidolen beim Tier

Die Toxizität aller erhaltenen Proanthocyanidole auf oralem Weg, untersucht bei der Maus, konnte nicht ausgewertet werden, da die einzuführenden Dosen die Möglichkeiten der Tiere überschritten und oberhalb 2 g pro kg Körpergewicht lagen.
Die Untersuchungen der ersten Hautreizungen derselben Produkte genauso wie die Untersuchungen der Augenreizungen, ausgeführt beim Hasen in 5% wässeriger Lösung für die löslichen Fraktionen, haben dazu geführt, die Produkte als nicht reizend zu definieren. Die Untersuchungen der ersten Hautreizung von nicht löslichen Proanthocyanidolen in 5% Lösung in einem 50% Gemisch von Monopropylenglycol und Wasser haben dazu geführt, diese Produkte als nicht reizend im Vergleich zu einem reinen Gemisch aus Monopropylenglycol und Wasser zu 50% zu definieren.

Beispiel 26

Klinische Versuche über die Procyanidole von Alpinia galanga

Die klinischen Versuche wurden über die in Beispiel 2 erhaltenen Proanthocyanidole von Alpinia galanga durchgeführt.
Die Studie hat sich auf 140 Kranke erstreckt, die Herpessymptome aufwiesen, welche seit weniger als 24 Stunden zum ersten Mal auftraten, wobei die Kranken folgendermaßen aufgeteilt waren:
24 Frauen mit einem Alter zwischen 17 und 47 Jahren, die einen mit dem Menstruationszyclus verbundenen wiederkehrenden Herpes aufwiesen. Unter ihnen zählte man 18 Fälle labialen Herpes und 6 Fälle mit Herpes, welcher nicht schleimhautartige verschiedene Körperregionen (Nasenflügel, Gesäß, Wangen) befiel.
116 Männer im Alter zwischen 19 und 54 Jahren, wobei alle einen labialen Herpes aufwiesen.
Die Frauen wurden in vier Gruppen aufgeteilt:
. eine Bezugsgruppe mit wiederkehrendem labialen Herpes,
. eine Versuchsgruppe mit derselben Erkrankung, das sind jedes Mai 9 Pesonen,
. eine Bezugsgruppe mit unterschied lichem Herpes,
. eine Versuchsgruppe mit unterschiedlichem Herpes, das sind jedes Mal 3 Personen.
Die Männer wurden in zwei gleiche Gruppen zu 58 Personen aufgeteilt, eine möglichst homogene Versuchsgruppe und Bezugsgruppe.
Die Bezugspersonen werden bis zum Verschwinden der Läsionen bei einer Verabreichung um 7h, 9h, 11h, 13h, 15h, 17h und 19h während drei Tagen, dann einer Verabreichung morgens, mittags und abends bis zum Schluß, mit einem Placebogel der folgenden Zusammensetzung behandelt:
vernetztes Natriumpolyacrylat: 0,75%
Karamel: qs zur Färbung
Konservierungsmittel: Propyl - und Methylparaoxybenzoat: 0,35%
destilliertes Wasser: qs 100%
Die Versuchsgruppen wurden unter denselben Bedingungen wie die Bezugsgruppen mit einem Gel der folgenden Zuammensetzung behandelt:
vernetztes Polyacrylat: 0,75%
Proanthocyanidolfraktion: 2%
Konservierungsmittel: Propyl- und Methylparaoxybenzoat: 0,35%
destilliertes Wasser: qs 100%

Ergebnisse

Man wertet die Zeit aus, die die Läsion vollständig verschwinden läßt, wobei nur eine völlig geschlossene und trokkene Narbenspur zurückbleibt.
Bezugsgruppe der Männer: 5. Tag: 1
6. Tag: 4 und 1 aufgegeben
7. Tag: 4
8. Tag: 16 und 2 aufgegeben
9. Tag: 11
10. Tag: 14
11. Tag: 2
12. Tag: 3
Versuchsgruppe der Männer: 1. Tag: 1
2. Tag: 5
3. Tag: 37
4. Tag: 12
5. Tag: 1
6. Tag: 0
7. Tag: 1 aufgegeben
8. Tag: 1
Erste Bezugsgruppe der Frauen:
5. Tag: 1
6. Tag: 1
7. Tag: 4
8. Tag: 0
9. Tag: 2 aufgegeben
10. Tag bis zum 15. Tag: 0
16. Tag: 1
Erste Versuchsgruppe der Frauen:
1. Tag: 4
2. Tag: 2
3. Tag: 2
4. Tag: 1
Zweite Bezugsgruppe der Frauen:
13. Tag: 2
17. Tag: 1
Zweite Versuchsgruppe der Frauen:
4. Tag: 3
Außer einer bedeutenden Wirksamkeit des Produkts stellt man bei al len behandelten Personen eine ausgezeichnete Behandlungsverträglichkeit fest, es hat sich keinerlei Nebenwirkung gezeigt, die während des Versuchs aufgebenden Personen sind nicht durch eine Produktunverträglichkeit veranlaßt worden.

Claims

1. Zusammensetzung auf Basis von Proanthocyanidolen, insbesonderen aus pflanzlicher Herkunft, gekennzeichnet dadurch, daß ein Gewichtsanteil von mindestens 50 % der Moleküle ein anscheinendes Molekulargewicht von größer als 2000 hat, wobei dieser Anteil zu mindest aus 40 % Proanthocyanidolen besteht und der Prozentsatz in Abhängigkeit von der Gerbung ausgedrückt wird, wobei diese Zusammensetzung im wesentlichen frei ist von:

- aromatischen Essenzen und insbesondere essentiellen Ölen, Harzen und anderen lipophilen Substanzen,

- polymerisierten Zuckern, wie beispielsweise Stärke, den Gummis, den Cellulosederivaten,

- oligomeren Zuckern, wie beispielsweise die Saccharose, die Glucose, die Levulose.

2. Zusammensetzung auf Basis von Proanthocyanidolen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen frei ist von:

- pflanzlichen Proteinen,

- Gallensäuren und Gallentanninen,

- Flavonoide, soweit sie nicht zur Familie der Flavan- Diole gehören,

- Flavan-Diole, Oligomere,

- Phenolsäuren.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 95 Trockengewichts-% Proanthocyanidole enthält.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Proanthocyanidole ein Molekulargewicht zwischen etwa 2000 ± 500 und etwa 55000 ± 5000 haben.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie Proanthocyanidole eines Molekulargewichts von etwa 45000 ± 5000 umfaßt.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie Proanthocyanidole mit einem Molekulargewicht von etwa 5000 ± 500 umfaßt.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie Proanthocyanidole mit einem Molekulargewicht von etwa 3000 ± 300 umfaßt.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß diese Proanthocyanidole in polymerer Form entsprechend der folgenden Formel umfaßt:

wobei n eine ganze Zahl oberhalb oder gleich 3 ist und vorzugsweise im Bereich zwischen 3 und 350 liegt,

R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; sind jeweils oder unabhängig voneinander H, OH oder OCH&sub3;, wobei es sich bevorzugterweise um Polymere des Procyanidols handelt, in denen R&sub1;, R&sub2;, R&sub4; und R&sub5; Hydroxylgruppen und R&sub3; eine Wasserstoffgruppe sind, oder wobei es sich bevorzugterweise um ein Polymer des Prodelphinidols handelt, bei dem R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; un d R&sub5; Hydroxylgruppen sind, oder wobei es sich um ein Polymer des Promalvidols handelt, bei dem R&sub1; und R&sub3; Methoxygruppen und R&sub2;, R&sub4; und R&sub5; Hydroxylgruppen sind.

9. Pflanzenextrakt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, welches aus pflanzlichem Material gewonnen wurde, ausgewählt unter den Koniferen wie Cupressus sempervirens, Pinus maritima, den Akazien, den Mimosen.

10. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung auf Basis von Proanthocyanidolen aus einem Pflanzenteil, das Proanthocyanidole mit einem MG größer als 2000 nach einem der Ansprüche 1 bis 9 enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:

- Abkochen oder Auslaugen in einem Alkohol, insbesondere Methanol oder Ethanol, um Polysaccharide, insbesondere Stärke, zu eliminieren,

- Gewinnung der hydroalkoholischen Extrakte und Eindampf en zur Trockne unter vermindertem Druck, gegebenenfalls gefolgt von Waschen und Gewinnung des trockenen Rückstandes,

- Aufnehmen des trockenen Rückstandes und Filtration, um einen Teil der aromatischen Fraktion des Extrakts zu eliminieren,

- Extraktion in Gegenstromfahrweise mittels aufeinanderfolgend mindestens drei Lösungsmitteln zunehmender Polarität, insbesondere Ethylether, Ethylacetat, Butanol oder Methanol, insbesondere um verbleibende aromatische Essenzen zu eliminieren, den größten möglichen Teil der Oligomere mit einem MG unterhalb von 2000 und der Monomere des Proanthocyanidols und um in der alkoholischen Phase einen pflanzlichen Extrakt zu erhalten, der Proanthocyanidole mit einem Molekulargewicht oberhalb von 2000 enthält,

- gegebenenfalls Reinigung des erhaltenen Extraktes, um verbleibende Lösungsmittel zu eliminieren.

11. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung auf Basis von Proanthocyanidolen aus einem Pflanzenteil, enthaltend Proanthocyanidole mit einem MG oberhalb von 2000 nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:

- Ultrafiltration der hydroalkoholischen Lösungen durch eine organische Membran, die eine Porosität aufweist, welche eine Ausschlußgrenze oberhalb 20000 Dalton hat für ein globuläres Protein, das in einer wäßrigen Lösung ultrafiltriert wird,

- Gewinnung des hydroalkoholischen Extrakts und Eindampf en zur Trockne unter vermindertem Druck, gegebenenfalls gefolgt von einem Waschen und Gewinnen des trockenen Rückstandes.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß der pflanzliche gewonnene Extrakt lyophilisiert oder kristallisiert konzentriert wird.

13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das pflanzliche Ausgangsmaterial aus Zapfen von Cupressus sempervirens besteht.

14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie nicht cytotoxisch ist.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirksubstanz eine wirksame Menge mindestens einer Zusammensetzung aus Proanthocyanidolen nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfaßt.

16. Verwendung einer Zusammensetzung aus Proanthocyanidolen nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels mit antiviraler Aktivität.

17. Verwendung einer Zusammensetzung aus Proanthocyanidolen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikaments mit Anti-Protease-Wirkung.