JP4765058B2 - 核酸修飾前の検体の前処理方法 - Google Patents
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Description
Xiongら, Nucleioc Acids Res :2532-2534 Mullerら, The lancet, vol 363, 1283-1285, 2004
1.以下の工程を含み、重亜硫酸塩を添加する工程より前に検体からDNAを精製することなく、検体に存在する非メチル化シトシンをウラシルに修飾する方法:
- 検体を溶解液に溶解又は希釈して検体含有溶液を調製する工程;
- 前記溶液にグリコーゲンを添加する工程;
- 前記溶液に重亜硫酸塩を添加する工程;であり、
検体が、血液、血清、糞便、射出***、喀痰、唾液、および脳脊髄から選択される、方法。
2.以下の工程を含み、重亜硫酸塩を添加する工程より前に検体からDNAを精製することなく、検体に存在する非メチル化シトシンをウラシルに修飾する方法:
- 検体を溶解液に溶解又は希釈して検体含有溶液を調製する工程;
- 検体含有溶液を加熱する工程;
- 前記溶液にグリコーゲンを添加する工程;
- 前記溶液に重亜硫酸塩を添加する工程。
3.タンパク質変性剤を添加しないことを特徴とする、前項1または2に記載の非メチル化シトシンをウラシルに修飾する方法。
4.前記検体が、哺乳類の糞便である前項1〜3のいずれか1に記載の非メチル化シトシンをウラシルに修飾する方法。
5.検体を含有させた溶液10〜100μLに対し、2〜200 μgのグリコーゲンを添加する前項1〜4のいずれか一に記載の非メチル化シトシンをウラシルに修飾する方法。
6.前項1〜5のいずれか一に記載の非メチル化シトシンをウラシルに修飾する方法により、目的とする遺伝子を解析する方法。
7.前項1〜5のいずれか一に記載の非メチル化シトシンをウラシルに修飾する方法に使用する、以下の試薬を含み、タンパク質変性剤を含まない、核酸修飾試薬キット:
(1)グリコーゲンを含有する試薬;および、
(2)重亜硫酸塩を含有する試薬。
本発明において「検体」とは、ヒトを含む動物等の生体より採取したもので、一切処理を施していないものを表す。本発明ではこれを「試料」とは区別して用いている。「試料」とは上記検体に何らかの処理、例えば検体を適当な溶液に溶解するなどの処理を施して得られたものを表す。また、「検体」は、該検体中に存在する遺伝子に関して解析する対象となるものであれば良く、特に限定はされない。例えば「検体」には、動物から採取した組織、血液、血清、糞便、射出***、喀痰、唾液、脳脊髄等が含まれる。また本発明は、検体が糞便である場合に好適に用いることができる。糞便中には、腸粘膜細胞、血液細胞、腸内細胞叢、病原微生物(例えば細菌やウイルス)、腸内新生組織(大腸癌やポリープを含む)などが存在する。糞便は各種疾患関連遺伝子や微生物関連遺伝子、例えば遺伝病等の原因遺伝子、大腸癌組織由来遺伝子、又は細菌由来遺伝子等の解析を行うための非侵襲DNA材料として有効である。
例えば検体が糞便の場合、前記溶液は糞便に含まれる固形物を溶解することができ、タンパク質変性剤を含まないものであれば特に限定されないが、Tris-EDTAバッファーを含むpH値が 9前後の溶液が好ましい。該溶液を糞便1 mgに対し、0.1〜100 μL、好ましくは1〜30 μL、より好ましくは3〜7 μL前後で添加して糞便含有溶液を調製することができる。例えば、1.5 mLチューブに糞便を100 mg取り、溶解バッファーを500 μL入れ、糞便を溶解することができる。
上記のようにして得られた検体含有溶液中にグリコーゲンを共存させることにより本発明の前処理方法を行う。グリコーゲンの添加時期は、核酸修飾工程の前であれば特に限定されない。
グリコーゲンはDNAキャリアとして作用するため、該作用をするような量でグリコーゲンを添加する必要がある。遠心分離していない検体含有溶液、又は遠心分離後であれば上澄み液10 〜100 μLに対して、グリコーゲンとして2 〜200 μg加えることができる。例えば、上記遠心分離して得られた上澄み液42 μLにグリコーゲンを45 μg加え、溶液を合計45 μLとすることができる。グリコーゲンは市販のものを用いることができる。グリコーゲンは粉末を該上澄み液に直接添加して溶解させてもよいが、グリコーゲン溶液として添加することが好ましい。グリコーゲン溶液の濃度は、試料の量等によって適宜調整することができるが、例えば15 〜20 mg/mLとすることができる。グリコーゲンが試料中に存在する状態で、15 〜30 分間、37 ℃でインキュベーションする。
本発明は、上記前処理方法を適用した検体中の特定の核酸を人為的に修飾する方法にも及ぶ。本明細書において「特定の核酸」とは、以後の解析方法に応じて「人為的な修飾」が必要な核酸を意味する。例えば、遺伝子中のメチル化の有無の検出を目的とする解析方法において、「特定の核酸」とは遺伝子中の非メチル化シトシン(メチル化シトシンではない)を示し、「人為的な修飾」とは、好ましくは重亜硫酸塩による該非メチル化シトシンのウラシルへの変換をいう。
本発明は、上記修飾方法により核酸を修飾して、目的とする遺伝子を解析する方法にも及ぶ。本発明の解析方法には、種々の公知の方法を用いることができる。遺伝子中のメチル化の有無を検出を目的とする場合は、MSP法、COBRA法、Methylight法等に当該修飾DNAを用いることができる。
本発明は、核酸の修飾前に使用する試薬であって、グリコーゲンを含み、タンパク質変性剤を含まないことを特徴とする検体前処理試薬、上記の前処理方法に用いるグリコーゲンを含みタンパク質変性剤を含まない検体前処理試薬キット、及び上記の核酸修飾方法に用いる核酸修飾試薬キットにも及ぶ。
糞便を溶解するための溶液として、500 mmol/L Tris-HCl、16 mmol/L EDTA、10 mmol/L NaCl、pH 9.0の組成の溶液(溶解バッファー)を調製した。1.5 mLチューブにサンプルナンバー9の糞便78 mg、サンプルナンバー12の糞便117 mg、サンプルナンバー45の糞便162 mg、及びサンプルナンバー51の糞便146 mgを入れて溶解バッファー 1,000 μLに糞便を溶解した。次に、該溶解溶液を95 ℃で10 分間加熱処理した。
得られた糞便溶解溶液を、5,000 rpm、3 分間で遠心分離を行った。
上記遠心分離して得られた上澄み液(サンプルナンバー45−1、51−1)(図2)43 μLにグリコーゲン溶液(15 mg/mL)2 μLを加え、撹拌した。また、糞便溶解溶液の上澄み液100 μLを溶解バッファー 500 μLにて希釈し(サンプルナンバー45−2、51−2)(図2)、得られた希釈溶液43 μLにグリコーゲン溶液(15 mg/mL)2 μLを加え、攪拌した。
以下の工程は、DNAメチル化キット(DNA methylation Kit, EZ:ZYMO RESEARCH製)の手順に従って行った。キットに含まれるM-Dilution Buffer(水酸化ナトリウム溶液)を各サンプルに5 μL加えて、15 分間、37 ℃にてインキュベートを行った。
キットを用いて非メチル化シトシンをウラシルに変換させた。キットに含まれるCT Conversion reagent(重亜硫酸ナトリウム溶液)を上記サンプルナンバー9、12、45−1、51−1、45−2、51−2の溶液に添加してインキュベートし、全ての非メチル化シトシンをウラシルに変換した。
以上により、糞便に存在する核酸の全ての非メチル化シトシンをウラシルに変換した。
6)核酸の精製
得られた修飾核酸をキットに含まれるZymo-Spin I Columnを用いて、高純度にまで精製し、以下の実験例1に用いた。
上記修飾核酸を用いて、糞便中に存在する遺伝子におけるシトシンのメチル化有無、具体的には、APC遺伝子のプロモーター領域に存在するCpG領域のシトシンのメチル化の有無について、MSSP法(特願2003-435631号、又は特願2003-209838号参照)を用いて検出を行った。APC遺伝子は細胞の増殖***を抑制調節し、APC遺伝子がメチル化されていると細胞***が抑制されないと考えられている。
APC1A-NS: 5'ATATTTTYGAGGGGTAYGGGGTTA(配列番号1)
APC1A-MS: 5'TATTGCGGAGTGCGGGTC(配列番号2)
APC1A-NAS: 5'ACRAAAATAAAAAACRCCCTAATC(配列番号3)
APC1A-NSとAPC1A-NASはメチル化シトシンの存在するアレルにも非メチル化シトシンの存在するアレルにもハイブリダイズするように設計されており、このプライマーセットにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、148bpの増幅産物が得られる。一方、APC1A-MSはメチル化シトシンの存在するアレルのみにハイブリダイズするように設計されており、メチル化シトシンが存在するならばAPC1A-MSとAPC1A-NASのプライマーセットにより、84bpの増幅産物が得られる。つまり、APC遺伝子のプロモーター領域に存在するCpG領域のシトシンにメチル化が存在する場合は、148bpと84bpの2つの遺伝子増幅産物が認められることとなり、一方、APC遺伝子のプロモーター領域に存在するCpG領域のシトシンにメチル化が存在しない場合は148bpの1つのみの遺伝子増幅産物が認められることになる。
図3に示されるように、サンプルナンバー12、サンプルナンバー51−1、51−2には、148bpと84bpの2つの遺伝子増幅産物が認められたので、これらのAPC遺伝子のプロモーター領域に存在するCpG領域のシトシンには、メチル化が認められることが分かった。一方、サンプルナンバー9、サンプルナンバー45−1、45−2には、148bpの遺伝子増幅産物しか認められなかったので、これらのAPC遺伝子のプロモーター領域に存在するCpG領域のシトシンには、メチル化が認められないことが分かった。
また、APC遺伝子のプロモーター領域において、サンプルナンバー45−1、45−2には共にメチル化は認められず、サンプルナンバー51−1、51−2には共にメチル化が認められた。従って、本発明の方法によると、糞便溶解溶液中の糞便の濃度が異なっていても、メチル化の有無の検出が可能であることが示された。
Claims (7)
- 以下の工程を含み、重亜硫酸塩を添加する工程より前に検体からDNAを精製することなく、検体に存在する非メチル化シトシンをウラシルに修飾する方法:
- 検体を溶解液に溶解又は希釈して検体含有溶液を調製する工程;
- 前記溶液にグリコーゲンを添加する工程;
- 前記溶液に重亜硫酸塩を添加する工程;であり、
検体が、血液、血清、糞便、射出***、喀痰、唾液、および脳脊髄から選択される、方法。 - 以下の工程を含み、重亜硫酸塩を添加する工程より前に検体からDNAを精製することなく、検体に存在する非メチル化シトシンをウラシルに修飾する方法:
- 検体を溶解液に溶解又は希釈して検体含有溶液を調製する工程;
- 検体含有溶液を加熱する工程;
- 前記溶液にグリコーゲンを添加する工程;
- 前記溶液に重亜硫酸塩を添加する工程。 - タンパク質変性剤を添加しないことを特徴とする、請求項1または2に記載の非メチル化シトシンをウラシルに修飾する方法。
- 前記検体が、哺乳類の糞便である請求項1〜3のいずれか1に記載の非メチル化シトシンをウラシルに修飾する方法。
- 検体を含有させた溶液10〜100μLに対し、2〜200 μgのグリコーゲンを添加する請求項1〜4のいずれか一に記載の非メチル化シトシンをウラシルに修飾する方法。
- 請求項1〜5のいずれか一に記載の非メチル化シトシンをウラシルに修飾する方法により、目的とする遺伝子を解析する方法。
- 請求項1〜5のいずれか一に記載の非メチル化シトシンをウラシルに修飾する方法に使用する、以下の試薬を含み、タンパク質変性剤を含まない、核酸修飾試薬キット:
(1)グリコーゲンを含有する試薬;および、
(2)重亜硫酸塩を含有する試薬。
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