-
Gebiet der
Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Onkologie und insbesondere betrifft
sie Olegonukleotide zur Detektion von Karzinomen in einer Testprobe.
-
Hintergrund
der Erfindung
-
Studien
haben vorgeschlagen, daß die
Anwesenheit von Epithelialzellen in dem haematopoietischen System
die Ausbreitung von Krebs von einem begrenzten Bereich zu anderen
Teilen des Körpers
anzeigt (auch bekannt als Metastasen). Diese Entdeckung ist wichtig,
da Metastasen ein Diagnostikum sind für bestimmte Stadien von Krebs,
und Entscheidungen, die die geeignete Behandlung eines Krebspatienten
betreffen, sind im großen
Maße abhängig von
der richtigen Charakterisierung des Stadiums der Krankheit. Insbesondere
kann die Behandlung von Patienten, die einen abgegrenzten Krebs
haben, in größtem Maße unterschiedlich
sein von der Behandlung von Patienten in metastatischen Stadien
von Krebs.
-
Frühere Versuche,
die Ausbreitung von Krebs durch Detektion von Epithelialzellen in
dem haematopoietischen System zu detektieren, schloß immunozytologische
Assayverfahren ein. Leider sind diese Verfahren in großem Maße ungenau,
weil Antikörper,
die in diesen Assays verwendet werden, und scheinbar spezifisch
sind für
Epithelialzellen, eine Kreuzreaktivität zeigen mit Zellen, die normalerweise
in dem haematopoietischen System gefunden werden. Somit werden manchmal "normale haematopoietische
Zellen" detektiert
in der Abwesenheit von metastatischen Zellen und deshalb können entsprechend
diesen Assayverfahren falsche positive Ergebnisse erhalten werden.
Zusätzlich
fehlt den immunozytologischen Assays Sensitivität und sie können falsche negative Ergebnisse
erzeugen, wenn niedrige Spiegel an Epithelialzellen tatsächlich in
dem haematopoietischen System anwesend sind. Dementsprechend können frühe Stadien
von metastasierendem Krebs unter Verwendung von immunozytologischen
Assays falsch diagnostiziert werden.
-
Mit
dem Aufkommen von Nukleinsäureamplifikationsreagenzien
wie zum Beispiel der Polymerasekettenreaktion (PCR), können Epithelialzellen,
die in dem haematopoietischen System anwesend sind, auf Nukleinsäureebene
anstatt auf Proteinebene detektiert werden. Somit werden Probleme,
die mit kreuzreaktiven Antikörpern
zusammenhängen,
vermieden. Zusätzlich
ist es wohl bekannt, daß Nukleinsäureamplifikationen signifikant
sensitiver sind als konventionellere Antikörper-basierte Assayverfahren.
Amplifikation-basierte Assays zur Detektion von Epithelialzellen
in dem Blutstrom haben deshalb signifikante Vorteile gegenüber immunozytologischen
Assayverfahren zur Detektion von frühen Stadien von metastasierendem
Krebs bereitgestellt.
-
Von
PCR-basierten Assays, die verwendet werden, um Epithelialzellen
in dem haematopoietischen System zu detektieren, wurde in der Literatur
berichtet. Die meisten dieser Assays haben eine Nukleinsäuresequenz
als Ziel, welche Cytokeratin 19 (CK19) kodiert, ein Protein, das
auf der Oberfläche
von Epithelialzellen gefunden wird. Jedoch sind Pseudogene (die
eine Nukleinsäuresequenz
umfassen, die das Gen für
CK19 imitiert) in dem menschlichen Genom anwesend. Somit ist es
eine Herausforderung angesichts dieser sich entwickelnden Amplifikationsassays,
um eine CK19 Zielsequenz zu detektieren, Assays zu entwickeln, welche eine
Sequenz aus dem CK19 Gen, aber nicht das nahe verwandte Pseudo-Gen,
amplifizieren und detektieren.
-
WO
99/14372 offenbart die Nukleotidsequenz, welche Cytokeratin 19 kodiert
(GenBank ID No. 184568), und schlägt die Verwendung von Primern
vor, die mindestens 50% Identität
haben mit einer solchen Sequenz zur Amplifizierung und Detektion
einer Cytokeratin 19 Zielsequenz in einer Probe. Auch offenbaren Stasiak
P. C. et al., Nucleic Acids Research, (1987), Band 15, Nr. 23, 10058,
die cDNA-Sequenz von menschlichem Keratin 19. Bustin, S.A. et al.,
British Journal of Cancer, (1999) 79 (11/12), 1813–1820, offenbaren
einen RT-PCR-Assay, um auf die Expression von Cytokeratin 19 in
dem peripheren Blut von sowohl gesunden als auch Kolorektalkrebs-
Patienten zu screenen. In der letztgenannten Studie wurde eine Expression
von Cytokeratin 19 mRNA in 30% von gesunden Patienten detektiert,
was zu dem Schluß führte, dass
Cytokeratin 19 kein verlässlicher
Marker für
die Detektion von Colon-Epithelzellen in peripherem Blut ist. Ruud
P. et al., Int. J. Cancer (1999) 80, 119–125, offenbaren Sequenzreihen
von Cytokeratin 19 und seine Pseudogene CK19a und CK19b, und schließen daraus,
daß solche
Pseudogene RT-PCR-Assays stören
können,
welche verwendet wurden, um mikrometastatische Tumorzellen zu detektieren.
-
Zusätzlich ist
es wohl bekannt, daß Amplifikationsprimersequenzen
basierend auf Computervergleichen von nahe verwandten Sequenzen
gewählt
werden können.
Theoretisch sollten Sequenzen, die auf diese Weise ausgewählt wurden,
von der gewählten
Zielsequenz wirksam Kopien erzeugen, wenn sie gemäß Nukleinsäureamplifikationsprinzipien
verwendet werden. Ungeachtet der theoretischen Wirksamkeit von Sequenzen,
die in der oben angegebenen Art und Weise ausgewählt wurden, ist es oftmals
wahr, daß solche
Sequenzen keine akzeptablen Mengen an Amplifikationsprodukt erzeugen.
Leider ist dieses Phänomen
nicht verstanden. Dementsprechend kann, während Primer anfangs unter
Verwendung von Computerprogrammen gescreent werden können, die
Wirksamkeit nicht adäquat
bestimmt werden, bis solche Primer in der Praxis verwendet werden.
-
Eine
weitere Herausforderung betrifft diejenigen, die PCR-Assays entwickeln,
welche Mikropartikel-Einfang basierte Detektionsverfahren zur Detektion
von Amplifikationsprodukten verwenden. Genauer müssen amplifizierte Zielsequenzen,
die mit Hilfe der Mikropartikel detektiert wurden, ausreichend kurz
sein, so daß das
Amplifikationsprodukt, das auf dem Mikropartikel eingefangen ist,
nicht den Einfang von zusätzlichem
Amplifikationsprodukt beeinträchtigt.
Dementsprechend stehen diejenigen, die es gewählt haben Amplifikationsprodukte
mit der Hilfe eines Mikropartikels zu detektieren, einer zusätzlichen
Einschränkung
hinsichtlich der Auswahl einer geeigneten Zielsequenz gegenüber. Insbesondere
sind geeignete Zielsequenzen beschränkt auf Sequenzen, die relativ
kurz sind.
-
Es
besteht daher ein Bedürfnis
im Fachgebiet nach einem Verfahren und Sequenzen, welche entsprechend
Nukleinsäureamplifikationsprinzipien
verwendet werden können,
um eine CK19 Zielsequenz unter Verwendung von Mikropartikel-basierten Detektionstechniken
zu detektieren.
-
Zusammenfassung der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung stellt Nukleinsäuresequenzen bereit, welche
verwendet werden können,
um eine CK 19 Zielsequenz spezifisch und empfindlich zu detektieren.
Insbesondere sind Primersequenzen, die in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden, bezeichnet als Sequenzidentifikationsnummer 2
und Sequenzidentifikationsnummer 3. Sequenzen, die hierin als Sequenzidentifikationsnummer
4, Sequenzidentifikationsnummer 5, Sequenzidentifikationsnummer
6 und Sequenzidentifikationsnummer 7 identifiziert werden, werden
als Sonden verwendet zur Detektion des Amplifikationsprodukts, das
durch Sequenzidentifikationsnummern 2 und 3 erzeugt wurde. Kombinationen
der oben angegebenen Sequenzen können
in Kits bereitgestellt werden, zusammen mit anderen Reagenzien zur
Durchführung
einer Amplifikationsreaktion, um eine CK 19 Zielsequenz in peripherem
Blut zu detektieren.
-
Die
CK 19 Zielsequenz, hierin bezeichnet als Sequenzidentifikationsnummer
1, kann amplifiziert werden durch Bilden einer Reaktionsmischung,
die Nukleinsäureamplifikationsreagenzien,
eine Testprobe, die eine CK 19 Zielsequenz enthält, und ein Primerset, das
Sequenzidentifikationsnummern 2 und 3 enthält, umfaßt. Nach der Amplifikation
kann die amplifizierte Zielsequenz detektiert werden. Zum Beispiel
kann jede Sonde oder jede Kombination an Sonden, bezeichnet als
Sequenzidentifikationsnummern 4, 5, 6 und 7, verwendet werden, um
die amplifizierte Zielsequenz zu hybridisieren, um ein Sonde/Amplifikationsprodukt-Hybrid
zu bilden, welches dann unter Verwendung von Mikropartikeleinfangtechniken
detektiert werden kann. Folglich können die Primer oder Sonden
markiert sein, um die amplifizierte Zielsequenz einzufangen und
zu detektieren, und deshalb die Anwesenheit von Zielsequenz in der
Testprobe anzuzeigen.
-
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
-
Wie
zuvor erwähnt,
stellt die vorliegende Erfindung Reagenzien, Verfahren und Kits
zur Amplifizierung und Detektion einer CK 19 Zielsequenz in einer
Testprobe bereit. Insbesondere können
Sequenzidentifikationsnummern 2 und 3 als Amplifikationsprimer verwendet
werden, um die CK 19 Zielsequenz zu amplifizieren, die hierin als
Sequenzidentifikationsnummer 1 bezeichnet wird. Es wurde herausgefunden,
daß diese
Primer spezifisch und empfindlich ein Amplifikationsprodukt erzeugen,
das dem Mikropartikeleinfang und Detektionstechniken zugänglich ist.
Sondensequenzen mit Sequenzidentifikationsnummern 4–7 können verwendet werden,
um die Spezifität
zu versichern und das Amplifikationsprodukt zu detektieren.
-
Die
Primer- und Sondensequenzen, die hierin offenbart sind, können routinemäßig synthetisiert
werden unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken, die derzeit
verfügbar
sind. Zum Beispiel kann eine Sequenz von DNA synthetisiert werden
unter Verwendung von konventioneller Nukleotidphosphoramidit-Chemie und
den Instrumenten, die erhältich
sind von Applied Biosystems, Inc, (Foster City, CA); DuPont, (Wilmington, DE);
oder Milligen, (Bedford, MA). In ähnlicher Weise, und wenn gewünscht, können die
Sequenzen markiert werden unter Verwendung der Methodiken, die im
Fachgebiet wohl bekannt sind, wie zum Beispiel beschrieben in U.S.
Patent Anmeldungen mit den Nrn. 5,464,746; 5,424,414; und 4,948,882.
-
Eine "Zielsequenz", wie hierin verwendet,
bedeutet eine Nukleinsäuresequenz,
welche detektiert, amplifiziert, sowohl amplifiziert als auch detektiert
wird oder anderweitig komplementär
ist zu einer der Sequenzen, die hierin bereitgestellt werden. Während sich
der Ausdruck Zielsequenz manchmal auf einzelsträngig bezieht, werden diejenigen,
die im Fachgebiet bewandert sind erkennen, daß die Zielsequenz tatsächlich doppelsträngig sein
kann.
-
Der
Ausdruck "Testprobe", wie hierin verwendet,
bedeutet irgendetwas, von dem vermutet wird, daß es die Zielsequenz enthält. Die
Testprobe kann abgeleitet sein von irgendeiner biologischen Quelle,
wie zum Beispiel Blut, alveolarer Bronchiallavage, Speichel, Rachenabstrichen,
Augenlinsenflüssigkeit,
Zerebrospinalflüssigkeit,
Schweiß,
Sputum, Urin, Milch, Ascitesfluid, Schleim, Synovialflüssigkeit,
Peritonealflüssigkeit, Fruchtwasser,
Geweben, wie zum Beispiel Herzgewebe und dergleichen, oder Fermentationsbrühen, Zellkulturen,
chemischen Reaktionsmischungen und dergleichen. Die Testprobe kann
verwendet werden (i) direkt wie aus der Quelle erhalten, oder (ii)
nach einer Vorbehandlung, um den Charakter der Probe zu modifizieren.
Somit kann die Testprobe vor der Verwendung vorbehandelt sein durch
beispielsweise Herstellen von Plasma aus Blut, Zerstören von
Zellen, Herstellen von Flüssigkeiten
aus festen Materialien, Verdünnen
von viskosen Flüssigkeiten,
Filtern von Flüssigkeiten,
Destillieren von Flüssigkeiten,
Konzentrieren von Flüssigkeiten,
Inaktivieren von störenden
Komponenten, Hinzufügen
von Reagenzien, Reinigen von Nukleinsäuren und dergleichen. Am üblichsten
wird die Testprobe peripheres Blut sein.
-
Sequenzidentifikationsnummern
2 und 3 können
als Amplifikationsprimer verwendet werden, gemäß Amplifikationsverfahren,
die im Fachgebiet wohl bekannt sind, um die Zielsequenz zu amplifizieren.
Vorzugsweise werden die Sequenzen, die hierin bereitgestellt sind,
gemäß den Prinzipien
der Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet, beschrieben in U.S.
Patenten 4,683,195 und 4,683,202. Es wird von denjenigen, die im Fachgebiet
bewandert sind, verstanden werden, daß für den Fall, daß die Zielsequenz
RNA ist, ein reverser Transkriptionsschritt in die Amplifikation
der Zielsequenz eingeschlossen werden sollte. Enzyme, die reverse Transkriptase-Wirksamkeit haben,
wie zum Beispiel Rt TH, sind wohl bekannt für ihre Wirksamkeit, daß sie in der
Lage sind, eine DNA-Sequenz von einer RNA-Matrize zu synthetisiseren.
Reverse Transkriptions-PCR (RT PCR) ist im Fachgebiet wohl bekannt
und in U.S. Patent. Nrn. 5,310,652 und 5,322,770 beschrieben.
-
Somit
umfassen Amplifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung im allgemeinen
die Schritte von (a) Bilden einer Reaktionsmischung, die Nukleinsäureamplifikationsreagenzien,
Sequenzidentifikationsnummern 2 und 3, und eine Testprobe, von der
vermutet wird, daß sie
eine Zielsequenz enthält,
umfaßt;
und (b) Unterwerfen der Mischung Amplifikationsbedingungen, um mindestens
eine Kopie einer Nukleinsäuresequenz zu
erzeugen, die komplementär
ist zu der Zielsequenz. Es wird verstanden werden, daß Schritt
(b) des oben genannten Verfahrens mehrere Male wiederholt werden
kann durch thermische Wechselbeanspruchung (thermal cycling) der
Reaktionsmischung, wie es im Fachgebiet wohl bekannt ist.
-
Wie
oben angegeben, umfaßt
die Reaktionsmischung "Nukleinsäureamplifikationsreagenzien", welche Reagenzien
einschließen,
die wohl bekannt sind, und die folgendes einschließen können, aber
nicht darauf beschränkt
sind: ein Enzym, das Polymeraseaktivität besitzt (und, wenn nötig, reverse
Transkriptaseaktivität),
Enzymcofaktoren, wie zum Beispiel Magnesium oder Mangan; Salze;
Nikotinamidadenindinukleotid (NAD); und Desoxynukleotidtriphosphate
(dNTPs), wie zum Beispiel Desoxyadenintriphosphat, Desoxyguanintriphosphat,
Desoxycytosintriphosphat und Desoxythymintriphosphat.
-
"Amplifikationsbedingungen" sind im allgemeinen
definiert als Bedingungen, welche die Hybridisierung oder das Annealing
von Primersequenzen an eine Zielsequenz und die nachfolgende Verlängerung
der Primersequenzen fördern.
Es ist im Fachgebiet wohl bekannt, daß ein solches Annealing in
einer ziemlich voraussehbaren Art und Weise abhängig ist von verschiedenen
Parametern, einschließlich
der Temperatur, Ionenstärke,
Sequenzlänge,
Komplementarität,
und dem G:C Gehalt der Sequenzen. Zum Beispiel fördert das Absenken der Temperatur
in der Umgebung der komplementären
Nukleinsäuresequenzen
das Annealing. Für jeden
gegebenen Satz (Set) an Sequenzen kann die Schmelztemperatur, oder
Tm, durch irgendeines von verschiedenen bekannten Verfahren geschätzt werden.
Typischerweise verwenden diagnostische Anwendungen Hybridisationstemperaturen,
welche nahe bei (d.h. Innerhalb 10°C) der Schmelztemperatur sind.
Ionische Stärke
oder "Salz" Konzentration wirkt
sich auch auf die Schmelztemperatur aus, da kleine Kationen dazu
neigen, die Bildung von Duplexen durch Aufheben der negativen Ladung
auf der Phosphodiesterhauptkette zu stabilisieren. Typische Salzkonzentrationen
hängen
von der Natur und der Valenz des Kations ab, werden aber leicht
von denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, verstanden. In ähnlicher
Weise sind ein hoher G:C Gehalt und eine erhöhte Sequenzlänge auch
dafür bekannt,
daß sie
die Duplexbildung stabilisieren, weil G:C Paare 3 Wasserstoffbindungen
einschließen,
wohingegen A:T Paare nur zwei haben, und weil längere Sequenzen mehr Wasserstoffbindungen
haben, was die Sequenzen zusammenhält. Somit wirken sich ein hoher G:C
Gehalt und längere
Sequenzlängen
durch Erhöhung
der Schmelztemperatur auf die Hybridisierungsbedingungen aus.
-
Wenn
Sequenzen einmal für
eine gegebene diagnostische Anwendung ausgewählt wurden, wird der G:C Gehalt
und die Länge
bekannt sein und kann berücksichtigt
werden für
die genaue Bestimmung, welche Hybridisierungsbedingungen umfaßt werden.
Da die Ionenstärke
typischerweise für
die enzymatische Wirksamkeit optimiert wird, ist der einzige Parameter,
der zur Variierung übrig
bleibt, die Temperatur. Im allgemeinen wird die Hybridisationstemperatur
nahe an oder bei der Tm der Primer oder der Sonde gewählt. Somit
ist das Erhalten von geeigneten Hybridisationsbedingungen für einen
speziellen Primer, eine Sonde, oder ein Primer- und Sondenset wohl
innerhalb des üblichen
Könnens
von jemandem, der in diesem Fachgebiet tätig ist.
-
Das
wie oben erzeugte Amplifikationsprodukt kann während oder nach der Amplifikation
der CK-19 Zielsequenz detektiert werden. Verfahren zur Detektion
der Amplifikation einer Zielsequenz während der Amplifikation sind
beschrieben in U.S. Patent Nr. 5,210,015. Gelelektrophorese kann
verwendet werden, um die Produkte einer Amplifikationsreaktion nach
ihrer Vervollständigung
zu detektieren. Vorzugsweise werden jedoch Amplifikationsprodukte
von anderen Reaktionskomponenten getrennt und unter Verwendung von
Mikropartikeln und markierten Sonden detektiert. Daher schließen Verfahren
zur Detektion der amplifizierten CK-19 Zielsequenz die folgenden
Schritte ein: (a) Hybridisieren von mindestens einer Hybridisationssonde
an die Nukleinsäuresequenz,
die komplementär
ist zu der Zielsequenz, um ein Hybrid zu bilden, das die Sonde und
die Nukleinsäuresequenz,
die komplementär
ist zu der Zielsequenz, umfaßt;
und (b) Detektieren des Hybrids als ein Anzeichen der Anwesenheit
der Zielsequenz in der Testprobe.
-
Hybride,
die wie oben gebildet wurden, können
detektiert werden unter Verwendung von Mikropartikeln und Markern,
die verwendet werden können,
um solche Hybride abzutrennen und zu detektieren. Vorzugsweise wird
die Detektion durchgeführt
gemäß den Protokollen,
die durch die kommerziell erhältliche
Abbott LCx® Instrumentierung
verwendet werden (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL).
-
Der
Ausdruck "Marker", wie hierin verwendet,
bedeutet ein Molekül
oder einen Anteil, der eine Eigenschaft oder Charakteristik hat,
die in der Lage ist detektiert zu werden. Ein Marker kann direkt
detektierbar sein, mit beispielsweise Radioisotopen, Fluorophoren,
Chemiluminophoren, Enzymen, kolloidalen Partikeln, fluoreszierenden
Mikropartikeln und dergleichen; oder ein Marker kann indirekt detektierbar
sein, wie zum Beispiel mit spezifischen Bindungsgliedern. Es wird
verstanden werden, daß direkt
detektierbare Marker zusätzliche Komponenten
erfordern können,
wie zum Beispiel Substrate, Triggerreagenzien, Licht und dergleichen,
um die Detektion des Markers zu ermöglichen. Wenn indirekt detektierbare
Marker verwendet werden, werden sie typischerweise in Kombination
mit einem "Konjugat" verwendet. Ein Konjugat
ist typischerweise ein spezifisches Bindungsglied, welches an einen
direkt detektierbaren Marker angeheftet oder gekoppelt wurde. Kopplungschemien
zur Synthetisierung eines Konjugats sind im Fachgebiet wohl bekannt
und können
beispielsweise irgendein chemisches Mittel und/oder physikalisches
Mittel einschließen, das
nicht die spezifische Bindungseigenschaft des spezifischen Bindungsglieds
oder die Detektionseigenschaft des Markers zerstört. Wie hierin verwendet, bedeutet "spezifisches Bindungsglied" ein Glied eines
Bindungspaars, d.h., zwei unterschiedliche Moleküle, wo eines der Moleküle durch
zum Beispiel ein chemisches oder physikalisches Mittel spezifisch
an das andere Molekül
bindet. Zusätzlich
zu Antigen und Antikörper
spezifischen Bindungspaaren schließen andere spezifische Bindungspaare
folgende ein, sollen aber nicht darauf beschränkt sein: Avidin und Biotin;
Haptene und Antikörper,
die spezifisch sind für
Haptene; komplementäre
Nukleotidsequenzen; Enzymcofaktoren oder Substrate und Enzyme; und
dergleichen.
-
Ein "Mikropartikel" bezieht sich auf
irgendein Material, welches unlöslich
ist, oder unlöslich
gemacht werden kann durch eine nachfolgende Reaktion, und in einer
partikulären
Form ist. Somit können
Mikropartikel Latex, Plastik, derivatisiertes Plastik, magnetisches
oder nicht magnetisches Metall, Glas, Silikon oder dergleichen sein.
Eine große
Reihe an Mikropartikelkonfigurationen sind auch wohl bekannt und
schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf folgende: Kügelchen,
Späne,
Körnchen,
oder andere Partikel, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert
sind, wohl bekannt sind. Mikropartikel gemäß der Erfindung sind vorzugsweise
zwischen 0,1 μm
und 1 μm
in der Größe und noch
bevorzugter zwischen 0,3 mm und 0,6 μm in der Größe.
-
Gemäß einer
Ausführungsform
können
Hybride detektiert werden durch Einschließen von Markern in die Primer-
und/oder Sondensequenzen, um die Detektion zu erleichtern. Somit
können
erste und zweite spezifische Bindungsglieder, angeheftet an die
Primer und Sonden, verwendet werden, um die Hybride an Mikropartikel
zu immobilisieren und die Anwesenheit der Mikropartikel mit der
Hilfe eines Konjugats detektieren.
-
Gemäß einer
anderen Ausführungsform
kann eine Kombination aus spezifischen Bindungsgliedern und direkt
detektierbaren Markern verwendet werden, um Hybride zu detektieren.
Zum Beispiel können
spezifische Bindungsglieder in die Hybride eingeführt werden,
unter Verwendung von Primern, die mit spezifischen Bindungsgliedern
markiert sind. Ein direkt detektierbarer Marker kann in die Hybride
eingeschlossen werden unter Verwendung einer Sonde, welche mit einem
direkt detektierbaren Marker markiert wurde. Somit können Hybride
an einen Mikropartikel immobilisiert werden unter Verwendung des
spezifischen Bindungsglieds, und direkt detektiert werden mit Hilfe
des Markers auf der Sonde. Es wird verstanden werden, daß andere
Detektionskonfigurationen eine Frage der Wahl sind für diejenigen,
die im Fachgebiet bewandert sind.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
wird "Oligonukleotidhybridisations
PCR" (hierin variabel bezeichnet
als "OH PCR") Amplifikationsreaktion,
wie in WO 97/07235 beschrieben, verwendet, um die CK19 Zielsequenz
zu detektieren. Kurz gesagt umfassen die Reagenzien, die in dem
bevorzugten Verfahren verwendet werden, mindestens einen Amplifikationsprimer
und mindestens eine interne Hybridisationssonde, ebenso wie Amplifikationsreagenzien
zur Durchführung
einer Amplifikationsreaktion.
-
Die
Primersequenz wird verwendet, um die Verlängerung einer Kopie einer Zielsequenz
(oder ihres Komplements) zu starten und wird mit entweder einem
Einfangmarker oder einem Detektionsmarker markiert. Die Sondensequenz
wird verwendet, um mit der Sequenz zu hybridisieren, die durch die
Primersequenz erzeugt wurde, und sie hybridisiert typischerweise
mit einer Sequenz, die nicht die Primersequenz einschließt. Ähnlich zu
der Primersequenz wird auch die Sondensequenz markiert mit entweder
einem Einfangmarker oder einem Detektionsmarker, mit der Ausnahme,
daß wenn
der Primer mit einem Einfangmarker markiert ist, die Sonde mit einem
Detektionsmarker markiert ist, und umgekehrt. Detektionsmarker haben
die gleiche Definition wie "Marker", die zuvor definiert
wurden, und "Einfangmarker" werden typischerweise
verwendet, um Extensionsprodukte, und Sonden, die mit irgendwelchen
solchen Produkten assoziiert sind, von anderen Amplifikationsreaktanden
zu trennen. Spezifische Bindungsglieder (wie zuvor definiert) sind
für diesen
Zweck gut geeignet. Auch Sonden, die gemäß diesem Verfahren verwendet
werden, sind vorzugsweise an ihren 3'-Enden blockiert, so daß sie nicht
unter Hybridisationsbedingungen verlängert werden. Verfahren zur
Verhinderung der Verlängerung
(Extension) einer Sonde sind wohl bekannt und eine Frage der Wahl
für jemanden,
der im Fachgebiet bewandert ist. Typischerweise wird das Hinzufügen einer
Phosphatgruppe an das 3'-Ende
der Sonde ausreichen für
die Zwecke der Blockierung der Extension der Sonde.
-
Gemäß der obigen
bevorzugten Ausführungsform,
wo die Sonde anfangs Teil der Reaktionsmischung ist, ist es vorzuziehen,
Primer, Sonden und Amplifikationsbedingungen so auszuwählen, daß die Sondensequenz
eine niedrigere Schmelztemperatur als die Primersequenzen hat, damit
nach dem Platzieren der Reaktionsmischung unter Amplifikationsbedingungen
Kopien der Zielsequenz oder ihres Komplements erzeugt werden, bei
einer Temperatur oberhalb der Tm der Sonde. Nachdem solche Kopien
synthetisiert wurden, werden sie denaturiert und die Mischung wird
gekühlt,
um die Bildung von Hybriden zwischen den Sonden und irgendwelchen
Kopien des Ziels oder seines Komplements zu ermöglichen. Die Geschwindigkeit
der Temperaturreduktion von der Denaturierungstemperatur hinab zu
einer Temperatur, bei welcher die Sonden an einzelsträngige Kopien
binden, ist vorzugsweise recht schnell (zum Beispiel 8 bis 15 Minuten)
und insbesondere durch den Temperaturbereich, in welchem ein Enzym,
das Polymeraseaktivität
besitzt, für
die Primerextension wirksam ist. Eine solche schnelle Abkühlung fördert die
Kopiesequenz/Sondenhybridisierung eher als die Primer/Kopiesequenzhybridisierung
und -Extension.
-
Die
folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung
weiter zu veranschaulichen und sie sollen die Erfindung nicht einschränken.
-
Beispiele
-
Die
folgenden Beispiele demonstrieren die Detektion von Cytokeratin
19 (CK19) unter Verwendung der DNA Oligomer-Primer und Sonden, die
hierin bereitgestellt werden. Diese DNA-Primer und Sonden sind identifiziert
als Sequenzidentifikationsnummer 2, Sequenzidentifikationsnummer
3, Sequenzidentifikationsnummer 4, Sequenzidentifikationsnummer
5, Sequenzidentifikationsnummer 6, Sequenzidentifikationsnummer
7 und Sequenzidentifikationsnummer 8, und sie sind spezifisch für eine Region
in dem CK19 Gen. Ein Teil des CK19 Gen-Ziels wird bezeichnet als
Sequenzidentifikationsnummer 1.
-
In
den folgenden Beispielen werden Sequenzidentifikationsnummer 2,
Sequenzidentifikationsnummer 3 und Sequenzidentifikationsnummer
8 als Amplifikationsprimer verwendet, die spezifisch sind für das CK19 Gen.
Sequenzidentifikationsnummer 4, Sequenzidentifikationsnummer 5,
Sequenzidentifikationsnummer 6 und Sequenzidentifikationsnummer
7 werden als interne Hybridisierungssonden für das CK19 Gen Amplifikationsprodukt
verwendet. Die Verwendung von Sequenzidentifikationsnummer 8 wird
als ein Vergleichsbeispiel gegeben.
-
Beispiel 1
-
Herstellung von CK19 Primern
und Sonden
-
A.
CK19 Primer Ziel-spezifische Primer und Sonden wurden entwickelt,
um die CK19 Gen-Zielsequenz durch Oligonukleotidhybridisations-PCR
zu amplifizieren und zu detektieren. Diese Primer sind Sequenzidentifikationsnummer
2, Sequenzidentifikationsnummer 3 und Sequenzidentifikationsnummer
8. Die Primersequenzen wurden synthetisiert unter Verwendung von
Standardoligonukleotidsynthesemethodiken und haptenisiert mit Adamantan
an ihren 5'-Enden
unter Verwendung von Standard-Cyanoethylphosphoramidit-Kopplungschemie,
wie beschrieben in U.S. Patent nr. 5,424,414.
-
B.
CK19 Sonden Die Detektionssonden wurden entwickelt, um mit der amplifizierten
CK19 Zielsequenz durch Oligonukleotidhybridisierung zu hybridisieren.
Diese Sonden sind Sequenzidentifikationsnummer 4, Sequenzidentifikationsnummer
5, Sequenzidentifikationsnummer 6 und Sequenzidentifikationsnummer
7. Die Sondensequenzen wurden synthetisiert unter Verwendung von
Standard-Oligonukleotidsynthese-Methodiken und haptenisiert mit
zwei Carbazolen an dem 3'-Ende
unter Verwendung von Standard-Cyanoethylphosphoramidit-Kopplungschemie
wie beschrieben in U.S. Patent nr. 5,464,746.
-
Beispiel 2
-
Herstellung von CK19 mRNA
und cDNA
-
CK19
RNA wurde aus der T47D Ductal Karzinomzell-Linie extrahiert, erhalten
von American Type Culture Collection, ATCC 'HTB-133, Rockville, Maryland.
-
RNA
wurde aus den T47D Zellkulturen unter Verwendung des TRIzol® Reagenzes
von Gibco, Grand Island, NY, gemäß den Anweisungen
des Herstells, extrahiert und gereinigt.
-
Gereinigte
RNA wurde quantitativ bestimmt durch Spectrophotometrie unter Verwendung
einer Extinktionsablesung bei 260 nm und einem Extinktionskoeffizienten
von 40, oder auf einer pro Zelle-Basis quantifiziert.
-
cDNA
wurde hergestellt durch Inkubieren der gereinigten RNA von 1 bis
10 × 106 Zellen (oben hergestellt) mit 2,5 Einheiten
MuLV Reverse Transkriptase in einem Puffer von 10 mM Tris-HCl, pH
8,3, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, enthaltend 1
mM von jeweils dGTP, dATP, dCTP und dTTP, 0,5 Einheiten von RNase
Inhibitor und 2,5 μM
Oligo d (T)18, bei 42°C für 30 Minuten. Darauf folgte
Erhitzen bei 99° für 5 Minuten,
Abkühlen
bei 4°C
für 5 Minuten
und Lagern bei 4°C.
-
Beispiel 3
-
Detektion von CK19
-
A. Detektion von CK19
-
cDNA
Die cDNA von der T47D Zell-Linie (hergestellt wie in Beispiel 2
beschrieben) wurde auf das Äquivalent
von 1 Zelle in 10 μl
in Wasser verdünnt.
Die verdünnte
cDNA wurde dann PCR amplifiziert und detektiert unter Verwendung
der Sequenzidentifikationsnummer 2 und Sequenzidentifikationsnummer
3 als Primer und Sequenzidentifikationsnummer 4 und Sequenzidentifikationsnummer
5 als Detektionssonden. Alle Reaktionen wurden in 190 μl Puffer
(pH 8,15) enthaltend 50 mM N,N,-bis[2-Hydroxyethyl]glycin, 81,7
mM Kaliumacetat, 33,33 mM Kaliumhydroxid, 0,01 mg/ml Rinderserumalbumin,
0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure,
0,02 mg/ml Natriumazid und 8% (m/v) Glycerol durchgeführt. Die Reaktionsmischungen
verwendeten rekombinante Thermus thermophilus Polymerase bei einer
Konzentration von 5 Einheiten/Reaktion, mit dAtP, dGTP, dTTP und
dCTP bei 0,15 mM jeweils. Sequenzidentifikationsnummer 2 wurde verwendet
bei einer Konzentration von 250 mM, Sequenzidentifikationsnummer
3 wurde verwendet bei einer Konzentration von 500 mM, und beide
Sonden waren bei 10 nM jeweils vorhanden. Manganchlorid wurde hinzugefügt bei einer
Endkonzentration von 1,63 mM direkt vor der Zugabe der 10 μl Probe.
Der Test wurde durchgeführt
in drei Wiederholungen mit Wasser und menschlicher Plazenta-DNA
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) als negative Kontrollen.
-
Reaktionsmischungen
wurden PCR amplifiziert durch eine Wechselbeanspruchung bei 94°C für 40 Sekunden/58°C für 60 Sekunden
für 45
Cyklen in einem Perkin-Elmer 480 Thermal Cycler. Nachdem die Reaktionsmischungen
thermisch wechselbeansprucht wurden, wurden die Mischungen bei 97°C für 5 Minuten gehalten
und die Sondenoligohybridisation wurde durch Absenken der Temperatur
auf 12°C
für 5 Minuten
erzielt. Nach der Sondenhybridisation wurden die Proben bei 12°C gehalten
bevor sie getestet wurden.
-
Reaktionsprodukte
wurden auf dem Abbott LCx® System detektiert (erhältlich von
Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Eine Suspension von Anti-Carbazol
Antikörper
beschichteten Mikropartikeln und ein Anti-Adamantan Antikörper/alkalische
Phosphatase-Konjugat (die alle kommerziell erhältlich sind von Abbott Laboratories,
Abbott Park, IL) wurden zusammen mit den LCx® verwendet,
um die Reaktionsprodukte einzufangen und zu detektieren. Die durchschnittlichen
Werte aus diesem Experiment (berechnet als Zähler s–2)
und Standardabweichungen (SD) sind in TABELLE 1 dargestellt und
zeigen die spezifische Detektion von CK19 cDNA aus dem Äqivalent
einer T47D Zelle.
-
-
Zusätzlich wurde
direkt nach dem thermischen Wechselbeanspruchungsschritt oben eine
kleine Menge an Probe vor der Oligohybridisierung entfernt und wurde
auf einem 2% Agarosegel, gefärbt
mit SYBR® Green,
sichtbar gemacht. Das Gel zeigte das erwartete 152 Basenpaarprodukt
(Daten nicht gezeigt).
-
B. Empfindlichkeit der
Detektion von CK19 aus RNA oder cDNA
-
Die
gereinigte RNA aus der T47 D Zell-Linie, hergestellt wie beschrieben
in Beispiel 2, wurde 10-fach in Wasser verdünnt von 1 × 10° bis 1 × 10–4 Zellen
pro Reaktion, dann revers transkribiert unter Verwendung der Reaktionsmischung
wie oben in Beispiel 3A beschrieben, mit einer anfänglichen
Inkubation bei 60°C
für 30
Minuten. Proben wurden dann PCR amplifiziert und detektiert wie
in Beispiel 3A. Der Test wurde dreifach durchgeführt, unter Verwendung von Wasser
als eine negative Kontrolle.
-
Dies
wurde verglichen mit der Verwendung der cDNA aus der T47D Zell-Linie
als dem Ausgangsmaterial, wobei die cDNA hergestellt wurde wie in
Beispiel 2 beschrieben, und 10-fach in Wasser verdünnt von
1 × 103 bis 1 × 10–4 Zellen
pro Reaktion. Reaktionsmischungen wurden PCR amplifiziert und detektiert,
wie oben in Beispiel 3A beschrieben.
-
Die
durchschnittlichen Werte aus diesem Experiment (berechnet als Zähler s–2)
und Standardabweichungen (SD) sind in Tabelle 2 gezeigt und zeigen
die Detektion von CK19 von T47D Zellen bei Konzentrationen so niedrig
wie 1 × 10–4 Zellen
pro Reaktion mit RNA als der Ausgangsprobe, und 1 × 10–3 Zellen
pro Reaktion mit cDNA als der Ausgangsprobe. Somit ist dieses Verfahren,
mit diesen Primern und Sonden, in der Lage CK19 von einer Ausgangsprobe
von entweder RNA oder cDNA zu detektieren, was in einer klinischen Laboreinrichtung
wichtig sein könnte,
da cDNA gut im Voraus hergestellt werden kann, leichter gelagert
werden kann und stabiler ist, mit einem geringeren Zersetzungsrisiko.
-
-
Beispiel 4
-
Detektion von CK19 mit
einer vs. zwei Sonden
-
Gereinigte
T47D cDNA, hergestellt wie in Beispiel 2, wurde auf 0,025 Zellen/Reaktion
in Wasser verdünnt,
dann drei mal PCR amplifiziert und detektiert unter Verwendung von
sowohl Sequenzidentifikationsnummer 4 als auch Sequenzidentifikationsnummer
5 Detektionssonden, wie in Beispiel 3A, oder unter Verwendung von
nur Sequenzidentifikationsnummer 5 als die einzige Detektionssonde.
Wasser und menschliche Plazenta DNA wurden als negative Kontrollen
verwendet.
-
Die
durchschnittlichen Werte aus diesem Experiment (berechnet als Zähler s–2)
und Standardabweichungen (SD)) sind in Tabelle 3 gezeigt und zeigen
an, daß die
Verwendung von beiden Sonden zu einem erhöhten Signal führt ohne
Erhöhung
des Hintergrundes des Assays. Somit ist die Verwendung von beiden
Sonden anstatt von nur einer Sonde ein Vorteil in der Detektion
von CK19.
-
-
Beispiel 5
-
Vergleich der Primerlänge
-
Ein
Vergleich wurde gezogen zwischen der Verwendung des Sequenzidentifikationsnummer
3 Primers und dem Sequenzidentifikationsnummer 8 Primer, welcher
2 extra Nukleotide enthält.
Gereinigte T47D cDNA, hergestellt wie in Beispiel 2, wurde auf 0,05
Zellen/Reaktion in Wasser verdünnt,
dann PCR amplifiziert in sechs Wiederholungen wie in Beispiel 3A,
außer
daß die
Wechselbeanspruchungsbedingungen geändert wurden auf 45 Cyclen
von 94°C
für 40
Sekunden/58°C
für 80
Sekunden. Die Reaktionsmischungen waren wie in Beispiel 3A unter
Verwendung des Sequenzidentifikationsnummer 2 Primers mit entweder
dem Sequenzidentifikationsnummer 3 oder Sequenzidentifikationsnummer
8 Primer. Wasser und menschliche Plazenta DNA wurden dreimal als
negative Kontrollen getestet. Die Reaktionsprodukte wurden wie in
Beispiel 3A detektiert.
-
Die
Daten aus diesem Experiment sind in Tabelle 4 gezeigt und sie zeigen
an, daß die
Verwendung des Sequenzidentifikationsnummer 8 Primers anstelle des
Sequenzidentifikationsnummer 3 Primers nachteilig für den Assay
ist, da es zu einem höheren
Hintergrund mit der menschlichen Plazenta DNA und daher zu einem
Verlust an Spezifität
führt.
-
-
-
-
