DE69013423T2

DE69013423T2 - Verfahren zur Konservierung pflanzlicher Embryonen.

Info

Publication number: DE69013423T2
Application number: DE69013423T
Authority: DE
Inventors: Bruno Florin; Vincent Petiard
Original assignee: Nestle SA
Current assignee: Nestle SA
Priority date: 1989-07-18
Filing date: 1990-06-22
Publication date: 1995-02-23
Anticipated expiration: 2010-06-23
Also published as: FR2649860B1; CA2020572C; IE902325A1; ZA905204B; NO903138D0; NZ234524A; ES2064534T3; ATE113072T1; AU629369B2; FI903229A0; JPH03101601A; EP0408922A1; DE69013423D1; BR9003442A; AP158A; EP0408922B1; IE65060B1; PT94720A; CA2020572A1; AU5867490A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konservierung pflanzlicher Embryonen.
Zahlreiche Pflanzensorten können in Form von Zell-, Kallus- oder Meristemsuspensionen konserviert werden.
Die Konservierung von pflanzlichen Embryonen ist in zahlreichen Fällen angebracht, und zwar beispielsweise zur Regulierung der Produktion von Sprossen, wenn sie jahreszeitlich bedingt ist, oder für die Aufrechterhaltung einer klonalen Linie.
Die Möglichkeit der Konservierung pflanzlicher Embryonen kann verschiedene Vorteile bieten: beispielsweise ermöglicht sie die zeitweilige Verlangsamung der Entwicklung der Embryonen (für die für ihre Beförderung zur Aussaat oder für ihre Lagerung erforderliche Zeit) sowie die Herstellung von künstlichen Samen.
Somatische Embryonen besitzen gewisse Vorteile für die Vermehrung von Pflanzen. Sie stammen im Prinzip von einer einzigen Zelle und führen zu genetisch identischen Pflanzen. Somatische Embryonen besitzen von Beginn ihrer Bildung an eine bipolare Struktur: sie besitzen die beiden für die Bildung einer Pflanze erforderlichen Stengel- und Wurzelmeristeme. Die somatische Embryogenese erscheint also als eine interessante Alternative für die Vermehrung von Pflanzen: sie könnte die schnelle Vermehrung von Sorten mit hohen Produktionskosten, von aus In-Vitro-Kulturen stammenden besonders leistungsstarken Individuen oder von transformierten Pflanzen, die beispielsweise auf geschlechtlichem Weg schwer manipulierbar sind, gestatten.
Es sind verschiedene Verfahren zur Konservierung von undifferenzierten Geweben bei herabgesetzter Temperatur und/oder unter Hypoxie bekannt. Allgemein werden die Gewebe auf einem halbfestem Medium gehalten oder bei einer Temperatur von unter 0ºC konserviert.
Ein bekanntes Verfahren besteht darin, daß Harzkalli bei einer Temperatur von 10 oder 15ºC konserviert werden. Zur Verbesserung ihrer Lebensdauer ist es möglich, auf die Kalli eine Silikonölschicht aufzubringen, wobei diese jedoch auf ihrem Nährboden bleiben. Ein anderes Verfahren, das auf Hefen oder Zellen anwendbar ist, besteht darin, daß eine wässrige Emulsion der Zellen mit einem öligen Medium gebildet wird und dann das Ganze auf eine Temperatur von etwa -20ºC/-30ºC gekühlt wird, so daß das Wasser im Zustand der Unterkühlung bleibt. Das Öl dient hierbei als Gefrierschutz für die Zellen oder Hefen.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Konservierung pflanzlicher Embryonen zu schaffen, das eine beträchtliche Verlangsamung der Entwicklung der Embryonen, die für eine kurze Zeit von ihrem Kulturmedium getrennt werden, und dann die Wiederaufnahme dieser Entwicklung ohne Auftreten einer sekundären Embryogenese gestattet.
Zu diesem Zweck ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß die Embryonen durch Umhüllung mit einem Ölbett unter Hypoxie gehalten werden und dann abgekühlt und bei einer Temperatur etwas oberhalb der Empfindlichkeitsschwelle der jeweiligen Embryonen gegenüber Kälte konserviert werden.
Man hat überraschend festgestellt, daß das Halten der Embryonen unter Hypoxie unter Öl, verbunden mit einer niedrigen Temperatur, es gestattet, eine partielle und dauerhafte Hemmung ihres Wachstums ohne Beeinträchtigung der Lebensdauer und des Keimvermögens zu erhalten, wobei die Struktur des Embryos im Laufe seiner späteren Entwicklung unversehrt bleibt, und ohne Auftreten einer anderen Form von Morphogenese wie Kallogenese oder sekundärer Embryogenese, und zwar sowohl bei Licht als auch im Dunkeln.
Mit anderen Worten, das vorliegende Verfahren zur Konservierung pflanzlicher Embryonen gestattet es einerseits, die Embryonen morphologisch unversehrt am Leben zu erhalten und andererseits ihre Fähigkeit, einen Sproß zu entwickeln, gut beizubehalten.
Ein Vorteil dieses Verfahrens ist also, daß es die Konservierung von Embryonen über relativ lange Zeiträume gestattet. Ein anderer Vorteil ist, daß die Konservierung bei einer leicht verfügbaren Temperatur (beispielsweise in einem Kühlschrank) stattfinden kann, ohne daß kostspielige Anlagen verwendet werden müssen. Ein weiterer Vorteil ist, daß ein Konservierungsverfahren vorgeschlagen wird, das schnell und leicht durchführbar ist, und zwar sowohl bei Licht als auch im Dunkeln.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten pflanzlichen Embryonen können jeden Ursprungs und von jeder Sorte, wie beispielsweise Karotte oder Kaffee, sein. Die Embryonen können somatische Embryonen oder zygotische Embryonen sein. Die somatischen Embryonen können über undifferenzierte Zellsuspensionen erhalten werden. In diesem Fall kann beispielsweise Hybridelternsaatgut aseptisch zum Keimen gebracht werden. Die Hypokotyle können zerschnitten und dann in ein Kulturmedium gebracht werden, das Wachstumshormone enthält. Die erhaltenen Kalli können anschließend in einem flüssigen Kulturmedium aufgelöst werden. Man erhält nun eine undifferenzierte Zellsuspension, deren Zellen nach mehreren Umsetzungen auf ein Kulturmedium übertragen werden können.
Nach etwa 10 Tagen kann die Zellsuspension gefiltert werden, so daß nur die Zellaggregate mit der gewünschten Größe zurückbehalten werden. Diese Aggregate können auf einem hormonfreien Kulturmedium einige Tage kultiviert werden, so daß die Bildung von Embryonen induziert wird. Die zygotischen Embryonen können durch Zerlegen am Korn im Reifen oder leicht unreifen Stadium entnommen werden. Die erhaltenen zygotischen und somatischen Embryonen können in Abhängigkeit von ihrem Entwicklungszustand sortiert werden. Man wählt vorzugsweise die Embryonen in den ersten Stadien ihrer Entwicklung, wenn sie eine Größe von etwa 150 bis 1.000 um besitzen. Diese Abmessungen entsprechen den Entwicklungsstadien vom Typ Herz oder Torpedo.
Die erhaltenen Embryonen können anschließend gewaschen werden, und zwar beispielsweise in einem bei Embryonenkulturen üblichen, von Wachstumshormonen freien, flüssigen Kulturmedium wie einem Medium nach Murashige und Skoog, das 5 g/l Saccharose enthält. Die gewaschenen Embryonen können anschließend auf Kulturschalen übertragen und durch Absaugen des Restkulturmediums beispielsweise mit Hilfe einer Pipette getrocknet werden.
Die Embryonen werden anschließend durch Umhüllung mit einem Ölbett unter Hypoxie gehalten. Das Öl wird in Abhängigkeit von seiner Fähigkeit, eine Hypoxie zu bewirken, d.h. den Außensauerstoff nicht oder nur wenig zum Embryo zu übertragen, ausgewählt. Das Öl spielt die Rolle eines Konservierungsmittels und liefert dem Embryo die Mindestsauerstoffmenge, die erforderlich ist, um ihn am Leben zu erhalten. Das zum Aufrechterhalten der Hypoxie verwendete Öl kann ein Öl organischen oder pflanzlichen Ursprungs, ein Syntheseöl oder jedes andere Öl sein, das die Hypoxie aufrechterhalten kann, ohne sich gegenüber den Embryonen als giftig herauszustellen. Das verwendete Öl ist vorzugsweise ein flüssiges Paraffinöl. Das Öl kann zuvor entgast und/oder sterilisiert worden sein, und zwar beispielsweise durch Behandlung im Autoklav bei 115ºC während 20 Minuten.
Die zugesetzte Ölmenge muß so groß sein, daß eine vollständige Umhüllung der Embryonen gewährleistet wird. Man fügt vorzugsweise etwa 0,02 bis 0,5 ml Öl pro Embryo hinzu.
Die Embryonen werden anschließend bis auf eine Temperatur abgekühlt, die etwas oberhalb der Empfindlichkeitsschwelle der betreffenden Embryonen gegenüber Kälte liegt. Unter Empfindlichkeitsschwelle gegenüber Kälte wird die Temperatur verstanden, unter welcher die Embryonen nicht mehr lebensfähig sind. Die Temperatur, bei der die Embryonen gekühlt und dann konserviert werden, kann um einige Grad, vorzugsweise um 1 bis 10ºC, höher als die Empfindlichkeitsschwelle gegenüber Kälte sein. Bei Embryonen von Sorten mit geringer Kälteempfindlichkeit wie die Karotte kann die Konservierungstemperatur beispielsweise 2 bis 8ºC und vorzugsweise 3 bis 5ºC betragen. Bei Embryonen von Sorten mit größerer Kälteempfindlichkeit, beispielsweise Sorten tropischen Ursprungs wie Kaffee, kann sie 12 bis 20ºC und vorzugsweise 15 bis 17ºC betragen.
Die Kühlung der Embryonen kann stattfinden, indem die die Embryonen enthaltenden Kulturschalen beispielsweise in einen Kühlschrank oder in einen klimatisierten Raum gesetzt werden. Die Kühlgeschwindigkeit kann sehr hoch sein, beispielsweise etwa 1 bis 3ºC pro Minute. Die Embryonen unter Hypoxie unter Öl können bei geringer Beleuchtung von etwa 200 Lux oder im Dunkeln konserviert werden. Das vorliegende Konservierungsverfahren gestattet es nämlich, die konservierten Embryonen im Dunkeln am Leben zu erhalten. Dies kann in dem Fall einen praktischen Vorteil darstellen, in dem man anschließend durch Verkapselung des Embryos einen künstlichen Samen herstellt. Wahrscheinlich gelangt nämlich kein Restlicht zum Embryo im Inneren der Kapsel. Die Embryonen können unter diesen Bedingungen über ziemlich lange Zeiträume konserviert werden, und zwar etwa 2 bis 4 Monate.
Nach Konservierung können die Embryonen aus dem Kühlschrank genommen und auf Raumtemperatur erwärmt werden. Wenn sie eine Temperatur von etwa 20ºC erreicht haben, können sie mit einem gebräuchlichen flüssigen Kulturmedium gewaschen werden, damit alle Ölspuren beseitigt werden.
Sie können anschließend in oder auf ein gebräuchliches Kulturmedium wie ein Murashige-Skoog-Medium gebracht werden, wo sie eine normale Entwicklung wiederaufnehmen, die mit der von Embryonen vergleichbar ist, die keiner Konservierung unterzogen worden waren.
Um beim Verbraucher eine Verteilung zum Zweck einer gebräuchlichen Aussaat in der Pflanzschule oder auf dem Feld zu gestatten, können die Embryonen in festeren Stoffen verkapselt werden, die ihnen einen Schutz bieten, der mit dem der natürlichen Körner vergleichbar ist. In diesem Fall können die mit Öl umhüllten Embryonen in natürlichen oder künstlichen Polymeren, beispielsweise einem Natriumalginatgel, verkapselt werden. Diese Kapseln gewährleisten den mechanischen Schutz und den Krankheitsschutz des Embryos sowie die Versorgung des Keimlings beim Keimen. Die Kapseln können anschließend mit einer zusätzlichen Haut bedeckt werden, die beispielsweise aus einem Film aus wasserlöslichem Harz besteht, der sie zum Teil gegen Bruch und Austrocknung schützt. Man erhält auf diese Weise einen künstlichen Samen, der über längere Zeiten, und zwar die für ihre praktische Verwendung erforderliche Zeit, konserviert werden kann.
Die vorliegende Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen ausführlicher dargestellt. Diesen Beispielen geht ein Beispiel der herkömmlichen Herstellung von somatischen Embryonen, die Beschreibung eines Lebensfähigkeitstests und die Tabelle 1 voraus, die die Zusammensetzung des verwendeten bevorzugten Kulturmediums angibt.

Beispiel für die Herstellung von somatischen Embryonen

Eine undifferenzierte Zellsuspension von Karottenzellen von Daucus carota L. wird alle 12 Tage in einer Menge von 1 g Biomasse auf 100 ml Milieu in ein flüssiges Murashige-Skoog- Medium umgesetzt, das 20 g/l Saccharose und 0,1 mg/l 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure enthält. Alle Manipulationen werden unter Abzug mit laminarer Strömung unter aseptischen Bedingungen vorgenommen. Die Suspension wird auf einen Schüttler gesetzt, der eine exzentrische Drehbewegung von 100 U/min ausführt, und wird bei 23ºC unter einer Beleuchtung von 200 Lux mit einer Photoperiode von 16 Stunden kultiviert. Nach 8 bis 10 Tagen Kultur wird die Zellsuspension gefiltert, um nur die Zellaggregate zurückzubehalten, die eine Größe von 50 bis 200 um haben. Diese Aggregate kleiner Größe stellen ein proembryonales Stadium der Embryonen dar, die ihre Entwicklung bis zu den Stadien Herz, Torpedo und Sproß weiterführen. Die Aggregate werden gewaschen und in ein Murashige-Skoog-Medium eingebracht, das keine 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure enthält, und zwar in einer Menge von etwa 1,5 10³ Aggregate pro ml Medium.
Nach 10 Tagen Kultur haben sich Embryonen gebildet. Man filtert die Suspension so, daß nur die Embryonen mit einer Größe von 150 bis 1.000 um zurückbehalten werden.

Lebensfähigkeitstest

Es wurde ein schnell und einfach durchzuführender Lebensfähigkeitstest entwickelt, um die Lebensfähigkeitsquote der Embryonen nach Konservierung zu ermitteln.
Von den verschiedenen zur Einschätzung der Lebensfähigkeitsquote der Embryonen verwendbaren Kriterien wurde hauptsächlich herangezogen:
- die Zunahme der Größe der Embryonen und
- das Auftreten einer Chlorophyllfärbung.
Die Einschätzung dieser Kriterien kann auf verschiedene Weisen durchgeführt werden, und zwar beispielsweise durch visuelle Zählung oder mit Hilfe von biochemischen Tests (beispielsweise Färbungstest). Bei diesem Test werden die Embryonen in ein gebräuchliches flüssiges oder halbfestes Kulturmedium eingebracht. Man ermittelt nach 10 Tagen Kultur die Anzahl Embryonen, deren Größe zugenommen hat und die Anzeichen einer Chlorophyllfärbung zeigen. Das Verhältnis dieser Zahl zur Gesamtzahl der vorhandenen Embryonen gestattet die Bestimmung der Lebensfähigkeitsquote der Embryonen.
Die Embryonen können anschließend auf demselben flüssigen Medium belassen oder auf ein festes Kulturmedium mit derselben Zusammensetzung wie das vorhergehende flüssige Medium gebracht werden, damit sie sich bis zum Sproß-Stadium weiter entwickeln. Nach 10 Tagen Kultur auf diesem Medium bestimmt man die Konversionsrate als das Verhältnis zwischen der Zahl Embryonen, die sich bis zum Sproß-Stadium entwickelt haben, und der Gesamtzahl Embryonen. Tabelle 1 Zusammensetzung des Murashige-Skoog-Mediums (pH 5,8-5) Makroelemente Mikroelemente Andere Elemente Nikotinsäure Thiamin (Vit.B&sub1;) Adenin Saccharose

Beispiel 1

Somatische Karottenembryonen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten wurden, im Torpedo-Stadium mit einer mittleren Größe von 670 um werden mit einem flüssigen Murashige-Skoog- Kulturmedium gewaschen. Die Embryonen werden anschließend auf Kulturschalen mit 6 Vertiefungen gebracht, und zwar 20/30 Embryonen pro Schacht, und durch Absaugen der Flüssigkeit mit einer Pipette von den Spuren des Restkulturmediums befreit.
Zwei Gruppen (A) und (B) von Embryonen werden mit einer Schicht aus flüssigem Paraffinöl umhüllt, das zuvor im Autoklav 20 Minuten lang bei 115ºC sterilisiert wurde Man setzt etwa 1 ml Öl pro 5 bis 8 Embryonen zu. Zwei Vergleichsgruppen (C) und (D) von Embryonen werden mit dem flüssigen Kulturmedium umhüllt.
Die Kulturschalen werden mit ihrem Deckel bedeckt und luftdicht verschlossen. Eine erste Gruppe (A) von Embryonen unter Hypoxie unter Öl wird in einen Kühlraum mit 4ºC gesetzt. Zum Vergleich wird eine zweite Gruppe (B) von Embryonen unter Hypoxie unter Öl in 23ºC gesetzt. Eine erste Vergleichsgruppe (C) von Embryonen, die nicht unter Hypoxie sind, kommt in 4ºC und eine zweite Gruppe (D) in 23ºC.
Die einzelnen Gruppen werden unter einer Beleuchtung von 200 Lux konserviert. Nach einer gewissen Zeit der Konservierung werden die Embryonen auf Raumtemperatur erwärmt und dann wird flüssiges Kulturmedium unter das die Embryonen unter Hypoxie umhüllende Ölbett injiziert, um möglichst viele Embryonen in das Kulturmedium zu übertragen.
Nach Entfernung des Ölbetts werden die Embryonen in mehreren aufeinanderfolgenden Kulturmediumbädern gewaschen, um jede Spur von Restöl zu beseitigen.
Man beobachtet die Entwicklung der Größe der Embryonen während der Konservierungszeit durch Messung ihrer Größe mit Hilfe einer binokularen Lupe, die mit einem Meßokular ausgerüstet ist.
Man erhält folgende Ergebnisse: Größe der Embryonen (um) Konservierungszeit (Tage) Gruppe Vergl.-Gr.
Man stellt fest, daß die bei 23ºC konservierten Embryonen unabhängig davon, ob sie unter Hypoxie sind oder nicht, ziemlich schnell wachsen. Nach 14 Tagen hat sich ihre Größe mindestens verdreifacht, während die bei 4ºC konservierten Embryonen sich praktisch nicht entwickelt haben. Nach 105 Tagen besitzen die bei 4ºC konservierten Embryonen unter Hypoxie unter Öl noch eine relativ kleine Größe, während die bei 4ºC im Kulturmedium konservierten Vergleichsembryonen weiterhin gewachsen sind.
Parallel hierzu beobachtet man den Einfluß der Konservierung unter Hypoxie unter Öl bei 4ºC auf die Lebensfähigkeit der Embryonen.
Zu diesem Zweck werden die von dem Ölbett befreiten und auf Raumtemperatur erwärmten Embryonen im flüssigen Murashige- Skoog-Kulturmedium kultiviert. Die Lebensfähigkeit der Embryonen wird durch die Wiederaufnahme oder die Weiterführung ihrer Entwicklung im flüssigen Medium eingeschätzt.
Nach 10 Tagen Kultur ermittelt man die Lebensfähigkeitsquote der Embryonen.
Man erhält folgende Ergebnisse: Lebensfähigkeitsquote: (ausgedrückt in % Wachstumswiederaufnahme) Konservierungszeit (Tage) Gruppe Vergl.-Gr.
Die unter Hypoxie unter Öl bei 4ºC konservierten Embryonen besitzen eine korrekte Lebensfähigkeitsquote nach 105 Tagen Konservierung, während die unter Hypoxie bei 23ºC konservierten Embryonen nach einer konservierungszeit von 35 Tagen nicht mehr lebensfähig sind.
Die bei 4ºC konservierten Vergleichsembryonen besitzen auch eine gute Lebensfähigkeit nach 105 Tagen, ihre Größe ist jedoch nun zu groß (etwa 3300 um), um ggf. eine Konservierung durch Verkapselung in einem Polymer zu gestatten.
Nach 20 Tagen Kultur im flüssigen Medium ermittelt man die Anzahl Embryonen, die einen normalen Sproß entwickelt haben.
Man erhält folgende Ergebnisse: Konversionsquote (ausgedrückt in % entwickelte Keimlinge) Konservierungszeit (Tage) Gruppe A (4ºC) Vergl.-Gr. (4ºC)
Die Embryonen, die bei 4ºC unter Hypoxie unter Öl konserviert wurden, wachsen auf die gleiche Weise wie die Vergleichsembryonen ohne Auftreten von Adventivproliferation weiter.
Die partielle Hemmung des Wachstums der somatischen Embryonen durch Halten unter Hypoxie unter Öl bei 4ºC hat die Lebensfähigkeit oder das Vermögen der Wiederaufnahme der Entwicklung der Embryonen nicht beeinträchtigt.

Beispiel 2

Somatische Karottenembryonen mit einer mittleren Größe von 460 um werden bei 4ºC auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise konserviert. Ein Teil der Embryonen wird im Dunkeln und der andere Teil zum Vergleich unter 200 Lux konserviert.
Man beobachtet die Entwicklung der Größe der Embryonen in der Konservierungszeit.
Man erhält die folgenden Ergebnisse: Größe der Embryonen (um) Konservierungszeit (Tage) Hypoxie unter Öl Dunkelheit Hypoxie unter Öl 200 Lux Vergl.-Gruppe Dunkelheit Vergl.-Gruppe 200 Lux
Man stellt fest, daß die unter Hypoxie unter Öl konservierten Embryonen sich in der Größe praktisch nicht entwickelt haben, ob sie nun bei Licht oder im Dunkeln konserviert wurden.
Die Beleuchtung des Embryos bei seiner Konservierung scheint seine Lebensfähigkeit nicht zu beeinflussen. Das Fehlen von Licht hat keine Auswirkung auf den durch die Kombination der Hypoxie unter Öl mit einer niedrigen Temperatur induzierten Hemmungsgrad.

Beispiel 3

Somatische Embryonen von Kaffee Coffea arabica im fortgeschrittenen Torpedo-Stadium mit einer mittleren Größe von 1590 um werden gewaschen und auf Kulturschalen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgebracht.
Drei Embryonengruppen (A), (B) und (C) werden mit einem sterilisierten flüssigen Paraffinölbett umhüllt, und zwar in einer Menge von etwa 1 ml Öl auf 5 bis 8 Embryonen. Drei Embryovergleichsgruppen werden mit einem flüssigen Murashige- Skoog-Medium umhüllt.
Eine Embryonengruppe (A) unter Hypoxie unter Öl wird in 4ºC, eine zweite Gruppe (B) in 10ºC und eine dritte Gruppe (C) in 15ºC gesetzt. Eine erste Vergleichsgruppe wird in 4ºC, in eine zweite in 10ºC und eine dritte in 15ºC gesetzt.
Die Gruppen werden bei Dunkelheit einen Monat konserviert und dann auf Raumtemperatur gebracht. Die Embryonen werden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise gewaschen und dann auf einem halbfesten Murashige-Skoog-Medium kultiviert.
Nach 10 Tagen Kultur ermittelt man die Lebensfähigkeitsquote der Embryonen.
Man erhält die folgenden Ergebnisse: Lebensfähigkeitsquote (% Wachstumswiederaufnahme) Gruppe Vergl.-Gr. Vergleich
Man stellt fest, daß die bei 4ºC oder 10ºC konservierten Embryonen braun werden und sterben, ob sie nun unter Hypoxie unter Öl oder in einem Kulturmedium sind. Die Kaffee-Embryonen konservieren sich gut bei einer Temperatur von 15ºC. Es ist also wichtig, daß die Empfindlichkeitsschwelle der betreffenden Sorte gegenüber Kälte bei der Bestimmung der Mindestkonservierungstemperatur berücksichtigt wird.

Beispiel 4

Somatische Kaffee-Embryonen im fortgeschrittenen Torpedo-Stadium mit einer mittleren Größe von 1590 um werden bei 15ºC unter Hypoxie unter Öl auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise konserviert.
Nach 1 oder 2 Monaten Konservierung werden die Embryonen auf Raumtemperatur erwärmt und gewaschen.
Man beobachtet die Entwicklung der Größe der Embryonen während der Konservierungsperiode.
Man erhält die folgenden Ergebnisse: Größe der Embryonen (um) Konservierungszeit Monat Embryonen unter Hypoxie unter Öl Vergl.-Embryonen
Man stellt fest, daß die Embryonen unter Hypoxie unter Öl viel langsamer wachsen als die Vergleichsembryonen.
Nach 10 Tagen Kultur der Embryonen auf halbfestem Medium ermittelt man die Lebensfähigkeitsquote. Er beträgt 70 % bei den Embryonen, die 2 Monate lang unter Hypoxie unter Öl konserviert wurden, und 84 % bei den Vergleichsembryonen, die 2 Monate lang im flüssigen Kulturmedium konserviert wurden. Die Umhüllung der Embryonen mit einem Ölbett gestattet also die Hemmung ihres Wachstums ohne ernste Änderung ihrer Lebensfähigkeit.

Beispiel 5

Somatische Kaffee-Embryonen im fortgeschrittenen Herz-Stadium mit einer mittleren Größe von 1100 um oder im Torpedo-Stadium mit einer mittleren Größe von 1320 um werden 1 Monat lang im Dunkeln bei 15ºC entweder unter Hypoxie unter Paraffinöl oder in flüssigem Kulturmedium auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise konserviert.
Nach Konservierung werden die Embryonen auf Raumtemperatur erwärmt und gewaschen. Man beobachtet die Entwicklung der Größe der Embryonen im Laufe der Konservierungszeit. Man erhält die folgenden Ergebnisse: Größe der Embryonen (um) Konservierungszeit Monat Embryonen fortgeschrittenes Herz Hypoxie unter Öl Vergleich Embryonen Torpedo Hypoxie unter Öl Vergleich
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 stellt man fest, daß die Embryonen unter Hypoxie unter Öl langsamer wachsen als die Vergleichsembryonen.
Man kultiviert die Embryonen 10 Tage lang auf einem halbfesten Murashige-Skoog-Medium und ermittelt die Lebensfähigkeitsquote.
Man erhält die folgenden Ergebnisse: Lebensfähigkeitsquote Embryonen fortgeschrittenes Herz - Hypoxie unter Öl - Vergleich Embryonen Torpedo - Hypoxie unter Öl - Vergleich

Claims

1. Verfahren zur Konservierung pflanzlicher Embryonen, dadurch gekennzeichnet, daß die Embryonen durch Umhüllung mit einem Ölbett unter Hypoxie gehalten werden und dann abgekühlt und bei einer Temperatur oberhalb der Empfindlichkeitsschwelle der jeweiligen Embryonen gegenüber Kälte konserviert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Embryonen somatische Embryonen sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Öl zur Aufrechterhaltung der Hypoxie ein Öl organischen oder pflanzlichen Ursprungs oder ein synthetisches Öl ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Öl zur Aufrechterhaltung der Hypoxie ein flüssiges Paraffinöl ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Embryonen unter Hypoxie unter Öl bei einer Temperatur konserviert werden, die 1 bis 10ºC oberhalb der Empfindlichkeitsschwelle der jeweiligen Embryonen gegenüber Kälte liegt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Embryonen in der Dunkelheit konserviert werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Embryonen somatische Karottenembryonen sind und bei einer Temperatur zwischen 2 und 8ºC konserviert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Embryonen somatische Kaffeebaumembryonen sind und bei einer Temperatur zwischen 12 und 20ºC konserviert werden.

9. Verfahren zum Konservieren pflanzlicher Embryonen, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Öl umhüllten Embryonen in natürliche oder künstliche Polymere verkapselt werden.

10. Ein künstlicher Samen, der nach Anspruch 9 erhalten wurde.