DE3879565T2

DE3879565T2 - Verfahren zum induzieren einer austrocknungstoleranz in somatischen embryos.

Info

Publication number: DE3879565T2
Application number: DE19883879565
Authority: DE
Inventors: J Derek Bewley; Steve Bowley; C W Brown; Bryan D Mckersie; Tissa Senaratna
Original assignee: University of Guelph
Current assignee: University of Guelph
Priority date: 1987-07-20
Filing date: 1988-07-19
Publication date: 1993-08-05
Anticipated expiration: 2008-07-20
Also published as: ES2054812T3; EP0300730A1; EP0300730B1; CA1309253C; GB8717099D0; DE3879565D1

Description

Fachgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, Austrocknungstoleranz in von Gewebekultur abgeleiteten Pflanzenembryos zu induzieren zum Zweck, künstliches Saatgut zu entwickeln.

Hintergrund der Erfindung

Samen sind normal das Produkt des sexuellen Prozesses. Der typische Samen besteht aus einem Embryo in einer Ruhephase, welcher Nährgewebe einlagert und von diesem umgeben ist, das für Nahrungsspeicherung bereitsteht und welcher in einer Schutzschicht enthalten ist.
Einige Pflanzen regenerieren sich auch asexuell. Asexuelle Embryogenese in vivo ist ein gut bekanntes Phänomen in den Familien Rustaceae, Coctaceae, Celastraceae, Liliaceae, Myrtaceae, Orchidaceae, Rosaceae und Solanaceae. Tisserat et al., Horticultural Reviews, S. 1-99 (1979).
Es ist möglich, asexuelle Embryos in vitro herzustellen. Techniken für die Regeneration von Pflanzen aus Gewebekulturen sind für viele verschiedene Arten entwickelt worden. Diese Technik kann als Mittel zum Clonieren von Pflanzen in einem kommerziellen Maßstab verwendet werden. Dies würde Anwendung in Verfahren finden, bei denen es nicht wünschenswert ist, ausgewählten Pflanzen Meiose und genetische Rekombination ausführen zu lassen, um Samen, wie bei der Hybridproduktion, bei der Vermehrung von Elite-Keimzellen bei Arten, die selten Samen herstellen oder bei der "Fixierung" von genetischen Linien bei obligaten fremdbestäubenden Arten herzustellen. Eine Zelle von beinahe jedem Teil einer Pflanze kann einen asexuellen Embryo produzieren und von ihr kann sich eine vollständige Pflanze regenieren.
Solche künstliche "Samen" würden der Samenindustrie, Landwirtschaft, Forstwirtschaft und dem Gartenbau beträchtlich nützen. Spezifische Anwendungen solcher Techniken umfassen die folgenden:
1) Als Züchtungsverfahren, um die Anzahl an Generationen zu vermindern, die benötigt werden, um einen kommerziellen Samen zu erreichen;
2) als ein Mittel zum Herstellen von Hybridsamen durch die Vermehrung von parentalen Pflanzen, wie männlichen und weiblichen sterilen Pflanzen;
3) als ein Mittel zum Vermehren wertvoller, agronomisch hochwertiger Pflanzen für die direkte Begrünung von Produktionsflächen;
4) als ein Mittel zum Lagern einer Pflanze in einem Ruhestadium, um das Anpflanzen zu synchronisieren, für einen Transport unter steriler Bedingung oder für langfristige Keimzellagerung;
5) als ein Mittel zum Herstellen von Samen von Arten, die nur unregelmäßig blühen und lebensfähigen Samen herstellen (z.B. Bambus).
Asexuelle in vitro Embryogenese-Techniken produzieren einen Embryo, der in den meisten Hinsichten zu normalen zygotischen Embryos identisch ist. Diesen Embryos fehlt ein umgebendes Endosperm und letzteres stammt ausschließlich von maternalem Gewebe in dem zygotischen Samen ab. Ein weiterer deutlicher Unterschied zwischen den zwei Typen von Embryos ist, daß asexuelle Embryos nicht getrocknet und gelagert werden können. Es gibt zwei Wege, um die Embryos vom Austrocknen zu schützen: Sie können mit Verbindungen beschichtet werden, die den Wasserverlust (d.h. das Austrocknen) verhindern oder können alternativ induziert werden, durch Synthetisieren von schützenden Chemikalien, die die Zellen vor den Folgen des Wasserverlustes schützen, das Austrocknen zu tolerieren. Frühere Methoden haben Wege zum Vermindern des Wasserverlustes hervorgehoben und besondere Beschichtungstechniken sind entwickelt worden. Edward W. Janssen beschreibt in seinem U.S.-Patent 3 920 436 ein Verfahren, das durch Beschichten eines Teils der Pflanze mit einem flüssigen Agens, welches hydrophile Urethanvorpolymere umfaßt, eine künstliche schützende Umgebung für Pflanzen schafft. Dieses System ist jedoch auf den Schutz reifer Pflanzen durch Verhindern des Wasserverlustes ausgelegt, und da das Vorpolymer unlöslich ist, würde es den Embryo nicht keimen lassen.
Feuchte Kapseln sind verwendet worden, um den Samenmantel zu ersetzen. Plant Genetics Inc. (PGI) hat ein Verfahren zum Beschichten von somatischen Embryos mit Gel entwickelt, um ihnen die Härten der Behandlung und Feldbepflanzung widerstehen zu helfen. Die Beschichtung umfaßt zwei Teile: Eine essentielle Nährstoffe etc. enthaltende Matrix und eine schützende polymere Samenschicht, welche Austrocknung verhindert. Die resultierenden Kapseln haben ungefähr die Größe von Sojabohnensamen, kugelförmige Gestalt und sind daher verwendbar für landwirtschaftlichen Gebrauch in großem Maßstab. Es gibt jedoch bei einer solchen feuchten Kapsel Nachteile. Die Kapseln benötigen spezielle Lagerbedingungen bei niedriger Temperatur; sonst werden sie vorzeitig zu keimen beginnen, wodurch eine langfristige Lagerung unmöglich gemacht wird. Die Vitalität der Keimlinge kann ebenso reduziert werden aufgrund der Vermeidung des natürlichen Trocknungsprozesses.
Janick und Kitto beschreiben in ihrem U.S.-Patent 4 615 141 gewisse Methoden zum Verstärken der Austrocknungstoleranz in somatischen Embryos. Die asexuellen Embryos werden durch verschiedene Mittel während ihrer Entwicklung "gehärtet", um Resistenz gegen Umweltstreß zu induzieren. Die gehärteten asexuellen Embryos werden danach mit einer Lösung eines nichttoxischen, biologisch verträglichen, wasserlöslichen, synthetischen Beschichtungsmaterials beschichtet. Die resultierenden, lösungsbeschichteten Embryos werden danach getrocknet, um lebensfähige Embryos, die in dem Beschichtungsmaterial eingekapselt sind, bereitzustellen. Embryos, die durch diese Methode eingekapselt sind, sind relativ kurzlebig in dem trockenen Zustand (ca. 2-4 Tage).
Janick und Kitto beschrieben vier getrennte Härtungsbehandlungen: hohe Animpfdichte, hohe Saccharosekonzentration, Abkühlen und/oder Behandeln mit Abscisinsäure (ABS). Jede dieser Vorbehandlungen verstärkt die Lebensfähigkeit der Embryos nach der Einkapselung. Es ist
...Konzentrationen und die hohe Animpfdichte steigern die Synthese von ABS, einem Pflanzenwachstumsregulator. Anscheinend ist ABS ein Faktor für das Überleben somatischer Embryos. Die Art der verwendeten Härtungsbehandlung ist kritisch, da sie asexuelle Embryos ruhigstellt und die endogene Synthese spezifischer Schutzverbindungen induziert, wie Radikalfänger für freie Sauerstoffradikale, wodurch die Überlebensrate der Embryos nach Austrocknung gesteigert wird.
Austrocknungsresistenz hat mindestens zwei Komponenten. Die erste ist Toleranz gegenüber Wasserverlust, und die zweite ist die Fähigkeit, Lebensfähigkeit während ausgedehnter Trockenperioden zu erhalten. Toleranz gegenüber Wasserverlust kann in Pflanzengeweben durch die Induktion des Ruhezustandes oder der Wachstumsruhe induziert werden. Toleranz gegenüber ausgedehnter Lagerung wird teilweise bereitgestellt durch hohe Raten an Abfangsystemen für freie Radikale (Antioxidantien), wie Tocopherol. Beide Austrocknungskomponenten können durch ABS induziert werden, aber die Antwort des Embryos ist abhängig von dem Entwicklungsstadium zur Zeit der Behandlung. Ruhezustand kann in einem weiten Bereich der Entwicklungsstadien induziert werden, aber die Induktion der Synthese von Antioxidantien wird nur in spezifischen Stadien erreicht. Bei dem Verfahren von Janick und Kitto wurde die ABS-Behandlung nicht im richtigen Entwicklungsstadium angewendet, um die Synthese von Antioxidantien zu induzieren. Dies würde erklären, warum ihre Embryos das Trocknen ohne Beschichtung nicht überlegen konnten und warum die beschichteten Embryos nur 2 bis 4 Tage überlebten.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Induzieren einer Austrocknungsresistenz in in vitro gebildeten Pflanzenembryos bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Induzieren einer Austrockungsresistenz in einem in vitro gebildeten Pflanzenembryo bereitgestellt, um die Herstellung von wachstumsfähigem künstlichen Saatgut zu ermöglichen; wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren von Pflanzenembryos in vitro, Stimulieren dieser Embryos, damit diese durch das globuläre und ein herzförmiges Stadium in ein länglich-torpedoförmiges Stadium und frühes Cotyledonen-Stadium fortschreiten, Induzieren dieser Embryos zum Zeitpunkt des torpedoförmigen Stadiums mit einer Quelle an Abscisinsäure mit einer wirksamen Konzentration der Abscisinsäure und für eine genügende Zeitdauer, um die Ausprägung der Austrocknungstoleranz hervorzurufen, welche eine Veränderung im zellulären Metabolismus, in Elektronentransportprozessen und Oxidations-Reduktions-Reaktionen in diesen Embryos umfaßt, und daraufhin Trocknen dieser induzierten Embryos bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 20 Gew.-%, um stabile wachstumsfähige Embryonen bereitzustellen.
Gemäß bevorzugter Aspekte der Erfindung wird die Quelle an Abscisinsäure entwickelt durch Anwendung eines Umweltstresses, um die Embryos zu veranlassen, Abscisinsäure zu synthetisieren, äußerliche Anwendung von Abscisinsäure oder äußere Anwendung alternativer Chemikalien, welche die Herstellung von ABS auslösen, d.h. Induzieren der Embryos mit einem Inhibitor des Isoprenoid- Stoffwechsels.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Es gibt eine große Vielfalt an Verfahren, durch welche Pflanzengewebe auf künstlichen Wachstumsmedien unter sterilen Bedingungen kultiviert und induziert werden können, um Embryos mit organisierten meristematischen Geweben zu bilden. Zwei Arten werden als Beispiele verwendet, um diese Erfindung darzulegen; die Prinzipien werden jedoch bei den meisten Pflanzenembryos, die sich unter in vitro-Kulturbedingungen entwickeln, angewendet werden. Wenn die Embryos einmal induziert worden sind, sich aus dem ursprünglichen Pflanzengewebe zu bilden, durchlaufen sie eine Entwicklungsfolge, die in vieler Hinsicht ähnlich ist zu derjenigen, die in zygotischen Embryos in vivo beobachtet wird.
Nach der Induktion schreitet die Entwicklung der Embryos durch ein globuläres und herzförmiges Stadium in ein länglich-torpedoförmiges Stadium mit ausgeprägten apicalen und Wurzel-Meristemen und rudimentären Cotyledonen fort. Vom Torpedostadium an ist der Embryo fähig durch geeignete Umwelt- oder chemische Signale induziert zu werden, um Austrocknungstoleranz zu entwickeln. Ohne diese Signale wird Austrocknungstoleranz nicht ausgeprägt werden. Außerdem, wenn die Signale in einem falschen Entwicklungsstadium angewendet werden, wird das Gewebe nicht richtig antworten. Das geeignete Stadium ist eine weite Zeitspanne, wobei das Optimum ungefähr zwischen den Torpedo- und den Cotyledonen-Entwicklungsstadien liegt. Die exakte zeitliche Festlegung des Signals, um die Ausprägung der Austrocknungstoleranz herbeizuführen, wird zwischen Arten, Medien, Wachstumsbedingungen und der Temperatur variieren, wobei alle davon die Embryorate und den Entwicklungstyp beeinflussen.
Das Signal, das dem Embryo zugeführt wird, um die Ausprägung der Toleranz zu induzieren, kann ebenso variieren, beinhaltet aber entweder die äußerliche Anwendung eines Pflanzenwachstumsregulators, Abscisinsäure (ABS), oder die Anwendung von Umweltstreß oder eines ähnlichen Signals, welches die Pfanzen veranlaßt, ABS zu synthetisieren. Die äußerliche Anwendung von ABS ist in den meisten Fällen das wirkungsvollste Mittel, die Ausprägung der Austrocknungstoleranz zu induzieren. Die bevorzugte Methode für die äußerliche Anwendung von ABS sind indirekte Techniken, z.B. auf einem festen Agar-Medium, auf dem die Embryos ausgesetzt werden, wobei sie von dem Medium durch ein Nylonpapier oder ein ähnliches Netz und eine dünne Kallusschicht getrennt werden, wodurch ein direkter Kontakt zwischen den Embryos und den ABS-enthaltenden Medien verhindert wird. Das Kultivieren von Embryos auf einem Netz hat auch andere Vorteile. Es ermöglicht eine leichte Handhabung der Embryos. Die Embryos können von einem Medium zu einem anderen mit dem Netz bewegt werden, ohne die Mikroumgebung und Polarität, die sich bereits entwickelt hat, zu zerstören.
Mehrere Umweltstreßarten können ebenso verwendet werden, um den Embryo in diesem Entwicklungsstadium zu induzieren, Austrocknungsresistenz als Ergebnis der ABS-Synthese durch den Embryo auszuprägen. Diese Streßarten umfassen eine langsame stufenweise Austrocknung über mehrere Tage, niedrige Temperaturen, Nahrungsmittelentzug, Wasserentzug oder osmotische Streßarten und nicht-letalen Hitzestreß. Es ist nennenswert, daß jede Chemikalie, die die Synthese oder Anhäufung von ABS verursacht, ähnliche Effekte haben würde.
Folglich gibt es zwei wichtige Prinzipien in diesem Prozeß. Das erste ist die Entwicklung des Embryos bis zu dem geeigneten Entwicklungsstadium. Das zweite ist das Einwirkenlassen des Wachstumsregulators ABS.
Die Anwendung von ABS löst ein deutlich verschiedenes Entwicklungsmuster in dem aus einer Gewebekultur abstammenden Embryo aus, welches in vieler Hinsicht zu dem eines zygotischen Embryos ähnlich ist. Dieser Prozeß gipfelt in der Hemmung des zellulären Metabolismus und der Unterdrückung der Elektronentransportvorgänge und Oxidations-Reduktions-Reaktionen. Wenn die Gewebe getrocknet würden, ohne daß die metabolischen Prozesse unterdrückt würden, könnte man erwarten, daß sie die Bildung schädlicher Agenzien, wie freie Sauerstoffradikale, verursachen. Das Gewebe häuft zur gleichen Zeit eine Anzahl zelluläre Membran-stabilisierende Agenzien an, wie Kohlenwasserstoffe mit niedrigem Molekulargewicht und fettlösliche Antioxidantien, wie Tocopherol.
Der Isoprenoid-Biosyntheseweg ist in die ABS-Synthese verwickelt. Obwohl die Struktur von ABS seit 1965 bekannt ist, blieb der genaue Weg der ABS-Synthese in höheren Pflanzen ungewiß. Die Forschung hat sich auf zwei Stoffwechselwege konzentriert; (1) den direkten Stoffwechselweg, in den ein vom Farnesylpyrophosphat abgeleitetes C&sub1;&sub5;-Vorläufermolekül verwickelt ist und (2) der indirekte Stoffwechselwege, in den ein von einem Carotinoid abgeleitetes Vorläufermolekül verwickelt ist. Die relative Wichtigkeit der beiden Stoffwechselwege ist unbekannt, und es existiert die Möglichkeit, daß beide Stoffwechselwege zur gleichen Zeit arbeiten, wie in Zeevart und Creelman, 1988, Metabolism and Physiology of Abscisic Acid. Ann. Rev. Plant. Physiol. and Plant Molec. Biol. 39:439-473 beschrieben ist. In beiden Fällen wird vermutet, daß Mevalonat das grundlegende Vorläufermolekül ist.
Die Behandlung der Pflanzen mit gewissen Chemikalien steigert die ABS-Rate in Pflanzengeweben. Z.B. wurde gezeigt, daß Triazole endogene ABS-Raten steigern, und es wurde angenommen, daß Triazole selektiv bestimmte Reaktionen in dem Isoprenoid-Stoffwechselweg hemmen und daß diese Hemmung zu gesteigerten ABS-Raten geführt haben kann. Andere Chemikalien, wie Mefluidide sind ebenso dafür bekannt, die ABS-Raten in Pflanzengeweben zu steigern.
Wie immer die metabolischen Stoffwechselwege sein mögen, gewisse Umweltstreßarten induzieren die ABS-Synthese in Pflanzengeweben.
Es ist gezeigt worden, daß die ABS-Raten in Geweben (Früchten, Blätter, Phloemexudaten) von Wasser-gestreßten Pflanzen ansteigen. Überfluten steigerte die ABS-Rate zehnfach ohne Wassermangel in Blättern. Es wurde angenommen, daß das Überfluten die Translokation vom Sproß zur Wurzel hemmte, und daß dies veranlaßte, ABS anzuhäufen. Interessante Ergebnisse wurden von Dunaliella parva berichtet. Diese gegenüber Salz tolerante Alge hatte ihren niedrigsten ABS-Gehalt bei 1,5 M NaCl, dem Medium, das für ihr Wachstum und die Photosynthese optimal ist. Niedrigere und höhere NaCl-Raten steigerten die Menge an ABS in den Zellen, wie auch im Medium. Vorübergehender Anstieg des ABS-Gehalts in Pflanzengewebe ereignete sich auch, wenn dieses niedrigen Temperaturen während der Kältehärtung ausgesetzt wurden.
Es wurde auch berichtet, daß Pflanzen, die zuvor Trockenheit, einem Mineralienentzug oder einem hohen Salzgehalt ausgesetzt wurden, erhöhte ABS-Raten hatten. Wenn einmal Toleranz induziert worden ist, kann der Embryo zu Feuchtigkeitsgehalten, die niedriger als 20 % Wasser oder äquivalent zu denjenigen sind, die in echten Samen beobachtet werden, luftgetrocknet werden. Das Trocknen kann langsam erfolgen durch Transferieren der Embryos zu aufeinanderfolgenden Umgebungen mit niedriger relativer Feuchtigkeit über den Zeitraum von mehreren Tagen; wenn jedoch die Toleranz richtig induziert worden ist, können die Embryos in der Luft innerhalb ungefähr 24 Stunden schnell getrocknet werden.
Einmal getrocknet, können die Embryos für ausgedehnte Zeitspannen bis zu mehreren Monaten bei Raumtemperatur unter atmosphärischen Bedingungen gelagert werden.
Wenn die trockenen Embryos unter kühlen, trockenen Bedingungen gelagert werden, wie denen, die verwendet werden, um echte Samen zu lagern, könnten die Embryos erfolgreich mehrere Jahre lang mit minimalem Lebensfähigkeitsverlust gelagert werden, der ähnlich zu demjenigen ist, der für echte Samen beobachtet wird.
Die getrockneten Embryos können in Wasser auf Keimungspapier rehydratisiert werden oder direkt in Torf oder Erde gepflanzt werden. Einmal rehydratisiert, folgt das Entwicklungsmuster des "Keimlings" demjenigen, das während der Keimung eines echten Samens beobachtet wird, nämlich Wurzelaustritt, Entwicklung und Ausbreitung des Primärblattes, des Sprosses und der Wurzel. Es ist nicht notwendig, den getrockneten Embryo auf Nährstoffen und Wurzelmedien zu rehydratisieren, wie denjenigen, auf denen er sich anfangs entwickelte. Die Wachstumsrate der Keimlinge von getrockneten Embryos ist ungefähr doppelt so hoch, wie die, die für Embryos, die nicht getrocknet worden sind, beobachtet werden. Der Grund für dies ist wahrscheinlich ähnlich zu demjenigen, der für echte Samen beobachtet wird, in denen Austrocknung selbst als ein Entwicklungsschalter zwischen anabolischen und katabolischen Prozessen wirkt.
Die Überlebensrate der erfindungsgemäßen Austrocknungsbehandlung an sich erreicht 100 %. Wenn die Embryos z.B. vorselektiert werden, basierend auf der sichtbaren morphologischen Entwicklung, und unter Verwendung unseres Verfahrens getrocknet werden, war die Überlebensrate nach Austrocknung 100 %. Niedrigere Erfolgsraten können gewöhnlich einer nicht ordnungsgemäßen Embryobildung vor der Ausstrocknungsphase zugeschrieben werden und reflektieren eine weniger als optimale anfängliche Embryonenbildung. Wenn die Nährstoff- oder Wachstsumsregulator-Raten während der ersten Phase der Kultur nicht optimal sind, können einige mißgebildet werden und, obwohl sie die Austrocknungsbehandlung überleben können, werden sie keine Keimlinge bilden.
Embryogenese-Techniken für asexuelle Pflanzen sind im Fachgebiet gut bekannt. Die Alfalfa-Linie A70-34 wird ausgewählt als ein Beispiel für die Bewertung der erfindungsgemäßen Austrocknungstoleranz, weil sie eine hohe Häufigkeit der Embryogenese hat. Wie zuvor angeführt, ist die erfindungsgemäße Austrocknungstechnologie geeignet für jede Pflanzenart, die Embryos in einem Zellkultursystem produzieren kann.

Beispiel 1

Stielschnitte von voll ausgebreiteten Alfalfa-Blättern werden verwendet, Kalli auf B5h-Medien nach Sterilisierung (Tabelle 1) zu initiieren. Die Kalli werden danach auf GB5-Medien zur Zellvermehrung transferiert. Drei vorherrschende Zelltypen kommen in einer Alfalfa-Zellsuspensionskultur vor: Große Klumpen nichtdifferentierter Zellen und abnormaler somatischer Embryos; kleine Zellanhäufungen, die aus nicht-differentierten meristematischen Zellen zusammengesetzt sind; und große "Bananen"-förmige, einzelne Zellen. Es wird geglaubt, daß die kleine Zellanhäufung, die aus nicht-differentierten meristematischen Zellen besteht, somatische Embryos entstehen läßt. Die größeren Aggregate werden durch Sieben der Suspension durch ein 1000 oder 500 µm- Nylonnetz entfernt. Darauffolgendes Filtrieren durch ein 200 µm-Netz sammelte einige einzelne Zellen und selektierte die meristematischen kleinen Zellanhäufungen. Diese Filtrierung dient dazu, die Kultur mit embryonischen Zellen anzureichern und die Embryoentwicklung zu synchronisieren.
Die Zellen werden auf ein Nylonnetz ausgebracht und aus Gründen einer einfachen Handhabung auf festen Bi2y-Agar-Medien (Tabelle 1) plaziert. Die Embryos entwickeln sich in einer synchronisierten Weise auf dem Nylonnetz. Erfindungsgemäß werden diese Nylonfilter auf Nährmedien ohne Pflanzenwachstumsregulatoren (Bi2Y) 10 bis 14 Tage lang plaziert.
Erfindungsgemäß werden die Embryos danach auf dieselben Medien, jedoch ABS enthaltend, transferiert. Die zeitliche Festlegung der ABS-Behandlung ist sehr wichtig, wie vorstehend diskutiert. Z.B. setzen Janick und Kitto in ihrem U.S.-Patent 4 615 141 die Embryos der ABS-Behandlung während der Induktionsphase aus, anstatt nach ihr. Solche Unterschiede bei der zeitlichen Festlegung der ABS-Behandlung können erhebliche Veränderungen für die Lebensfähigkeit der behandelten Embryos verursachen. Je später nach der Induktion, aber vor einer vorzeitigen Keimung die Embryos der ABS-Behandlung ausgesetzt werden, desto besser ist die Resistenz gegenüber Austrocknung. Embryos im Alter zwischen 9 und 18 Tagen nach der Induktion antworten am besten auf eine 5 bis 14 Tage angewendete ABS-Konzentration zwischen 5 und 10 µM.
Erfindungsgemäß werden nach 5 bis 14 Tagen ABS-Behandlung die Embryos getrocknet. Zwei verschiedene Trocknungssysteme werden verwendet: "Schnell"- und "Langsam" -Trocknung. Schnelltrocknung wird entweder durch Lufttrocknen oder in einer Kammer mit niedriger Feuchtigkeit (43 % relative Feuchtigkeit) erreicht. Mit diesem System werden die Embryos bis zu einem niedrigen Feuchtigkeitsgehalt, wie 7,4 % Feuchtigkeitsgehalt Gew./Gew., innerhalb eines Tages getrocknet. Langsamtrocknung wird durch 6 Tage langes Plazieren der Embryos in eine Reihe von Trocknern mit kontrollierter Feuchtigkeit erreicht. Den ersten Trocknungstag werden die Embryos bei 97 % Feuchtigkeit gehalten und sie werden dann täglich zu Kammern mit 87 %, 75,5 %, 62,5 %, 50,5 % und letztendlich 43 % relativer Luftfeuchtigkeit transferiert. Tabelle 1 Nährstoff myo-Inositol Nicotinsäure Pyridoxin HCl Thiamin HCl Adenin L-Glutamin L-Glutathion L-Serin 1-Prolin Glycin Sucrose Auxin: 2,4-D* Kinetin Agär oder Agarose
Man läßt danach die Embryos mit Luft äquilibrieren. In diesem Stadium können die Embryos gelagert werden. Keine Einkapselung ist notwendig.

Beispiel 2

Die Tabelle II zeigt die Überlebensrate von mit ABS behandelten Embryos nach "Schnell"- oder "Langsam"-Trocknung. Mit ABS behandelte Embryos waren tolerant gegenüber Austrocknung nach schnellem oder langsamen Trocknen. Die Überlebensrate nach Austrocknung (Konversion zu Pflanzen) war bis 80 % hoch. Tabelle II Überlebensraten von mit ABS behandelten Embryos nach schneller oder langsamer Austrocknung Mittel aus zwei Experimenten Tage Embryoalter Trocknungssystem schnell langsam Überlebensrate in %
Diese Erfindung hat einen bedeutenden Vorteil gegenüber der Behandlung, die von Janick et al. vorgeschlagen wurde, wodurch die Embryos nur getrocknet werden, nachdem die Embryos mit dem einkapselnden Material in Kontakt gebracht worden sind. Andererseits erzeugt die erfindungsgemäße Behandlung unter Verwendung von ABS, gefolgt von einer Trocknungsbehandlung, einen Embryo, der einem echten Samen ähnlicher ist. Wenn die Embryos einmal reif und trocken sind, können sie direkt im Gewächshaus in sterilisierte Erde gepflanzt werden. Dies ist anders bei Janick et al., wo die Lebensfähigkeit der Embryos durch Wachstum auf sterilisierten Nährmedien in Kultur gemessen wird. Wachstum der Embryos auf solchen stabilisierten Nährmedien in Kultur ist viel teurer und zeitaufwendiger als das Pflanzen direkt in sterilisierte Erde.
Embryos, die der Behandlung mit ABS und Trocknung gemäß dieser Erfindung ausgesetzt werden, haben 60 bis 75 %-ige Konversionsraten zu intakten Pflanzen. Die Ergebnisse sind konsistenter als diejenigen, die mit Embryos erreicht werden, die der von Janick und Kitto beschriebenen Behandlung ausgesetzt werden. Der Defekt einiger Embryos, sich nach der Trocknungsbehandlung zu erholen, ist das Ergebnis einer qualitätsmäßig schlechten anfänglichen Embryobildung. Die Überlebensrate würde 99 bis 100 % erreichen, wenn die Embryos vorzugsweise vor dem Trocknen vorselektiert werden.
Embryos, die durch die erfindungsgemäßen Methoden entwickelt wurden, sind in offener Atmosphäre bis zu 8 Monate gelagert worden. Dies ist sehr günstig im Vergleich zum vollkommenen Verlust der Lebensfähigkeit bei Embryos, die durch die Methode von Janick und Kitto behandelt werden. Die durch diese Erfindung bereitgestellte längere Überlebenszeit hat direkte kommerzielle Konsequenzen auf den Versand und die Lagerung. Die Embryos könnten für ausgedehnte Zeitspannen in ähnlichen Systemen, wie sie für langzeitige Samenlagerung verwendet werden, gelagert werden. Solche Lagerungsmethoden würden eine wertvolle Bank genetischen Materials bereitstellen und einen leichten Transport von Embryos über ausgedehnte Zeitspannen ermöglichen.
Gemäß dieser Erfindung erzeugt die Behandlung von asexuell hergestellten Embryos durch ABS nach der Induktionsphase, gefolgt durch ein Trocknungssystem, künstliche Samen mit erhöhter Lebensfähigkeit. Obwohl keine Einkapselung notwendig ist, könnte eine Nährstoffe, Fungizide, etc. enthaltende Kapsel den Embryos von Nutzen sein, wenn das Wachstum einmal angefangen hat.
Es ist ebenso nennenswert, daß andere Techniken angewendet werden können, um die ABS-Synthese im Embryo zu induzieren. Eine solche Synthese kann durch Einschließen von Triazolverbindungen, wie Triadimefon, induziert werden. Umweltstreß wird ebenso die ABS-Synthese induzieren, wie das vorstehende langsame Trocknungsverfahren (Tabelle II), stufenweiser milder Wasserstreß, Kältestreß und Nährstoffstreß. Schonender Wasserstreß wird dadurch erreicht, daß man die Embryos-enthaltenden Agar-Medien langsam dehydratisieren läßt, wie z.B. durch Verwendung von hochosmotischen Medien, um die Dehydratisierung zu induzieren. Kältestreß kann durch das Stellen der die Embryos enthaltenden Agar-Platten in kontrollierte Umweltkammern erreicht werden.

Beispiel 3

Temperaturen zwischen 2º und 6º C sind untersucht worden, wie in der folgenden Tabelle III ausgeführt.

Tabelle III

Wirkung der Kältebehandlung auf die Austrocknungstoleranz der Embryos.

14 Tage alte Embryos wurden bei 2º bis 4º C 2 Wochen lang kältebehandelt. Tabelle III Überlebensrate % Schnelltrocknung Langsamtrocknung Experiment

Beispiel 4

Nährstoffmangel kann erreicht werden durch Ausbringen der voll ausgewachsenen Embryos auf Medien mit reduzierten Nährstoffraten im Vergleich zu Medien, in denen sie zuvor kultiviert wurden. Die Ergebnisse des Nährstoffentzugs sind in Tabelle IV gezeigt. Tabelle IV Wirkung des Nährstoffentzugs auf die Austrocknungstoleranz somatischer Alfalfa-Embryos Überlebensrate % Schnelltrocknung Langsamtrocknung Bi2Y-Kontrollmedium Voll-Saccharose + 1/2 Salze

Beispiel 5

Die Wirkung der Langsamtrocknung somatischer Embryos auf die Steigerung ihrer Austrocknungstoleranz wird in der folgenden Tabelle V gezeigt. Tabelle V Wirkung der Langsamtrocknung (unversiegelt) somatischer Embryos in Agar-Medien auf ihre Austrocknungstoleranz Tage auf Bi2Y Mittel % überlebten Kontrolle Langsamtrocknung Schnelltrocknung unversiegelt Langsamtrocknung Schnelltrocknung
Die Einbeziehung von ABS in die Wachstumsmedien oder alternativ das Einwirkenlassen eines jeden Umwelt- oder chemischen Agens, welches die Synthese oder Anhäufung von ABS induziert, induziert deutlich somatische Embryos, Austrocknungstoleranz gegenüber Raten niedrigen Wassergehalts zu entwickeln. Der Einbeziehung jeder Chemikalie in die Wachstumsmedien oder das Einwirkenlassen einer Umweltbedingung, die die Synthese induziert oder andererseits den Gehalt an fettlöslichen Antioxidantien in zellulären Membranen oder die Menge anderer Membranstabilisierender Agenzien steigert, induziert ebenso ähnliche Grade der Austrocknungstoleranz.

Alfalfa-Zellkultursystem

Zusätzliche Beispiele werden bereitgestellt, um andere Aspekte der Erfindung hinsichtlich der Medien zu beschreiben, die für die Kulturen, Bedingungen der Signalisierung der Austrocknungstoleranz und Anwendung der Erfindung auf andere Pflanzensorten verwendet werden. Die meisten in den folgenden Beispielen beschriebenen Experimente verwendeten das Alfalfa- Zellkultursystem als ein Modellsystem. Die in diesem Verfahren verwickelten Prinzipien sind breit anwendbar für andere Systeme, die Embryos oder ähnlich organisierte meristimetische Gewebe bilden, wenn auch mit recht unterschiedlichen optimalen Behandlungsbedingungen. Das hier beschriebene Alfalfa-Zellkultursystem wird zur Information dargestellt und ist nicht ein zwingender Teil des Verfahrens zur Induktion der Austrocknungstoleranz.

Präparation

Kallus-Kulturen werden anfangs gebildet von sterilen Schnitten des Stielgewebes von einer Donorpflanze. Spezifische Zellinien von Alfalfa werden verwendet, die ein oder mehrere Gene tragen, die für die Regenerationsfähigkeit codieren. Diese Gene stammen ursprünglich von einer Alfalfa-Pflanze des Züchters Rangelander, bezeichnet als A70-34, und sind durch konventionelle Pflanzenzüchtungsmethoden in andere Linien überführt worden. Die Auswahl der Donorpflanze ist sehr wichtig für die Produktion großer Mengen von somatischen Embryos mit hoher Qualität. Die für die anfängliche Kallus-Bildung verwendeten Medien, bezeichnet B5h (Tabelle VI) enthalten 1,0 mg/l 2,4-D als Auxin-Quelle. Dieser Pflanzenwachstumsregulator stimuliert die Embryoinitiierung. Nachdem eine bestimmte Masse an Kallus gebildet worden ist, die gemäß dieser Ausführungsform 14 bis 21 Tage nach der anfänglichen Kultivierung erreicht ist, wird der Kallus in ein Flüssigmedium, GB5 (Tabelle VI), welches ebenso 2,4- D enthält, überführt. Dieses Medium dient dazu, die Kallusmasse in kleine Fragmente aufzulösen und erlaubt die weitere Zellvermehrung und Embryoinitiation. Drei vorherrschende Zelltypen kommen in dieser Suspensionskultur vor: Große Klumpen nicht-differentierter Zellen und abnormale somatische Embryos; kleine aus nicht-differentierten meristematischen Zellen zusammengesetzte Zellanhäufungen, die sich unter geeigneten Bedingungen in globuläre Embryos entwickeln; und große "Bananen"-förmige Einzelzellen, die endständig differenziert sind. Diese Zellklassen werden durch Sieben der Suspension zuerst durch ein 500 µm-Nylonnetz und danach durch ein 200 µm-Netz getrennt. Der letztere Siebvorgang führt zu kleinen Anhäufungen von Zellen, die in ihrer Entwicklung zu somatischen Embryos mehr oder weniger synchronisiert sind. Folglich dient dieser Filtrationsschritt dazu, Embryonalzellen in der Kultur anzureichern und die Embryoentwicklung zu synchronisieren. Tabelle VI Chemische Zusammensetzung des Gewebekulturmediums Gewicht (mg/l) Chemikalie Makronährelemente: Mikronährelemente: Aminosäuren: Adenin Glycin Tabelle VI (Forts.) Aminosäuren: (Forts.) L-Glutamin L-Glutathion Serin Vitamine: Myo-Inositol Nicotinsäure Pyridoxin HCl Thiamin HCl Sucrose Hefeextrakt Agar Hormone: Kinetin
Um die fortlaufende Entwicklung der somatischen Embryos zu erlauben, wird die mit den durch das 200 µm-Sieb gesammelten Embryonalzellen angereicherte Fraktion in eine dünne Schicht ausgebreitet und mit dem Sieb auf ein hormonfreies Medium, Bi2Y (Tabelle 1), ausgebracht. Nach ungefähr 4 Tagen sind die zukünftigen Embryos als grüne Flecken sichtbar. Nach ungefähr 7 Tagen ragen offensichtlich grüne herzförmige Embryos in einem mehr oder weniger synchronisierten Entwicklungsstadium aus dem Kallus-Bett hervor.
Es ist anerkannt, daß viele verschiedene Verfahren verwendet werden können, um Embryos aus Pflanzengeweben mit einem gewissen Synchronisierungsgrad herzustellen. Jede dieser Verfahren würden zufriedenstellend bereitstellen, daß die Embryos von "hoher Qualität" sind, d.h. in der Form ähnlich zu zygotischen Embryos und fähig, einen Keimling mit Wurzeln und Sprossen zu bilden und keine Tendenz zu zeigen, spontan einen Kallus zu bilden.
Bei dem im vorstehenden Abschnitt beschriebenen Gewebekulturverfahren werden 5 Alfalfa-Stielschnitte (25 mg Gew.) pro Petrischale verwendet. Der Kallus dieser 5 Schnitte wird verwendet, um 1 Flasche Suspensionskultur (25 ml) anzuimpfen, die danach verwendet wird, um 10 Nylonscheiben (eine Scheibe besitzt die Größe von ungefähr 7 cm²) herzustellen. Jede Nylonscheibe produziert ungefähr 150 Embryos (bestes Ergebnis = 220) in zwei Entwicklungswellen: Die erste Welle ist diejenige, die für die weitere Arbeit verwendet wird und ungefähr 60 % des Gesamtansatzes oder 90 Embryos (bestes Ergebnis = 132) pro Nylonsieb enthält. In diesem Stadium werden 900 (bestes Ergebnis = 1320) somatische Embryos pro 5 Stielschnitte produziert. Dies stellt eine Embryobildungsrate von 36 000 Embryos (bestes Ergebnis = 52 800) pro g Stielgewebe dar, was ein hochembryogenes System ist, verglichen zu anderen Arten. Eine vorsichtige Schätzung ist, daß 60 % der somatischen Embryos erfolgreich in Pflanzen konvertieren werden, unabhängig davon, ob sie getrocknet werden oder nicht, wobei sich 21 600 Pflanzen pro g Stiel ergeben.
Man bräuchte ungefähr 160 Stielschnitte oder 80 vollständige Stiele, um 1 g Donorgewebe zu erhalten. Die Verwendung von 3 Stielen von einem Stamm einer Alfalfa-Pflanze mit insgesamt 10 Stämmen würden 60 sterilisierte Stielschnitte (0,30 g) ergeben. Folglich könnte erwartet werden, daß eine Alfalfa-Pflanze 6500 regenerierte Pflanzen in einem Zyklus des Zellkultursystems ergibt. Die gesamte für diesen Zyklus benötigte Zeit beträgt ungefähr 3 Monate.

Beispiel 6

Auswirkung des Entwicklungsstadiums und der ABS-Konzentration auf die Überlebensrate von Alfalfa-Embryos nach Trocknung.
Es gibt ein optimales Entwicklungsstadium und eine optimale ABS-Konzentration, die in dem Embryo eine Antwort hervorruft, die zu der Ausprägung der Austrocknungstoleranz führt. Es kann erwartet werden, daß dieses Optimum zwischen Arten und Kulturbedingungen variiert. In diesem Beispiel wurden somatische Embryos wie in dem vorstehenden Verfahren gebildet. Am 11., 14. und 18. Tag nach der Überführung auf Bi2Y-Medium (entsprechend den Torpedo-, frühen Cotyledonen und mittleren Cotyledonen-Entwicklungsstadien) wurden die Embryos auf dem Nylonsieb auf Bi2Y-Medium, enthaltend 0,5 oder 10 µ Molar ABS-Konzentration 5 bis 14 Tage lang überführt. Die Embryos wurden nachfolgend in der Luft getrocknet und die Lebensfähigkeit wurde 1 Woche später bestimmt durch die Fähigkeit der Embryonen, nach Rehydratisierung in Pflanzen auszuwachsen. Tabelle VII Überlebensrate somatischer Alfalfa-Embryos nach Lufttrocknung Embryoalter (Tage) ABS-Konzentration 10&supmin;&sup6; Molar % wiedereinsetzendes Wachstum
Das optimale Entwicklungsstadium ist relativ breit und wird bis zu einem gewissen Grad von der Synchronisierung der Embryoentwicklung beeinflußt. Etwas Austrocknungstoleranz wurde auch in der Abwesenheit von ABS induziert, jedoch begünstigten 5 bis 10 µM-Konzentrationen höhere Überlebensraten der somatischen Embryos. Das relativ niedrige (50-70%) wiedereinsetzende Wachstum der Embryos gemäß der vorstehenden Daten ist primär ein Ergebnis der Qualität der Embryos vor dem Trocknen und nicht notwendigerweise des Trocknungsverfahrens an sich. Wenn Embryos guter Qualität vorselektiert werden, erreicht die Überlebensrate 100 % (Tabelle VIII). Weitere Experimente haben gezeigt, daß ABS-Konzentrationen im Bereich von 10 -3 Molar toxisch für das Pflanzengewebe und daher unbefriedigend sind. Weiterhin sind Konzentrationen im Bereich von 10&supmin;&sup8; molar unwirksam. Tabelle VIII Überlebensrate (% wiedereinsetzendes Wachstum) vorselektierter Embryos nach Embryos nach Lufttrocknung Embryoalter (Tage) ABS-Konzentration (10&supmin;&sup6; molar)

Beispiel 7

Wirkung des Embryoentwicklungsstadiums auf die Sensitivität gegenüber der ABS-Induktion von Austrocknungstoleranz.

Somatische Alfalfa-Embryos wurden, wie vorstehend ausgeführt, induziert und überführt auf hormonfreies Bi2y'. An spezifischen Tagen des Wachstums auf Bi2y'-Medium wurden die Embryos für eine Zeitspanne von 7 Tagen auf 10-5 M ABS (10 µ molar) enthaltendes Bi2y'-Medium überführt. Die Embryos wurden nachfolgend getrocknet und auf Keimungspapier rehydratisiert, um die Lebensfähigkeit, wie in Beispiel 6, abzuschätzen. Tabelle IX Antwort der Embryos in verschiedenen Entwicklungsstadien auf die ABS-Behandlung Embryoalter (Tage) % Lebensfähigkeit Experiment
Die Daten zeigen deutlich, daß die Antwort der Embryos auf ABS-Behandlung altersabhängig ist. Die ABS-Behandlung an Embryos in frühen Entwicklungsstadien (vor 5 Tagen) induzierte keine Austrocknungstoleranz. Jedoch ist es nennenswert, daß diese Zeit abhängig von den Wachstumsbedingungen und Arten variiert.

Beispiel 8

Wirkung von Schnell- und Langsamtrocknen auf die Überlebensrate von Alfalfa-Embryos

In diesem Beispiel wurden Alfalfa-Embryos, wie beschrieben, gebildet und wie in Beispiel 6 mit ABS behandelt. Die Embryos wurden danach wie in Beispiel 1 einer "Schnell" -Trocknung und einer "Langsam" -Trocknung ausgesetzt. Schnelltrocknung betrifft eine Wasserverlustrate von ungefähr 6,7 g H&sub2;O/g Trockengewicht/Tag. Bei der Langsamtrocknungsbehandlung wurden die Embryos in eine Reihe von Kammern mit kontrollierter Feuchtigkeit mit fortlaufend niedriger Feuchtigkeit über eine Zeitspanne von 6 Tagen gesetzt. Die verwendeten Feuchtigkeiten waren aufeinanderfolgend 97, 87, 76, 63, 51 und 43 %. Die in Tabelle X gezeigte Wasserverlustrate nähert sich 1,2 g H&sub2;O/g Trockengewicht/Tag an. Tabelle X Wasserverlust von Alfalfa-Embryos während Langsamtrocknung relative Feuchtigkeit % Tag g H&sub2;O.g Trockengew.
Am Ende der Trocknungsfolge wurden die Embryos in Luft bis zum selben Feuchtigkeitsgehalt wie bei den schnell getrockneten Embryos äquilibriert. Die Lebensfähigkeit wurde gemessen als wiedereinsetzendes Wachstum wie in Beispiel 6. Tabelle XI Überlebensrate von Alfalfa-Embryos nach Langsam- und Schnelltrocknungsbehandlungen Trocknungsrate ABS-Konzentration µ Molar schnell langsam % wiedereinsetzendes Wachstum
Langsamtrocknen verlieh den Embryos in der Abwesenheit von ABS einen gewissen Grad an Toleranz. Wie in Tabelle XI gezeigt, trat die maximale Überlebensrate mit 5 x 10&supmin;&sup6; M ABS bei Langsamtrocknen und mit 10&supmin;&sup5; M ABS bei Schnelltrocknen ein, jedoch ist die wirksame Konzentration ziemlich breit. Es ist ziemlich wahrscheinlich, daß Langsamtrocknen die Synthese von endogenem ABS durch den Embryo selbst induziert.

Beispiel 9

Wirkung der Dauer des Einwirkenlassens von ABS auf die Austrocknungstoleranz

Die Dauer des Einwirkenlassens von ABS verändert die optimale Konzentration und das optimale Entwicklungsstadium der Alfalfa-Embryos, jedoch ist dieser Bereich ziemlich breit. Um dies aufzuzeigen, wurden die Wirkungen des Ausgesetztseins gegenüber 3 ABS-Konzentrationen für 5,10 und 15 Tage, wie in Beispiel 6 ausgeführt, bestimmt. Die verwendeten Trocknungsbehandlungen waren Schnell- und Langsamtrocknen, wie in Beispiel 7 beschrieben. Lebensfähigkeit wurde bestimmt als wiedereinsetzendes Wachstum zu Pflanzen. Tabelle XII Wirkung der ABS-Konzentration und Dauer des Einwirkenlassens auf die Überlebensrate von Alfalfa-Embryos nach Schnell- und Langsamtrocknen Tage des Einwirkenlassens Trocknungsrate ABS-Konzentration (10&supmin;&sup6; molar) schnell langsam % wiedereinsetzendes Wachstum
Alle Faktoren, von denen erwartet werden könnte, daß sie die ABS-Konzentration in den Zellen der Embryos beeinflussen, beeinflußten die Überlebensrate nach Austrocknen und scheinen wechselzuwirken. Die ABS-Konzentration im Medium, die Dauer des Einwirkenlassens und die Trocknungsrate hatten signifikante Effekte.

Beispiel 10

Wirkung von Umweltstreßarten, einschließlich niedriger und hoher Temperatur und Nahrungsmittel- und Wasserentzug auf die Überlebensrate von Alfalfa-Embryos nach Trocknung.
Viele Umweltstreßarten veranlassen Pflanzen, ABS zu synthetisieren, wie in Walton, D.C. 1980, Biochemistry and Physiology of Abscisic Acid Ann. Rev. Plant Physiol. 26:775-780 aufgezeichnet. Somatische Embryos können in ähnlicher Weise antworten. Diese Möglichkeit ist durch 4 verschiedene Experimente gezeigt, die unter Verwendung von somatischen Embryos ausgeführt wurden, die wie vorstehend beschrieben, hergestellt und 14 Tage nach Überführung auf Bi2Y'-Medium gesammelt wurden. Kein ABS wurde äußerlich zugegeben. Die Embryos wurden:
a) überführt auf Bi2Y'-Medium mit niedrigen Raten an anorganischen Salzen
b) überführt in einen Kälteraum mit 2-4º C, 12 Stunden Lichtdauer 200 µEm&supmin;1²s&supmin;1 Photonenflußdichte für weitere 14 Tage
c) langsam trocknengelassen auf Bi2Y' Agar-Medium durch Entfernen der Parafilm-Versiegelung und 18-23 Tage später gesammelt
d) bei 38º C 10 min bis 120 min inkubiert. Die Embryos wurden nachfolgend entweder durch die in Beispiel 2 beschriebene "Schnell"- oder "Langsam"-Methode getrocknet und die Lebensfähigkeit wurde bewertet als wiedereinsetzendes Wachstum zu Pflanzen. Tabelle XIII Wirkung von Umweltstreßarten auf die Überlebensrate von somatischen Alfalfa-Embryos nach Trocknung Behandlung Schnelltrocknung Langsamtrocknung % wiedereinsetzendes Wachstum Kontrolle 1/2 Bi2Y' Salze kältegestreßt wassergestreßt hitzegestreßt bei 38º C für:
Wenn die Embryos einem zusätzlichen Streß oder Signal vor dem Trocknen, besonders vor dem Langsamtrocknen ausgesetzt werden, wurde dadurch die Fähigkeit der Embryos nach Trocknung auszuwachsen gesteigert. Einige dieser Behandlungen erreichten oder überschritten die Wirksamkeit der äußerlichen Anwendung von ABS und könnten verwendet werden anstatt dieser als ein Signal für den Embryo, welches zur Entwicklung der Austrocknungstoleranz führt.

Beispiel 11 Wirkung von Triazolen auf die Überlebensrate von Alfalfa-Embryos nach Trocknung.

Triazole sind Gruppen von Verbindungen, welche Pflanzenwachstum regulierende Eigenschaften haben. Von einigen ist bekannt, daß sie einen Anstieg der ABS-Synthese in Pflanzen induzieren. Uniconizol (Ortho Chemical Co.) ist für unsere Experimente ausgewählt worden, um diese Gruppe der Verbindungen zu repräsentieren und ebenso als ein chemisches Agens mit der Fähigkeit, die ABS-Synthese zu induzieren.
Die Embryos wurden wie vorstehend beschrieben auf Bi2Y'-Medium kultiviert und auf Bi2y-Medium, enthaltend verschiedene Konzentrationen an Triazol überführt. ABS wurde nicht äußerlich zugefügt. Nach 10 Tagen wurden die Embryos entweder durch die "Langsam"- oder "Schnell"-Methode getrocknet. Tabelle XIV Wirkung der Triazol-Behandlung auf die Embryoüberlebensrate nach Trocknung Uniconizol-Konzentration % wiedereinsetzendes Wachstum (X 10&supmin;&sup6; molar) Schnelltrocknung Langsamtrocknung
Obwohl diese Embryos überlebten und in Pflänzchen konvertierten, war die Qualität der Pflänzchen nicht vergleichbar mit ABS-behandelten Pflanzen. Triazol scheint andere Effekte, wie wachstumsverzögernde Effekte zu haben. Jedoch ist es nennenswert, daß die Methode verwendet werden kann, um Austrocknungstoleranz in Embryonen zu verbessern.

Beispiel 12 Verstärkung der Keimlingsvitalität in getrockneten somatischen Embryos

Somatische Alfalfa-Embryos wurden, wie vorstehend induziert, für 7 Tage auf 10&supmin;&sup5; M ABS-Medium überführt und langsam getrocknet. Die getrockneten Embryos wurden auf feuchtem Keimungspapier 2 Wochen lang gekeimt. Zu dieser Zeit war ihr Wachstum vergleichbar zu somatischen Embryos, denen man erlaubt hatte, ihre Entwicklung auf Bi2Y'-Medium für die gleiche Zeitdauer fortzusetzen. Tabelle XV Wachstum und Entwicklung von Alfalfa-Keimlingen von verschiedenen Arten somatischer und zygotischer Embryos nach 2-wöchigem Auswachsenlassen somatischer Embryo kein ABS kein Trocknen mit ABS getrocknet Gesamt-Frischgewicht (mg) Sproßfrischgewicht (mg) Wurzelfrischgewicht (mg) Sproßlänge (mm)
Das Trocknen der somatischen Embryos steigerte die Wachstumsrate der Keimlinge nach der Keimung ungefähr zweifach. Es würde erwartet werden, daß die erhöhte Vitalität der getrockneten somatischen Embryos die Ausbildung von Keimlingen unter kompetitiven Bedingungen erleichtert, wie solche, die unter Gewächshaus- oder Feldbedingungen ausgetestet wurden.

Beispiel 13 Vergleich der ABS-Behandlung während der Embryoinduktionsphase und der ABS-Behandlung nach der Embryobildung

Der grundlegende Unterschied zwischen der Technik von Janick und Kitto (wie oben) und dem vorstehend beschriebenen Verfahren ist das Stadium, bei welchem die ABS-Behandlung angewandt wird. Das erstere Verfahren bezieht ABS in dem Medium während der Embryoinduktionsphase ein, in welcher andere Wachstumsregulatoren vorhanden waren. Im Gegensatz verwendet dieses Verfahren ABS, nachdem die Induktion der Embryobildung abgeschlossen ist, wenn andere Wachstumsregulatoren abwesend sind. Um diese zwei Verfahren zu vergleichen, wurden somatische Alfalfa-Embryos induziert und die ABS-Behandlung (10&supmin;&sup5; Molar) wurde entweder während der Induktionsphase in Suspension durchgeführt, in der andere Wachstumsregulatoren (2,4-D, NAA) vorhanden waren oder nachdem die Embryos auf hormonfreiem Bi2y-Medium gebildet wurden. Diese Daten (Tabelle XVI) zeigen deutlich den Unterschied zwischen den zwei Verfahren. Die ABS-Behandlung in der Induktionsphase (in Suspension) induzierte keine Austrocknungstoleranz. Im Gegensatz dazu induzierte die ABS-Behandlung zu einem Zeitpunkt, nachdem der Embryo sich zu dem frühen Cotyledonen-Stadium entwickelt hat, Austrocknungstoleranz in den Embryos. Tabelle XVI Vergleich der Antwort der Embryos auf ABS-Behandlung in der Induktionsphase mit der ABS-Behandlung nach Embryobildung Behandlung 1o µ molar ABS während Induktion (in Suspension) 10 µ molar ABS nach Embryobildung (7 Tage alte Embryos) % Überlebensrate (wiedereinsetzendes Wachstum

Beispiel 14 Langlebigkeit getrockneter somatischer Embryos im trockenen Zustand

Getrocknete somatische Embryos können unter Verwendung von Systemen, die identisch zu denjenigen für die Lagerung von echten Samen sind, gelagert werden. Es wird erwartet, daß die optimale Lagerung der Embryos unter kühlen, trockenen Bedingungen erreicht wird. Die in Beispiel 1 produzierten getrockneten somatischen Embryos wurden in einer Petrischale unter normalen atmosphärischen Bedingungen bei Raumtemperatur in einer Laboratoriumsschublade gelagert. Nach 8-monatiger Lagerung unter Bedingungen, die schlechter als optimal sind, gab es keinen nennenswerten Verlust der Embryolebensfähigkeit, d.h. das wiedereinsetzende Wachstum der Embryos lag im Bereich von 65-70 %.

Beispiel 15 Induktion der Austrocknungstoleranz in aus Mikrosporen abstammenden Embryos von Brassica

Um zu demonstrieren, daß das hierin beschriebene Verfahren auf Pflanzenembryos im allgemeinen anwendbar und nicht spezifisch für somatische Alfalfa-Embryos ist, ist Austrocknungstoleranz in von Brassica-Mikrosporen abgeleiteten Embryos induziert worden.
In vorläufigen Experimenten wurden Embryos in den Torpedo- bis Cotyledonen-Entwicklungsstadien mit 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;&sup6; molar ABS auf Agar-Medium behandelt worden unter Verwendung von Nylonnetzen, um die Embryos vom Medium zu separieren. Die Embryos wurden 7 Tage lang auf dem ABS-Medium gehalten und nachfolgend unter Anwendung der schnellen und langsamen Methoden getrocknet. Im wesentlichen war das verwendete Verfahren ähnlich demjenigen, das für die somatischen Alfalfa-Embryos verwendet wurde. Die Überlebensrate der von Mikrosporen abstammenden Embryos war ungefähr 60 %. Wachstum der nicht behandelten Embryos liegt routinemäßig im Bereich von 60-70 %; daher schien das Trocknungsverfahren ziemlich befriedigend zu sein. Tabelle XVII Überlebensrate von mit ABS behandelten Brassica- Embryos nach Trocknung % wiedereinsetzendes Wachstum ABS-Konzentration µ Mole nur Wurzeln Sprosse Pflänzchen
In zusätzlichen Experimenten wurden Embryos von Brassica napus-Mikrosporen in Flüssigkultur induziert, wie genauer in Pecham, P. M. und W.A. Keller (1988) Identification of potentially embryonic microspores in Brassica napus L. Physiol. Plant. (in press) beschrieben ist. Am 32. Tag wurden die Kulturen einer ABS-Behandlung durch Zufügen von ABS direkt in die Lösung unterzogen. Die Kulturen bestanden aus Embryos in verschiedenen Entwicklungsstadien. Die Embryos wurden gemäß ihrer Größe in zwei Gruppen fraktioniert; eine Fraktion mit 2-4 mm großen Embryos, die reifere Embryos im Cotyledonen-Stadium darstellen und eine Fraktion mit Embryos mit einer Größe kleiner als 2 mm (jüngere Embryos). Beide Fraktionen wurden mit 5 x 10&supmin;&sup5; molar ABS behandelt, das für 7 Tage zu der Lösung zugegeben wurde. Anschließend wurden die Embryos entweder langsam oder schnell auf einem Netz oder einem Filterpapier getrocknet, wie für Alfalfa genau beschrieben wurde. Tabelle XVIII Überlebensrate von aus Brassica napus-Mikrosporen abgeleiteten Embryos nach schneller und langsamer Trocknung kein ABS 5 x 10&supmin;&sup5; molar ABS Trocknungsrate schnell langsam % Lebensfähigkeit % Konversion zu normalen Pflanzen
Die Daten zeigen deutlich, daß die ABS-Behandlung die Austrocknungstoleranz in Brassica-Embryos verbessert und daß diese Antwort spezifisch für das Entwicklungsstadium des Embryos ist. Reifere Embryos im Cotyledonen-Stadium antworten besser auf die ABS-Behandlung als jüngere Embryos.
Diese Ergebnisse sind in voller Übereinstimmung mit denen, die mit Alfalfa erhalten werden, wodurch angezeigt wird, daß das Verfahren äußerst wahrscheinlich breit anwendbar ist für alle Embryos, die sich in vitro entwickeln.
Die Fähigkeit, somatische oder von Mikrosporen abstammende Embryos zu trocknen, wird eine gewaltige Verbesserung für die laufende Technologie zur Produktion künstlicher Samen bedeuten. Die zwei Hauptvorteile sind ausgedehnte Lagerung in einem Ruhezustand und erhöhte Widerstandsfähigkeit des resultierenden Keimlings. Wenn der Embryo trocken ist, ist der Metabolismus abgeschaltet und folglich wird die Verwendung von wertvollen Speicherreserven und das Wachstum des Keimlings verhindert. Es wird betont, daß Gewebe, das, wie für dieses Verfahren beschrieben wurde, hergestellt und getrocknet wurde, in ähnlicher Weise und für ähnliche Zeitspannen gelagert werden könnte, verglichen zu denen "echter" Samen. Der andere Vorteil ist die erhöhte Widerstandsfähigkeit des von einem trockenen Embryo hergestellten Keimlings im Vergleich zu der, die von einem Embryo produziert wird, der einem Entwicklungsweg folgt, der analog zur vorzeitigen Keimung ist. Der Grund für diese erhöhte Widerstandsfähigkeit ist in diesem Fall nicht klar definiert, jedoch ist sie wahrscheinlich analog zu der Situation für zygotische Embryos.
Einige der Verwendungen künstlicher Samen zu kommerziellen Zwecken sind beschrieben worden, jedoch wurde das vollständige Potential noch nicht vollständig verwirklicht wegen der Unfähigkeit, Embryos zu trocknen. Die Anwendungen umfassen die folgenden:
1. Pflanzengewebekulturtechniken und künstliche Samen können verwendet werden, um einzelne Pflanzen zu clonieren zur:
a) Vermehrung von Zierpflanzen;
b) Vermehrung von Elite-Keimplasma, wie hybride oder parentale Stämme für die Saatherstellung;
c) Vermehrung steriler Pflanzen, wie männlich- oder weiblich-steriler Pflanzen, die in der Hybridherstellung verwendet werden;
d) Verminderung der Anzahl meiotischer Ereignisse, die benötigt werden, um Samen für kommerzielle Zwecke herzustellen, in Fällen, in denen solche meiotische Rekombinationen verminderte Pflanzennutzeffekte ergeben;
e) Herstellung pathogenfreier Vermehrungsstadien für den Transport, Vermeidung von Problemen und Verzögerungen, die sich durch Quarantäne und/oder Einfuhrbeschränkungen ergeben, wenn dieser Transport über internationale Grenzen erfolgt.
2) Trockene somatische oder von Mikrosporen abstammende Embryos könnten ebenso verwendet werden, um Pflanzen in einen Ruhezustand für lange oder kurze Zeitspannen für Gelegenheiten zu lagern, die analog zur Samenlagerung sind. Dies hat Vorteile für das
a) Erhalten lebensfähiger Stämme genetisch verschiedener Pflanzen, wie bei der Keimplasmalagerung;
b) Erhalten eines Stammens herausragender oder einzigartiger Pflanzen, die genetisch heterozygot sind und deren Nachkommen daher nicht notwendigerweise die gleichen Charakteristiken haben würden;
c) Erhalten eines Stammes an Pflanzen, bis günstige Pflanzbedingungen oder -räume verfügbar sind, wie bei der Beurteilung doppelt-haploider von aus Mikrosporen abgeleiteten Embryos;
d) Erhalten eines Stammes an Pflanzen für den direkten kommerziellen Verkauf an Gärter oder Züchter.
e) Erhalten von Vermehrungsmaterial für Pflanzen, die nicht regelmäßig Samen herstellen oder nicht lebensfähige, z.B. leere Samen herstellen.

Claims

1. Verfahren zum Induzieren einer Austrocknungstoleranz in einem in vitro gebildeten Pflanzenembryo, um die Herstellung von wachstumsfähigem künstlichen Saatgut zu ermöglichen, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren von Pflanzenembryos in vitro, Stimulieren dieser Embryos, damit diese durch das globuläre und ein herzförmiges Stadium in ein länglich-torpedoförmiges Stadium und frühes Cotyledonen-Stadium fortschreiten, Induzieren dieser Embryos zum Zeitpunkt des torpedoförmigen Stadiums mit einer Quelle an Abscisinsäure mit einer wirksamen Konzentration der Abscisinsäure und für eine genügende Zeitdauer, um die Ausprägung der Austrocknungstoleranz hervorzurufen, welche eine Veränderung im zellulären Metabolismus, in Elektronentransportprozessen und Oxidations-Reduktions-Reaktionen in diesen Embryos umfaßt, und daraufhin Trocknen dieser induzierten Embryos bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 20 Gew.-%, um stabile wachstumsfähige Embryonen bereitzustellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Induktion der Embryonen mit der Quelle an Abscisinsäure die Anwendung von Umweltstreß umfaßt, um die Embryos zu veranlassen, Abscisinsäure in einer ausreichenden Menge zu synthetisieren, um die Ausprägung der Austrocknungstoleranz hervorzurufen, welche eine Veränderung im zellulären Metabolismus, in Elektronentransportprozessen und Oxidations-Reduktions-Reaktionen in den Embryos umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, in welchem die Anwendung von Umweltstreß eine oder mehrere der folgenden Behandlungen umfaßt:

i) langsame stufenweise Austrocknung

ii) niedrige Temperatur

iii) Nährstoffmangel

iv) Hitzestreß und

v) osmotischer Streß.

4. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Induktion der Embryos mit der Quelle an Abscisinsäure die äußerliche Verabreichung der Abscisinsäure zu den kultivierten Embryos umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, in welchem die Abscisinsäure in einer Konzentration im Bereich von 10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;³ M angewendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, in welchem die Embryos auf einem Träger kultiviert werden, der durchlässig für ein Kulturmedium für die Embryos ist und die Abscisinsäure zu dem Medium zugefügt wird, um die Embryos zu induzieren.

7. Verfahren nach Anspruch 6, in welchem der Träger ein durchlässiges Nylonpapier oder Netz ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, in welchem das Medium ein festes Agar-Medium ist.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem die Induktion der Embryos 5 bis 14 Tage fortgesetzt wird.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem die Embryos während des globulären Stadiums abgetrennt werden, um eine Kultur somatischer Embryos bereitzustellen, die in ihrer Entwicklung synchronisiert sind.

11. Verfahren nach Anspruch 10, in welchem die Embryos durchgesiebt und zurückgehalten werden zwischen einem 500 µm-offenmaschigen und einem 200 µm-offenmaschigen Nylonnetz.

12. Verfahren nach Anspruch 11, in welchem die Embryos von Alfalfa-Pflanzen oder einer Brassica-Pflanze abgeleitet sind.

13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem das Trocknen der induzierten Embryos durch Lufttrocknung über die Zeitspanne eines Tages bewerkstelligt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, in welchem die induzierten Embryos mit einer Rate von 1,2 bis 6,7 g H&sub2;O/g Trockengewicht/Tag getrocknet werden.

15. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Quelle an Abscisinsäure entwickelt wird durch Induzieren der Embryos mit einem Inhibitor des Isoprenoidmetabolismus, wobei der Inhibitor Uniconizole ist.