NO179352B - Fremgangsmåte for konservering av planteembryoer - Google Patents
Fremgangsmåte for konservering av planteembryoer Download PDFInfo
- Publication number
- NO179352B NO179352B NO903138A NO903138A NO179352B NO 179352 B NO179352 B NO 179352B NO 903138 A NO903138 A NO 903138A NO 903138 A NO903138 A NO 903138A NO 179352 B NO179352 B NO 179352B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- embryos
- oil
- stored
- hypoxia
- temperature
- Prior art date
Links
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 title claims description 141
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 25
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 45
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 32
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims description 32
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims description 16
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 12
- 240000007154 Coffea arabica Species 0.000 claims description 8
- 235000007460 Coffea arabica Nutrition 0.000 claims description 8
- 230000035601 cold sensitivity Effects 0.000 claims description 7
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 claims description 5
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 claims description 5
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 claims description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 23
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 17
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 2
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241001338022 Daucus carota subsp. sativus Species 0.000 description 1
- 241000204888 Geobacter sp. Species 0.000 description 1
- 206010021033 Hypomenorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 238000012505 colouration Methods 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 230000030118 somatic embryogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N3/00—Preservation of plants or parts thereof, e.g. inhibiting evaporation, improvement of the appearance of leaves or protection against physical influences such as UV radiation using chemical compositions; Grafting wax
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
Description
Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for konservering av planteembryoer.
En lang rekke planter kan bli konservert og lagret i form av cellesuspensjoner, kalluser eller til og med meristemer.
Lagring av planteembryoer blir motivert i mange tilfeller f.eks. ved regulering av produksjonen til kimplantene sesong-messig, eller for å opprettholde en klonal linje. Konservering av planteembryoer kan ha forskjellige fordeler, inkludert f.eks. mulighet for temporær stopping av utviklingen til embryoene, tiden som er nødvendig for transport til frøsengen eller evnen og muligheten for å produsere kunstige frø.
Somatiske embryoer har visse fordeler ved formering av planter. De utgår i prinsippet fra en enkelt celle og gir genetisk identiske planter. Fra begynnelsen av deres dannelse har somatiske embryoer en bipolar struktur: de har to meristemer, stamme og rot, som er nødvendige for å fremstille en plante. Således synes somatisk embryogenese å være et interessant alternativ for formering av planter: den kunne bli anvendt til rask formering av arter som er kostbare å fremstille eller med høy-yteevneindivider som går ut fra in vitro-kulturer eller fra transformerte planter som er f.eks. vanskelige å reprodusere seksuelt.
Det finnes forskjellige kjente prosesser for å lagre udifferensiert vev ved lave temperaturer og/eller under hypoxi. Generelt blir vevene bevart på et halv-faststoffmedium eller lagret ved en temperatur under 0"C.
En kjent fremgangsmåte omfatter lagring av druekalluser ved en temperatur på 10°C eller 15"C. For å øke deres lagringstid kan et lag med silikonolje bli tilsatt kallusene, mens de forblir på sitt naeringssubstrat. En annen fremgangsmåte som kan bli anvendt på gjær eller celler omfatter dannelse av en vandig emulsjon av cellene ved å anvende et oljemedium og avkjøle det hele til en temperatur i størrelsesorden -20°C/-30°C slik at vannet forblir superavkjølt. Oljen fungerer således som et kryobeskyttende middel for cellene eller gjæren.
Målet med foreliggende oppfinnelse er å frembringe en fremgangsmåte for konservering av planteembryoer der veksten hos embryoene isolert fra deres dyrkingsmedium, kan bli betydelig nedbremset i en forhåndsbestemt tid og deretter gjenopptatt uten fremkomst av sekundær embryogenese.
Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er kjenne-tegnet ved at embryoene blir bevart under hypoxi ved tildekking med et lag olje, og etter dette blir embryoene avkjølt og lagret ved en temperatur svakt over kuldesensitivitetsterskelen til de aktuelle embryoene.
Det har overraskende blitt funnet at ved å beholde embryoene under hypoxi i olje ved en lav temperatur, kan veksten deres bli delvis eller vesentlig hemmet uten noen effekt på levedyktighet og spireevne, men samtidig blir integriteten i strukturen til embryoene under den etterfølgende veksten opprettholdt uten fremkomst av noen andre former for morfogenese, slik som kallogenese eller sekundær embryogenese, enten i lys eller mørke.
Med andre ord vil fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for konservering av planteembryoer på den ene side muliggjøre at embryoene overlever når det gjelder morfologiske integritet, og på den annen side muliggjør at de effektivt beholder evnen til å utvikle en kimplante.
Således er en annen fordel med fremgangsmåten at den muliggjør at embryoer kan bli lagret i relativt lange perioder. En annen fordel med fremgangsmåten er at den muliggjør at embryoer blir lagret ved raskt tilgjengelige temperaturer (f.eks. i et kjøleskap) uten å anvende kostbart utstyr. En annen fordel med oppfinnelsen er at den skaffer til veie en fremgangsmåte som kan bli gjennomført raskt og enkelt både i mørke og lys.
Embryoene som blir anvendt i foreliggende oppfinnelse kan være av en hvilken som helst opprinnelse og en hvilken som helst art, slik som f.eks. gulrøtter eller kaffetre.
Embryoene kan være somatiske embryoer eller zygotiske embryoer.
De somatiske embryoene kan bli oppnådd fra udifferensierte cellesuspensjoner. I dette tilfelle kan f.eks. frø fra et hybridopphav spires aseptisk. Hypokotylen kan bli kuttet og deretter plassert på et dyrkingsmedium som inneholder veksthormoner. Kallusene som blir oppnådd kan deretter bli dissosiert i et flytende dyrkingsmedium. Dette gir en udifferensiert cellesuspensjon der cellene, etter flere underkulturer, kan bli overført et dyrkingsmedium. Etter ca. ti dager kan cellesuspensjonen bli filtrert slik at bare celleaggregatene med ønsket størrelse blir beholdt. Disse aggregatene kan bli dyrket i noen få dager på et hormon-fritt dyrkingsmedium for å indusere dannelse av embryoer.
De zygotiske embryoene kan bli oppnådd ved prøvesamling ved disseksjon av prøvene ved det modne eller svakt umodne trinnet.
Somatiske og zygotiske embryoer som er oppnådd kan bli klassifisert i henhold til deres utviklingstrinn. Foretrukne embryoer er i de initielle utviklingstrinnene når de er mellom 150 og 1000 pm i størrelse. Disse størrelsene tilsvarer hjerte og torpedotrinnene i utviklingen.
De oppnådde embryoene kan deretter bli vasket, f.eks. med et flytende dyrkingsmedium som er fritt for veksthormoner av en type som ofte blir benyttet i embryodyrking, slik som et Murashige og Skoog-medium som inneholder 5 g/l sukrose. De vaskede embryoene kan deretter blir overført til dyrkingsplater og tørket ved borttrekking av det resterende dyrkingsmedium, f.eks. ved hjelp av en pipette.
Embryoene blir deretter bevart under hypoxi ved tildekking med et lag olje. Oljen blir valgt for dens evne til å besørge hypoxi, dvs. overføring av lite, hvis noe, ytre oksygen til embryoene. Oljen fungerer som et konserveringsmiddel og frembringer embryoer med den minimale mengden oksygen som er nødvendig for dens overlevelse. Oljen som blir anvendt for å opprettholde hypoxi kan være en mineralolje, en olje av vegetabilsk opprinnelse, en syntetisk olje eller en hvilken som helst annen olje som har evne til å opprettholde hypoxi uten at den blir toksisk mot embryoene. Oljen som blir anvendt er fortrinnsvis en flytende parafinolje. Oljen kan være avgasset og/eller sterilisert på forhånd, f.eks. ved autoklavering i 20 minutter ved 115°C.
Oljemengden som blir tilsatt bør være tilstrekkelig til å dekke embryoene fullstendig. Oljen blir fortrinnsvis tilsatt i en mengde fra 0,02 til 0,5 ml pr. embryo.
Embryoene blir deretter avkjølt til en temperatur rett over kuldesensitivitetsterskelen til de aktuelle embryoene. Kuldesensitivitetsterskelen forstås å være temperaturen der embryoene ikke lenger er levedyktige. Temperaturen som embryoene blir avkjølt og deretter lagret ved, kan være noen få grader, fortrinnsvis 1 til 10°C over kuldesensitivitetsterskelen .
Lagringstemperaturen kan f.eks. være mellom 2 og 8°C og fortrinnsvis mellom 3 og 5°C for embryoene av arter som bare er svakt sensitive for kulde, slik som gulrøtter. Den kan være mellom 12 og 20°C og fortrinnsvis mellom 15 og 17°C for embryoer av arter som er mer sensitive for kulde, f.eks. arter av tropisk opprinnelse, slik som f.eks. kaffetrær.
Embryoene kan f.eks. bli avkjølt ved overføring av dyrkings-platene som inneholder embryoene til et kjøleskap eller luft-kondisjonert kammer. Avkjølingshastigheten kan være litt rask, f.eks. i størrelsesorden fra 1 til 3°C pr. minutt.
Embryoene under hypoxi i olje kan bli lagret i svakt lys (i størrelsesorden 200 lux) eller i mørke.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen sikrer overlevelse av embryoene som blir lagret i mørke. Dette kan ha en praktisk fordel i tilfeller der kunstige frø senere skal produseres ved innkapsling av embryoet. Dette er fordi det synes sannsynlig at ikke noe resterende belysning når embryoene på innsiden av kapselen. Embryoene kan bli lagret under disse betingelsene i relativt lange perioder, dvs. i tilnærmet to til fire måneder.
Etter lagring kan embryoene bli fjernet fra kjøleskapet og gjenoppvarmet til omgivelsestemperatur. Når de har nådd en temperatur i størrelsesorden 20°C, kan de bli vasket med et typisk flytende dyrkingsmedium for å eliminere et hvert spor av olje.
De kan deretter bli plassert i eller på et typisk dyrkingsmedium, slik som et Murashige og Skoog-medium, der de gjenopptar normalt vekst som kan sammenlignes med den til embryoer som ikke har blitt lagret.
For distribusjon blant brukere til konvensjonell såing i en frøseng eller i et felt, kan embryoene bli innkapslet i mer resistente materialer som gir dem beskyttelse som kan sammenlignes med den til naturlige frø. I dette tilfelle kan olje-tildekkede embryoer bli innkapslet i naturlige eller kunstige polymerer, f.eks. en natriumalginatgel. Disse kapslene gir embryoene mekanisk og hygienisk beskyttelse og skaffer tilveie ernæring til kimplanten under dens spiring. Kapslene kan deretter bli dekket med en ytterligere film, f.eks. av en vann-oppløselig harpiks som delvis beskytter dem mot brekkasje og uttørking. Det er mulig på denne måten å oppnå et kunstig frø som bevares i lengre perioder, nemlig den tiden som er nødvendig for praktisk anvendelse.
Foreliggende oppfinnelse blir illustrert i mer detalj i de følgende eksemplene. Disse eksemplene blir forutgått av et eksempel på den konvensjonelle fremstillingen av somatiske embryoer, ved beskrivelsen av en levedyktighetstest og ved tabell 1 som gir sammensetningen av det foretrukne dyrknings-mediet som blir anvendt.
Eksempel på fremstilling av somatiske embryoer
En udifferensiert cellekultur av gulrotceller (Dausuc carota L. ) blir subdyrket hver 12 dag (1 g biomasse til 100 ml medium) i et Murashige og Skoog-væskedyrkingsmedium som inneholder 20 g/l sukrose og 0,1 mg/l 2,4-diklorfenoksyeddiksyre.
All behandling ble gjennomført under aseptiske forhold under en laminær strømbeskyttelse. Suspensjonen blir plassert på en rører som lager en eksentrisk gyratorisk bevegelse på 100 rpm og blir dyrket ved 23 °C under 200 lux belysning med en lysperiode på 16 timer.
Etter dyrking i 8 til 10 dager blir cellesuspensjonen filtrert slik at bare celleaggregatene mellom 50 og 200 pm størrelser blir beholdt. Disse små aggregatene representerer et proembryonisk trinn til embryoene som vil fortsette utviklingen til hjerte-, torpedo- og kimplantetrinnet. Aggregatene blir vasket og plassert i et Murashige og Skoog-medium som ikke inneholder noe 2,4-diklorfenoksyeddiksyre i en mengde på tilnærmet 1,5 x 10^ aggregater pr. ml medium. Etter dyrking i 10 dager har embryoene blitt dannet. Suspensjonen blir filtrert slik at bare embryoer mellom 150 og 1000 pm i størrelse blir beholdt.
Levedyktighetstest
En rask og enkel levedyktighetstest er utviklet for å vurdere levedyktigheten til embryoene etter frysing.
Blant de forskjellige kriteriene som kan bli anvendt for å evaluere levedyktigheten til embryoene,
økning i størrelsen på embryoene og
fremkomst av en klorofyll isk farging
er særlig passende.
Disse kriteriene kan bli evaluert på forskjellige måter, f.eks. ved visuell telling eller ved biokjemiske tester (fargingstester f.eks.).
Under prinsippene til denne testen blir embryoene plassert i et typisk væske- eller halv-faststoffdyrkingsmedium. Etter dyrking i 10 dager blir antall embryoer som har øket i størrelse og viser tegn på klorofyllisk farging registrert. Forholdet mellom dette tallet og samlet antall embryoer som er tilstede muliggjør at levedyktigheten til embryoene kan bli bestemt.
Embryoene kan deretter bli bevart på samme væskemedium eller kan bli plassert på et faststoffdyrkingsmedium som har tilsvarende sammensetning som det foregående væskemedium slik at de kan fortsette deres utvikling til kimplantetrinnet. Etter dyrking i 10 dager på dette mediet, blir omdannings-nivået bestemt som forholdet mellom antall embryoer som har utviklet seg til kimplantetrinnet og samlet antall embryoer.
Eksempel 1
Somatiske gulrotembryoer på torpedotrinnet (gjennomsnittlig størrelse 670 pm) oppnådd som beskrevet over, blir vasket med et flytende Murashige og Skoog-dyrkingsmedium. Embryoene blir deretter plassert på dyrkingsplater som består av 6 kopper i en mengde på 20/30 embryoer pr. kopp og deretter fjernet for spor av resterende dyrkingsmedium ved borttaking av væsken med en pipette.
To grupper (A) og (B) med embryoer blir tildekket med et lag flytende parafinolje sterilisert på forhånd ved autoklavering i 20 minutter ved 115°C. 1 ml olje blir deretter tilsatt 5 til 8 embryoer. To kontrollgrupper (C) og (D) med embryoer blir tildekket med det flytende dyrkingsmediet.
Dyrkingsplaten blir deretter tildekket og hermetisk for-seglet. En første gruppe (A) med embryoer under hypoxi i olje blir plassert i et kammer avkjølt til 4°C. Til sammenligning blir en annen gruppe (B) med embryoer under hypoxi i olje bevart ved 23°C. En første kontrollgruppe (C) med embryoer som ikke er under hypoxi blir lagret ved 4°C mens en annen kontrollgruppe (D) blir lagret ved 23°C.
De forskjellige gruppene blir lagret under lys på 200 lux.
Etter en viss lagringstid blir embryoene oppvarmet på nytt til omgivelsestemperatur og et flytende medium blir injisert under laget med olje som omgir embryoene under hypoxi for å overføre så mange embryoer som mulig til dyrkingsmediet.
Etter eliminering av oljelaget blir embryoene vasket i flere etterfølgende bad med dyrkingmedium for å eliminere hvert spor av resterende olje.
Utviklingen av størrelse på embryoene under lagringsperioden ble observert ved måling av deres størrelse med et binokulaert forstørrelsesglass utstyrt med et måleøyestykke.
De følgende resultatene er oppnådd:
Størrelse på embryoer (pm)
Man kan se at embryoene som er lagret ved 23°C vokser raskere uavhenig om de er under hypoxi eller ikke. Etter 14 dager har de mer enn tredoblet seg i størrelse, mens embryoene som er lagret ved 4°C så vidt har vokst. Etter 105 dager er embryoene som er lagret ved 4°C under hypoxi i olje fremdeles relativt små i størrrelse, men kontrollembryoene lagret ved 4°C i dyrkingsmedium har fortsatt å vokse.
På samme tid kan man se at lagring under hypoxi i olje ved 4°C influerer på levedyktigheten til embryoene.
Embryoene blir frigjort fra oljelaget og oppvarmet på nytt til omgivelsestemperatur og dyrket i Murashige og Skoog-vaeskedyrkingsmedium.
Levedyktigheten til embryoene blir evaluert ved gjenopptakelse eller fortsettelse av deres vekst i flytende medium.
Etter dyrking i 10 dager blir levedyktighetsnivået til embryoene bestemt.
De følgende resultatene blir oppnådd:
Levedyktighetsnivå:
(uttrykt i 5t av vekstgjenopptakelse)
Embryoene som blir lagret under hypoxi i olje ved 4°C har et riktig levedyktighetsnivå etter lagring i 105 dager, mens embryoene som blir lagret under hypoxi ved 23"C lever ikke lenger etter en lagringstid på 35 dager.
Kontrollembryoene lagret ved 4°C viser også god levedyktighet etter 105 dager, men blir deretter for store (tilnærmet 3300 pm) for å tillate mulig lagring ved innkapsling i en polymer.
Etter dyrking i 20 dager i væskemediet, blir antall embryoer som har utviklet en normal kimplante bestemt.
De følgende resultatene ble oppnådd:
Omdanningsnivå (uttrykt i it av kimplanter dyrket)
Embryoene lagret ved 4"C under hypoxi i olje fortsetter å vokse uten fremkomst av ytterligere proliferering på eksakt samme måte som kontrollembryoene.
Delvis hemming av veksten til de somatiske embryoene ved å beholde dem under hypoxi i olje ved i' C synes ikke å påvirke levedyktigheten til embryoene eller deres evne til å gjenoppta vekst.
Eksempel 2
Somatiske gulrotembryoer (gjennomsnittlig størrelse 460 pm) blir lagret ved 4°C ved metoden beskrevet i eksempel 1. Embryoene blir delvis lagret i mørke, og til sammenligning delvis i lys med 200 lux.
Utvikling av størrelse på embryoene under lagringsperioden blir observert.
Følgende resultater blir oppnådd:
Størrelse på embryoer (pm)
Man kan se at embryoer som er beholdt under hypoxi i olje har så vidt utviklet seg i størrelse, enten de er lagret i lys eller i mørke.
Eksponering til lys under lagring av embryoene synes ikke å påvirke deres levedyktighet. Fravær av lys har ingen effekt på graden av hemming indusert ved kombinasjonen av hypoxi i olje og en lav temperatur.
Eksempel 3
Somatiske embryoer fra kaffetreet, Coffea arabica, på det utviklede torpedotrinnet (gjennomsnittlig størrelse 1590 pm) blir vasket og plassert på dyrkingsplater ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1.
Tre grupper (A), (B) og (C) med embryoer blir tildekket med et lag sterilisert flytende parafinolje i en mengde på tilnærmet 1 ml olje til 5 til 8 embryoer. Tre kontrollgrupper med embryoer blir tildekket med et Murashige og Skoog-væskemedium.
En gruppe (A) embryoer under hypoxi i olje blir lagret ved 4°C, en annen gruppe (B) ved 10°C og en tredje gruppe (C) ved 15° C. En første kontrollgruppe blir lagret ved 4°C, en andre ved 10°C og en tredje ved 15°C.
Gruppene blir holdt i mørke i en måned og blir deretter returnert til omgivelsestemperatur. Embryoene blir vasket ved metoden beskrevet i eksempel 1 og deretter dyrket på et Murashige og Skoog-halvfaststoffmedium.
Etter dyrking i 10 dager blir levedyktighetsnivået til embryoene bestemt.
De følgende resultatene blir oppnådd:
Levedyktighetsnivå vekst gjenopptakelse)
Man kan se at embryoene lagret ved 4°C eller 10°C blir brune og dør om de enten er under hypoxi i olje eller i et flytende dyrkingsmedium.
Kaffetreembryoene holdt seg godt ved en temperatur på 15°C.
Det er således viktig å ta i betraktning kuldesensitivitetsterskelen til de aktuelle artene når hensikten er bestemmelse av minimum lagringstemperatur.
Eksempel 4
Somatiske kaffetreembryoer ved det utviklede torpedotrinn (gjennomsnittlig størrelse 1590 pm) blir lagret ved 15°C under hypoxi i olje ved metoden beskrevet i eksempel 1.
Etter lagring i 1 eller 2 måneder blir embryoene oppvarmet på nytt til omgivelsestemperatur og vasket.
Utviklingen i størrelse på embryoene i løpet av lagringsperioden blir observert.
De følgende resultatene blir oppnådd:
Størrelse på embryoer (pm)
Man kan se at embryoene under hypoxi i olje vokser mye langsommere enn kontrollembryoene.
Levedyktigheten til embryoene blir bestemt etter dyrking i 10 dager på halv-f aststof fmedium. Den er 70$ for embryoene lagret i 2 måneder under hypoxi i olje og 84£ for kontrollembryoene lagret i 2 måneder i flytende dyrkingsmedium. Tildekking av embryoene med et lag olje muliggjør således at deres vekst er effektivt hemmet uten alvorlig påvirkning av deres levedyktighet.
Eksempel 5
Somatiske kaffetreembryoer ved det utviklede hjertetrinnet (gjennomsnittlig størrelse 1100 pm) eller på torpedotrinnet (gjennomsnittlig størrelse 1320 pm) blir lagret i mørke ved 15°C i 1 måned enten under hypoxi i parafinolje eller i et flytende dyrkingsmedium ved metoden beskrevet i eksempel 1.
Etter lagring blir embryoene oppvarmet på nytt til omgivelsestemperatur og vasket. Utviklingen av størrelse på embryoene i løpet av lagringsperioden blir observert.
De følgende resultatene blir oppnådd:
Størrelse på embryoer (pm)
Som i eksempel 4 kan men se at embryoene under hypoxi i olje vokser langsommere enn kontrollembryoene.
Embryoene blir dyrket i 10 dager på et Murashige og Skoog-halv-faststoffmedium, og etter dette blir levedyktighetsnivået bestemt.
De følgende resultatene blir oppnådd:
Claims (8)
1.
Fremgangsmåte for konservering av planteembryoer, karakterisert ved at embryoene blir holdt under hypoxi ved tildekking med et lag olje og deretter avkjølt og lagret ved en temperatur over kuldesensitivitetsterskelen til de aktuelle embryoene.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at embryoene er somatiske embryoer.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at oljen som opprettholder hypoxi er en mineralolje, en olje av vegetabilsk opprinnelse eller en syntetisk olje.
4.
Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at oljen som opprettholder hypoxi er en flytende parafinolje.
5.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at embryoene under hypoxi i oljen blir lagret ved en temperatur fra 1 til 10°C over kuldesensitivitetsterskelen til de aktuelle embryoene.
6.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at embryoene blir lagret i mørke.
7.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at embryoene er somatiske gulrotembryoer og blir lagret ved en temperatur fra 2 til 8°C.
8.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at embryoene er somatiske kaffetreembryoer og blir lagret ved en temperatur fra 12 til 20°C.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8909639A FR2649860A1 (fr) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | Procede de conservation d'embryons vegetaux |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO903138D0 NO903138D0 (no) | 1990-07-13 |
| NO903138L NO903138L (no) | 1991-01-21 |
| NO179352B true NO179352B (no) | 1996-06-17 |
| NO179352C NO179352C (no) | 1996-09-25 |
Family
ID=9383871
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO903138A NO179352C (no) | 1989-07-18 | 1990-07-13 | Fremgangsmåte for konservering av planteembryoer |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5138793A (no) |
| EP (1) | EP0408922B1 (no) |
| JP (1) | JPH03101601A (no) |
| AP (1) | AP158A (no) |
| AT (1) | ATE113072T1 (no) |
| AU (1) | AU629369B2 (no) |
| BR (1) | BR9003442A (no) |
| CA (1) | CA2020572C (no) |
| DE (1) | DE69013423T2 (no) |
| DK (1) | DK0408922T3 (no) |
| ES (1) | ES2064534T3 (no) |
| FI (1) | FI96375C (no) |
| FR (1) | FR2649860A1 (no) |
| IE (1) | IE65060B1 (no) |
| MX (1) | MX171281B (no) |
| MY (1) | MY105818A (no) |
| NO (1) | NO179352C (no) |
| NZ (1) | NZ234524A (no) |
| OA (1) | OA09218A (no) |
| PT (1) | PT94720B (no) |
| ZA (1) | ZA905204B (no) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE202261T1 (de) * | 1991-12-19 | 2001-07-15 | Univ Saskatchewan | Desikkation von gymnosperm somatischen embryonen |
| US6340594B1 (en) | 1991-12-19 | 2002-01-22 | Cellfor, Inc. | Production of desiccation-tolerant gymnosperm embryos |
| NZ272210A (en) * | 1995-05-25 | 1997-10-24 | Carter Holt Harvey Ltd | Treatment of somatic embryos to provide viable embryos after storage periods |
| EP0816488A1 (fr) * | 1996-06-25 | 1998-01-07 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Procédé de conditionnement de tissus de végétaux cultivés in-vitro |
| JP4476442B2 (ja) * | 2000-06-20 | 2010-06-09 | アグリテクノ矢崎株式会社 | トルコギキョウのロゼット化による発育不良防止方法 |
| AU2002312458A1 (en) * | 2001-06-11 | 2002-12-23 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods for inducing reversible stasis |
| ES2546537T3 (es) | 2001-06-28 | 2015-09-24 | Morishita Jintan Co., Ltd. | Cápsulas que contienen células o tejidos vivos |
| EP2446741A4 (en) * | 2009-06-25 | 2014-08-06 | Morishita Jintan Co | PROCESS FOR STORING SEEDS |
| EP2725887A4 (en) * | 2011-06-29 | 2015-01-07 | Weyerhaeuser Nr Co | ARTIFICIAL SEED WITH AN EMBRYO IN IT |
| US20150191771A1 (en) * | 2014-01-09 | 2015-07-09 | Syngenta Participations Ag | Embryo sampling method |
| US9706723B2 (en) * | 2014-08-29 | 2017-07-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for creating doubled haploid maize embryos using oil matrices |
| US9078427B1 (en) * | 2014-08-29 | 2015-07-14 | Pioneer Hi Bred International Inc | Method of storing plant embryos |
| EP3186390B1 (en) | 2014-08-29 | 2019-03-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and devices involving oil matrices |
| US11111548B2 (en) * | 2014-08-29 | 2021-09-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Systems and methods for genotyping seed components |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2091534B (en) * | 1980-12-09 | 1984-06-27 | Boc Lit | Method of preservation |
| US4397681A (en) * | 1981-06-08 | 1983-08-09 | Fats And Proteins Research Foundation, Inc. | Foliar antitranspirant |
| US4583320A (en) * | 1982-10-12 | 1986-04-22 | Plant Genetics, Inc. | Delivery system for meristematic tissue |
| GB8323094D0 (en) * | 1983-08-26 | 1983-09-28 | Franks F | Preservation of cells |
| JPS6140708A (ja) * | 1984-07-31 | 1986-02-27 | ライオン株式会社 | 人工種子 |
| US4615141A (en) * | 1984-08-14 | 1986-10-07 | Purdue Research Foundation | Process for encapsulating asexual plant embryos |
| JPS62138107A (ja) * | 1985-12-10 | 1987-06-20 | フロイント産業株式会社 | 組成物およびその製造方法 |
| JPS62257320A (ja) * | 1986-04-28 | 1987-11-09 | 株式会社 日本グリンナ− | 穂発芽の予防、抑制法 |
| EP0397665A1 (en) * | 1987-12-18 | 1990-11-22 | University Of Florida | Quiescent plant somatic embryos and method for their production |
| ES2042673T3 (es) * | 1988-09-19 | 1993-12-16 | Nestle Sa | Procedimiento para la produccion de sustancias de origen vegetal. |
-
1989
- 1989-07-18 FR FR8909639A patent/FR2649860A1/fr active Granted
-
1990
- 1990-06-22 DE DE69013423T patent/DE69013423T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-06-22 DK DK90111821.6T patent/DK0408922T3/da active
- 1990-06-22 EP EP90111821A patent/EP0408922B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-22 AT AT90111821T patent/ATE113072T1/de active
- 1990-06-22 ES ES90111821T patent/ES2064534T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-25 US US07/543,475 patent/US5138793A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-27 FI FI903229A patent/FI96375C/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-06-27 IE IE232590A patent/IE65060B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-07-02 AU AU58674/90A patent/AU629369B2/en not_active Ceased
- 1990-07-03 ZA ZA905204A patent/ZA905204B/xx unknown
- 1990-07-06 CA CA002020572A patent/CA2020572C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-07-09 MX MX021506A patent/MX171281B/es unknown
- 1990-07-13 NO NO903138A patent/NO179352C/no not_active IP Right Cessation
- 1990-07-16 NZ NZ234524A patent/NZ234524A/xx unknown
- 1990-07-16 MY MYPI90001188A patent/MY105818A/en unknown
- 1990-07-16 AP APAP/P/1990/000193A patent/AP158A/en active
- 1990-07-17 PT PT94720A patent/PT94720B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-07-17 BR BR909003442A patent/BR9003442A/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-07-17 JP JP2189262A patent/JPH03101601A/ja active Pending
- 1990-07-18 OA OA59819A patent/OA09218A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2649860B1 (no) | 1994-08-19 |
| CA2020572C (en) | 2000-03-28 |
| IE902325A1 (en) | 1991-06-19 |
| ZA905204B (en) | 1991-04-24 |
| NO903138D0 (no) | 1990-07-13 |
| NZ234524A (en) | 1991-10-25 |
| ES2064534T3 (es) | 1995-02-01 |
| ATE113072T1 (de) | 1994-11-15 |
| AU629369B2 (en) | 1992-10-01 |
| FI903229A0 (fi) | 1990-06-27 |
| JPH03101601A (ja) | 1991-04-26 |
| EP0408922A1 (fr) | 1991-01-23 |
| DE69013423D1 (de) | 1994-11-24 |
| BR9003442A (pt) | 1991-08-27 |
| AP158A (en) | 1991-11-15 |
| EP0408922B1 (fr) | 1994-10-19 |
| IE65060B1 (en) | 1995-10-04 |
| PT94720A (pt) | 1991-03-20 |
| CA2020572A1 (en) | 1991-01-19 |
| AU5867490A (en) | 1991-01-24 |
| FI96375C (fi) | 1996-06-25 |
| MY105818A (en) | 1995-01-30 |
| MX171281B (es) | 1993-10-15 |
| FI96375B (fi) | 1996-03-15 |
| FR2649860A1 (fr) | 1991-01-25 |
| US5138793A (en) | 1992-08-18 |
| NO903138L (no) | 1991-01-21 |
| OA09218A (en) | 1992-06-30 |
| PT94720B (pt) | 1997-07-31 |
| NO179352C (no) | 1996-09-25 |
| DE69013423T2 (de) | 1995-02-23 |
| AP9000193A0 (en) | 1990-07-31 |
| DK0408922T3 (da) | 1995-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO179352B (no) | Fremgangsmåte for konservering av planteembryoer | |
| Castro et al. | Development of a germination protocol for blueberry seeds (Vaccinium meridionale Swartz) | |
| Popova et al. | The effect of seed cryopreservation on the development of protocorms by the hybrid orchid Bratonia | |
| KR100868523B1 (ko) | 새우난속 식물의 기내 무균발아를 통한 증식방법 | |
| Ayenew et al. | Efficient use of temporary immersion bioreactor (TIB) on pineapple (Ananas comosus L.) multiplication and rooting ability | |
| US7229828B2 (en) | Sugar cane production | |
| BR102013007727A2 (pt) | Método para obtenção de propágulos vegetais para micropropagação de cana-de-açucar, para produção de semente sintética de cana-de-açucar, para armazenamento de semente sintética, para produção de mudas, propágulos viavéis, e, semente sintética de cana-de-açucar | |
| Haynes | Potato embryo culture | |
| Van Sambeek et al. | In vitro establishment of tissues from adult black walnut | |
| CN111820118B (zh) | 一种透明原位三维植物栽培装置及其在植物根系观测中的应用 | |
| Lazzeri et al. | In vitro regeneration from seedling organs of Brassica oleracea var. italica Plenck cv. Green Comet II. Effect of light conditions and explant size | |
| Urbaniec-Kiepura et al. | Effect of pre-storage on Lilium martagon L. seed longevity following cryopreservation | |
| US7950183B2 (en) | Methods of producing a synchronized population of conifer somatic embryo germinants | |
| JPS6371121A (ja) | 組織培養によるナガイモムカゴの大量生産法 | |
| Karun et al. | Short-term storage of coconut zygotic embryos in sterile water | |
| JP2001095381A (ja) | ササユリ等地下発芽性ユリ属植物の早期苗生産方法 | |
| Quin-Yuan et al. | Germination of Azolla filiculoides Lam. sporocarps and factors affecting their growth | |
| Hiraoka | Nonfrozen storage of plant cell cultures and its effect on metabolites | |
| NO179271B (no) | Fremgangsmåte for lagring av vegetabilske embryoer | |
| Nicolae et al. | Research on the use of synthetic seed in conservation of Kalanchoe blossfeldiana. | |
| Jitsopakul et al. | Cryopreservation of Orchid Pollinia Using the V Cryo-Plate Method | |
| Paz | Rhizome manipulation affects growth and development of ornamental gingers | |
| Szendrak et al. | In vitro propagation and anatomical studies of temperate orchid species (Orchidaceae) | |
| Tsui | Studies to aid peanut breeding techniques | |
| Ayenew et al. | EFFICIENT USE OF TEMPORARY IMMERSION BIOREACTOR (TIB) ON |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |
Free format text: LAPSED IN JANUARY 2001 |