DE69012999T2 - Schutz zytolytischer aktivität von nk-zellen in peripheren blut-mononuklearzellen. - Google Patents
Schutz zytolytischer aktivität von nk-zellen in peripheren blut-mononuklearzellen.Info
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Description
- Natürliche Killerzellen (NK) und Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK) sind mit der Immunüberwachung gegen Tumorzellen und eine Allopfropfabstoßung in Zusammenhang gebracht worden (T. Barlozzari, C.W. Reynolds und R.B. Herberman, J. Immunol., 131, 1024, 1983; A.A. Rayner, E.A. Grimm, M.T. Lotze, E.W. Chu und S.A. Rosenberg, Cancer, 55, 1327, 1985). Diese Effektorzellen spielen ferner eine Rolle bei der Steuerung von Immunantworten (R.B. Herberman und J.R. Ortaldo, Science, 214, 24, 1981) und der Kontrolle viraler und bakterieller Infektionen (R.M. Natuk und R.M. Welsh, J. Immunol., 138, 877, 1987; Weinhold et al., Lancet, April 23, 902-904 (1988). Es ist daher von möglicher Bedeutung, in der Lage zu sein, funktionelle NK-Zellen für die adoptive Transfer-Immuntherapie in Menschen herzustellen.
- Es wurde gezeigt, daß Monozyten die Aktivierung der LAK-Aktivität durch IL-2 stören. Von L-Leucinmethylester (LME) und L- Phenylalaninmethylester (PME) wurde gezeigt, daß sie Monozyten aus mononukleären Zellen aus menschlichem, peripherem Blut (PBMC) entfernen. Von LME ist ferner gezeigt worden, daß es die NK-Aktivität und NK-Zellen abreichert (M. Hoyer, T. Meineke, W. Lewis, B. Zwilling und J. Rinehart, Cancer Res., 46, 2834, 1986; D.L. Thiele und P.E. Lipsky, J. Immunol., 134, 786, 1985; Lipsky und Thiele, US-Patent 4 752 602).
- Um LAK-Zellen in hoher Zelldichte zu erzeugen, sind ferner Monozyten durch ihre Haftung an Nylonwolle-Säulen oder Zentrifugalanschlämmung entfernt worden. Diese Verfahren zur Monozytenentfernung sind jedoch mühsam und kompliziert Einige LAK-Zellvorläufer können auch an den Nylonwolle-Säulen haften. Wir haben deshalb PME in einer Konzentration von etwa 1 bis 5 mM als einzigen Schritt zur Monozytenabreicherung eingesetzt. Wir waren in der Lage, LAK aus PME-behandelten Zellen zu erzeugen. Wir haben gezeigt, daß die Monozytenabreicherung durch PME die Erzeugung von LAK-Zellen durch rIL-2 in einer Zelldichte von 5 x 10&sup6;/ml oder höher erlaubt (Leung, K.H., Lymphokine Research, 6, Abstract #1718, 1987; europäische Patentanmeldung 87 107 755.8, veröffentlicht am 2. Dezember 1987, und die erteilte US-Anmeldung 07/038361, angemeldet am 20. April 1987).
- Die Monozytenabreicherung durch PME verminderte ebenso wie LME die NK-Aktivität der Zellen. Während die Hemmung der NK-Aktivität durch LME irreversibel war, erholte sich jedoch die NK- Aktivität innerhalb 18 h durch Inkubation der Zellen in mit FCS oder IL-2 ergänzten Medium bei 37ºC. Dieser Erholungsvorgang kann jedoch zur Infusion in einen Patienten unter einer Therapievorschrift zum adoptiven Transfer nicht annehmbar sein. Wir haben deshalb die Entfernung von Monozyten mittels Aminosäureniederalkylestern in Anwesenheit anderer Aminosäureanaloge untersucht, um festzustellen, ob diese Analoge die NK-Zellaktivität vor der Hemmung durch die Aminosäureniederalkylester schützen können.
- Wir haben entdeckt, daß drei Aminosäureanaloge - Phenylalaninol (PheOH), Benzamidin und Leucinol (LeuOH) - den Verlust der NK- Aktivität in mit LME oder PME behandelten PBMC hemmen. PheOH und Benzamidin störten die Monozytenabreicherung durch PME oder LME nicht, wogegen LeuOH sowohl die Monozytenabreicherung als auch die NK-Abreicherung durch PME und LME hemmte. Wir haben ferner entdeckt, daß bei PBMC, die mit LME oder PME und pheOH, LeuOH oder Benzamidin behandelt worden sind, eine LAK-Aktivität erzeugt werden kann. Es war überraschend, daß ein hoher Wert der LAK-Aktivität in PBMC erzeugt werden konnte, die mit LME oder PME und LeuOH behandelt wurden, da LeuOH die Monozytenabreicherung sowohl durch LME als auch PME verhinderte.
- Es wird erwartet, daß diese Befunde gleichermaßen auf Ester und Amide anderer Aminosäuren und Dipeptide anwendbar sind, von denen bekannt ist, daß sie Monozyten aus PBMC reversibel oder irreversibel abreichern. Die Aminosäureanaloge können zum Schützen gegen einen Verlust der NK-Aktivität nicht nur bei PBMC sondern auch in daraus stammenden Lymphozyten aus peripherem Blut (PBL), z.B. durch Behandlung von PBMC mit Nylonwolle oder Zentrifugalanschlämmung unter Abreichern von Monozyten verwendet werden.
- Somit ist ein Aspekt unserer Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen einer LAK-Zellaktivität in mononukleären, peripheren Blutzellen (PBMC) oder daraus stammenden peripheren Blutlymphozyten (PBL), während die natürliche Killerzellaktivität (NK) erhalten wird, welches
- (a) das Behandeln der PBMC oder PBL mit
- (i) einem Niederalkylester einer Aminosäure oder eines Dipeptids, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Leucin, Alanin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glutamin, Phenylalanin, Prolin, Tyrosin, Tryptophan, Valin und Dipeptiden besteht, die aus Resten einer oder zwei der Aminosäuren zusammengesetzt sind, oder einem Amid einer Aminosäure, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Leucin, Isoleucin, Phenylalanin und Valin besteht, oder einem pharmazeutisch geeigneten Salz des Esters oder Amids und
- (ii) einem Mitglied der aus Benzamidin, Phenylalaninol und Leucinol bestehenden Gruppe und anschließend
- (b) das Kultivieren der Zellen in einem Wachstumsmedium, das Interleukin 2 enthält, unter Erzeugen von LAK-Zellen umfaßt, die für NK-resistente Tumorzellen zytotoxisch sind.
- In einem weiteren Aspekt ist diese Erfindung ein Verfahren zum Abreichern von Monozyten aus mononukleären, peripheren Blutzellen (PBMC), während die natürliche Killerzellaktivität (NK) in den Zellen erhalten wird, welches das Behandeln der PBMC mit
- (a) einem Niederalkylester einer wie vorstehend definierten Aminosäure oder eines Dipeptids oder einem Amid einer Aminosäure oder einem pharmazeutisch geeigneten Salz des Esters oder Amids und
- (b) einem Mitglied der aus Benzamidin und Phenylalaninol bestehenden Gruppe umfaßt.
- In einem weiteren Aspekt ist die Erfindung ein Verfahren zum Hemmen der Monozytenabreicherung und des Verlustes der NK-Aktivität beim Behandeln von PBMC mit einem Niederalkylester einer vorstehend definierten Aminosäure oder eines Dipeptids oder einem Amid einer Aminosäure oder einem pharmazeutisch geeigneten Salz des Esters oder Amids, welches das gleichzeitige Behandeln der Zellen mit Leucinol umfaßt.
- Die drei in dieser Erfindung verwendeten Aminosäureanaloge werden durch die folgenden Strukturformeln dargestellt: Leucinol Phenylalaninol Benzamidin
- Wie vorstehend erwähnt offenbaren die europäische Patentanmeldung 87 107 755.8, veröffentlicht am 2. Dezember 1987, und die entsprechende erteilte US-Anmeldung 07/038361, angemeldet am 20. April 1987, die Behandlung von PBMC oder PBL mit Niederalkylestern gewisser Aminosäuren unter Verstärken der LAK-Aktivierung. Die in dieser Erfindung zur Behandlung von PBMC und zur LAK-Aktivierung verwendeten Bedingungen sind dieselben wie in der europäischen Patentanmeldungen 87 107 755.8 und der US-Anmeldung 07/038361 beschriebenen, deren Offenbarungen hierin eingeschlossen sind. PBMC zur Verwendung in der Erfindung können durch eine in den vorstehenden Anmeldungen beschriebene Ficoll- Hypaque-Dichtegradiententrennung oder ohne Ficoll-Hypaque-Trennung, wie in der 4 808 151, erteilt am 28. Februar 1989, beschrieben, deren Offenbarung hierin inbegriffen ist, erhalten werden. Die PBMC werden gewaschen, gegebenenfalls durch in den inbegriffenen Anmeldungen beschriebene, herkömmliche Techniken zum Abreichern von Monozyten behandelt und in einem geeigneten Medium bei einer Konzentration im Bereich von etwa 1 x 10&sup6; bis 2 x 10&sup7; Zellen je ml suspendiert.
- Die PBMC oder daraus folgenden PBL werden anschließend mit dem Aminosäureester oder Amid bei einer Konzentration im Bereich von etwa 1 mM bis 5 mM und mit Benzamidin, PheOH oder LeuOH in einer Konzentration in ungefähr demselben Bereich behandelt. Die Konzentrationen beruhen auf dem Gesamtvolumen der PBMC-Suspension und der Lösung des Esters oder Amids und des Analogen. Das Zusammenbringen wird bei Umgebungstemperatur, vorzugsweise 20- 25ºC, während eines Zeitraums von wenigstens 15 Minuten, vorzugsweise etwa 20-40 Minuten durchgeführt.
- Die in dieser Erfindung verwendeten Ester können nicht nur die in den inbegriffenen Anmeldungen sein, welche die NK-Aktivität reversibel hemmen, sondern auch Ester von Aminosäuren und Dipeptiden, wie etwa LME und Leucyl-leucinmethylester (LLME), welche die NK-Aktivität irreversibel hemmen. Die Dipeptide werden bei Lipsky und Thiele, US-Patent 4 752 602, offenbart, deren Offenbarung hierin ebenfalls inbegriffen ist. Pharmazeutisch annehmbare Salze der Ester und Amide können ebenfalls verwendet werden; bevorzugte Salze sind die Chlorwasserstoff- und Bromwasserstoffsalze.
- Die PBMC- oder PBL-Suspension wird anschließend während eines Inkubationszeitraums von etwa 2 bis 7 Tagen bei 35 bis 39ºC, vorzugsweise 37ºC, in Anwesenheit von etwa 4-7% CO&sub2; kultiviert.
- Das Kultivieren wird bei einer Zellkonzentration im Bereich von etwa 1 x 10&sup6; bis 2 x 10&sup7;, vorzugsweise 5 x 10&sup6; bis 1 x 10&sup7; Zellen je ml, in IL-2-haltigem Medium bei einer Konzentration von etwa 150 bis 1500 pM, vorzugsweise 1000-2000 pM durchgeführt. Das Kultivieren kann in herkömmlichen Behältern wie etwa T-Kolben ausgeführt werden, wird aber vorzugsweise in geschlossenen, gasdurchlässigen, sterilen Beuteln wie etwa Du Ponts SteriCell Zellkulturbeuteln ausgeführt. Das Kultivieren unter diesen Bedingungen erzeugt LAK-Zellen, eine Population von Zellen, die zum Lysieren von Tumorzellen in der Lage sind, welche gegen eine Lysis durch NK-Zellen resistent sind.
- Durch diese Erfindung hergestellte LAK-Zellen werden auf die in den inbegriffenen Anmeldungen 87 107 755.8 und die US-Anmeldung 07/038361 beschriebene Weise bei der adoptiven Immuntherapie verwendet.
- In den Beispielen, die folgen, wurde ein &sup5;¹Cr-Freisetzungstest über 4 h zum Messen der Zytotoxizität von LAK-Zellen für Tumorzellen verwendet. Tumorzellen wurden 1 h bei 37ºC in einer Konzentration von etwa 2 x 10&sup6; bis 10 x 10&sup6; mit 50 uCi Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; in 0,4 ml Tris-phosphatgepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Die Zellen werden 4 Mal mit 5% oder 10% fetales Kälberserum (FCS) enthaltendem RPMI 1640 gewaschen und in cRPMI-20% FCS oder RPMI 10% FCS zu 10&sup5; Zellen/ml erneut suspendiert. Die Effektorzellen (LAK-Zellen) werden in verschiedenen Konzentrationen suspendiert und 0,1 ml wird Näpfchen in Rundboden-Mikroliterplatten zugesetzt. Die &sup5;¹Cr-markierten Zielzellen (0,1 ml) werden allen Näpfchen zugesetzt und die Platten werden 5 Minuten bei 200 x g zentrifugiert. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37ºC werden die Platten erneut zentrifugiert und 0,1 ml des sich daraus ergebenden Überstands wird jedem Näpfchen entnommen und in einem Gammazähler gezählt. Die prozentuale Zytotoxizität wird aus der folgenden Formel berechnet:
- % Zytotoxizität = cm experimental - cpm spontan/cpm insgesamt - cpm spontan x 100
- Jede Variable wird dreifach getestet und die sich daraus ergebenden Daten werden als % Zytotoxizität oder Lysis ausgedrückt. Dieser Zytotoxizitätstest wird in "Selected Methods in Cellular Immunology", Mishell und Shiigi, Hrsg., 124-137, W.H. Freeman and Co., San Francisco (1980), weiter beschrieben.
- Wir haben die Wirkung von PheOH und Benzamidin auf die Monozytenabreicherung, NK-Aktivität und LAK-Aktivierung durch IL-2 von mit PME behandelten PBMC untersucht. PBMC wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit von PheOH und Benzamidin mit 5 mM PME behandelt. Die PME-behandelten PBMC wurden durch Giemsa-Anfärbung auf die % Monozyten und die NK-Aktivität gegenüber K562-Zielzellen analysiert und wurden anschließend zu 1 x 10&sup7;/ml mit rIL-2 enthaltenden Medien 3-4 Tage kultiviert. Die LAK-Zellaktivität wurde anschließend gegen &sup5;¹Cr-markierte Raji-Zielzellen gemessen.
- Die experimentellen Ergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt. PME allein reichert Monozyten von 50% auf 3% ab. PheOH und Benzamidin hatten wenig Wirkung auf die Monozytenabreicherung durch sie selbst und sie störten die Monozytenabreicherung durch PME nicht. Wie jedoch in Tabelle 1 dargestellt wird, verhinderten sowohl PheOH als auch Benzamidin die Hemmung der durch die PME-Behandlung von PBMC induzierte NK-Aktivität. Weiter störte auch die Anwesenheit von PheOH oder Benzamidin die LAK- Aktivierung durch IL-2 bei hoher Zelldichte nicht, welche durch die PME-Behandlung verstärkt wird. TABELLE 1 Wirkung von PheOH und Benzamidin in Kombination mit PME auf die Monozytenabreicherung, NK-Aktivität und LAK-Aktivierung [PheOH], mM [Benzamidin], mM % Monozyten % Lysis, NK-Aktivität (Tag 0) (E:T-Verhältnis, 20:1 gegen K562)
- PBMC wurde mit 5 mM PME oder 5 mM LME in Anwesenheit oder Abwesenheit von 5 mM LeuOH oder PheOH behandelt. Die Wirkung dieser Behandlung der PBMC auf die % Monozyten, die NK-Aktivität gegenüber K562-Zielzellen und die LAK-Aktivität gegen Raji- Zielzellen auf 3 Tage Kultur in Anwesenheit von IL-2 folgend werden in Tabelle 2 dargestellt. PME oder LME waren in der Lage, Monozyten abzureichern. LeuOH war in der Lage, die Monozytenabreicherung durch PME oder LME zu verhindern. Auf der anderen Seite verhinderte PheOH nicht die Monozytenabreicherung durch PME oder LME. PME hatte wenig Wirkung auf die großen, granulären Lymphozyten (LGL), wie durch die fluoreszenzaktivierte Zellsortierungsanalyse (FACS) gemessen wurde, hemmte aber die NK- Aktivität gegenüber K562. Auf der anderen Seite reicherte LME die LGL und NK-Aktivität ab. LeuOH verhinderte die Hemmwirkungen von LME auf die LGL und NK-Aktivität. PheOH konnte die Hemmwirkungen auf die NK-Aktivität durch PME verhindern, verhinderte die Hemmwirkungen auf die NK-Aktivität durch LME aber nur teilweise. LeuOH und PheOH hatten eine geringe nachteilige Wirkung auf die verstärkte LAK-Aktivierung durch PME. Weiter kehrten LeuOH und PheOH die Hemmwirkung von LME auf die LAK-Aktivierung um. TABELLE 2 Schutzwirkung von PheOH und LeuOH NK-Aktivität % Leu Aktivität Kontrolle PME/LeuOH LME/LeuOH
- (a) Der Monozytengehalt wurde durch FACS mittels LeuM3-Antikörper gegen Monozyten bestimmt.
- (b) NK-Zellen wurden durch FACS mittel Leu19-Antikörper gegen NK-Zellen abgeschätzt.
- (c) Die NK-Aktivität wurde am Tag 0 mittels K562-Zielen bei einem E:T-Verhältnis von 50:1 bestimmt. Die Zahlen sind % Lysis.
- (d) Die LAK-Aktivität wurde bei einem E:T-Verhältnis von 20:1 gegen Raji-Zielzellen abgeschätzt, nachdem die Zellen 3 Tage mit 10 E/ml rIL-2 bei 1 x 10&sup7; Zellen/ml inkubiert wurden. Die Zahlen sind % Lysis.
Claims (32)
1. Verfahren zum Erzeugen einer LAK-Zellaktivität in
mononukleären, peripheren Blutzellen (PBMC) oder davon stammenden
peripheren Blutlymphozyten (PBL), während die natürliche
Killerzellaktivität (NK) beibehalten wird, welches
(a) das Behandeln der PBMC oder PBL mit
(i) einem Niederalkylester einer Aminosäure oder eines
Dipeptids, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus
Leucin, Alanin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure,
Glutamin, Phenylalanin, Prolin, Tyrosin, Tryptophan, Valin
und Dipeptiden besteht, die aus Resten einer oder zwei der
Aminosäuren zusammengesetzt sind, oder einem Amid einer
Aminosäure, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus
Leucin, Isoleucin, Phenylalanin und Valin besteht, oder
einem pharmazeutisch geeigneten Salz des Esters oder Amids
und
(ii) einem Mitglied der aus Benzamidin, Phenylalaninol und
Leucinol bestehenden Gruppe und anschließend
(b) das Kultivieren der Zellen in einem Wachstumsmedium, das
Interleukin 2 enthält, unter Erzeugen von LAK-Zellen
umfaßt, die für NK-resistente Tumorzellen cytotoxisch sind.
2. Verfahren von Anspruch 1, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL in einer Konzentration im Bereich von etwa 1x10&sup6; bis
2x10&sup7; Zellen je ml mit dem Aminosäureester oder -amid in einer
Konzentration im Bereich von etwa 1 bis 10 mM und mit
Benzamidin, Phenylalaninol oder Leucinol in einer Konzentration im
Bereich von etwa 1 bis 5 mM behandelt werden.
3. Verfahren von Anspruch 2, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL mit Phenylalaninmethylester oder Phenylalaninamid
behandelt werden.
4. Verfahren von Anspruch 3, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL mit Phenylalaninol behandelt werden.
5. Verfahren von Anspruch 3, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL mit Leucinol behandelt werden.
6. Verfahren von Anspruch 3, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL mit Benzamidin behandelt werden.
7. Verfahren von Anspruch 2, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL mit Leucinmethylester oder Leucinamid behandelt werden.
8. Verfahren von Anspruch 7, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL mit Phenylalaninol behandelt werden.
9. Verfahren von Anspruch 7, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL mit Leucinol behandelt werden.
10. Verfahren von Anspruch 7, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL mit Benzamidin behandelt werden.
11. Verfahren zum Herstellen mononukleärer, peripherer
Blutzellen (PBMC) oder davon stammender peripherer Blutlymphozyten
(PBL) zur Verwendung beim Erzeugen von LAK-Zellen, während die
natürliche Killerzellaktivität (NK) in den Zellen beibehalten
wird, welches das Behandeln der PBMC oder PBL mit
(a) einem Niederalkylester einer Aminosäure oder eines
Dipeptids, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Leucin,
Alanin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glutamin,
Phenylalanin, Prolin, Tyrosin, Tryptophan, Valin und
Dipeptiden besteht, die aus Resten einer oder zwei der
Aninosäuren zusammengesetzt sind, oder einem Amid einer Aminosäure,
die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Leucin,
Isoleucin, Phenylalanin und Valin besteht, oder einem
pharmazeutisch
geeigneten Salz des Esters oder Amids und
(b) einem Mitglied der aus Benzamidin, Phenylalaninol und
Leucinol bestehenden Gruppe umfaßt.
12. Verfahren von Anspruch 11, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL in einer Konzentration im Bereich von etwa 1x10&sup6; bis
2x10&sup7; Zellen je ml mit dem Aminosäureester oder -amid in einer
Konzentration im Bereich von etwa 1 bis 5 mM und mit Benzamidin,
Phenylalaninol oder Leucinol in einer Konzentration im Bereich
von etwa 1 bis 5 mM behandelt werden.
13. Verfahren von Anspruch 12, wobei die PBMC oder PBL mit
Phenylalaninmethylester oder Phenylalaninamid behandelt werden.
14. Verfahren von Anspruch 13, wobei die PBMC oder PBL mit
Phenylalaninol behandelt werden.
15. Verfahren von Anspruch 13, wobei die PBMC oder PBL mit
Leucinol behandelt werden.
16. Verfahren von Anspruch 13, wobei die PBMC oder PBL mit
Benzamidin behandelt werden.
17. Verfahren von Anspruch 12, wobei die PBMC oder PBL mit
Leucinmethylester oder Leucinamid behandelt werden.
18. Verfahren von Anspruch 13, wobei die PBMC oder PBL mit
Phenylalaninol behandelt werden.
19. Verfahren von Anspruch 13, wobei die PBMC oder PBL mit
Leucinol behandelt werden.
20. Verfahren von Anspruch 13, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL mit Benzamidin behandelt werden.
21. Verfahren zum Abreichern von Monozyten aus mononukleären,
peripheren Blutzellen (PBMC), während die natürliche
Killerzellaktivität (NK) in den Zellen beibehalten wird, welches das
Behandeln der PBMC mit
(a) einem Niederalkylester einer Aminosäure oder eines
Dipeptids, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Leucin,
Alanin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glutamin,
Phenylalanin, Prolin, Tyrosin, Tryptophan, Valin und
Dipeptiden besteht, die aus Resten einer oder zwei der
Aminosäuren zusammengesetzt sind, oder einem Amid einer Aminosäure,
die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Leucin,
Isoleucin, Phenylalanin und Valin besteht, oder einem
pharmazeutisch geeigneten Salz des Esters oder Amids und
(b) einem Mitglied der aus Benzamidin, Phenylalaninol und
Leucinol bestehenden Gruppe umfaßt.
22. Verfahren von Anspruch 21, wobei die PBMC in einer
Konzentration im Bereich von etwa 1x10&sup6; bis 2x10&sup7; Zellen je ml mit dem
Aminosäureester oder -amid in einer Konzentration im Bereich von
etwa 1 bis 5 mM und mit Benzamidin, Phenylalaninol oder Leucinol
in einer Konzentration im Bereich von etwa 1 bis 5 mM behandelt
werden.
23. Verfahren von Anspruch 22, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL mit Phenylalaninmethylester oder Phenylalaninamid
behandelt werden.
24. Verfahren von Anspruch 23, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL mit Phenylalaninol behandelt werden.
25. Verfahren von Anspruch 23, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL mit Benzamidin behandelt werden.
26. Verfahren von Anspruch 22, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL mit Leucinmethylester oder Leucinamid behandelt werden.
27. Verfahren von Anspruch 26, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL mit Phenylalaninol behandelt werden.
28. Verfahren von Anspruch 26, wobei in Schritt (a) die PBMC
oder PBL mit Benzamidin behandelt werden.
29. Verfahren zum Hemmen der Monozytenabreicherung beim
Behandeln von PBMC mit einem Niederalkylester einer Aminosäure oder
eines Dipeptids, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus
Leucin, Alanin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure,
Glutamin, Phenylalanin, Prolin, Tyrosin, Tryptophan, Valin und
Dipeptiden besteht, die aus Resten einer oder zwei der
Aminosäuren zusammengesetzt sind, oder einem Amid einer Aminosäure, die
aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Leucin, Isoleucin,
Phenylalanin und Valin besteht, oder einem pharmazeutisch geeigneten
Salz des Esters oder Amids, welches das gleichzeitige Behandeln
der Zellen mit Leucinol umfaßt.
30. Verfahren von Anspruch 29, wobei die PBMC in einer
Konzentration im Bereich von etwa 1x10&sup6; bis 2x10&sup7; Zellen je ml mit
dem Aminosäureester oder -amid in einer Konzentration im Bereich
von etwa 1 bis 5 mM und mit Leucinol in einer Konzentration im
Bereich von etwa 1 bis 5 mM behandelt werden.
31. Verfahren von Anspruch 30, wobei die PBMC mit
Phenylalaninmethylester oder Phenylalaninamid und Leucinol behandelt werden.
32. Verfahren von Anspruch 30, wobei die PBMC mit
Phenylalanimethylester oder Leucinamid und Leucinol behandelt werden.
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