DE69002769T2

DE69002769T2 - Mittel zum nachweis einer fibrinolytischen wirkung.

Info

Publication number: DE69002769T2
Application number: DE90912800T
Authority: DE
Inventors: Johan Selmer; Niels Tromholt
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1989-08-18
Filing date: 1990-08-16
Publication date: 1993-12-02
Anticipated expiration: 2010-08-17
Also published as: ATE92770T1; AU6285990A; CZ404790A3; FI920669A0; CZ280904B6; NO920624D0; KR920703120A; IL95407A; JPH04507254A; US5165912A; DK0487594T3; CA2065147A1; ES2058931T3; NO920624L; AU639940B2; DE69002769D1; DD297064A5; EP0487594B1; EP0487594A1; IL95407A0

Description

ERFINDUNGSGEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft ein diagnostisches Reagenz zum Nachweis erhöhter Freisetzung eines fibrinolytischen Enzyms oder erhöhter fibrinolytischer Aktivität, sowie die Verwendung des Reagenz bei der Herstellung eines diagnostischen Reagenz zum Nachweis solch eines Enzyms oder einer Aktivität in vivo.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Entwicklung eines Thrombus ist ein hoch komplexer Prozeß. Kurz gesagt leitet das Anhaften von Blutplättchen an der Gefäßoberfläche die gesamte Gerinnungskaskade ein, was schließlich zur Aggregation von Blutplättchen führt, die mit Fibrin überzogen sind. Die andauernde Fibrinablagerung hört möglicherweise innerhalb von 24-48 Stunden vom Beginn des Prozesses an auf, wonach der Thrombus entweder organisiert, d.h. schließlich durch Fasergewebe ersetzt wird, das aus glatten Muskelzellen oder Fibroblasten besteht, oder Fibrinolyse stattfinden wird. Im letzteren Fall wird Gewebeplasminogenaktivator aus dem Endothel sekretiert, um sich an das Fibrin auf dem Thrombus zu binden, wo es die Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin katalysiert. Der Thrombus kann sich dann als ein Ergebnis der Fibrinolyse auflösen.
Mit der Entwicklung neuer thrombolytischer Mittel (wie etwa Gewebeplasminogenaktivator oder Streptokinase) werden schnelle, verläßliche Verfahren zur Diagnose von Thrombose benötigt weil diese Mittel am wirksamsten innerhalb von 4-6 Stunden von der Thrombusbildung an sind (TIMI-Studiengruppe, N. Engl. J. Med., 312, 1985, S. 932-936). Bisher sind biochemische Parameter nicht als irgendwie hilfreich bei der Lösung dieses Problems erschienen (G.E. Austin, Arch. Path. Lab. Med. 111, 1987, S. 1158-1162).
Szintigraphische Verfahren zur Diagnose von Thrombose sind vorgeschlagen worden. Anfänglich wurden die Reagenzien, die für die Diagnose entwickelt wurden, auf radioaktiv markierten Blutbestandteilen aufgebaut (z.B. Fibrinogen oder Blutplättchen) weil diese Blutbestandteilen in die Thromben während deren Bildung eingebaut werden [für eine Übersicht über diese Methoden siehe K.A. Krohn und L.C. Knight, "Radiopharmaceuticals for Thrombosis Detection: Selection, Preparation and Critical Evaluation", Seminars in Nuclear Medicine, Bd. VII, Nr. 3, Juli 1977, S. 219-228]. Einige Nachteile der Verwendung von markiertem Fibrinogen oder Blutplättchen sind berichtet worden (im Falle von radioaktiv markierten Blutplättchen weisen A.M. Peters et al., British Medical Journal 293, 13. Dez. 1986, S. 1525, kurz darauf hin, daß die Produktion von markierten Blutplättchen zeitaufwendig ist und beträchtliche technische Fertigkeit erfordert, aus welchem Grund ihre Verwendung keine breite Anwendung gefunden hat); einer der schwerwiegendsten Nachteile ist, daß die Akkumulation der Reagenzien in Thromben, die älter als etwa 24 Stunden sind, voraussichtlich ungenügend ist, um szintigraphischen Nachweis zu ermöglichen (z.B. wie kurz angedeutet von J.R. Paulsma-De Waal et al., NucCompact 18, 1987, S. 284-286).
Kürzlich sind Versuche unternommen worden, radioaktiv matkierte Antikörper gegen eine Vielzahl von Blutbestandteilen als Reagenzien für die Diagnose von Thrombose einzusetzen. Eine beträchtliche Zahl von Veröffentlichungen berichten über die Verwendung von monoklonalen oder polyklonalen Antifibrin-Antikörpern, die mit einer Vielzahl von radioaktiven Isotopen markiert sind, wobei In-111, I-131 oder Tc-99m die am häufigsten verwendeten Isotope sind, insbesondere zur Diagnose tiefer Venenthrombose.
So beschreiben z.B. S.F. Rosebrough et al., Radiology 156, 1985, S. 515-517, die Verwendung von mit I-131 markierten monoklonalen Antifibrin-Antikörpern für die Abbildung von Venenthromben, die in Hunden induziert wurden. S.F. Rosebrough et al., Radiology 162, 1987, S. 575-577, beschreiben die Verwendung von mit I-131 markierten monoklonalen Antikörpern, die für Human- und Hunde-Fibrin spezifisch sind, zur Abbildung von reifen Thromben, wobei sie über die erfolgreiche Abbildung von tiefen Hunde- Venenthromben berichten, die 1, 3 und 5 Tage alt waren. In ähnlicher Weise beschreiben L.C. Knight et al., J. Nucl. Med. 29, 1988, S. 404-502, die Verwendung eines mit In-111 markierten monoklonalen Antifibrin-Antikörpers zur Abbildung von Gefäßthromben in einem Tiermodell (Kaninchen und Hund), wobei sie über die Abbildung von Thromben, die bis zu vier Tage alt waren, in 5 von 8 Kaninchen und von Thromben, die 0,5 Stunden bis 24 Stunden alt waren, in 6 von 8 Hunden berichten. Alle diese Studien schließen, daß, auf der Grundlage dieser Ergebnisse, markierte monoklonale Antifibrin-Antikörper auch nützlich sein können, um Thromben in menschlichen Patienten sichtbar zu machen.
Studien der Diagnose von tiefer Venenthrombose bei Menschen mit Hilfe von radioaktiv markierten monoklonalen Antifibrin- Antikörpern sind z.B. von M. Jung et al., Eur. J. Nucl. Med. 14(5-6), 1988, S. 280-283; H.J. Aronen et al. Eur. J .Nucl. Med. 14 (5-6), 1988, S. 288-290 und F. De Geeter et al., Eur. J. Nucl. Med. 14 (5-6), 1988, S. 284-287 beschrieben worden. Jung et al. schließen, daß die szintigraphische Analyse für die Diagnose von gebildeter tiefer Venenthrombose der Wade, der Kniekehlenvene und des Oberschenkels nützlich ist, wenn die Thromben nicht älter als 10 Tage sind. Aronen et al. berichten über falsche positive Ergebnisse der szintigraphischen Analyse und schließen, daß es notwendig ist, ein positives Ergebnis durch Phlebographie zu bestätigen. De Geeter et al. halten Antifibrin-Szintigraphie für eine vielversprechende Alternative im Gegenüberstellung zu Venographie. Antifibrin- Antikörper haben den Vorteil, daß ihre Antigenstelle im thrombotischen Bereich angeordnet ist. Antifibrin-Antikörper haben jedoch eine lange Halbwertszeit im Kreislauf und folglich gibt es eine hohe Hintergrundaktivität. Dies begrenzt die Verwendung von markiertem Antifibrin- Antikörpern auf Nicht-Notfallsituationen (vgl. Z. Oster und P. Som, American Journal of Radiology 152, Feb. 1989, S. 253-260, die auch anmerken, daß markierte Antifibrin- Antikörper besonders gut für den Nachweis von reifen tiefen Venenthromen geeignet sein können).
Andere Veröffentlichungen offenbaren die Verwendung von radioaktiv markierten monoklonalen Anti-Blutplättchen- Antikörpern für die Diagnose von Thrombose. So beschreiben A.M. Peters et al., British Medical Journal 293, 1986, S. 1525-1527 die Verwendung eines mit In-111 markierten monoklonalen Anti-Blutplättchen-Antikörpers zur Abbildung von tiefen Venenthromben bei Patienten und schließen, daß der Antikörper zum Abbilden von frischen Thromben eher als von reifen Thromben nützlich ist, weil das Anhaften der Blutplättchen an der Oberfläche des Thrombus im Fortschreiten begriffen sein muß, um ein positives Ergebnis zur Abbildung zu erhalten. Sie schlagen auch die Verwendung des Antikörpers zum Abbilden von Nierenallotransplantatabstoßung, Blutplättchenaufnahme aus prothetischen arteriellen Oberflächen und arteriellen und intrakardialen Thromben vor.
A.W.J. Stuttle et al., Eur. J. Nucl. Med. 14(5-6), 1988, S. 122-125, berichten über die Verwendung eines Fragments eines monoklonalen Anti-Blutplättchen-Antikörpers zur Abbildung tiefer Venenthromben. In ähnlicher Weise beschreiben P. Som et al., J. Nucl. Med. 27, 1986, S. 1315-1320, die Verwendung von mit Tc-99m markierten monoklonalen Anti-Blutplättchen- Antikörperfragmenten zur Abbildung experimentell induzierter Thromben bei Hunden. Sie schließen, daß Antikörper-Fragmente zur Abbildung von Thromben im Thorax ohne Blutpool- Subtraktion verwendet werden können und daß sie zum Nachweis intrakoronarer Thromben nützlich sein können. Sie geben weiter an, daß das Markieren der Antikörperfragmente einfacher als das Markieren von Blutplättchen ist.
Z.H. Oster und P. Som, American Journal of Radiology 152, Feb. 1989, S. 253-260, diskutieren die Eigenschaften von markierten Anti-Blutplättchen-Antikörpern gegenüber markierten Antifibrin-Antikörpern für den Zweck der Thrombusabbildung. Relativ zu Antifibrin-Antikörpern, die, wie oben diskutiert, eine lange Halbwertszeit haben, haben Anti-Blutplättchen-Antikörper den Vorteil einer schnellen Blut-Clearance. Ihre Antigenstelle ist auf den zirkulierenden Blutplättchen angeordnet, was diesen die Möglichkeit gibt, in den sich entwickelnden Thrombus in einem frühen Stadium eingebaut zu werden, wodurch das Ziel/Blut-Verhältnis erhöht wird, d.h. das Verhältnis der Aktivität der thrombotischen Stelle und der Hintergrundaktivität im Blut. Andererseits macht es das Anhaften der Anti-Blutplättchen-Antikörper an zirkulierenden Blutplättchen schwierig, Thromben sichtbar zu machen, die älter als etwa 24 Stunden sind.
Die Nützlichkeit von radioaktiv markierten fibrinolytischen Enzymen (z.B. Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA), Urokinase, Streptokinase) oder Vorläufern dafür (z.B. Plasminogen) für den Nachweis von Thromben sowie für die Lokalisierung von malignen Tumoren (im Falle von t-PA) ist auch aus dem Grund ihrer Affinität zu Fibrinogen oder anderen Bestandteilen von Thromben untersucht worden. So beschreiben J.H. Paulsma-De Waal et al., aaO., die Untersuchung von mit Tc-markiertem t- PA als einem Reagenz für den Nachweis von Thrombose. Sie schließen, daß systemisch injizierter, radioaktiv markierter t-PA keine nützlichen Ergebnisse liefert (d.h. Aktivitätsaufnahme im Thrombus) vermutlich wegen seiner schnellen Clearance in der Leber, wohingegen lokal injizierter markierter t-PA eine merkbare Aktivitätsaufnahme im Thrombus zeigt. Andererseits haben D.J. Hnatowich et al., Eur. J. Nucl. Med. 13, 1987, S. 467-473 positive Abbildung von experimentell induzierten Hundethromben mit intravenös injiziertem, rekombinanten t-PA, gekoppelt an Diethylentriaminpentaessigsäure, markiert mit In-111, gefunden, obgleich sie immer noch eine schnelle Clearance ihres Reagenz in der Leber beobachten.
S.-L. Karonen et al., J. Nucl. Med. 29, 1988, S. 1194-1199, berichten über die Lokalisierung maligner Tumore mit radioaktiv markiertem, rekombinanten t-PA, wobei sie schließen, daß die Akkumulation von markiertem t-PA in malignem Gewebe auf eine potenzielle Verwendung des markierten t-PA für den Nachweis von Tumoren hindeutet. Eine spätere Studie (S.-L. Karonen et al., Eur. J. Nucl. Med. 14(5-6), 1988, S. 610-611) bestätigt jedoch, daß ein Hauptteil des radioaktiv markierten t-PA schnell aus Plasma eliminiert wird. Ein anderer Nachteil der Verwendung von markiertem t-PA ist, daß, weil er in der Leber akkumuliert, das Risiko, eine zu hohe lokale radioaktive Dosis zu erhalten, es notwendig macht die Menge an eingesetztem diagnostischen Reagenz zu verringern. Abgesehen davon muß der markierte t-PA mit dem im Körper als eine Reaktion auf die Fibrinablagerung gebildeten t-PA um Haftstellen auf dem Thrombus konkurrieren.
Markierte Streptokinase und Urokinase sind ebenfalls zur Thrombusabbildung verwendet worden, wie übersichtsartig von K.A. Krohn und L.C. Knight, aaO berichtet wird, die auch über einige der inhärenten Schwierigkeiten bei der Verwendung eines dieser Enzyme berichten (siehe S. 326) und schließen, daß sie klinisch noch nicht für die Lokalisierung von Thromben brauchbar sind. Über die Verwendung von radioaktiv markiertem Plasminogen ist ebenfalls übersichtsartig von K.A. Krohn und L.C. Knight, aaO, berichtet worden, die schließen, daß es von potenzieller Nutzen zur Abbildung älterer Thromben ist.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Trotz der Existenz einer breiten Vielfalt von radioaktiv markierten Reagenzien, die für den Nachweis von Thromben vorgeschlagen worden sind, wird es jedoch für neuartig gehalten, einen Antikörper gegen ein fibrinolytisches Enzym zu markieren und den markierten Antikörper für den Nachweis in vivo erhöhter fibrinolytischer Aktivität zu verwenden. Die bisher über diese Reagenzien erhaltenen Forschungsdaten zeigen, daß ihre Verwendung wenigstens einige der von den bekannten Reagenzien berichteten Unzulänglichkeiten überwindet.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein diagnostisches Reagenz für den Nachweis in vivo erhöhter Freisetzung eines fibrinolytischen Enzyms oder erhöhter fibrinolytischer Aktivität im menschlichen oder tierischen Körper, wobei das Reagenz einen mit einem fibrinolytischen Enzym reaktiven Antikörper oder ein Fragment besagten Antikörpers umfaßt, markiert mit einer Substanz markiert ist, die den Nachweis in vivo der Bindung des Antikörpers an das fibrinolytische Enzym erlaubt.
Im vorliegenden Zusammenhang wird der Ausdruck "fibrinolytisches Enzym" so verstanden, daß er ein Enzym bedeutet, das entweder direkt den Abbau von Fibrin katalysiert (z.B. Plasmin), oder ein Vorläufer dafür (z.B. Plasminogen) oder das die Spaltung eines Enzym-Vorläufers in eine fibrinolytisch aktive Form katalysiert (z.B. t-PA oder Urokinase). Bevorzugte fibrinolytische Enzyme sind diejenigen, die eine Affinität für Fibrin zeigen, d.h. die an Fibrin selbst anhaftet oder an einer Komponente, die an Fibrin anhaftet, wie etwa t-PA, Plasmin, Plasminogen oder Analoge derselben, oder das modifiziert worden ist, um eine Affinität für Fibrin zu zeigen (z.B. modifizierte Urokinase). Der Ausdruck "Analog" kann als ein Derivat des fraglichen Enzyms definiert werden, das durch Modifizieren der DNA-Sequenz, die es kodiert, in einer Art und Weise erhalten wird, die zu Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren in der nativen Sequenz führt, oder als ein homologes Enzym oder eines, das mit einem Antikörper reaktiv ist, das gegen das native Enzym gezüchtet oder auf dieses gerichtet ist. Es sollte angemerkt werden, daß zumindest für t-PA, mehrere solche Analoge früher beschrieben worden sind. Die Modifikationen, die erforderlich sind, um ein fibrinolytisches Enzym mit Affinität für Fibrin aus einem Enzym mit niedriger Fibrinaffinität (z.B. nativer Urokinase) zu erhalten, können mit rekombinanten DNA-Techniken in einer der se bekannten Art und Weise hergestellt werden. Natürlich findet man solche Analoge oder modifizierten Enzyme nicht in Natur im menschlichen oder tierischen Körpern, aber sie können einen Teil einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden diagnostischen Methode bilden, bei der ein Analog oder ein modifiziertes Enzym einem Patienten vor oder nach der Verabreichung des markierten Antikörpers verabreicht wird. Ein Vorteil einer solchen Methode wäre, daß der Gehalt an fibrinolytischem Enzym an der Stelle eines z.B. Thrombus oder einer anderen Fibrinablagerung fast nach Wahl erhöht werden kann, was zu erhöhter Antikörper-Anhaftung führt, um die Genauigkeit der Diagnose zu verbessern.
Der Ausdruck "erhöhte fibrinolytische Aktivität" ist so gemeint, daß er ein höheres als ein normales Niveau an Fibrinabbau bedeutet, während der Ausdruck "erhöhte Freisetzung eines fibrinolytischen Enzmyns" sich auf eine erhöhte Sekretion eines oder mehrerer Enzyme bezieht, die einen Teil des fibrinolytischen Systems bilden, z.B. im Zusammenhang mit einem schwach ischämischen Zustand, in dem keine Fibrinablagerung und folglich keine Fibrinolyse stattfindet.
Der Ausdruck "Antikörper" bezieht sich auf jede Substanz, die als Reaktion eines Menschen oder eines Tieres oder einer menschlichen oder tierischen Zelle auf die Einwirkung des fibrinolytischen Enzyms (oder des Analogs) gebildet wird. Gemäß herkömmlicher Praxis kann "Fragment besagten Antikörpers" ein Fab'-F(ab')&sub2;- oder Fv-Fragment des Antikörpers sowie ein Single-Domain-Antikörper sein.
Unter physiologischen Bedingungen ist die Menge an zirkulierenden fibrinolytischen Enzymen niedrig, wohingegen die lokale Konzentration dieser Enzyme im Falle von Thrombose stark erhöht ist, was bedeutet, daß die Antigenstellen für Antikörper gegen irgendeines der fraglichen fibrinolytischen Enzyme fast ausschließlich im thrombotischen Bereich gefunden werden, was zu einem günstigen Ziel/Blut-Verhältnis führt. Dies kann weiter erhöht werden durch Verabreichung des fibrinolytischen Enzyms, mit dem der Antikörper reaktiv ist, vor oder nach Verabreichung des Antikörpers. Auf diese Art und Weise ist es möglich, den Gehalt an dem fraglichen fibrinolytischen Enzym auf älteren thrombotischen Läsionen zu erhöhen und nicht-gebundene Antikörper gegen das fibrinolytische Enzym zu entfernen, um die Hintergrundaktivität im Falle akuter Untersuchungen zu verringern. In einer besonders begünstigten Ausführungsform ist das fibrinolytische Enzym t-PA, das bei Verabreichung schnell aus dem Kreislauf ausgeschieden wird, wobei es an einen Leberrezeptor gebunden wird. Es ist überraschenderweise festgestellt worden, daß, wenn t-PA oder ein Analog desselben, wie oben definiert, an einem geeigneten Punkt nach Verabreichung eines Anti-t-PA- Antikörpers verabreicht wird, der resultierende t-PA/Anti-t- PA-Komplex eine weit kürzere Halbwertszeit in Plasma hat als der nicht-komplexierte Antikörper, wegen der Bindung des Komplexes an denselben Rezeptor wie freies t-PA. Folglich betrifft die Erfindung gemäß dieser Ausführungsform weiter eine diagnostische Zusammensetzung, die, in separaten Behältern,
(a) einen mit einem fibrinolytischen Enzym, insbesondere t-PA, reaktiven Antikörper oder ein Fragment besagten Antikörpers, markiert mit einer Substanz, die Nachweis in vivo der Bindung des Antikörpers an das fibrinolytische Enzym erlaubt, und
(b) ein fibrinolytisches Enzym, mit dem der Antikörper reaktiv ist, insbesondere t-PA oder ein Analog desselben,
umfaßt.
Ein Verfahren zum in vivo-Nachweis erhöhter Freisetzung eines fibrinolytischen Enzyms oder erhöhter fibrinolytischer Aktivität im menschlichen oder tierischen Körper umfaßt
(a) Verabreichen einer diagnostisch wirksamen Menge eines mit einem fibrinolytischen Enzym reaktiven Antikörpers oder eines Fragmentes besagten Antikörpers, markiert mit einer Substanz, die den Nachweis in vivo der Bindung des Antikörpers oder Fragments desselben an das fibrinolytische Enzym erlaubt, an einen menschlichen oder tierischen Patienten und
(b) Lokalisieren erhöhter Freisetzung eines fibrinolytischen Enzmys oder erhöhter fibrinolytischer Aktivität im Patienten durch Bestimmung des Vorhandenseins von gebundenem markierten Antikörper.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens kann ein Analog eines fibrinolytischen Enzyms oder ein Enzym, das modifiziert worden ist, um Fibrinaffinität zu zeigen, dem Patienten vor der Verabreichung des markierten Antikörpers verabreicht werden. Wie oben angegeben, kann dies eine höhere Konzentration des Enzyms an der Stelle der Fibrinablagerung und damit ein stärkeres szintigraphisches Signal (relativ zur Hintergrundaktivität) sicherstellen, was eine genauere Diagnose des Zustandes erlaubt. Alternativ kann das fibrinolytische Enzym oder ein Analog desselben an irgendeinem geeigneten Punkt nach Verabreichung des Antikörpers verabreicht werden, wie oben angegeben. So kann Verabreichung des fibrinolytischen Enzyms nach einem Zeitraum stattfinden, der ausreicht, um die Bindung einer angemessenen Menge des markierten Antikörpers an der Stelle erhöhter fibrinolytischer Aktivität sicherzustellen, wobei die anschließende Verabreichung des fibrinolytischen Enzyms für schnelle Eliminierung des im Kreislauf verbliebenen Antikörpers und folglich für eine wesentlich verringerte Hintergrundaktivität sorgt. Dieser Zeitraum kann geeigneterweise von etwa 30 Minuten bis etwa 24 Stunden sein. Die Dosierung des fibrinolytischen Enzyms liegt typischerweise unterhalb einer therapeutischen Dosis.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines mit einem fibrinolytischen Enzym reaktiven Antikörpers oder eines Fragments besagten Antikörpers, markiert mit einer Substanz, die den Nachweis in vivo der Bindung des Antikörpers oder Fragments desselben an das fibrinolyitsche Enzym erlaubt, zur Herstellung eines diagnostischen Reagenz für den Nachweis in vivo erhöhter Freisetzung eines fibrinolytischen Enzyms oder erhöhter fibrinolytscher Aktivität im menschlichen oder tierischen Körper. Wie oben erläutert, wird das fibrinolytische Enzym vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus t-PA, Plasmin, Plasminogen oder einem Analog derselben oder einem modifizierten fibrinolytischen Enzym mit Affinität für Fibrin besteht.
Ein besonders bevorzugtes fibrinolytisches Enzym zum Ziehen von Antikörpern für den vorliegenden Zweck ist t-PA oder ein Analog desselben, insbesondere ein nativer t-PA, da dieses Enzym eine hohe Affinität für Fibrin zeigt. Auch ist die Menge an t-PA im Blut normalerweise sehr gering, wohingegen die Konzentration von t-PA in Verbindung mit pathologischen Prozessen hoch ist.
Im diagnostischen Verfahren der Erfindung verwendete Antikörper sind vorzugsweise monospezifische Antikörper, die nur auf eine spezifische Komponente gerichtet sind, in diesem Fall das gewünschte fibrinolytische Enzym. Monospezifische Antikörper können sowohl polyklonal als auch monoklonal sein.
Polyklonale Antikörper können hergestellt werden, indem einem geeigneten Tier eine im wesentlichen reine Zubereitung des fraglichen fibrinolytischen Enzyms (um ihre Monospezifität sicherzustellen) injiziert wird, gefolgt von einer oder mehreren Booster-Injektionen in geeigneten Intervallen (z.B. von zwei Wochen bis zu einem Monat) bis zu sechs Monate vor dem ersten Aderlaß. Dann wird das Tier, während dieses Immunisierungsregime fortgesetzt wird, etwa eine Woche nach jeder Booster-Immunisierung zur Ader gelassen und Antikörper werden aus dem Serum in einer der se bekannten Art und Weise isoliert, wie von Harboe und Ingild, Scand. J. Immun. 2 (Anhang 1), 1973, S. 161-164 beschrieben.
Es ist jedoch bevorzugt, im Verfahren der Erfindung monoklonale Antikörper einzusetzen (oder Fragmente derselben, wie etwa Fab'-, F(ab')&sub2;- oder Fv-Fragmente), da dies eine höhere Spezifität und Genauigkeit der Diagnose sicherstellt. Monoklonale Antikörper können durch gut eingeführte Verfahren erhalten werden, z.B. wie beschrieben von L.C. Petersen et al. , Thrombosis and Haemostasis 57 (2), 1987, s. 205-211. Es sollte angemerkt werden, daß die monokionalen Antikörper aus irgendeiner geeigneten Quelle stammen können ünd somit ausgewählt werden können aus z.B. murinen oder menschlichen monoklonalen Antikörpen.
Der Antikörper kann auch durch Klonieren einer DNA-Sequenz, die für den Antikörper oder ein Fragment desselben kodiert, in eine geeignete Zelle hinein, z.B. eine mikrobielle, pflanzliche, tierische oder menschliche Zelle, und Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die für die Produktion des fraglichen Antikörpers oder Fragments förderlich sind, und Gewinnung des Antikörpers oder Fragments desselben aus der Kultur produziert werden. Mögliche Strategien für die Herstellung von klonierten Antikörpern oder Fragmenten von Antikörpern sind diskutiert in z.B. L. Riechmann et al., Nature 332, 24. März 1988, S. 323 ff., die die Herstellung von chimären Antikörpern von variablen Bereichen bei Ratten und konstanten Bereichen bei Menschen beschreiben; M. Better et al., Science 240, 20. Mai 1988, S. 1041 ff., die die Herstellung von chimären Mäuse/Mensch-Fab-Fragmenten beschreiben; A. Sharra und A. Plückthun, Science 240, 20. Mai 1988, S. 1038-1040, die die Klonierung eines Immunglobulin-Fv-Fragmentes beschreiben, das antigenbindende variable Domänen enthält; und E.S. Ward et al., Nature 341, 12. Oktober 1989, s. 544-546, die die Klonierung von isolierten antigenbindenden variablen Domänen ("Single-Domain-Antikörper") beschreiben.
Ein besonders bevorzugter Antikörper zur Verwendung als ein diagnostisches Reagenz für den vorliegenden Zweck ist ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment desselben, der (das) mit nativem t-PA oder einem Analog desselben (wie oben definiert) reaktiv ist. Monoklonale Antikörper gegen t-PA sind zuvor für andere Zwecke beschrieben worden, siehe z.B. L.C. Petersen et al., aaO, EP 298 783, K. Kaltoft et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1982, S. 3720-3723, L.S. Nielsen et al., The EMBO Journal 2, 1983, S. 115-119, L.S. Nielsen et al., Biochemistry 21, 1982, S. 6410-6415, K. Danφ et al., J Histochem. Cytochem. 30, 1982 S. 1156-1170.
Die im Reagenz der Erfindung verwendeten Antikörper sollten vorzugsweise in im wesentlichen reiner Form vorliegen, um die Genauigkeit der Diagnose zu verbessern.
Die Substanz, die verwendet wird, um den Antikörper zu markieren, kann geeigneterweise ein radioaktives Isotop sein. Das Isotop ist vorzugsweise eines, das eine vernünftig kurze Halbwertszeit hat, so daß Patienten, denen das Reagenz der Erfindung verabreicht wird, keine zu hohe radioaktive Dosis erhalten. Die radioaktive Gesamtdosis kann auch durch Auswahl eines Antikörpers minimiert werden, der aus dem Körper innerhalb eines relativ kurzen Zeitraumes eliminiert wird. Das Isotop kann aus den zuvor für diesen Zweck vorgeschlagenen ausgewählt werden, z.B. In-111, Tc-99m, I- 131, I-123 oder I-125. Markieren des Antikörpers mit dem Radionuklid kann durchgeführt werden, wie im Stand der Technik für das radioaktive Markieren von Antikörpern im allgemeinen beschrieben, vgl. z.B. D.J. Hnatowich et al., Science 220, 1983, S. 613-615 (wobei der Antikörper vor dem Markieren an Diethylentriaminpentaessigsäure konjugiert wird, um stabile Bindung an das Radionuklid zu erleichtern) oder B.A. Rhodes et al., in Tumor Imaging (S.W. Burchiel und B.A. Rhodes Hrg.), New York, Mason Publishing, S. 111-123 (wobei der Antikörper direkt mit dem Radionuklid inkubiert wird). Markieren mit Tc-99m kann im wesentlichen durchgeführt werden, wie in EP 169 232, EP 271 806 oder EP 304 780 beschrieben. Die von diesen radioaktiven Isotopen eminttierte Radioaktivität kann in einem Gamma-Zähler oder in einer Szintillationskamera in einer per se bekannten Art und Weise gemessen werden.
Alternativ kann die Substanz, die verwendet wird, um den Antikörper zu markieren, eine für magnetische Resonanzabbildung brauchbare Substanz sein. Beispiele geeigneter Substanzen sind Magnetit-Teilchen, die mit dem Antikörper beschichtet und zur Abbildung verwendet werden können, im wesentlichen wie bei S. Cerdan et al., Magnetic Resonance in Medicine 12, 1989, S. 151-163 beschrieben, öder paramagnetische Atome, z.B. C¹³ oder Gadolinium (vgl. z.B. J.C. Saccavini et al., Invest. Radiol., Anhang 1, 1988, S. S292-S293).
Das diagnostische Reagenz der Erfindung kann in jeder Weise formuliert werden, die es für parenterale, nasale, enterische oder rektale Verabreichung geeignet macht. So kann das Reagenz in Form von z.B. einer injizierbaren Formulierung, Aerosolformulierung, Suspension, Lösung oder Einlaufmittel vorliegen. Das Reagenz kann mit pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoffen oder Vehikeln, z.B. isotonischer Kochsalzlösung, gemäß herkömmlicher pharmazeutischer Praxis formuliert werden. Das Dosierungsniveau des Reagenz wird üblicherweise im Bereich von 0,1-10 mg, vorzugsweise 0,5-5 mg, z.B. etwa 1 mg, des markierten Antikörpers liegen.
Es wird in Betracht gezogen, daß das diagnostische Reagenz der Erfindung zum Diagnostizieren jeden Zustandes geeignet sein kann, der eine lokale Akkumulation von Fibrin, die zu lokal erhöhter fibrinolytischer Aktivität führt, umfaßt. So kann das Reagenz zum Diagnostizieren solcher Zustände nützlich sein wie Thromoose (einschließlich tiefer Venenthromoose, Koronarthrombose, Cerebralthrombose, Kardialthrombose, Gefäßwandthrombose, Gastrointestinalthrombose, Arterienthrompose), Embolie (einschließlich Lungenembolie), Blutung (einschließlich Hirnblutung, postoperativer Blutung, gastrointestinaler Blutung, Hämaturie, Hämoptysis), Magen - oder Zwölffingerdarmgeschwüre, Ischämie, Neoplasmen (einschließlich Brustkrebs, Eierstockkrebs, malignem Melanom oder Gehirn oder Knochentumoren), Vasculitis, lokale Infektionen, lokale entzündliche Zustände (einschließlich Arthritis) oder Frakturen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen veranschaulicht, in denen
Fig. 1 ein Szintigramm ist, das erhöhte Aufnahme von mit In-111 markiertem monoklonalen Anti-t-PA- Antikörper (t-PA-MoAb) an der Stelle der Blutprobennahme in der Ellenbogenvene zeigt,
Figs. 2 u. 3 Szintigramme sind, die erhöhte Aufnahme von mit In-111 markiertem t-PA-MoAb an der Stelle einer Arteriotomie in der Oberschenkelarterie, unmittelbar nach Injektion des Reagenz (Fig. 2) und nach 24 Stunden (Fig. 3), zeigt,
Fig. 4 ein Szintigramm ist, das erhöhte Aufnahme von mit In-111 markiertem t-PA-MoAb an der Stelle gastrointestinaler Blutung in unteren, zentralen Teil des Abdomens und Blinddarms zeigt,
Fig. 5 ein Szintigramm ist, das erhöhte Aufnahme von mit In-111 markiertem t-PA-MoAb in Bereichen tiefer Venenthrombose in Bereich des rechten Knies zeigt,
Fig. 6 ein Szintigramm ist, das erhöhte Aufnahme von mit In-III markiertem t-PA-MoAb im Wandthrombus eines Bauchaorten-Aneurysmas zeigt,
Fig. 7 ein Szintigramm ist, das erhöhte Aufnahme von mit In-111 markiertem t-PA-MoAb in einen Bereich von Lungenembolie zeigt,
Fig. 8 ein Szintigramm ist, das erhöhte Aufnahme von mit In-111 markiertem t-PA-MoAb im Bereich der im linken Unterschenkel proximalen, arteriellen Trifurkation vor und 1 und 40 Stunden nach einer Operation zur Entfernung eines Embolus in diesem Bereich zeigt,
Fig. 9 ein Szintigramm ist, das erhöhte Aufnahme von mit In-111 markiertem t-PA-MoAb im Bereich einer Außenknöchelfraktur zeigt,
Fig. 10 ein Szintigramm der Abdominalregion ist, das erhöhte Aufnahme von mit In-111 markiertem t- PA-MoAb in einem Throiabus der linken Darmbeinvene zeigt,
Fig. 11 ein Szintigramm der Abdominalregion ist, das erhöhte Aufnahme von mit In-111 markierten t- PA-MoAb in der bilateralen Eierstockregion, der Blase und einer Tumormetastase zum Quercolon zeigt,
Fig. 12 ein Szintigramm der hinteren Abdominalregion ist, das erhöhte Aufnahme von mit In-111 markiertem t-PA-MoAb in einem perityphlitischen Abzess zeigt,
Fig. 13 drei Szintigramme sind, die erhöhte Aufnahme von mit In-111 markiertem t-PA-MoAb zeigt, entsprechend rheumatoider Artritis der Gelenke in den Handwurzeln, dem rechten Knöchel und den Knien,
Fig. 14 ein Szintigramm ist, das erhöhte Aufnahme von mit In-111 markiertem t-PA-MoAb in der Nasalregion zeigt (die Nasenschleimhaut zeigt im allgemeinen erhöhte fibrinolytische Aktivität, wie dies die Prostata und die Gonaden tun),
Fig. 15 ein Diagramm ist, das die Gesamtradioaktivität im Plasma des mit In-111 markiertem t-PA-MoAb mit und ohne anschließende Injektion von t-PA zeigt,
Fig. 16 ein Diagramm ist, das den immunreaktiven Teil des mit In-111 markierten t-PA-MoAb mit und ohne anschließende Injektion von t-PA zeigt,
Fig. 17 ein Szintigramm ist, das die Organverteilung in Kaninchen des mit In-111 markierten t-PA- MoAb allein und komplexiert mit t-PA zeigt,
Fig. 18 ein Diagramm ist, das die Gesamtreaktivität in menschlichem Plasma des mit In-111 markierten t-PA-MoAb vor und nach Injektion von t-PA zeigt,
Fig. 19 ein Diagramm das die Veränderung der menschlichen Organverteilung des mit In-111 markierten t-PA-MoAb im Anschluß an Injektion von t-PA zeigt,
Fig. 20 zwei Szintigramme der Schenkelregion sind, die zunächst erhöhte Akkumulation des In-111 markierten t-PA-MoAb im Gefäßbett des rechten Beines zeigt (A) und, nach t-PA-Injektion, den fokalen Thrombusbereich enthüllt (oberes Ende des rechten Beines) (B).
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung.

BEISPIEL 1

Produktion eines monoklonalen Antikörpers gegen t-PA

Reinigung von t-PA-Antigen

Der für die Immunisierung von Mäusen verwendete t-PA wurde gereinigt, wie bei Rijken, D.C. und Collen, D., J. Biol. Chem. 256, 1981, S. 7035-41 offenbart. Das gereinigte Material enthielt > 95% reinen t-PA, wie durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit Silberanfärbung bestimmt wurde.

Immunisierung von AKR-Mäusen mit t-PA

Gereinigter t-PA, der wie oben beschrieben erhalten wurde, wurde gegen 0,15 M NaCl dialysiert, das 0,01% (v/v) Tween 80 enthielt, und die Konzentration wurde auf 10 ug/ml eingestellt.
AKR-Mäuse wurden 3mal in zwei-wöchentlichen Intervallen immunisiert. Für die ersten zwei Immunisierungen wurden jeder Maus 50 ul t-PA, emulgiert mit 50 ul Inkomplettem Freundschen Adjuvans, subkutan injiziert (entsprechend 5 ug t-PA/Maus). Die letzte Immunisierung war identisch mit den ersten zwei, wurde aber intraperitoneal statt subkutan gegeben. Zwei Monate später erhielt eine Maus eine intravenöse Booster-Injektion von 90 ul t-PA ohne jegliches Freundsches Adjuvans.

Zellfusion und Zellkultur

Drei Tage nach dem intravenösen t-PA-Booster wurde die Milz entfernt und eine Milzzellsuspension wurde hergestellt, indem die Milz sorgfältig seziert und zertrümmert wurde. Die resultierenden Milzzellen wurden für Zellfusionen verwendet, wie bei Petersen, L.C. et al., Thrombosis and Haemostasis 57 (2), 1987, S. 205-211 beschrieben. Kurz gesagt wurden Milzzellen mit X63-Ag8-6.5.3-Myelomzellen in Gegenwart einer Polyethylenglykol-Lösung verschmolzen. Nach Fusion wurden die Zellen in 10 Mikrotiter-Zellplatten mit 96 Vertiefungen eingesät. Hybridomüberstände wurden nach zwei Wochen mit Enzymverknüpftem Immunsorbierenden Test unter Verwendung von t-PA als Antigen gescreent. Ein positiver Klon wurde mehrmals mit der Technik der Grenzverdünnung rekloniert, um Monoklonalität sicherzustellen. Die Zellinie wurde dann im Großmaßstab in "Zellfabriken" von NUNC in einem Medium, das aus RPMI 1640 (Gibco, UK) mit 2% BMS (Gibco, UK) bestand, gezüchtet.

Reinigung des monoklonalen Antikörpers

Die Hybridomüberstände wurden konzentriert. pH wurde auf 8,3 eingestellt, woraufhin der monoklonale Antikörper bei 4ºC durch Adsorption an ein Protein A-Gel gereinigt wurde. Die Elution wurde dann mit Zitratpuffer pH 4,5 durchgeführt.

Produktion von F(ab)&sub2;-Fragmenten

Der gereinigte monoklonale Antikörper (Unterklasse IgG&sub1;) wurde mit Pepsin bei einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:100 bei pH 4,30 für 16 h bei 37ºC verdaut. Die Reaktion wurde durch Einstellen des pH der Reaktionsmischung auf pH 8,5 mit festem Tris abgebrochen. Das F(ab)&sub2; wurde von unverdautem IgG und Produkten mit niedrigem Molekulargewicht auf einer Ultrogel AcA 44-Säule abgetrennt. Reinigung des Antikörpers, Pepsinverdauung und Reinigung von F(ab)&sub2; wurde auf SDS-Gelen mit Silberanfärbung überwacht.

Markierung von F(ab)&sub2; mit Indium

Das gereinigte F(ab)&sub2; wurde mit Indium im wesentlichen gemäß der Methode von Hnatowich (J.Immun.Methods. 65, 147-157 (1983)) markiert. Immunreaktivität von Konjugaten wurden durch ELISA und mit immunsorbierender Technik unter Verwendung von t-PA als Antigen bestätigt. Radiochemische Reinheit wurde durch HPLC bestätigt.

BEISPIEL 2

Fallgeschichten

Allen Patienten wurde 1 mg des mit In-111 markierten Anti-t- PA-MoAb, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, bei einer radioaktiven Dosierung von 100 MBq injiziert, mit Ausnahme von Fall B, wo die radioaktive Dosierung 50 MBq betrug. Szintigraphische Untersuchung wurde mit Hilfe einer szintigraphischen Kamera GE StarCam durchgeführt, die mit einem Computer Star System 2 verbunden war, wobei damit unmittelbar nach Injektion des Antikörpers begonnen wurde. Es wurden über den gesamten Zeitraum, während dem die Untersuchungen stattfanden, keine Komplikationen beobachtet.
A. Einem 50 Jahre alten Mann wurde eine Blutprobe aus der rechten Ellenbogenvene 3 Stunden vor Injektion des markierten Antikörpers abgenommen. Für die ersten 8 Stunden der szintigraphischen Untersuchung wurde ein kleiner Venenkatheter distaler in der rechten Ellenbogenvene zum Zweck der Blutprobennahme plaziert. Eine erhöhte Aufnahme des markierten Antikörpers an den Probennahmestellen wurde auf dem Szintigramm 24 Stunden nach Injektion des Antikörpers beobachtet (Fig. 1), was zeigt, daß der markierte Antikörper zum Nachweis von Bereichen von Gefäßschädigungen eingesetzt werden kann.
B. Eine Thromoendarterektomie wurde in der linken Arteria femoralis communis eines 50 Jahre alten Mannes mit schwerer Arteriosklerose durch eine 5 cm lange Arteriotomie durchgeführt 20 Stunden später wurde der markierte Antikörper injiziert. Bei szintigraphischer Untersuchung wurde eine sofortig erhöhte Aufnahme des Antikörpers entlang der Arteriotomie beobachtet (Fig. 2). 24 Stunden nach Injektion wurde eine erhöhte Aufnahme des Antikörpers im gesamten Operationsbereich beobachtet, was einer Mikrothrombose von Blutgefäßen, die bei der Operation verletzt worden waren, entsprach (Fig. 3).
C. Ein 61 Jahre alter Mann war mehrmals über die letzten 2 Jahre wegen schwerer gastrointestinaler Blutung ins Krankenhaus aufgenommen worden. Trotz sorgfältiger Suche nach der Blutungsstelle wurde diese nicht gefunden. Der Patient wurde wieder aufgenommen nach 5 Tagen Blutung, die nach seiner Aufnahme ins Krankenhaus andauerte. Markierter Anti-t-PA-MoAb wurde injiziert und 2,5 Stunden später wurde ein Bereich mit erhöhter fibrinolytischer Aktivität im unteren, zentralen Teil des Abdomen festgestellt (Fig. 4). Die fibrinolytische Aktivität stieg in diesem Bereich weiter an und nach 6 Stunden szintigraphischer Untersuchung wurde Aktivität auch im Blinddarm festgestellt. An diesem Punkt war immer noch fokal erhöhte Aktivität im ursprünglich beobachteten Bereich nachweisbar. Bei Operation des Patienten wurde ein Karzinoidpolyp beobachtet und 50 cm vom Krummdarm-Blinddarm-Bereich reseziert, d.h. wo die erhöhte fokale Aktivität nachgewiesen worden war. Seitdem ist keine gastrointestinale Blutung beobachtet worden.
D. Der Patient war ein 78 Jahre alter Mann, der zwei Wochen vor der szintigraphischen Untersuchung in einen Verkehrsunfall verwickelt worden war. Er war wegen Schmerzen im Rücken für den gesamten Zeitraum ruhig gestellt. Am Tag vor der szintigraphischen Untersuchung wurde er einer Kontrastphlebographie unterzogen. Untersuchung 20 Stunden nach Injektion des markierten Antikörpers zeigte stark erhöhte fibrinolytische Aktivität im rechten Bein (Fig. 5), in exakter Übereinstimmung mit den proximalen Teilen der okkludierten thrombotischen Bereiche, die durch Phlebographie beobachtet worden waren, d.h. der Seitenvenen distai zum Knie und dem distalen Teil der Vena femoralis unmittelbar oberhalb des Knies.
E. Einem 81 Jahre alten Mann mit einem Aneurysma der Abdominalaorta, das mit einem Wandthrombus überzogen war, wurde der markierte Antikörper injiziert und die szintigraphische Untersuchung wurde 20 Stunden bevor der Patient wegen dieses Zustands operiert wurde, begonnen. Erhöhte fibrinolytische Aktivität wurde an der Stelle des Wandthrombus beobachtet (Fig. 6). Proben des Blutgefäßes, die aus diesem Bereich während der Operation entnommen wurden, zeigten eine 60% höhere Aufnahme des markierten Antikörpers im Bereich des Wandthrombus, relativ zu einem Aortabereich mit einem hohen Grad an Arteriosklerose, aber keiner Thrombusbildung.
F. Ein 69 Jahre alter Mann wurde wegen Atemproblemen ins Krankenhaus aufgenommen. Ein kombiniertes Perfusions- und Ventilations-Szintigramm enthüllte kleine Lungenemboli, kombiniert mit einer chronischen obstruktiven Lungenerkrankung. Szintigraphische Untersuchung 24 Stunden nach Injektion des markierten Antikörpers zeigte eine erhöhte Aufnahme des Antikörpers im Emboliebereich in der rechten Lunge (Fig. 7).
G. Eine 81 Jahre alte Frau, die über 5 Tage einen leichten Schmerz im unteren linken Bein hatte, wurde ins Krankenhaus aufgenommen, als der Schmerz schlimmer wurde und beginnende Hyposensibilität im Vorderfuß beobachtet worden war. Ein Embolus in der Schenkelregion wurde diagnostiziert und durch Operation entfernt. Präoperative szintigraphische Untersuchung im Anschluß an die Injektion des markierten Antikörpers zeigte eine unregelmäßige erhöhte Aufnahme des Antikörpers im Bereich der im linken Unterschenkel proximalen, arteriellen Trifurkation (Fig. 8). Eine diffuse erhöhte Aktivität im Vorderfuß wurde ebenfalls beobachtet, was eine erhöhte lokale Freisetzung von t-PA anzeigte. Szintigraphische Untersuchung wurde postoperativ fortgesetzt und eine Normalisierung im Szintigramm wurde innerhalb 48 Stunden nach der Operation beobachtet. Die Patientin erholte sich ohne Folgeerscheinungen.
H. Ein 81 Jahre alter Mann wurden mit einer Außenknöchelfraktur im rechten Bein am Tag vor der Injektion des markierten Antikörpers ins Krankenhaus aufgenommen. Szintigraphische Untersuchung zeigte eine erhöhte Aufnahme des Antikörpers in der Region der Fraktur (Fig. 9).
I. Eine 32 Jahre alte Frau wurde wegen deutlichem Ödem des linken Beines ins Krankenhaus aufgenommen. Akute Kontrastphlebographie enthüllte Anzeichen einer Thrombose der linken Darmbeinvene. Szintigraphie 24 Stunden nach Injektion des markierten Antikörpers zeigte hohe fokale Aktivität im gesamten Bereich der linken Darmbeinvene (Fig. 10).
J. Eine 72 Jahre alte Frau wurde mit Verdacht auf malignen Eierstocktumor ins Krankenhaus aufgenommen.
Ultraschalluntersuchung enthüllte präoperativ verdächtige Veränderungen des rechten Eierstocks und einen 2x2x2 cm Tumormasse in der oberen Abdominalregion. Szintigraphie 24 Stunden nach Injektion des markierten Antikörpers zeigte fokale Aktivitätsakkumulation in der Blase, der bilateralen Eierstockregion und fokal in der oberen Abdominalregion (Fig. 11). Während der Operation wurde die Diagnose des Eierstockkrebses durch bilateralen Eierstockkrebs unter Einbeziehung der Blase und durch eine entfernte Metastase am Quercolon bestätigt.
K. Ein 38 Jahre alter Mann wurde wegen Fieber und leichter Schmerzen, die im unteren rechten Teil des Abdomens lokalisiert waren, ins Krankenhaus aufgenommen. Ultraschalluntersuchung enthüllte eine fokale Homogeniemasse im unteren rechten Abdominalbereich, was konsistent mit einem perityphlitischen Abzess war. Ein Nachschau- Szintigramm, aufgenommen 27 Stunden nach Injektion des markierten Antikörpers, zeigte fokale Aktivitätsakkumulation in demselben Bereich, was fokale Infektion anzeigte, was den Ultraschallbefund unterstützte (Fig. 12).
L. Ein 60 Jahre alter Mann mit schwerer Rheumatoidarthritis seit mehreren Jahren wurde wegen eines Wiederaufflackerns der Erkrankung ins Krankenhaus aufgenommen. Szintigraphie 24 Stunden nach Injektion des markierten Antikörpers zeigte erhöhte Aktivität in den Gelenken, die vom akuten Stadium der Erkrankung betroffen waren (Fig. 13).
Diese Ergebnisse zeigen, daß der radioaktiv markierte Anti- t-PA-MoAb zur Diagnose einer breiten Vielzahl von Zuständen, die mit erhöhter fibrinolytischer Aktivität verbunden sind, in vielen verschiedenen Teilen des Körpers verwendet werden kann, mit der möglichen Ausnahme von Geweben mit einer hohen intrinsischen fibrinolytischen Aktivität, wie etwa der Prostata, der Gonaden und der Nasenschleimhaut (vgl. Fig. 14). Der MoAb zeigt eine hohe Immunspezifität und Sensitivität. Die Aufnahme des Antikörpers in der Leber war über die ersten 4 Stunden niedrig, was bedeutet, daß im Gegensatz zur Verwendung des radioaktiv markierten t-PA selbst eine hepatische Extraktion und folglich eine hohe lokale Konzentration von Radioaktivität in der Leber kein Problem zu sein scheint. Für die ersten paar Minuten nach Injektion des Antikörpers war die Aufnahme im thrombotischen Bereich deutlich, wonach die Hintergrundaktivität für bis zu mehrere Stunden anstieg. Das Ziel/Blut-Verhältnis verbesserte sich dann, so daß sich ein klares szintigraphisches Bild des Bereichs erhöhter fibrinolytischer Aktivität ergab.

BEISPIEL 3

Biologische Hintergrundsubtraktion - Tierstudie

Monoklonaler Antikörper

Ein monoklonaler Antikörper wurde hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das F(ab)&sub2;-Fragment wurde mit In-111 radioaktiv markiert, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die radiochemische Reinheit des markierten Antikörpers betrug 93% wie durch HPLC bestimmt.
Die immunchemische Reinheit des markierten Antikörpers wurde bestimmt als der Prozentanteil Antikörper-Radioaktivität, der in der Lage ist, sich an eine mit t-PA gekoppelte Sepharose -Säule (Pharmacia AB, Schweden) zu binden. Die immunchemische Reinheit des Konjugats war niedriger als die radiochemische Reinheit, da ein Teil des markierten Antikörpers immunologisch nicht-reaktiv war. Die immunologische Reinheit des Antikörpers betrug 91%.

t-PA

Der t-PA, der in den Experimenten verwendet wurde, war Actilyse , erhalten von Boehringer Ingelheim.

Versuchsanordnung

Zwei Kaninchen wurde der Antikörper in vergleichbarer Dosis/kg zu den in Beispiel 2 erwähnten Humanstudien und spezifischer Radioaktivität, intravenös injiziert.
Kaninchen 1 erhielt Antikörper bei t = 0 Minuten. Kein t-PA wurde anschließend verabreicht. Kaninchen 2 erhielt Antikörper bei t = 0 Minuten. Bei t = 120 Minuten erhielt Kaninchen 2 eine intravenöse Injektion von t-PA, verabreicht über einen Zeitraum von 1 Minute. Die injizierte Menge t-PA lag in 3 x molarer Konzentration des verabreichten Antikörpers vor.

Plasmaaktivität

Blutproben wurde genommen bei t = 0, 10, 20, 40, 60 min. und 2, 4, 6, 12 und 24 Stunden nach der Antikörper-Injektion. Bei Kaninchen 2 wurden zusätzliche Proben 5, 10, 20, 40 und 60 min. nach Injektion von t-PA genommen.
Für jede Probe wurde die Vollplasmaaktivität gezählt und durch Regressionsanalyse (Freelance Plus ver 3.01 ) wurden diese Daten auf eine exponentielle Kurve eingestellt und die biologische Gesamtwertszeit wurde berechnet. Alle dargestellten Kurven wurde auf physische Zersetzung korrigiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 15 dargestellt.
T½ des Antikörpers betrug 10,3 h.
Als t-PA bei t = 2 Stunden zugegeben wurde, wurde eine dramatische Abnahme in der Plasmaaktivität beobachtet. Innerhalb 10 min. wurde eine 92%ige Verringerung beobachtet.
Die biologische Halbwertszeit des radioaktiv markierten immunreaktiven Antikörpers im Plasma wurde als die Halbwertszeit der t-PA-Bindungsaktivität bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 16 dargestellt.
Innerhalb 10 Minuten nach der Injektion von t-PA bei t = 2 Stunden wurden mehr als 99% der immunreaktiven Antikörperaktivität aus dem Plasma eliminiert. Die Halbwertzeit dieser Eliminierung beträgt 1 Minute. Ein leichter Anstieg in der Aktivität - bis zu 1,6% - ist in den Stunden nach der anfänglichen Eliminierung zu sehen. Dies wird unzweifelhaft durch Neuverteilung des extravaskulären Antikörperpools verursacht.

Vollkörperaktivität

Nach 24 Stundenwurden die Kaninchen geopfert. Vollkörperszintigramme der Kaninchen wurden erhalten. Die Ergebnisse sind Fig. 17 dargestellt. Nicht mit t-PA komplexierter Antikörper wurde hauptsächlich in den Nieren lokalisiert, wohingegen mit t-PA komplexierter Antikörper fast ausschließlich in der Leber gefunden wurde. Aus diesen Experimenten zeigt sich, daß t-PA/Anti-t-PA-MoAb-Komplexe eine beträchtlich kürzere Halbwertszeit im Organismus haben als Anti-t-PA allein. Außerdem zeigen die Experimente, daß es möglich ist, die schnelle t-PA/Anti-t-PA-MoAb-Clearance in vivo auszunutzen. Die Ergebnisse der Studie legen nahe, daß der Leber-t-PA-Rezeptor für diesen Anstieg in der Antikörper-Clearance verantwortlich ist.
Der Abfall in der Gesamtradioaktivität ist ein wesentlicher Parameter für die Abbildung, indem die Gesamtplasmaaktivität das Ziel/Blut-Verhältnis entscheiden wird. Die Verringerung in der t-PA-Bindungsradioaktivität ist ein Maß für die in- vivo-Effizienz des Rezeptor-Eliminierungsweges. Die Abnahme in der Gesamtradioaktivität wird geringer sein als die Verringerung in der t-PA-Bindungsradioaktivität, sofern das Konjugat nicht 100% immunchemisch aktiv ist.

BEISPIEL 4

Biologische Hintergrundsubtraktion - Humanstudie

Eine 77 Jahre alte Frau wurde wegen deutlichen Ödem des rechten Beines ins Krankenhaus aufgenommen. Eine akute Kontrastphlebographie ergab Anzeichen einer Thrombose in einer der seitlichen Schenkelvenen des rechten Beines. Szintigraphie wurde unter Verwendung eines radioaktiv markierten monoklonalen Antikörpers, der wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, durchgeführt. Die radiochemische Reinheit betrug nur 67%.
Eine Stunde nach Injektion des radioaktiv markierten Antikörpers wurden 5 mg t-PA (Actilyse Boehringer Ingelheim) injiziert.

Plasmaaktivität

Blutproben wurden in regelmäßigen Intervallen nach der t-PA- Injektion genommen. Für jede Probe wurde die Vollplasmaradioaktivität in einem Vertiefungs-Gammazähler gezählt und gegen die Zeit aufgetragen (Fig. 18). Exponentielle Regressionsanalyse wurde auf Freelance Plus ver 3.01 durchgeführt. T½ der Initialphase betrug 4,8 h. Nach t-PA- Injektion wurde eine beträchtliche Abnahme in der Plasmaaktivität beobachtet, innerhalb 17 Min. wurde eine 50%ige Verringerung beobachtet.

Szintigraphie

Bioverteilung:

Während der t-PA-Injektion wurde eine dynamische Acquisition der Leber- und Herzregion auf der Gamma-Kamera mit 60 Frames durchgeführt, der jeder 15 sec. dauerte. Aktivität des Blutes (Herzregion) und der Leber wurden berechnet und gegen die Zeit aufgetragen. Die Verschiebung in der Verteilung von der zirkulierenden Blutaktivität zur gebundenen Leberaktivität im Anschluß an die Injektion ist in Fig. 19 klar nachgewiesen.

Thrombus-Nachweis:

Anfänglich wurden Anzeichen von Stauung im unteren Bein enthüllt. Die präzise Lokalisierung des Thrombus konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Nach der t-PA-Injektion nahm die Aktivität im erweiterten Gefäßbett ab und der Thromhusbereich wurde nachgewiesen (Fig. 20).
Die biologische Hintergrundsubtraktion scheint die Abbildungstechnik zu verbessern, was es möglich macht, die Thrombose innerhalb weniger Stunden nachzuweisen.

Claims

1. Diagnostisches Reagenz für den Nachweis in vivo erhöhter Freisetzung eines fibrinolytischen Enzyms oder erhöhter fibrinolytischer Aktivität im menschlichen oder tierischen Körper, wobei das Reagenz einen mit einem fibrinolytischen Enzym reaktiven Antikörper oder ein Fragment besagten Antikörpers, markiert mit einer Substanz, die den Nachweis in vivo der Bindung des Antikörpers an das fibrinolytische Enzym erlaubt, umfaßt.

2. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 1, wobei das fibrinolytische Enzym ausgewählt ist aus Gewebe- Plasminogenaktivator (t-PA), Plasmin, Plasminogen oder einem Analog derselben oder einem modifizierten fibrinolytischen Enzym mit Affinität für Fibrin (wie etwa modifizierter Urokinase).

3. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 2, wobei das fibrinolytische Enzym t-PA oder ein Analog desselben ist.

4. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 3, wobei das fibrinolytische Enzym nativer t-PA ist.

5. Diagnostische- Reagenz nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein monospezifischer Antikörper oder ein Fragment desselben ist.

6. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment desselben ist.

7. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 6, wobei der monoklonale Antikörper einer ist, der mit t-PA oder einem Analog desselben reaktiv ist.

8. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 1, wobei die Substanz, die zum Markieren des Antikörpers verwendet wird, ein radioaktives Isotop ist.

9. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 8, wobei das radioaktive Isotop ausgewählt ist aus In-111, Tc-99m, I-131, I-123 und I-125.

10. Diagnostisches Reagenz nach einem der Ansprüche 1-9, das in einer zur parenteralen, nasalen, enteralen oder rektalen Verabreichung geeigneten Form vorliegt, wie etwa eine injizierbare Formulierung, Aerosolformulierung, Suspension oder Einlaufmittel.

11. Diagnostische Zusammensetzung, die, in separaten Behältern,

a) einen mit einem fibrinolytischen Enzym reaktiven Antikörper oder ein Fragment besagten Antikörpers, markiert mit einer Substanz, die Nachweis in vivo der Bindung des Antikörpers an das fibrinolytische Enzym erlaubt, und

b) ein fibrinolytisches Enzym, mit dem der Antikörper reaktiv ist,

umfaßt.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das fibrinolytische Enzym t-PA oder ein Analog desselben ist.

13. Verwendung eines mit einem fibrinolytischen Enzym reaktiven Antikörpers oder eines Fragments besagten Antikörpers, markiert mit einer Substanz, die den Nachweis in vivo der Bindung des Antikörpers oder des Fragments desselben an das fibrinolytische Enzym erlaubt, zur Herstellung eines diagnostischen Reagenz für den Nachweis in vivo erhöhter Freisetzung eines fibrinolytischen Enzyms oder erhöhter fibrinolytischer Aktivität im menschlichen oder tierischen Körper.

14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei das fibrinolytische Enzym ausgewählt ist aus Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA), Plasmin, Plasminogen oder einem Analog derselben oder einem modifizierten fibrinolytischen Enzym mit Affinität für Fibrin.

15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das fibrinolytische Enzym t-PA oder ein Analog desselben ist.

16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das fibrinolytische Enzym nativer t-PA ist.

17. Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Antikörper ein monospezifischer Antikörper oder ein Fragment desselben ist.

18. Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment desselben ist.

19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei der monoklonale Antikörper einer ist, der mit t-PA oder einem Analog desselben reaktiv ist.

20. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Substanz, die zum Markieren des Antikörpers verwendet wird, ein radioaktives Isotop ist.

21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das radioaktive Isotop ausgewählt ist aus In-111, Tc-99m, I-131, I-123 und I-125.

22. Verwendung nach einem der Ansprüche 13-21, wobei der Antikörper als eine parenterale, nasale, enterale oder rektale Formulierung formuliert ist, wie etwa eine injizierbare Formulierung, Aerosolformulierung, Suspension oder Einlaufmittel.