DE68929306T2 - H-Phosphonat Ribonucleotid-Derivate - Google Patents

H-Phosphonat Ribonucleotid-Derivate

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DE68929306T2 DE1989629306 DE68929306T DE68929306T2 DE 68929306 T2 DE68929306 T2 DE 68929306T2 DE 1989629306 DE1989629306 DE 1989629306 DE 68929306 T DE68929306 T DE 68929306T DE 68929306 T2 DE68929306 T2 DE 68929306T2
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Description

  • Die Erfindung betrifft neue Zwischenverbindungen zur Herstellung von 2'-O-Methylribooligonucleotidphosphorthioat- Derivaten, 2'-O-Methylribooligonucleotid-Derivaten und Oligoribonucleotid-Derivaten, welche die Vermehrung des AIDS-Virus (HIV-1, HIV-2, usw.), das AIDS (erworbenes Immunschwächesyndrom) verursacht, hemmen können, um das AIDS-Virus avirulent zu machen, und die eingesetzt werden können für Medikamente, bspw. für Antivirusmittel wie Anti-AIDS-Medikamente oder dergleichen.
  • AIDS (erworbenes Immunschwächesyndrom) ist seit 1981 bekannt. Es wird vom HIV (dem menschlichen Immunschwächevirus, nachstehend einfach als AIDS-Virus bezeichnet) verursacht, das zur Familie der Retroviren gehört. Die Patientenzahl steigt jährlich weltweit an. Nach dem Bericht der WHO lag am 31. August 1988 die weltweite Anzahl an Patienten bei über 110000. Japan berichtet von 90 Patienten (S-)and: 31. August 1988). Falls man außerdem Träger hinzurechnet, die mit dem Virus infiziert sind; jedoch bisher kein AIDS entwickeln, liegt die Anzahl an Patienten auf der Welt (von der WHO geschätzt) über 10000000 und beträgt 1048 in Japan (wie vom Ministerium für Gesundheit und Soziales am 31. August 1988 bekanntgegeben). Bisher ist noch kein Medikament entdeckt worden, mit dem sich AIDS, eine schwere Erkrankung, vollständig heilen läßt. 3'- Desoxy-3'-azidothymidin (nachfolgend einfach als "AZT" bezeichnet) wird im klinischen Bereich als Medikament verwendet, um das Fortschreiten von AIDS zu verzögern und das klinische Syndrom des Patienten zu bessern. Man kennt jedoch Nebenwirkungen, bspw. Schädigung des Knochenmarks usw., die mit seiner Wirksamkeit einhergehen (vgl. The New England Journal of Medicine 317 192-197, 1987). Der Mechanismus von AZT beruht auf der Hemmung der Aktivität der Reversen Transkriptase, die das Retrovirus selbst besitzt. Sie transkribiert nach Eindringen des Virus in die Wirtszelle seine genomische RNA in DNA (Mitsuya, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7096-7100, 1985). Der Mechanismus hängt voraussichtlich mit den Nebenwirkungen zusammen.
  • Phosphorthioat-Derivate von Desoxyoligonucleotiden weisen eine Anti-AIDS-Virusaktivität auf (s. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7706-7710, 1987).
  • Das AIDS-Virus besitzt hinsichtlich seines Hüllproteins äußerst häufige Variationen in seinen Stämmen. Es ist daher sehr schwierig, einen wirksamen Impfstoff und chemotherapeutische Mittel zu entwickeln, die wie oben beschrieben erwünscht sind. Nucleozido-Derivate wie AZT, die gewöhnlich als chemotherapeutische Mittel verwendet werden, weisen einerseits Anti-AIDS-Virusaktivität auf, andererseits haben sie jedoch schwere Nebenwirkungen. Wünschenswerterweise werden demnach Medikamente entwickelt, die minimale Nebenwirkungen und hohe Praktikabilität besitzen. Zu diesem Zweck befinden sich die Desoxyoligonucleotidphosphorthioat-Derivate im Stadium der Grundlagenforschung. Es wird jedoch erwünscht, Medikamente mit einer stärkeren Wirkung zu entwickeln, und diese billig bereitzustellen.
  • Intensive Forschung der Erfinder zur Lösung der genannten Probleme ergab, daß neu hergestellte 2'-O-Methyloligoribonucleotid-Derivate und Oligoribonucleotid-Derivate die Infektion von und die Vermehrung des AIDS-Virus in Wirtszellen hemmen können und als Medikamente für die Behandlung von AIDS angewendet werden können. Sie haben aufgrund dieses Befundes die vorliegende Erfindung gemacht.
  • Die Erfindung betrifft 2'-O-ethylribonucleosid-3'-(H- phosphonat)-Verbindung, die für eine Verwendung zur Oligonucleötidsynthese geschützt ist, wobei die Nucleosidbase Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin oder Hypoxanthin ist, sowie 3'-O-Methylribonucleosid-2'-(H-phosphonat)-Verbindung, die für eine Verwendung zur Oligonuleoctidsynthese geschützt ist, wobei die Nucleosidbase Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin oder Hypoxanthin ist.
  • Die Verbindungen können eingesetzt werden zur Herstellung von neuen Oligoribonucleotid-Derivaten gemäß nachstehender allgemeiner Formel (1) und als wirksamer Inhaltsstoff für Anti-AIDS-Virus - Zusammensetzungen;
  • von neuen 2'-O-Methyloligoribonucleotidphosphorthioat- Derivaten mit einer Sequenz, die zum RNA-Gen des AIDS-Virus (HIV-1, HTV-2, usw.) oder zur ins Chromosom integrierten DNA komplementär ist, dargestellt von der nachstehenden allgemeinen Formel (2), und die eingesetzt werden kann in Anti-AIDS-Virus- Zusammensetzungen als wirksamer Inhaltsstoff;
  • von neuen 2'-O-Methyloligoribonucleotid-Derivaten gemäß nachstehender allgemeiner Formel (3), die in Anti-AIDS-Virus- Zusammensetzungen als wirksamer Inhaltsstoff eingesetzt werden können; und
  • von neuen Oligoribonucleotid-Derivaten gemäß nachstehender allgemeiner Formel (4), die in Anti-AIDS-Virus-Zusammensetzungen als wirksamer Inhaltsstoff eingesetzt werden können. Allgemeine Formel (1)
  • wobei:
  • m eine ganze Zahl von 1-100 ist (vorausgesetzt, X&sub1; und X&sub2; sind alle in der 2'-Stellung substituiert, stehen für ein Wasserstoffatom und m ist eine ganze Zahl von 4 bis 50)
  • B B&sub2;, B5,...... B(m+1) darstellt; und B&sub1; bis B(m+2), die gleich oder verschieden sein können, jeweils einen der Reste Hypoxanthin-9-yl, Guanin-9-yl, Adenin-9-yl, Cytosin-1-yl, Uracil-1-yl bzw. Thymin-1-yl darstellen, vorausgesetzt, sind X&sub1; und alle X in der 3'-Stellung substituiert und stehen für ein Wasserstoffatom, dann sind sie nicht alle Adenin-9-yl);
  • Q Q&sub2;, Q&sub3;,..... Q(m+1) darstellt, und Q&sub1; bis Q(m+1) unabhängig voneinander ein Thioanion, ein Oxoanion, eine Alkylgruppe, eine Aryloxygruppe, eine Alkylaminogruppe, eine Arylaminogruppe, eine Alkylthiogruppe bzw. eine Arylthiogruppe darstellen (mit der Maßgabe, daß zumindest einer der Reste aus Q&sub1; bis Q(m+1) ein Thioanion darstellt);
  • X X&sub2;, X&sub3;, ..... X(m+1) darstellt, und X&sub1; bis X(m+1), die gleich oder verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Acylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen darstellen;
  • R ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, eine Phosphorylgruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten besitzen kann, eine Thiophosphorylgruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten besitzen kann, oder eine Alkylaminophosphorylgruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten besitzen kann, darstellt; und
  • Y&sub1; und Y&sub2; unabhängig voneinander eine Methoxygruppe, eine Carboxylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, eine Alkyloxygruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten haben kann, eine Phosphoryloxygruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten haben kann, eine Thiophosphoryloxygruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten haben kann, und eine Alkylaminophosphoryloxygruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten haben kann, darstellen. Das Alkyl stellt hier einen gerad- oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen dar.
  • Das Aryl stellt einen Kohlenwasserstoffrest mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen einschließlich einer Phenylgruppe dar.
  • In der oben beschriebenen Formel (1) ist X an ein Sauerstoffatom in der 2'- oder der 3'-Stellung im Zuckerrest gebunden. In diesem Fall ist der jeweils andere mit dem Phosphoratom (P) verknüpft. Der Verknüpfungsmodus des Monomers mit dem Zuckerrest kann eine 2'-5'-Bindung sein oder eine 3'-5'-Bindung. Es können in einem Oligoribonucleotid auf beide Verknüpfungsmoden vorhanden sein.
  • Beispiele des Substituenten an R, Y&sub1; und Y&sub2; enthalten weiter in der oben beschriebenene Formel (1) eine Cyanethylgruppe, Chlorphenylgruppe, Monophosphorylgruppe, Pyrophosphorylgruppe, einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, eine Cholesterylgruppe und eine durch J-(K-O-L)E dargestellte Gruppe, die gleich oder verschieden sind: mit der Maßgabe, daß J:
  • eine Hydroxylgruppe oder eine der Oligoribonucleotidylgruppen darstellt, die für die Strukturformel des Derivates nach Anspruch 1 festgelegt sind, aus denen einer der Reste RO, Y&sub1; und Y&sub2; entfernt ist;
  • K eine Phosphorylgruppe, eine Thiophosphorylgruppe bzw. eine Alkylaminophosphorylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt;
  • L einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen darstellt; und
  • E eine ganze Zahl von 1 bis 10 darstellt.
  • Die Nucleotidsequenz muß nicht notwendigerweise zu der Sequenz genomischer RNA aus AIDS-Virus oder zu in Chromosomen integrierte DNA komplementär sein.
  • In der oben beschriebenen Formel sind B&sub1; bis B(m+2), Q&sub1; bis Q(m+1) und X&sub1; bis x vom 5'-Ende in der Reihenfolge 1, 2, 3, 4, ... (m+1) gezeigt. Ist z. B. m = 2, sind B&sub1; bis B(m+2) vom 5'Ende in der Reihenfolge B&sub1;, B&sub2;, B&sub3;, B&sub4;; Q&sub1; bis Q(m+1) sind vom 5'-Ende in der Reihenfolge Q&sub1;, Q&sub2;, Q&sub3;; und X, bis X(m+1) sind vom 5'-Ende in der Reihenfolge X&sub1;, X&sub2;, X&sub3;, siehe folgende Strukturformel:
  • Ist m = 100, sind B&sub1; bis B(m+2) ebenfalls in der Reihenfolge vom 5'-Ende B&sub1;, B&sub2;, B&sub3;, ... B&sub1;&sub0;&sub0; B&sub1;&sub0;&sub1; B&sub1;&sub0;&sub2;; Q&sub1; bis Q(m+1) sind vom 5'-Ende in der Reihenfolge Q&sub1;, Q&sub2;, Q&sub3;, ... Q&sub1;&sub0;&sub0;, Q; und X&sub1; bis X(m+1) sind vom 5'-Ende in der Reihenfolge X&sub1;, X&sub2;, X&sub3;, ... X&sub1;&sub0;&sub0;, X&sub1;&sub0;&sub1;, siehe folgende Strukturformel: Allgemeine Formel (2)
  • wobei:
  • m' eine ganze Zahl von 1 bis 50 ist;
  • B' 1 bis B'(m'+2) die gleich oder verschieden sein können, jeweils einen der Reste Adenin-9-yl (A), Guanin-9-yl (G), Cytosin-1-yl (C), Uracil-1-yl (U), Thymin-1-yl (T) bzw. Hypoxanthin-9-yl (H) darstellen.
  • Q'&sub1; ein Thioanion (S&supmin;) ein Oxoanion (O&supmin;), eine Alkylgruppe, eine Alkyloxygruppe, eine Aryloxygruppe, eine Alkylaminogruppe, eine Arylaminogruppe, eine Alkylthiogruppe bzw. eine Arylthiogruppe darstellt;
  • wobei zumindest einer der Reste Q'&sub2; bis Q'(m'+1) ein Thioanion (S&supmin;) darstellt und durch entweder ein Thioanion oder ein Oxoanion (O&supmin;) ausgeglichen wird;
  • Y'&sub1; bis Y'&sub3; unabhängig voneinander eine Methoxygruppe, eine Alkyloxygruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten haben kann, eine Hydroxylgruppe, eine Alkylsilylgruppe und ein Wasserstoffatom darstellen;
  • R' ein Wasserstoffatom, eine Phosphorylgruppe oder eine Thiophosphorylgruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten haben kann, darstellt. Das Alkyl stellt hier einen gerad- oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen dar und das Aryl stellt einen Kohlenwasserstoffrest mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen einschließlich einer Phenylgruppe dar. Beispiele der Substituenten sind u. a. eine Cyanethylgruppe, Chlorphenylgruppe und ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen.
  • In der oben beschriebenen Formel sind B' und Q' in der Reihenfolge 1, 2, 3, 4, ...(m'+2) gezeigt. Ist beispielsweise m' = 2, sind B'&sub2; bis B'(m+1) in der Reihenfolge vom 5'-Ende B'&sub2;, B'&sub3;; Q'&sub2; bis Q'(m+1) sind in der Reihenfolge vom 5'-Ende Q'&sub2;, Q'&sub3;, siehe folgende Strukturformel:
  • Ist m' 50, sind B'&sub2; bis B' (m'+1) ebenfalls in der Reihenfolge vom 5'-Ende B'&sub2;, B'&sub3;, B'&sub4;, ... B'&sub5;&sub0;, B'&sub5;&sub1;; Q'&sub2; bis Q'(m'+1) sind in der Reihenfolge vom 5'-Ende Q'&sub2;, Q'&sub3;, Q4, ... Q'&sub5;&sub0;, Q'&sub5;&sub1;, siehe folgende Strukturformel: Allgemeine Formel (3)
  • wobei:
  • m" eine ganze Zahl von 1 bis 50 ist;
  • B"1 bis B"(m"+2), die gleich oder verschieden sein können, jeweils einen der Reste Adenin-9-yl (A), Guanin-9-yl (G), Cytosin-1-yl (C) Uracil-1-yl (U), Thymin-1-yl (T) bzw. Hypoxanthin-9-yl (H) darstellen;
  • Q" zumindest ein Thioanion enthält, und ein Thioanion (S&supmin;) ein Oxoanion (O&supmin;), eine Alkylgruppe, eine Alkyloxygruppe, eine Aryloxygruppe, eine Alkylaminogruppe, eine Arylaminogruppe, eine Alkylthiogruppe bzw. eine Arylthiogruppe darstellt;
  • Y"&sub1; bis Y"&sub3; unabhängig voneinander eine Methoxygruppe, eine Alkyloxygruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten haben kann, eine Hydroxylgruppe, eine Alkylsilylgruppe bzw. ein Wasserstoffatom darstellen;
  • R" ein Wasserstoffatom oder eine Phosphorylgruppe darstellt, die gegebenenfalls einen Substituenten haben kann.
  • Das Alkyl stellt hier einen gerad- oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen dar, und das Aryl stellt einen Kohlenwasserstoffrest mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen einschließlich einer Phenylgruppe dar. Beispiele des Substituenten sind u. a. eine Cyanethylgruppe, Chlorphenylgruppe und ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Die Nucleotidsequenz muß nicht notwendigerweise zu der Sequenz genomischer RNA aus AIDS-Virus oder zu in Chromosomen integrierter -DNA komplementär sein. Allgemeine Formel (4)
  • wobei:
  • m''' eine ganze Zahl von 1 bis 100 ist (vorausgesetzt, X'&sub1; und X' sind alle in der 2'-Stellung substituiert, stehen für ein Wasserstoffatom und m ist eine ganze Zahl von 4 bis 50);
  • B''' B'''&sub2;, B'''&sub3;, ..... B'''(m'''+1) darstellt, mit der Maßgabe, daß nicht alle von ihnen Adenin-9-yl darstellen; und B''' &sub1; bis (m'''+2)' die gleich oder verschieden sein können, jeweils einen der Reste Hypoxanthin-9-yl, Guanin-9-yl, Adenin-9-yl, Cytosin-1-yl, Uracil-1-yl bzw. Thymin-1-yl darstellen;
  • Q''' Q'''&sub2;, Q'''&sub3; .....Q'''(m'''+1) darstellt, und mindestens einer der Reste Q'''1 bis Q'''(m'''+1) ein Thioanion darstellt.
  • Q'''&sub1; bis Q'''(m'''+1) stellen unabhängig voneinander ein Thioanion, ein Oxoanion, eine Aryloxygruppe, eine Alkylaminogruppe, eine Arylaminogruppe, eine Alkylthiogruppe bzw. eine Arylthiogruppe dar;
  • X' X'&sub2;, X'&sub3;, ..... X'(m'''+1) darstellt, und K'&sub1; bis X'(m'''+1) die gleich oder ungleich sein können, jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe darstellen (vorausgesetzt, sind alle X'&sub1; bis X'(m'''+1) in der 2'-Stellung substituiert, so sind nicht alle eine Methylgruppe);
  • R''' ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und eine Phosphorylgruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten besitzen kann, darstellt; und
  • und Y'''&sub2; unabhängig voneinander eine Methoxygruppe, eine Carboxylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, eine Alkyloxygruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten besitzen kann, eine Hydroxylgruppe, eine Alkylsilylgruppe, ein Wasserstoffatom, bzw. eine Phosphorylgruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten haben kann, darstellen.
  • Das Alkyl stellt hier einen gerad- oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen und das Aryl einen Kohlenwasserstoffrest mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen einschließlich einer Phenylgruppe dar. Beispiele des Substituenten sind u. a. eine Cyanethylgruppe, Chlorphenylgruppe und einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen.
  • In der oben beschriebenen Formel bedeuten die Sauerstoffatome in der 2'-Stellung und in der 3'-Stellung im Zuckerteil des Nucleosidmonomers, ist eines X', dass das andere an das Phosphoratom (P) gebunden ist. Der Bindungsmodues des Monomers am Zuckerteil ist entweder eine 2'-5'-oder eine 3'-5'-Bindung. Es können auch beide Bindungsformen in einem Oligoribonucleotid vorliegen.
  • Die Nucleotidsequenz muss nicht notwendigerweise zu der Sequenz genomischer RNA aus AIDS-Virus oder zu in Chromosomen integrierter DNA komplementär sein.
  • Die Nucleosidbase (oder die geschützte Nucleosidbase) der 2'-O-Methylribonucleosid-3'-(H-phosphonat)-Verbindung oder der 3'-O-Methylribonucleosid-2'-(H-phosphonat)-Verbindung gemäß der Erfindung ist ausgewählt aus
  • Die 5'-OH-Gruppe der 2'-O-Methylribonucleosid-3'-(H- phosphonat)-Verbindung oder der 3'-O-Methylribonucleosid-2'-(H- phosphonat)-Verbindung gemäß der Erfindung kann geschützt sein durch eine Monomethoxytrityl-Schutzgruppe oder eine Dimethoxytrityl-Schutzgruppe.
  • Die 2'-O-Methylribonucleosid-3'-(H-phosphonat)-Verbindung hat die allgemeine Formel (5) Die Nucleoside haben die allgemeine Formel (6)
  • Sie können zusammen mit den Methytrebionucleosid- Verbindungen gemäß der Erfindung verwendet werden.
  • In den allgemeinen Formeln (5) und (6) stellt W eine Monomethoxytritylgruppe oder eine Dimethoxytritylgruppe dar; Y&sub4; stellt eine Methoxygruppe, eine Alkyloxygruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten haben kann oder ein Wasserstoffatom dar; n und t, die verschieden oder unabhängig voneinander sein können, stellen jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 30 dar; (P) stellt ein Regelporen-Glasderivat, ein Polystyrolderivat oder ein Silikagelderivat dar; und Z stellt einen Substituenten dar, der durch eine der unten stehenden allgemeinen Formeln dargestellt wird:
  • Die Kohlenstoffatomanzahl des Alkylanteils in der Alkyloxygruppe ist 1 bis 10. Beispiele der Alkyloxygruppe mit einem Substituenten sind u. a.:
  • usw.
  • Zur Antiviruswirkung des Oligodesoxynucleotids wird ein Beispiel der Verwendung von Oligodesoxynucleotid für die Hemmung der Vermehrung von Rous-Sarkoma-Virus beschrieben, ohne daß es in irgendein Derivat umgewandelt wird. (Zamecnik, P. C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 280-284, 1978). Das Oligodesoxynucleotid zersetzt sich dagegen wie beschrieben schnell in Kulturen von Säugetierzellen, Zellextrakten oder Seren wird (Wickstrom, E., Journal of Biochemical and Biophysical methods, 13, 97-102, 1986). Um eine wirksamere Antivirusaktivität des Oligodesoxynucleotides zu erhalten, muß es wünschenswerterweise in nicht-zersetzbare Derivate umgewandelt werden. Derivate, die durch Umwandeln des Phosphodiesters im Oligodesoxynucleotid in Methylphosphonat erhalten werden, hemmen wie beschrieben die Vermehrung des Herpes-simplex-Virus vom Typ I (Smith, C. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2787-2791, 1986). Derivate, erhalten durch Umwandeln des Phosphordiesters im Oligodesoxynucleotid in Phosphorthioat, sind außerdem stabiler (S-)ein, C. A., Nucleic Acids Res., 16, 3209-3221, 1988). Diese Derivate hemmen die Proliferation des AIDS-Virus (Matsukura, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7706-7710, 1987). Die Antivirus- Aktivität wird zudem gegen das vesikuläre Stomatitis-Virus aus Rind durch Einbringen von Phosphorthioatderivaten in doppelsträngige poly-RNA oder einem Interferon-Induktor erhöht. (De Clercq, E. et al., Virology, 42, 421-428, 1970).
  • 2'-O-Methylribooligonucleotid nimmt dagegen bekanntlich die Struktur der 2'-Hydroxygruppe im Zuckerteil von methylierter RNA an. Es ist resistent gegenüber verschiedenen Enzymen (Nukleasen), die DNA oder RNA zersetzen (Gray, M. W. et al., Biochem. Biophys. Acta, 134, 243, 1967; Dunlap, B. E., et al., Biochemistry, 10, 2581-2587, 1971). Außerdem bildet 2'-O-Methylribooligonucleotid einen stabilen Duplex mit RNA, die dessen komplementäre Sequenz besitzt. Die Stabilität ist erheblich besser als die Stabilität von komplementärem DNA-RNA- Doppelstrang mit der gleichen Nucleotidsequenz (Inoue, H., et al. Nucleic Acids Res., 15, 6131-6148, 1987). 2'-O- Methylribooligonucleotid wird bekanntlich auch für stellenspezifisches Spalten von RNA verwendet, wobei man die Eigenschaft ausnutzt, daß es gegenüber Zersetzung durch RNase H resistent ist (Inoue, H. et al., FEBS Letters, 215, 327-330, 1987). Außerdem wird 2'-O-Methylribooligonucleotid verwendet, um eine unidirektionale DNA-Deletionsmutante zu erzeugen, wobei man die Eigenschaft ausnutzt, daß es gegenüber der DNase Bal31-Nuklease verglichen mit DNA sehr beständig ist (Mukai, S. et al., Nucleic Acids Symposium Series, Nr. 19, 117-120, 1988). Die vorangegangenen Befunde beruhen auf den Eigenschaften, daß 2'-O-Methylribooligonucleotid mit RNA einen stabilen Duplex bildet, die dessen komplementäre Nucleotidsequenz hat und gegenüber verschiedenen DNA- oder RNA-zersetzenden Enzymen (Nukleasen) beständig ist. Poly-2'-O-methylribooligonucleotid hemmt außerdem wie früher schon beschrieben das Fortschreiten von durch Retrovirus verursachten Krebs in Mäusen, wenngleich dessen Mechanismus vollkommen unbekannt war (Tennant, R. W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71. 3167-3171, 1974). Außerdem kann 2'-O-Methylribooligonucleotid wie ein Oligoribonucleotid hergestellt werden, wobei billigere Rohstoffe als bei Desoxyoligonucleotid verwendet werden.
  • Folgende Befunde sind gemäß jüngster Studien bezüglich der Struktur und der Eigenschaften des ATDS-Virus gemacht worden, d. h.: Das AIDS-Virus ist ein Retrovirus mit einzelsträngiger RNA von etwa 9000 Nucleotiden Länge als Gensubstanz und besitzt eine reverse Transkriptase. Seine Gen-Nucleotidsequenz (Primärstruktur) ist bereits beschrieben worden (Ratner et al., Nature 313, 277-284, 1985; Muesing, M. A. et al., Nature 313, 450-458, 1985; Sanchez-Pescador, R. et al., Science 227, 484-492, 1985; Wain-Hobson, S. et al.., Cell, 40, 9-17, 1985). Zielzellen der Infektion sind Helfer-/Induktorzellen, die als Oberflächenantigen unter den menschlichen Lymphozyten T4-(mit einem monoklonalen Antikörper nachgewiesenes Antigen)-positiv sind. Nach der Infektion verursachen sie cytopathische Wirkungen und zerfallen. Das Virus wechselt nach Adsorption an und Eindringen in die Zellen durch reverse Transkriptase, die es selber besitzt, unter Verwendung von tRNALys als Primer in lineare doppelsträngige Virus-DNA, wandert in den Kern, nimmt eine zirkuläre Struktur an und wird in die chromosomale Wirtszell-DNA integriert. Es entsteht so ein Provirus. Das Provirus wird von einer zellabstammenden RNA-Polymerase II wie messenger-RNA (nachstehend einfach als mRNA bezeichnet) von Wirtszellen transkribiert. Dadurch wird das Provirus in Virusprotein translatiert. Dieser Vorgang wird durch mindestens zwei Genprodukte reguliert, d. h. tat (Transaktivator) und rev (Regulator der Expression von Virionproteinen), die vom Virus selbst codiert werden. Tat wirkt als transkripbionsaktivierender Faktor für das Virus auf den Bereich, der als TAR-Element (transwirkendes reagierendes Element) bezeichnet wird, unmiatelbar hinter der Transkriptionsinitiationsstelle (Rosen, C. A. et al., Cell 41, 813-823, 1985). Die transkribierte Virus-RNA wird teilweise zu genomischer RNA, die in das Virion eingekapselt wird, und wird in einigen Fällen als mRNA für die Genexpression verwendet. Es liegen mehrere mRNA- Sorten vor; RNA voller Länge für die Expression von Virus- Antigen und reverser Transkriptase, mRNA für die Expression von Hüll-Glykoprotein, die durch einmaliges Spleißen verkürzt wird, mRNA, die zudem für die Expression von Genen wie tat, rev, usw. durch mindestens zweimaliges Spleißen verkürzt wird, und dergleichen.
  • Die mithilfe der erfindungsgemäßen Verbindungen hergestellten Oligonucleotide hemmen wirksam die Infektion und die Vermehrung des AIDS-Virus, indem der Phosphatteil weiter derivatisiert wird und man die Vorteile von 2'-O-Methylribobligonucleotid und Oligoribonucleotid ausnutzt. Die Hemmwirkung liegt klar in der Bindungsart der 3'-5'-Bindung im Monomer dieser Oligomere, d. h. 3'-O-Methylnucleosid kann ihr Bestandteil sein. Das Monomer des Oligomermoleküls enthält somit die 3'-5'-Bindung des Zuckers. Ferner kann die 2'- Hydroxygruppe vollständig oder teilweise methyliert oder acyliert sein. Der Zucker an den 3'- und 5'-Termini des Oligonucleotids kann gegebenenfalls einen Substituenten haben, wie in den allgemeinen Formeln (1) bis (4) gezeigt.
  • Die mithilfe der erfindungsgemäßen Verbindungen hergestellten Oligonucleotide liegen in einer Form vor, bei der das Phosphat in dem Oligomer derivatisiert ist, s. oben. Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, daß die Derivate, die eine Thiophosphatbindung enthalten, besonders wirksam sind. Die Thiophosphatbindung ist nicht für alle Phosphordiesterbindungen in dem Oligomermolekül notwendig. Die Hemmwirkung kann in jedem Fall hervorgerufen werden, wenn diese Nucleotidsequenzen zu denen von genomischer RNA für das AIDS-Virus oder in das Chromosom integrierter DNA komplementär sind, und wenn die Nucleotidsequenzen nicht nötigerweise komplementär sind.
  • Das Oligomer mit einer komplementären Sequenz hat bevorzugt einen Bereich zum Ziel, der bei Virusgenen eine wichtige Rolle spielt. Verbindung VI, Verbindung VII, Verbindung VIII, Verbindung IX und Verbindung XII in den Bespielen sind alles Sequenzen, die komplementär sind zu dem Bereich mit der Nucleotidequenz:
  • 5' U U U A U C C A U U U U C A G A A U U G G G U C U 3',
  • der nach Position 5300 (die Transkriptionsinitiationsstelle wird als erste Position gezählt) genomischer Virus-RNA oder mRNA vorliegt, und dem Bereich, in dem Spaltung und Ligierung des ersten Spleißens der mRNA auftreten,. Man erwartet, daß durch dessen Hemmung die Expression von Hüllprotein- oder Genen wie tat, rev usw. gehemmt wird. Außerdem ist Verbindung X in den Beispielen komplementär zu der Nucleotidsequenz:
  • 5ºC A G U G G C G C C C G A A C A G G G A C 3'
  • mit der Primer-tRNA-Bindungsstelle in dem Bereich für die Initiation der reversen Transkription genomischer Virus-RNA. Folglich kann man die Hemmung der Transkriptionsinitiation, die die erste Stufe bei der Replikation von Virusgen ist, erwarten.
  • Außerdem ist Verbindung X&sub1; in den Beispielen komplementär zu einer Nucleotidsequenz im TAR-Element, bei dem das tat- Produkt:
  • 5ºC A G A U C U. G A G C C U G G G A G C U C 3'
  • am 5'-Terminus von genomischer Virus-RNA oder mRNA wirkt. Sämtliche Derivate zeigen eine starke Anti-AIDS-Virus- Aktivität. Der Mechanismus auf die Aktivität ist jedoch experimentell noch nicht eingehend bewiesen.
  • Oligodesoxynucleotid-Derivate, die nicht komplementär zur Nucleotidsequenz von genomischer AIDS-Virus-RNA oder in Chromosomen integrierter DNA sind, sind dagegen wie die Komplementärderivate ebenfalls aktiv gegen AIDS-Virus, siehe Veröffentlichungen, die sich mit der Anti-AIDS-Virus-Aktivität unter Verwendung von Oligodesoxynucleotid-Derivaten beschäftigen (vgl. Matsukura, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7706-7710, 1987; Agrawal, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7709-7083, 1988)
  • Dagegen zeigen die durch die allgemeinen Formeln (1), (3) und (4) dargestellten erfindungsgemäßen Verbindungen, die mit billigeren Rohstoffen als bei Oligodesoxynucleotid- Derivaten erzeugt werden können, Anti-AIDS-Virus-Aktivität, obwohl diese Verbindungen nicht notwendigerweise zu der Nucleotidsequenz von genomischer ATDS-Virus-RNA oder in das Chromosom integrierter -DNA komplementär sind.
  • Die Verbindungen XV, XVII, und XVIII in den Beispielen, unter anderem Verbindungen gemäß allgemeiner Formel (3), besitzen antivirale Aktivität, wenngleich diese Verbindungen nicht komplementär sind zur Nucleotidsequenz von genomischer AIDS-Virus-RNA oder in das Chromosom integrierter -DNA.
  • Andererseits haben mithilfe der erfindungsgemäßen Verbindungen hergestellte Oligönugleotide niedrigere Molekulargewichte als die hochmolekulargewichtigen doppelsträngigen RNA, die als starker Interferon-Induktor bekannt ist (s. Lanpson, G. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58, 782, 1967; Field, A. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58, 1004, 1967) und Derivaten davon (DeClercg, E. et ah, Virology, 42, 421-428, 1970). Die Verbindungen sind klar verschieden von 2'-5'-OligoA, das gänzlich aus Adenosinen zusammengesetzt ist, die 2'-5'-Bindung enthält und ein Proteinsynthese-Hemmstoff ist, der in mit Interferon behandelten Zellen gefunden wird, (vgl. Kerr, I. M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 256, 1978) und Derivaten davon.
  • Die mithilfe der erfindungsgemäßen Verbindungen hergestellten Oligoribonucleotid-Derivate können durch bekannte Verfahren wie dem Amidit-Verfahren (vgl. Matteucci, M. D. et al., Tetrahedron Lett., 22, 719, 1980), dem H-Phosphonat- Verfahren (vgl. Froehler, B. C. et ah, Tetrahedron Lett. 27 469, 1986; Garegg, P. J. et al., Tetrahedron Lett., 27, 4055, 1986) und dergleichen hergestellt werden. Die durch die allgemeine Formel (5) dargestellten 2'-O-Methylribonucleotid-Derivate, die als Rohstoffe für die Erzeugung der 2'-O-Methylribooligonucleotid-Derivate nach dem H-Phosphonat-Verfahren bereitgestellt werden können, können hergestellt werden, indem man zu den geschützten 2'-O-Methylribonucleosid-Derivaten nach bekannten Verfahren (vgl. Robins, M. J. et al., J. Org. Chem. 39, 1891, 1974; Heikkila, J. et al.., Acta Chem Scand., B 36, 715, 1982; Inoue, H. et al., Nucleic Acids Research 15, 6131, 1987) Phosphortrichlorid leitet und mit diesem nach bekannten Verfahren umsetzt (vgl. Froehler, B. C. et al., Tetrahedron Letters, 27, 469-427, 1986; Garegg, P. J. et al., Tetrahedron Letters, 27, 4051-4054, 1986). Nach diesem Verfahren wurden die Verbindungen I, II, III, IV und V unten hergestellt.
  • wobei DMT und MMT die Dimethoxytritylgruppe bzw. die Monomethoxytritylgruppe darstellen.
  • Ferner können die durch die allgemeine Formel (5) dargestellten 2'-O-Methylribonucleotid-Derivate ebenfalls durch Umsetzen der geschützten 2'-O-Methylribonucleosid-Derivate mit Phosphorsäure in Gegenwart eines Kondesationsmittels wie Triisopropylbenzolsulfonylchlorid oder Pivaloylchlorid durch bekannte Verfahren (vgl. Hata, T. et al., J. Am. Chem. Soc., 96, 7363, 1974; Sekine, M. et al., Tetrahedron Letters, 29, 1037-1040, 1988) erzeugt werden. Außerdem werden die geschützten 3'-O-Methylnucleosid-Derivate nach bekannten Verfahren hergestellt (vgl. Robins, M. J. et al., J. Org. Chem., 39, 1891, 1974; Heikkila, J. et ah, Acta Chem. Scand., B36, 715, 1982), und die Derivate können in die 3'-O-Methylnucleosid-H-Phosphonat-Derivate nach dem oben beschriebenen Verfahren umgewandelt werden. Diese können als Rohstoffe zur Herstellung der durch die allgemeinen Formeln (1) und (4) dargestellten Oligoribonucleotid-Derivate bereitgestellt werden.
  • Die Rohstoffe für die Herstellung der durch die allgemeinen Formeln (1) und (4) dargestellten Oligoribonucleotid-Derivate sind, wobei alle oder einige der durch X&sub1; - Xm+1 oder X'&sub1; - X'm'''+1 gezeigten Substituenten, Wasserstoff sind, z. B. geschützte 2'- (oder 3')-O-(tert.-Butyldimethylsilyl) ribonucleoside, die leicht durch ein bekanntes Verfahren hergestellt werden können (Ogilvie, K.K., Can. J. Chem., 51. 3799, 1973); diese Derivate könijen ähnlich wie oben in die H-Phosphonat-Derivate umgewandelt werden.
  • Die durch die allgemeine Formel (6) dargestellten neuartigen Nucleosidderivate können z. B. durch ein bekanntes Verfahren (vgl. Miyoshi, K. et al., Nucleic Acids Res. 8, 5491, 1980) unter Verwendung der geschützten 3'-O-Methyl (3'-Oalkyl- oder 3'-desoxy)nucleoside hergestellt werden.
  • Mithilfe der neuen geschützten 2'-O-Methylribonucleotid- und 3'-O-Methylribonucleotid-Derivate gemäß der Erfindung und/oder der geschützten 2'(oder 3')-O-(tert.-Butyldimethylsilyl)ribo-nucleotid-Derivate und der neuartigen Nucleosid- Derivate, hergestellt nach mit vorgenannten Verfahren, können 2'-O-Methylribooligonucleotid-Derivate und Oligoribonucleotid- Derivate hergestellt werden, z. B. nach bekannten Verfahren (vgl. Froehler et al., Tetrahedron Letters 27, 469-472, 1986; Garegg, P. J. et al., Tetrahedron Letters 27, 4051-4054, 1986). Die Nucleotidderivatbestandteile sind somit nacheinander kondensierte neuartige Nucleosidderivate als Polymerträger, wobei Acylchlorid zur Kettenverlängerung dient. Dann wird unter Verwendung verschiedener Oxidationsmittel wie Schwefel (S&sub8;), Iod (12) oder eines Alkylamin/Tetrachlorkohlenstoff, usw. oxidiert, gefolgt von dem Entfernen der Schutzgruppe und Reinigen.
  • Ferner können die durch die allgemeinen Formeln (1), (2) und (4) dargestellten Verbindungen, wobei die durch Q, Q' und Q''' gezeigten Substituenten Thioanionen oder Thioanionen und Oxoanionen sind, und die durch die allgemeine Formel (3) dargestellten Verbindungen, ebenfalls nach dem Amidit-Verfahren hergestellt werden (vgl. Matteucci, M. D. et al., Tetraedron Lett. 22, 719, 1980; Shibahara, S. et al., Nucleic Acids Research 15, 4403, 1987; Usman, N. et al., J. Am. Chem. Soc. 109, 7845, 1987). In diesem Fall kann das Monomer mit (S&sub8;) oder Iod (12) in dem Oxidationsschritt nach der Kondensation oxidiert werden, und dann einer Kettenverlängerung unterzogen werden, gefolgt von Entfernen der Schutzgruppe und Reinigung.
  • Die Kettenverlängerung des Oligomers auf dem Polymerträger erfolgt ferner in den Verbindungen, die an ihrem 5'-Terminus, z. B. eine alkylsubstituierte Thiophosphorylgruppe, eine alkylsubstituierte Phosphorylgruppe oder eine alkylsubstituierte Alkylaminophosphorylgruppe enthalten, durch das vorstehend beschriebene Verfahren. Nach Beendigung der Oxidation wird das Oxidationsprodukt mit einem Alkyl-H- phosphonat kondensiert, und das Kondensationsprodukt wird mit Schwefel (S&sub8;), Iod (I&sub2;) oder einem Alkylamin/Tetrachlotkohlenstoff oxidiert, gefolgt von Entfernen der Schutzgruppe und Reinigung. Die Derivate, bei denen Cholesterin am 5'- Terminus über ein Zwischenstück gebunden ist, können ähnlich erhalten werden, indem man mit Mono (monomethoxytrityliertem)- alkandiol-H-phosphonat kondensiert, mit einer Säure behandelt, mit Cholesteryl-H-phosphonat kondensiert, oxidiert, die Schutzgruppen entfernt und reinigt.
  • Die Verbindungen, die z. B. eine Hydroxyalkylphosphoryloxygruppe oder eine Hydroxyalkylthiophosphoryloxygruppe an ihren 3'-Termini besitzen, können dagegen durch Kondensieren, Oxidieren, Entfernen der Schutzgruppe und Reinigen auf ähnliche Weise erhalten werden, wobei ein Polymerträger als Ausgangsstoff verwendet wird, an den ein Alkandiolmonosuccinat gebunden ist.
  • Die Anti-AIDS-Aktivität kann bestimmt werden durch das in einer Veröffentlichung beschriebene Verfahren (vgl. Harada, S. et al., Science, 229, 563-566, 1985) unter Verwendung von HTLV-IIIB (vgl. Popovic, M. et al., Science, 224, 497-500, 1984), einem isolierten AIDS-Virus-Stamm. Nach diesem Verfahren wird/werden MT-4-Zellen oder eine HTLV-I-positive Zellinie als Zielzelle verwendet. Dieses Verfahren reagiert daher stark sensititv auf virale Infektion und zeigt eindeutige cytopathische Wirkung. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde die Cytopathogen-Hemmwirkung mit den Verbindungen VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XV, XVI, XVII, XVIII, XXIII und XXIV bestimmt, nachdem jede Verbindung mit Medium auf verschiedene Konzentrationen verdünnt wurde. Daher wurde die Cytopathogen- Hemmwirkung und die Hemmung der Entwicklung von Zellen, die für virusspezifisches Antigen positiv sind, mit Verbindung VI in einer Konzentration von 10 uM, Verbindungen VII, X und XII in einer Konzentration von 15 uM und Verbindung VIII in einer Konzentration von 1 uM erhalten. Es wurde sogar bei der getesteten Höchstkonzentration von 120 uM keine Cytotoxizität nachgewiesen. Die Cytopathogen-Hemmwirkung und die Hemmung der Entwicklung von Zellen, die für virusspezifisches Antigen positiv sind, wurde dagegen mit Verbindung IX in einer Konzentration von 240 uM und mit Verbindung XI in einer Konzentration von 30 uM erhalten. In diesen Konzentrationen wurde keine Cytotoxizität nachgewiesen.
  • Diese Hemmwirkungen wurden ähnlich mit Verbindung XVI in einer Konzentration von 1 uM erhalten. Sie wurden jedoch mit Verbindung XV in einer Konzentration von 7,5 uM, mit Verbindung XVII in einer Konzentration von 15 uM und mit Verbindung XVIII in einer Konzentration von 120 uM erhalten. Es wurde sogar bei den Höchstkonzentration (60 uM mit den Verbindungen XV und XVI und 120 uM mit den Verbindungen XVII und XVIII) keine Cytotoxizität nachgewiesen.
  • Ferner hemmte die Verbindung XXIII das Cytopathogen vollständig in einer Konzentration von 3,8 uM bzw. das Auftreten von Zellen, die für virusspezifisches Antigen positiv sind, in einer Konzentration von 7,5 uM. Die Verbindung XXTV hemmte das Cytogathogen im wesentlichen vollständig in einer Konzentration von 7,5 uM, bzw. das Auftreten von Zellen, die für virusspezifisches Antigen positiv sind, in einer Konzentration von 30 uM. Es wurde sogar bei den getesteten Höchstkonzentration (60 uM) mit diesen Verbindungen keine Cytotoxizität nachgewiesen.
  • Die Cytopathogen-Hemmwirkung wurde dagegen mit Desoxyoligocytidinphosphorthioat (15mer) oder Desoxyoligonucleotid (Phosphat-Typ) mit der gleichen Nucleotid-Sequenz wie Verbindung VI oder XI in einer Konzentration von 10 uM beobachtet.
  • Daraus folgt, daß die erfindungsgemäßen neuen 2'-O- Methylribooligonucleotid-Derivate und die neuen Oligoribonucleotid-Derivate Anti-AIDS-Virus-Aktivität besitzen. Man erwartet, daß sie als Anti-AIDS-Medikamente verwendet werden.
  • Das erfindungsgemäße Anti-Virusmittel kann von 0,01 bis 2000 mg, vorzugsweise von 0,02 bis 500 mg, verwendet werden.
  • Der wirksame Bestandteil kann z. B. in Form einer Kapsel, eines Elixiers, einer Mikrokapsel oder einer Suspension verwendet werden.
  • Die als erfindungsgemäßer wirksamer Bestandteil verwendete Verbindung kann dem Patienten, der eine Behandlung oder Prophylaxe benötigt, in einer Dosis von 0,01 bis 1000 mg pro Person, gewöhnlich mehrmals in einer täglichen Dosis von 0,02 bis 2000 mg verabreicht werden. Die Dosis kann in Abhängigkeit vom Erkrankungszustand, dem Körpergewicht des Patienten und anderen Faktoren, die der Fachmann kennt, variiert werden.
  • Die erfindungsgemäß verwendete Verbindung oder eine physiologisch annehmbare Salzverbindung oder ein Gemsich davon kann gemeinsam gemischt werden mit Vehikeln, Trägern, Verdünnungsmitteln, Bindemitteln, Antiseptika, Stabilisierungsmitteln, Geschmacksstoffen, usw. in einer Menge von etwa 0,2 bis 500 mg in einer Einheits-Dosierungsform, die zur Herstellung gewöhnlich zugelassener pharmazeutischer Präparate erforderlich ist. In diesen Zusammensetzungen oder Präparaten ist der Wirkstoff in einer Menge eingeschlossen, die eine angemessene Dosis im angegebenen Bereich liefert.
  • Spezifische Beispiele für Medikamente, die in Tabletten, Kapseln usw. eingebracht werden können, sind: Bindemittel wie Traganthkautschuk, Gummi arabicum, Maisstärke oder Gelatine; Exzipienten wie feine kristalline Cellulose; Schwellmittel wie Maisstärke, vorgelatinierte Stärke, Alginsäure, usw.; Schmiermittel wie Magnesiumstearat; Süßstoffe wie Saccharose, Lactose oder Saccharin; Geschmacksstoffe wie Pfefferminz, Gaultheria adenothrix-Öl oder Kirsche, usw. Ist die Präparate-Einheitsform eine Kapsel, kann ein flüssiger Träger wie Öle und Fette zusätzlich in die Stoffe des oben beschriebenen Typs eingebracht werden. Andere Stoffe können als Schutzmittel eingebracht werden, oder um die physikalische Form der Präparate-Einheit durch ein anderes Verfahren zu ändern. Tabletten können z. B. mit Schellack oder Zucker oder mit beiden beschichtet werden. Ein Sirup oder Elixier kann Saccharose als Süßstoff, Methyl- und Propylparabene als Antiseptika, und Pigmente und Geschmacksstoffe wie Kirschen- oder Orangengeschmack enthalten.
  • Bei einer magensaftresistenten Beschichtung wird z. B. eine wäßrige 8%ige Hydroxyphenylmethylcellulose-Lösung als Beschichtungs-Vorbehandlungsmittel, eine wäßrige 10%ige Hydroxypropylmethylcellulosephthalat-Lösung und eine wäßrige 3%ige Polyacetyn-Lösung als Beschichtungsmittel verwendet. Diese werden jeweils verwendet, um Präparate mit magensaftresistenter Beschichtung auf herkömmliche Weise herzustellen.
  • Eine sterile Zusammensetzung für die Injektion kann auf herkömmliche Weise formuliert werden, um pharmazeutische Präparate durch Lösen oder Suspendieren des Wirkstoffes, natürlich vorkommender Pflanzenöle wie Sesamöl, Kokosnußöl, Erdnußöl, Baumwollsamenöl, usw. oder synthetischer Fettvehikel wie Ethyloleat in einem Vehikel wie Wasser zur Injektion herzustellen. Man kann, soweit nötig, auch Puffer, Antiseptika, Antioxidantien, usw. zugeben.
    • Beispiele
  • Die Erfindung wird nachstehend anschaulich hinsichtlich der nachfolgenden Beispiele beschrieben.
    • Beispiel 1 Herstellung von N&sup4;-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methylcytidin-3'-O-(H-phosphonat) (Verbindung 1):
  • Zu 50 ml einer Lösung aus 436 ul (5 mMol) Phosphortrichlorid und 5,5 ml (50 mMol) n-Methylmorpholin in Dichlormethan wurden 1,197 g (17,3 mMol) 1,2,4-Triazol gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Zu dem Gemisch wurden 17 ml einer Lösung aus 664,7 mg (1mMol) N&sup4;- Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methylcytidin in Dichlormethan während 10 Minuten gegeben. Das Gemisch wurde weiter bei Raumtemperatur gerührt. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie (mobile Phase: Dichlormethan/2% Triethylamin/8% Methanol) unter Verwendung von Silicagel 60 überwacht. Nachdem feststand, daß der Flecken des Rohstoffs (Rf-Wert: 0,60) verschwand und ein neuer, von Verbindung I herrührender Fleck mit einem Rf-Wert von 0,41 entstand, wurden 40 ml Triethylamin-Bicarbonatpuffer (1 M, pH-Wert 7,5) zugegeben. Die wäßrige Schicht wurde mit 15 ml Dichlormethan extrahiert. Die Dichlormethanschichten wurden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann bis zur Trockne verdampft. Dann wurde der entstandene schaumige Rückstand in 3 ml Dichlormethan gelöst, das 2% Triethylamin enthielt. Die Lösung wurde über eine Säule gereinigt, die mit 24 g Silicagel 60 gefüllt war. D. h. die Elution wurde durchgeführt, indem 100 ml Dichlormethan/2% Triethylamin, dann 200 ml Dichlormethan/2% Triethylamin/3% Methanol und weiter 200 ml Dichlormethan/2% Triethylamin als mobile Phase verwendet wurden. Die erhaltene reine Fraktion der Verbindung I wurde bis zur Trockne verdampft. Der erhaltene Rückstand wurde in 40 ml Dichlormethan gelöst. Die Lösung wurde mit 15 ml 1 M Triethylamin-Bicarbonatpuffer (pH-Wert 7,5) gewaschen. Nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wurde die Dichlormethan-Schicht bis zur Trockne verdampft, wobei 703 mg (0,849 mMol) Verbindung I in einer 84,9%igen Ausbeute entstanden.
  • Auf ähnliche Weise wie bei dem oben beschriebenen Arbeitsgang wurden N&sup6;-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-Omethyladenosin-3'-O-(H-phosphonat) (Verbindung 11), N²- Isobutylyl-5'-O-monomethoxytrityl-2'-O-methylganosin-3'-O-(H- phosphonat) (Verbindung III), 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-Omethyluridin-3'-O-(H-phosphonat) (Verbindung IV), 5'-O- Dimethoxytrityl-2'-O-methylinosin-3'-O-(H-phosphonat) (Verbindung V) in Ausbeuten von 93,9%, 49,4%, 77,4% bzw. 56,0% erhalten.
  • Dann wurden die ³¹P-NMR dieser Verbindungen gemessen. Von Verbindung I, II und III wurde jeweils ein Teil in Dichlormethan gelöst, und nach Mischen der Lösung mit einer äguimolaren Menge 1,8-Diazabicyclo [5.4.0] undec-7en (einfach als DBU bezeichnet) wurde das Gemisch in n-Hexan getropft, wobei das DBU-Salz gebildet wurde. Das Salz wurde pulverisiert, und das Pulver wurde gemessen. Die Verbindungen IV und V wurden dagegen so gemessen wie sie waren, d. h. als Triethylaminsalze. Als Lösungsmittel für die Messung wurde d&sub5;-Pyridin verwendet. Als externer Standard wurde eine Lösung von Phosphorsäure in D&sub2;O verwendet.
    • Die chemische Verschiebungen (ppm) waren wie folgt:
  • Verbindung I -1,79 ppm
  • Verbindung II -2,20 ppm
  • Verbindung III -2,04 ppm
  • Verbindung IV -0,73 ppm
  • Verbindung V -0,40 ppm
    • Beispiel 2: Herstellung von 5'-O-Monomethoxytrityl-N²- isobutylyl-3'-O-methylguanosin-gebundenem Regelporen-Glas:
  • Auf herkömmliche Weise hergestelltes 5'-O-Monomethoxytrityl-N²-isobutylyl-3'-Omethylguanosin wurde durch ein bekanntes Verfahren in einen 2'-O-Succinylpentachlorphenylester überführt (vgl. Miyoshi, K. et al., Nucleic Acids Res. 8, 5491, 1980). D. h. es wurden 639 mg (1mMol) 5'-O-Monomethoxytrityl-N²-isobutylyl-3'-O-methyl-guanosin und 183 mg 4-N,N- Dimethylaminopyridin (lediglich als DMAP bezeichnet) in 4 ml absolutem Pyridin gelöst. Zu der Lösung wurden unter Rühren bei Raumtemperatur 150 mg (1,5 mMol) Bernsteinsäureanhydrid gegeben. Nach 90minütigem Rühren wurde die Reaktionsflüssigkeit unter reduziertem Druck destilliert. Der entstandene ölige Rückstand wurde in 35 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wurde dreimal mit 30 ml 0,1 M Triethylamin-Bicarbonatpuffer (pH-Wert 7,5) gewaschen. Nach Trocknen über wassserfreiem Natriumsulfat; wurde die Chloroformschicht bis zur Trockne unter reduziertem Druck verdampft. Der erhaltene Rückstand wurde in 5 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst, und 400 mg (1,5 mMol) Pentachlorphenol und 309 mg (1,5 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zu der Lösung gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur während 13,5 Stunden. Die gefällten nichtlöslichen Substanzen wurden durch Filtration entfernt; und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck durch Destillation entfernt. Der entstandene Rückstand wurde in 3 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wurde durch Säulenchromatographie mit einer Säule gereinigt, die mit 20 g Silicagel 60 gefüllt war. D. h. die Elution wurde durchgeführt, indem als mobile Phase nacheinander 100 ml Chloroform, 100 ml Chloroform/ 0,3% Methanol, 100 ml Chloroform/0,5% Methanol und weiter 100 ml Chloroform/0,6% Methanol verwendet wurden. Die entstandenen reinen Fraktionen von 5'-O- Monomethoxytrityl-N²-isobutylyl-3'-O-methyl-guanosin-2'-Osuccinyl-pentachlorphenylester wurden gesammelt und unter reduziertem Druck bis zur Trockne verdampft, wobei 530 mg Ester in einer Ausbeute von 53,6% (Rf-Wert: 0,73 bei Entwicklung mit Chloroform: Methanol = 20 : 1 in Silicagel 60-Dünnschichtchromatographie) erhalten wurden. Dann wurde die gesamte Menge (530 mg) des Esters in 5,4 ml DMF gelöst; Parallel wurden 1 g Regelporen-Glas (CPG/langkettiges Alkylamiri, Porendurchmesser 500 Å, Partikelgröße 122-177 u NH&sub2;-30 uMol/g, hergestellt von Pierce Chemical Inc.) in einen Reaktor gegeben, der mit einem Glasfilter ausgerüstet war, und mit 1 ml DMF gewaschen, gefolgt von Trocknen während 1 Minute in einem Argongastrom. Es wurden 5,4 ml der vorher erwähnten Pentachlorphenylester-DMF-Lösung und 73 ul Triethylamin jeweils zu dem Porenglas gegeben. Nach Verschließen wurde die Reaktion über Nacht bei 30ºC durchgeführt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde unter einem Argondruck filtriertv Nach dreimaligem Waschen mit 5 ml DMF und dann dreimal mit 5 ml Tetrahydrofuran (THF) wurde das Regelporen-Glas eine Minute lang unter einem Argonstrom getrocknet. Anschließend wurde ein Flüssiggemisch aus 410 mg DMAP, 1,4 g 2,6-Lutidin, 660 ul Essigsäureanhydrid und 6 ml THF zu dem Porenglas gegeben. Das Gemisch wurde 15 Minuten lang bei 30ºC geschüttelt, um die nicht umgesetzte Aminogruppe zu acetylieren. Nach Filtration wurde das Reaktionsgemisch dreimal mit 5 ml THF und dann dreimal mit 5 ml Diethylether gewaschen, und in einem Argonstrom unter Bildung von 1 g an Regelporen-Glas gebundenem 5'-O-Monomethoxytrityl-N²-isobutylyl-3'-O-methyl-guanosin getrocknet. Eine geringe Menge Produkt wurde gewogen, und die Monomethoxytritylgruppe wurde mit 3%iger Trichloressigsäure gespalten. Das isolierte Tritanol wurde einer quantitativen kolorimetrischen Bestimmung mit einem Perchlorsäure-Ethanol- Gemisch unterworfen. Die gebundene Menge betrug 26 uMol/g.
  • Außerdem wurden 5'-O-Dimethoxytrityl-N&sup6;-benzoyl-3'-Omethyladenosin-gebundenes Regelporen-Glas, 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-Omethylinosin-gebundenes Regelporen-Glas, 5'-O- Dimethoxytrityl-3'-O-methyluridin-gebundenes Regelporen-Glas, 5'-O-Dimethoxytrityl-N&sup4;-benzoyl-3'-O-methylcytidin-gebundenes Regelporen-Glas, 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-(tert.-butyldimethylsilyl)inosin-gebundenes Regelporen-Glas und Monomethoxytritylhexandiol-gebundenes Regelporen-Glas auf gleiche Weise wie oben hergestellt. Beispiel 3: Herstellung von 5' Amp Cmp Amp Cmp Cmp Cmp Amp Amp Ump Ump"Cmp Ump Gmp Amp Amp knp Amp Ump Gmp Gm' 3' (Verbindung VI), wobei m eine 2'-O-Methylnucleosideinheit, m' ein 23-O- Methylnucleosideinheit, und P:
  • darstellt
  • Es wurden 40 mg N²-Tsobutylyl-5'-O-monomethoxytrityl-3'-Omethylguanosin-gebundener Polymerträger (bindende Menge: 1,0 uMol) in eine Kapsel verpackt, und die Kapsel wurde in einem DNA-Synthetisiergerät (Model 380A, hergestellt von Applied Biosystems Inc. untergebracht. Nach dem in Tabelle 1 gezeigten Verfahren wurden die 2'-O-Methylribonucleosid-3'-O-(H-phosphonat)-Verbindungen (Verbindungen I bis IV) unter Verwendung von III, IV, II, II, II, II, III, IV, I, IV, IV, II, II, I, I, I, II, I und II in dieser Reihenfolge behandelt. Nach Wiederholen von 19 Zyklen wurde das Zwischenprodukt zur Herstellung des Polymerträgers aus der Kapsel genommen und in einen mit einem Glasfilter ausgerüsteten Reaktor überführt. Nach Waschen mit 1 ml Acetonitril wurde das Zwischenprodukt in einem Argongasstrom getrocknet. Dann wurden 2 ml einer Lösung aus 0,2 M Schwefel (S&sub8;) in Triethylamin : Schwefelkohlenstoff : Pyridin (1 : 12 : 12, Volumenverhältnis) zu dem Zwischenprodukt gegeben. Nach Schütteln wurde das Gemisch 12 Stunden lang stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Zwischenprodukt für die Synthese des Polymerträgers wurde fünfmal mit 2 ml Schwefelkohlenstoff und einmal mit 2 ml Diethylether gewaschen. Nach Trocknen in einem Argonstrom wurde das Zwischenprodukt in ein Glasgefäß mit 3 ml Volumen überführt. Es wurden 2 ml 28%iges Ammoniakwasser in das Gefäß gegeben und versiegelt, gefolgt von 5stündigem Erhitzen bei 55ºC. Der Polymerträger wurde durch Filtration entfernt und die Reaktionsflüssigkeit wurde bis zur Trockne unter reduziertem Druck verdampft. Der entstandene Rückstand wurde in 300 ul 0,1 M Triethylammonium-Essigsäure- Puffer (pH-Wert 7,0, nachstehend einfach als TEAA bezeichnet), der 10% Acetonitril enthielt, gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm und einer Länge von 12 cm gereinigt, die mit Umkehrphasen-Silicagel (Waters Co., Ltd., Prep PAK-500/C-18) gefüllt war. D. h. 0,1 M TEAA- Puffer (pH-Wert 7,0) mit einem linearen Gradienten von 10% bis 35% Acetonitril wurde als mobile Phase verwendet, und quantitative Bestimmung wurde bei einer Absorption bei einer Wellenlänge von 254 nm durchgeführt, wobei die Fraktion der Verbindung VI mit einer Dimethoxytritylgruppe am 5'-Terminus erhalten wurde. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels unter reduziertem Druck wurde der Rückstand zusammen mit 2 ha Wasser dreimal coverdampft. Es wurden 3 ml 80%ige Essigsäure dazugegeben, gefolgt von Rühren während 10 Minuten. Nach Verdampfen der Reaktionsflüssigkeit bis zur Trockne wurde der Rückstand weiter mit Wasser coverdampft, um die Essigsäure zu entfernen. Zu dem Rückstand wurden 1, 5 ml 0,1 M Triethylamin-Bicärbonatpuffer (pH-Wert 7,5) mit 10% Acetonitril gegeben. Das Gemisch wurde zweimal mit 1,5 ml Diethylether gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde bis zur Trockne verdampft, und 200 ul 0,1 M TEAA-Puffer (pH-Wert 7,0) mit 10% Acetonitril wurden zu dem entstandenen Rückstand gegeben nach Hindurchleiten durch ein 0,45 u-Filter (hergestellt von Millipore Corp.) wurde durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gereinigt. D. h. es wurde eine YMC-Pack-ODS-(hergestellt von Yamamurä Science Co., Ltd.) -Säule und 0,1 M TEAA-Puffer (pH-Wert 7,0) mit einem linearen Gradienten von 10% bis 70% Acetonitril als mobile Phase verwendet. Der Hauptpeak, der bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,2 ml/min eluierte, wurde fraktioniert, so daß 52,9 OD260nm-Einheiten (ca. 226 nMol) Verbindung VI in einer Ausbeute von 22,6% entstanden.
  • Die Verbindung VI wurde in D&sub2;O mit 10 mM Triethylaminbicarbonatpuffer (pH-Wert 7,5)gelöst, und ³¹P-NMR wurde gemessen (Meßgerät: JEOL JMS-DX300, hergestellt von JEOL Inc.). Wenn Trimethylphosphat als externer Standard verwendet wurde, zeigte Verbindung VI ein charakteristisches Phosphorthioat- Multiplett-Signal bei 51-55 ppm: Tabelle 1: Ein Verfahrenszyklus der Kettenverlängerungsreaktion
  • Außerdem wurde unter Verwendung von 2 uMol nucleosidgebundenem Träger als Ausgangsstoff auf ähnliche Weise wie bei dem oben beschriebenen Verfahren Verbindung VII in 26 OD260nm-Einheiten (etwa 132 nMol) in einer Ausbeute von etwa 6,3% erhalten, wobei nacheinander III, IV, II, II, II, II, III, IV, I, VI, IV, II, II, I, I und I in dem Kondensationszyklus verwendet wurden; Verbindung VILI wurde in 41,5 OD260nm- Einheiten (etwa 136 nMol) in einer Ausbeute von etwa 6,2% erhalten, wobei nacheinander II, II, IV, II, III, III, IV, II, II, II, II, III, IV, I, IV, IV, II, II, I, I, I, II, I und II in dem Kondensationszyklus verwendet wurden; Verbindung IX wurde in 62 OD260nm-Einheiten (etwa 528 nMol) in einer Ausbeute von etwa 24,2% erhalten, wobei nacheinander II, III, IV, I, IV, IV, II, II und I in dem Kondensationszyklus verwendet wurden; und Verbindung X wurde in 37 OD260nm-Einheiten (etwa 180 nMol) in einer Ausbeute von etwa 8,7% erhalten, wobei nacheinander IV, I, II, I, I, III, I, III, III, III, I, IV, IV, III, IV, I, I, I, IV und III in dem Kondensationszyklus verwendet wurden. Außerdem wurde unter Verwendung von 1 uMol Nucleosidgebundenem Träger als Ausgangsstoff, Verbindung XI in 16,0 OD260nm-Einheiten (etwa 72 nMol) in einer Ausbeute von etwa 7,2% erhalten, wobei nacheinander IV, I, IV, II, III, II, I, IV, I, III, III, II, I, I, I, IV, I, III, II und III in dem Kondensationszyklus verwendet wurden.
  • Außerdem wurde auf einer Weise, ähnlich dem oben beschriebenen Verfahren, Verbindung XV in 25 OD260nm Einheiten (etwa 81,7 nMol) in einer Ausbeute von etwa 3,4% erhalten, wobe i als Ausgangsstoff 2,4 uMol 5'-O-Dimethoxytrityl-N&sup6;- benzoyl-3'-Omethyladenosin-gebundenes Regelporen-Glas und Verbindung 11 über 19 Zyklen in dem Kondensationszyklus verwendet wurden; Verbindung XVI wurde in 74 OD260nm-Einheiten (etwa 301 nMol) in einer Ausbeute von etwa 8,3% erhalten, wobei als Ausgangsstoff 3,6 uMol 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-Omethylinosin-gebundener Polymerträger und Verbindung V über 19 Zyklen in dem Kondensationszyklus verwendet wurden; Verbindung XVII wurde in 58 OD260nm-Einheiten (etwa 292 nMol) in einer Ausbeute von etwa 8,1% erhalten, wobei als Ausgangsstoff 3,6 uMol 5'-O-Dimethoxytrztyl-3'-O-methyluridingebundener Polymerträger und Verbindung IV über 19 Zyklen in dem Kondensationszyklus verwendet wurden; und Verbindung XVIII wurde in 25 OD260nm-Einheiten (etwa 168 nMol) in einer Ausbeute von etwa 4,7% erhalten, wobei als Ausgangsstoff 3,6 uMol 5'-O-Dimethoxytrityl-N&sup4;-benzoyl-3'-O-methylcytidingebundener Polymerträger und Verbindung I über 19 Zyklen in dem Kondensationszyklus verwendet wurden.
  • Auf ähnliche Weise wurden die Verbindungen XXVII, XXVIII und XXIX hergestellt.
    • Beispiel 4: Herstellung von Verbindung XII
  • In einen mit einem Glasfilter ausgerüsteten Reaktor wurden 120 mg (insgesamt bindende Menge 3,12 uMol) Polymerträger gefüllt, an den N²-Isobutylyl-5'-O-monomethoxytrityl-3'-O- methylguanosin gebunden war. Nach dem in Tabelle 1 gezeigten Verfahren wurden die 2'-O-Methylribonucleosid-3'-O-(H- phosphonat)-Verbindungen (Verbindungen I bis IV) in der Reihenfolge III, IV, II, II und II verwendet, was über 5 Zyklen wiederholt wurde. In den Arbeitsgängen Nr. 1, 3, 5, 6 und 9 wurden jedoch jeweils 2 ml verwendet. Anschließend wurden 2 ml einer Lösung aus 0,2 M Schwefel (S&sub8;) in Triethylamin:- Schwefelkohlenstoff: Pyridin (1 : 12 : 12, Volumenverhältnis) zu dem System gegeben. Nach Schütteln wurde das Gemisch 70 Minuten lang stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Zwischenprodukt für die Synthese des Polymerträgers wurde fünfmal mit 2 ml Schwefelkohlenstoff und fünfmal mit 2 ml Acetonitril gewaschen, gefolgt von Trocknen in einem Argonstrom. Außerdem wurde das Verfahren wie in Tabelle 1 gezeigt über 9 Zyklen wiederholt, wobei die Verbindungen II, III, IV, I, IV, IV, II, II und I in dieser Reihenfolge verwendet wurden. Danach wurden 2 ml einer Lösung aus 0,1 M Iod (I&sub2;) in Pyridin: N-Methylimidazol : H&sub2;O : THF (5 : 1 : 5 : 90, Volumenverhältnis) zu dem System gegeben. Das Gemisch wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktionsflüssigkeit wurde filtriert, und 2 ml einer Lösung aus 0,1 M Iod (I&sub2;) in Triethylamin : H&sub2;O : THF (5 : 5 : 90, Volumenverhältnis) wurden dann zu dem Systemgegeben. Nach Stehenlassen bei Raumtemperatur während 20 Minuten wurde die Reaktionsflüssigkeit filtriert. Außerdem wurde das Verfahren wie in Tabelle 1 gezeigt über 5 Zyklen wiederholt, wobei die Verbindungen I, I, II, I und II in dieser Reihenfolge verwendet wurden, gefolgt von der gleichen wie oben beschriebenen Schwefel-Oxidationsbehandlung über Nacht.
  • Die Reaktionsflüssigkeit wurde filtriert und das Zwischenprodukt für die Synthese des Polymerträgers wurde fünfmal mit 2 ml Schwefelkohlenstoff und einmal mit 2 ml Diethylether gewaschen. Nach Trocknen in einem Argonstrom wurde das Zwischenprodukt in ein Glasgefäß mit einem Volumen von 3 ml überführt. Es wurden 2 ml 28%iges Ammoniakwasser in das Gefäß gefüllt und dieses verschlossen, gefolgt von Erhitzen bei 55ºC während 5 Stunden. Der Polymerträger wurde durch Filtrieren entfernt, und die Reaktionsflüssigkeit wurde bis zur Trockne unter reduziertem Druck verdampft. Der erhaltene Rückstand wurde in 300 ul 0,1 M Triethylammonium- Essigsäure-Puffer (pH-Wert 7,0, nachstehend einfach als TEAA bezeichnet), der 10% Acetonitril enthielt, gelöst. Die Lösung wurde über eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm und einer Länge von 12 cm, gefüllt mit Umkehrphasen-Silicagel (Waters Co., Ltd., Prep-PAK-500/C-18) gereinigt. D. h. es wurde 0,1 M TEAA-Puffer (pH-Wert 7,0) mit einem linearen Gradienten von 10% bis 35% Acetonitril als mobile Phase verwendet. Quantitative Bestimmung wurde bei einer Absorbtion bei einer Wellenlänge von 254 nm durchgeführt, wobei die Fraktion von Verbindung XII mit einer Dimethoxytritylgruppe am 5'-Ende erhalten wurde. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels unter reduziertem Druck, wurde der Rückstand zusammen mit 2 ml Wasser dreimal coverdampft, und 3 ml 80%ige Essigsäure wurden hinzugefügt, gefolgt von Rühren während 10 Minuten. Nach Verdampfen der Reaktionsflüssigkeit bis zur Trockne wurde der Rückstand weiter zusammen mit Wasser coverdampft, um die Essigsäure zu entfernen. Zu dem Rückstand wurden 1,5 ml 0,1 M Triethylamin-Bicarbonat-Puffer (pH-Wert 7,5) gegeben, der 10% Acetonitril enthielt. Das Gemisch wurde zweimal mit 1,5 ml Diethylether gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde bis zur Trockne verdampft und 200 ul 0,1 M TEAA-Puffer (pH-Wert 7,0), der 10% Acetonitril enthielt, wurden zu dem entstandenen Rückstand gegeben. Nach Durchleiten durch einen 0,45 u-Filter (hergestellt von Millipore Corp.), wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt. D. h. es wurde eine YMC-Pack-ODS-(hergestellt von Yamamura Science Co., Ltd)- Säule verwendet, und 0,1 M TEAA-Puffer (pH-Wert 7,0) mit einem linearen Gradienten von 10% bis 50% Acetonitril wurde als mobile Phase verwendet. Der bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,2 ml/min eluierende Hauptpeak wurde fraktioniert, so daß 65,2 OD260nm-Einheiten (ca. 278 nMol) Verbindung XII in einer Ausbeute von 8,9% erhalten wurden.
  • Die Verbindung XII wurde in D&sub2;O, das 10 mM Triethylamin- Bicarbonatpuffer (pH-Wert 7,5) enthielt, gelöst, und ³¹P-NMR wurde gemessen (Meßgerät: JEOL JMS-DX300, hergestellt von JEOL Inc.). Wurde Trimethylphosphat als externer Standard verwendet, ergab Verbindung XII ein charakteristisches Phosphorthioat-Multiplett-Signal bei 51-55 ppm und ein von Phosphat abgeleitetes Singulett-Signal bei -4,2 ppm bei einem Integrierungsverhältnis von 7 : 12. Aus den Ergebnissen dieser NMR und der Reihenfolge für die Oxidation beim Kettenverlängerungsschritt folgt, daß Verbindung XII 5 Phosphoratome am 5'-Terminus und 5 Phosphoratome am 3'-Terminus hat, von denen durchschnittlich 2 Phosphoratome Thiophosphate und der Rest Phosphordiesterbindungen sind.
    • Beispiel 5: Test auf Anti-Virus-Aktivität
  • Verbindung XIII, ein Desoxyoligonucleotid (Phophat-Typ) mit einer Basensequenz komplementär zu den gleichen Bereichen wie in Verbindung VI, Verbindung Xi und Verbindung VI, Verbindung XIV, ein Desoxyoligonucleotid (Phosphattyp) mit einer Basensequenz komplementär zum gleichen Bereich wie in Verbindung Xi und dCS (15mer); ein Desoxyoligocytidylatphosphorthioat wurden in 10%igem Serum aus fötalen Kälbern gelöst, das RPMI 1640 in einer bestimmten Konzentration enthielt. MT-4-Zellen, die bei einer MOI von 0,002 mit AIDS- Virus (HTLV-IIIB-Stamm, 3 · 10&sup5; PFU/ml) infiziert waren, wurden mit dem vorgenannten Medium, das 3 · 10&sup5;/ml Oligonucleotid im Anfangsstadium enthielt, gemischt, und anschließend bei 37ºC gezüchtet. Nachdem der Zellzustand am Tag 3 beobachtet wurde, wurde die Zellzahl von 3 · 10&sup5;/ml erneut auf 5 · 10&sup5;/ml eingestellt. Oligonucleotid würde ebenfalls frisch angereichert, so daß die gleiche Konzentration wie zu Beginn erhalten wurde. Sechs Tage nach der Infektion wurde die cytopathische Wirkung unter Virusinfektion bewertet. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 2. Das Symbol + zeigt den Fall, bei dem Virusinfektion und -proliferation gehemmt sind und die Zellen normal wachsen. Das Symbol - zeigt den Fall, bei dem die Zellen aufgrund von Virusinfektion zerstört sind. In keinem Fall wurde bei den getesteten Konzentrationen eine Cytotoxiziät festgestellt. Tabelle 2
  • (Anmerkung 1) Verbindung XIII: Desoxyoligonucleotid (Phosphat- Typ), komplementär zum gleichen Bereich wie in Verbindung VI.
  • (Anmerkung 2) Verbindung XIV: Desoxyoligonucleotid (Phosphat- Typ), komplementär zum gleichen Bereich wie in Verbindung XI.
  • (Anmerkung 3) dCS (15mer): Desoxyoligocytidylatphospborthioat (15mer).
  • Verbindung VI wurde noch weiter eingehend getestet. D. h. Verbindung VI wurde in Konzentrationen von 100 uM, 50 uM, 25 uM, 12,5 uM, 6 uM und 3 uM in 10%igem Serum aus fötalen Kälbern, das RPMI-1640-Medium enthielt, zu Beginn des Tests gelöst. MT-4-Zellen, die mit AIDS-Virus (HTLV-IIIB-Stamm) infiziert waren, wurden bei einer MOI von 0,002 mit dem Medium, das zu Beginn Verbindung VI in 30 · 10&sup4; Zellen/ml enthielt, gemischt. Danach wurden sie in einem CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC gezüchtet. Als Kontrolle wurden gleichzeitig nichtinfizierte MT-4-Zellen in dem Medium gezüchtet, das Verbindung VI enthielt. Ein Teil der Kultur wurde an Tag 3 entnommen; überlebende Zellen wurden mit Trypan-Blau-Färbung gezählt, und die Menge an virusantigenpositiven Zellen wurde durch das Immunfluoreszenz-Verfahren bestimmt. Die Kulturzellen wurden dagegen, um den Einfluß auf das Zellwachstum aufgrund Proliferation zu verhindern, erneut auf 30 bis 50 · 10&sup4; Zellen/ml verdünnt, wobei die Kultur Verbindung VI in gleicher Verdünnung enthielt. Die Kultur wurde weiter bei 37ºC inkubiert. Am Tag 6 nach Beginn des Tests wurden die überlebenden Zellen gezählt und die Menge an virusantigenpositiven Zellen erneut bestimmt. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 3. Die Zahl lebender Zellen an Tag 3 und Tag 6 zeigen jeweils die Fig. 1 und 2. Die Menge virusantigenpositiver Zellen zeigt Fig. 3: Tabelle 3: Anti-AIDS-Virus-Aktivität von Verbindung VI (Anzahl lebender Zellen und Menge an virusantigenpositiven Zellen)
  • Mit den Verbindungen VI, VII, VITI, IX, X, XII und Desoxyoligocytidylatphosphorthioat: dCS (15mer), wurden ähnliche Tests durchgeführt, um die Anzahl der lebenden Zellen und die Menge an virusantigenpositiven Zellen an Tag 6 nach der Infektion zu bestimmen.
  • Die Tabelle 4 zeigt als Ergebnisse die Zellzahl an Tag 6 nach Infektion. Tabelle 5 zeigt als Ereignisse die Menge an virusantigenpositiven Zellen an Tag 6 nach Infektion. Diese Ergebnisse zeigen jeweils auch die graphischen Darstellungen in Fig. 4 und 5. Tabelle 4: Anti-AIDS-Virus-Aktivität der Verbindungen VI, VII, VIII, IX, X, XII und dCS (15mer) (Anzahl lebender Zellen an Tag 6 nach Infektion: · 10&sup4; Zellen/ml)
  • Nichtinfizierte MT-4-Zellen: 220 Tabelle 5: Anti-AIDS-Virus-Aktivität der Verbindungen VI, VII, VIII, IX, X, XII und dCS (15mer) (Menge der virusantigenpositiven Zellen an Tag 6 nach Infektion: %)
  • Nichtinfizierte MT-4-Zellen: 0
  • Mit den Verbindungen XV, XVI, XVII und XVIII wurden ähnliche Tests durchgeführt. Die Anzahl lebender Zellen an Tag 6 nach Infektion sind als Ergebnisse der Verbindungen XV, XVI, XVII und XVIII in Tabelle 6 gezeigt und die Menge an virusantigenpositiven Zellen an Tag 6 nach Infektion ist in Tabelle 7 gezeigt. Diese Ergebnisse sind auch jeweils in den graphischen Darstellungen von Fig. 6 und 7 gezeigt. Tabelle 6: Anti-AIDS-Virus-Aktivität der Verbindungen XV, XVI, XVII und XVIII (Anzahl lebender Zellen am Tag 6 nach Infektion: · 10&sup4; Zellen/ml)
  • Nichtinfizierte MT-4-Zellen: 220 Tabelle 7: Anti-AIDS-Virus-Aktivität der Verbindungen XV, XVI, XVII und XVIII (Menge an virusantigenpositiven Zellen an Tag 6 nach Infektion: %)
  • Nichtinfizierte MT-4-Zellen: 0
  • Die mithilf der erfindungsgemäßen Methylribonucleotide hergestellten neuen 2'-O-Methylribooligonucleotidphosphorthioat-Derivate haben Anti-AIDS-Virus-Aktivität, s. oben. Man erwartet, daß sie als Medikamente verwendet werden, bspw. als Medikamente zur Behandlung von AIDS. Daher eignet sich die Erfindung besonders für die Medikamenten-Industrie.
  • Auf die anliegenden Zeichnungen wird Bezug genommen. Es zeigen:
  • Fig. 1 und 2 die Meßergebnisse der Anzahl lebender Zellen von Verbindung VI an Tag 3 bzw. 6;
  • Fig. 3 die Meßergebnisse der Menge virusantigenpositiver Zellen;
  • Fig. 4 und 5 die Meßergebnisse der Anzahl lebender Zellen und der Menge virusantigenpositiver Zellen der Verbindungen VI, XII, VIII, IX, X, XII bzw. Desoxyoligocytidylatphosphorthioat: dCS (15mer) an Tag 6 nach der Infektion;
  • Fig. 6 und 7 die Meßergebnisse von Beispiel 7 der Anzahl lebender Zellen und der Menge virusantigenpositiver Zellen der Verbindungen XV, XVI, XVII bzw. XVIII an Tag 6 nach der Infektion;

Claims (4)

1. 2'-O-Methylribonucleosid-3'- (H-phosphonat)-Verbindung, die für eine Verwendung zur Oligonucleotidsynthese geschützt ist, wobei die Nucleosidbase Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin oder Hypoxanthin ist.
2. 3'-O-Methylribonucleosid-2'-(H-phosphonat)-Verbindung, die für eine Verwendung zur Oligonuleoctidsynthese geschützt ist, wobei die Nucleosidbase Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin oder Hypoxanthin ist.
3. 2'-O-Methylribonucleosid-3'-(H-phosphonat)-Verbindung nach Anspruch 1, oder eine 3'-O-Methylribonucleosid- 2'-(H-phosphonat)-Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Nucleosidbase oder die geschützte Nucleosidbase ausgewählt ist aus
4. 2'-O-Methylribonucleosid-3'-(H-phosphonat)-Verbindung nach Anspruch 1 oder 3, oder eine 3'-O-Methylribonucleosid-2'-(H-phosphonat)-Verbindung nach Anspruch 2 oder 3, wobei die 5'-OH-Gruppe geschützt ist durch eine Monomethoxytrityl-Schutzgruppe oder eine Dimethoxytrityl-Schutzgruppe.
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