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Die Erfindung betrifft neue Zwischenverbindungen zur
Herstellung von 2'-O-Methylribooligonucleotidphosphorthioat-
Derivaten, 2'-O-Methylribooligonucleotid-Derivaten und
Oligoribonucleotid-Derivaten, welche die Vermehrung des AIDS-Virus
(HIV-1, HIV-2, usw.), das AIDS (erworbenes
Immunschwächesyndrom) verursacht, hemmen können, um das AIDS-Virus avirulent
zu machen, und die eingesetzt werden können für Medikamente,
bspw. für Antivirusmittel wie Anti-AIDS-Medikamente oder
dergleichen.
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AIDS (erworbenes Immunschwächesyndrom) ist seit 1981
bekannt. Es wird vom HIV (dem menschlichen Immunschwächevirus,
nachstehend einfach als AIDS-Virus bezeichnet) verursacht,
das zur Familie der Retroviren gehört. Die Patientenzahl steigt
jährlich weltweit an. Nach dem Bericht der WHO lag am 31.
August 1988 die weltweite Anzahl an Patienten bei über 110000.
Japan berichtet von 90 Patienten (S-)and: 31. August 1988).
Falls man außerdem Träger hinzurechnet, die mit dem Virus
infiziert sind; jedoch bisher kein AIDS entwickeln, liegt
die Anzahl an Patienten auf der Welt (von der WHO geschätzt)
über 10000000 und beträgt 1048 in Japan (wie vom Ministerium
für Gesundheit und Soziales am 31. August 1988 bekanntgegeben).
Bisher ist noch kein Medikament entdeckt worden, mit dem sich
AIDS, eine schwere Erkrankung, vollständig heilen läßt. 3'-
Desoxy-3'-azidothymidin (nachfolgend einfach als "AZT"
bezeichnet) wird im klinischen Bereich als Medikament
verwendet, um das Fortschreiten von AIDS zu verzögern und
das klinische Syndrom des Patienten zu bessern. Man kennt
jedoch Nebenwirkungen, bspw. Schädigung des Knochenmarks usw.,
die mit seiner Wirksamkeit einhergehen (vgl. The New England
Journal of Medicine 317 192-197, 1987). Der Mechanismus von
AZT beruht auf der Hemmung der Aktivität der Reversen
Transkriptase, die das Retrovirus selbst besitzt. Sie transkribiert
nach Eindringen des Virus in die Wirtszelle seine genomische
RNA in DNA (Mitsuya, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82, 7096-7100, 1985). Der Mechanismus hängt voraussichtlich
mit den Nebenwirkungen zusammen.
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Phosphorthioat-Derivate von Desoxyoligonucleotiden weisen
eine Anti-AIDS-Virusaktivität auf (s. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84, 7706-7710, 1987).
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Das AIDS-Virus besitzt hinsichtlich seines Hüllproteins
äußerst häufige Variationen in seinen Stämmen. Es ist daher
sehr schwierig, einen wirksamen Impfstoff und
chemotherapeutische Mittel zu entwickeln, die wie oben beschrieben erwünscht
sind. Nucleozido-Derivate wie AZT, die gewöhnlich als
chemotherapeutische Mittel verwendet werden, weisen einerseits
Anti-AIDS-Virusaktivität auf, andererseits haben sie jedoch
schwere Nebenwirkungen. Wünschenswerterweise werden demnach
Medikamente entwickelt, die minimale Nebenwirkungen und hohe
Praktikabilität besitzen. Zu diesem Zweck befinden sich die
Desoxyoligonucleotidphosphorthioat-Derivate im Stadium der
Grundlagenforschung. Es wird jedoch erwünscht, Medikamente
mit einer stärkeren Wirkung zu entwickeln, und diese billig
bereitzustellen.
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Intensive Forschung der Erfinder zur Lösung der genannten
Probleme ergab, daß neu hergestellte
2'-O-Methyloligoribonucleotid-Derivate und Oligoribonucleotid-Derivate die Infektion
von und die Vermehrung des AIDS-Virus in Wirtszellen hemmen
können und als Medikamente für die Behandlung von AIDS
angewendet werden können. Sie haben aufgrund dieses Befundes die
vorliegende Erfindung gemacht.
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Die Erfindung betrifft 2'-O-ethylribonucleosid-3'-(H-
phosphonat)-Verbindung, die für eine Verwendung zur
Oligonucleötidsynthese geschützt ist, wobei die Nucleosidbase
Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin oder Hypoxanthin ist,
sowie 3'-O-Methylribonucleosid-2'-(H-phosphonat)-Verbindung,
die für eine Verwendung zur Oligonuleoctidsynthese geschützt
ist, wobei die Nucleosidbase Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil,
Thymin oder Hypoxanthin ist.
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Die Verbindungen können eingesetzt werden zur Herstellung
von neuen Oligoribonucleotid-Derivaten gemäß nachstehender
allgemeiner Formel (1) und als wirksamer Inhaltsstoff für
Anti-AIDS-Virus - Zusammensetzungen;
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von neuen 2'-O-Methyloligoribonucleotidphosphorthioat-
Derivaten mit einer Sequenz, die zum RNA-Gen des AIDS-Virus
(HIV-1, HTV-2, usw.) oder zur ins Chromosom integrierten DNA
komplementär ist, dargestellt von der nachstehenden allgemeinen
Formel (2), und die eingesetzt werden kann in Anti-AIDS-Virus-
Zusammensetzungen als wirksamer Inhaltsstoff;
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von neuen 2'-O-Methyloligoribonucleotid-Derivaten gemäß
nachstehender allgemeiner Formel (3), die in Anti-AIDS-Virus-
Zusammensetzungen als wirksamer Inhaltsstoff eingesetzt werden
können; und
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von neuen Oligoribonucleotid-Derivaten gemäß nachstehender
allgemeiner Formel (4), die in
Anti-AIDS-Virus-Zusammensetzungen als wirksamer Inhaltsstoff eingesetzt werden können.
Allgemeine Formel (1)
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wobei:
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m eine ganze Zahl von 1-100 ist (vorausgesetzt, X&sub1; und
X&sub2; sind alle in der 2'-Stellung substituiert, stehen für ein
Wasserstoffatom und m ist eine ganze Zahl von 4 bis 50)
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B B&sub2;, B5,...... B(m+1) darstellt; und B&sub1; bis B(m+2), die gleich
oder verschieden sein können, jeweils einen der Reste
Hypoxanthin-9-yl, Guanin-9-yl, Adenin-9-yl, Cytosin-1-yl,
Uracil-1-yl bzw. Thymin-1-yl darstellen, vorausgesetzt, sind
X&sub1; und alle X in der 3'-Stellung substituiert und stehen für
ein Wasserstoffatom, dann sind sie nicht alle Adenin-9-yl);
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Q Q&sub2;, Q&sub3;,..... Q(m+1) darstellt, und Q&sub1; bis Q(m+1) unabhängig
voneinander ein Thioanion, ein Oxoanion, eine Alkylgruppe,
eine Aryloxygruppe, eine Alkylaminogruppe, eine
Arylaminogruppe, eine Alkylthiogruppe bzw. eine Arylthiogruppe
darstellen (mit der Maßgabe, daß zumindest einer der Reste
aus Q&sub1; bis Q(m+1) ein Thioanion darstellt);
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X X&sub2;, X&sub3;, ..... X(m+1) darstellt, und X&sub1; bis X(m+1), die gleich
oder verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom,
eine Methylgruppe oder eine Acylgruppe mit 1 bis 20
Kohlenstoffatomen darstellen;
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R ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe mit 1 bis 20
Kohlenstoffatomen, eine Phosphorylgruppe, die gegebenenfalls
einen Substituenten besitzen kann, eine Thiophosphorylgruppe,
die gegebenenfalls einen Substituenten besitzen kann, oder
eine Alkylaminophosphorylgruppe, die gegebenenfalls einen
Substituenten besitzen kann, darstellt; und
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Y&sub1; und Y&sub2; unabhängig voneinander eine Methoxygruppe, eine
Carboxylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, ein
Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, eine Alkyloxygruppe, die
gegebenenfalls einen Substituenten haben kann, eine Phosphoryloxygruppe,
die gegebenenfalls einen Substituenten haben kann, eine
Thiophosphoryloxygruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten
haben kann, und eine Alkylaminophosphoryloxygruppe, die
gegebenenfalls einen Substituenten haben kann, darstellen.
Das Alkyl stellt hier einen gerad- oder verzweigtkettigen
Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen dar.
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Das Aryl stellt einen Kohlenwasserstoffrest mit 6 bis 30
Kohlenstoffatomen einschließlich einer Phenylgruppe dar.
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In der oben beschriebenen Formel (1) ist X an ein
Sauerstoffatom in der 2'- oder der 3'-Stellung im Zuckerrest
gebunden. In diesem Fall ist der jeweils andere mit dem
Phosphoratom (P) verknüpft. Der Verknüpfungsmodus des Monomers
mit dem Zuckerrest kann eine 2'-5'-Bindung sein oder eine
3'-5'-Bindung. Es können in einem Oligoribonucleotid auf beide
Verknüpfungsmoden vorhanden sein.
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Beispiele des Substituenten an R, Y&sub1; und Y&sub2; enthalten
weiter in der oben beschriebenene Formel (1) eine
Cyanethylgruppe, Chlorphenylgruppe, Monophosphorylgruppe,
Pyrophosphorylgruppe, einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 20
Kohlenstoffatomen, eine Cholesterylgruppe und eine durch J-(K-O-L)E
dargestellte Gruppe, die gleich oder verschieden sind: mit
der Maßgabe, daß J:
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eine Hydroxylgruppe oder eine der Oligoribonucleotidylgruppen
darstellt, die für die Strukturformel des Derivates nach
Anspruch 1 festgelegt sind, aus denen einer der Reste RO,
Y&sub1; und Y&sub2; entfernt ist;
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K eine Phosphorylgruppe, eine Thiophosphorylgruppe bzw.
eine Alkylaminophosphorylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen
darstellt;
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L einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 20
Kohlenstoffatomen darstellt; und
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E eine ganze Zahl von 1 bis 10 darstellt.
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Die Nucleotidsequenz muß nicht notwendigerweise zu der
Sequenz genomischer RNA aus AIDS-Virus oder zu in Chromosomen
integrierte DNA komplementär sein.
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In der oben beschriebenen Formel sind B&sub1; bis B(m+2), Q&sub1;
bis Q(m+1) und X&sub1; bis x vom 5'-Ende in der Reihenfolge 1,
2, 3, 4, ... (m+1) gezeigt. Ist z. B. m = 2, sind B&sub1; bis B(m+2)
vom 5'Ende in der Reihenfolge B&sub1;, B&sub2;, B&sub3;, B&sub4;; Q&sub1; bis Q(m+1) sind
vom 5'-Ende in der Reihenfolge Q&sub1;, Q&sub2;, Q&sub3;; und X, bis X(m+1) sind
vom 5'-Ende in der Reihenfolge X&sub1;, X&sub2;, X&sub3;, siehe folgende
Strukturformel:
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Ist m = 100, sind B&sub1; bis B(m+2) ebenfalls in der Reihenfolge
vom 5'-Ende B&sub1;, B&sub2;, B&sub3;, ... B&sub1;&sub0;&sub0; B&sub1;&sub0;&sub1; B&sub1;&sub0;&sub2;; Q&sub1; bis Q(m+1) sind
vom 5'-Ende in der Reihenfolge Q&sub1;, Q&sub2;, Q&sub3;, ... Q&sub1;&sub0;&sub0;, Q; und
X&sub1; bis X(m+1) sind vom 5'-Ende in der Reihenfolge X&sub1;, X&sub2;, X&sub3;,
... X&sub1;&sub0;&sub0;, X&sub1;&sub0;&sub1;, siehe folgende Strukturformel:
Allgemeine Formel (2)
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wobei:
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m' eine ganze Zahl von 1 bis 50 ist;
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B' 1 bis B'(m'+2) die gleich oder verschieden sein können,
jeweils einen der Reste Adenin-9-yl (A), Guanin-9-yl (G),
Cytosin-1-yl (C), Uracil-1-yl (U), Thymin-1-yl (T) bzw.
Hypoxanthin-9-yl (H) darstellen.
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Q'&sub1; ein Thioanion (S&supmin;) ein Oxoanion (O&supmin;), eine
Alkylgruppe, eine Alkyloxygruppe, eine Aryloxygruppe, eine
Alkylaminogruppe, eine Arylaminogruppe, eine Alkylthiogruppe
bzw. eine Arylthiogruppe darstellt;
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wobei zumindest einer der Reste Q'&sub2; bis Q'(m'+1) ein
Thioanion (S&supmin;) darstellt und durch entweder ein Thioanion oder
ein Oxoanion (O&supmin;) ausgeglichen wird;
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Y'&sub1; bis Y'&sub3; unabhängig voneinander eine Methoxygruppe,
eine Alkyloxygruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten
haben kann, eine Hydroxylgruppe, eine Alkylsilylgruppe und
ein Wasserstoffatom darstellen;
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R' ein Wasserstoffatom, eine Phosphorylgruppe oder eine
Thiophosphorylgruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten
haben kann, darstellt. Das Alkyl stellt hier einen gerad-
oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 30
Kohlenstoffatomen dar und das Aryl stellt einen
Kohlenwasserstoffrest mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen einschließlich
einer Phenylgruppe dar. Beispiele der Substituenten sind u. a.
eine Cyanethylgruppe, Chlorphenylgruppe und ein
Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen.
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In der oben beschriebenen Formel sind B' und Q' in der
Reihenfolge 1, 2, 3, 4, ...(m'+2) gezeigt. Ist beispielsweise
m' = 2, sind B'&sub2; bis B'(m+1) in der Reihenfolge vom 5'-Ende B'&sub2;,
B'&sub3;; Q'&sub2; bis Q'(m+1) sind in der Reihenfolge vom 5'-Ende Q'&sub2;,
Q'&sub3;, siehe folgende Strukturformel:
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Ist m' 50, sind B'&sub2; bis B' (m'+1) ebenfalls in der Reihenfolge
vom 5'-Ende B'&sub2;, B'&sub3;, B'&sub4;, ... B'&sub5;&sub0;, B'&sub5;&sub1;; Q'&sub2; bis Q'(m'+1) sind
in der Reihenfolge vom 5'-Ende Q'&sub2;, Q'&sub3;, Q4, ... Q'&sub5;&sub0;, Q'&sub5;&sub1;,
siehe folgende Strukturformel:
Allgemeine Formel (3)
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wobei:
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m" eine ganze Zahl von 1 bis 50 ist;
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B"1 bis B"(m"+2), die gleich oder verschieden sein können,
jeweils einen der Reste Adenin-9-yl (A), Guanin-9-yl (G),
Cytosin-1-yl (C) Uracil-1-yl (U), Thymin-1-yl (T) bzw.
Hypoxanthin-9-yl (H) darstellen;
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Q" zumindest ein Thioanion enthält, und ein Thioanion
(S&supmin;) ein Oxoanion (O&supmin;), eine Alkylgruppe, eine Alkyloxygruppe,
eine Aryloxygruppe, eine Alkylaminogruppe, eine
Arylaminogruppe, eine Alkylthiogruppe bzw. eine Arylthiogruppe
darstellt;
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Y"&sub1; bis Y"&sub3; unabhängig voneinander eine Methoxygruppe,
eine Alkyloxygruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten
haben kann, eine Hydroxylgruppe, eine Alkylsilylgruppe bzw.
ein Wasserstoffatom darstellen;
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R" ein Wasserstoffatom oder eine Phosphorylgruppe
darstellt, die gegebenenfalls einen Substituenten haben kann.
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Das Alkyl stellt hier einen gerad- oder verzweigtkettigen
Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen dar,
und das Aryl stellt einen Kohlenwasserstoffrest mit 6 bis
30 Kohlenstoffatomen einschließlich einer Phenylgruppe dar.
Beispiele des Substituenten sind u. a. eine Cyanethylgruppe,
Chlorphenylgruppe und ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis
10 Kohlenstoffatomen. Die Nucleotidsequenz muß nicht
notwendigerweise zu der Sequenz genomischer RNA aus AIDS-Virus
oder zu in Chromosomen integrierter -DNA komplementär sein.
Allgemeine Formel (4)
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wobei:
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m''' eine ganze Zahl von 1 bis 100 ist (vorausgesetzt,
X'&sub1; und X' sind alle in der 2'-Stellung substituiert, stehen
für ein Wasserstoffatom und m ist eine ganze Zahl von 4 bis
50);
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B''' B'''&sub2;, B'''&sub3;, ..... B'''(m'''+1) darstellt, mit der Maßgabe,
daß nicht alle von ihnen Adenin-9-yl darstellen; und B''' &sub1; bis
(m'''+2)' die gleich oder verschieden sein können, jeweils
einen der Reste Hypoxanthin-9-yl, Guanin-9-yl, Adenin-9-yl,
Cytosin-1-yl, Uracil-1-yl bzw. Thymin-1-yl darstellen;
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Q''' Q'''&sub2;, Q'''&sub3; .....Q'''(m'''+1) darstellt, und mindestens
einer der Reste Q'''1 bis Q'''(m'''+1) ein Thioanion darstellt.
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Q'''&sub1; bis Q'''(m'''+1) stellen unabhängig voneinander ein Thioanion,
ein Oxoanion, eine Aryloxygruppe, eine Alkylaminogruppe, eine
Arylaminogruppe, eine Alkylthiogruppe bzw. eine Arylthiogruppe
dar;
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X' X'&sub2;, X'&sub3;, ..... X'(m'''+1) darstellt, und K'&sub1; bis X'(m'''+1)
die gleich oder ungleich sein können, jeweils ein
Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe darstellen (vorausgesetzt, sind
alle X'&sub1; bis X'(m'''+1) in der 2'-Stellung substituiert, so sind
nicht alle eine Methylgruppe);
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R''' ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe mit 1 bis 20
Kohlenstoffatomen und eine Phosphorylgruppe, die gegebenenfalls
einen Substituenten besitzen kann, darstellt; und
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und Y'''&sub2; unabhängig voneinander eine Methoxygruppe,
eine Carboxylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, eine
Alkyloxygruppe, die gegebenenfalls einen Substituenten besitzen
kann, eine Hydroxylgruppe, eine Alkylsilylgruppe, ein
Wasserstoffatom, bzw. eine Phosphorylgruppe, die gegebenenfalls
einen Substituenten haben kann, darstellen.
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Das Alkyl stellt hier einen gerad- oder verzweigtkettigen
Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen und das
Aryl einen Kohlenwasserstoffrest mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen
einschließlich einer Phenylgruppe dar. Beispiele des
Substituenten sind u. a. eine Cyanethylgruppe,
Chlorphenylgruppe und einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 20
Kohlenstoffatomen.
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In der oben beschriebenen Formel bedeuten die
Sauerstoffatome in der 2'-Stellung und in der 3'-Stellung im Zuckerteil
des Nucleosidmonomers, ist eines X', dass das andere an das
Phosphoratom (P) gebunden ist. Der Bindungsmodues des Monomers
am Zuckerteil ist entweder eine 2'-5'-oder eine 3'-5'-Bindung.
Es können auch beide Bindungsformen in einem Oligoribonucleotid
vorliegen.
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Die Nucleotidsequenz muss nicht notwendigerweise zu der
Sequenz genomischer RNA aus AIDS-Virus oder zu in Chromosomen
integrierter DNA komplementär sein.
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Die Nucleosidbase (oder die geschützte Nucleosidbase)
der 2'-O-Methylribonucleosid-3'-(H-phosphonat)-Verbindung
oder der 3'-O-Methylribonucleosid-2'-(H-phosphonat)-Verbindung
gemäß der Erfindung ist ausgewählt aus
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Die 5'-OH-Gruppe der 2'-O-Methylribonucleosid-3'-(H-
phosphonat)-Verbindung oder der 3'-O-Methylribonucleosid-2'-(H-
phosphonat)-Verbindung gemäß der Erfindung kann geschützt
sein durch eine Monomethoxytrityl-Schutzgruppe oder eine
Dimethoxytrityl-Schutzgruppe.
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Die 2'-O-Methylribonucleosid-3'-(H-phosphonat)-Verbindung
hat die
allgemeine Formel (5)
Die Nucleoside haben die allgemeine Formel (6)
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Sie können zusammen mit den Methytrebionucleosid-
Verbindungen gemäß der Erfindung verwendet werden.
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In den allgemeinen Formeln (5) und (6) stellt W eine
Monomethoxytritylgruppe oder eine Dimethoxytritylgruppe dar;
Y&sub4; stellt eine Methoxygruppe, eine Alkyloxygruppe, die
gegebenenfalls einen Substituenten haben kann oder ein
Wasserstoffatom dar; n und t, die verschieden oder unabhängig
voneinander sein können, stellen jeweils eine ganze Zahl von
1 bis 30 dar; (P) stellt ein Regelporen-Glasderivat, ein
Polystyrolderivat oder ein Silikagelderivat dar; und Z stellt
einen Substituenten dar, der durch eine der unten stehenden
allgemeinen Formeln dargestellt wird:
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Die Kohlenstoffatomanzahl des Alkylanteils in der
Alkyloxygruppe ist 1 bis 10. Beispiele der Alkyloxygruppe
mit einem Substituenten sind u. a.:
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usw.
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Zur Antiviruswirkung des Oligodesoxynucleotids wird ein
Beispiel der Verwendung von Oligodesoxynucleotid für die
Hemmung der Vermehrung von Rous-Sarkoma-Virus beschrieben,
ohne daß es in irgendein Derivat umgewandelt wird. (Zamecnik,
P. C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 280-284, 1978). Das
Oligodesoxynucleotid zersetzt sich dagegen wie beschrieben
schnell in Kulturen von Säugetierzellen, Zellextrakten oder
Seren wird (Wickstrom, E., Journal of Biochemical and
Biophysical methods, 13, 97-102, 1986). Um eine wirksamere
Antivirusaktivität des Oligodesoxynucleotides zu erhalten,
muß es wünschenswerterweise in nicht-zersetzbare Derivate
umgewandelt werden. Derivate, die durch Umwandeln des
Phosphodiesters im Oligodesoxynucleotid in Methylphosphonat
erhalten werden, hemmen wie beschrieben die Vermehrung des
Herpes-simplex-Virus vom Typ I (Smith, C. C. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83, 2787-2791, 1986). Derivate, erhalten
durch Umwandeln des Phosphordiesters im Oligodesoxynucleotid
in Phosphorthioat, sind außerdem stabiler (S-)ein, C. A., Nucleic
Acids Res., 16, 3209-3221, 1988). Diese Derivate hemmen die
Proliferation des AIDS-Virus (Matsukura, M. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84, 7706-7710, 1987). Die Antivirus-
Aktivität wird zudem gegen das vesikuläre Stomatitis-Virus
aus Rind durch Einbringen von Phosphorthioatderivaten in
doppelsträngige poly-RNA oder einem Interferon-Induktor erhöht.
(De Clercq, E. et al., Virology, 42, 421-428, 1970).
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2'-O-Methylribooligonucleotid nimmt dagegen bekanntlich
die Struktur der 2'-Hydroxygruppe im Zuckerteil von
methylierter RNA an. Es ist resistent gegenüber verschiedenen
Enzymen (Nukleasen), die DNA oder RNA zersetzen (Gray, M. W.
et al., Biochem. Biophys. Acta, 134, 243, 1967; Dunlap, B. E.,
et al., Biochemistry, 10, 2581-2587, 1971). Außerdem bildet
2'-O-Methylribooligonucleotid einen stabilen Duplex mit RNA,
die dessen komplementäre Sequenz besitzt. Die Stabilität ist
erheblich besser als die Stabilität von komplementärem DNA-RNA-
Doppelstrang mit der gleichen Nucleotidsequenz (Inoue, H.,
et al. Nucleic Acids Res., 15, 6131-6148, 1987). 2'-O-
Methylribooligonucleotid wird bekanntlich auch für
stellenspezifisches Spalten von RNA verwendet, wobei man die
Eigenschaft ausnutzt, daß es gegenüber Zersetzung durch RNase
H resistent ist (Inoue, H. et al., FEBS Letters, 215, 327-330,
1987). Außerdem wird 2'-O-Methylribooligonucleotid verwendet,
um eine unidirektionale DNA-Deletionsmutante zu erzeugen,
wobei man die Eigenschaft ausnutzt, daß es gegenüber der DNase
Bal31-Nuklease verglichen mit DNA sehr beständig ist (Mukai,
S. et al., Nucleic Acids Symposium Series, Nr. 19, 117-120,
1988). Die vorangegangenen Befunde beruhen auf den
Eigenschaften, daß 2'-O-Methylribooligonucleotid mit RNA einen stabilen
Duplex bildet, die dessen komplementäre Nucleotidsequenz hat
und gegenüber verschiedenen DNA- oder RNA-zersetzenden Enzymen
(Nukleasen) beständig ist. Poly-2'-O-methylribooligonucleotid
hemmt außerdem wie früher schon beschrieben das Fortschreiten
von durch Retrovirus verursachten Krebs in Mäusen, wenngleich
dessen Mechanismus vollkommen unbekannt war (Tennant, R. W.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71. 3167-3171, 1974).
Außerdem kann 2'-O-Methylribooligonucleotid wie ein
Oligoribonucleotid hergestellt werden, wobei billigere
Rohstoffe als bei Desoxyoligonucleotid verwendet werden.
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Folgende Befunde sind gemäß jüngster Studien bezüglich
der Struktur und der Eigenschaften des ATDS-Virus gemacht
worden, d. h.: Das AIDS-Virus ist ein Retrovirus mit
einzelsträngiger RNA von etwa 9000 Nucleotiden Länge als
Gensubstanz und besitzt eine reverse Transkriptase. Seine
Gen-Nucleotidsequenz (Primärstruktur) ist bereits beschrieben
worden (Ratner et al., Nature 313, 277-284, 1985; Muesing,
M. A. et al., Nature 313, 450-458, 1985; Sanchez-Pescador,
R. et al., Science 227, 484-492, 1985; Wain-Hobson, S. et
al.., Cell, 40, 9-17, 1985). Zielzellen der Infektion sind
Helfer-/Induktorzellen, die als Oberflächenantigen unter den
menschlichen Lymphozyten T4-(mit einem monoklonalen Antikörper
nachgewiesenes Antigen)-positiv sind. Nach der Infektion
verursachen sie cytopathische Wirkungen und zerfallen. Das
Virus wechselt nach Adsorption an und Eindringen in die Zellen
durch reverse Transkriptase, die es selber besitzt, unter
Verwendung von tRNALys als Primer in lineare doppelsträngige
Virus-DNA, wandert in den Kern, nimmt eine zirkuläre Struktur
an und wird in die chromosomale Wirtszell-DNA integriert.
Es entsteht so ein Provirus. Das Provirus wird von einer
zellabstammenden RNA-Polymerase II wie messenger-RNA
(nachstehend einfach als mRNA bezeichnet) von Wirtszellen
transkribiert. Dadurch wird das Provirus in Virusprotein
translatiert. Dieser Vorgang wird durch mindestens zwei
Genprodukte reguliert, d. h. tat (Transaktivator) und rev
(Regulator der Expression von Virionproteinen), die vom Virus
selbst codiert werden. Tat wirkt als
transkripbionsaktivierender Faktor für das Virus auf den Bereich, der als
TAR-Element (transwirkendes reagierendes Element) bezeichnet
wird, unmiatelbar hinter der Transkriptionsinitiationsstelle
(Rosen, C. A. et al., Cell 41, 813-823, 1985). Die
transkribierte Virus-RNA wird teilweise zu genomischer RNA, die in
das Virion eingekapselt wird, und wird in einigen Fällen als
mRNA für die Genexpression verwendet. Es liegen mehrere mRNA-
Sorten vor; RNA voller Länge für die Expression von Virus-
Antigen und reverser Transkriptase, mRNA für die Expression
von Hüll-Glykoprotein, die durch einmaliges Spleißen verkürzt
wird, mRNA, die zudem für die Expression von Genen wie tat,
rev, usw. durch mindestens zweimaliges Spleißen verkürzt wird,
und dergleichen.
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Die mithilfe der erfindungsgemäßen Verbindungen
hergestellten Oligonucleotide hemmen wirksam die Infektion und
die Vermehrung des AIDS-Virus, indem der Phosphatteil weiter
derivatisiert wird und man die Vorteile von
2'-O-Methylribobligonucleotid und Oligoribonucleotid ausnutzt. Die
Hemmwirkung liegt klar in der Bindungsart der 3'-5'-Bindung
im Monomer dieser Oligomere, d. h. 3'-O-Methylnucleosid kann
ihr Bestandteil sein. Das Monomer des Oligomermoleküls enthält
somit die 3'-5'-Bindung des Zuckers. Ferner kann die 2'-
Hydroxygruppe vollständig oder teilweise methyliert oder
acyliert sein. Der Zucker an den 3'- und 5'-Termini des
Oligonucleotids kann gegebenenfalls einen Substituenten haben,
wie in den allgemeinen Formeln (1) bis (4) gezeigt.
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Die mithilfe der erfindungsgemäßen Verbindungen
hergestellten Oligonucleotide liegen in einer Form vor, bei
der das Phosphat in dem Oligomer derivatisiert ist, s. oben.
Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, daß die Derivate,
die eine Thiophosphatbindung enthalten, besonders wirksam
sind. Die Thiophosphatbindung ist nicht für alle
Phosphordiesterbindungen in dem Oligomermolekül notwendig. Die
Hemmwirkung kann in jedem Fall hervorgerufen werden, wenn
diese Nucleotidsequenzen zu denen von genomischer RNA für
das AIDS-Virus oder in das Chromosom integrierter DNA
komplementär sind, und wenn die Nucleotidsequenzen nicht
nötigerweise komplementär sind.
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Das Oligomer mit einer komplementären Sequenz hat
bevorzugt einen Bereich zum Ziel, der bei Virusgenen eine wichtige
Rolle spielt. Verbindung VI, Verbindung VII, Verbindung VIII,
Verbindung IX und Verbindung XII in den Bespielen sind alles
Sequenzen, die komplementär sind zu dem Bereich mit der
Nucleotidequenz:
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5' U U U A U C C A U U U U C A G A A U U G G G U C U 3',
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der nach Position 5300 (die Transkriptionsinitiationsstelle
wird als erste Position gezählt) genomischer Virus-RNA oder
mRNA vorliegt, und dem Bereich, in dem Spaltung und Ligierung
des ersten Spleißens der mRNA auftreten,. Man erwartet, daß
durch dessen Hemmung die Expression von Hüllprotein- oder
Genen wie tat, rev usw. gehemmt wird. Außerdem ist Verbindung
X in den Beispielen komplementär zu der Nucleotidsequenz:
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5ºC A G U G G C G C C C G A A C A G G G A C 3'
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mit der Primer-tRNA-Bindungsstelle in dem Bereich für die
Initiation der reversen Transkription genomischer Virus-RNA.
Folglich kann man die Hemmung der Transkriptionsinitiation,
die die erste Stufe bei der Replikation von Virusgen ist,
erwarten.
-
Außerdem ist Verbindung X&sub1; in den Beispielen komplementär
zu einer Nucleotidsequenz im TAR-Element, bei dem das tat-
Produkt:
-
5ºC A G A U C U. G A G C C U G G G A G C U C 3'
-
am 5'-Terminus von genomischer Virus-RNA oder mRNA wirkt.
Sämtliche Derivate zeigen eine starke Anti-AIDS-Virus-
Aktivität. Der Mechanismus auf die Aktivität ist jedoch
experimentell noch nicht eingehend bewiesen.
-
Oligodesoxynucleotid-Derivate, die nicht komplementär
zur Nucleotidsequenz von genomischer AIDS-Virus-RNA oder in
Chromosomen integrierter DNA sind, sind dagegen wie die
Komplementärderivate ebenfalls aktiv gegen AIDS-Virus, siehe
Veröffentlichungen, die sich mit der Anti-AIDS-Virus-Aktivität
unter Verwendung von Oligodesoxynucleotid-Derivaten
beschäftigen (vgl. Matsukura, M. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84, 7706-7710, 1987; Agrawal, S. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 85, 7709-7083, 1988)
-
Dagegen zeigen die durch die allgemeinen Formeln (1),
(3) und (4) dargestellten erfindungsgemäßen Verbindungen,
die mit billigeren Rohstoffen als bei Oligodesoxynucleotid-
Derivaten erzeugt werden können, Anti-AIDS-Virus-Aktivität,
obwohl diese Verbindungen nicht notwendigerweise zu der
Nucleotidsequenz von genomischer ATDS-Virus-RNA oder in das
Chromosom integrierter -DNA komplementär sind.
-
Die Verbindungen XV, XVII, und XVIII in den Beispielen,
unter anderem Verbindungen gemäß allgemeiner Formel (3),
besitzen antivirale Aktivität, wenngleich diese Verbindungen
nicht komplementär sind zur Nucleotidsequenz von genomischer
AIDS-Virus-RNA oder in das Chromosom integrierter -DNA.
-
Andererseits haben mithilfe der erfindungsgemäßen
Verbindungen hergestellte Oligönugleotide niedrigere
Molekulargewichte als die hochmolekulargewichtigen doppelsträngigen
RNA, die als starker Interferon-Induktor bekannt ist (s.
Lanpson, G. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58, 782,
1967; Field, A. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58, 1004,
1967) und Derivaten davon (DeClercg, E. et ah, Virology,
42, 421-428, 1970). Die Verbindungen sind klar verschieden
von 2'-5'-OligoA, das gänzlich aus Adenosinen zusammengesetzt
ist, die 2'-5'-Bindung enthält und ein
Proteinsynthese-Hemmstoff ist, der in mit Interferon behandelten Zellen gefunden
wird, (vgl. Kerr, I. M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 256,
1978) und Derivaten davon.
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Die mithilfe der erfindungsgemäßen Verbindungen
hergestellten Oligoribonucleotid-Derivate können durch bekannte
Verfahren wie dem Amidit-Verfahren (vgl. Matteucci, M. D. et
al., Tetrahedron Lett., 22, 719, 1980), dem H-Phosphonat-
Verfahren (vgl. Froehler, B. C. et ah, Tetrahedron Lett. 27
469, 1986; Garegg, P. J. et al., Tetrahedron Lett., 27, 4055,
1986) und dergleichen hergestellt werden. Die durch die
allgemeine Formel (5) dargestellten
2'-O-Methylribonucleotid-Derivate, die als Rohstoffe für die Erzeugung der
2'-O-Methylribooligonucleotid-Derivate nach dem H-Phosphonat-Verfahren
bereitgestellt werden können, können hergestellt werden, indem
man zu den geschützten 2'-O-Methylribonucleosid-Derivaten
nach bekannten Verfahren (vgl. Robins, M. J. et al., J. Org.
Chem. 39, 1891, 1974; Heikkila, J. et al.., Acta Chem Scand.,
B 36, 715, 1982; Inoue, H. et al., Nucleic Acids Research
15, 6131, 1987) Phosphortrichlorid leitet und mit diesem nach
bekannten Verfahren umsetzt (vgl. Froehler, B. C. et al.,
Tetrahedron Letters, 27, 469-427, 1986; Garegg, P. J. et al.,
Tetrahedron Letters, 27, 4051-4054, 1986). Nach diesem
Verfahren wurden die Verbindungen I, II, III, IV und V unten
hergestellt.
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wobei DMT und MMT die Dimethoxytritylgruppe bzw. die
Monomethoxytritylgruppe darstellen.
-
Ferner können die durch die allgemeine Formel (5)
dargestellten 2'-O-Methylribonucleotid-Derivate ebenfalls durch
Umsetzen der geschützten 2'-O-Methylribonucleosid-Derivate
mit Phosphorsäure in Gegenwart eines Kondesationsmittels wie
Triisopropylbenzolsulfonylchlorid oder Pivaloylchlorid durch
bekannte Verfahren (vgl. Hata, T. et al., J. Am. Chem. Soc.,
96, 7363, 1974; Sekine, M. et al., Tetrahedron Letters, 29,
1037-1040, 1988) erzeugt werden. Außerdem werden die
geschützten 3'-O-Methylnucleosid-Derivate nach bekannten
Verfahren hergestellt (vgl. Robins, M. J. et al., J. Org. Chem.,
39, 1891, 1974; Heikkila, J. et ah, Acta Chem. Scand., B36,
715, 1982), und die Derivate können in die
3'-O-Methylnucleosid-H-Phosphonat-Derivate nach dem oben beschriebenen
Verfahren umgewandelt werden. Diese können als Rohstoffe zur
Herstellung der durch die allgemeinen Formeln (1) und (4)
dargestellten Oligoribonucleotid-Derivate bereitgestellt
werden.
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Die Rohstoffe für die Herstellung der durch die
allgemeinen Formeln (1) und (4) dargestellten
Oligoribonucleotid-Derivate sind, wobei alle oder einige der durch X&sub1; - Xm+1
oder X'&sub1; - X'm'''+1 gezeigten Substituenten, Wasserstoff sind, z. B.
geschützte 2'- (oder
3')-O-(tert.-Butyldimethylsilyl) ribonucleoside, die leicht durch ein bekanntes Verfahren
hergestellt werden können (Ogilvie, K.K., Can. J. Chem., 51.
3799, 1973); diese Derivate könijen ähnlich wie oben in die
H-Phosphonat-Derivate umgewandelt werden.
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Die durch die allgemeine Formel (6) dargestellten
neuartigen Nucleosidderivate können z. B. durch ein bekanntes
Verfahren (vgl. Miyoshi, K. et al., Nucleic Acids Res. 8,
5491, 1980) unter Verwendung der geschützten 3'-O-Methyl
(3'-Oalkyl- oder 3'-desoxy)nucleoside hergestellt werden.
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Mithilfe der neuen geschützten 2'-O-Methylribonucleotid-
und 3'-O-Methylribonucleotid-Derivate gemäß der Erfindung
und/oder der geschützten 2'(oder
3')-O-(tert.-Butyldimethylsilyl)ribo-nucleotid-Derivate und der neuartigen Nucleosid-
Derivate,
hergestellt nach mit vorgenannten Verfahren, können
2'-O-Methylribooligonucleotid-Derivate und Oligoribonucleotid-
Derivate hergestellt werden, z. B. nach bekannten Verfahren
(vgl. Froehler et al., Tetrahedron Letters 27, 469-472, 1986;
Garegg, P. J. et al., Tetrahedron Letters 27, 4051-4054, 1986).
Die Nucleotidderivatbestandteile sind somit nacheinander
kondensierte neuartige Nucleosidderivate als Polymerträger,
wobei Acylchlorid zur Kettenverlängerung dient. Dann wird
unter Verwendung verschiedener Oxidationsmittel wie Schwefel
(S&sub8;), Iod (12) oder eines Alkylamin/Tetrachlorkohlenstoff,
usw. oxidiert, gefolgt von dem Entfernen der Schutzgruppe
und Reinigen.
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Ferner können die durch die allgemeinen Formeln (1),
(2) und (4) dargestellten Verbindungen, wobei die durch Q,
Q' und Q''' gezeigten Substituenten Thioanionen oder Thioanionen
und Oxoanionen sind, und die durch die allgemeine Formel (3)
dargestellten Verbindungen, ebenfalls nach dem Amidit-Verfahren
hergestellt werden (vgl. Matteucci, M. D. et al., Tetraedron
Lett. 22, 719, 1980; Shibahara, S. et al., Nucleic Acids
Research 15, 4403, 1987; Usman, N. et al., J. Am. Chem. Soc.
109, 7845, 1987). In diesem Fall kann das Monomer mit (S&sub8;)
oder Iod (12) in dem Oxidationsschritt nach der Kondensation
oxidiert werden, und dann einer Kettenverlängerung unterzogen
werden, gefolgt von Entfernen der Schutzgruppe und Reinigung.
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Die Kettenverlängerung des Oligomers auf dem Polymerträger
erfolgt ferner in den Verbindungen, die an ihrem 5'-Terminus,
z. B. eine alkylsubstituierte Thiophosphorylgruppe, eine
alkylsubstituierte Phosphorylgruppe oder eine
alkylsubstituierte Alkylaminophosphorylgruppe enthalten, durch
das vorstehend beschriebene Verfahren. Nach Beendigung der
Oxidation wird das Oxidationsprodukt mit einem Alkyl-H-
phosphonat kondensiert, und das Kondensationsprodukt wird
mit Schwefel (S&sub8;), Iod (I&sub2;) oder einem
Alkylamin/Tetrachlotkohlenstoff oxidiert, gefolgt von Entfernen der Schutzgruppe
und Reinigung. Die Derivate, bei denen Cholesterin am 5'-
Terminus über ein Zwischenstück gebunden ist, können ähnlich
erhalten werden, indem man mit Mono (monomethoxytrityliertem)-
alkandiol-H-phosphonat kondensiert, mit einer Säure behandelt,
mit Cholesteryl-H-phosphonat kondensiert, oxidiert, die
Schutzgruppen entfernt und reinigt.
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Die Verbindungen, die z. B. eine
Hydroxyalkylphosphoryloxygruppe oder eine Hydroxyalkylthiophosphoryloxygruppe
an ihren 3'-Termini besitzen, können dagegen durch
Kondensieren, Oxidieren, Entfernen der Schutzgruppe und Reinigen
auf ähnliche Weise erhalten werden, wobei ein Polymerträger
als Ausgangsstoff verwendet wird, an den ein
Alkandiolmonosuccinat gebunden ist.
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Die Anti-AIDS-Aktivität kann bestimmt werden durch das
in einer Veröffentlichung beschriebene Verfahren (vgl. Harada,
S. et al., Science, 229, 563-566, 1985) unter Verwendung von
HTLV-IIIB (vgl. Popovic, M. et al., Science, 224, 497-500,
1984), einem isolierten AIDS-Virus-Stamm. Nach diesem Verfahren
wird/werden MT-4-Zellen oder eine HTLV-I-positive Zellinie
als Zielzelle verwendet. Dieses Verfahren reagiert daher stark
sensititv auf virale Infektion und zeigt eindeutige
cytopathische Wirkung. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde
die Cytopathogen-Hemmwirkung mit den Verbindungen VI, VII,
VIII, IX, X, XI, XII, XV, XVI, XVII, XVIII, XXIII und XXIV
bestimmt, nachdem jede Verbindung mit Medium auf verschiedene
Konzentrationen verdünnt wurde. Daher wurde die Cytopathogen-
Hemmwirkung und die Hemmung der Entwicklung von Zellen, die
für virusspezifisches Antigen positiv sind, mit Verbindung
VI in einer Konzentration von 10 uM, Verbindungen VII, X und
XII in einer Konzentration von 15 uM und Verbindung VIII in
einer Konzentration von 1 uM erhalten. Es wurde sogar bei
der getesteten Höchstkonzentration von 120 uM keine
Cytotoxizität nachgewiesen. Die Cytopathogen-Hemmwirkung und die
Hemmung der Entwicklung von Zellen, die für virusspezifisches
Antigen positiv sind, wurde dagegen mit Verbindung IX in einer
Konzentration von 240 uM und mit Verbindung XI in einer
Konzentration von 30 uM erhalten. In diesen Konzentrationen
wurde keine Cytotoxizität nachgewiesen.
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Diese Hemmwirkungen wurden ähnlich mit Verbindung XVI
in einer Konzentration von 1 uM erhalten. Sie wurden jedoch
mit Verbindung XV in einer Konzentration von 7,5 uM, mit
Verbindung XVII in einer Konzentration von 15 uM und mit
Verbindung XVIII in einer Konzentration von 120 uM erhalten.
Es wurde sogar bei den Höchstkonzentration (60 uM mit den
Verbindungen XV und XVI und 120 uM mit den Verbindungen XVII
und XVIII) keine Cytotoxizität nachgewiesen.
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Ferner hemmte die Verbindung XXIII das Cytopathogen
vollständig in einer Konzentration von 3,8 uM bzw. das
Auftreten von Zellen, die für virusspezifisches Antigen positiv
sind, in einer Konzentration von 7,5 uM. Die Verbindung XXTV
hemmte das Cytogathogen im wesentlichen vollständig in einer
Konzentration von 7,5 uM, bzw. das Auftreten von Zellen, die
für virusspezifisches Antigen positiv sind, in einer
Konzentration von 30 uM. Es wurde sogar bei den getesteten
Höchstkonzentration (60 uM) mit diesen Verbindungen keine
Cytotoxizität nachgewiesen.
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Die Cytopathogen-Hemmwirkung wurde dagegen mit
Desoxyoligocytidinphosphorthioat (15mer) oder
Desoxyoligonucleotid (Phosphat-Typ) mit der gleichen Nucleotid-Sequenz
wie Verbindung VI oder XI in einer Konzentration von 10 uM
beobachtet.
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Daraus folgt, daß die erfindungsgemäßen neuen 2'-O-
Methylribooligonucleotid-Derivate und die neuen
Oligoribonucleotid-Derivate Anti-AIDS-Virus-Aktivität besitzen. Man
erwartet, daß sie als Anti-AIDS-Medikamente verwendet werden.
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Das erfindungsgemäße Anti-Virusmittel kann von 0,01 bis
2000 mg, vorzugsweise von 0,02 bis 500 mg, verwendet werden.
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Der wirksame Bestandteil kann z. B. in Form einer Kapsel,
eines Elixiers, einer Mikrokapsel oder einer Suspension
verwendet werden.
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Die als erfindungsgemäßer wirksamer Bestandteil verwendete
Verbindung kann dem Patienten, der eine Behandlung oder
Prophylaxe benötigt, in einer Dosis von 0,01 bis 1000 mg pro
Person, gewöhnlich mehrmals in einer täglichen Dosis von 0,02
bis 2000 mg verabreicht werden. Die Dosis kann in Abhängigkeit
vom Erkrankungszustand, dem Körpergewicht des Patienten und
anderen Faktoren, die der Fachmann kennt, variiert werden.
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Die erfindungsgemäß verwendete Verbindung oder eine
physiologisch annehmbare Salzverbindung oder ein Gemsich davon
kann gemeinsam gemischt werden mit Vehikeln, Trägern,
Verdünnungsmitteln, Bindemitteln, Antiseptika,
Stabilisierungsmitteln, Geschmacksstoffen, usw. in einer Menge von etwa 0,2
bis 500 mg in einer Einheits-Dosierungsform, die zur
Herstellung gewöhnlich zugelassener pharmazeutischer Präparate
erforderlich ist. In diesen Zusammensetzungen oder Präparaten
ist der Wirkstoff in einer Menge eingeschlossen, die eine
angemessene Dosis im angegebenen Bereich liefert.
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Spezifische Beispiele für Medikamente, die in Tabletten,
Kapseln usw. eingebracht werden können, sind: Bindemittel
wie Traganthkautschuk, Gummi arabicum, Maisstärke oder
Gelatine; Exzipienten wie feine kristalline Cellulose;
Schwellmittel wie Maisstärke, vorgelatinierte Stärke,
Alginsäure, usw.; Schmiermittel wie Magnesiumstearat; Süßstoffe
wie Saccharose, Lactose oder Saccharin; Geschmacksstoffe wie
Pfefferminz, Gaultheria adenothrix-Öl oder Kirsche, usw. Ist
die Präparate-Einheitsform eine Kapsel, kann ein flüssiger
Träger wie Öle und Fette zusätzlich in die Stoffe des oben
beschriebenen Typs eingebracht werden. Andere Stoffe können
als Schutzmittel eingebracht werden, oder um die physikalische
Form der Präparate-Einheit durch ein anderes Verfahren zu
ändern. Tabletten können z. B. mit Schellack oder Zucker oder
mit beiden beschichtet werden. Ein Sirup oder Elixier kann
Saccharose als Süßstoff, Methyl- und Propylparabene als
Antiseptika, und Pigmente und Geschmacksstoffe wie Kirschen-
oder Orangengeschmack enthalten.
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Bei einer magensaftresistenten Beschichtung wird z. B.
eine wäßrige 8%ige Hydroxyphenylmethylcellulose-Lösung als
Beschichtungs-Vorbehandlungsmittel, eine wäßrige 10%ige
Hydroxypropylmethylcellulosephthalat-Lösung und eine wäßrige
3%ige Polyacetyn-Lösung als Beschichtungsmittel verwendet.
Diese werden jeweils verwendet, um Präparate mit
magensaftresistenter Beschichtung auf herkömmliche Weise
herzustellen.
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Eine sterile Zusammensetzung für die Injektion kann auf
herkömmliche Weise formuliert werden, um pharmazeutische
Präparate durch Lösen oder Suspendieren des Wirkstoffes,
natürlich vorkommender Pflanzenöle wie Sesamöl, Kokosnußöl,
Erdnußöl, Baumwollsamenöl, usw. oder synthetischer Fettvehikel
wie Ethyloleat in einem Vehikel wie Wasser zur Injektion
herzustellen. Man kann, soweit nötig, auch Puffer, Antiseptika,
Antioxidantien, usw. zugeben.
Beispiele
-
Die Erfindung wird nachstehend anschaulich hinsichtlich
der nachfolgenden Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
Herstellung von
N&sup4;-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methylcytidin-3'-O-(H-phosphonat) (Verbindung 1):
-
Zu 50 ml einer Lösung aus 436 ul (5 mMol)
Phosphortrichlorid und 5,5 ml (50 mMol) n-Methylmorpholin in Dichlormethan
wurden 1,197 g (17,3 mMol) 1,2,4-Triazol gegeben. Das Gemisch
wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Zu dem
Gemisch wurden 17 ml einer Lösung aus 664,7 mg (1mMol) N&sup4;-
Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methylcytidin in
Dichlormethan während 10 Minuten gegeben. Das Gemisch wurde weiter
bei Raumtemperatur gerührt. Das Fortschreiten der Reaktion
wurde durch Dünnschichtchromatographie (mobile Phase:
Dichlormethan/2% Triethylamin/8% Methanol) unter Verwendung
von Silicagel 60 überwacht. Nachdem feststand, daß der Flecken
des Rohstoffs (Rf-Wert: 0,60) verschwand und ein neuer, von
Verbindung I herrührender Fleck mit einem Rf-Wert von 0,41
entstand, wurden 40 ml Triethylamin-Bicarbonatpuffer (1 M,
pH-Wert 7,5) zugegeben. Die wäßrige Schicht wurde mit 15 ml
Dichlormethan extrahiert. Die Dichlormethanschichten wurden
vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und
dann bis zur Trockne verdampft. Dann wurde der entstandene
schaumige Rückstand in 3 ml Dichlormethan gelöst, das 2%
Triethylamin enthielt. Die Lösung wurde über eine Säule
gereinigt, die mit 24 g Silicagel 60 gefüllt war. D. h. die
Elution wurde durchgeführt, indem 100 ml Dichlormethan/2%
Triethylamin, dann 200 ml Dichlormethan/2% Triethylamin/3%
Methanol und weiter 200 ml Dichlormethan/2% Triethylamin als
mobile Phase verwendet wurden. Die erhaltene reine Fraktion
der Verbindung I wurde bis zur Trockne verdampft. Der erhaltene
Rückstand wurde in 40 ml Dichlormethan gelöst. Die Lösung
wurde mit 15 ml 1 M Triethylamin-Bicarbonatpuffer (pH-Wert
7,5) gewaschen. Nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat
wurde die Dichlormethan-Schicht bis zur Trockne verdampft,
wobei 703 mg (0,849 mMol) Verbindung I in einer 84,9%igen
Ausbeute entstanden.
-
Auf ähnliche Weise wie bei dem oben beschriebenen
Arbeitsgang wurden
N&sup6;-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-Omethyladenosin-3'-O-(H-phosphonat) (Verbindung 11), N²-
Isobutylyl-5'-O-monomethoxytrityl-2'-O-methylganosin-3'-O-(H-
phosphonat) (Verbindung III),
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-Omethyluridin-3'-O-(H-phosphonat) (Verbindung IV), 5'-O-
Dimethoxytrityl-2'-O-methylinosin-3'-O-(H-phosphonat)
(Verbindung V) in Ausbeuten von 93,9%, 49,4%, 77,4% bzw. 56,0%
erhalten.
-
Dann wurden die ³¹P-NMR dieser Verbindungen gemessen.
Von Verbindung I, II und III wurde jeweils ein Teil in
Dichlormethan gelöst, und nach Mischen der Lösung mit einer
äguimolaren Menge 1,8-Diazabicyclo [5.4.0] undec-7en (einfach
als DBU bezeichnet) wurde das Gemisch in n-Hexan getropft,
wobei das DBU-Salz gebildet wurde. Das Salz wurde pulverisiert,
und das Pulver wurde gemessen. Die Verbindungen IV und V wurden
dagegen so gemessen wie sie waren, d. h. als Triethylaminsalze.
Als Lösungsmittel für die Messung wurde d&sub5;-Pyridin verwendet.
Als externer Standard wurde eine Lösung von Phosphorsäure
in D&sub2;O verwendet.
Die chemische Verschiebungen (ppm) waren wie folgt:
-
Verbindung I -1,79 ppm
-
Verbindung II -2,20 ppm
-
Verbindung III -2,04 ppm
-
Verbindung IV -0,73 ppm
-
Verbindung V -0,40 ppm
Beispiel 2: Herstellung von 5'-O-Monomethoxytrityl-N²-
isobutylyl-3'-O-methylguanosin-gebundenem
Regelporen-Glas:
-
Auf herkömmliche Weise hergestelltes
5'-O-Monomethoxytrityl-N²-isobutylyl-3'-Omethylguanosin wurde durch ein
bekanntes Verfahren in einen 2'-O-Succinylpentachlorphenylester
überführt (vgl. Miyoshi, K. et al., Nucleic Acids Res. 8,
5491, 1980). D. h. es wurden 639 mg (1mMol)
5'-O-Monomethoxytrityl-N²-isobutylyl-3'-O-methyl-guanosin und 183 mg 4-N,N-
Dimethylaminopyridin (lediglich als DMAP bezeichnet) in 4
ml absolutem Pyridin gelöst. Zu der Lösung wurden unter Rühren
bei Raumtemperatur 150 mg (1,5 mMol) Bernsteinsäureanhydrid
gegeben. Nach 90minütigem Rühren wurde die Reaktionsflüssigkeit
unter reduziertem Druck destilliert. Der entstandene ölige
Rückstand wurde in 35 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wurde
dreimal mit 30 ml 0,1 M Triethylamin-Bicarbonatpuffer (pH-Wert
7,5) gewaschen. Nach Trocknen über wassserfreiem Natriumsulfat;
wurde die Chloroformschicht bis zur Trockne unter reduziertem
Druck verdampft. Der erhaltene Rückstand wurde in 5 ml
Dimethylformamid (DMF) gelöst, und 400 mg (1,5 mMol)
Pentachlorphenol und 309 mg (1,5 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden
zu der Lösung gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur
während 13,5 Stunden. Die gefällten nichtlöslichen Substanzen
wurden durch Filtration entfernt; und das Filtrat wurde unter
reduziertem Druck durch Destillation entfernt. Der entstandene
Rückstand wurde in 3 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wurde
durch Säulenchromatographie mit einer Säule gereinigt, die
mit 20 g Silicagel 60 gefüllt war. D. h. die Elution wurde
durchgeführt, indem als mobile Phase nacheinander 100 ml
Chloroform, 100 ml Chloroform/ 0,3% Methanol, 100 ml
Chloroform/0,5% Methanol und weiter 100 ml Chloroform/0,6% Methanol
verwendet wurden. Die entstandenen reinen Fraktionen von 5'-O-
Monomethoxytrityl-N²-isobutylyl-3'-O-methyl-guanosin-2'-Osuccinyl-pentachlorphenylester wurden gesammelt und unter
reduziertem Druck bis zur Trockne verdampft, wobei 530 mg
Ester in einer Ausbeute von 53,6% (Rf-Wert: 0,73 bei
Entwicklung mit Chloroform: Methanol = 20 : 1 in Silicagel 60-Dünnschichtchromatographie)
erhalten wurden. Dann wurde die gesamte
Menge (530 mg) des Esters in 5,4 ml DMF gelöst; Parallel wurden
1 g Regelporen-Glas (CPG/langkettiges Alkylamiri,
Porendurchmesser 500 Å, Partikelgröße 122-177 u NH&sub2;-30 uMol/g,
hergestellt von Pierce Chemical Inc.) in einen Reaktor gegeben,
der mit einem Glasfilter ausgerüstet war, und mit 1 ml DMF
gewaschen, gefolgt von Trocknen während 1 Minute in einem
Argongastrom. Es wurden 5,4 ml der vorher erwähnten
Pentachlorphenylester-DMF-Lösung und 73 ul Triethylamin jeweils zu dem
Porenglas gegeben. Nach Verschließen wurde die Reaktion über
Nacht bei 30ºC durchgeführt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde
unter einem Argondruck filtriertv Nach dreimaligem Waschen
mit 5 ml DMF und dann dreimal mit 5 ml Tetrahydrofuran (THF)
wurde das Regelporen-Glas eine Minute lang unter einem
Argonstrom getrocknet. Anschließend wurde ein Flüssiggemisch aus
410 mg DMAP, 1,4 g 2,6-Lutidin, 660 ul Essigsäureanhydrid
und 6 ml THF zu dem Porenglas gegeben. Das Gemisch wurde 15
Minuten lang bei 30ºC geschüttelt, um die nicht umgesetzte
Aminogruppe zu acetylieren. Nach Filtration wurde das
Reaktionsgemisch dreimal mit 5 ml THF und dann dreimal mit
5 ml Diethylether gewaschen, und in einem Argonstrom unter
Bildung von 1 g an Regelporen-Glas gebundenem
5'-O-Monomethoxytrityl-N²-isobutylyl-3'-O-methyl-guanosin getrocknet.
Eine geringe Menge Produkt wurde gewogen, und die
Monomethoxytritylgruppe wurde mit 3%iger Trichloressigsäure
gespalten. Das isolierte Tritanol wurde einer quantitativen
kolorimetrischen Bestimmung mit einem Perchlorsäure-Ethanol-
Gemisch unterworfen. Die gebundene Menge betrug 26 uMol/g.
-
Außerdem wurden
5'-O-Dimethoxytrityl-N&sup6;-benzoyl-3'-Omethyladenosin-gebundenes Regelporen-Glas,
5'-O-Dimethoxytrityl-3'-Omethylinosin-gebundenes Regelporen-Glas, 5'-O-
Dimethoxytrityl-3'-O-methyluridin-gebundenes Regelporen-Glas,
5'-O-Dimethoxytrityl-N&sup4;-benzoyl-3'-O-methylcytidin-gebundenes
Regelporen-Glas,
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-(tert.-butyldimethylsilyl)inosin-gebundenes Regelporen-Glas und
Monomethoxytritylhexandiol-gebundenes Regelporen-Glas auf gleiche
Weise wie oben hergestellt.
Beispiel 3: Herstellung von 5' Amp Cmp Amp Cmp Cmp Cmp
Amp Amp Ump Ump"Cmp Ump Gmp Amp Amp knp Amp
Ump Gmp Gm' 3' (Verbindung VI), wobei m eine
2'-O-Methylnucleosideinheit, m' ein 23-O-
Methylnucleosideinheit, und P:
-
darstellt
-
Es wurden 40 mg
N²-Tsobutylyl-5'-O-monomethoxytrityl-3'-Omethylguanosin-gebundener Polymerträger (bindende Menge: 1,0
uMol) in eine Kapsel verpackt, und die Kapsel wurde in einem
DNA-Synthetisiergerät (Model 380A, hergestellt von Applied
Biosystems Inc. untergebracht. Nach dem in Tabelle 1 gezeigten
Verfahren wurden die
2'-O-Methylribonucleosid-3'-O-(H-phosphonat)-Verbindungen (Verbindungen I bis IV) unter Verwendung
von III, IV, II, II, II, II, III, IV, I, IV, IV, II, II, I,
I, I, II, I und II in dieser Reihenfolge behandelt. Nach
Wiederholen von 19 Zyklen wurde das Zwischenprodukt zur
Herstellung des Polymerträgers aus der Kapsel genommen und
in einen mit einem Glasfilter ausgerüsteten Reaktor überführt.
Nach Waschen mit 1 ml Acetonitril wurde das Zwischenprodukt
in einem Argongasstrom getrocknet. Dann wurden 2 ml einer
Lösung aus 0,2 M Schwefel (S&sub8;) in Triethylamin :
Schwefelkohlenstoff : Pyridin (1 : 12 : 12, Volumenverhältnis) zu dem
Zwischenprodukt gegeben. Nach Schütteln wurde das Gemisch 12
Stunden lang stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde
filtriert und das Zwischenprodukt für die Synthese des
Polymerträgers wurde fünfmal mit 2 ml Schwefelkohlenstoff
und einmal mit 2 ml Diethylether gewaschen. Nach Trocknen
in einem Argonstrom wurde das Zwischenprodukt in ein Glasgefäß
mit 3 ml Volumen überführt. Es wurden 2 ml 28%iges
Ammoniakwasser in das Gefäß gegeben und versiegelt, gefolgt von
5stündigem Erhitzen bei 55ºC. Der Polymerträger wurde durch
Filtration entfernt und die Reaktionsflüssigkeit wurde bis
zur Trockne unter reduziertem Druck verdampft. Der entstandene
Rückstand wurde in 300 ul 0,1 M Triethylammonium-Essigsäure-
Puffer (pH-Wert 7,0, nachstehend einfach als TEAA bezeichnet),
der 10% Acetonitril enthielt, gelöst. Die Lösung wurde durch
eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm und einer Länge
von 12 cm gereinigt, die mit Umkehrphasen-Silicagel (Waters
Co., Ltd., Prep PAK-500/C-18) gefüllt war. D. h. 0,1 M TEAA-
Puffer (pH-Wert 7,0) mit einem linearen Gradienten von 10%
bis 35% Acetonitril wurde als mobile Phase verwendet, und
quantitative Bestimmung wurde bei einer Absorption bei einer
Wellenlänge von 254 nm durchgeführt, wobei die Fraktion der
Verbindung VI mit einer Dimethoxytritylgruppe am 5'-Terminus
erhalten wurde. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels unter
reduziertem Druck wurde der Rückstand zusammen mit 2 ha Wasser
dreimal coverdampft. Es wurden 3 ml 80%ige Essigsäure
dazugegeben, gefolgt von Rühren während 10 Minuten. Nach Verdampfen
der Reaktionsflüssigkeit bis zur Trockne wurde der Rückstand
weiter mit Wasser coverdampft, um die Essigsäure zu entfernen.
Zu dem Rückstand wurden 1, 5 ml 0,1 M
Triethylamin-Bicärbonatpuffer (pH-Wert 7,5) mit 10% Acetonitril gegeben. Das Gemisch
wurde zweimal mit 1,5 ml Diethylether gewaschen. Die wäßrige
Schicht wurde bis zur Trockne verdampft, und 200 ul 0,1 M
TEAA-Puffer (pH-Wert 7,0) mit 10% Acetonitril wurden zu dem
entstandenen Rückstand gegeben nach Hindurchleiten durch
ein 0,45 u-Filter (hergestellt von Millipore Corp.) wurde
durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gereinigt.
D. h. es wurde eine YMC-Pack-ODS-(hergestellt von Yamamurä
Science Co., Ltd.) -Säule und 0,1 M TEAA-Puffer (pH-Wert 7,0)
mit einem linearen Gradienten von 10% bis 70% Acetonitril
als mobile Phase verwendet. Der Hauptpeak, der bei einer
Fließgeschwindigkeit von 1,2 ml/min eluierte, wurde
fraktioniert, so daß 52,9 OD260nm-Einheiten (ca. 226 nMol) Verbindung
VI in einer Ausbeute von 22,6% entstanden.
-
Die Verbindung VI wurde in D&sub2;O mit 10 mM
Triethylaminbicarbonatpuffer (pH-Wert 7,5)gelöst, und ³¹P-NMR wurde
gemessen (Meßgerät: JEOL JMS-DX300, hergestellt von JEOL Inc.).
Wenn Trimethylphosphat als externer Standard verwendet wurde,
zeigte Verbindung VI ein charakteristisches Phosphorthioat-
Multiplett-Signal bei 51-55 ppm:
Tabelle 1: Ein Verfahrenszyklus der
Kettenverlängerungsreaktion
-
Außerdem wurde unter Verwendung von 2 uMol
nucleosidgebundenem Träger als Ausgangsstoff auf ähnliche Weise wie
bei dem oben beschriebenen Verfahren Verbindung VII in 26
OD260nm-Einheiten (etwa 132 nMol) in einer Ausbeute von etwa
6,3% erhalten, wobei nacheinander III, IV, II, II, II, II,
III, IV, I, VI, IV, II, II, I, I und I in dem
Kondensationszyklus verwendet wurden; Verbindung VILI wurde in 41,5 OD260nm-
Einheiten (etwa 136 nMol) in einer Ausbeute von etwa 6,2%
erhalten, wobei nacheinander II, II, IV, II, III, III, IV,
II, II, II, II, III, IV, I, IV, IV, II, II, I, I, I,
II, I
und II in dem Kondensationszyklus verwendet wurden; Verbindung
IX wurde in 62 OD260nm-Einheiten (etwa 528 nMol) in einer
Ausbeute von etwa 24,2% erhalten, wobei nacheinander II, III,
IV, I, IV, IV, II, II und I in dem Kondensationszyklus
verwendet wurden; und Verbindung X wurde in 37 OD260nm-Einheiten
(etwa 180 nMol) in einer Ausbeute von etwa 8,7% erhalten,
wobei nacheinander IV, I, II, I, I, III, I, III, III, III,
I, IV, IV, III, IV, I, I, I, IV und III in dem
Kondensationszyklus verwendet wurden. Außerdem wurde unter Verwendung
von 1 uMol Nucleosidgebundenem Träger als Ausgangsstoff,
Verbindung XI in 16,0 OD260nm-Einheiten (etwa 72 nMol) in einer
Ausbeute von etwa 7,2% erhalten, wobei nacheinander IV, I,
IV, II, III, II, I, IV, I, III, III, II, I, I, I, IV, I, III,
II und III in dem Kondensationszyklus verwendet wurden.
-
Außerdem wurde auf einer Weise, ähnlich dem oben
beschriebenen Verfahren, Verbindung XV in 25 OD260nm Einheiten
(etwa 81,7 nMol) in einer Ausbeute von etwa 3,4% erhalten,
wobe i als Ausgangsstoff 2,4 uMol 5'-O-Dimethoxytrityl-N&sup6;-
benzoyl-3'-Omethyladenosin-gebundenes Regelporen-Glas und
Verbindung 11 über 19 Zyklen in dem Kondensationszyklus
verwendet wurden; Verbindung XVI wurde in 74 OD260nm-Einheiten
(etwa 301 nMol) in einer Ausbeute von etwa 8,3% erhalten,
wobei als Ausgangsstoff 3,6 uMol
5'-O-Dimethoxytrityl-3'-Omethylinosin-gebundener Polymerträger und Verbindung V über
19 Zyklen in dem Kondensationszyklus verwendet wurden;
Verbindung XVII wurde in 58 OD260nm-Einheiten (etwa 292 nMol)
in einer Ausbeute von etwa 8,1% erhalten, wobei als
Ausgangsstoff 3,6 uMol
5'-O-Dimethoxytrztyl-3'-O-methyluridingebundener Polymerträger und Verbindung IV über 19 Zyklen
in dem Kondensationszyklus verwendet wurden; und Verbindung
XVIII wurde in 25 OD260nm-Einheiten (etwa 168 nMol) in einer
Ausbeute von etwa 4,7% erhalten, wobei als Ausgangsstoff 3,6
uMol
5'-O-Dimethoxytrityl-N&sup4;-benzoyl-3'-O-methylcytidingebundener Polymerträger und Verbindung I über 19 Zyklen in
dem Kondensationszyklus verwendet wurden.
-
Auf ähnliche Weise wurden die Verbindungen XXVII, XXVIII
und XXIX hergestellt.
Beispiel 4: Herstellung von Verbindung XII
-
In einen mit einem Glasfilter ausgerüsteten Reaktor wurden
120 mg (insgesamt bindende Menge 3,12 uMol) Polymerträger
gefüllt, an den N²-Isobutylyl-5'-O-monomethoxytrityl-3'-O-
methylguanosin gebunden war. Nach dem in Tabelle 1 gezeigten
Verfahren wurden die 2'-O-Methylribonucleosid-3'-O-(H-
phosphonat)-Verbindungen (Verbindungen I bis IV) in der
Reihenfolge III, IV, II, II und II verwendet, was über 5 Zyklen
wiederholt wurde. In den Arbeitsgängen Nr. 1, 3, 5, 6 und
9 wurden jedoch jeweils 2 ml verwendet. Anschließend wurden
2 ml einer Lösung aus 0,2 M Schwefel (S&sub8;) in Triethylamin:-
Schwefelkohlenstoff: Pyridin (1 : 12 : 12, Volumenverhältnis)
zu dem System gegeben. Nach Schütteln wurde das Gemisch 70
Minuten lang stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde
filtriert und das Zwischenprodukt für die Synthese des
Polymerträgers wurde fünfmal mit 2 ml Schwefelkohlenstoff
und fünfmal mit 2 ml Acetonitril gewaschen, gefolgt von
Trocknen in einem Argonstrom. Außerdem wurde das Verfahren
wie in Tabelle 1 gezeigt über 9 Zyklen wiederholt, wobei die
Verbindungen II, III, IV, I, IV, IV, II, II und I in dieser
Reihenfolge verwendet wurden. Danach wurden 2 ml einer Lösung
aus 0,1 M Iod (I&sub2;) in Pyridin: N-Methylimidazol : H&sub2;O : THF
(5 : 1 : 5 : 90, Volumenverhältnis) zu dem System gegeben. Das
Gemisch wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen
gelassen. Die Reaktionsflüssigkeit wurde filtriert, und 2
ml einer Lösung aus 0,1 M Iod (I&sub2;) in Triethylamin : H&sub2;O : THF
(5 : 5 : 90, Volumenverhältnis) wurden dann zu dem Systemgegeben.
Nach Stehenlassen bei Raumtemperatur während 20 Minuten wurde
die Reaktionsflüssigkeit filtriert. Außerdem wurde das
Verfahren wie in Tabelle 1 gezeigt über 5 Zyklen wiederholt,
wobei die Verbindungen I, I, II, I und II in dieser Reihenfolge
verwendet wurden, gefolgt von der gleichen wie oben
beschriebenen Schwefel-Oxidationsbehandlung über Nacht.
-
Die Reaktionsflüssigkeit wurde filtriert und das
Zwischenprodukt für die Synthese des Polymerträgers wurde
fünfmal mit 2 ml Schwefelkohlenstoff und einmal mit 2 ml
Diethylether gewaschen. Nach Trocknen in einem Argonstrom
wurde das Zwischenprodukt in ein Glasgefäß mit einem Volumen
von 3 ml überführt. Es wurden 2 ml 28%iges Ammoniakwasser
in das Gefäß gefüllt und dieses verschlossen, gefolgt von
Erhitzen bei 55ºC während 5 Stunden. Der Polymerträger wurde
durch Filtrieren entfernt, und die Reaktionsflüssigkeit wurde
bis zur Trockne unter reduziertem Druck verdampft. Der
erhaltene Rückstand wurde in 300 ul 0,1 M Triethylammonium-
Essigsäure-Puffer (pH-Wert 7,0, nachstehend einfach als TEAA
bezeichnet), der 10% Acetonitril enthielt, gelöst. Die Lösung
wurde über eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm und einer
Länge von 12 cm, gefüllt mit Umkehrphasen-Silicagel (Waters
Co., Ltd., Prep-PAK-500/C-18) gereinigt. D. h. es wurde 0,1
M TEAA-Puffer (pH-Wert 7,0) mit einem linearen Gradienten
von 10% bis 35% Acetonitril als mobile Phase verwendet.
Quantitative Bestimmung wurde bei einer Absorbtion bei einer
Wellenlänge von 254 nm durchgeführt, wobei die Fraktion von
Verbindung XII mit einer Dimethoxytritylgruppe am 5'-Ende
erhalten wurde. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels unter
reduziertem Druck, wurde der Rückstand zusammen mit 2 ml Wasser
dreimal coverdampft, und 3 ml 80%ige Essigsäure wurden
hinzugefügt, gefolgt von Rühren während 10 Minuten. Nach
Verdampfen der Reaktionsflüssigkeit bis zur Trockne wurde
der Rückstand weiter zusammen mit Wasser coverdampft, um die
Essigsäure zu entfernen. Zu dem Rückstand wurden 1,5 ml 0,1
M Triethylamin-Bicarbonat-Puffer (pH-Wert 7,5) gegeben, der
10% Acetonitril enthielt. Das Gemisch wurde zweimal mit 1,5
ml Diethylether gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde bis zur
Trockne verdampft und 200 ul 0,1 M TEAA-Puffer (pH-Wert 7,0),
der 10% Acetonitril enthielt, wurden zu dem entstandenen
Rückstand gegeben. Nach Durchleiten durch einen 0,45 u-Filter
(hergestellt von Millipore Corp.), wurde durch
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt. D. h. es wurde
eine YMC-Pack-ODS-(hergestellt von Yamamura Science Co., Ltd)-
Säule verwendet, und 0,1 M TEAA-Puffer (pH-Wert 7,0) mit einem
linearen Gradienten von 10% bis 50% Acetonitril wurde als
mobile Phase verwendet. Der bei einer Fließgeschwindigkeit
von 1,2 ml/min eluierende Hauptpeak wurde fraktioniert, so
daß 65,2 OD260nm-Einheiten (ca. 278 nMol) Verbindung XII in
einer Ausbeute von 8,9% erhalten wurden.
-
Die Verbindung XII wurde in D&sub2;O, das 10 mM Triethylamin-
Bicarbonatpuffer (pH-Wert 7,5) enthielt, gelöst, und ³¹P-NMR
wurde gemessen (Meßgerät: JEOL JMS-DX300, hergestellt von
JEOL Inc.). Wurde Trimethylphosphat als externer Standard
verwendet, ergab Verbindung XII ein charakteristisches
Phosphorthioat-Multiplett-Signal bei 51-55 ppm und ein von
Phosphat abgeleitetes Singulett-Signal bei -4,2 ppm bei einem
Integrierungsverhältnis von 7 : 12. Aus den Ergebnissen dieser
NMR und der Reihenfolge für die Oxidation beim
Kettenverlängerungsschritt folgt, daß Verbindung XII 5 Phosphoratome
am 5'-Terminus und 5 Phosphoratome am 3'-Terminus hat, von
denen durchschnittlich 2 Phosphoratome Thiophosphate und der
Rest Phosphordiesterbindungen sind.
Beispiel 5: Test auf Anti-Virus-Aktivität
-
Verbindung XIII, ein Desoxyoligonucleotid (Phophat-Typ)
mit einer Basensequenz komplementär zu den gleichen Bereichen
wie in Verbindung VI, Verbindung Xi und Verbindung VI,
Verbindung XIV, ein Desoxyoligonucleotid (Phosphattyp) mit
einer Basensequenz komplementär zum gleichen Bereich wie in
Verbindung Xi und dCS (15mer); ein
Desoxyoligocytidylatphosphorthioat wurden in 10%igem Serum aus fötalen Kälbern
gelöst, das RPMI 1640 in einer bestimmten Konzentration
enthielt. MT-4-Zellen, die bei einer MOI von 0,002 mit AIDS-
Virus (HTLV-IIIB-Stamm, 3 · 10&sup5; PFU/ml) infiziert waren, wurden
mit dem vorgenannten Medium, das 3 · 10&sup5;/ml Oligonucleotid im
Anfangsstadium enthielt, gemischt, und anschließend bei 37ºC
gezüchtet. Nachdem der Zellzustand am Tag 3 beobachtet wurde,
wurde die Zellzahl von 3 · 10&sup5;/ml erneut auf 5 · 10&sup5;/ml
eingestellt. Oligonucleotid würde ebenfalls frisch
angereichert, so daß die gleiche Konzentration wie zu Beginn
erhalten wurde. Sechs Tage nach der Infektion wurde die
cytopathische Wirkung unter Virusinfektion bewertet. Die
Ergebnisse zeigt Tabelle 2. Das Symbol + zeigt den Fall, bei
dem Virusinfektion und -proliferation gehemmt sind und die
Zellen normal wachsen. Das Symbol - zeigt den Fall, bei dem
die Zellen aufgrund von Virusinfektion zerstört sind. In keinem
Fall wurde bei den getesteten Konzentrationen eine
Cytotoxiziät festgestellt.
Tabelle 2
-
(Anmerkung 1) Verbindung XIII: Desoxyoligonucleotid (Phosphat-
Typ), komplementär zum gleichen Bereich wie in Verbindung
VI.
-
(Anmerkung 2) Verbindung XIV: Desoxyoligonucleotid (Phosphat-
Typ), komplementär zum gleichen Bereich wie in Verbindung
XI.
-
(Anmerkung 3) dCS (15mer): Desoxyoligocytidylatphospborthioat
(15mer).
-
Verbindung VI wurde noch weiter eingehend getestet. D. h.
Verbindung VI wurde in Konzentrationen von 100 uM, 50 uM,
25 uM, 12,5 uM, 6 uM und 3 uM in 10%igem Serum aus fötalen
Kälbern, das RPMI-1640-Medium enthielt, zu Beginn des Tests
gelöst. MT-4-Zellen, die mit AIDS-Virus (HTLV-IIIB-Stamm)
infiziert waren, wurden bei einer MOI von 0,002 mit dem Medium,
das zu Beginn Verbindung VI in 30 · 10&sup4; Zellen/ml enthielt,
gemischt. Danach wurden sie in einem CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC
gezüchtet. Als Kontrolle wurden gleichzeitig nichtinfizierte
MT-4-Zellen in dem Medium gezüchtet, das Verbindung VI
enthielt. Ein Teil der Kultur wurde an Tag 3 entnommen;
überlebende Zellen wurden mit Trypan-Blau-Färbung gezählt,
und die Menge an virusantigenpositiven Zellen wurde durch
das Immunfluoreszenz-Verfahren bestimmt. Die Kulturzellen
wurden dagegen, um den Einfluß auf das Zellwachstum aufgrund
Proliferation zu verhindern, erneut auf 30 bis 50 · 10&sup4;
Zellen/ml verdünnt, wobei die Kultur Verbindung VI in gleicher
Verdünnung enthielt. Die Kultur wurde weiter bei 37ºC
inkubiert. Am Tag 6 nach Beginn des Tests wurden die
überlebenden Zellen gezählt und die Menge an
virusantigenpositiven Zellen erneut bestimmt. Die Ergebnisse zeigt Tabelle
3. Die Zahl lebender Zellen an Tag 3 und Tag 6 zeigen jeweils
die Fig. 1 und 2. Die Menge virusantigenpositiver Zellen
zeigt Fig. 3:
Tabelle 3: Anti-AIDS-Virus-Aktivität von Verbindung VI (Anzahl
lebender Zellen und Menge an virusantigenpositiven Zellen)
-
Mit den Verbindungen VI, VII, VITI, IX, X, XII und
Desoxyoligocytidylatphosphorthioat: dCS (15mer), wurden
ähnliche Tests durchgeführt, um die Anzahl der lebenden Zellen
und die Menge an virusantigenpositiven Zellen an Tag 6 nach
der Infektion zu bestimmen.
-
Die Tabelle 4 zeigt als Ergebnisse die Zellzahl an Tag
6 nach Infektion. Tabelle 5 zeigt als Ereignisse die Menge
an virusantigenpositiven Zellen an Tag 6 nach Infektion. Diese
Ergebnisse zeigen jeweils auch die graphischen Darstellungen
in Fig. 4 und 5.
Tabelle 4: Anti-AIDS-Virus-Aktivität der Verbindungen VI,
VII, VIII, IX, X, XII und dCS (15mer) (Anzahl lebender Zellen
an Tag 6 nach Infektion: · 10&sup4; Zellen/ml)
-
Nichtinfizierte MT-4-Zellen: 220
Tabelle 5: Anti-AIDS-Virus-Aktivität der Verbindungen VI,
VII, VIII, IX, X, XII und dCS (15mer) (Menge der
virusantigenpositiven Zellen an Tag 6 nach Infektion: %)
-
Nichtinfizierte MT-4-Zellen: 0
-
Mit den Verbindungen XV, XVI, XVII und XVIII wurden ähnliche
Tests durchgeführt. Die Anzahl lebender Zellen an Tag 6 nach
Infektion sind als Ergebnisse der Verbindungen XV, XVI, XVII
und XVIII in Tabelle 6 gezeigt und die Menge an
virusantigenpositiven Zellen an Tag 6 nach Infektion ist in Tabelle 7
gezeigt. Diese Ergebnisse sind auch jeweils in den graphischen
Darstellungen von Fig. 6 und 7 gezeigt.
Tabelle 6: Anti-AIDS-Virus-Aktivität der Verbindungen XV,
XVI, XVII und XVIII (Anzahl lebender Zellen am Tag 6 nach
Infektion: · 10&sup4; Zellen/ml)
-
Nichtinfizierte MT-4-Zellen: 220
Tabelle 7: Anti-AIDS-Virus-Aktivität der Verbindungen XV,
XVI, XVII und XVIII (Menge an virusantigenpositiven Zellen
an Tag 6 nach Infektion: %)
-
Nichtinfizierte MT-4-Zellen: 0
-
Die mithilf der erfindungsgemäßen Methylribonucleotide
hergestellten neuen
2'-O-Methylribooligonucleotidphosphorthioat-Derivate haben Anti-AIDS-Virus-Aktivität, s. oben.
Man erwartet, daß sie als Medikamente verwendet werden, bspw.
als Medikamente zur Behandlung von AIDS. Daher eignet sich
die Erfindung besonders für die Medikamenten-Industrie.
-
Auf die anliegenden Zeichnungen wird Bezug genommen. Es
zeigen:
-
Fig. 1 und 2 die Meßergebnisse der Anzahl lebender
Zellen von Verbindung VI an Tag 3 bzw. 6;
-
Fig. 3 die Meßergebnisse der Menge virusantigenpositiver
Zellen;
-
Fig. 4 und 5 die Meßergebnisse der Anzahl lebender
Zellen und der Menge virusantigenpositiver Zellen der
Verbindungen VI, XII, VIII, IX, X, XII bzw.
Desoxyoligocytidylatphosphorthioat: dCS (15mer) an Tag 6 nach der Infektion;
-
Fig. 6 und 7 die Meßergebnisse von Beispiel 7 der Anzahl
lebender Zellen und der Menge virusantigenpositiver Zellen
der Verbindungen XV, XVI, XVII bzw. XVIII an Tag 6 nach der
Infektion;