DE68924316T2 - Menschliches Gamma-Interferon, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung. - Google Patents
Menschliches Gamma-Interferon, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gamma-HuIFN, ein Verfahren zur Herstellung des Gamma-HuIFN und seine Verwendung (im folgenden als "Gamma-HuIFN" bezeichnet), insbesondere ein Gamma-HuIFN mit einer neuen Struktur, ein Verfahren zur Herstellung des Gamma-HuIFN, und ein Mittel, welches das Gamma-HuIFN als eine wirksame Komponente enthält, welches Mittel auf die Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten gerichtet ist, welche auf Gamma-HuIFN ansprechen.
- Es ist bekannt, daß menschliche Interferone (HuIFNe) Alpha-HuIFN (oder Leukozyten- HuIFN), Beta-HuIFN (oder Fibroblasten-HuIFN) und Gamma-HuIFN (oder Immun-HuIFN oder HuIFN vom Typ II) umfassen: Für Alpha-HuIFN und Beta-HuIFN wurden einige Verfahren, welche Lymphoblasten- bzw. Fibroblastenzellen anwenden, entwickelt, und Pharmazeutika, welche diese HuIFNe enthalten, wurden kürzlich in den Handel gebracht.
- Obgleich viele Verfahren zum Herstellen eines Gamma-HuIFN vorgeschlagen wurden, wurde keines von ihnen in industriellem Umfang praktiziert.
- Allgemein ist dasjenige Verfahren welches eine Massenproduktion von Gamma-HuIFN ermöglicht und welches als das am ehesten realisierbare angesehen wird, jenes, welches eine rekombinante Gentechnik, in welcher E. coli eingesetzt wird, anwendet (siehe die offengelegten japanischen Patente Nr. 201,995/83 und 202,899/85).
- Ein Gamma-HuIFN, welches mit dem Verfahren erhalten wird, ist jedoch vom natürlichen Gamma-HuIFN weit entfernt, da das erstere Gamma-HuIFN aus einer Polypeptidkettenstruktur besteht. wahrend das letztere Gamma-HuIFN eine Kohlenhydratkettenstruktur umfaßt. Aus diesem Grund wurde ein Gen, welches ein Gamma-HuIFN kodiert, in eine Eizelle des chinesischen Hamsters (CHO-Zelle) eingebracht, welche dann Gamma-HuIFN mit einer Kohlenhydratkettenstruktur abgeben gelassen wurde, und Gewinnen des erhaltenen Gamma-HuIFN (offengelegtes japanisches Patent Nr. 289,600/87).
- European Journal of Biochemistry, Band 156, S. 651-654 (1986) beschreibt die Kohlenhydratkettenstruktur detailliert wie folgt:
- Dieser Bericht lehrt jedoch nur die Kohlenhydratkettenstruktur eines Gamma-HuIFN, welches von einer CHO-Zelle abgeleitet wurde.
- Eine Kohlenhydratketten-Teilstruktur eines Gamma-HuIFN, welches von einer menschlichen Zelle abgeleitet wurde, wird in Nikkei Biotechnology, S. 5 (22.9.1986) berichtet:
- Dieser Bericht offenbarte jedoch keinen Kopplungsmodus in der Kohlenhydratkettenstruktur dieser Gamma-HuIFNe, und es ist auch nicht klar, ob die Kohlenhydratkettenstrukturen identisch sind oder nicht.
- Um menschliche Krankheiten zu behandeln oder zu verhindern, ist die Verwendung eines Gamma-HuIFN, welches im wesentlichen von einer menschlichen Zelle abgeleitet wurde, sicher und zweckmaßig, weil es keine Nebenwirkung, wie z.B. eine Antigen/Antikörper-Reaktion, verursacht.
- Die Struktur eines natürlichen Gamma-HuIFN wurde nun durch Exponieren einer menschlichen Zelle der Wirkung eines Induktors, um ein natürliches Gamma-HuIFN zu produzieren, Hochreinigen und Gewinnen des erhaltenen Gamma-HuIFN, und Analysieren seiner Polypeptidkettenstrukturen und Kohlenhydratkettenstrukturen, abgeleitet. Als Ergebnis wurde gefunden, daß ein natürliches Gamma- HuIFN, welches durch Exponieren einer menschlichen Zelle der Wirkung eines Induktors hergestellt werden kann, ein Glycoprotein mit einer neuen Struktur ist.
- Die vorliegende Erfindung stellt daher ein menschliches Gamma-Interferon zur Verfügung, welches im wesentlichen aus einer Polypeptidkette besteht, die eine Sequenz besitzt, wie sie in einer der folgenden Formeln gezeigt ist: Formel I: Formel II: Formel III: Formel IV: Formel V:
- (worin die Abkürzungen üblicherweise im Stand der Tecluiik für L-Aminosäuren verwendet werden);
- wobei ein oder beide Asparagine, welche an der fünfundzwanzigsten und an der siebenundneunzigsten Position hinsichtlich des NH&sub2;-Terminus der Polypeptidkette angeordnet sind, an eine Kohlenhydratkette gekoppelt sind, welche eine Struktur aufweist, vie sie in einer der folgenden Formeln gezeigt ist: Formel VI: Formel VIII: Formel X: oder Formel XI:
- (wobei NeuAc, GlcNAc, Gal, Man und Fuc N-Acetylneuramlnsäure, N-Acetyl-D-glucosanun, D-Galactose, D-Mannose bzw. L-Fucose bedeuten), sowie Vorschlagen einer Verwendung des Gamma- HuIFN.
- Da die vorliegende Erfindung ein Gamma-HuIFN mit neuer Struktur ergab, kann jegliches Verfahren zur Herstellung des Gamma-HuIFN angewendet werden.
- Ein natürliches Gamma-HuIFN kann hergestellt werden, indem eine menschliche Zelle der Wirkung eines Induktors ausgesetzt wird, um das Gamma-HuIFN zu induzieren, welches dann gereinigt und gewonnen wird.
- Ferner kann das vorliegende Gamma-HuIFN vorteilhaft mit erhöhter Ausbeute und ohne Exposition an einen Induktor gebildet werden, indem ein Gamma-HuIFN-Gen in eine menschliche Zelle eingebracht wird, und indem eine menschliche Zelle, die in der Lage ist, ein Gamma-HuIFN zu produzieren, mit einer anderen menschlichen Zelle verschmelzen gelassen wird.
- Die menschliche Zelle kann erhalten werden, indem eine menschliche Zelle, die in der Lage ist, das menschliche Gamma-Interferon zu produzieren, in einen nicht-menschlichen Warmblütler implantiert wird und indem diese menschliche Zelle proliferieren gelasen wird, wahrend zugelassen wird, daß sie die Körperflüssigkeit aus dem nicht-menschlichen Warmblütler empfängt.
- Falls notwendig, kann das vorliegende Gamma-HuIFN vorteilhafterweise hergestellt werden, indem ein Verfahren angewendet wird, in welchem eine Polypeptidkette des Gamma-HuIFN, welche von einem rekombinanten Mikroorganismus, wie z.B. rekombinantem E. coli oder durch organische und chemische Synthese, oder durch biochemische Synthese hergestellt wird, zum Beispiel der Wirkung einer Glycosyltransferase unterworfen wird. um eine Kohlenhydratkette auf die Polypeptidkette auf biochemische Weise zu übertragen.
- Die menschliche Zelle, die oben verwendet werden kann, ist eine errichtete menschliche Zelle, zum Beispiel BALL-1-Zelle (JCRB 0071), TALL-1-Zelle (JCRB 0086), MOLT-3-Zelle (ATCC CRL 1552), geoffenbart in der japanischen Patentpublikation Nr. 1,296/88, oder es kann eine menschliche Myelomonocytenzelle, zum Beispiel HBL-38-Zelle, HL-60-Zelle (ATCC CCL 240), KG-1-Zelle (ATCC CCL 246), oder eine ML-1-Zelle, geoffenbart im offengelegten japanischen Patent Nr. 152,993/88: oder, falls nötig, eine Leukozytenzelle, wie z.B. Buffy-Coat, hergestellt aus menschlichem peripherem Blut, verwendet werden.
- Eine Herstellung eines Gamma-HuIFN, welche diese Zellen verwendet, wird allgemein auf eine Weise durchgeführt, daß die Zellen in einem Nahrkulturmedium, welches auf etwa 20-40ºC gehalten wird, suspendiert werden, um eine Zelldichte von etwa 10&sup5; x 10&sup8; Zellen/ml zu ergeben, und der Wirkung eines Induktors ausgesetzt werden.
- Ein solcher Induktor sollte in der Lage sein, eine Gamma-HuIFN-Produktion zu induzieren, zum Beispiel Mitogene, wie z.B. Phytohämaggiutinin, Concanavalin A, Taschenunkraut-Mitogen (Pokeweed-Mitogen), Lipopolysaccharid, Lipid A, Endotoxin, Polysaccharid oder Bakterien. Ferner wirken Antigene auf sensibilisierte Zellen, um eine Gamma-HuIFN-Produktion zu induzieren.
- Die obigen Gamma-HuIFN-Induktoren werden üblicherweise in einer Konzentration von etwa 0,001 Mikrogramm/ml bis 10 mg/ml verwendet. Sie können zusammen mit Alpha-HuIFN-Induktoren, zum Beispiel Viren, Nukleinsäure und Polynukleotid, falls nötig, verwendet werden.
- Das Gamma-HuIFN, das auf diese Weise erhalten wurde, kann einfach isoliert, gereinigt und gewonnen werden, und zwar durch herkömmliche Reinigungs- und Isolierungsmethoden, wie zum Beispiel Aussalzen, Dialyse, Filtration, Zentrifugieren, Konzentrieren und Lyophilisieren.
- Wenn eine weitere Reinigung erforderlich ist, werden ein oder mehrere herkömmliche Verfahren, zum Beispiel Adsorption und Desorption mit Ionenaustausch, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, Fraktionierung unter Ausnutzung des isoelektrischen Punktes, Hochleistungsflüssigchromatographie und Elektrophorese in Kombination verwendet. Insbesondere führt eine Chromatographie unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers zu einem Gamma-HuIFN der höchsten Reinheit.
- Das Gamma-HuIFN, das auf diese Weise erhalten wurde, kann vorteilhaft in prophylaktischen oder therapeutischen Mitteln für Krankheiten verwendet werden, die auf Gamma-HuIFN ansprechen.
- Der Ausdruck "Krankheiten, die auf Gamma-HuIFN ansprechen" bedeutet solche, welche mit einem Gamma-HuIFN verhindert und/oder behandelt werden können, zum Beispiel Viruserkrankungen, wie eine epidemische Konjunktivitis, herpetische Keratitis, Influenza, Masern, Serumhepatitis und erworbenes Immunmangelsydrom (AIDS); nichtvirale Erkrankungen; maligne Tumore, wie z.B. Colonkarzinom, Lungenkarzinom Leberkarzinom und Osteosarkom; und Immunopathien, wie z.B. atopische Allergien, Myasthenia gravis, Kollagenose, perniziöse Anämie, Gelenksrheumatismus und systemischer Lupus erythematosus.
- Die Form des Mittels gemäß der vorliegenden Erfindung kann gemäß ihrer Endverwendung frei gewahlt werden und ist zum Beispiel ein Nebel, ein Augenwasser, ein Collutorium, ein flüssiges Arzneimittel, z.B. eine Injektion. ein pastenförmiges Arzneimittel. wie eine Salbe, und ein festes Arzneimittel, wie ein Pulver, ein Granulat oder eine Tablette.
- In das Mittel wird das Gamma-HuIFN im Bereich von 1-10.000.000 Einheiten/g, falls notwendig, zusammen mit einem oder mehreren Lymphokinen. wie Alpha-IFN, Beta-IFN, Tumornekrosefaktor (im folgenden mit "TNF" abgekürzt), Lymphotoxin, Interleukin 2 und B-Zellen-differenzierender Faktor, oder ein oder mehrere naturliche oder synthetische Chemotherapeutika eingebracht, so daß die Wirksamkeit des Mittels in vorteilhafter Weise verstärkt wird.
- Falls notig, kann das Gamma-HuIFN in Kombination mit einem Hilfsstoff, einem Füllmittel und/oder einem Stabilisator frei verwendet werden. Das Mittel, das auf diese Weise erhalten wird, wird vorteilhafterweise zum Beispiel in einem Antivirusmittel, cinem Antiorikotikum, einem Verstärker für antionkotische Chemotherapeutika, einem Unterdrückungsmittel für Metastasen maligner Tumore, einem Unterdruckungsmittel für Palindromic einem Immunregulator und einem Mittel für Immunopathien verwendet.
- Die Aktivität von IFNen mit einer hohen Spezifitat für den Menschen wurde mittels der Plaquereduktionsmethode unter Anwendung von FL-Zellen, die von menschlichem Amnion abgeleitet sind, bestimmt, wie in Protein Nucleic Acid und Enzyme, Band 20, Nr. 6, Seiten 616-643 (1975) beschrieben.
- Wenn ein Gamma-HuIFN in einem Gemisch mit Alpha-HuIFN und Beta-HuIFN vorliegt, wird das Gemisch mit anti-Alpha-HuIFN- und anti-Beta-HuIFN-Antikörpern vorbehandelt, um sowohl Alpha-HuIFN als auch Beta-HuIFN zu neutralisieren, und das Ergebnis wurde auf seine Gamma- HuIFN-Aktivität getestet.
- Die vorliegende Erfindung wird detaillierter mit den folgenden Beispielen veranschaulicht.
- Neugeborenen Hamstern wurde ein Antiserum injiziert, welches auf herkömmliche Weise von Kaninchen hergestellt wurde, um eine mögliche Immunreaktion abzuschwächen, wurde subkutan KG-1- Zellen (ATCC CCL246) implantiert, und auf übliche Weise drei Wochen lang gefüttert. Die Tumoren, die sich in den Hamstern subkutan bildeten, und zwar jeder etwa 15 g, wurden extrahiert und disaggregiert, indem sie in einer physiologischen Salzlösung, welche Kollagenase enthielt, suspendiert wurden. Die erhaltenen Zellen wurden gewonnen, mit dem Medium RPMI 1640 gewaschen und in einer frischen Präparation des gleichen Kulturmediums erneut suspendiert, und zwar bis zu einer Zelldichte von etwa 2 x 106 Zellen/ml. Der Zellsuspension wurden etwa 5 Mikrogramm Lipopolysaccharid/ml zugegeben, und sie wurde zwei Tage lang bei 37ºC inkubiert, um eine Gamma-HuIFN-Produktion zu induzieren. Die erhaltene Kultur wurde durch Zentrifugieren abgetrem, um einen Überstand zu erhalten, welcher etwa 45.000 Einheiten Gamma-HuIFN/ml Überstand. oder etwa 35.000.000 Einheiten Gamma-HuIFN pro Hamster, enthielt. Der (iberstand wurde mit einem Membranfilter konzentriert, sterilfiltriert und chromatographiert, wobei eine Säule mit einem monoklonalen anti-Gamma-HuIFN-Antikörper verwendet wurde, ein Handelsname für γ-Sepharose, Celltech, Ltd., Berkshire, UK. Die erhaltene Lösung wurde konzentriert und einer Gelchromatographie unterworfen, um eine Fraktion zu erhalten, welche eine Gamma-HuIFN-Aktivität aufwies. Dann wurde eine Gamma-HuIFN-Lösung in der Ausbeute von etwa 80% hinsichtlich der Gamma-HuIFN-Aktivität gewonnen.
- Das Produkt war ein Gamma-HuIFN hoher Reinheit und einer spezifischen Aktivität von 2 x 10&sup7; Einheiten/mg Protein.
- Nach dem Auftragen eines hochreinen Gamma-HuIFN, welches mit dem Verfahren in Beispiel A-1-(1) hergestellt worden war, auf einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gemaß dem von U.K. Laemmli in Natur, Band 227, S. 680-685 (1970) beschriebenen Verfahren wurden mehrere Banden um das Molekulargewicht von etwa 24.000, 20.000 und 16.000 Dalton beobachtet. Die Proteinmengen in den Banden waren etwa 7:2:1, bezogen auf ihre jeweiligen Molekulargewichtsverhältnisse. Die Gamma- HuIFN-Aktivität wurde in jeder Bande nachgewiesen. Ferner wurde die Anwesenheit von Kohlenhydratketten durch periodische saure Schiffsche Basenfärbung gemäß dem von R. A. Kapitany und E. J. Zebrowski in Analytical Biochemistry, Band 56, Seiten 361-369 (1973) beschriebenen Verfahren geprüft, und die Banden mit einem Molekulargewicht von etwa 24.000 und etwa 20.000 Dalton wurden als positiv bestimmt.
- Die Aminosäuresequenz von hochreinem Gamma-HuIFN, hergestellt mit dem Verfahren in Beispiel A-1-(1), wurde gemaß dem Verfahren bestimmt, welches von Ernst Rinderknecht et al. in The Journal of Biological Chemistry, Band 259, Nr. 11, S. 6790-6797 (1984) beschrieben wurde.
- Das Gamma-HuIFN wurde mit Trypsin oder V8-Protease, einem Produkt von Sign Chemical Company, St. Louis, Mo., USA, verdaut, und die erhaltenen Peptidfragmente wurden mit Hochleistungsflüssigchromatographie fraktioniert. Jedes Fragment wurde einem Gasphasen-Proteinsequenzer, "Model 470A", zugeführt, welcher von Appjied Biosystems, Inc., CA, USA in den Handel gebracht wird, und dann mit Hochleistungsflüssigchromatographie analysiert, um die Aminosäuresequenz von Gamma-HuIFN zu bestimmen. Kohlenhydratketten, die an Peptidfragmente gekoppelt waren, wurden zuerst mit Glycopeptidase A, einem Produkt von Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha, Tokio, Japan, geschnitten und dann einem Gasphasen-Proteinsequenzer zugeführt.
- Der Beweis bestätigte daß das vorliegende Gamma-HuIFN eine Polypeptidkette besitzt, welche mit der folgenden Formel als die Hauptstruktur gezeigt ist: Formel I: Formel II: Formel III: Formel IV: Formel V:
- In der obigen Formel ist eine Kohlenhydratkette in der Form eines Glycosylamin-Kettentypus an ein oder beide Asparagine gekoppelt, welche an der fünfundzwanzigsten und an der siebenundneunzigsten Position vom NH&sub2;-Terminus der Polypeptidkette lokalisiert sind.
- Mit anderen Worten, der Polypeptidkette, die in der Formel II gezeigt ist, fehlt 9 Aminosäuren vom COOH-Terminus der mit der Formel 1 gezeigten Polypeptidkette, und ähnlich fehlen den mit den Formeln III, IV und V gezeigten Polypeptidketten 10, 11 bzw. 12 Aminosäuren vom COOH-Terminus der mit der Formel I gezeigten Polypeptidkette. Es wurde insbesondere auch bestätigt, daß der Gehalt der mit der Formel IV gezeigten Polypeptidkette relativ hoch ist, und zwar etwa 50-80%, bezogen auf die Molekularverhältnisse dieser Polypeptidketten.
- Die Kohlenhydratkettenstruktur eines hochreinen Gamma-HuIFN, welches mit dem Verfahren in Beispiel A-1-(1) hergestellt wurde, wurde studiert.
- Gemäß dem in European Journal of Biochemist, Band 156, S. 651-654 (1986) beschriebenen Verfahren wurde ein Gamma-HuIFN einer Methanolyse unterworfen, und das Resultat wurde trimethylcylyliert und einer Gaschromatographie zugeführt, gefolgt von einem Bestimmen eines nichtionischen Saccharides im Gamma-HulFN. Ferner wurde ein Gamma-HuIFN zuerst mit Methansulfönsäure gemaß dem von R. J. Simpson et al., in The Journal of Biological Chemistry, Band 251, Nr. 7, S. 1936-1940 (1976) beschriebenen Verfahren hydrolysiert und dann einem Aminosäureanalysator zugeführt, um den Aminozucker von Gamma-HuIFN gemäß dem von A. M. Bella et al. in Journal of Chromatography, Band 51, S. 314-315 (1970) beschriebenen Verfahren zu bestimmen.
- Die Ergebnisse bestätigten, daß sowohl das nichtionische Saccharid als auch der Aminozucker aus D-Mannose, D-Galactose, L-Fucose und N-Acetyi-D-glucosamin in einem Molekularverhältnis von 3,00:2,16:0,82:3,94 bestanden.
- Gemäß dem von S. Hase et al. in The Journal of Biochemistry, Band 95, S. 197-203 (1984) beschriebenen Verfahren wurde ein Gamma-HuIFN einer Hydrazinolyse und einer Pyridylaminierung unterworfen, und das Ergebnis wurde dann einer Gelchromatographie zugeführt, um eine ubersehussige Menge von Reagenzien zu entfernen, um eine Pyridylaminozuckerkette zu erhalten, gefolgt von einem Bestimmen einer Anordnung und eines Kopplungsmodus einer Kohlenhydratkette im Gamma-HuIFN.
- Die Anionenaustausehchromatographie ergab, daß der Pyridylaminozucker ein monosialyliertes Oligosaccharid und ein disialyliertes Oligosaccharid enthielt.
- Ferner wurde der Pyridylaminozucker mit Neurammidase verdaut, um eine disialylierte Pyridylaminozuckerkette zu erhalten, welche dann gemaß den Molekulargrößen mit Hochleistungsflüssigchromatographle fraktioniert wurde. Jede Fraktion wurde einem sukzessiven Abbau unterworfen, wobei Exoglycosidase verwendet wurde, um die Anordnung der Kohlenhydratkette von Gamma-HuIFN zu bestimmen.
- Ferner wurde der Pyridylaminozucker mit Umkehrphasen-Säulenchromatographle fraktioniert, und die erhaltenen Fraktionen wurden jeweils einer 500 MHz-¹H-NMR-Spektroskopie unterworfen, um ihren Kopplungsmodus zu bestimmen.
- Die Ergebnisse bestätigten, daß die oben erwähnte Polypeptidkette des Gamma-HuIFN an eine Kohlenhydratkette gekoppelt war, welche mit der folgenden Formel in der Form eines Glycosylamin- Kettentypus gezeigt ist: Formel VI: Formel VII: Formel VIII: Formel IX: Formel X: Formel XI:
- Diese Strukturen von Kohlenhydratketten von Gamma-HuIFN, welche in Alpha-IFN und in Beta-IFN sowie in dem von CHO-Zellen abgeleiteten Gamma-HuIFN nicht gefunden worden waren, wurden durch die vorliegende Erfindung dargelegt.
- Ferner war der Gehalt dieser neuen Kohlenhydratketten relativ hoch, d.h., etwa 50-80%, bezogen auf ein Molekularverhältnis.
- Es wurde gefunden daß das vorliegende Gamma-HuIFN auch eine kleine Menge einer Kohlenhydratkette enthielt, welde in einem von CHO-Zellen abgeleiteten Gamma-HuIFN gefunden worden war.
- Die Ergebnisse bestätigten, daß das vorliegende Gamma-HuIFN mit einem Molekulargewicht von etwa 24.000 Dalton Kohlenlhydratketten aufweist, die an beide Asparagine gekoppelt sind, welche an der fünfundzwanzigsten und an der siebenundneunzigsten Position hinsichtlich des NH&sub2;-Terminus der Polypeptidkette angeordnet sind, und daß das vorliegende Gamma-HuIFN mit einem Molekulargewicht von etwa 20.000 Dalton eine Kohlenhydratkette autweist, welche an eines der Asparagine gekoppelt ist.
- Daraus ergibt sich, daß das vorliegende Gamma-HuIFN, welches von einer menschlichen Zelle abgeleitet ist, ein neues Gamma-HuIFN ist und eine Polypeptidkette als die Hauptstruktur aufweist, welche mit der folgenden Formel gezeigt ist: Formel 1: Formel II: Formel III: Formel IV: Formel V:
- (worin die Abkürzungen üblicherweise im Stand der Technik für L-Aminosäuren verwendet werden);
- wobei ein oder beide Asparagine, welche an der fünfundzwanzigsten und an der siebenundneunzigsten Position hinsichtlich des NH&sub2;-Terminus der Polypeptidkette angeordnet sind, an eine Kohlenhydratkette gekoppelt sind, welche gezeigt ist mit: Formel VI: Formel VII: Formel VII1: Formel IX: Formel X: Formel XI:
- Das Produkt kann vorteilhafterweise als eine wirksame Komponente in therapeutischen oder prophylaktischen Mitteln für virale Krakkheiten und maligne Tumore sowie als ein Material zum Herstellen von Gamma-HuIFN-Derivaten verwendet werden.
- Gemaß dem Verfahren in Beispiel A-1-(1) wurden neugeborenen Hamstern HBL-38-Zellen implantiert und wurden die Hamster auf herkömmliche Weise vier Wochen lang gefüttert. Die Tumore, welche in den Hamstern subkutan gebildet wurden, wobei jeder etwa 20 g autwies, wurden extrahiert und disaggregiert, indem sie in physiologischer Salzlösung, welche Kollagenase enthielt, suspendiert wurden, gefolgt von einem Gewinnen der erhaltenen Zellen.
- Die Zellen wurden mit Eagle'schem Minimalmedium gewaschen und mit einer frischen Präparation des gleichen Kulturmediums, welches bei 37º gehalten wurde, auf eine Zelldichte von etwa 2 x 10&sup6; Zellen/ml verdünnt. Dann wurde der Zellsuspension 200 Mikrogramm Phytomämagglutinin/ml und 5 Mikrogramm Lipid A/ml zugegeben und zwei Tage lang bei 37ºC inkubiert, um eine Gamma-HuIFN- Produktion zu induzieren. Die erhaltene Kultur wurde durch Zentrifugieren getrennt, wobei ein Überstand mit etwa 93.000 Einheiten Gamma-HuIFN/ml Uberstand erhalten wurde. Es wurden etwa 183.000.000 Einheiten Gamma-HuIFN pro Hamster erhalten.
- Gemäß dem Verfahren in Beispiel A-1-(1) wurde der Uberstand gereinigt, wobei eine Gamma- HuIFN-Lösung in einer Ausbeute von etwa 80% hinsichtlich der Gamma-HuIFN-Aktivität erhalten wurde.
- Das Produkt war ein Gamma-HuIFN hoher Reinheit mit einer spezifischen Aktivität von 2 x 10&sup7; Einheiten/mg Protein.
- Untersuchungen über das Molekulargewicht, die Aminosäuresequenz und die Kohlenhydratkettenstruktur des hochreinen Gamma-HuIFN gemäß den Verfahren in den Beispielen A-1-(2), A-1-(3) und A-1-(4) zeigten, daß das Gamma-HuIFN ein neues Gamma-HuIFN war, welches die gleiche Struktur wie das Gamma-HuIFN in Beispiel A-1 aufwies.
- Auf ähnliche Weise wie das Produkt in Beispiel A-1 kann das Produkt vorteilhaft als eine wirksame Komponente in prophylaktischen oder therapeutischen Mitteln für Krankheiten sowie als ein Material zum Herstellen von Gamma-HuIFN-Derivaten verwendet werden.
- Ein Buffy-Coat, welcher aus peripherem menschlichem Blut hergestellt worden war, wurde in Eagle'schem Minimalmedium, welches mit 10 Vol./Vol.-% fötalem Kalbsserum ergänzt war, zu einer Zelldichte von 2,5 x 10&sup6; Zellen/ml suspendiert. Der Zellsuspension wurden etwa 10 Mikrogramm Phytohämagglutinin/ml zugegeben und drei Tage lang bei 37ºC inkubiert, um eine Gamma-HuIFN- Produktion zu induzieren. Das erhaltene Kulturmedium wurde durch Zentrifugieren getrennt, wobei ein Überstand mit etwa 1.000 Einleiten Gamma-HuIFN/ml Überstand erhalten wurde.
- Der Überstand wurde gemaß dem Verfahren in Beispiel A-1-(1) gereinigt, wobei eine Gamma- HuIFN-Lösung in einer Ausbeute von etwa 75% hinsichtlich der Gamma-HuIFN-Aktivität erhalten wurde.
- Das Produkt war ein Gamma-HuIFN hoher Reinheit mit einer spezifischen Aktivität von 2 x 10&sup7; Einheiten/mg Protein.
- Untersuchungen über das Molekulargewicht die Aminosäuresequenz und die Kohlenhydratkettenstruktur des hochreinen Gamma-HuIFN gemaß den Verfahren in den Beispielen A-1-(2), A-1-(3) und A-1-(4) zeigten, daß das Gamma-HuIFN ein neues Gamma-HuIFN war, welches die gleiche Struktur wie das Gamma-HuIFN in Beispiel A-1 aufwies.
- Auf ähnliche Weise wie das Produkt in Beispiel A-1 kann das Produkt vorteilhaft als eine wirksame Komponente in prophylaktischen oder therapeutischen Mitteln für Krankheiten sowie als ein Material zum Herstellen von Gamma-HuIFN-Derivaten verwendet werden.
- Ein flüssiges Arzneimittel wurde erhalten, indem in einer physiologischen Salzlösung 50 Einheiten/ml eines hochreinen Gamma-HuIFN, welches mit dem Verfahren in Beispiel A-1 hergestellt worden war, gelöst wurden, und das Gemisch wurde steril filtriert und in ein sterilisiertes 50 ml Plastikfläschchen gegeben, gefolgt von einem Verschließen des Fläschchens.
- Das Produkt wird zweckmäßig zu einem Nebel, einem Augenwasser, Collunarium oder einem Mundwasser für prophylaktische oder therapeutische Mittel für virale Krankheiten, wie z.B. epidemische Konjunktivitis und Influenza, verarbeitet.
- Eine feste Injektion wurde erhalten, indem in einer physiologischen Salzlösung 100.000 Einheiten eines hochreinen Gamma-HuIFN/ml, welches mit dem Verfahren in Beispiel A-1 hergestellt worden war, gelöst wurden, und das Gemisch wume steril flltriert. Zwei Milliliter Aliquote des Filtrates wurden in sterilisierte Glasfläschchen gegeben und lyophilisiert, gefolgt von einem Verschließen der Glasfläschchen.
- Ähnlich wie das Produkt in Beispiel B-1 kann das Produkt vorteilhaft in prophylaktischen oder therapeutischen Mitteln für virale Krankheiten verwendet werden.
- Das Produkt ist für prophylaktische oder therapeutische Mittel für maligne Tumore, wie z.B. Brustkrebs, Lungenkarzinom, Leberkarzinom und Leukämie, und Immunopathien, wie z.B. atopische Allergie, perniziöse Anämie, Gelenksrheumtismus und systemischer Lupus erythematosus geeignet.
- Ferner wird das Produkt vorteilhaft verwendet, um die antionkotische Aktivität von Chemotherapeutika, wie z.B. Melphalan, Methotrexat und Doxorubicin, zu verstärken.
- Einer physiologischen Salzlösung wurden 250.000 Einheiten hochreines Gamma-HuIFN/ml, hergestellt nach dem Verfahren in Beispiel A-2, zugegeben, und gemaß dem Verfahren in Beispiel B-2 wurde das Gemisch in Glasfläschchen gegeben, lyophilisiert und verschlossen, um eine feste Injektion zu erhalten.
- Ähnlich wie das Produkt in Beispiel B-2 kann das Produkt vorteilhafterweise in prophylaktischen oder therapeutischen Mitteln für virale Krankheiten und maligne Tumore verwendet werden.
- Einer physiologischen Salzlösung wurden 1.000 Einheiten hochreines Gamma-HuIFN/ml, hergestellt nach dem Verfahren in Beispiel A-3, 100.000 Einheiten lymphoblastisches Alpha-IFN/ml und 100.000 Einheiten lymphoblastisches TFN zugegeben, und das Gemisch wurde steril filtriert und lyophilisiert, ahnlich wie in Beispiel B-2, um eine feste Injektion zu erhalten.
- Das Produkt für prophylaktische oder therapeutische Mittel für virale Krankheiten geeignet.
- Das Produkt ist auch für prophylaktische oder therapeutische Mittel für maligne Tumore, wie z.B. Brustkrebs, Lungenkarzinom, Leberkarzinom, Magenkrebs und Leukämie, und Immunopathien, wie z.B. atopische Allergie, Kollagenose, Gelenksrheumtismus und systemischer Lupus erythematosus geeignet.
- Das Produkt kann vorteilhaft verwendet, um die antiorikotische Aktivität von Chemotherapeu tika, wie z.B. Tegafur, Mitomycin C und Vincristinsulfat, zu verstärken.
- Bei der üblichen Herstellung von Tabletten unter Verwendung von Stärke und Maltose als Träger wurden ein hochreines Gamma-HuIFN, welches mit dem Verfahren in Beispiel A-1 hergestellt worden war, und ein natürliches lymphoblastisches TNF in eine Tablette zu jeweils 10.000 Einheiten pro Tablette (200 mg) eingebracht. Dann wurde die erhaltene Tablette mit Methylcellulosephthalat beschichtet, um eine magensaftresistente Tablette zu erhalten.
- Das Produkt ist vorteilhaft verwendbar für prophylaktische oder therapeutische Mittel für virale Krankheiten, wie z.B. jene im Dünndarm und im Dickdarm, sowie jene für maligne Tumore, wie z.B. Kolonkarzinom, Nierenkarzinom und Lebenrkarzinom, und Immunopathien, wie z.B. atopische Allergie, perniziöse Anämie, Gelenksrheumtismus und systemischer Lupus erythematosus geeignet.
- Das Produkt kann vorteilhaft verwendet, um die antionkotische Aktivität von Chemotherapeutika, wie z.B. Doxorubicin, Fluoruracil und Mitomycin C, zu verstärken.
- Wie oben detailliert ausgeführt, wird ein Gamma-HuIFN mit einer dargelegten Struktur, welches im wesentlichen von einer menschlichen Zelle abgeleitet ist, zweckmaßig bei Vorbeugung oder Behandlung von menschlichen Krankheiten verwendet.
- Bis heute ist keine detaillierte Struktur eines Gamma-HuIFN, das von einer menschlichen Zelle abgeleitet ist, bekannt geworden, und ob ein solches Gamma-HuIFN und das von CHO-Zellen abgeleitete Gamma-HuIFN identisch sind oder nicht, war bis heute nicht klar.
- Die vorliegende Erfindung legte eine Struktur eines natürlichen Gamma-HuIFN dar, erzielte das Verfahren zur Herstellung desselben und gelangte zu prophylaktischen oder therapeutischen Mitteln, welche keine Nebenwirkung verursachen.
- Die vorliegende Erfindung besitzt ferner einen signifikanten Effekt auf den Stand der Technik, weil die Offenbarung der Struktur des natürlichen Gamma-HuIFN das Verfahren zum Herstellen von Gamma-HuIFN in einer Massenproduktion ändert und das Verfahren zum Herstellen von Gamma- HuIFN-Derivaten sowie die Entwicklung neuer Pharmazeutika, die Substanzen enthalten, welche eine ähnliche Struktur wie jene des Gamma-HuIFN besitzen, fördert. Die vorliegende Erfindung ist daher im Stand der Technik von Pharmazeutika signifikant.
- Obgleich das beschrieben wurde, was gegenwärtig als die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung angesehen wird, ist klar, daß verschiedenste Modifikationen vorgenommen werdend können, und es ist daran gedacht, in den beigefügten Ansprüchen alle solchen Modifikationen abzudecken, welche innerhalb des wahren Geistes und des Umfangs der Erfindung sind.
Claims (15)
1. Menschliches Gamma-Interferon, welches im wesentlichen aus einer Polypeptidkette besteht, die
eine Sequenz besitzt:, wie sie in einer der folgenden Formeln gezeigt ist:
Formel I:
Formel II:
Formel III:
Formel IV:
Formel V:
wobei ein oder beide Asparagine, welche an der fünfundzwanzigsten und an der
siebenundneunzigsten Position hinsichtlich des NH&sub2;-Terminus der Polypeptidkette angeordnet sind, an eine
Kohlenhydratkette gekoppelt sind, welche eine Struktur aufweist, wie sie in einer der folgenden Formeln
gezeigt ist:
Formel VI:
Formel VIII:
Formel X:
oder
Formel XI:
2. Menschliches Gamma-Interferon, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das menschliche
Gamma-Interferon ein Molekulargewicht von etwa 20.000 oder etwa 24.000 Dalton bei
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese besitzt.
3. Menschliches Gamma-interferon, wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht, wobei das
menschliche Gamma-Interferon erhältlich ist durch:
Exponieren einer menschlichen Zelle, die das menschliche Gamma-Interferon produzieren kann,
der Wirkung eines Induktors, um die menschliche Zelle das menschliche Gamma-Interferon produzieren
zu lassen; und
Gewinnen des menschlichen Gamma-Interferons.
4. Menschliches Gamma-Interferon, wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei die menschliche Zelle
eine aus einer Gruppe von proliferierten Zellen ist, die erhältlich sind durch:
Implantieren einer ersten menschlichen Zelle, die das menschliche Gamma-Interferon
produzieren kann, in einen nicht-menschlichen Warmblütler; und
Proliferierenlassen der menschlichen Zelle, während zugelassen wird, daß sie die
Körperflüssigkeit aus dem nicht-menschlichen Warmblütler erhält, wodurch die Gruppe der proliferierten Zellen
gebildet wird.
5. Menschliches Gamma-Interferon, wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei die menschliche Zelle
ein Glied, ausgewählt aus der Gruppe von BALL-1-Zelle (JCRB 0071), TALL-1-Zelle (JCRB 0086),
MOLT-3-Zelle (ATCC CRL 1552), HBL-38-Zelle, HL-60-Zelle (ATCC CCL 240), KG-1-Zelle
(ATCC CCL 246), ML-1-Zelle und Leukozytenzelle, ist.
6. Menschlisches Gamma-Interferon, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht,
wobei der Induktor ein Glied ausgewählt aus der Gruppe von Phytohämagglutinin, Concanavalin A,
Taschenunkraut-Mitogen, Lipopolysaccharid, Lipid A, Endotoxin, Polysaccharid, Bakterien, Antigen
und Gemischen davon, ist.
7. Verfahren zur Herstellung eines menschlichen Gamma-Interferons, wie in Anspruch 1 oder
Anspruch 2 definiert, welches Verfahren umfaßt:
Exponieren einer menschlichen Zelle, die das menschliche Gamma-Interferon produzieren kann,
der Wirkung eines Induktors um die menschliche Zelle das menschliche Gamma-Interferon produzieren
zu lassen: und
Gewinnen des menschlichen Gamma-Interferons.
8. Verfahren, wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei die menschliche Zelle eine aus einer Gruppe
von proliferierten Zellen ist, die erhältlich sind durch:
Implantieren einer ersten menschlichen Zelle, die das menschliche Gamma-Interferon
produzieren kann, in einen nicht-menschlichen Warmblütler; und
Proliferierenlassen der menschlichen Zelle, wahrend zugelassen wird, daß sie die
Körperflüssigkeit aus dem nicht-menschlichen Warmblütler erhält, um dadurch die Gruppe der proliferierten Zellen
zu bilden.
9. Verfahren, wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei die menschliche Zelle ein Glied, ausgewählt
aus der Gruppe von BALL-1-Zelle (JCRB 0071), TALL-1-Zelle (JCRB 0086), MOLT-3-Zelle (ATCC
CRL 1552), HBL-38-Zelle, HL-60-Zelle (ATCC CCL 240), KG-1-Zelle (ATCC CCL 246), ML-1-
Zelle und Leukozytenzelle, ist.
10. Verfahren, wie in einem der Ansprüche 7, 8 oder 9 beansprucht, wobei der Induktor ein Glied,
ausgewählt aus der Gruppe von Phytohämagglutinin, Concanavalin A, Taschenunkraut-Mitogen,
Lipopolysaccharid, Lipid A, Endotoxin, Polysaccharid, Bakterien, Antigen und Gemischen davon, ist.
11. Prophylaktisches oder therapeutisches Mittel für Krankheiten, die auf menschliches
Gamma-Interferon ansprechen, welches Mittel als einen wirksamen Bestandteil ein menschliches
Gamma-Interferon, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert ist, enthält.
12. Mittel, wie in Anspruch 11 beansprucht, wobei das Mittel ein zusätzliches Lymphokin enthält.
13. Mittel, wie in Anspruch 12 beansprucht, wobei das Lymphokin ein Glied, ausgewählt aus der
Gruppe von Alpha-Interferon, Beta-Interferon, Tumornekrosefaktor, Lymphotoxin, Interleukin 2, B-
Zellen-differenzierender Faktor und Gemischen davon, ist.
14. Mittel, wie in Anspruch 11 beansprucht, wobei das Mittel ein Antivirusmittel, ein
Antionkotikum, ein Verstärker für antionkotische Chemotherapeutika, ein Unterdrückungsmittel für die Metastase
bösartiger Tumore, ein Unterdrückungsmittel für Palindromie, ein Immunregulator oder ein
therapeutisches Mittel für Immunopathien ist.
15. Mittel, wie in einem der Ansprüche 11 bis 14 beansprucht, wobei das Mittel das Gamma-
Interferon im Bereich von 1 - 10.000.000 Einheiten/g enthält.
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