DE68920321T2

DE68920321T2 - Verfahren zur herstellung eines menschlichen "neutrophil chemotactic factor"-polypeptids.

Info

Publication number: DE68920321T2
Application number: DE68920321T
Authority: DE
Inventors: Ryuji Furuta; Kouji Matsushima; Masaaki Yamada; Junichi Yamagishi; Teizo Yoshimura
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1988-05-02
Filing date: 1989-04-26
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: DE68920321D1; JPH03505037A; EP0413818A1; US5306627A; EP0413818B1; KR900700615A; WO1989010962A1; ATE116366T1

Description

Die Erfindung betrifft einen Expressionsvektor, in den eine DNA, die ein menschlicher-neutrophiler-chemotaktischer-faktor-Polypeptid codiert, insertiert ist, einen Transformanten (eine mit dem Expressionsvektor transformierte Escherichia coli-Zelle) und ein Verfahren zur Produktion des Polypeptids unter Verwendung des Transformanten.
Der menschliche neutrophile chemotaktische Faktor (als NCF abgekürzt) ist ein physiologisch aktives Polypeptid, das aus menschlichen mononuclearen Leucocyten, die mit Lipopolysaccharid stimuliert sind, produziert wird, und die biologische Aktivität besitzt, spezifisch Neutrophile anzuziehen und das als einer der modulierenden Faktoren bezüglich des Anfangsstadiums der entzündlichen Reaktion bewertet wird (Yoshimura, T. et al., J. Immunol., 139, 788, 1987).
Was den von menschlichen mononuclearen Leucocyten abgeleiteten NCF betrifft, so wurde seine Aminosäure-Teilsequenz bereits bestimmt (Yoshimura, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 9233, 1987). Den Erfindern gelang die Isolierung einer cDNA, die den menschlichen NCF codiert, auf der Grundlage der vorstehenden Aminosäure-Teilsequenz (siehe Referenzbeispiel 1). Die Basensequenz der clonierten menschlichen NCF cDNA war in der codierenden Region mit der von Schmid und Weissmann beschriebenen Basensequenz identisch (J. Immunol., 139, 250, 1987). Seit der Bestimmung der vollständigen Primärstruktur des Polypeptids durch genetische Analyse wurde gefunden, daß ein menschliches NCF-Polypeptid ein Polypeptid mit dem niedrigen Molekulargewicht von 8,4 kD ist.
Was die verschiedenen physiologisch aktiven Polypeptide, wie Interleukin-1, Interleukin-2, Interleukin-3, TNFα (Tumornecrosefaktor), Lymphotoxin (TNFβ), GM-CSF (Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor), G-CSF (Granulocyten-Kolonie-stimulierender Faktor) und verschiedene Interferone betrifft, so gelang die Produktion dieser Polypeptide mit einem Molekulargewicht von mehr als 10 kD durch Verwendung der rekombinanten DNA-Technik. Aber im Falle der Produktion eines Polypeptids mit niedrigem Molekulargewicht durch die rekombinante DNA-Technik, insbesondere unter Verwendung von E. coli als Wirt, wird es üblicherweise als ein Fusionsprotein im allgemeinen mit dem von E. coli abgeleiteten Protein produziert, um den Abbau der Wirtszellen zu vermeiden. Beispielsweise beschrieben Schulz et al., daß es extrem schwierig ist, direkt ein menschliches Somatomedin C-Polypeptid (7,7 kD), bestehend aus 69 Aminosäureresten durch die rekombinante DNA-Technik unter Verwendung von E. coli als Wirt zu produzieren, und ihnen gelang die effiziente Produktion davon als dimeres Polypeptid oder als die verstümmelten Derivate des dimeren Polypeptids durch rekombinante DNA-Technik in E. coli (Schulz, M-F. et al., J. Bacteriol., 169, 5385, 1987). Der Grad dieses Abbaus steht in engem Zusammenhang mit der Struktur des Polypeptids, und diese Beziehung ist wahrscheinlicher, wenn das Molekulargewicht des benötigten Polypeptids niedriger ist und ist insbesondere äußerst wahrscheinlich im Falle eines Polypeptids mit einem extrem niedrigen Molekulargewicht in E. coli (Itakura, K. et al., Science 198, 1056, 1977).
Das FASEB-Journal, 1988, 2(5), abstract 6683 beschreibt, daß eine cDNA, die menschlichen MDNCF codiert, cloniert wurde. Diese cDNA ist 1,7 kb lang und codiert ein Polypeptid, bestehend aus 99 Aminosäuren.
Die genannten Erfinder versuchten, das menschliche NCF-Polypeptid mit einem solchen niedrigen Molekulargewicht durch Anwendung der rekombinanten DNA-Technik unter Verwendung von E. coli als Wirt direkt zu exprimieren. Folglich wurde überraschenderweise gefunden, daß das Polypeptid effizient ohne signifikanten Abbau in den Wirtszellen produziert werden kann.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein effizientes Verfahren für ein menschliches NCF-Polypeptid durch die rekombinante DNA-Technik bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines rekombinanten Expressionsvektors, in den eine DNA, die ein menschliches NCF-Polypeptid codiert, insertiert ist, und eine mit dem Vektor transformierte Wirtszelle.
Weitere Aufgaben gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor.
Erfindungsgemäß kann ein menschliches NCF-Polypeptid, insbesondere ein Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz der in Tabelle 1 gezeigten Formel [I] durch Anwenden der rekombinanten DNA-Technik in Escherichia coli produziert werden. Tabelle 1

Formel [I]

Als Basensequenz einer DNA, die ein Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz der Formel [I], werden die DNA, bestehend aus der Basensequenz der in Tabelle 2 gezeigten Formel [A] und seiner degenerierten Sequenz angegeben. Tabelle 2

Formel [A]

Die DNA, die ein menschliches NCF-Polypeptid codiert, kann beispielsweise nach dem in Referenzbeispiel 1 beschriebenen Verfahren und nach dem von Schmid und Weissmann, wie vorstehend angegeben, beschriebenen Verfahren isoliert werden. Es ist auch möglich, die chemische Totalsynthese der genannten DNA durchzuführen. Was die Extraregion oder die defekte Region der so erhaltenen DNA betrifft, so kann die gewünschte DNA durch die Verfahren der Spaltung und/oder Reparatur als solche, beispielsweise durch Spalten durch ein geeignetes Restriktionsenzym und Ligierung mit chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotiden produziert werden.
Durch Hinzufügen eines Translationsstartcodons ATG an das 5'-terminale Ende (stromaufwärts) dieser DNA, Ligieren eines DNA-Fragments, das ein Terminationscodon am 3'-Ende (stromabwärts) der DNA mit dem Startcodon enthält, Verknüpfen der 50 erhaltenen DNA mit einem geeigneten Promotor (z.B.. trp, lac, phoS, PL, früher SV40) und SD-Sequenz und anschließende Insertion der so erhaltenen DNA mit dem geeigneten Promotor und der SD-Sequenz in einen geeigneten Vektor (z.B. das Plasmid pBR322), wird ein Expressionsvektor zur Produktion des menschlichen NCF-Polypeptids konstruiert.
Die Basensequenz von der SD-Sequenz bis zu dem Translationsstartcodon wird bevorzugt durch die Formel [D]
5'-XGGAGGTTTYATT-3' Formel [D]
wiedergegeben, worin X für (A)x steht, wobei x den Wert 1 bis 5 besitzt und Y für (A)y(T)z steht, wobei y den Wert 0 bis 3 und z den Wert 0 oder 1 besitzt.
Ein erfindungsgemäßer Transformant kann durch Einschleusen des wie vorstehend konstruierten Expressionsvektors in eine geeignete Wirtszelle, beispielsweise E. coli, nach dem Verfahren von Cohen et al. (Cohen, S.N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110, 1972) konstruiert werden.
Das menschliche NCF-Polypeptid kann durch Züchten des erfindungsgemäßen Transformanten unter geeigneten Kulturbedingungen produziert werden. Der das Polypeptid enthaltende Extrakt kann aus der Kultur nach Zerstören der Zellen, beispielsweise durch Spaltung mit Lysozym und Gefrieren-Auftauen, Beschallen oder unter Verwendung einer French-Presse mit anschließender Gewinnung des Extrakts durch Zentrifugation oder Filtration erhalten werden.
Das menschliche NCF-Polypeptid kann aus dem Extrakt durch Reinigungsverfahren, die durch eine Kombination der Behandlung zur Entfernung von Nucleinsäuren, Aussalzen, Anionennd/oder Kationenaustausch-Chromatographie, Ultrafiltration, Gelfiltration, ggf. Dialyse, Elektrophorese, Affinitätschromatographie unter Verwendung spezifischer Antikörper usw. gekennzeichnet ist, gereinigt werden.
Die chemischen, physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften des menschlichen NCF-Polypeptids werden nachstehend ausführlich beschrieben.
Das in dem Beispiel erhaltene hochgereinigte menschliche NCF-Polypeptid (als rekombinanter menschlicher NCF bezeichnet) wurde für die nachstehenden Analysen verwendet.

(1) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des rekombinanten menschlichen NCFs wurde durch eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gemessen. Als Molekulargewichts-Markerproteine wurde das Standardprotein-Kit (Pharmacia Fine Chemicals, Schweden), bestehend aus den folgenden Proteinen, verwendet: Lysozym (14,4 kD), Sojabohnentrypsininhibitor (20,1 kD), Carbonsäureanhydrase (30 kD), Ovalbumin (43 kD), Rinderserumalbumin (67 kD) und Phosphorylase b (94 kD).
Als Ergebnis besaß der rekombinante menschliche NCF ein Molekulargewicht von etwa 8 bis 10 kD.
Das polymerisierte Molekül des rekombinanten menschlichen NCFs wurde als Folge der Bildung einer intermolekularen Disulfidbindung nicht signifikant nachgewiesen.

(2) Aminosäuresequenz

Aminosäuresequenzen des rekombinanten menschlichen NCFs wurden durch den automatischen Edman-Abbau bestimmt.
Der rekombinante menschliche NCF wurde zuvor durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen mit 2-Mercaptoethanol und anschließende S-β- 4-Pyridylethylierung der Cysteinreste mit 4-Vinylpyridin gemäß dem Verfahren von Fullmer (Anal. Biochem., 142, 336, 1984) behandelt.
Getrennt davon wurden mehrere Arten von Peptidfragmenten des rekombinanten menschlichen NCFs hergestellt und gemäß den folgenden Verfahren isoliert.
Der rekombinante menschliche NCF wurde mit 70%iger Ameisensäure nach dem Verfahren von Sonderegger et al. (Anal. Biochem., 122, 298, 1982) behandelt, um spezifisch die Asp-Pro-Peptid-Bindung zu spalten. Von den so erhaltenen zwei Peptidfragmenten wurde das C-terminale Fragment durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer SynChropak RP-P-Säule (SynChrom, Inc., USA) unter der Elutionsbedingung eines linearen Acetonitrilgradienten von 0 bis 50 % in 0,1 % Trifluoressigsäure isoliert.
Der pyridylethylierte menschliche NCF wurde mit einer Metalloendopeptidase (EC 3.4.24; Seikagaku Kogyo, Japan) gespalten, und die so erhaltenen Peptidfragmente wurden mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter der Elutionsbedingung eines linearen Acetonitrilgradienten von 0 bis 30 % in 0,1 % Trifluoressigsäure isoliert.
Die N-terminalen Aminosäuresequenzen des pyridylethylierten NCFs und jedes Peptidfragments wurden unter Verwendung eines Protein-Sequenators, Modell 470A (Applied Biosystems, USA) und eines SP8440 UV/VIS-Detektors (Specta-Physics, USA) bestimmt.
Es wurde gefunden, daß die N-terminale Aminosäuresequenz des pyridylethylierten rekombinanten menschlichen NCFs wie folgt lautete:
Diese Aminosäuresequenz war vollständig mit der Aminosäuresequenz von dem N-terminalen Ser bis Asn in der 36. Position des menschlichen NCF-Polypeptids der Formel [I] gemäß Tabelle 1 identisch. Ein Methioninrest als Folge des Translationsstartcodons (ATG) konnte am N-Terminus nicht nachgewiesen werden.
Es wurde auch gefunden, daß die N-terminale Aminosäuresequenz des säuregespaltenen C-terminalen Fragments wie folgt lautete:
Diese Aminosäuresequenz war mit der Aminosäuresequenz von der 53. Position vom N-Terminus bis zu dem C-terminalen Ser des menschlichen NCF- Polypeptids der Formel [I] gemäß Tabelle 1 identisch.
Die Aminosäuresequenzen der zwei Peptidfragmente, die durch Spaltung mit Metalloendopeptidase hergestellt wurden, wurden wie folgt bestimmt:
und
Diese Aminosäuresequenzen waren mit der Aminosäuresequenz der 19 Reste von der 23. Position bis zu der 41. Position vom N-Terminus und der Aminosäuresequenz von 12 Resten von der 42. Position bis zu der 53. Position vom N-Terminus des menschlichen NCF-Polypeptids der Formel [I] gemäß Tabelle 1 identisch.
Folglich wurde bestätigt, daß die Aminosäuresequenz des rekombinanten menschlichen NCF-Polypeptids vollständig mit der von einer Basensequenz, die den menschlichen NCF codiert, abgeleiteten Sequenz identisch ist.

(3) Extinktionskoeffizient

Das rekombinante menschliche NCF-Polypeptid wurde ohne irgendeine Trägerkomponente lyophilisiert. Der Wassergehalt und der Aschegehalt in diesem lyophilisierten Produkt wurden zu 6,01 % bzw. 0,52 % bestimmt.
Der Wert für den Extinktionskoeffizienten des rekombinanten menschlichen NCFs wurde zu 8,25 bei 280 nm unter den Bedingungen 1%ige wäßrige Lösung und 1 cm optische Weglänge bestimmt.

(4) Chemotaktische Aktivität

Die neutrophile chemotaktische Aktivität wurde in einer Boyden- Chemotaxis-Kammer mit vielen Kavitäten (Neuro Probe, Inc., USA) wie von Harvath, L. et al., (J. Immunol. Methods, 37, 39, 1980) beschrieben, gemessen. Der rekombinante NCF wurde stufenweise in Dulbeccos-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), supplementiert mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA), verdünnt. Normale menschliche Neutrophile wurden aus Buffy-Coat, gewonnen von gesunden Spendern (National Institutes of Health, Blood Bank, USA) durch Trennen auf Ficoll-Hypaque mit anschließender Lyse verunreinigender roter Blutkörperchen mit ACK-Lysepuffer, gereinigt. Die Reinheit der Neutrophilen betrug mehr als 95 % gemäß Anfärben der Zellen mit Giemsa-Lösung. Die Lebensfähigkeit betrug ebenfalls mehr als 95 % gemäß einem Trypan-Blau-Farbstoffaussschlußtest. Die neutrophilen Zellen wurden in einer Zelldichte von einer Million Zellen/ml in DMEM, supplementiert mit 1 % BSA, für 40 min bei 37 ºC, inkubiert. Die migrierten Neutrophilen, die an einer Membran hafteten (3 um: Nuclepore Corp., USA), wurden mit Methanol fixiert und mit Giemsa-Lösung angefärbt. Bei 0,1 ng/ml wurde eine signifikante Migration gemäß mikroskopischer Beobachtung beobachtet. Bei 10 ng/ml wurde die maximale Migration beobachtet. Die migrierten Zellen wurden morphologisch als Neutrophile identifiziert.
Zur Vereinfachung der Beschreibung werden die folgenden Abkürzungen in der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet.
A: Adenin
C: Cytosin
G: Guanin
T: Thymin
I: Inosin
dATP: Desoxyadenosintriphosphat
dCTP: Desoxycytidintriphosphat
dGTP: Desoxyguanosintriphosphat
dTTP: Desoxythymidintriphosphat
ATP: Adenosintriphosphat
DNA: Desoxyribonucleinsäure
cDNA: komplementäre DNA
kbp: Kilobasenpaare
SD-Sequenz: Shine-Dalgarno-Sequenz
kD: Kilodalton
SDS: Natriumlaurylsulfat
[3H]-Thymidin: tritiiertes Thymidin
In der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen ist die durch einen Einzelstrang gezeigte Nucleotidsequenz die Nucleotidsequenz eines Sinnstranges und das linke Ende ist ein 5'-Ende und das rechte Ende ist ein 3'-Ende. In der Aminosäuresequenz ist das linke Ende ein N-terminales Ende und das rechte Ende ist ein C-terminales Ende.
Das folgende Beispiel und die Referenzbeispiele erläutern diese Erfindung genauer.
Es ist jedoch zu verstehen, daß diese Erfindung in keiner Weise auf diese Beispiele beschränkt ist.
Zum besseren Verständnis des folgenden Beispiels und der Referenzbeispiele sind die Schemata 1 bis 3 der vorliegenden Beschreibung beigefügt.
Schema 1 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion des Expressionsplasmids pHNP101 (Beispiel);
Schema 2 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion des Expressionsvektors pEP205 (Referenzbeispiel 2);
Schema 3 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion des Expressionsplasmids pHIPH383a (Referenzbeispiel 3).

Beispiel

Produktion eines menschlichen NCF-Polypeptids

Ein menschliches NCF-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I] in Tabelle 1 wurde nach den folgenden Verfahren produziert.

(1) Konstruktion des Expressionsplasmids pHNP101

Aus dem rekombinanten Plasmid pUCl9-1.7-5, in das menschlicher NCFcDNA, wie in Referenzbeispiel 1 erwähnt, insertiert war, wurde das DNA-Fragment, das das Polypeptid entsprechend den Aminosäuren von der 18. Position bis zu der 97. Position vom N-Terminus eines menschlicher-NCF- Vorläuferpolypeptids (entsprechend der Basensequenz von der Base Nr. 52 bis Nr. 291 in Tabelle 3) isoliert durch Spalten mit den Restriktionsendonucleasen PstI und EcoRI. Dieses DNA-Fragment wurde dann in einen Phagenvektor M13mp18 (Takara Shuzo Co., Japan) in einer Region zwischen der Restriktionsendonucleasen-Spaltstelle von PstI und der von EcoRI in der Polylinkersequenz cloniert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Phagen-DNA wurde eine spezifische Basensequenz, die 5'-TTTAAATTATG-3' lautete, zwischen dem Codon entsprechend dem Arg in der 27. Position vom N-Terminus des menschlicher-NCF-Vorläuferpolypeptids und dem Codon entsprechend Ser in der 28. Position durch die Technik der ortsspezifischen Mutagenese gemäß dem Verfahren von Kunkel et al. (Methods in Enzymol., 154, 367-382, 1987) insertiert. Die ortsspezifische Mutagenese wurde unter Verwendung eines MutaGene in vitro Mutagenese-Kits gemäß den Angaben des Herstellers (BioRad Labs., USA) durchgeführt.
E. coli JM105 wurde mit der rekombinanten Phagen-DNA infiziert, und sie wurde dann gezüchtet, um den rekombinanten Phagen zu gewinnen. Dann wurde E. coli CJ236 mit dem wie vorstehend erhaltenen, rekombinanten Phagen infiziert und in 2xTY-Medium [Zusammensetzung: 1,6 % Trypton, 1 % Hefeextrakt, 0,5 % Natriumchlorid], supplementiert mit Uridin (1 ug/ml) und Chloramphenicol (20 pg/ml) bei 37ºC 5 h lang gezüchtet. Die einzelsträngige Phagen-DNA, die Uracile enthielt, wurde aus dem Kulturmedium isoliert.
Getrennt davon wurde ein mutagener Oligodesoxyribonucleotid-Primer, bestehend aus 33 Basen der folgenden Formel [E] chemisch synthetisiert.
5'-GTTTTGCCAAGGTTTAAATTATGAGTGCTAAAG-3'

Formel [E]

Das 5'-Ende des mutagenen Primers wurde zuvor phosphoryliert. Der phosphorylierte Primer wurde mit der Uracile enthaltenden einzelsträngigen Phagen-DNA wie vorstehend in einem Assoziierungspuffer [20 mM Tris-HCl-Puffer (ph 7,4), enthaltend 2 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Natriumchloridj durch 10-minütige Inkubation bei 70ºC mit anschließender Abkühlung auf 30ºC in einer Geschwindigkeit von 1ºC pro min reassoziiert. Dann wurde der Primer mit einer T4 DNA-Polymerase in einem Synthesepuffer [10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend jeweils 0,4 mM Desoxynucleosidtriphosphat (dGTP, dATP, dCTP, dTTP), 0,75 mM ATP, 3,75 mM Magnesiumchlorid und 1,5 mM Dithiothreit] verlängert, um einen komplementären Strang zu synthetisierten, und die Enden wurden mit T4 DNA-Ligase durch aufeinanderfolgende Inkubation auf Eis für 5 min, bei 25ºC für 5 min und bei 37ºC für 90 min ligiert. Die Reaktion wurde durch Gefrieren auf -20ºC gestoppt. Die kreisförmige doppelsträngige DNA (Heteroduplex) wurde in E. coli JM105-Zellen eingeschleust, und sie wurden gezüchtet, um die mutierte doppelsträngige replikative DNA-Form zu isolieren. Die Nucleotidsequenz der mutierten DNA wurde durch Sequenzieren der einzelsträngigen, aus dem Kulturmedium isolierten DNA bestätigt.
Die so erhaltene mutierte, doppelsträngige DNA wurde mit den Restriktionsendonucleasen DraI und EcoRI gespalten, um ein DNA-Fragment, das den Hauptteil der codierenden Region für ein menschlicher-NCF-Polypeptid enthielt, zu isolieren. Das isolierte DNA-Fragment wird nachstehend als NCF(DraI-EcoRI)-Fragment bezeichnet.
Dieses NCF(DraI-EcoRI)-Fragment wurde durch T4 DNA-Ligase mit einem chemisch synthetisierten Oligodesoxynucleotidadaptor der folgenden Formel [F]
ligiert.
Das so erhaltene ligierte DNA-Fragment wird als NCF(Dral-XhoI)- Fragment bezeichnet.
Getrennt davon wurde das in Referenzbeispiel 2 erwähnte Expressionsplasmid pEP205 mit den Restriktionsendonucleasen Dral und Xhol gespalten, und das so erhaltene größere DNA-Fragment einschließlich eines Ampicillin-Resistenz-Gens und eines Replikations-Origins (nachstehend als das EP205-Vektor-DNA-Fragment bezeichnet) wurde isoliert, und dieses EP205-Vektor-DNA-Fragment wurde durch T4 DNA-Ligase mit dem zuvor hergestellten NCF(DraI-XhoI)-Fragment ligiert, um ein Expressionsplasmid pHNP101 zur Produktion von menschlichem NCF zu konstruieren (siehe Schema 1).

(2) Transformation von Escherichia coli

Das so erhaltene Expressionsplasmid pHNP101 wurde in E. coli HB101 nach folgender Art eingeschleust.
E. coli HB101 wurde in LB-Brühe [Zusammensetzung: 1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Natriumchlorid (pH 7,5)] inokuliert und über Nacht bei 30ºC gezüchtet. 1 ml der so erhaltenen Kultur wurde in 100 ml LB-Brühe inokuliert und bei 30ºC weitergezüchtet, bis die Trübung bei 600 nm der Kultur etwa 0,6 erreicht hatte. Nach 30-minütigem Stehenlassen in Eiswasser wurden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen. Sie wurden in 50 ml 50 mM Calciumchlorid resuspendiert und 60 min lang in Eiswasser stehengelassen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen und erneut in 10 ml 50 mM Calciumchlorid, enthaltend 20 % Glycerin, suspendiert.
Diese Zellsuspension wurde mit dem Expressionsplasmid pHNP101 vermischt und stufenweise in Eiswasser 20 min lang und bei Raumtemperatur 60 min lang inkubiert. Dann wurde die LB-Brühe der Zellsuspension zugesetzt, und sie wurde unter Schütteln bei 37ºC 60 min lang gezüchtet. Ein Aliquot der so erhaltenen Zellsuspension wurde auf LB-Agarplatten (1,5 % Agar), enthaltend 25 ug/ml Ampicillin, inokuliert. Nach Züchten bei 37ºC über Nacht wurden die ampicillin-resistenten Kolonien ausgewählt, um die Transformanten zu erhalten. Einer der Transformanten wurde als E. coli HB101/pHNp101 bezeichnet, und der wurde zur Produktiond es menschlichen NCF-Polypeptids verwendet.

(3) Produktion des menschlicher-NCF-Polypeptids

E. coli HB101/pHNP101, erhalten gemäß Abschnitt (2), wurde in der LB-Brühe über Nacht bei 37 C gezüchtet. Die Kultur wurde in 100fachen Volumina des Nährmediums [Zusammensetzung: 1,5 % Natriumphosphat, dibasiasch 12-Wasser, 0,3 % Kaliumphosphat, monobasisch, 0,1 % Ammoniumchlorid, 2 mg/l Vitamin BI, 0,5 % Casaminosäure, 2 mM Magnesiumsulfat, 0,1 mM Calciumchlorid, 1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Natriumchlorid und 0,4 % Glycerin] inokuliert, und dann wurde 3-Indolacrylsäure zugesetzt, wodurch eine Endkonzentration von 20 pg/ml erhalten wurde. Die Züchtung wurde 28 h lang bei 35ºC durchgeführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), enthaltend 0,1 % Lysozym und 30 mM Natriumchlorid, suspendiert. Die Suspension wurde 30 min lang in Eiswasser stehengelassen. Dann wurden das Gefrieren in einem Trockeneis/Ethanolbad und Auftauen bei 37ºC wiederholt, um die Zellen aufzubrechen. Nach Zugabe von 1/50 Volumen eines 10%igen Ethyleniminpolymeren wurde ein geklärter Zellextrakt durch Zentrifugation erhalten. Dieser Zellextrakt wurde mit Ammoniumsulfat bis zu einer 70%igen Sättigung versetzt, und das gebildete Präzipitat wurde durch Zentrifugation gewonnen. Das Präzipitat wurde in destilliertem Wasser aufgelöst und gegen 5 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 6,5) (nachstehend als PBS bezeichnet) dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Säule aus Sephacryl S- 200 (Pharmacia, Schweden) aufgebracht, und die Fraktion, die Polypeptide mit einem Molekulargewicht von etwa 6 bis 10 kD enthielten, wurden gewonnen und vereinigt. Die Molekülgrößen der Polypeptide in jedem Eluat wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophose gemessen. Die Vereinigungsfraktion wurde gegen 20 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) (nachstehend als PB bezeichnet) dialysiert. Dann wurde das Dialysat auf eine Säule aus CM- Sepharose CL-6B (Pharmacia, Schweden), die zuvor mit PB äquilibriert worden war, aufgebracht. Die Säule wurde mit PB gewaschen und mit einem linearen Gradienten aus Natriumchlorid mit einer Molarität von 0 bis 0,5 M in PB eluiert. Die das menschlichr-NCF-Polypeptid enthaltenden Fraktionen wurden gewonnen und vereinigt und durch Ultrafiltration eingeengt. Ferner wurde das Konzentrat einer Gelfiltration auf einer Toyopearl HW-55-Säule (TOSOH Co., Japan) unterworfen, wodurch das hochgereinigte menschlicher-NCF-Polypeptid erhalten wurde.
Gemäß SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde keine Verunreinigung in dem hochgereinigten menschlicher-NCF-Polypeptid-Präparat nachgewiesen.
Dieses menschlicher-NCF-Präparat wurde für chemische, physikalisch chemische und biologische Analysen, wie zuvor gezeigt, verwendet.

Referenzbeispiel 1

Clonierung der cDNA die menschlichen NCF codiert

Die cDNA-Bank wurde durch Insertion von cDNA, synthetisiert gemäß normaler menschlicher polyadenylierter Monocyten-mRNA, erhalten aus mit 10 ug/ml Lipopolysaccharid 6 h lang stimulierten Monocyten, in die EcoRI- Spaltstelle des Phagenvektors λ gt10 konstruiert. Eine halbe Million einzelner Plaques wurden auf Hybridisierung mit den zwei Arten [32P]-markierter chemisch synthetisierter Oligonucleotidsonden der folgenden Formeln:
und
abgesucht.
Bei dem ersten Absuchen wurden 13 vermutlich positive Clone erhalten. Aus diesen positiven Clonen wurde ein Clon (mit der Bezeichnung r-MDNCF 2-1) bei dem zweiten Screening unter Verwendung der anderen Sonde ausgewählt. Die Phagen-DNA in r-MDNCF 2-1 wurde in das pUC19-Plasmid subcloniert.
Das so erhaltene rekombinante Plasmid wurde als pUC19-1.7-5 bezeichnet. Die clonierte cDNA in dem rekombinanten Plasmid pUCl9-1.7-5 enthält eine Nucleotidsequenz, die den menschlichen NCF codiert und ist in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Nucleotidsequenz des menschlicher-NCF-Vorläufer-cDNA und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz

Referenzbeispiel 2

Konstruktion des Expressionsvektors pEP205

Das Plasmid pBR322 wurde mit den Restriktionsendonucleasen AvaI und PvuII gespalten, und das so erhaltene größere DNA-Fragment (Größe etwa 3,7 kbp) wurde isoliert. Nach Auffüllen seiner kohäsiven Enden zu glatten Enden mit der E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) in Gegenwart von dGTP, dATP, dCTP und dTTP wurden beide Enden durch die T4 DNA-Ligase ligiert, wodurch ein neuer Plasmidvektor (mit der Bezeichnung pBRS6) konstruiert wurde, von dem eine Genregion zur Regulation der Kopienzahl, die in der Nähe des Replikations-Origins des Plasmids pBR322 angeordnet war, deletiert war.
Der Plasmidvektor pBRS6 wurde mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und PstI gespalten, und ein kleineres DNA-Fragment, das eine stromaufwärtige Region des Amplicillin-Resistentenz-Gens enthielt (Größe etwa 0,75 kbp) wurde isoliert. Das so erhaltene DNA-Fragment wird als das Amp(PstI-EcoRI)-Fragment bezeichnet.
Dieses Amp(PstI-EcoRI)-Fragment wurde in den Phagenvektor M13mp18, wie in dem Beispiel erwähnt, cloniert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten Phagen-DNA wurde eine Base (T) in der Nucleotidsequenz des Amp(PstI-EcoRI)-Fragments in eine andere Base (C) durch die ortsspezifische Mutagenese gemäß dem in dem Beispiel erwähnten Verfahren geändert, um die spezifische Nucleotidsequenz (AAATTT), die von der Restriktionsendonuclease DraI erkannt werden kann, zu beseitigen.
Die Uracile enthaltende, einzelsträngige Phagen-DNA wurde aus dem Kulturmedium von E. coli CJ236, das mit der vorstehend erwähnten, rekombinanten Phagen-DNA infiziert war, isoliert. Als Mutagenese-Primer wurde das Oligodesoxyribonucleotid der folgenden Formel [G] chemisch synthetisiert.
5'-CAGAACTTTGAAAGTGCTC-3' Formel [G]
Der phosphorylierte Primer wurde mit der Uracil enthaltenden DNA- Matritze assoziiert. Gemäß dem in dem Beispiel, Abschnitt (1), beschriebenen Verfahren wurde die gewünschte, mutierte, doppelsträngige DNA isoliert.
Die so erhaltene, mutierte, doppelsträngig DNA wurde mit den Restriktionsendonucleasen Pstl und EcoRI gespalten, um ein DNA-Fragment entsprechend dem Amp(PstI-EcoRI)-Fragment, wie vorstehend erwähnt, das aber die Erkennungssequenz für die Spaltung durch die Restriktionsendonuclease DraI nicht enthielt, zu isolieren [nachstehend als das mutierte Amp(PstI-EcoRI)-Fragment bezeichnet]. Das mutierte Amp(PstI-EcoRI)- Fragment wurde mit dem größeren DNA-Fragment, das aus dem Vektor pBRS6 durch Spaltung mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und PstI isoliert worden war, ligiert, um einen neuen Vektor zu konstruieren, bei dem die Erkennungssequenz für die Dral-Spaltung in dem Amplicillin-Resistenz-Gen des Plasmidvektors pBRS6 eliminiert war. Dieser neue Vektor wird als pBRS601 bezeichnet.
Ferner wurde dieser neue Vektor pBRS601 mit der Restriktionsendonuclease DraI gespalten, und das so erhaltene größere DNA-Fragment wurde isoliert. Das größere DNA-Fragment wurde mit dem SmaI-Linker (Takara Shuzo Co., Japan) durch die T4 DNA-Ligase ligiert, wodurch ein neuer Plasmidvektor konstruiert wurde. Dieser so erhaltene neue Plasmidvektor ist ein Derivat des Plasmids pBRS6 und enthält keine Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonuclease Dral. Dieser neue Plasmidvektor wird als pBRS602 bezeichnet.
Die Nucleotidsequenz des SmaI-Linkers ist nachstehend gezeigt.
5'-CCCGGG-3'
Ferner wurde dieser neue Vektor pBRS602 mit der Restriktionsendonuclease AatII und SalI gespalten, und das so erhaltene größere DNA-Fragment wurde isoliert [nachstehend als das pBRS602(AatII-SalI)-Fragment] bezeichnet.
Getrennt davon wurde das Expressionsplasmid pHIPH383a zur Produktion von menschlichem Interleukin-1α, wie in Referenzbeispiel 3 erwähnt, mit den Restriktionsendonucleasen AatII und SalI gespalten, und das so erhaltene DNA-Fragment, das die E. coli-Tryptophan-Promotor-Sequenz und die codierende Region für menschliches Interleukin-1α enthielt, wurde isoliert. Das so erhaltene DNA-Fragment wird als das trp-Promotor/IL1α- DNA-Fragment bezeichnet.
Dieses trp-Promotor/ILlα-DNA-Fragment wurde mit dem pBRS602(AatII- SalI)-Fragment durch T4 DNA-Ligase ligiert, wodurch ein neues Expressionsplasmid konstruiert wurde (siehe Schema 2).
Dieses neue Expressionsplasmid wird als pEP205 bezeichnet.

Referenzbeispiel 3

Konstruktion eines Expressionsplasmids pHIPH383a

Die clonierte cDNA, die das menschliche Interleukin-1α-Vorläufer- Polypeptid codiert, wurde nach dem in der europäischen Patentpublikation Nr. 0188920 beschriebenen Verfahren isoliert.
Aus dem rekombinanten Plasmid pHL4, das die menschliche Interleukin-la-Vorläufer-cDNA (Furutani, Y., et al., Nucleic Acis Res., 13, 5869, 1985) enthielt, wurde die cDNA-Insertion durch Spalten mit der Restriktionsendonuclease PstI isoliert und weiter mit den Restriktionsendonuclease EcoRI und BstNI gespalten, um ein DNA-Fragment (Größe 411 bp), das einen Mittelteil der codierenden Region für das reife menschliche Interleukin-1α enthält, zu isolieren. Das isolierte DNA-Fragment entspricht der Nucleotidsequenz von Base Nr. 398 bis Nr. 808 in der in der europäischen Patentpublikation Nr. 0188920 gezeigten Tabelle 5.
Dieses DNA-Fragment wurde stufenweise durch T4 DNA-Ligase mit chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotid-Adaptoren der folgenden Formeln [H] und [I] ligiert. Das so erhaltene DNA-Fragment wird als das SD-IL1-Fragment bezeichnet.
Der synthetische Oligodesoxyribonucleotid-Adaptor [H] wurde durch aufeinanderfolgende Ligierung der folgenden fünf Arten an DNA-Fragmenten der Formeln [a] bis [e]
und
hergestellt.
Eine Basensequenz der Formel [I] lautete wie folgt:
Getrennt davon wurde ein Expressionsvektor pEP302 (Furutani, Y., et al., Nucleic Acids Res., 13, 5869, 1985) mit den Restriktionsendonucleasen HpaI und BamHI gespalten, und das so erhaltene größere DNA-Fragment, das die E. coli-Tryptophan-Promotor-Sequenz und ein Amplicillin-Resistenz-Gen enthielt, wurde isoliert (nachstehend als das EP302-Vektor-DNA- Fragment bezeichnet).
Das EP302-Vektor-DNA-Fragment wurde durch T4 DNA-Ligase mit dem SD-IL1-Fragment, hergestellt wie vorstehend, ligiert, wodurch das Expressionsplasmid pHIPH383a zur Produktion des reifen menschlichen Interleukin-1α-Polypeptids konstruiert wurde (siehe Schema 3).

Industrielle Anwendbarkeit

Neutrophile infiltrieren die Orte einer bakteriellen Infektion, einer Entzündungsstelle und um maligne Tumorzellen und spielen eine wichtige Rolle bei den homöostatischen Verteidungsmechanismen. Die Neutrophilen werden durch NCF oder durch die Kombination aus NCF mit Interleukin-1 angezogen und weiter aktiviert. Beispielsweise erwartet man von der Verwendung der Kombination aus NCF und Interleukin-1 ein Arzneimittel zur Behandlung bestimmter bakterieller infektiöser Erkrankungen oder Krebsarten. Schema 1 Konstruktion des Expressionsplasmids pHNP101 Menschlicher NCFcDNA-Clon:pUC19-1.7-5 Spaltung mit PstI und EcoRI PstI-EcoRI-DNA-Fragment Clonierung in den Vektor M13mp18 Infektion von E. coli JM105 Rekombinanter Phage Züchtung in Uridin enthaltendem Medium Uracil enthaltende DNA-Matritze Assoziierung eines 33-meren Mutagenese-Primers [E] Extension des Primers mit T4 DNA-Polymerase Ligierung an den Enden mit T4 DNA-Ligase Heteroduplex Transformation von E. coli JM105 Mutierte doppelsträngige DNA Spaltung mit DraI und EcoRI NCF{DraI-EcoRI)-Fragment - wird fortgesetzt - Schema 1 [Fortsetzung) NCF(DraI-EcoRI)-Fragment Synthetische DNA [F] Ligierung mit T4 DNA-Ligase NCF(DraI-XhoI)-Fragment Expressionsvektor Spaltung mit DraI und XhoI EP205-Vektor-DNA-Fragment Expressionsplasmid pHNP101 Schema 2 Konstruktion eines Expressionsvektors pE205 Plasmid pBR322 Spaltung mit Aval und Pvul Größeres DNA-Fragment (3,7 kbp) Auffüllen der kohäsiven Enden zu glatten Enden mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) Ligierung mit TA DNA-Ligase Plasmid-Vektor pBS6 Spaltung mit EcoRI und PstI Amp(PstI-EcoRI)-Fragment Größeres pBRS6-Fragment* Clonierung in den Vektor M13mp18 Infektion von E. coli JM105 Rekombinanter Phage Züchtung in Uridin enthaltendem Medium Uracil enthaltende DNA-Matritze Assoziierung eines mutagenen Oligonudeoud-Primers [G] Extension des Primers mit TA DNA-Polymerase Heteroduplex - wird fortgesetzt - Schema 2 (Fortsetzung) Heteroduplex Transformation von E. coli JM105 Mutierte doppelsträngige DNA Spaltung mit PstI und EcoRI utertts Amp(PstIEcoRI)-Fragment Größeres pBRS6-Fragment* Ligierung mit T4 DNA-Ligase Plasmidvektor pBRS601 Spaltung mit DraI Größeres DNA-Fragment [SmaI-Linker] Spaltung mit AatlI und SalI pBRS602 (AatlI-SalI)-Fragment Expressionsplasmid pHIPH383a trp-Promotor/IL1α-DNA-Fragment Expressionsvektor pEP205 Schema 3 Konstruktion des Expressionsplasmids pHIPH383a Menschliche IL-1α-cDNA:pHL4 Spaltung mit PstI cDNA-Insertion Spaltung mit EcoRI und BstNI EcoRI-BstNI-Fragment Synthetische DNA Adaptor (H) Ligierung mit T4 DNA-Ligase Expressionsvektor pEP302 SD-IL1-Fragment Spaltung mit HpaI und BamHI EP302-Vektor-DNA-Fragment Expressionsplasmid pHIPH383a

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines menschlichen neutrophilen chemotaktischen Faktor-Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I]

dadurch gekennzeichnet, daß man eine das Polypeptid codierende Nucleotidsequenz mit der Aminosäuresequenz der Formel [I] in einem mit einem Expressionsvektor einschließlich der Nucleotidsequenz transformierten Escherichia coli direkt exprimiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleotidsequenz, die das menschliche neutrophile chemotaktische Faktor-Polypeptid codiert eine Nucleotidsequenz der Formel [A]

ist.

3. Verfahren zur Herstellung eines menschlichen neutrophilen chemotaktischen Faktor-Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I]

dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nucleotidsequenz, die das Polypeptid codiert, mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I] in einem mit einem Expressionsvektor einschließlich einer Nucleotidsequenz transformierten Escherichia coli direkt exprimiert, wobei eine Nucleotidsequenz der Formel [B] stromaufwärts einer Nucleotidsequenz der Formel [A]

worin X (A)x bedeutet, worin x einen Wert von 1 bis 5 besitzt und Y (A)y(T)z bedeutet, worin y einen Wert von 0 bis 3 besitzt und z einen Wert von 0 oder 1 besitzt, verknüpft ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die durch Formel [B] wiedergegebene Nucleotidsequenz eine Nucleotidseguenz der Formel [C] ist.

5'-AAAAGGAGGTTTAAATTATG-3' Formel [C]

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressionsvektor das rekombinante Plasmid pHNP101 ist, wobei das Plasmid gemäß dem Konstruktionsschema 1 der Beschreibung erhältlich ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die direkte Expression unter der regulatorischen Kontrolle eines trp-Promotors in Escherichia coli erfolgt.

7. Reinigungsverfahren eines menschlichen neutrophilen chemotaktischen Faktor-Polypeptids, hergestellt nach dem in einem der Ansprüche 1 bis 6 beanspruchten Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Stufen zur Behandlung des Polypeptids kombiniert werden: Zerstörung der Transformanten, Behandlung zur Entfernung der Nucleinsäuren, Anionen- und/oder Kationenaustauschchromatographie und Gelfiltration.