DE3586826T2 - Cdna-klone, kodierend fuer peptide mit der wirksamkeit eines menschlichen granulocyte-, makrophage- und eosinophilzellenwachstumsfaktors. - Google Patents
Cdna-klone, kodierend fuer peptide mit der wirksamkeit eines menschlichen granulocyte-, makrophage- und eosinophilzellenwachstumsfaktors.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft allgemein die Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie zur Aufklärung des Kontrollmechanismus der Immunantwort bei Säugern, und insbesondere die Isolierung von Nukleinsäureklonen, die für Polypeptide mit der Wirksamkeit des Granulocyten-/Makrophagen- Wachstumsfaktors, einschließlich des Eosinophilen- Wachstumsfaktors kodieren.
- Rekombinante DNA-Technologie bezieht sich allgemein auf die Technik des Einbaus genetischer Information aus einer Donorquelle in Vektoren für die nachfolgende Prozessierung, wie durch Einbau in einen Wirtsorganismus, wobei die übertragene genetische Information in die neue Umgebung kopiert und/oder exprimiert wird. Die genetische Information existiert im allgemeinen in Form der von der Messenger-RNA (mRNA) abgeleiteten komplementären DNA (cDNA), welche für ein gewünschtes Protein kodiert. Der Träger ist häufig ein Plasmid, das die Fähigkeit hat, den Einbau von cDNA zur späteren Replikation in einem Wirtsorganismus und in einigen Fällen tatsächlich die Expression der cDNA zu kontrollieren und dabei die Synthese des kodierten Produkts im Wirtsorganismus zu steuern.
- Diese Technologie hat sich in den vergangenen Jahren außerordentlich rasch entwickelt, und eine Reihe exogener Proteine ist inzwischen in einer Anzahl von Wirtsorganismen exprimiert worden. Wenn man aber irgendeinen- neuen cDNA-Klon erhalten will, bleibt dies mit Unsicherheitsfaktoren verbunden. Zu den mittels der rekombinanten DNA-Technologie hergestellten eukaryotischen Proteine zählen zum Beispiel: Proinsulin (Naber, S. et al., Gene 21 : 95-104 [1983]); Interferone (Simon, L. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 80 : 2059-2062 [1983) und Derynck, R. et al., Nucl. Acids Res. 1 : 1819-1837 [1983]); Wachstumshormon (Goeddel, D. et al., Nature 281 : 544-548 [1979]); und der Mastzellenwachstumsfaktor (Yokoda, T. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 81 : 1070- 1074 [1984]). (Diese Veröffentlichungen und andere, nachher zitierte Literaturstellen sind hier einbezogen worden, um zusätzliche Einzelheiten zur Vorgeschichte auf dem Fachgebiet und, in bestimmten Fällen, zur Durchführung der Erfindung zur Verfügung zu stellen; sie alle sind hierin durch Bezugnahme aufgenommen.)
- Eine Zeitlang war es ein Dogma, daß die Immunreaktion bei Säugern primär von einer Reihe komplexer zellulärer Wechselwirkungen, dem sogenannten "Immun-Netzwerk", verursacht wird. Während es weiterhin klar bleibt, daß sich bei dieser Reaktion vieles tatsächlich um netzwerkartige Wechselwirkungen von Lymphocyten, Makrophagen, Granulocyten und anderen Zellen dreht, vertreten jetzt Immunologen generell die Auffassung, daß lösliche Proteine (z. B. die sogenannten Lymphokine) eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle zellulärer Wechselwirkungen spielen.
- Lymphokine spielen bei zellulären Vorgängen anscheinend in vielfältiger Weise eine Mittlerrolle. Man hat gezeigt, daß sie die Fähigkeit haben, die Proliferation und das Wachstum verschiedener hämatopoetischer Zellen zu unterstützen, und man nimmt an, daß sie tatsächlich eine entscheidende Rolle bei der grundlegenden Differenzierung pluripotenter hämatopoetischer Stammzellen in die gewaltige Vielzahl der Vorläufer der verschiedenen, für die Immunreaktion verantwortlichen Zell- Hauptlinien spielen. Für die Reaktion wichtige Zell- Hauptlinien beinhalten zwei Klassen von Lymphocyten: die B- Zellen, die Immunglobuline (Proteine mit der Fähigkeit der Erkennung von fremden Substanzen und Bindung an diese, um deren Beseitigung zu bewirken) produzieren und ausscheiden können, und die T-Zellen (mit verschiedenartigen Untergruppen), von denen man annimmt, daß sie durch verschiedene Mechanismen B-Zellen und einige der anderen Zellen (einschließlich anderer T-Zellen), die das Immun- Netzwerk bilden, induzieren oder unterdrücken.
- Ein weiterer wichtiger Typ der weißen Blutzellen sind die Phagocyten, insbesondere die polymorphonuklearen und mononuklearen Leukocyten. Man nimmt an, daß diese Zellen spezialisiert sind im Abfangen, eine Fähigkeit, die eine Voraussetzung für das Mitwirken bei der Beseitigung eindringender Organismen und bei der Entfernung abgestorbener Zellen und extrazellulärer Trümmer ist.
- Zu diesen Zelltypen der Leukocyten zählen die Granulocyten, einschließlich der Neutrophilen und Eosinophilen. Neutrophile findet man im peripheren Blut, vielen Geweben und den meisten Körperregionen, die direkten Kontakt mit der Umgebung haben (z. B. Mundhöhle, Bronchotrachealbaum und Zervikalkanal). Ihre Phagocyten- Reaktion auf Mikroben-Einfall ist gut untersucht worden (Klebanoff, S. und Clark, R., The Neutrophil: Function and Clinical Disorders, Elsevier/North Holland Biomedical Prep., Amsterdam [1978]), zusammen mit der Zerstörung der von ihnen einverleibten Organismen, welche primär durch die kontrollierte Freisetzung verschiedener antimikrobischer Wirkstoffe (z. B. Sauerstoffradikale, H&sub2;O&sub2; und Halogenidionen) in die Vakuolen bewirkt wird. Viel weniger ist über Eosinophile bekannt, obwohl sie schnell durch ihr sehr charakteristisches Granulationsmuster identifizierbar sind und ein dokumentierter Zusammenhang besteht mit allergischen Erkrankungen und bestimmten parasitären Krankheiten, wie der Trichinose.
- Makrophagen unterscheiden sich von den Granulocyten darin, daß sie bestimmte Charakteristiken in Abhängigkeit vom umgebenden Gewebe entwickeln; so zählen zu den Gewebsmakrophagen Histiocyten im Bindegewebe, Kupffer-Zellen in der Leber, alveoläre Makrophagen in der Lunge, Osteoklasten in den Knochen, mikrobische Zellen im Nervensystem, Langerhaus-Zellen in der Haut, sowie freie oder ortsansässige Zellen in anderen Organen. Zusätzlich zu ihrer phagocytischen Fähigkeit können Makrophagen viele sehr wichtige biologisch aktive Substanzen absondern, wie Lysozym, Plasminogenaktivator, Kollagenase, Elastase, Säurehydrolasen, komplementäre Komponenten, Prostaglandine, endogenes Pyrogen, einige Lymphokine und Sauerstoffmetaboliten. Man nimmt auch an, daß die Makrophagen die Versorgung mit Antigenen und deren Bereitstellung an die B- und T-Lymphocyten regeln (Cline, M., The White Cell, Harvard University Press, Cambridge, Mass. [1975]).
- Für die Forschung mit dem Ziel, Neutropenie, Lymphopenie, Monocytopenie, Leukämie oder eine leukomoide Reaktion, sowie auch andere Immunstörungen durch Untersuchung von Makrophagen, Granulocyten, T-Zellen und den anderen an der Immunreaktion beteiligten Zellen besser verstehen (und so möglicherweise therapeutisch behandeln) zu können, war es ein Hemmschuh, daß es nicht möglich war, diese Zellen in vitro zu halten. Verschiedene Immunologen haben jedoch kürzlich entdeckt, daß viele solcher Zellen isoliert und in einigen Fällen kultiviert werden konnten, wenn man sie auf Sekreten anderer Zellen, wie konditionierten Medien von mittels Conacanavalin A (ConA) stimulierten Lymphocyten der Milz, wachsen ließ. Durch diese Arbeiten ist nun klar geworden, daß es bei der Bildung von Zellklonen eine Abhängigkeit von spezifischen Faktoren, wie Lymphokinen, gibt.
- Anscheinend werden fast alle Blutzelltypen im Knochenmark erwachsener Wirbeltiere ununterbrochen durch Wachstum und Differenzierung einer Hierarchie hämatopoetischer Vorläuferzellen gebildet. An der Spitze dieses hierarchischen Stammbaums steht die pluripotente Stammzelle, welche die Fähigkeit hat, ein tödlich bestrahltes Tier unter Entwicklung der meisten, wenn nicht aller hämatopoetischen Zelltypen (z. B. Erythrocyten, Trombocyten, Lymphocyten, verschiedene Granulocyten und Monocyten/Makrophagen) wiederbesiedeln zu können. Die pluripotente Zelle hat nicht nur die Fähigkeit, die pluripotenten Stammzell-Kompartments zu regenerieren (Selbsterneuerung), sondern sie regt auch zur Entwicklung auf einer bestimmten Bahn der Hauptlinie determinierte Vorläuferzellen an. Ein Nachkomme einer bestimmten determinierten Stammzelle scheint die gleiche Zell-Linien-Determinierung wie die Elternzelle aufzuweisen (Metcalf, D. Hemopoietic Colonies, Springer Publishing Co., New York, N.Y. [1977]).
- In vitro-Studien der Hämatopoese haben gezeigt, daß eine Anzahl löslicher Faktoren das Wachstum und die Diffenzierung dieser verschiedenen Vorläuferzellen und determinierter Zellen steuern können. Einige dieser Faktoren sind teilweise gereinigt worden, und man hat zeigen können, daß sie spezifisch auf zu einer bestimmten Hauptlinie gehörende Stammzellen einwirken. Zum Beispiel stimuliert Erythropoetin, das in erster Linie in den Nieren gebildet wird, die stärker differenzierten Mitglieder der Erythroiden-Hierarchie (Miyake, T., et al., J. Biol. Chem. 252 : 5558 [1977]), und in T-Zellen und Makrophagen gebildete kolonien-stimulierende Aktivität stimuliert bevorzugt in halbfesten Knochenmarkzellkulturen gezogene Granulocyten und Makrophagen (Stanley, E., und Heard, P., J. Biol. Chem. 252 : 4305 [1977]). Noch ein anderer Typ eines Wachstumsfaktors scheint aus einzelnen Zelltypen und Mischungen von Zellen bestehende hämatopoetische Kolonien stimulieren zu können. Die Tatsache, daß eine Reihe von Zellen, wie Präerythrocyten, Megakaryocyten, Granulocyten, Mastzellen und Monocyten/Makrophagen, auf einen Faktor dieses zweiten Typs anzusprechen scheinen, hat dazu geführt, daß dieser als ein auf multiple Hauptlinien wirkender zellulärer Wachstumsfaktor bezeichnet wird (Iscove, N. et al., J. Cell. Physiol. Suppl., 1 : 65-78 [1982]), um anzuzeigen, daß dieser die Fähigkeit hat, auf eine größere Anzahl von determinierten Vorläuferzellen und pluripotenter Stammzellen einzuwirken.
- Von der kolonien-stimulierenden Aktivität ist bekannt, daß sie in mehreren molekularen Formen existiert, die auch zusammen bekannt sind als kolonien-stimuliernde Faktoren (CSFs). CSFs sind eine Familie von Glycoproteinen mit Molekulargewichten, die von ungefähr 20000 bis 70000 Dalton reichen, und die verbreitet im Blut und im Urin gefunden werden. Die Gruppe dieser Faktoren, die fähig ist, sowohl die Granulocyten- als auch die Makrophagen-Kolonienbildung zu stimulieren (siehe Metcalf, D., Hematopoietic Colonies; In Vitro Cloning of Normal and Leukemic Cells; Springer Publishing Co., New York [1977]) ist als "GM-CSF" bekannt.
- In Anbetracht dessen, daß Maus- und Human-GM-CSFs beide wenigstens teilweise gereinigt und biochemisch charakterisiert worden sind, ist doch über gewaltige Diskrepanzen, sowohl was Molekulargewicht als auch das Wirkungsspektrums angeht, berichtet worden - und dies selbst innerhalb der gleichen Art (Metcalf, D., "Hematopoietic Colony Stimulating Factors" in Handbook of Experimental Pharmacology, 57 : 343-384, Springer- Verlag, New York [1978]). Die erfolgreiche Klonierung von für GM-CSF der Maus kodierender cDNAs (Gough, N. et al., Nature 309, 763-767 [1984]) sollte viele der noch vorhandenen Fragen im Umfeld des Maus-GM-CSF zu beantworten helfen; aber die Probleme im Human-System bleiben. Mindestens zwei Gruppen von Forschern haben über zwei Human-GM-CSFs berichtet (Das, S. et al., Blood 58 : 630-641 [1981] und Nicola, N. et al., Blood 54: 614-627 [1979)). In der Tat, selbst mit der in vitro- Translation von für Human-GM-CSF kodierender mRNA (isoliert aus einer T-Lymphocytenzellinie, ATCC-Zugangs-Nummer CRL8066; siehe US-Patent 4438032), welche, wie verlautet, biologisch aktives Protein liefert (Lusis, A. et al., Nature 298 : 75-77 [1982]), bleiben gewaltige Unsicherheiten im Umfeld der Human- CSFs (siehe Burgess, A., Growth Factors and Stem Cells, Kapitel 4, Seiten 93-124, Academic Press, New York [1984]).
- Obgleich Molekulargewichtsdifferenzen vielleicht teilweise durch unterschiedliche Glycosylierungsgrade erklärt werden könnten, werden zur Aufklärung dieses Sachverhalts und des von einem einzigen Molekül gezeigten Spektrums von Wirkungen zusätzliche strukturelle Daten, wie z. B. eine im wesentlichen vollständige Sequenzanalyse des fraglichen Moleküls benötigt. Die Proteinsequenzierung bietet sich natürlich als mögliches Hilfmittel zur Lösung des Problems an; ihre experimentelle Durchführung ist aber sehr schwierig, und oft können weder hinreichend genaue noch vollständige Aminosäuresequenzen erhalten werden. Wenn man nun imstande ist, größere Mengen eines Polypeptids mit Human-GM-CSF- Aktivität herzustellen, wird dies die Untersuchung der Biologie der Granulocyten, Makrophagen und anderer an der Immunreaktion beteiligter Zellen außerordentlich fördern; z. B. ist man dann in geringerem Maße auf ConA-konditionierte Medien zur Stimulierung des Zellwachstums angewiesen. Genaue und vollständige Sequenzdaten eines Human-CSF werden bei der Vereinfachung der Suche nach anderen immunologischen Faktoren dienlich sein. Schließlich werden zusätzliche Informationen über ein Lymphokin bei der Bewertung der Rolle der verschiedenen Wachstumsfaktoren und Zellen des Immun- Netzwerkes helfen und so Einsicht in das ganze Immunsystem geben - mit dem damit verbundenen therapeutischen Nutzen.
- Somit existiert ein signifikanter Bedarfan umfassenden Nukleotidsequenzdaten von für Proteine mit GM-CSF-Aktivität kodierenden DNAs und an deren Aminosäuresequenzen sowie einem einfachen und wirtschaftlichen Verfahren zu Herstellung nennenswerter und im wesentlichen reiner Mengen solcher Stoffe. Die vorliegende Erfindung befriedigt diese Bedürfnisse.
- Die vorliegende Erfindung stellt c-DNA-Klone zur Verfügung, die für Polypeptide mit Human-GM-CSF-Aktivität kodieren. Fig. 1 zeigt eine Nukleotidsequenz für eine cDNA und eine mutmaßliche Aminosäuresequenz für das zugehörige Polypeptid. Die cDNA-Sequenz kann in unterschiedliche Vektoren eingebaut werden, die dann wieder die Synthese der entsprechenden Polypeptide in einer Vielzahl von Wirtsorganismen, einschließlich der eukaryotischen Zellen, wie Säugerzellen in Kultur, steuern können.
- Um es genauer auszudrücken, mit der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden mit CSF-Aktivität bereitgestellt, mit den folgenden Schritten:
- (a) Bildung eines Vektors, der eine für dieses Polypeptid kodierende Nukleotidsequenz umfaßt, worin die Nukleotidsequenz die Fähigkeit zu Exprimierung in einem den Vektor enthaltenden Wirt aufweist;
- (b) Einbau des Vektors in den Wirt; und
- (c) Halten des den Vektors enthaltenden Wirts unter Bedingungen, die für die Expression der Nukleotidsequenz in dieses Polypeptid geeignet sind.
- Vorzugsweise stammt die cDNA-Sequenz aus einer nichttransformierten Human-T-Zellen-mRNA-Sequenz, die für das Polypeptid kodiert, und der Wirt ist eine mit dem Vektor transfizierte oder transformierte eukaryotische Zelle, z. B. von einem Säuger. Weiterhin umfaßt der Vektor vorzugsweise auch eine zweite Nukleotidsequenz, die zur Kontrolle der für das Polypeptid kodierenden Nukleotidsequenz befähigt ist. Diese zweite kodierende Sequenz kann eine Promotorsequenz, eine oder mehrere Intronsequenzen und eine Polyadenylierungssequenz enthalten, um Transkription, Spleißen bzw. Polyadenylierung der für das Polypeptid kodierenden Nukleotidsequenz zu ermöglichen. Wenn es sich bei dem Wirt um eine Säugerzelle, wie eine COS-7-Affen-(Nieren)-Zelle, handelt, enthält der Vektor insbesondere die Promotorsequenz des Promotors aus der frühen Affenvirus 40-(SV40)-Region und als Polyadenylierungssequenz diejenige aus der späten SV40- Region.
- Die Human-cDNA-Sequenz von Fig. 1 (siehe unten) weist die Fähigkeit zur Hybridisierung mit anderen DNA-Sequenzen auf, wie z. B. DNA aus cDNA oder einer Genbank, die für andere Wachstumsfaktoren von Säugern kodiert. Es sei angemerkt, daß die beschriebene cDNA-Sequenz die Information für eine Leader- Sequenz zu enthalten scheint.
- Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung verfügen über die Fähigkeit, das Wachstum menschlicher neutrophiler Granulocyten, Makrophagen und anderer Zellen (wie z. B. Eosinophilen) insbesondere in in vitro-Kulturen zu fördern. Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen können hergestellt werden durch Zugabe der Polypeptide (deren Präparate im wesentlichen frei sind von anderen menschlichen Wachstumsfaktoren) zu therapeutisch verträglichen Trägern.
- Die anderen Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden detaillierten Beschreibung hervor, welche in Verbindung mit den dazugehörigen Zeichnungen und durch Beispiele die vorliegende Erfindung beschreibt. In den Zeichnungen:
- Fig. 1 erläutert die Nukleotidsequenz und die mutmaßliche entsprechende Aminosäuresequenz eines Human-GM- CSF-Wirkung entfaltenden cDNA-Klons,
- Fig. 2A erläutert pcD-Human-GM-CSF, ein Plasmid, das einen Human-GM-CSF-Wirkung entfaltenden cDNA-Klon trägt;
- Fig. 2B ist eine Kartierung der Restriktionsendonukleaseschnittstellen der cDNA-Insertionen von Fig. 2A; und
- Fig. 3 zeigt einen Vergleich zwischen der mutmaßlichen Maus- und der Human-GM-CSF-Aminosäuresequenz.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung werden cDNA-Klone bereitgestellt, welche für Polypeptide mit Human-GM-CSF- Wirkung kodieren. Nachdem die cDNA-Sequenzen in einem replizierenden Expressionsvektor eingebaut und der Vektor in einen geeigneten Wirt (z. B. eine Säugerzellkultur) transfiziert worden ist, sind das(die) exprimierte(n) Polypeptid(e) fähig, die Vermehrung von neutrophilen Granulocyten, Makrophagen und anderer hämatopoetischer Hauptlinien (wie z. B. Eosinophilen) zu ermöglichen.
- Fig. 1 zeigt ein Beispiel einer mutmaßlichen Aminosäuresequenz basiernd auf der isolierten Nukleotidsequenz.
- Die Human-GM-CSF-cDNA enthält einen einfachen Leserahmen bestehend aus 144 Codons. Stromabwärts vom mutmaßlichen Startcodon ist eine an hydrophoben Aminosäuren reiche Region. Es ist daher wahrscheinlich, daß die reife Form des abgeschiedenen GM-CSF mit einem Serinrest beginnt, und die vorhergehenden 23 Aminosäuren eine Leader-Sequenz bilden, welche beim proteolytischen Abbau entfernt wird. In einer Ausführungsform würde so Human-GM-CSF aus ungefähr 121 Aminosäuren bestehen, mit einem berechneten Molekulargewicht von annähernd 13500 Dalton (unglycosyliert). Es scheinen zwei potentielle N-Glycosylierungsstellen (Asn-X-Ser/Thr) (Neuberger, A. et al., Glycoproteins 5, 450-490, Elsevier Publishing Co., U.S.A. [1972]) in den Positionen 44-46 und 54- 56 zu existieren, welche für Molekulargewichtsdiskrepanzen in der Literatur verantwortlich sein könnten.
- c-DNA-Klone dieser Erfindung können, wenn sie in COS-7- Affenzellen oder andere geeignete Expressionssysteme transfiziert worden sind, die Synthese von biologisch aktivem Human-GM-CSF steuern. Die Zugabe dieses exprimiert klonierten Genprodukts zu Kulturen hämatopoetischer Vorläuferzellen ermöglicht es, dafür empfängliche Zellen zu vermehren und/oder in Kultur zu halten. Die exprimierten Polypeptide können die mit einem Human-GM-CSF verbundenen verschiedenartigen Wirkungen ausüben.
- Zur Herstellung der cDNAs der vorliegenden Erfindung kann eine Vielzahl von Verfahren benutzt werden. Man extrahiert zum Beispiel die gesamte mRNA (z. B. wie bei Berger, S. et al., Biochemistry 18 : 5143-5149 [1979] beschrieben) aus Zellen (z. B. einer nicht-transformierten menschlichen T-Zellen- Quelle), die Polypeptide mit Human-GM-CSF-Aktivität produzieren. Aus dieser gesamten mRNA können unter Verwendung der primer-initiierten reversen Transkription (Verma, I., Biochim. Biophys. Acta, 473 : 1-38 [1977]), zunächst unter Bildung des Komplements jeder mRNA-Sequenz und dann durch Priming für die Synthese des zweiten Strangs (Land, H. et al., Nucleic Acids Res., 9 : 2251-2266 [1981]) die doppelsträngigen cDNAs aufgebaut werden. Anschließend können die cDNAs kloniert werden, indem man sie mit geeigneten Plasmid- oder Bakteriophagenvektoren (Rougeon, F. et al., Nucleic Acids Res., 2, 2365-2378 [1975] oder Scherer, G. et al., Dev. Biol. 86, 438-447 [1981]) durch komplimentäre homopolymere Schwänze (Efstratiadis, A. et al., Cell, 10, 571-585 [1977]) oder mit geeignete Restriktionsstellen (Seeburg, P. et al., Nature, 270, 486-494 [1977] oder Shine, J. et al., Nature, 270, 494- 499 [1977]) enthaltenden Linker-Segmenten hergestellten kohäsiven Enden verbindet, und dann ein geeigneter Wirt transformiert wird. (Siehe allgemein: Efstratiasis, A., und Villa-Karmaroff, L., "Cloning of double stranded cDNA" in Setlow, J. und Hollaender, A. (Verleger) Genetic Engineering, Band 1.; Plenum Publishing Corp., N.Y., U.S.A. [1982].) Eine bevorzugte Methode, die vollständig klonierten cDNAs dieser Erfindung zu erhalten, ist das von H. Okayama und P. Berg (Mol. and Cell. Biol. 2 : 161-170 [1982]) entwickelte Verfahren. Diese Methode hat den Vorteil, daß die cDNA- Insertionen in einem bakteriellen Klonierungsvektor in eine geeignete Position plaziert werden können, wobei die cDNA in Säugerzellen auch direkt translatiert und prozessiert werden kann. Kurz ausgedrückt: der erste cDNA-Strang wird mit Polydesoxythymidylsäure, welche kovalent mit einem Ende einer linearen Plasmidvektor-DNA verknüpft ist, geprimt. Der Plasmidvektor wird dann mit einem Linker-DNA-Segment, welches ein Ende des Plasmids und das 5'-Ende der cDNA- Kodierungssequenz verbrückt, cyclisiert. Unter Verwendung eines den Promotor aus der frühen Affenvirus 40-(SV40)-Region enthaltenden DNA-Fragments und eines ein Intron aus der modifizierten späten SV40-Region enthaltenden Linkers kann die cDNA ohne weitere Modifikationen in COS-7-Maus-(Nieren)-Zellen in vitro exprimiert werden (allgemein siehe Okayama, H. und Berg, P., Mol. and Cell. Biol., 3 : 280-289 [1983] und Jolly, D. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 80 : 477-481 [1983].).
- Sobald die cDNA-Genbank in dem Okayama/Berg-Plasmid- Vektor vervollständigt worden ist, werden die cDNA-Klone gesammelt, und zufällig ausgewählte Pools können durch Hybridselektion, Translation und Assay (z. B. durch Messung der Human-GM-CSF-Aktivität auf Zellkulturen, das Vorhandensein von Antigen-Determinanten oder andere biologische Wirkungen) auf Anwesenheit der gewünschten cDNAs untersucht werden. Gemäß diesen Kriterien positive Pools können dann mit einer geeigneten subtraktiven Sonde, z. B. cDNA aus einer B-Zell- Linie und/oder einer uninduzierten T-Zell-Linie überprüft werden. Danach werden die positiven, sondierten Pools in individuelle Klone unterteilt, welche durch Transfektion in einem geeigneten Wirt (wie einer Säuger-Zellkultur) getestet werden, und der Überstand des Host wird auf die gewünschte Aktivität geprüft. Die positiven Klone werden dann sequenziert.
- Die gewünschten c-DNA-Klone können auch durch Hybridisierungs-Screening mit geeigneten mRNA-Proben nachgewiesen und isoliert werden (Heindell, H. et al., Cell, 15 : 43-54 [1978]). Ein andere Möglichkeit ist es, die cDNA- Genbanken mittels Hybridselektion (Harpold, M. et al., Nucleic Acid Res., 5 : 2039-2053 [1978] oder Parnes, J. et al., Proc. Nat. acad. Sci. U.S.A., 78: 2253-2257 [1981]) oder in Xenopus-Oocyten (Aurdon, J., Nature, 233 : 177-182 [1971]) zu screenen. (allgemein siehe Villa-Kamaroff, L. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 75 : 3727-3731 [1978].) In der folgenden Beschreibung der die Herstellung von cDNA-Klonen dieser Erfindung betreffenden Verfahrensweisen wird zuerst auf die Zellquelle und andere Linien eingegangen, dann folgen allgemeine Beschreibungen der Verfahrensweisen zur Isolierung der für die Proteine mit GM-CSF-Wirkung kodierenden mRNA; des Aufbaus einer die cDNA-Sequenzen enthaltenden cDNA- Genbank; der Isolierung von vollständigen cDNA-Klonen aus einem Plasmidvektor und der anschließenden Expression in Säugerzellen; der Subklonierung und Expression in Bakterien und Hefe und der Reinigung und der Formulierung. Danach folgt eine detailliertere Beschreibung des ganzen experimentellen Verfahrens.
- Jede beliebige Zelle aus einer großen Vielfalt verschiedener Zellen kann als Quelle für die humane GM-CSF- Aktivität und deren Assays benutzt werden (siehe z. B. Burgess, A., Growth Factors and Stem Cells, Academic Press, Seiten 43-124, New York [1984]). Eine bevorzugte Quelle ist eine T-Helferzell-Linie, aber auch menschliche periphere Blutzellen (Verma, D. et al., Brit.J. of Haetm 57 : 505-520 (1984) und Hasketh, P. et al, Blood 63 : 1141-1146 [1984]), Makrophagen und andere GM-CSF-Aktivität produzierende Zellen (Bodecker B. et. al., Immunobiol. 166 : 12-23 [1984]) sind geeignet, inklusive der Hybridomas und transformierter Zell-Linien (Gasson, J. et al., "Lymphokines and Hematopoiesis" Normal and Neoplastic Hematopoiesis, Alan R. Liss, Inc., New York [1983)).
- Eine bevorzugte Quelle für die Anwendung in Verbindung mit Human-GM-CSF-Aktivitäts-Assays ist menschliches Knochenmark, das nicht unter Blutkrankheiten leidenden Spendern entnommen wurde. Jedoch auch menschliches Nabelschnurblut und menschliche Milz sind geeignete Quellen, sofern sie ungefähr 12-48 Stunden nach der Entnahme verwendet werden.
- Um die CSF-Aktivität zu bestimmen, wird die hämatopoetische Zellquelle zu einer Einzelzellsuspension verarbeitet. Die einzelnen Zellen werden dann in einem halbfesten (Agar) oder viskosen (Methylcellulose), Nährstoffe und gewöhnlich fötales Kalbserum enthaltenden Medium immobilisiert. Die einzelnen Zellen proliferieren und differenzieren sich in Gegenwart eines geeigneten Faktors. Da die Ausgangszellen immobilisiert sind, entwickeln sich, indem die Zellen proliferieren und reifen, Kolonien. Diese Kolonien können nach 7-14 Tagen ausgezählt werden (Burgess, A., Growth Factors and Stem Cells, Seiten 52-55, Academic Press, New York [1984].) (Zur spezifischen Anwendbarkeit auf das Wachstum von Granulocyten und Makrophagen siehe Bradely, T. und Metcalf, D., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 44 : 287-300 [1966], und allgemein siehe Metcalf, D., Hemopoietic Colonies, Springer- Verlag Berlin [1977]). Falls es erwünscht ist, können individuelle Kolonien entnommen, auf einen Objektträger aufgebracht, fixiert und nach der Methode Wright/Geimsa gefärbt werden (Todd-Sanford, Clinical Diagnosis by Laboratory Methods, 15. Auflage, Herausgeber: Davidson und Henry [1974]). Man kann dann eine morphologische Analyse aller pro einzelne Kolonie vorhandenen Zelltypen durchführen.
- Isolierung von mRNA und Aufbau einer cDNA-Genbank Die gesamte zelluläre mRNA kann mittels einer Reihe weithin bekannter Methoden isoliert werden (z. B. Przybla, A. et al., J. Biol. Chem. 254 : 2154-2158 [1979]), das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al. (Biochemistry, 18 : 5294-5299 [1979]) ist aber die bevorzugte Methode. Bei Anwendung dieser Methode werden aus 1-2·10&sup8; aktivierten menschlichen Helfer-T-Zellen annähernd 10 ug PolyA&spplus;-mRNA, getrennt auf Oligo(dT)-Cellulosesäulen erhalten.
- Aus der PolyA&spplus;-mRNA kann die cDNA-Genbank am besten aufgebaut werden unter Verwendung des pcDV1-Vektor-Primers und dem pL1-Linkerfragments (erhältlich von P-L Biochemical Inc., Milwaukee, WI) nach Verfahren aufgebaut werden, die zu außerordentlich angereicherten vollständigen Kopien der mRNA- Transkripte führen (z. B. Okayama, H. und Berg, P., Mol. Cell Biol., 2, 161-170 [1982] und Mol. Cell Biol., 3, 280-289 [1983]). Der den frühen Promotor aus SV40 und die SV40-RNA- Synthesesignale enthaltende Plasmidvektor ist dazu bestimmt, die Expression klonierter cDNA-Segmente in Säugetierzellen zu fördern.
- Das cyclisierte Vektor-cDNA-Präparat wird mit Hilfe des Verfahrens von Okayama und Berg unter Verwendung von Calciumchlorid (Cohen, S. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 69 : 2110-2114 [1972]) in eine geeignete bakterielle Zelle, wie E. coli-MC1061-Zellen (Casadaban, M. und Cohen, S., J. Mol. Biol., 138 : 179-207 [1980]) transformiert. Ausgehend von 5 ug PolyA&spplus;-RNA aus ConA-stimulierten T-Zellen können ungefähr 1,5·10&sup6; unabhängige Transformanten erhalten werden. Normalerweise werden ungefähr 10&sup4; Klone einzeln auf genommen und in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (Flow Laboratories Inc., McLean, Virginia), die 200 ul Luria(L)-Brühe mit 50 ug/ml Ampicillin und 7% DMSO enthalten, geimpft. Gewünschtenfalls werden wie bei Okayama, H. und Berg, P. (Mol. Cell Biol., 3, 280-299 [1983]) beschrieben, auf der Position des cDNA-Inserts basierende Sub- Genbanken hergestellt. Kurz zusammengefaßt: Plasmid-DNA wird mit SalI, ClaI und HindIII getrennt verdaut und in 1%igem Agarosegel elektrophoresiert. Nach Färbung mit Ethidiumbromid wird das Gel in 7 Abschnitte zerschnitten, die den cDNA- Insertionsgrößen 0 bis 1, 1 bis 2, 2 bis 3, 3 bis 4, 4 bis 5, 5 bis 6 und mehr als 6 Kilobasen (kb) entsprechen. Man extrahiert aus jedem Stück die DNA, recyclisiert sie mit T4-DNA-Ligase und verwendet sie zur Transformation von MC1061. Sämtliche Nukleotid-Sequenzierungen können nach dem Verfahren von Maxam, A. und Gilbert, W. (Methods Enzymol., 65 : 499-560 [1980]) durchgeführt werden.
- Ungefähr 1·10&sup6; COS-7-Affennierenzellen werden einen Tag vor der Transfektion auf 60 mm-Platten plattiert. Am besten werden die Transfektionen mit 15 ug Plasmid-DNA in 1,5 ml DME durchgeführt, welches 50 mM Tris·HCl, pH 7,4 und 400 ug/ml DEAE-Dextran (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) enthält. Nach 4 Stunden entfernt man dann diese Lösung und ersetzt sie durch 2,0 ml DME mit 4% fötalem Kälberserum. Nach 72 Stunden sammelt man das Medium und prüft es, wie oben beschrieben, auf humane GM-CSF-IL-2-Aktivität. Die DNA-Transfektionen können in L-Zellen und ebenso einer Reihe anderer Zellquellen durchgeführt werden (siehe unten).
- cDNA-Klone der vorliegenden Erfindung können zur Identifizierung und Isolierung von verwandte Gene kodierenden Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Wegen des häufig niedrigen Homologiegrads zwischen homologen Genen muß die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen angepaßt werden, um eine Kreuz-Hybridisierung zwischen Sequenzen zu ermöglichen, die nur zu 70 bis 80% homolog sind.
- Eine Reihe verschiedener Versuchsprotokolle kann verwendet werden, um verwandte Gene ausfindig zu machen. Beispielsweise ist das Gen der leichten Kette des Human-Ck- Immunglobulins unter Verwendung des entsprechenden Maus-Ck- Gens als Sonde (Heiter, P., et al., Cell 22 : 197-207 [1981]) isoliert worden, und Maus-Transplantations-Antigen-Gene sind durch Hybridisierung mit ihren, die Humangegenstücke kodierenden DNA-Klonen (Steinnetz, T. et al., Cell 24 : 125-134 [1981]) isoliert worden.
- Eine bevorzugte Methode für die genomische DNA beinhaltet das Plattieren von Phagen-Klonen von einer die homologen Gene (Maniatis, T. et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, U.S.A. [1982]) enthaltenden DNA-Genbank in einer Dichte von 2·10&sup4; bis 5· 10&sup4; Plaques pro 150 mm-Platte auf einem geeigneten Wirtsstamm, wie E.coli LE392. Zehn bis zwanzig Platten reichen im allgemeinen.
- Nach 10-12-stündiger Inkubation bei 37ºC kühlt man die Platten für zwei Stunden und legt dann ein 132 mm- Nitrocellulose-Filter auf die Agaroberfläche jeder Platte auf. Man läßt das Filter mindestens fünf Minuten lang in Kontakt mit der Platte. Währenddessen kennzeichnet man die Filter durch Punkte mit einer tintegefüllten 22-Gauge-Nadel. Die Filter werden dann von den Platten gelöst und nacheinander zuerst in 250 ml 0,1 N NaOH mit 0,5 M NaCl; dann in 250 ml 0,5 M Tris·HCl, pH 7,5 mit 1,5 M NaCl mindestens zwei Minuten lang inkubiert. Man trocknet die Filter an einem Papierhandtuch ab und härtet sie dann 4-8 Stunden lang bei 80ºC.
- Für die Hybridisierung werden die Filter in 1· SET (0,15 M NaCl, 30 mM Tris·HCl, pH 8,0, 1 mM Na&sub2;EDTA) angefeuchtet, dann in einer Lösung aus 3· SET, 5· Denhardt (Denhardt, D.T., B.B.R.C. 23: 641-646 [1966]), 10% Dextransulfat, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und jeweils 50 ug/ml poly-(rA), poly-(rC) und poly-(rG) bei 65ºC 2 Stunden lang (1,5-2 ml/Filter) unter konstanter Bewegung inkubiert. Man verwirft dann diese Lösung, und hybridisiert die Filter mit 0,5 ug (≥ 108 cpm) einer nick-translatierten, aus GM-CSF-cDNA hergestellten Sonde in der gleichen Lösung (frisch) 1,5-2 ml/Filter, eine Stunde lang bei 65ºC und dann 12-20 Stunden lang bei 55ºC. Die Filter werden dann nacheinander in 3· SET, 1· Denhardt; 0,1% SDS; und 1· SET, 0,1% SDS (10-15 ml/Filter) bei 55ºC eine Stunde lang unter leichter Bewegung gewaschen. Man trocknet die Filter an einem Papierhandtuch ab und autoradiographiert sie dann 12-24 Stunden lang mit einem geeigneten Film und einem Verstärkungsschirm. Man sammelt hybridisierende Plaques mit sterilen Pasteur-Pipetten von den Agarplatten und expelliert jede in 1 ml 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris·HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 100 ug/ml Gelatine 50 ul CHCl&sub3;- Zusatz. Nach wenigstens 4-8 Stunden in der Kälte werden die Phagen aus jeder Plaque in geringer Dichte (2000-4000 Plaques/150 mm-Platte) mit dem gleichen, wie dem oben beschriebenen Verfahren nochmals gescreent.
- Sofern man keine Glycosylierung will, sind Prokaryoten, wie E. coli, für die Expression der Polypetide der vorliegenden Erfindung sehr geeignet (siehe zum Beispiel US- Patent-Nummern 4 338 397 und 4 411 994).
- Um hohe Expressionsraten zu erhalten, sollte man Promotoren, wie die β-Lactamase(Penicillase)- und Lactose- Promotorsysteme (Chang et al., Nature, 275: 615 [1978]; Itakura et al., Science 198; 1056 [1977]; Goeddel et al., Nature 281: 544 [1979]) oder ein Tryptophan(Trp)- Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8 : 4057 [1980]) zusammen mit Shine-Delgarno-Sequenzen verwenden.
- Es ist dem Fachmann bekannt, daß nicht nur Prokaryoten sondern auch eukaryotische Mikroben, wie Hefe, in der Proteinherstellung verwendet werden könnten. Ein bevorzugter eukaryotischer Mikroorganismus ist Saccharom ces cerevisae.
- Zu den geeigneten Promotorsequenzen in Hefevektoren zählen die Promotoren für die 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255 : 12073-12080 [1980]) oder andere glycolytischen Enzyme (Hess et al., Adv. Enzyme Reg., 7: 149-167 [1969]; Holland et al., Biochemistry, 17 : 49.00-4907 [1978]). Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der durch die Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription haben, können auch verwendet werden. Grundsätzlich ist jeder Plasmidvektor geeignet, der einen hefekompatiblen Promotor, einen Ursprungspunkt der Replikation und Abschlußsequenzen enthält.
- Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Human-GM- CSF unter Anwendung der cDNAs der vorliegenden Erfindung macht sich die Sekretionswege des Zygotenbildungs-Pheromon-α-Faktors der Hefe zunutze. (Julius, D. et al., Cell 32: 839-852 [1983]). S. cerevisiaesekretiert Zygotenbildungstyp spezifische Oligopeptidpheromone. MATα-Zellen sekretieren den α-Faktor, der die Wachstumshemmung von MATα-Zellen in der GI- Phase des Zellzyklus induziert (Thorner, J., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Habor Laboratory, New York [1981]; siehe insbesondere Seiten 143- 180). Der α-Faktor wird zuerst synthetisiert als ein größeres Vorläufermolekül, bestehend aus einer NH&sub2;-terminalen Signalsequenz aus ungefähr 20 Aminosäuren, gefolgt von einer zusätzlichen Leader-Sequenz aus 60 Aminosäuren und endet mit vier identischen Tandemwiederholungen der reifen α-Faktor- Sequenz. Die Wiederholungen sind durch Spacer aus sechs oder acht Aminosäuren (Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala und Lys-Arg- Glu-Ala-Glu- [oder Asp-]-Ala-Glu-Ala) voneinander getrennt. Dieser Präpro-α-Faktor wird an verschiedenen spezifischen Stellen gespalten. Der erste Prozeß ist die durch das KEX2-Produkt katalysierte Abspaltung der COOH-terminalen Seite des Lys-Arg-Paars der Spacer-Sequenz (Julius et al., Cell 37: 1075-1089 [1984]). Ein der Carboxypeptidase-B ähnliches Enzym spaltet an der NH&sub2;-terminalen Seite des Lys-Arg-Paars. Der letzte Schritt ist die Entfernung der Glu-Ala- oder Asp-Ala-Paare durch Diaminopeptidase, die durch STE13 kodiert wird. Brake, J. et al. (Proc. Nat. acad. Sci. U.S.A. 81: 4642-4646 [1984]) haben gezeigt, daß die Fusion der für reife Humanproteine kodierenden Sequenz zur ersten Prozessierungsstelle die Sekretion solcher Proteine ermöglicht.
- Ein allgemeiner, als pMF-alpha-8 bezeichneter Hefe- Expressionsvektor, der den alpha-Faktor-Promotor und die stromabwärts befindliche Leader-Sequenz in Verbindung mit anderen Elementen enthält, ist bei der ATCC hinterlegt worden (Zugangsnummer 40140). Er kann wie folgt konstruiert werden:
- Ein das MFα1-Gen (Kurjan, J. und Hershowitz, I., Cell. 30 : 933-943 [1982]) tragendes 1,7 kB-EcoRI-Fragment wird in die EcoRI-Schnittstelle des M13mp8 kloniert (Viera, J. und Messing, J., Gene 19 : 259-268 [1982]). Um eine HindIII-Stelle nach dem Lysin-Kodon der ersten Spacer-Region einzuführen hybridisiert man das synthetische Oligonukleotid TCTTTTATCCAAAGATACCC an einsträngige M13-MFα1-DNA und verlängert den Oligonukleotid-Primer durch das DNA-Polymerase- I-Klenow-Fragment. Nach SI-Nuklease-Behandlung wird die DNA mit EcoRI abgespalten und das den MFα1-Promotor und die Leader-Sequenz tragende Fragment wird zwischen die EcoRI- und die aufgefüllten HindIII-Schnittstellen von pUC8 kloniert (Viera, J. und Messing J., obenerwähnt). Man isoliert ein Plasmid mit der gewünschten Struktur (als pMFα4Δ1 bezeichnet). Das pMFα4Δ1 wird mit HindIII gespalten und in Gegenwart von dATP und dGTP partiell mit DNA-Polymerase-I-Klenow-Fragment aufgefüllt. Man behandelt die DNA mit Mungobohnen-Nuklease und verknüpft sie mit dem Oligonukleotid-Linker GCCTCGAGGC. Das resultierende Plasmid (als pMFα6 bezeichnet) hat dann eine StuI-Spaltstelle unmittelbar nach dem Arginin-Kodon, gefolgt von einer XhoI-Schnittstelle. Ein S. cerevisiae-E. coli- Shuttle-Vektor (pTRP584) kann wie folgt konstruiert werden: Man kloniert das PstI-XbaI-Fragment, welches den 2 um Plasmid- Replikationsursprung (Broach, J., obenerwähnt) trägt, zwischen die ClaI-Schnittstelle von pTRP56 (Miyajima et al., Mol. Cell.
- Biol. 4 : 407-414 [1984]) und die Stui-Schnittstelle im Bereich des durch PvuII-Linker-Insertion in eine PvuII-Schnittstelle umgewandelten TRP1-ARSI-Fragments. Die KpnI-Schnittstelle im ursprünglichen pTRP56 wird durch XhoI-Linker-Insertion in XhoI umgewandelt. Man erhält dann den allgemeinen Sekretionsvektor pMFα8 durch Insertion des Bg1II-XhoI-Fragments von pMFα5 in die BamH1-XhoI-Schnittstellen von pTRP584.
- Der Fachmann weiß, daß für Human-GM-CSF kodierende cDNA- Klone da nn ohne weiteres in den pMFα-Vektor eingefügt und im Anschluß daran zur Human-GM-CSF-Produktion in Hefe transformiert werden können. Zum Beispiel wird ein 1,0 kB-Bam-H1- Fragment, das die ganze Human-GM-CSF cDNA trägt, in die Bam-H1-Schnittstelle von M13mp8 (Viera, J. und Messing, J., Gene 19 : 259-268 [1982]) kloniert. Um ein doppelsträngiges Fragment, welches die das reife Peptid kodierende Sequenz trägt, herzustellen, wird ein Oligonukleotid-Primer AGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCAT konstruiert. Dieser Primer wird dann an ein die Human-GM-CSF-cDNA tragendes, einsträngiges M13mp8 hybridisiert und durch das DNA-Polymerase-I-Klenow- Fragment verlängert. Die doppelsträngige DNA wird mit BamH1 gespalten, und dann der einsträngige Bereich mit Mungobohnen- Nukleolase entfernt. Man isoliert dann das doppelsträngige Fragment, das die für das reife Human-GM-CSF-Protein kodierende Sequenz trägt und kloniert sie in die StuI-Schnittstelle des allgemeinen Sekretionsvektors pMF8. Man kann diese Plasmid-DNA (welche das TRPI-Gen trägt) mit dem Lithiumacetat-Verfahren (Ito, H. et al., J. Bacteriol. 153 : 163-168 [1983]) in Hefezellen einschleusen, und die Transformanten in einem synthetischen Tryptophan-Mangel-Medium selektieren. Man kultiviert dann die Transformanten in einem üblichen, mit 0,5% Casein-Aminosäuren ergänzten Medium. Um die Hefezellen zu ernten, resuspendiert man sie zuerst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 1 mM PMSF enthält und zerstört sie dann durch kräftiges Schütteln mit säuregewaschenen Glasperlen. Durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 10000 UpM erhält man einen klaren Überstand.
- Zusätzlich zu den Mikroorganismen können aus mehrzelligen Organismen stammende Zellkulturen (inbesondere Säugerzellen) als Wirte verwendet werde. Beispiele solcher geeigneter Wirtszell-Linien sind HeLa-Zellen, chinesische Hamster- Ovarzell-Linien und Babyhamster-Nierenzell-Linien.
- Notwendigerweise enthalten Expressionsvektoren für solche Zellen gewöhnlich einen Ursprung der Replikation, einen vor dem zu exprimierenden Gen lokalisierter Promotor zusammen mit etwaig erforderlichen ribosomalen Bindungsstellen, RNA-Spleiß- Stellen, Polyadenylierungstellen und transskriptionale Terminatorsequenzen. Bei Anwendung in Säugerzellen besitzt der Expressionsvektor oft aus viralem Material stammende Kontrollfunktionen. Im allgemeinen verwendete Promotoren stammen zum Beispiel auf Polyoma, dem Adenovirus 2 und, am häufigsten, aus SV-40. (Siehe z. B. US-Patent Nr. 4 399 216 und Gheysen, D. und Fiers, W., J. of Mol. and Appl. Genetics 1 : 385-394 [1982].)
- Die in E. coli, in Hefe oder in anderen Zellen exprimierten Human-GM-CSF-Polypeptide können nach bekannten Standardverfahren gereinigt werden, wozu Ammoniumsulfat- Präzipitation, fraktionierte Säulenchromatographie (z. B. Ionenaustausch, Gelfiltration, Elektrophorese, Affinitätschromatographie etc.) und schließlich Kristallisation zählen (allgemein siehe "Enzyme Purification and Related Techniques", Methods in Enzymology, 22 : 233-577 [1977] und Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York [1982]). Die Polypeptide der Erfindung können, sobald sie einmal teilweise oder bis zur Homogenität gereinigt sind, für Forschungszwecke verwendet werden, z. B. als Zusatz zu Zellkulturmedien (z. B. minimales essentielles Eagle-Medium, nach Iscove modifiziertes Dulbecco- Medium oder RPMI 1640; erhältlich bei Sigma Chemical Company, St. Louis, MO und GIBCO Division, Chagrin Falls, OH) und als Antigen, um die Freisetzung spezifischer, in Immunoassays, Immunofluoreszenz-Färbungen etc. verwendbarer Immunglobuline zu bewirken (allgemein siehe Immunological Methods, Bände I & II, Herausgeber Lefkovits, I. und Pernis, B., Academic Press, New York, N.Y. [1979 & 1981]; und Handbook of Experimental Immunology, Herausgeber Weir, D., Blackwell Scientific Publications, St. Louis, MO [1978].)
- Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, z. B. zur Steigerung der natürlichen Abwehr gegen verschiedene neoplastische und infektiöse Krankheitsstadien oder als Zusatz in der Chemotherapie, um die Myelosuppression zu überwinden (siehe Gasson, J. et al., "Lymphokines and Hematopoiesis" in Normal and Neoplastic Hematopoiesis, Seiten 129-139, Alan R. Liss, Inc. New York [1983]).
- Zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, welche die in dieser Erfindung beschriebenen Polypeptide enthalten, vermischt man diese Polypeptide mit vorzugsweise inerten, pharmazeutisch annehmbaren Trägern. Dem Fachmann sind geeignete Träger und Verfahren zu ihrer Herstellung bekannt (siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA [1980]). Die parenterale Verabreichung ist die bevorzugte Applikationsart; sie kann die Verwendung mechanischer Freigabesysteme einschließen.
- Die Einheitsdosis ist die bevorzugte Form der pharmazeutischen Zubereitung. Dafür wird das Präparat in die passende Menge der wirksamen Komponente enthaltende Einheitsdosen unterteilt. Die Menge an wirksamer Verbindung in einer Einheitsdosis des Präparats kann verändert oder von 1 ug bis 100 mg entsprechend der speziellen Anwendung und der Wirkstärke des wirksamen Bestandteils eingestellt werden. Die Zubereitung kann gewünschtenfalls auch andere therapeutische Mittel enthalten.
- Man kann die Dosierungen abhängig vom Bedürfnis des Patienten, der Schwere des zu behandelnden Zustands und der speziell verwendeten Verbindung variieren. Die richtige Dosierung für eine spezielle Situation zu bestimmen, liegt im Rahmen des Fachwissens. Im allgemeinen wird die Behandlung mit geringeren, unterhalb der optimalen Dosis liegenden Dosierungen eingeleitet. Danach steigert man diese Dosis in kleinen Schritten, bis der unter diesen Umständen optimale Effekt erreicht wird. Die tägliche Gesamtdosis kann nach Belieben geteilt und in Portionen davon während des Tages verabreicht werden.
- Die folgenden experimentellen Informationen und Daten dienen als Beispiele und sind in keiner Weise einschränkend.
- 1) Man isolierte gemäß der in den Kapiteln 36 und 37 von Isolation, Characterization, and Utilization of T Lymphocyte Clones, Herausgeber Fathman, C. und Fitch, F., Academic Press, New York [1982] einen als T-7 bezeichneten Klon menschlicher Helfer-T-Zellen.
- Man hielt die Zell-Linie kontinuierlich bei 0,5· 10&sup5; Zellen/ml in nach Dulbecco modifiziertem Eagle- Medium (DME) mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 5·10&supmin;&sup5; M 2-ME, 2 mM Glutamin, nichtessentiellen Aminosäuren und essentiellen Vitaminen, welches mit 30% Überständen von Phytohämagglutinin (PHA) stimulierten menschlichen peripheren Lymphocyten konditioniert war.
- 2) PHA-Aktivierung der T-7-Zellen: Man kultivierte die Zellen bei 5·10&sup5;/ml in DME mit 4% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 5·10&supmin;&sup5; M 2-ME, 2 mM Glutamin, nicht-essentiellen Aminosäuren, essentiellen Vitaminen und 4 ug/ml ConA. Nach 4-6- stündiger Inkubation bei 37ºC unter 10% CO&sub2; wurde die Zellsuspension 10 Minuten lang bei 1500 UpM zentrifugiert. Die Zellpellets wurden gesammelt und sofort bei -70ºC eingefroren. Die Überstände wurden filtriert (Nalgene-0,22 Mikron) und bei -80ºC als Quelle für Wachstumsfaktoren gelagert. Aliquote des Überstandes wurden auf CSF-Aktivität untersucht (siehe unten), um die Induktion der Linie durch die PHA-Behandlung zu verifizieren.
- Von Patienten ohne Blutkrankheiten gesammelte Knochenmarkzellen wurden über Ficoll (Typ 400, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) geschichtet, zentrifugiert (2000 UpM, 20 Min.) und Zellen an der Zwischenschicht entfernt. Diese Zellen wurden zweimal mit 10% fötales Kälberserum (FCS) enthaltendem nach Iscove modifiziertem Dulbecco- Medium gewaschen, nochmals im gleichen Medium suspendiert und anhaftende Zellen durch Adhäsion an Plastik-Petrischalen entfernt. Die nicht-haftenden Zellen wurden bei 10&sup5; Zellen/ml zu Iscove-Medium, welches 20% FCS, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 0,9% Methylcellulose und wechselnde Konzentrationen an bekanntermaßen kolonien-stimulierende Aktivität enthaltenden Überständen oder Test-Überständen enthielt, gegeben. 1 ml-Aliquote wurden in 35 mm- Petrischalen plattiert und bei 37ºC unter mit Feuchtigkeit gesättigter Atmosphäre aus Luft mit 6% CO&sub2; kultiviert. Zu jeder Platte wurde drei Tage nach Beginn der Kultur eine Einheit Erythropoietin (Eaves, A. British Columbia Cancer Research Center, Vancover, B.C.) gegeben. Nach 10-14 Tagen zählte man unter einem Invertmikroskop die Granulocytenmakrophagen-Kolonien und die erythroiden Bursts.
- In Heparin gesammelte Nabelblut-Zellen wurden 6 Min. lang mit 2000 UpM zentrifugiert. Die weißen Blutzellen an der Grenzfläche zwischen dem Plasma und dem Gipfel der roten Blutzellen wurden in ein 0,17 N Ammoniumchlorid und 6% FCS enthaltendes Röhrchen transferiert. Nach 5 Min. auf Eis unterschichtete man die Suspension mit 4 ml FCS und zentrifugierte sie 6 Min. bei 2000 UpM. Die Zellpellets wurden mit Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, und es wurden mit ihnen die oben für die Knochenmarkzellen beschriebenen Ficoll- und Plastik- Adhäsionsschritte durchlaufen. Die weniger dichten, nicht-haftenden Zellen wurden gesammelt und mit 10&sup5; Zellen/Kultur, wie oben beschrieben, in das halbfeste Agarsystem gegeben.
- Am Ende der Prüfungen wurde nach Aufbringen der einzelnen Kolonien auf Glasobjektträger und Anfärbung mit Wright-Giemsa-Färbung die zelluläre Zusammensetzung bestimmt. Die Eosinophilen wurden durch Anfärbung mit Luxol-Schnellblau bestimmt (Johnson, G. und Metcalf, D., Exp. Hematol. 8 : 549- 561 [1980]).
- Gefrorene Zellpellets aus nicht-induzierten oder ConA-induzierten menschlichen Helferzellen (4 Stunden nach Stimulation) wurden in Guanidin- Isothiocyanat-Lyse-Lösung suspendiert. Für 1,5·10&sup8; Zellen wurden zwanzig ml Lyse-Lösung benötigt. Die Pellets wurden durch Pipettieren resuspendiert, dann wurde die DNA mittels viermaliger Passage durch eine Spritze mit 16 Gauge-Nadel abgeschert. Man schichtete die Lysate in 40 ml-Polyallomer Zentrifugenröhrchen auf 20 ml 5,7 M CsCl, 10 mM EDTA. Diese Lösung wurde 40 Stunden lang bei 15ºC mit 25000 UpM in einem Beckman SW28 Rotor (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) zentrifugiert. Die die DNA enthaltende Guanidinisothiocyanat-Phase wurde von oben bis zur Grenzfläche hinunter abpipettiert. Die Wände des Röhrchens und die Grenzfläche wurden mit 2-3 ml Guanidin- Isothiocyanat-Lyse-Lösung gewaschen. Man zerschnitt das Röhrchen unterhalb der Grenzfläche mit einer Schere und dekantierte die CsCl-Lösung ab. Die RNA- Pellets wurden zweimal mit kaltem 70%igem Ethanol gewaschen. Die Pellets wurden dann in 500 ul 10 mM Tris·HCl pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,05% SDS resuspendiert. Man setzte 50 ul 3 M Natriumacetat zu und fällte die RNA mit 1 ml Ethanol. Es wurden ungefähr 0,3 mg Gesamt-RNA durch Zentrifugieren gesammelt, und die Pellets wurden einmal mit kaltem Ethanol gewaschen.
- Das gewaschene und getrocknete Gesamt-RNA-Pellet wurde in 900 ul Oligo(dT)-Elutionspuffer (10 mM Tris·HCl pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) resuspendiert. Man erhitzte die RNA 3 Min. lang auf 68ºC und kühlte dann auf Eis. Es wurden 100 ul 5 M NaCl zugegeben. Man belud eine mit Bindungspuffer (10 mM Tris·HCl pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 0,5% SDS) äquilibrierte 1,0 ml-Oligo(dT)-Cellulosesäule (Typ 3, Collaborative Research, Waltham, MA) der RNA-Probe. Das Eluat von der Säule wurde zwei weitere Male durch die Säule passiert. Die Säule wurde dann mit 20 ml Bindungspuffer gewaschen. Man sammelte die PolyA&spplus;-RNA durch Waschen mit Elutionspuffer. Die RNA wurde gewöhnlich mit den ersten 2 ml Elutionspuffer eluiert. Man fällte die RNA mit 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 6) und zwei Volumina Ethanol aus. Das RNA-Pellet wurde durch Zentrifugation gesammelt, zweimal mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet. Man resuspendierte das Pellet dann in Wasser. Man verdünnte Aliquote und bestimmte die Absorption bei 260 nm.
- Man benutzte das Verfahren von Okayama & Berg (Mol. & Cell. Biol. 2: 161-170 [1982]) mit nur geringfügigen Änderungen und angepaßt an die von Okayama & Berg (Mol. & Cell. Biol. 3: 380-389 [1983]) beschriebenen pcDV1- und pL1-Plasmide.
- In 450 ul einer 6 mM Tris·HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM NaCl, 6 mM 2-ME und 0,1 mg Rinderserumalbumin (BSA) pro ml enthaltenden Reaktionsmischung wird eine 80 ug-Probe von pcDV1- DNA bei 30ºC mit 20 Einheiten KpnI-Endonuklease verdaut. Nach 16 Stunden wurde die Verdauung mit 40 ul 0,25 M EDTA (pH 8,0) und 20 ul 10%igem Natriumdodecylsulfat (SDS) beendet; die DNA wurde nach Extraktion mit wassergesättigtem Phenol-CHCl&sub3; 1 : 1 (im folgenden als Phenol-CHCl&sub3; bezeichnet) und Ethanol-Präzipitation wiedergewonnen. Homopolymere Schwänze, die durchschnittlich 60, aber nicht mehr als 80 Desoxythymidat-Reste je Ende enthielten, wurden an die mittels KpnI generierten Termini mit Kalbsthymus-Terminaltransferase wie folgt addiert:
- Die Reaktionsmischung (38 ul) enthielt Natriumkakodylat - 30 mM Tris·HCl pH 6,8 als Puffer, mit 1 mM CoCl&sub2;, 0,1 mM Dithiothreitol, 0,25 mM dTTP, der mit KpnI-Endonuklease verdauten DNA und 68 Einheiten terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase (P-L Biochemicals, Inc., Milwaukee, WI). Nach 30 Min. bei 37ºC wurde die Reaktion mit 20 ul 0,25 M EDTA (pH 8,0) und 10 ul 10%igem SDS gestoppt, und die DNA wurde nach mehrfacher Extraktion mit Phenol- CHCl&sub3; durch Ethanol-Präzipitation wiedergewonnen.
- Die DNA wurde dann mit 15 Einheiten EcoRI-Endonuklease in 50 ul enthaltend 10 mM Tris·HCl pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol und 0,1 mg BSA pro ml bei 37ºC 5 Stunden lang verdaut. Das große Fragment, welches die SV40-Polyadenylierungsstelle und den Ursprungspunkt der pBR322-Replikation und das Ampicillin-Resistenzgen enthielt, wurde durch Agarosegel(1%)-Elektrophorese gereinigt und aus dem Gel durch eine modifizierte Form der Glaspulver- Methode gewonnen (Vogelstein, B. & Gillespie, D., Proc. Nat. Acad. Sci. 76 : 615-619 [1979]). Die DT- schwänzige DNA wurde durch Adsorption an und Elution von einer Qligo(dA)-Cellulosesäule wie folgt weiter gereinigt. Man löste die DNA in 1 ml 1 mM EDTA und l M NaCl enthaltendem 10 mM Tris·HCl-Puffer pH 7,3, kühlte auf 0ºC ab und gab es auf eine mit dem selben Puffer äquilibrierte Oligo(dA)-Cellulosesäule bei 0ºC (0,6·2,5 cm). Man wusch die Säule bei 0ºC mit dem selben Puffer und eluierte mit Wasser bei Raumtemperatur. Die eluierte DNA wurde mit Ethanol ausgefällt und in 10 mM Tris·HCl pH 7,3 mit 1 mM EDTA gelöst.
- Die oligo(dG)schwänzige Linker-DNA wurde hergestellt durch Verdauung von 75 ug pL1-DNA mit 20 Einheiten PstI-Endonuklease in 450 ul, enthaltend 6 mM Tris·HCl pH 7,4, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM 2-ME, 50 mM NaCl und 0,01 mg BSA pro ml. Nach 16 Stunden bei 30ºC wurde die Reaktionsmischung mit Phenol-CHCl&sub3; extrahiert und die DNA mit Alkohol ausgefällt. An den Enden wurden mit 46 Einheiten terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase in der gleichen Reaktionsmischung wie oben (abgesehen davon, daß dTTP durch 0,1 mM dGTP ersetzt ist) jeweils Schwänze aus 10 bis 15 Desoxyguanylat(dG)-Resten addiert. Nach 20 Min. bei 37ºC wurde die Mischung mit Phenol-CHCl&sub3; extrahiert, und nachdem die DNA mit Ethanol ausgefällt worden war, wurde sie mit 35 Einheiten Hindlli-Endonuklease in 50 ul, enthaltend 20 mM Tris·HCl pH 7,4, 7 mM MgCl&sub2;, 60 mM NaCl und 0,1 mg BSA, bei 37ºC 4 Stunden lang verdaut. Die kleine oligo(dG)schwänzige Linker-DNA wurde durch Agarosegel(1,8%)-Elektrophorese gereinigt und, wie oben beschrieben, wiedergewonnen.
- Schritt 1: cDNA-Synthese. Die Reaktionsmischung (10 ul) enthielt 50 mM Tris·HCl pH 8,3, 8 mM MgCl&sub2;, 30 mM KCl, 0,3 mM Dithiothreitol, jeweils 2 mM dATP, dTTP, dGTP und dCTP, 20 uCi³²P-dCTP (3000 Ci/mmol), 3 ug PolyA&spplus;-RNA aus Con-A-induzierten T-Zellen, 60 Einheiten RNasin (Biotec, Inc., Madison, WI) und 2 ug der Vektorprimer-DNA (15 pmol des Primer-Endes) und 45 Einheiten der reversen Transkriptase. Die Reaktion wurde 60 Min. bei 42ºC inkubiert und dann durch Zusatz von 1 ul 0,25 M EDTA (pH 8,0) und 0,5 ul 10%igem SDS gestoppt; man gab 40 ml Phenol-CHCl&sub3; zu, mischte die Lösung kräftig in einem Vortex- Mischer und zentrifugierte. Nach Zugabe von 40 ul 4 M Ammoniumacetat und 160 ul Ethanol zu der wäßrigen Phase kühlte man die Lösung 15 Min. mit Trockeneis, erwärmte unter leichtem Schütteln auf Raumtemperatur, um unumgesetztes Desoxynukleosidtriphosphat, welches während des Abkühlens ausgefallen war, zu lösen und zentrifugierte 10 Min. in einer Eppendorf-Microfuge.
- Man löste das Pellet in 10 ul 10 mM Tris·HCl pH 7,3 und 1 mM EDTA, mischte mit 10 ul 4 M Ammoniumacetat und fällte nochmals mit 40 ul Ethanol aus (ein Verfahren, das mehr als 99% des unumgesetzten Desoxynukleotidtriphosphats beseitigt). Man spülte das Pellet mit Ethanol.
- Schritt 2: Oligodesoxycytidylat[oligo(dc)]- Addition. Das die Plasmid-cDNA:mRNA enthaltende Pellet wurde in 20 ul 140 mM Natriumkakodylat-30 mM Tris·HCl-(pH 6,8)-Puffer, der 1 mM CoCl&sub2;, 0,1 mM Dithiothreitol, 0,2 ug poly(A), 70 uM dCTP, 5 uCi ³²P-dCTP, 3000 Ci/mMol und 60 Einheiten terminale Desoxynukleotidyltransferase enthielt, gelöst. Um die Addition von 10 bis 15 dCMP-Resten pro Ende zu ermöglichen, führte man die Reaktion bei 37ºC innerhalb von 5 Min. durch, und beendete dann mit 2 ul 0,25 M EDTA (pH 8,0) und 1 ul 10%igem SDS. Nach Extraktion mit 20 ul Phenol-CHCl&sub3; wurde die wäßrige Phase mit 20 ul 4 M Ammoniumacetat gemischt, die DNA ausgefällt und mit 80 ul Ethanol umgefällt und das schließlich erhaltene Pellet mit Ethanol gespült.
- Schritt 3: HindIII-Endonuklease-Verdauung. Man löste das Pellet in 30 ul 20 mM Tris·HCl pH 7,4, 7 mM MgCl&sub2;, 60 mM NaCl und 0,1 mg BSA pro ml enthaltendem Puffer und verdaute dann bei 37ºC 2 Stunden lang mit 10 Einheiten HindIII-Endonuklease. Die Reaktion wurde mit 3 ul 0,25 M EDTA (pH 8,0) und 1,5 ul 10%igem SDS beendet, und, nach Extraktion mit Phenol-CHCl&sub3; und anschließender Zugabe von 30 ul 4 M Ammoniumacetat, wurde die DNA mit 120 ul Ethanol ausgefällt. Man spülte das Pellet mit Ethanol und löste es dann in 10 ul 10 mM Tris·HCl (pH 7,3) und 1 mM EDTA auf und gab 3 ul Ethanol zu, um das Gefrieren während der Lagerung bei -20ºC zu verhindern.
- Schritt 4: Cyclisierung mittels oligo(dG)schwänziger Linker-DNA. Eine 9 ul-Probe des mit HindIII -Endonuklease verdauten oligo(dC)schwänzigen cDNA:mRNA-Plasmids (ungefähr 90% der Probe) wurden in einer Mischung (90 ul) aus 10 mM Tris·HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl und 1,8 pmol oligo(dG)schwänziger Linker-DNA 5 Min. bei 65ºC inkubiert, 60 Min. bei 42ºC gehalten und dann auf 0ºC abgekühlt. Die Mischung (90 ul) wurde auf ein Volumen von 900 ul eingestellt und enthielt 20 mM Tris·HCl pH 7,5 4 mM MgCl&sub2;, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,1 mM KCl, 50 ug BSA por ml und 0,1 mM β-NAD; man gab 6 ug E. coli-DNA-Ligase zu und inkubierte die Lösung über Nacht bei 12ºC.
- Schritt 5: Ersatz des RNA-Strangs durch DNA. Um den RNA-Strang der Insertion zu ersetzen, wurde die Ligierungsmischung so eingestellt, daß sie jeweils 40 uM von jedem der vier Desoxynukleosidtriphosphate, 0,15 mM b-NAD, 4 ug zusätzlicher E. coli-DNA-Ligase, 16 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase I (PolI) und 9 Einheiten E. coli-RNase H enthielt. Man inkubierte diese Mischung (960 ul) nacheinander jeweils 1 Stunde bei 12ºC und bei Raumtemperatur, um die optimale Reparatursynthese und die Nick-Translation durch PolI zu fördern.
- Schritt 6: Transformation von E. coli. Die Transformation wurde mit kleinen Abänderungen nach dem von Cohen et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 69 : 2110-2114 [1972] beschriebenen Verfahren durchgeführt. Der E. coli-K-12-Stamm MC1061 (Casadaban, M. und Cohen, S., J. Mol. Biol. 138 : 179-207 [1980]) wurde bei 37ºC in 20 ml L-Brühe gezogen, bis 0,5 Absorptionseinheiten bei 600 nm erreicht waren. Man sammelte die Zellen durch Zentrifugieren, suspendierte sie in 10 ml 50 mM CaCl&sub2; enthaltendem 10 mM Tris·HCl pH 7,3 und zentrifugierte 5 Min. bei 0ºC. Die Zellen wurden in 2 ml des obigen Puffers resuspendiert und wieder bei 0ºC 15 Min. lang inkubiert; dann wurden 0,2 ml der Zellsuspension mit 0,1 ml der DNA-Lösung (Schritt 5) gemischt und 15 Min. lang bei 0ºC inkubiert. Zunächst hielt man die Zellen 2 Min. bei 37ºC und danach 10 Min. bei Raumtemperatur, dann wurden 0,5 ml L-Brühe zugegeben, und die Kultur bei 37ºC 30 Min. lang inkubiert, mit 2,5 ml L-Brühe-Weichagar bei 42ºC gemischt und über 50 ug Ampicillin pro ml enthaltenden L-Brühe-Weichagar verteilt. Nach 12- bis 24-stündiger Inkubation bei 37ºC sammelte man die einzelnen Kolonien mit sterilen Zahnstochern auf. Alles in allem wurden ungefähr 5·10&sup4; unabhängige cDNA-Klone gebildet.
- Eine Sammlung von 10&sup4; unabhängigen Klonen wurde zufällig aus der T-Zellen-cDNA-Genbank ausgewählt und einzeln in die Vertiefungen von Mikrotiterschalen, die 200 ul L-Brühe mit 50 ug/ml Ampicillin und 7% Dimethylsulfoxid enthielten, verteilt. Man stellte aus den Mikrotiter-Kulturen 48 cDNA- Klone enthaltende Pools her. 40 solcher Pools wurden in 100 ug/ml Ampicillin enthaltenden 1 l-Kulturen von L-Brühe aufgezogen. Man isolierte aus jeder Kultur die Plasmid-DNA und reinigte sie mittels zweifacher Dichtegradientenreinigung durch CsCl-Gradienten. Die dem jeweiligen Pool entsprechende DNA wurde wie folgt in COS-7-Affenzellen transfiziert.
- Einen Tag vor Transfektion wurden ungefähr 10&sup6; COS-7- Affenzellen auf einzelne 60 mm-Platten in 10% fötales Kälberserum und 2 mM Glutamin enthaltendes DME geimpft. Zur Durchführung der Transfektion wurde das Medium von jeder Platte gesaugt und durch 1,5 ml DME, welches 50 mM Tris·HCl pH 7,4, 400 ug/ml DEAE-Dextran und 15 ug der zu testenden Plasmid-DNAs enthielt, ersetzt. Die Platten wurden vier Stunden lang bei 37ºC inkubiert, dann das DNA enthaltende Medium entfernt, und die Platten zweimal mit 2 ml serumfreiem DME gewaschen. 150 uM Chloroquin enthaltendes DME wurden auf die Platten zurückgegeben, die dann weitere 3 Stunden bei 37ºC inkubiert wurden. Die Platten wurden einmal mit DME gewaschen und dann wurden 4% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin, Penicillin und Streptomycin enthaltendes DME zugegeben. Die Zellen wurden dann 72 Stunden bei 37ºC inkubiert. Das Kulturmedium wurde gesammelt und, wie oben beschrieben, auf Human-GM-CSF-Aktivität geprüft.
- Vier Pools (Gruppen 1A, 3B, 7A und 14A) zeigten Human-GM- CSF-Aktivität (siehe Tabelle I, unten). Jede Gruppe wurde dann in 6, je 8 der ursprünglich vereinigten Klone enthaltende Pools unterteilt. Aus jedem Ausgangspool war im Transfektionsassay ein Sub-Pool positiv, mit Ausnahme von 7A, welcher zwei positive Sub-Pools lieferte. Jedes der Plasmide in den vier der fünf Sub-Pools wurde einzeln in die COS-7- Zellen transfiziert. Vier einzelne, als 3-8a, 7-1a, 7-4d und 14-1e bezeichnete Klone waren in der Produktion der GM-CSF- Aktivität aktiv. Eine Restriktionsendonukleasen-Analyse zeigte, daß diese Klone im wesentlichen alle die gleiche Struktur aufweisen.
- Tabelle I zeigt die Anzahl der durch jede Transfektionsprobe in Nabelschnurblut-Doppelassays stimulierten hämopoetischen Kolonien. Ein Cluster repräsentiert 20 bis 50 Zellen, eine kleine Kolonie war 51 bis 150 Zellen und eine Kolonie war mehr als 150 Zellen.
- Erstes Screening 40 Pools mit 48 Klonen (1-20, A+B)
- Scheininfiziertes COS-7: 7 + 12 Cluster
- Pool 1A: 29 + 25 Cluster
- Pool 3B: 38 + 20 Cluster
- Pool 7A: 22 + 19 Cluster
- Pool 14A: 26 + 32 Cluster
- Alle anderen Pools: weniger als 20 Cluster
- Zweites Screening Sub-Pools mit 8 Klonen
- Scheininfizierte COS-7: 9 + 15 Cluster
- Sub-Pool 1-5: 56 + 54 Cluster
- Sub-Pool 3-8: 98 + 52 kleine Kolonien
- Sub-Pool 7-1: 29 + 41 kleine Kolonien
- Sub-Pool 7-4: 100 + 93 kleine Kolonien
- Sub-Pool 14-1: 40 + 73 kleine Kolonien
- Alle anderen Sub-Pools: weniger als 20 Cluster
- Drittes Sceening Einzelne Klone
- Klon 3-8a: 120 + 127 Kolonien
- Klon 7-1a: 198 + 164 Kolonien
- Klon 7-4a: 176 + 160 Kolonien
- Klon 14-1e: 62 + 67 Kolonien
- Alle anderen Klone: weniger als 20 Cluster
- Fig. 2 zeigt ein Plasmid (pcD-Human-GM-CSF), das eine im wesentlichen vollständige cDNA-Insertion trägt; ein das Plasmid in sich tragendes E. coli-Bakterium (MC1061) ist bei der ATCC hinterlegt worden (Zugangsnummer 39923). In Fig. 2 wird die Transkription der 776 Bp.-cDNA-Insertion, welche in dem pcD-Expressionsvektor aus dem frühen Promotor von SV40 enthalten ist, mit einem Pfeil gekennzeichnet. Es wird die Lage der Spleiß-Donor- und -Akzeptor-Stellen gezeigt. Am 3'- Ende der cDNA-Insertion befindet sich ein aus SV40 stammendes Polyadenylationssignal. Die für GM-CSF kodierende Region in der cDNA-Insertion ist stark schattiert, während die nichtkodierenden Regionen leicht schattiert sind. Der Rest der Vektorsequenzen einschließlich des β-Lactamase-Gens (AmpR) und des Ursprungspunkts der Replikation stammt aus pBR322.
- Die 3-8a-Sequenz wurde unter Anwendung der M13-Didesoxy- Kettenterminationsmethode (Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 : 5463-5467 [1977]) und der modifizierten Maxam/Gilbert-Technik (Rubin, C. und Schmid, C., Nucleic Acid Res. 8 : 4613-4619 [1981]) bestimmt. Die cDNA-Insertion enthält einen einfachen offenen Leserahmen. Das erste ATG wird 33-35 Nukleotide vom 5'-Ende weg gefunden, und bis zum Terminations- Triplett (TGA) in Nukleotidposition 465-467 folgen diesem 144 Kodons.
- Tabelle II zeigt eine prozentuale Klassifizierung der zellulären Zusammensetzung von ungefähr 60 Human-Knochenmark- und Nabelschnurblut-Kolonien, die sich unter dem Einfluß der einzelnen Klone 3-8a, 7-1a, 7-4d und 14-1e entwickelt haben. Das Vorhandensein gemischter Kolonien von Eosinophilen und den anderen Zelltypen könnte auf ein Zusammenwachsen der Kolonien zurückzuführen sein. TABELLE II Zelluläre Zusammensetzung menschlicher Knochenmark-Kolonien Neu
- Eine für die Maus-GM-CSF-Aktivität kodierende vollständige cDNA (einschließlich einer Signalsequenz) ist isoliert worden, und ein E. coli-Bakterium (MC1061), welches ein pcD-Plasmid mit der Maus-cDNA in sich trägt, ist bei der ATCC hinterlegt worden (Zugangsnummer 39924). Eine ³²P- markierte Sonde des PST I/Ala III-Fragments aus der Maus-cDNA hybridisierte unter wenig stringenten Bedingungen (42ºC) mit einer der Human-GM-CSF-cDNAs der vorliegenden Erfindung (siehe Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory [1982]).
- Fig. 3 ist ein Vergleich zwischen den mutmaßlichen Maus- und Human-GM-CSF-Proteinsequenzen. Identische Reste (nach Ausrichtung) sind unterstrichen, während Reste, die nur im Humanprotein aber nicht im Mausprotein präsent sind, mit einem Stern gekennzeichnet sind, und Reste, die nur in der Maus vorhanden sind (z. B. Ser+Asn in den Positionen 57-58 und Lys- Lys in Position 65) mit einer kurzen vertikalen Linie gekennzeichnet sind. Die Homologien zwischen den Maus- und Human-GM-CSF-DNAs überrascht. Insgesamt gibt es ungefähr 70% Homologie zwischen den beiden CM-CSF-Sequenzen (Brutlag, D. et al., Nucleic Acids Res. 10 : 279-294 [1981]). Jedoch stimuliert die Human-GM-CSF der vorliegenden Erfindung nicht signifikant das Wachstum von Maus-hämatopoetischen Stammzellen in vitro.
- Die Klon-Genbank in dem pcD-Expressionsvektor ermöglicht die Identifikation vollständiger cDNA-Klone durch direkte Expression in Säugerzellen. Speziell werden vollständige Human-GM-CSF-cDNA-Klone direkt durch Transfektion von COS-7- Zellen mit zufällig ausgewählten cDNA-Klonen und Messung der freigesetzten GM-CSF-Aktivität im Zellüberstand identifiziert. Diese Ergebnisse bestätigen, daß eine Identifikation vollständiger cDNA-Klone von Lymphokinen oder Hormonen nur auf der Grundlage des Nachweises von funktionellen Polypeptiden in eukaryotischen Zellen erreicht werden kann.
- Die vorhergehenden Ausführungen lassen erkennen, daß die cDNA-Klone der vorliegenden Erfindung genaue und vollständige Sequenzdaten von Human-GM-CSF liefern. Die Erfindung stellt dem Fachmann außerdem Mittel zur Herstellung merklicher Mengen des Faktors (im wesentlichen frei von anderen hämatopoetischen Faktoren) zur verbesserten in vitro-Haltung von neutrophilen Granulocycten und Makrophagen, sowie von anderen hämatopoetischen Zellen (z. B. Eosinophile) zur Verfügung. Die aus den cDNA-Klonen erhaltenen Informationen führen weiterhin dazu, daß die Immunreaktion der Säuger zunehmend besser verstanden wird, was die experimentellen Möglichkeiten der Forschung fördert.
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