DE68917642T2

DE68917642T2 - Verfahren zur kontinuierlichen Züchtung von haftenden tierischen Zellen.

Info

Publication number: DE68917642T2
Application number: DE68917642T
Authority: DE
Inventors: Yoshiharu Takazawa; Michiyuki Tokashiki
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1988-05-25
Filing date: 1989-05-24
Publication date: 1995-02-09
Anticipated expiration: 2009-05-25
Also published as: EP0343635A2; DE68917642D1; EP0343635A3; EP0343635B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen Züchtung von adhärenten tierischen Zellen und genauer ein Verfahren zur kontinuierlichen Züchtung von adhärenten tierischen Zellen in Suspensionen.
Die Züchtung der Zellen in großen Mengen in einem industriellen Maßstab ist eine Technik, die bei der Produktion verschiedener Hormone, Enzyme, Lymphokine, Nucleinsäuren, Antibiotika und anderen nützlichen biologisch aktiven Substanzen wichtig ist. In vielen Fällen sind Zellen, die diese biologisch aktiven nützlichen Substanzen produzieren, insbesondere transformierte Zellen mit insertierter DNA, um die Sekretion der gewünschten Substanzen zu erlauben, adhärent, und es ist ein industriell wichtiges Problem, eine Technik zur effizienten Züchtung dieser Zellen zu entwickeln.
Es wurden früher einige Verfahren zur Züchtung großer Mengen an adhärenten Zellen und Vorrichtungen dafür vorgeschlagen. Viele davon betreffen jedoch das Wachstum von Zellen, die an der Oberfläche eines festen Trägers haften, und führen zu Problemen hinsichtlich der Vergrößerung des Maßstabs, der Ausführbarkeit und der Stabilität beim kontinuierlichen Langzeitbetrieb. Beispielsweise ist das Mikroträgerkulturverfahren, das von Van Wezel entwickelt wurde, ausgezeichnet und betrifft die Züchtung von Zellen auf Mikroträgern, wodurch diese in Suspension in einem Tank gezüchtet werden können (vgl. Growth of Cell Strains and Primary Cells on Microcarriers in Homogeneous Culture, Nature 216, 64-65 (1967)). Jedoch hängt nach dem Kulturverfahren von Van Wezel et al. die Kulturfläche von der Fläche des Mikroträgers ab, und wenn die Züchtung für eine lange Zeitspanne fortgeführt wird, lösen sich die Zellen schrittweise von den Mikroträgern.
Das US-Patent Nr. 4,059,485 beschreibt einen Versuch, adhärente Zellen in Suspension in einem serumhaltigen Medium zu züchten. Dieses Verfahren besitzt jedoch den Nachteil, daß bei Fortführung der Kultur die adhärenten Zellen unter Bildung großer Massen aggregieren und daß die Zellen in den großen Massen absterben.
Nach dem besten Wissen der Erfinder gab es keine industrielle Technik zur kontinuierlichen Züchtung adhärenter tierischer Zellen in Suspension als solche selbst über lange Zeitspannen ohne Bildung großer aggregierter Zellklumpen.
R.I. Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, zweite Auflage, 1987, Kapitel 7, S. 54-84 und Kapitel 23, S. 309-312, beschreibt allgemeine Verfahren zur Züchtung tierischer Zellen. Es wird beschrieben, daß zur Verringerung der Aggregation und der Befestigung der adhärenten Zellen in Suspension eine Variante von Eagle's Minimalnährmedium verwendet werden sollte, das bezüglich der Ca²&spplus;-Ionen mangelhaft oder verringert ist.
Die US-A-4,673,649 beschreibt ein Verfahren zur Züchtung menschlicher Keratinocytenzellen in einer einschichtigen Kultur in einem serumfreien Medium bei sehr niedrigen Konzentrationen an Calciumionen (0,01-0,1 mM), um die Stratifizierung und die terminale Differenzierung der Zellen zu vermeiden und um die Zellmultiplikation zu verbessern.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung ein Verfahren bereit zustellen, gemäß dem adhärente tierische Zellen in Suspension ohne Verwendung fester Träger, wie Mikroträger, gezüchtet werden können.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines industriellen Verfahrens, gemäß dem adhärente tierische Zellen in Suspension kontinuierlich über lange Zeitspannen gezüchtet werden können.
Eine noch weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines industriellen Verfahrens, gemäß dem adhärente tierische Zellen kontinuierlich über lange Zeitspannen gezüchtet werden können, während die Zellen als solche oder in relativ kleinen aggregierten Teilchen in Suspension gehalten werden.
Eine noch weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, gemäß dem adhärente tierische Zellen in Suspension in einer sehr hohen Dichte gezüchtet werden können.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, gemäß dem adhärente tierische Zellen in Suspension unter Verwendung eines serumfreien Kulturmediums gezüchtet werden können.
Eine noch weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, gemäß dem adhärente tierische Zellen, die eine nützliche biologisch aktive Substanz sezernieren, in Suspension gezüchtet werden, die Kulturbrühe aus dem Kulturtank entnommen wird und die nützliche biologisch aktive Substanz kontinuierlich und stabil aus der Kulturbrühe gewonnen wird.
Um die vorstehenden Aufgaben der Erfindung zu lösen, führten die Erfinder Untersuchungen bezüglich eines Verfahrens durch, mit dem adhärente tierische Zellen in Suspension ohne Verwendung fester Träger, wie Mikroträger, gezüchtet werden können. Diese Untersuchungen führten zu der Erkenntnis, daß die Konzentration eines Calciumions in dem Medium eng mit der Aggregation der Zellen zu Massen verbunden ist. In serumhaltigen Medien oder bestimmten serumfreien Medien, die allgemein bei der Züchtung tierischer Zellen verwendet werden, liegt ein Calciumion in Form von Calciumchlorid, Calciumpantothenat oder eines anderen Calciumsalzes üblicherweise in einer Konzentration von 0,3 mM, in vielen Fällen mehr als 0,5 mM, vor.
Wenn die adhärenten tierischen Zellen in Suspension in einem Medium mit einer üblichen Calciumkonzentration gezüchtet werden, haften die Zellen schrittweise aneinander und verklumpen oder aggregieren schließlich zu großen Massen.
Wenn die Anzahl der Zellen pro Masse mindestens 100, insbesondere mehr als 300, beträgt, erreichen Sauerstoff und Nährstoffe nicht ausreichend die Zellen, die im Inneren der Massen vorliegen, und sie verlieren die Fähigkeit zur Proliferation und die Fähigkeit, die nützliche biologisch aktive Substanz auszuscheiden, und sterben in vielen Fällen ab.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß, wenn die Calciumionenkonzentration in dem Medium unter den Kulturbedingungen erniedrigt wird, insbesondere auf weniger als 0,3 mM, bevorzugt weniger als 0,25 mM, die adhärenten tierischen Zellen selbst in einer hohen Dichte nicht zu großen Massen werden und über lange Zeitspannen in Suspension als solche oder als relativ kleine Teilchen gezüchtet werden können.
Es wurde gefunden, daß, wenn die Calciumionenkonzentration in dem Medium unter 0,02 mM, insbesondere unter 0,002 mM, erniedrigt wird, das Wachstum oder die Proliferation der Zellen schwierig wird oder ihre Fähigkeit zur Sekretion der nützlichen biologisch aktiven Substanz abrupt verringert wird, aber daß durch Halten der Calciumionenkonzentration innerhalb eines spezifischen Bereiches die adhärenten tierischen Zellen in Suspension über lange Zeitspannen gezüchtet werden können und ihre Fähigkeit zur Sekretion der nützlichen biologisch aktiven Substanzen nicht nachteilig beeinflußt wird.
Folglich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur kontinuierlichen Züchtung adhärenter tierischer Zellen, ausgewählt aus Stamm 293, abgeleitet von menschlichen fötalen Nierenzellen und Transformanten davon, die eine nützliche biologisch aktive Substanz in einem serumfreien Medium ausscheiden können, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
(1) ein frisches Medium in ein Kulturgefäß eingespeist wird und ein verbrauchtes Medium dem Gefäß entnommen wird,
(2) die adhärenten tierischen Zellen in dem serumfreien Medium in dem Gefäß in Suspension gehalten werden,
(3) die adhärenten tierischen Zellen in Suspension bei einer Dichte von mindestens 3 x 10&sup6; Zellen/ml gezüchtet werden und
(4) die Konzentration eines Calciumions in dem Medium unter den Kulturbedingungen bei 0,002 mM bis 0,3 mM gehalten wird.
Einige Informationen sind aus der Literatur des Stands der Technik bezüglich der Wirkung eines Calciumions auf die Züchtung tierischer Zellen vorhanden. Beispielsweise können die folgenden Literaturstellen genannt werden, und sie werden etwas ausführlicher diskutiert.

(a) Science, Band 130, 432-437 (1959)

Dies ist eine Druckschrift mit dem Titel "Amino Acid Metabolism in Mammalian Cell Cultures". Tabelle 1 auf Seite 433 zeigt ein Minimalnährmedium zur Züchtung tierischer Zellen entweder einschichtig oder in Suspension. Es wird beschrieben, daß die Konzentration des Calciumions (Ca&spplus;&spplus;) in diesem Nährmedium 1,8 mM oder 0 (vgl. die Reihe für CaCl&sub2; in der Spalte der Komponente) beträgt.
Als Erklärung für Tabelle 1 wird ausgeführt: "Bei der Verwendung dieses Mediums zum Wachstum von Zellen in Suspension sollte Ca&spplus;&spplus; weggelassen oder stark verringert werden, um ein Verklumpen zu minimieren (siehe 43)". W.F. McLimens, J. Immunol. 79, 428 (1957) als Zitat 43 führt auf Seite 42, linke Spalte, Zeilen 6-9 aus: "Der HeLa-Stamm (Gey) wurde in einem Medium aus menschlichem, Kälber- oder Pferdeserum, 10%; Eagle's-Gemisch (9) in Earle's ausgeglichener Salzlösung 90% ... gezüchtet". Gemäß dieser Aussage besitzt das bei der vorstehenden Kultur verwendete Medium vermutlich eine Calciumionenkonzentration von mindestens 1,85 mM. Genauer, 10% Serum enthält etwa 0,25 mM Calciumionen, und, da Earle's ausgewogene Salzlösung bekanntlich 200 mg/l CaCl&sub2; enthält, sind 90% dieser Salzlösung etwa 1,6 mM an Calciumionen. Als Ergebnis enthält das Mischmedium, das 10% Serum und 90% Salzlösung enthält, etwa 1,85 mM Calciumionen.
Folglich geht aus den vorstehenden Ausführungen hervor, obwohl die Druckschrift angibt, daß Ca&spplus;&spplus; weggelassen werden sollte, daß das tatsächlich verwendete Medium Ca&spplus;&spplus; in einer relativ hohen Konzentration von etwa 1,85 mM enthält. So kann, obwohl die Druckschrift offenbart, daß bei dieser Ca&spplus;&spplus;-Konzentration ein Verklumpen der Zellen minimiert wurde, es nicht unmittelbar aus dieser Offenbarung erwartet werden, daß Zellen in kleinen aggregierten Massen, wie erfindungsgemäß, in einer hohen Dichte für eine lange Zeitspanne gezüchtet werden. Die vorstehende Druckschrift legt überhaupt nicht nahe, daß adhärente Zellen in Suspension in einer hohen Dichte unter Verwendung eines serumfreien Mediums gezüchtet werden.

(b) Journal of Experimental Medicine, Band 152, 469-474 (1980)

Diese Druckschrift führt auf Seite 46 aus: "HeLa-S3-Zellen wurden in Suspension in der Spinnermodifikation von Eagle's Minimalnährmedium (Spinnermedium), das mit 4% fötalem Kälberserum supplementiert war, gezüchtet. Die anfängliche Zellkonzentration betrug 2 x 10&sup4; Zellen/ml." Diese Aussage zeigt jedoch nur die Ergebnisse, die durch Untersuchen der Wirkung der Konzentration an Interferon in dieser Kultur auf alle Oberflächenrezeptoren für das Lectin-Concanavalin-A erhalten wurden. Sie beschreibt überhaupt nicht den Zustand der hohen Zelldichte, insbesondere ihr Verklumpen bei einer niedrigen Calciumionenkonzentration.

(c) Nature, Band 329, 341 (24. September 1987)

Diese Druckschrift beschreibt "Transformation of cell adhesion properties by exogenously introduced E-cadherin cDNA". Die Tabelle 1 auf Seite 343 zeigt die Ergebnisse, die durch Untersuchung der Ca&spplus;&spplus;-abhängigen Aggregation nicht transformierter und transformierter L- und F9-Zellen erhalten wurden. Tabelle 1 zeigt die Aggregationsgrade in Anwesenheit von 1 mM Ca&spplus;&spplus; und in Abwesenheit von Ca&spplus;&spplus;. Die Tabelle 1 zeigt, daß je nach Zelltyp der Aggregationsgrad von dem Vorhandensein von Ca&spplus;&spplus; abhängen kann oder nicht und daß im allgemeinen in Abwesenheit von Ca&spplus;&spplus; keine Aggregation eintritt. In dem in Tabelle 1 gezeigten Versuch wurde jedoch der Zustand der Zellaggregation nur 30 Minuten nach der Inkubation untersucht, und kein Zustand der Aggregation wurde nach Langzeitzüchtung untersucht. Ferner enthält diese Druckschrift keine Angabe über die Art des verwendeten Mediums und die Zelldichte. Wenn Ca&spplus;&spplus; fehlt, können die Zellen selbst nicht überleben. Diese Druckschrift legt daher den Gegenstand der vorliegenden Erfindung nicht nahe.

(d) IN VITRO, 16(6), 486-490 (1980)

Diese Druckschrift beschreibt "cell aggregate suspension culture for large-scale production of biomolecules". Sie zeigt, daß, wenn SV3T3-Zellen in Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium, welches 10% fötales Rinderserum enthielt (vermutlich enthält dieses Medium etwa 2 mM Ca&spplus;&spplus;), gezüchtet wurden, sehr große Zellblöcke gebildet wurden.
Diese Druckschrift beschreibt jedoch überhaupt nicht, daß bei Durchführung der Züchtung bei einer hohen Zelldichte in einem serumfreien Medium, wie erfindungsgemäß, die Aggregation der Zellen durch Halten der Ca&spplus;&spplus;-Konzentration auf einer relativ niedrigen Ebene eingestellt wird.
Die Erfindung wird nun ausführlicher beschrieben.
Die erfindungsgemäß zu züchtenden Zellen sind adhärente tierische Zellen. Die adhärenten Zellen bezeichnen Zellen des Typs, der nach Züchtung in einem serumhaltigen Medium in einer Zellkulturschale nicht als lebende einzelne Zellen durch Pipettieren getrennt werden kann. Geeignete adhärente tierische Zellen zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren besitzen die Eigenschaft, daß sie Klumpen bilden, die mindestens 100 Zellen pro Klumpen im Durchschnitt enthalten, wenn sie in Suspension unter Rühren in einem üblichen Medium für tierische Zellen etwa 5 Tage lang gezüchtet werden. Das übliche Medium enthält Calciumionen in einer Konzentration von 0,3 bis 1,8 mM.
Die adhärenten tierischen Zellen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, werden aus dem Stamm 293 (hinterlegt unter der ATCC-Nr. CRL 1573), abgeleitet von menschlichen fötalen Nierenzellen und Transformanten davon, die eine nützliche biologisch aktive Substanz ausscheiden können, ausgewählt. Da bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Zellen in einer hohen Dichte gezüchtet werden können und die Kulturbrühe herausgenommen wird, kann die nützliche biologisch aktive Substanz, die von den Zellen ausgeschieden wird, in einer hohen Konzentration aus der Kulturbrühe abgetrennt werden.
So können gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren adhärente tierische Zellen, die eine nützliche biologisch aktive Substanz sezernieren, in Suspension als Einzelzellen oder als kleine Zellklumpen in einem serumfreien Medium gezüchtet werden, und die Züchtung kann mit einer hohen Zelldichte kontinuierlich für eine lange Zeitspanne fortgesetzt werden. Daher enthält die Kulturbrühe, die aus dem Kultursystem herausgenommen wird, die nützlich biologisch aktive Substanz in einer hohen Konzentration, und dessen Abtrennung ist ökonomisch vorteilhaft. Folglich kann die nützliche biologisch aktive Substanz industriell kontinuierlich und stabil produziert werden. Das erfindungsgemäße Züchtungsverfahren wird auf die 293-Zellen, abgeleitet von menschlichen fötalen Nierenzellen, angewendet.
Die Herstellung der Transformanten wird durch ein allgemeines Verfahren der Transfektion eines Expressionsvektors, welcher die DNA enthält, die eine Basensequenz besitzt, die die Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins codiert, in Zellen eines Wirtstieres durchgeführt.
Beispiele für den Expressionsvektor, der in die adhärenten tierischen Zellen transfiziert werden kann, umfassen Expressionsvektoren, erhalten durch Insertieren von DNAs, die nützliche biologisch aktive Substanzen, wie nachstehend aufgeführt, codieren, in verschiedene Vektoren, beispielsweise virale Vektoren, wie BLPV, AMIV und Vacciniavirus, oder Plasmidvektoren unter Verwendung von Promotoren, wie des frühen SV-40 Promotors, des Adenovirus MLP- und LRSV-Promotors, gegebenenfalls zusammen mit einem Selektionsmarker.
Beispiele für die nützliche biologisch aktive Substanz, die von den in die Expressionsvektoren zu insertierenden DNAs codiert werden, sind nachstehend angegeben.

Hormone

Erythropoetin (EPO), Wachstumshormon, Insulin, beta-Endorphin, Calcitonin, Somatostatin, Wachstumshormon-Releasingfaktor (GRF), Caerulein, Cholecystokinin, Corticotropin- Releasingfaktor, alpha-Neoendorphin, Hypophysen-Gonadotropin, Glucagon, LH-PH, Natrium-diuretisches Peptid, Oxytocin, Parathyroidhormon, Secretin, THR, Vasopressin, Proinsulin, luteinisierendes Hormon, Enkephalin, Lipocortin, Somatomedin, Renin, Angiotensin I, angiogener Faktor, Thiolproteaseinhibitor (TPI), α&sub1;-Antitrypsin (AAT), Collagenaseinhibitor, Glutathion, Urogastron und Hirudin.

Cytokinine

Interferon (IFN), Tumornekrosefaktor (TNF), Interleukin 1 (IL-1), Interleukin 2 (IL-2), Interleukin 3 (IL-3), Interleukin 4 (IL-4), B-Zelldifferenzierungsfaktor (BCDF), T- Zellersatzfaktor (TRF) 2, NKCF, Leukoregulin, Makrophagenaktivierender Faktor (MCF) und Leumorphin.

Fibrolytische Gerinnungsproteine

Protein C (PC), aktiviertes Protein C (APC), Gewebsplasminogenaktivator (TPA), Thrombomodulin, Urokinase (UK), Prourokinase (pro-UK), Streptokinase, Blutgerinnungsfaktor VIII, Blutgerinnungsfaktor IX, Blutgerinnungsfaktor XIII und Gewebsfaktorprotein S.

Enzyme

Chymosin, Elastase, Superoxiddismutase, A-Amylase, T-4 Lysozym, alkalische Phosphatase, Penicillinase, T-4 Ligase, beta-Lactamase, beta-Glucanase, beta-Glucosidase, Staphylokinase, Lipase, Penicillin-G-Acylase, Glucoamylase, Pullulanase, Cathechol-2,3-Oxygenase, Prochymosin, Metallothionein, Oxyreductase und DNA-Ligase.

Impfstoffe

HBsAg, antigenes KEB-Virusprotein, antigenes KATLV-Peptid, antigenes Poliovirusprotein, antigenes Hepatitisvirus-A-Typ Protein, antigenes HSV-Protein, antigenes FMDV-Protein, M- Protein von Streptococcus und antigenes Diphterietoxinproesin.

Blutbestandteile

Immunoglobulin, Serumalbumin, Apolipoprotein E und Apolipoprotein A-1.

Wachstumsfaktor

Kolonie-stimulierender Faktor (CSF), Epidermiswachstumsfaktor (EGF), transformierender Wachstumsfaktor (TGF), Nervenwachstumsfaktor (NGF), Insulin-artiger Wachstumsfaktor und Makrophagenproliferationsfaktor.

Andere nützliche biologisch aktive Substanzen

Protein A, Beta-Actin und Sojabohnenspeicherprotein (Glycinin).
Besonders bevorzugt sind die adhärenten tierischen Zellen diejenigen, die Protein C (PC) oder aktiviertes Protein C (APC), transfiziert durch das vorstehende Verfahren, sezernieren.
Das erfindungsgemäß verwendete Züchtungsverfahren ist ein Verfahren, gemäß dem Zellen in Suspension über eine lange Zeitspanne unter kontrollierten Kulturbedingungen gezüchtet werden, während kontinuierlich oder intermittierend aus dem Kulturgefäß ein Teil des verbrauchten Mediums mit den darin enthaltenen oder davon abgetrennten Zellen entnommen wird und ein frisches Medium in einer Menge entsprechend der Menge des entnommenen Mediums eingespeist wird.
Einfach ausgedrückt kann man sagen, daß das erfindungsgemäße Züchtungsverfahren ein Perfusions-Suspensions-Züchtungsverfahren ist. Ein wichtiger Punkt bei der Perfusions-Suspensions-Züchtung ist, daß lebende Zellen effizient von der Kulturbrühe entfernt werden, das verbrauchte Medium aus dem Kulturgefäß herausgenommen wird und die Umgebung für das Leben der Zellen in dem Kulturgefäß unter optimalen Bedingungen gehalten wird. Das verbrauchte Medium, das aus dem Kulturgefäß herausgenommen wird, kann als ein frisches Medium erneut verwendet werden, indem die nützlichen Substanzen, die darin enthalten sind, isoliert werden oder wachstumshemmende Substanzen abgetrennt und entfernt werden, indem ein Trennverfahren mit einer Membran oder ein Trennverfahren durch Absorption zur Züchtung und Einstellen der Calciumionen auf einen vorbestimmten Wert angewendet wird.
Das wichtigste bei dem erfindungsgemäßen Kulturverfahren ist die Einhaltung der Calciumionenkonzentration (Ca&spplus;&spplus;) in dem Medium unter den Kulturbedingungen bei 0,002 mM bis 0,3 mM. Die Einheit "mM" bezeichnet die Menge in Millimol an Calciumionen, die in dem wäßrigen Medium (Wasser) pro Liter vorhanden sind. Calciumionen (Ca&spplus;&spplus;) bedeutet Calciummetall basierend auf einer in dem Medium in aufgelöstem Zustand vorhandenen Calciumverbindung.
Die Calciumionenkonzentration in dem Medium beträgt bevorzugt 0,02 mM bis 0,25 mM, bevorzugter 0,05 mM bis 0,20 mM. Bei Züchtung in einem Medium mit einer Calciumionenkonzentration von mehr als 0,3 mM haften die adhärenten tierischen Zellen aneinander und aggregieren zu vielen großen Klumpen, wenn die Züchtung fortgesetzt wird. Wenn die Züchtung weiter fortgesetzt wird, werden sie stufenweise größer, und die Zellen im Inneren der Klumpen sterben ab. Wenn ferner die Klumpen eine Größe über einer bestimmten Grenze erreichen, neigt die Menge an nützlicher biologisch aktiver Substanz, die pro Zelle sezerniert wird, dazu, in unerwünschter Weise abzunehmen.
Wenn andererseits die Calciumionenkonzentration unter den vorstehend angegebenen Bereich fällt, wachsen die Zellen nicht langer und sterben in vielen Fällen ab. Selbst wenn die Zellen wachsen, nimmt die Menge der nützlichen biologisch aktiven Substanz, die von den Zellen sezerniert wird, abrupt ab, und der Zweck der Kultur kann nicht erzielt werden.
Folglich können erfindungsgemäß durch Halten der Calciumionenkonzentration in dem Medium unter den Kulturbedingungen die Zellen über eine lange Zeitspanne als relativ kleine Teilchen gezüchtet werden, selbst wenn die Zelldichte so hoch wie mindestens 3 x 10&sup6; Zellen/ml, bevorzugt mindestens 5 x 10&sup6; Zellen/ml, ist.
Unter bevorzugten Bedingungen kann die Suspensionszüchtung bei einer hohen Dichte von 7 x 10&sup6; bis 3 x 10&sup7;)-Zellen/ml durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die meisten der Zellen in dem Kulturgefäß, bevorzugt mindestens 90% davon, besonders bevorzugt mindestens 95% davon, in Suspension gehalten, während relativ kleine Teilchen gebildet werden, die jeweils 1,1 bis 50 Zellen im Durchschnitt, bevorzugt 1,5 bis 30 Zellen im Durchschnitt, enthalten. Dies kann durch Züchten der Zellen in einem Medium mit der vorstehend angegebenen niedrigen Calciumkonzentration erzielt werden, und das Kultursystem wird in einem gut suspendierten Zustand durch Rühren und/oder Belüften und effizientes Zuführen eines frischen Mediums und Abführen des verbrauchten Mediums gehalten.
Das einfachste Verfahren, um die Calciumionenkonzentration in dem Medium unter den Züchtungsbedingungen zu halten, ist die kontrollierte Einstellung der Calciumionenkonzentration eines frischen Mediums, das in das Kulturgefäß eingespeist werden soll, auf den vorstehend genannten Bereich. Genauer, es ist einfach, ein serumfreies Medium mit einer niedrigen Calciumionenkonzentration als das frische Medium zu verwenden.
Das erfindungsgemäß verwendete serumfreie Medium wird nun beschrieben.
Die erfindungsgemäße Züchtung wird im wesentlichen unter Verwendung eines serumfreien Mediums, das im wesentlichen keine Proteine, die von einer biologischen Quelle, wie Serum, abgeleitet sind, enthält, durchgeführt. Jedes Grundmedium, das bisher zur Züchtung in Gegenwart von Serum verwendet wurde, kann als das serumfreie Medium verwendet werden. Beispiele umfassen RPMI-1640 Medium, Eagle's Grundmedium (BME), Minimalnährmedium (MEM), Isocove's Medium, HAM F12 Medium, L-15 Medium, William's Medium, Waymouth's Medium und Dulbecco's modifiziertes Eagle's-Medium (DME). Die meisten dieser Grundmedien werden üblicherweise mit einer Calciumionenkonzentration von 0,3 bis 1,8 mM, insbesondere 0,5 mM bis 1,5 mM, verkauft und in diesem Zustand sind sie für die Verwendung bei der erfindungsgemäßen Züchtung mit niedrigem Calciumionengehalt ungeeignet. Folglich ist es notwendig, ein solches Grundmedium herzustellen, dessen Calciumkonzentration auf eine niedrige Konzentration, beispielsweise 0,0026 mM, eingestellt ist und gegebenenfalls ein Calciumion zuzusetzen, um die Gesamt-Calciumionenkonzentration auf den erfindungsgemäß bevorzugten Bereich einzustellen. Es ist ebenfalls möglich, einen Teil des Calciumions aus einem oder einem Gemisch aus im Handel erhältlichen Grundmedien mit einer relativ hohen Calciumionenkonzentration zu entfernen und das so erhaltene Medium als ein Medium mit einer niedrigen Calciumionenkonzentration zu verwenden.
Die Zusammensetzungen der vorstehenden Grundmedien benötigen vom Grund her die Zugabe von mindestens 10% Serum. Um sie für die erfindungsgemäße serumfreie Züchtung zu verwenden, ist es notwendig, verschiedene Nährstoffe oder Wachstumsfaktoren oder Proliferationsfaktoren anstelle des Serums zuzusetzen.
Gegebenenfalls können bis zu 2 Vol.-% Serum einem serumfreien Medium, das an die niedrige Calciumionenkonzentration angepaßt ist, zugesetzt werden, solange die Calciumionenkonzentration auf den erfindungsgemäß angegegebenen Bereich beschränkt bleibt. Hinsichtlich der Verringerung des Verklumpens der Zellen ergibt die Züchtung bei einer niedrigen Calciumionenkonzentration eine ausreichende Wirkung, aber hinsichtlich der Proliferation und der Erhaltung der Zellen ist die Zugabe einer gewissen Menge an Serum für einige Zelltypen bevorzugt. Das Serum kann beispielsweise fötales Kälberserum (FCS), Neugeborenen-Kälber-Serum (NBCS), Kälberserum (CS) oder Pferdeserum (HS) sein. Im Falle der Zugabe eines solchen Serums sollte die Calciumionenkonzentration angesichts der Tatsache, daß üblicherweise das Serum eine gewisse Menge an Calciumionen enthält, eingestellt werden.
Anstelle der Verwendung der handelsüblichen serumfreien Medien kann ein Kulturmedium mit einer niedrigen Calciumionenkonzentration, wie erfindungsgemäß ausgeführt, durch Zugabe der Komponenten, die üblicherweise für die Zellkultur verwendet werden, wie anorganische Salze, Vitamine, Coenzyme, Glucose, Aminosäuren und Antibiotika, und weiter ein Calciumsalz, wie Calciumchlorid oder Calciumnitrat oder beides, zu einem wäßrigen Medium, bestehend im wesentlichen aus Wasser, und gegebenenfalls unter Zugabe von weniger als 3 Vol.- % Serum, hergestellt werden.
Im allgemeinen wird die Züchtung der Zellen in Suspension durch Ausbringen der Zellen in einer relativ niedrigen Dichte, beispielsweise etwa 5 x 10&sup4; bis 1 x 10&sup6; Zellen/ml, begonnen. Bei einer Dichte von bis zu etwa 3 x 10&sup6; Zellen/ml können die Zellen nach einem üblicherweise bekannten Verfahren gezüchtet werden, das heißt in einem Medium mit einer Calciumionenkonzentration von mindestens 0,3 mM (serumhaltiges oder serumfreies Medium) oder in einem erfindungsgemäßen Medium mit einer niedrigen Calciumionenkonzentration. Erfindungsgemäß wird, wenn die Zelldichte 3 x 10&sup6; Zellen/ml überschreitet und die Zellen in Suspension vorliegen, das Medium mit niedrigem Calciumionengehalt, wie erfindungsgemäß beschrieben, verwendet.
Bei dem erfindungsgemäßen Züchtungsverfahren wird die Sauerstoffkonzentration des Kulturmediums durch Zufuhr von Sauerstoff, beispielsweise durch direkte Zufuhr von Sauerstoff oder durch Zufuhr eines Sauerstoff-enthaltenden Gases zu der Suspension konstant gehalten. Als weiteres Mittel zur Zufuhr von Sauerstoff kann ein Sauerstoffträger beispielsweise verwendet werden. Der Sauerstoffträger ist eine flüssige Verbindung, die im wesentlichen mit Wasser nicht mischbar ist und Sauerstoff lösen kann. Beispiele sind verschiedene Fluorkohlenstoffe, die als Material für künstliches Blut verwendet werden. Wenn solche Fluorkohlenstoffe als Mittel zum Lösen von Sauerstoff verwendet werden, kann ein Fluorkohlenstoff, in dem Sauerstoff gelöst ist, von oben in Form flüssiger Tröpfchen oder eines dünnen Films zugesetzt werden. Es ist auch möglich, ein Sauerstoff-durchlässiges Teflon- oder Siliconröhrchen im Inneren des Kulturgefässes anzubringen.
Folglich können gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren adhärente tierische Zellen in Suspension kontinuierlich über einen langen Zeitraum mit einer hohen Zelldichte, ohne einen teuren Mikroträger verwenden zu müssen, gezüchtet werden. Da ferner bei diesem Verfahren ein serumfreies Medium verwendet wird, ist es billig, und die nützliche biologisch aktive Substanz kann leicht aus dem gewonnenen Medium abgetrennt und gereinigt werden.
Da zusätzlich die Suspensionskultur mit einer hohen Zelldichte für eine lange Zeitspanne durchgeführt werden kann, ist die Volumeneffizienz des Kulturgefässes hoch, und die nützliche biologisch aktive Substanz kann in großen Mengen selbst in einem relativ kleinen Kulturgefäß erzeugt werden.
Ein weiterer großer Vorteil der Erfindung ist die Tatsache, daß, da das Verfahren in Suspension stattfindet, die Zellen meistens kleine Zehner-Klumpen bilden und das verbrauchte Medium sehr leicht aus dem Kulturgefäß herausgenommen werden kann. In einem kontinuierlichen Betrieb einer Suspensionskultur nicht-adhärenter Zellen ist es extrem schwierig, das verbrauchte Medium heraus zunehmen und gleichzeitig den Einschluß der Zellen darin zu vermeiden. Eine derartige Schwierigkeit tritt jedoch bei der erfindungsgemäßen Suspensionskultur nicht auf.
So kann erfindungsgemäß das verbrauchte Medium, das eine relativ hohe Konzentration der nützlichen biologisch aktiven Substanz, die von den Zellen sezerniert wird, enthält, aus dem Kulturgefäß kontinuierlich und leicht entnommen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich sehr für die industrielle Produktion nützlicher Substanzen.

Kurze Beschreibung der Figur

Die beigefügte Figur ist eine schematische Darstellung des bei den folgenden Beispielen der Erfindung verwendeten Kulturgefässes.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

1. Kulturvorrichtung

Das in der beigefügten Figur gezeigte Kultursystem.wurde verwendet. In diesem Kultursystem ist eine Absetzzone, die durch eine Wand innerhalb einer Außenwand abgeteilt ist, vorgesehen, und eine Auslaßöffnung für das Kulturmedium ist oben angebracht. Die Nettokapazität des Kultursystems beträgt etwa 180 ml.

2. Kulturmedium

Das verwendete Grundmedium wurde durch Vermischen von RPMI 1640-Medium, HAM F12-Medium und Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium in einem Verhältnis von 2:1:1, Zugabe von Glucoseaminosäuren etc. (das so erhaltene Gemisch wird als eRDF bezeichnet) und Erniedrigen der Calciumionenkonzentration des Gemisches auf 0,1 mM von den üblichen 0,74 mM hergestellt. Insulin, Transferrin, Ethanolamin und Natriumselenit (als ITES bezeichnet) wurden als Proliferationsfaktor in einer Konzentration von 9 ug/ml, 10 ug/ml, 10 uM bzw. 20 nM zugesetzt.

3. Verfahren und Ergebnis der Züchtung

Das Kulturmedium wurde in ein Nettokulturvolumen von etwa 180 ml in das Kulturgefäß, das zuvor autoklaviert worden war, eingespeist. Der Stamm 293 aus fötalen Nierenzellen und erhalten von der ATCC wurde in das Kulturgefäß in einer Dichte von 0,8 x 10&sup6; Zellen/ml eingebracht.
Sauerstoffgas wurde in das Kulturgefäß durch eine Blasdüse (B) mit automatischer Kontrolle eingespeist, so daß die Konzentration des aufgelösten Sauerstoffs 3 ppm wurde. Das Kulturmedium in dem Kulturgefäß wurde bei 37ºC gehalten. Ein Rührflügel vom marinen Typ wurde in das Kulturgefäß eingesetzt und mit einer Geschwindigkeit von 40 UpM rotiert. Die Züchtung wurde chargenweise für einen Tag nach der Ausbringung durchgeführt, und danach wurde die Perfusion begonnen.
Die Pumpe P wurde in Betrieb genommen, und das Kulturmedium, das von den Zellen in dem Kulturgefäß abgetrennt war, wurde über Leitung (D) entnommen, und ein frisches Medium in der gleichen Menge, wie die des entnommenen Mediums, wurde kontinuierlich in das Kulturgefäß über Leitung (A) eingespeist.
Mit der Zeit nahm die Zelldichte zu und erreichte am sechsten Tag 15 x 10&sup6; Zellen/ml. Danach zeigte die Proliferation der Zellen ein Gleichgewicht. Die Züchtung wurde 30 Tage lang fortgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Zelle: Stamm 293 Medium: ITES-eRDF (Calciumionen 0,15 mM) Züchtungszeit (Tage) Mediumaustausch (ml/Tag) Dichte dem lebenden Zellen (x 10&sup6; Zellen/ml)
Der durchschnittliche Grad der Aggregation im Gleichgewichtszustand betrug 5 Zellen pro Teilchen.

Vergleichsbeispiel 1

Beispiel 1 wurde wiederholt, ausgenommen, daß ein Kulturmedium (ITES-eRDF) mit einer üblichen Calciumkonzentration (0,74 mM) anstelle des in Beispiel 1 verwendeten Kulturmediums verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Zelle: Stamm 293 Medium: ITES-eRDF (Calciumionen 0,74 mM) Züchtungszeit (Tage) Mediumaustausch (ml/Tag) Dichte dem lebenden Zellen (x 10&sup6; Zellen/ml)
Der durchschnittliche Grad der Aggregation im Gleichgewichtszustand betrug 7 x 10³ Zellen pro Teilchen.

Beispiel 2

1. Kulturvorrichtung

Das in der beigefügten Figur gezeigte Kultursystem wurde verwendet. In diesem Kultursystem ist eine Absetzzone, die durch eine Wand innerhalb einer Außenwand abgeteilt ist, vorgesehen, und ein Auslaßteil für das Kulturmedium ist oben vorgesehen. Die Nettokapazität des Kultursystems beträgt etwa 180 ml.

2. Kulturmedium

Das verwendete Grundmedium wurde durch Vermischen von RPMI 1640-Medium, HAM F12-Medium und Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium in einem Verhältnis von 2:1:1, Zugabe von Glucose, Aminosäuren, etc. (das so erhaltene Gemisch wird als eRDF bezeichnet) und Entfernung der Calciumsalze (Calciumchlorid, Calciumnitrat) außer Calciumpanthotenat (das so erhaltene Medium wird als eRDF mit niedrigem Ca bezeichnet) hergestellt. Insulin, Transferrin, Ethanolamin und Natriumselenit (ITES) wurden als Proliferationsfaktoren in einer Konzentration von 9 ug/ml, 10 ug/ml, 10 uM bzw. 20 nM zugesetzt.

3. Verfahren und Ergebnis der Züchtung

Das Kulturmedium wurde in ein Nettokulturvolumen von etwa 180 ml in das Kulturgefäß, das zuvor autoklaviert worden war, eingespeist. Der das Protein C produzierende Stamm 293 # 3, der durch Einschleusen eines DNA-Fragments, das die Aminosäuresequenz von menschlichem Protein C codiert, gemäß dem in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 111690/1987 beschriebenen Verfahren in den Stamm 293 mit Ursprung aus menschlichen fötalen Nierenzellen, erhalten von der ATCC, erhalten worden war, wurde in das Kulturmedium ausgebracht.
Sauerstoffgas wurde in das Kulturgefäß durch eine Blasdüse (B) mit automatischer Kontrolle eingespeist, so daß die Konzentration an gelöstem Sauerstoff 3 ppm wurde. Das Kulturmedium in dem Gefäß wurde bei 37ºC gehalten. Ein Rührflügel vom marinen Typ wurde in das Kulturgefäß eingesetzt und mit einer Geschwindigkeit von 40 UpM rotiert. Die Züchtung wurde chargenweise für einen Tag nach dem Ausbringen durchgeführt, und dann wurde die Perfusion begonnen.
Die Pumpe P wurde in Betrieb genommen, und das von den Zellen in dem Kulturgefäß abgetrennte Medium wurde über Leitung (D) entnommen, und ein frisches Medium in gleicher Menge, wie die des entnommenen Mediums, wurde kontinuierlich über Leitung (A) eingespeist. Die Ergebnisse und die Anzahl der Austausche des Mediums sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Zellen: Stamm 293 #3 Medium: ITES + eRDF mit niedrigem Ca-Gehalt (Ca&spplus;&spplus; betrug nur 0,0026 mM aus Calciumpanthotenat) Züchtungszeit (Tage) Austausch des Mediums (ml/Tag) Dichte der lebenden Zellen (x 10&sup6; Zellen/ml)
Der durchschnittliche Aggregationsgrad im Gleichgewichtszustand betrug 7 Zellen pro Teilchen.

Vergleichsbeispiel 2

Beispiel 2 wurde wiederholt, ausgenommen, daß das übliche eRDF (Ca&spplus;&spplus;-Konzentration 0,74) anstelle des in Beispiel 2 verwendeten eRDFs verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Zellen: Stamm 293 #3 Medium: ITES + eRDF (mit einer üblichen Calciumionenkonzentration von 0,74 mM) Züchtungszeit (Tage) Austausch des Mediums (ml/Tag) Dichte der lebenden Zellen (x 10&sup6; Zellen/ml)
Der durchschnittliche Aggregationsgrad im Gleichgewichtszustand betrug 2 x 10³ Zellen pro Teilchen.

Beispiel 3

Beispiel 2 wurde wiederholt, ausgenommen, daß 0,01 mM Calciumchlorid weiter dem Kulturmedium zugesetzt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Zellen: Stamm 293 #3 Medium: 0,01 mM CaCl&sub2; + ITES + eRDF mit niedrigem Calciumgehalt Züchtungszeit (Tage) Austausch des Mediums (ml/Tag) Dichte der lebenden Zellen (x 10&sup6; Zellen/ml)
Der durchschnittliche Aggregationsgrad im Gleichgewichtszustand betrug 8 Zellen pro Teilchen.

Beispiel 4

Beispiel 2 wurde wiederholt, ausgenommen, daß 0,04 mM Calciumchlorid weiter dem Kulturmedium zugesetzt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Zellen: Stamm 293 #3 Medium: 0,04 mM CaCl&sub2; + ITES + eRDF mit niedrigem Calciumgehalt Züchtungszeit (Tage) Austausch des Mediums (ml/Tag) Dichte der lebenden Zellen (x 10&sup6; Zellen/ml)
Der durchschnittliche Aggregationsgrad im Gleichgewichtszustand betrug 7 Zellen pro Teilchen.

Beispiel 5

Beispiel 2 wurde wiederholt, ausgenommen, daß 0,1 mM Calciumchlorid dem Kulturmedium zugesetzt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 Zellen: Stamm 293 #3 Medium: 0,1 mM CaCl&sub2; + ITES + eRDF mit niedrigem Calciumgehalt Züchtungszeit (Tage) Austausch des Mediums (ml/Tag) Dichte der lebenden Zellen (x 10&sup6; Zellen/ml)
Der durchschnittliche Aggregationsgrad im Gleichgewichtszustand betrug 6 Zellen pro Teilchen.

Vergleichsbeispiel 3

Beispiel 2 wurde wiederholt, ausgenommen, daß der Protein C produzierende Stamm BHK 229-10, erhalten durch Einschleusen eines DNA-Fragments, das die Aminosäuresequenz von menschlichem Protein C codiert, in einen BHK-Stamm, von der ATCC erhalten, als zu züchtende Zellen verwendet wurde. Bis zum 13. Tag wurde die Züchtung unter Verwendung des in Beispiel 3 verwendeten Mediums durchgeführt, und am 14. Tag und von da an wurde die Züchtung unter Verwendung des in Vergleichsbeispiel 2 verwendeten Mediums durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 Zellen: BHK 229-10 Medium: (A) 0,01 mM CaCl&sub2; + ITES + eRDF mit niedrigem Calciumgehalt (B) ITES + eRDF (übliche Calciumionenkonzentration 0,74 mM) Züchtungszeit (Tage) Austausch des Mediums (ml/Tag) Dichte der lebenden Zellen (x 10&sup6; Zellen/ml)
Der durchschnittliche Aggregationsgrad im Gleichgewichts zustand betrug 40 Zellen pro Teilchen.
Die Tabelle 8 zeigt, daß, wenn BHK-Zellen in einem Medium mit niedrigem Calciumgehalt für eine bestimmte Zeitspanne gezüchtet wurden und dann in einem Medium mit einer üblichen Calciumionenkonzentration die Zellklumpen nicht groß wurden und die Zellen in Suspension gezüchtet werden konnten.

Vergleichsbeispiel 4

Vergleichsbeispiel 3 wurde wiederholt, ausgenommen, daß das in Vergleichsbeispiel 1 verwendete Kulturmedium während der ganzen Züchtungsdauer verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9 Zellen: Stamm BHK 229-10 Medium: ITES + eRDF (übliche Calciumionenkonzentration 0,74 mM) Züchtungszeit (Tage) Austausch des Mediums (ml/Tag) Dichte der lebenden Zellen (x 10&sup6; Zellen/ml)
Der durchschnittliche Aggregationsgrad im Gleichgewichtszustand betrug 3 x 10&sup4; Zellen pro Teilchen.

Vergleichsbeispiel 5

Beispiel 5 wurde wiederholt, ausgenommen, daß der Protein C produzierende CHO Z4-I5-Stamm, erhalten durch Einschleusen eines DNA-Fragments, das die Aminosäuresequenz von menschlichem Protein C codiert, in den CHO-Stamm, anstelle der in Beispiel 5 gezüchteten Zellen verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10 Zellen: Stamm CHO Z4-I5 Medium: 0,1 mM CaCl&sub2; + ITES + eRDF mit niedrigem Calciumgehalt Züchtungszeit (Tage) Austausch des Mediums (ml/Tag) Dichte der lebenden Zellen (x 10&sup6; Zellen/ml)
Der durchschnittliche Aggregationsgrad im Gleichgewichtszustand betrug 30 Zellen pro Teilchen.

Claims

1. Verfahren zur kontinuierlichen Züchtung von adherenten tierischen Zellen, ausgewählt aus dem Stamm 293 (ATCC Nr. CRL 1573), abgeleitet von menschlichen fetalen Nierenzellen und Transformanten davon, die eine nützliche biologisch aktive Substanz in einem serumfreien Medium ausscheiden können, dadurch gekennzeichnet, daß

(1) ein frisches Medium in ein Kulturgefäß eingespeist wird und ein verbrauchtes Medium dem Gefäß entnommen wird,

(2) die adherenten tierischen Zellen in dem serumfreien Medium in dem Gefäß in Suspension gehalten werden,

(3) die adherenten tierischen Zellen in Suspension bei einer Dichte von mindestens 3 x 10&sup6; Zellen/ml gezüchtet werden, und

(4) die Konzentration eines Calciumions in dem Medium unter den Kulturbedingungen bei 0,002 mM bis 0,3 mM gehalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration eines Calciumions in dem Medium unter den Kulturbedingungen bei 0,002 mM bis 0,25 mM gehalten wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die meisten der adherenten tierischen Zellen in Suspension als aggregierte Teilchen vorhanden sind, die jeweils 1,5 bis 50 Zellen im Durchschnitt enthalten.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge -kennzeichnet, daß die meisten der adherenten tierischen Zellen in Suspension als aggregierte Teilchen vorhanden sind, die jeweils 1,5 bis 30 Zellen im Durchschnitt enthalten.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die adherenten tierischen Zellen in Suspension in einer Dichte von mindestens 5 x 10&sup6; Zellen/ml vorhanden sind.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Einspeisen des frischen Mediums und das Abziehen des verbrauchten Mediums in und aus dem Kulturgefäß kontinuierlich oder intermittierend durchgeführt werden und der Flüssigkeitsspiegel in dem Kulturgefäß im wesentlichen konstant gehalten wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der suspendierte Zustand der adherenten tierischen Zellen in dem Kulturgefäß durch Rühren und/oder Belüften aufrechterhalten wird.