DE68914532T2

DE68914532T2 - Verfahren zur Herstellung von Trifluorthymidin.

Info

Publication number: DE68914532T2
Application number: DE1989614532
Authority: DE
Inventors: Yoshinori C O Yuki Gos Hayashi; Akio C O Japan Tobac Katsuyama; Yoichi C O Japan Tobacc Mikami; Takamitsu C O Yuki Gosei Shiba; Takahiro C O Yuki Gos Sugimoto; Yonosuke C O Yuki Gosei Sunaga
Original assignee: YUKI GOSEI YAKUHIN KOGYO KK; Japan Tobacco Inc
Current assignee: YUKI GOSEI YAKUHIN KOGYO KK; Japan Tobacco Inc
Priority date: 1988-07-22
Filing date: 1989-07-20
Publication date: 1994-11-03
Anticipated expiration: 2009-07-21
Also published as: EP0351853A3; EP0351853A2; DE68914532D1; EP0351853B1; JPH0231686A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Trifluorthymidin unter Anwendung einer Enzymreaktion und insbesondere ein Verfahren zum Herstellen von Trifluorthymidin durch eine basische Austauschreaktion oder dergleichen eines Nucleosids unter Einsatz eines Enzyms.
Trifluorthymidin als Verbindung, die durch die vorliegende Erfindung herzustellen ist, ist eine Art von Desoxyribosid von Trifluormethyluracil. Diese Verbindung hat Antivirus- Eigenschaften in einer niedrigen Konzentration und ist eine Substanz, die für die Therapie von Herpeserkrankungen wie etwa Keratitis geeignet ist.
Ein herkömmliches Verfahren zur Herstellung von Pyrimidin- Ribonucleosiden und Pyrimidin-Desoxyribonucleosiden ist ebenfalls bekannt, bei dem ein Nucleosid als ein Ribose- oder Desoxyribosedonor eingesetzt und mit einer Pyrimidinbase in Gegenwart eines Bakteriums umgesetzt wird, um eine basische Austauschreaktion unter Einsatz eines Enzyms durchzuführen (veröffentlichte ungeprüfte JP-Patentanmeldung Nr. 56-102794). Nach diesem Verfahren wird ein Stamm der Gattung Escherichia, Erwinia, Klebsieila, Bacterium, Enterobacter, Aeroinonas, Serratia, Proteus, Xanthomonas oder Citorobacter eingesetzt. Die Reaktion wird in einer wäßrigen Lösung bei 50-65 ºC durchgeführt.
Agric. Biol. Chem. 49(11) 3239-3246, 1985, beschreibt Eigenschaften von Nucleosidphosphorylase von Enterobacter- Aerogenen. Die Reaktionen werden bei 60-65 ºC durchgeführt.
Da, wie oben beschrieben, Trifluorthymidin eine Art von Desoxyribosid von Trifluormethyluracil ist, kann Trifluorthymidin prinzipiell durch Anwendung des oben beschriebenen herkömmlichen Verfahrens hergestellt werden. Ein Beispiel, bei dem ein ganzer Körper eines Bakteriums eingesetzt wird, das insbesondere zu der Gattung Serratia gehört, ist jedoch in der obigen Patentanmeldung nicht beschrieben. Es wurde außerdem gefunden, daß die Herstellung von Trifluorthymidin nach dem vorstehenden Verfahren unter Einsatz von Trifluormethyluracil als Ausgangsmaterial in einer sehr geringen Ausbeute resultierte.
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Herstellen von Trifluorthymidin mit hoher Ausbeute.
Ein Verfahren gemäß der Erfindung weist die folgenden Schritte auf: Bewirken, daß Trifluormethyluracil und ein Desoxyribosedonor in einer Lösung, die ein der Gattung Serratia angehörendes Bakterium enthält, in einem Temperaturbereich von 30-45 ºC miteinander reagieren, wodurch Trifluorthymidin erzeugt wird; und Gewinnen des Trifluorthymidins aus der Lösung.
Die Erfindung weist ferner ein Verfahren auf, das die folgenden Schritte umfaßt: Bereitstellen eines gegebenen Enzyms, das bei einer Reaktion zwischen Trifluormethyluracil und einem Desoxyribosedonor wirksam und von einem der Gattung Serratia angehörenden Bakterium erhalten ist, oder eines immobilisierten Enzyms, das durch Immobilisieren des gegebenen Enzyms erhalten ist; In-Kontakt-Bringen einer Lösung, die Trifluormethyluracil und den Desoxyribosedonor enthält, mit dem gegebenen Enzym oder dem immobilisierten Enzym in einem Temperaturbereich von 30-45 ºC, wodurch Trifluorthymidin erzeugt wird; und Gewinnen des Trifluorthymidins aus der Lösung.
Gemäß der Erfindung wird ein Bakterium der Gattung Serratia oder das Enzym oder das immobilisierte Enzym, das in der obigen Reaktion aktiv ist und aus einem kultivierten Bakterium der Gattung Serratia erhalten ist, eingesetzt, um kontinuierlich Trifluorthymidin mit hoher Ausbeute aus dem Trifluormethyluracil und dem Desoxyribosedonor unter gemäßigten Reaktionsbedingungen zu erhalten.
Der Erfinder hat ausführliche Untersuchungen an einem Verfahren zum herstellen von Trifluorthymidin aus Trifluormethyluracil und einem Desoxyribosedonor auf der Grundlage einer basischen Austauschreaktion unter Einsatz einer Bakterie durchgeführt, und es ist gelungen, eine hohe Ausbeute zu erzielen, indem eine Bakterie der Gattung Serratia und gemäßigte Temperaturbedingungen im Bereich von 30-45 ºC gewählt werden.
Wenn von Enzymen, die aus kultivierten Bakterien der Gattung Serratia erhalten waren, ein gegebenes Enzym, das in der Reaktion aktiv ist, oder ein immobilisiertes Enzym, das durch Immobilisieren des gegebenen Enzyms erhalten ist, eingesetzt wurde, wurde nach den Feststellungen der Erfinder Trifluorthymidin mit hoher Ausbeute auf die gleiche Weise wie in dem Fall erhalten, in dem der ganze Bakterienkörper eingesetzt wurde. Außerdem kann, wenn das immobilisierte Enzym eingesetzt wird, Trifluorthymidin kontinuierlich erhalten werden.
Die Erfindung wird nachstehend im einzelnen beschrieben.
Beispiele von Bakterien, die zu der Gattung Serratia gehören, die bei der Erfindung eingesetzt wird, sind Serratia marcescens IFO3052, Serratia marcescens IFO3046, Serratia marcescens IFO3735, Serratia liquefaciens IFO12979 und Serratia liquefaciens ATCC11367. Von diesen Beispielen hat Serratia marcescens IFO3052 eine ausgezeichnete Wirkung. Diese Bakterien können beispielsweise durch die folgende Methode erhalten werden. Stämme der obigen Bakterien werden in normalem Kulturmedium kultiviert, das folgendes enthält: eine Kohlenstoffquelle wie Glucose, Maltose, Restmelasse und ein saures oder enzymatisches Stärkehydrolysat; eine Stickstoffquelle wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Harnstoff; eine organische Nährstoffquelle wie einen Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton und Fleischextrakt; und anorganische Ionen wie Phosphat, Magnesium, Kalium, Zink, Eisen und Mangan. Die Suspensionen können nach der Kultivierung direkt eingesetzt werden. Aus den Kulturlösungen durch Zentrifugieren abgeschiedene Bakterien oder ein bakterieller Körper, der durch eine Ultraschallwelle oder dergleichen aufgebrochen ist, kann jedoch anstelle der Suspensionen eingesetzt werden. In diesem Fall kann eine Menge der Bakterien oder der aufgebrochenen bakteriellen Körper 0,1-40, bevorzugt 10-40 mg/ml (nasse Bakterien) in Pufferlösung sein.
Ein durch Fliehkraftabscheidung erhaltener Überstand des aufgebrochenen bakteriellen Körpers, eine aktive Fraktion, die durch Aussalzen des Überstands erhalten ist, oder ein acetonbehandeltes Bakterium kann als ein Enzym der Erfindung entweder direkt oder nach Reinigung eingesetzt werden. Von diesen enzymatischen Materialien ist der Überstand, der durch Fliehkraftabscheidung des auf gebrochenen bakteriellen Körpers erhalten wird, am wirksamsten. In diesem Fall kann eine Menge dieser Enzyme die gleiche wie die sein, die aus 0,1-40, bevorzugt 10-40 mg/ml Bakterien oder aufgebrochenen bakteriellen Körpern in Pufferlösung erhalten wird.
Diese Enzyme können immobilisiert werden. Eine Immobilisierungsmethode für diese Enzyme kann eine Methode sein, bei der das Enzym an einem Ionenaustauschharz adsorbiert wird, oder eine Methode, bei der das Enzym in ein Gel wie Calciumalginat oder ein unter Einsatz von Glutaraldehyd vernetztes Gel eingebracht und immobilisiert wird. Von diesen Methoden ist ein Adsorptionsverfahren unter Einsatz eines schwachen Anionenaustauschharzes am meisten bevorzugt. Eine Menge des immobilisierten Enzyms kann durch die Reaktionsbedingungen bestimmt werden. Beispielsweise kann die Menge gleich derjenigen sein, die aus 0,1-40, bevorzugt 10-40 mg/ml Bakterien oder aufgebrochenen bakteriellen Körpern in Pufferlösung erhalten wird.
Beispiele für den Desoxyribosedonor, der bei der Erfindung eingesetzt wird, sind 2'-Desoxyribonucleosid wie 2'-Desoxyadenosin, 2'-Desoxyinosin, 2'-Desoxyguanosin, Thymidin und 2'-Desoxyuridin sowie 2-Desoxy-α-D-ribose-1-phosphorsäure. Der Anteil eines solchen Desoxyribosedonors ist das 1-10fache in Molekülen und bevorzugt das 2-5fache in Molekülen, bezogen auf Trifluormethyluracil.
Eine Reaktion wird im allgemeinen in einer wäßrigen Lösung durchgeführt. Wenn der Desoxyribosedonor 2'-Desoxyribonucleosid ist, wird der wäßrigen Lösung bevorzugt 1-50 mmol Phosphorsäure zugesetzt.
Die Reaktionstemperatur fällt in den Bereich von 30-45 ºC, weil die Ausbeute bei hohen Temperaturen geringer wird. Da Trifluormethyluracil als das Ausgangsmaterial und Trifluorthymidin als das Produkt der Erfindung chemisch instabil sind, wird eine gemäßigte Temperaturbedingung bevorzugt.
Die Reaktionsdauer fällt bevorzugt in den Bereich von 3-20 h. Eine lange Reaktionsdauer wird nicht bevorzugt, da das erzeugte Trifluorthymidin instabil ist. Nach Beendigung der Reaktion wird der ganze bakterielle Körper oder das Enzym abgeschieden, und das hergestellte Trifluorthymidin wird durch Harzadsorption oder Kristallisation isoliert und gereinigt.
Wenn die Reaktion unter Einsatz eines immobilisierten Enzyms durchgeführt wird, wird sie in eine Säule gefüllt, und eine wäßrige Substratlösung, in der Trifluormethyluracil, der Desoxyribosedonor und nach Bedarf zugefügte Phosphorsäure gelöst sind, wird durch die Säule geschickt. Die Konzentration der wäßrigen Substratlösung ist durch die Menge Trifluormethyluracil bestimmt. Der Gehalt an Trifluormethyluracil ist im allgemeinen 0,3 Gew.-% oder weniger. Eine Durchlaufrate ist gegeben als eine Verdünnungsrate von 10 h&supmin;¹ oder weniger und bevorzugt 3 h&supmin;¹ oder weniger. Die Einheit der Verdünnungsrate bezeichnet ein Verhältnis des durch die Säule geschickten Lösungsvolumens zu dem Volumen der Säule pro Stunde.
Die Erfindung wird mit Hilfe von Beispielen im einzelnen erläutert.

Beispiel 1

100 ml einer Kulturlösung, enthaltend 1 g/dl Glucose, 1 g/dl Pepton, 0,5 g/dl Hefeextrakt und 0,5 g/dl Salz (pH: 7,0), wurden in einem Erlenmeyer-Kolben von 500 ml eingebracht. Nachdem die Kulturlösung in einem Autoklaven sterilisiert worden war, wurde Serratia marcescens IFO3052 einmal in die Kulturlösung mit einer Platinschlinge geimpft und für 24 h bei 30 ºC kultiviert. Nach der Kultivierung wurden Kulturbakterien aus der Kulturlösung durch Fliehkraftabscheidung abgeschieden.
Die abgeschiedenen Bakterien wurden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in einer 5 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) suspendiert (25 mg Naßbakterien/ml). 0,1 g/dl Trifluormethyluracil und 0,5 g/dl Thymidin wurden dieser Suspension zugefügt, und das Gemisch wurde für 6 h bei 45 ºC umgesetzt. Nach der Reaktion wurde die resultierende Lösung mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) analysiert. Die bei der obigen Reaktion hergestellte Menge Trifluorthymidin war 89 mg/dl. Die Ausbeute an Trifluorthymidin aus Trifluormethyluracil war 54,1 %.

Beispiel 2

6 l einer Kulturlösung wie in Beispiel 1 wurden in einen 10-l-Bioreaktor vom Gefäßtyp eingetragen, und Serratia marcescens IFO3052 wurde in die Kulturlösung geimpft und für 24 h bei 30 ºC kultiviert. 126 mg/dl Trifluorthymidin wurden erhalten, nachdem anschließende Operationen unter Anwendung der gleichen Vorgänge wie in Beispiel 1 durchgeführt wurden. Die Ausbeute an Trifluorthymidin aus Trifluormethyluracil war 76,6 %.

Beispiel 3

72 mg/dl Trifluorthymidin wurden erhalten nach Durchführung von Operationen entsprechend dem Vorgehen von Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß 2'-Desoxyguanosin anstelle von Thymidin wie in Beispiel 1 eingesetzt wurde. Die Ausbeute an Trifluorthymidin aus Trifluormethyluracil war 43,8 %.

Beispiel 4

73 mg/dl Trifluorthymidin wurden bei Durchführung der gleichen Abläufe wie in Beispiel 1 erhalten, wobei jedoch 2'- Desoxyadenosin anstelle von Thymidin von Beispiel 1 eingesetzt wurde. Die Ausbeute an Trifluorthymidin aus Trifluormethyluracil war 44,4 %.

Beispiel 5

Produkte wurden unter Durchführung der gleichen Abläufe wie in Beispiel 1 erhalten, wobei jedoch die Reaktionstemperaturen 30 ºC, 40 ºC, 50 ºC und 60 ºC waren. Ausbeuten von Trifluorthymidin aus Trifluormethyluracil bei den Reaktionen mit den obigen Temperaturen sind in der Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Reaktionstemperatur (ºC) Ausbeute (%)

Beispiel 6

Wie in Beispiel 1 behandelte Bakterien wurden in einer 50 mM Tris(hydrochlorid)pufferlösung (pH 7,5) suspendiert (25 mg Naßbakterien/ml). 0,1 g/dl Trifluormethyluracil und 0,5 g/dl 2-Desoxy-α-D-ribose-1-phosphorsäure wurden der Lösung zugefügt, und das resultierende Gemisch wurde bei Temperaturen von 30 ºC, 40 ºC, 50 ºC und 60 ºC für 16 h umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die resultierende Lösung nach den gleichen Abläufen wie in Beispiel 1 analysiert. Die Ausbeuten von Trifluorthymidin aus Trifluormethyluracil bei den jeweiligen Reaktionstemperaturen sind in der Tabelle 1 angegeben. Tabelle 2 Reaktionstemperatur (ºC) Ausbeute (%)

Beispiel 7

1 l einer Kulturlösung (pH 7,0), enthaltend 10 g/l Glucose, 10 g/l Pepton, 5 g/l Hefeextrakt und 5 g/l Salz, wurde in einen 3-l-Kolben eingetragen und in einem Autoklaven sterilisiert. Serratia marcescens IFO3052 wurde in 100 ml einer Kulturlösung, die die gleiche Zusammensetzung wie die obige Kulturlösung hatte, in einem 500-ml-Behälter bei 30 ºC für 16 h einer Schüttelkultivierung unterworfen. 5 ml dieser Kulturlösung wurden in die sterilisierte Kulturlösung geimpft und bei 30 ºC für 16 h kultiviert. Nach Fertigstellung der Kultur wurden kultivierte Bakterien durch Fliehkraftabscheidung abgetrennt. 8 g der Naßbakterien wurden in 16 ml einer 15 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) suspendiert, und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure wurden ihr zugegeben, um den Bakterienkörper mit einer Ultraschallwelle aufzubrechen, während die Lösung gleichzeitig mit Eis gekühlt wurde. Die aufgebrochenen Bakterien wurden durch Fliehkraftabscheidung abgetrennt, um einen Überstand zu erhalten, und der Überstand wurde als grobe Enzymlösung eingesetzt.
20 ml eines schwachen Anionenaustauschharzes (TOYOPEARL: DEAE 650 M) wurden in eine Säule mit einem Durchmesser von 16 mm eingefüllt, und 20 ml der vorstehenden groben Enzymlösung wurden mit dem Ionenaustauschharz in Kontakt gebracht, um das Enzym an dem Anionenaustauschharz hinreichend zu adsorbieren. Danach wurde das Anionenaustauschharz ausreichend mit 3,7 mM Phosphatpuffferlösung (pH 7,0) gewaschen.
Eine Substratlösung, die erhalten wurde durch Auflösen von Substraten (7,5 g/l Thymidin und 2,0 g/l Trifluormethyluracil) in einer 3,7 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) wurde kontinuierlich mit einem Durchsatz von 10 ml/h für 517 h durch die Säule geschickt. Das resultierende ausfließende Medium wurde mittels HPLC analysiert. Die Ausbeute an Trifluorthymidin aus dem aufgegebenen Trifluormethyluracil war 65 %.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen von Trifluorthymidin, das die folgenden Schritte aufweist:

Bewirken, daß Trifluormethyluracil und ein Desoxyribosedonor in einer Lösung, die eine der Gattung Serratia angehörende Bakterie enthält, in einem Temperaturbereich von 30-45 ºC miteinander reagieren, wodurch Trifluorthymidin erzeugt wird; und

Gewinnen des Trifluorthymidins aus der Lösung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Desoxyribosedonor ein Material ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 2'-Desoxyadenosin, 2'-Desoxyinosin, 2'-Desoxyguanosin, Thymidin, 2'-Desoxyuridin und 2- Desoxy-α-D-ribose-1-phosphorsäure besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die der Gattung Serratia angehörende Bakterie Serratia marcescens oder Serratia liauefaciens ist.

4. Verfahren zum Herstellen von Trifluorthymidin, das die folgenden Schritte aufweist:

Bereitstellen eines gegebenen Enzyms, das bei einer Reaktion zwischen Trifluormethyluracil und einem Desoxyribosedonor wirksam und von einer der Gattung Serratia angehörenden Bakterie erhalten ist oder eines immobilisierten Enzyms, das durch Immobilisieren des gegebenen Enzyms erhalten ist;

In-Kontakt-Bringen einer Lösung, die Trifluormethyluracil und den Desoxyribosedonor enthält, mit dem gegebenen Enzym oder dem immobilisierten Enzym in einem Temperaturbereich von 30-45 ºC, wodurch Trifluorthymidin erzeugt wird; und

Gewinnen des Trifluorthymidins aus der Lösung.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Desoxyribosedonor ein Material ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 2'-Desoxyadenosin, 2'-Desoxyinosin, 2'-Desoxyguanosin, Thymidin, 2'-Desoxyuridin und 2- Desoxy-α-D-ribose-1-phosphorsäure besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die der Gattung Serratia angehörende Bakterie Serratia marcescens oder Serratia liquefaciens ist und das Enzym ein Material ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Überstand, der durch Trennung eines aufgebrochenen Bakterienkörpers durch Zentrifugation erhalten ist, einer aktiven Fraktion, die durch Aussalzen des Überstands erhalten ist, einer acetonbehandelten Bakterie und einem gereinigten Material davon besteht.