DE68914384T2

DE68914384T2 - Verhütung der kalzifizierung einer prothese.

Info

Publication number: DE68914384T2
Application number: DE68914384T
Authority: DE
Inventors: Jean-Marie Girardot
Original assignee: Biomedical Design Inc
Current assignee: Biomedical Design Inc
Priority date: 1988-02-03
Filing date: 1989-01-31
Publication date: 1994-07-28
Anticipated expiration: 2009-02-01
Also published as: JP2772087B2; EP0364517A1; EP0364517B1; WO1989006945A1; EP0364517A4; JPH02503064A; DE68914384D1; CA1307743C

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verzögerung oder Verhinderung der Verkalkung einer in einem Säuger, wie einem Menschen, implantierten Prothese.
Die chirurgische Implantation von prothetischen Vorrichtungen (Prothesen) in Menschen und anderen Säugern wurde in den letzten Jahren mit steigender Häufigkeit durchgeführt. Solche Prothesen schließen ein Herzklappen, Gefäßtransplantate, Harnblasen, Herzbeutel (heart bladders), Vorrichtungen zur Unterstützung der linksventrikulären Funktion, Hüftprothesen, Silikongummi-Brustimplantate, Sehnenprothesen. Sie können aus natürlichen Geweben, anorganischen Materialien, synthetischen Polymeren oder deren Kombinationen hergestellt sein. Beispielsweise sind mechanische Herzklappenprothesen typischerweise aus festen Materialien hergestellt, wie Polymeren, Kohlenstoff (carbons) und Metallen. Sie verwenden eine Scheibenklappe (poppet occluder), die passiv auf Änderungen im interkardialen Druck oder Fluß reagiert. Klappen-Bioprothesen sind andererseits typischerweise hergestellt entweder aus Aortaklappen von Schweinen oder Rinder-Perikard. In jedem Fall wird das Gewebe mit Glutaraldehyd vorbehandelt und anschließend auf eine flexible Metallegierung oder einen polymeren Träger genäht, der anschließend mit einer ringförmigen poly(ethylenterephthalat) - Tuch-Benähung abgedeckt wird. Die zusammengesetzten Prothesen (oft in der Literatur als Bioprothesen bezeichnet) werden in einer 0,2%igen Glutaraldehyd-Lösung aufbewahrt. Beispiele finden sich u.a. in Helen E. Kambic et al., "Biomaterials in Artificial Organs", Chem. Eng. News, 14.04.1986, Seiten 31-48; Federick J. Schoen, "Pathology of Cardiac Valve Replacement", Kapitel 8, in D. Morse et al., Herausgeber, "Guide to Prosthetic Cardiac Valves", Springer Verlag, New York, 1985, Seiten 209-238.
Aus natürlichen Geweben hergeleitete Prothesen sind gegenüber mechanischen Vorrichtungen bevorzugt, da sie bestimmte signifikante klinische Vorteile aufweisen. Aus Gewebe hergeleitete Prothesen benötigen in der Regel keine Routine- Antikoagulationsbehandlung. Mißlingt die Implantation, so zersetzen sie sich in der Regel graduell, wobei der Prozeß über Monate oder Jahre abläuft. Mißlingt die Implantation bei einer mechanischen Vorrichtung, so tritt in der Regel eine Katastrophe ein.
Jede prosthetische Vorrichtung kann versagen aufgrund von Mineralisierung, insbesondere Verkalkung. Diese Ursache für die Prothesendegeneration ist besonders signifikant für aus Gewebe hergeleiteten Prothesen. Die Verkalkung ist in über 60% der Versagensfälle verantwortlich für das Versagen von kardialen bioprosthetischen Klappenimplantaten.
Trotz der klinischen Relevanz des Problems ist die Pathogenese der Verkalkung nur unvollständig verstanden. Derzeit ist offenbar keine effektive Therapie bekannt.
Das Verkalkungsproblem und seine Verhinderung sind beispielsweise beschrieben in R.J. Levy et al., "Bioprosthetic Heart Valve Calcification: Clinical Features, Pathobiology, and Prospect for Prevention", CRC Review in Biocompatibility, 2, 147-187 (1986); Frederick J. Schoen et al., "Calcification of Bovine Pericardium Used in Cardiac Valve Bioprotheses", Am. J. Pathol., 123, 134-145 (1986); Robert J. Levy et al., "Inhibition by Diphosphonate Compounds of Calcification of Porcine Bioprosthetic Heart Valve Cusps Implanted Subcutaneously in Rats", Circulation, 71, 349-356 (1985); Gershon Golomb et al., "Inhibition of Bioprosthetic Heart Valve Calcification by Sustained Local Delivery of Ca and Na Diphosphonate via Controlled Release Matrices", Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 32, 587-590 (1986); R.J. Levy et al., "Local Controlled-Release of Diphosphonates from Ethylenevinyllacetate Matrices Prevents Bioprothetic Heart Valve Calcification", Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 31, 459-463 (1985); und Federick J. Schoen et al., "Onset and Progression of Experimental Bioprosthetic Heart Valve Calcification", Lab. Invest., 52, 523-532 (1985).
Wie aus der vorstehenden Literatur bekannt ist, schließen frühere Bemühungen zur Verhinderung der Verkalkung von aus Gewebe abgeleiteten Prothesen ein:
(a) Vorbehandlung der Prothese mit Detergenzien,
(b) tägliche Injektion von Diphosphonat, wie 1- Hydroxyethylidendiphosphonsäure,
(c) kovalente Bindung eines Diphosphonats, wie 1-Hydroxy-3- aminopropan-1,1-diphosphonsäure, an bioprosthetische Gewebeproteine über verbleibende Aldehydgruppen, die nach einer Vorbehandlung mit Glutaraldehyd zurückbleiben und
(d) kontrollierte Abgabe von ortsspezifischen Diphosphonaten durch eine osmotische Pumpe oder eine kontrollierte Freigabematrix, wie ein Ethylen-Vinylacetat-Copolymer, typischerweise mit 1-Hydroxyethylidendiphosphonsäure oder 1-Hydroxy-3-aminopropan-1,1-diphosphonsäure, wie dem Diphosphonat. Geeignete Polymere sind beispielsweise in den US-PS 4 378 224, 4 164 560 und 4 391 797 beschrieben. Keine der Patentschriften scheint die Verhinderung der Verkalkung zu behandeln. Ähnliche Offenbarungen, die sich ebenfalls nicht auf die Verhinderung der Verkalkung von implantierten Prothesen zu beziehen scheinen, sind in der US-PS 4 357 312 angegeben. Zusätzlich zu den zwei erwähnten Diphosphonaten (siehe auch Krammsch et al., Circ. Res., 42, 562-571, (1978)) schließen andere Anti- Verkalkungsmittel, die für Anwendungen mit kontrollierter Abgabe geeignet erscheinen, Calciumkanalblocker, wie Nifedipin, (Henry et al., J. Clin. Invest., 68, 1366-1369 (1981)), Calciumchelatbilder wie Ethylendiamintetraessigsäure (Wartman et al., J. Atheroscler, Res., 7, 331-341 (1967)), ionische Antagonisten, wie Lanthantrichlorid (Krammsch, supra), Thiophenverbindungen (Krammsch, supra), und Phosphocitratanaloga, wie 2-Aminotricarballylat, ein.
Als Variation des Verfahrens (c) sind Vorbehandlungsverfahren von fixierten natürlichen Gewebeprothesen bekannt, die scheinbar keine kovalenten Bindungen einschließen. Zahlreiche Beispiele sind nachstehend angegeben. In der US-PS 4 402 697 ist die Vorbehandlung unter Verwendung einer Lösung eines wasserlöslichen Phosphatesters, wie Natriumdodecylhydrogenphosphat, beschrieben.
In der US-PS 4 405 327 ist eine ähnliche Vorbehandlung unter Verwendung einer Lösung eines wasserlöslichen quartären Ammoniumsalzes, wie Dodecyltrimethylammoniumchlorid beschrieben.
Schließlich ist in der US-PS 4 323 358 die Vorbehandlung unter Verwendung einer Lösung eines wasserlöslichen Salzes eines sulfatierten höheren aliphatischen Alkohols, wie Natriumdodecylsulfat, beschrieben.
Diese Verfahren verminderten die Verkalkung von bioprothetischem Gewebe, sie waren aber nicht frei von Schwierigkeiten. Beispielsweise weist die Vorbehandlung mit Detergenzien eine Kurzzeiteffektivität auf, ist aber kein geeigneter Ansatz für die Langzeitverhinderung von Gewebeverkalkung. Die Phosphonatinjektionen in effektiv wirksamen Mengen sind begleitet von starken Nebenwirkungen auf das Knochen- und allgemeine somatische Wachstum. Die Verwendung einer osmotischen Pumpe erfordert eine subdermale chirurgische Implantation der Pumpe, und die Langzeitversorgung des Anti-Verkalkungsmittels, das durch die Pumpe verabreicht wird, ist ein zu lösendes Problem. Die Langzeitverabreichung eines Anti-Verkalkungsmittels ist außerdem ein Problem bei kontrollierten Freisetzungsverfahren. Zusätzlich erleichtert die Vorbehandlung von allen kardialen Bioprothesen mit Glutaraldehyd anscheinend die Verkalkung des Prothesengewebes.
In der WO-A-84/01879 ist das Kontaktieren von biologischem Gewebe mit einem oberflächenaktiven Stoff zur Verminderung der Verkalkung des Gewebes nach der Implantation beschrieben. Beispielsweise ist die Verwendung von anionischen oberflächenaktiven Stoffen, wie N-Alkanoylaminosäuren der allgemeinen Formel R&sub1;CONR&sub2;CHR&sub3;COO- beschrieben. Die Intention ist die kovalente Bildung an das biologische Gewebe über die Carboxylsäuregruppe. Darüberhinaus sind die den oberflächenaktiven Stoff enthaltenden Lösungen so ausgelegt, daß sie nicht mit dem Fixiermittel, d.h. Glutaraldehyd, reagieren.
Es wird folglich ein effektiveres Verfahren zur Verminderung oder Verhinderung der Verkalkung von Prothesen gebraucht.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Verzögerung oder Verhinderung der Verkalkung einer in einem Säuger implantierten Prothese durch kovalente Bindung an die Prothese vor der Implantation eines Anti-Verkalkungsmittels in Form einer substituierten aliphatischen Carbonsäure oder deren Derivat. Die Säure enthält 8 bis 30 C-Atome und kann unverzweigt oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt sein. Die kovalente Bindung erfolgt über den Substituentenrest, der ein Amino-, Mercapto-, Carboxyl- oder Hydroxylrest sein kann. Die Erfindung betrifft weiterhin nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellte Prothesen, die geeignet zur Implantation in Säuger sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Anti- Verkalkungsmittel eine substitutierte aliphatische Carbonsäure mit 12 bis 24 C-Atomen und nicht mehr als 3 C-C- Doppelbindungen. Insbesondere bevorzugte Anti- Verkalkungsmittel sind unverzweigte substituierte aliphatische Carbonsäuren mit 12 bis 22 C-Atomen und einer C-C- Doppelbindung.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist verwendbar zur Verzögerung oder Verhinderung der Verkalkung einer in einem Säuger, wie in einem Menschen, implantierten Prothese, es ist insbesondere anwendbar hinsichtlich solcher Prothesen, die besonders anfällig gegenüber Degeneration infolge von Verkalkung sind.
Der Ausdruck "Prothese" schließt jegliche Vorrichtungen ein, die in einen Säuger implantiert werden. Der Ausdruck schließt ein Herzklappen und andere Herzkomponenten, Gefäßersatzteile oder -transplantate, künstliche Herzen, Harnleiter und Harnblasenersatzteile, Darm- und Gewebe-Resektionen allgemein, Vorrichtungen zur Unterstützung der linksventrikulären Funktion, Hüftersatzteile, Silikongummi-Brustimplantate, künstliche Sehnen, Elektroden, Katheter, usw. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung wichtig für Prothesen, in denen die Verkalkung nach der Implantation ein klinisches Problem darstellt. Solche Prothesen sind dem Fachmann bekannt. Die vorliegende Erfindung kann auf im wesentlichen jede Prothese angewendet werden, sie bringt allerdings nicht so große Vorteile für Prothesen, bei denen die Wahrscheinlichkeit für eine Degeneration oder Fehlfunktion infolge von Mineralisierung gering ist.
Das Material, aus dem die Prothese hergestellt ist, ist nicht kritisch. Die Prothese kann hergestellt sein aus natürlichen Geweben, einschließlich Rinder-, Schafs-, Schweinegewebe und menschlichem Gewebe, Metallen, synthetischen und organischen Materialien, wie Polyurethanen, Polyetherurethanen, Silikonen, Polyestern, Polycarbonaten, Polyacrylaten und -methacrylaten, Polyacetaten, Polyolefinen, wie Polyethylen und Polypropylen, Polyalkohlen, Kombinationen und Derivaten daraus. Andere bekannte Materialien können ebenfalls verwendet werden.
Im allgemeinen ist das Anti-Verkalkungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus aliphatischen Carbonsäuren und Alkalimetallsalzen und -derivaten davon, wobei jede der Säuren 8 bis 30 C-Atome enthalten kann. Vorzugsweise enthält das Anti-Verkalkungsmittel 12 bis 22 oder 24 C-Atome, insbesondere 15 bis 20 C-Atome. Bevorzugte Alkalimetallsalze sind die Kalium- und Natriumsalze.
Das Anti-Verkalkungsmittel kann eine unverzweigte oder verzweigte Verbindung sein, die geeignet substituiert ist. Bis auf den Substituenten, durch den die kovalente Bindung erfolgt, ist die Art und die Anzahl der Substituenten nicht kritisch, vorausgesetzt, daß sie die Anti- Verkalkungseigenschaften der Verbindung nicht nachteilig beeinflussen und keine signifikanten nachteiligen physiologischen Effekte nach der Implantation der Prothese aufweisen, die mit einem solchen Mittel behandelt ist. Allgemein sollte die Anzahl und Natur der vorliegenden Substituenten so gewählt sein, daß die Ausbildung eines sehr starren Moleküls vermieden wird. Beispiele für Substituenten schließen ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Cycloalkinyl-, Aryl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Aryloxy-, Carbonyl-, Amino-, Alkylamino-, Dialkylamino-, Arylamino-, Diarylamino-, Alkylarylamino-, Mercapto-, Alkylthio-, Arylthioreste oder Halogenatome. Wie nachstehend detaillierter beschrieben, sollte mindestens einer der Substituenten ausgewählt sein aus Amino-, Hydroxy-, Mercapto- oder Carboxylsubstituenten, um die gewünschte kovalente Bindung herstellen zu können.
Die die Anti-Verkalkungsmittel umfassenden erfindungsgemäßen Säuren können gesättigt oder ungesättigt sein. Die Unsättigung kann monoolefinisch oder polyolefinisch sein infolge des Vorliegens einer oder mehrerer ethylenischer oder acetylenischer Bindungen in der Verbindung, d.h. einer oder mehrerer C-C-Doppelbindungen, einer oder mehrer C-C- Dreifachbindungen, oder einer Kombination einer oder mehrerer C-C-Doppelbindungen und einer oder mehrerer C-C- Dreifachbindungen. Darüber hinaus können solche Doppel- und Dreifachbindungen an jeder Stelle des Moleküls vorliegen. Weiterhin können C-N-Doppel- und/oder Dreifachbindungen vorliegen, jedoch dürfen solche Bindungen weder die Anti- Verkalkungseigenschaften, noch die physiologische Kompatibilität der Verbindung beeinträchtigen. C-C- Doppelbindungen sind die bevorzugten ungesättigten Bindungen, wobei eine oder zwei dieser Bindungen insbesondere bevorzugt ist. Insbesondere bevorzugt hat das Anti-Verkalkungsmittel eine einzige C-C-Doppelbindung in der Carbonsäurehauptkette, unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit von ungesättigten Bindungen in irgendeinem gegebenenfalls vorliegenden Substituenten.
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines einzelnen Anti- Verkalkungsmittels, wie auch von Gemischen aus zwei oder mehreren unterschiedlichen Anti-Verkalkungsmitteln. Wird ein Gemisch verwendet, so kann das Gemisch eine Säure oder deren Salz einschließen, sowie mehr als eine freie Säure oder Salze verschiedener Säuren, wie auch Derivate davon. Die Verwendung des Ausdrucks "Anti-Verkalkungsmittel" in der Beschreibung und den Ansprüchen schließt demnach einzelne Anti- Verkalkungsmittel und beliebige Gemische von zweien und mehreren Anti-Verkalkungsmitteln ein, einschließlich solcher wie vorstehend beschriebener Gemische.
Der Ausdruck "Derivat" schließt jede Verbindung ein, die mindestens einen Teil oder Rest aufweist, der im wesentlichen eine wie vorstehend beschriebene aliphatische Carbonsäure ist. Diese aliphatische Carbonsäure kann zu Zwecken der Klarheit durch nachstehende allgemeine Formel wiedergegeben werden
wobei der Rest R eine aliphatische Kette ist, in der sich die Carboxylgruppe vorzugsweise an einem Ende der Kette befindet. Ein Rest der im wesentlichen aus einer solchen aliphatischen Carbonsäure besteht, sollte mindestens den Teil
der aliphatischen Carbonsäure enthalten. Vorzugsweise enthält der Rest den Teil
der aliphatischen Carbonsäure. Wie nachstehend erläutert wird, sollte bei Verwendung eines Derviats das Derivat über den aliphatischen Carbonsäureteil des Moleküls an die Prothese kovalent gebunden sein, damit nicht der aliphatische Carbonsäureteil von der Prothese infolge von Hydrolyse oder anderen Reaktionen des Derivats entfernt werden kann.
Aus praktischen Gründen sind die Derivate der aliphatischen Carbonsäuren, die die erfindungsgemäßen Anti-Verkalkungsmittel umfassen, typischerweise entweder Ester oder Amide, wobei Ester bevorzugt sind. Beispiele für geeignete Klassen von Estern sind zur Erläuterung nachstehend angeben.
(1) Aliphatische, cycloaliphatische und aromatische Ester der aliphatischen Carbonsäuren,
(2) Phosphorsäurester der aliphatischen Carbonsäuren und
(3) Mono- und Polyester einer oder mehrerer aliphatischer Carbonsäuren, die gleich oder verschieden sein können, mit zwei- oder mehrwertigen aliphatischen oder aromatischen Alkoholen, wahlweise über eine Phosphorsäureestergruppe, wobei Beispiele solcher Mono- und Polyester einschließen 1-Monoacylglycerine, 2- Monoacylglycerine, 1,2-Diacylglycerine, Triacylglycerine, Alkyletheracylglycerine, Glykosyldiacylglycerine, Phosphoglyceride, Plasmalogene, Sphingolipide, Wachse und ähnliche.
Beispiele unter die vorstehende Definition fallender aliphatischer Carbonsäuren schließen ein Octansäure, 2- Aminooctansäure, Oct-3-ensäure, 2-Methylnonansäure, 10- Hydroxydec-5-insäure, Undecansäure, Phenyltetradecansäure, 3- Chlor-8- (2-hydroxylethoxy) -pentadec-4-en-9-insäure, Hexadecansäure, Hexadec-9-ensäure, 3,7-Dimethylhexadec-9- ensäure, Octadec-9-ensäure (Ölsäure), 2-Aminooctadec-9- ensäure, Octadec-9,12-diensäure, Octadec-9,12,15-triensäure, Eicosansäure, Eicos-5,8,11,14-tetraensäure, Tetracosansäure. Diese Säuren werden in einer geeigneten substituierten Form eingesetzt, wie als 2-Aminooctansäure, 10-Hydroxydec-5- insäure, 12-Aminododecansäure, 2-Aminooctadec-9-ensäure (2- Aminoölsäure) und 2,2-Dicarboxyloctadec-9-ensäure.
Wie schon erwähnt, schließen die Anti-Verkalkungsmittel die Alkalimetallsalze aliphatischer Carbonsäuren ein. Weiterhin sind Ester solcher Säuren mit einwertigen Alkoholen eingeschlossen, wie auch Mono- und Polyester mit mehrwertigen Alkoholen, beispielsweise mit Methanol, Ethanol, 2-(4- Ethoxyphenyl)-ethanol, 2-Chlorpropanol, 1-Butanol, 2-Butanol, Hex-3-en-1-ol, Octanol, Eicosanol, Phenol, 3-Methylphenol, 1,2-Ethandiol, 1,4-Butandiol, Glycerin, L-Glycerin-3- Phosphorsäure, Phosphorsäure, Sphingosin, Dihydrosphingosin, Cholesterin, Lanosterin, Cholsäure, Aldosteron, Esteron, Testosteron.
Wie schon erwähnt, beinhaltet das erfindungsgemäße Verfahren die kovalente Bindung eines Anti-Verkalkungsmittels an eine Prothese. Als Folge der kovalenten Bindung ist das Anti- Verkalkungsmittel fest mit der Oberfläche der Prothese verbunden. Allerdings kann das Mittel auch in das massive Material wandern und mit einem Teil oder dem ganzen Material assoziiert sein, aus dem die Prothese hergestellt ist, abhängig von einer Zahl von Faktoren, wie der Porosität des Materials und der Permeabilität solcher Materialien bezüglich des Anti-Verkalkungsmittels. Für die erfindungsgemäßen Zwecke wird kein Unterschied gemacht, je nachdem ob sich das Mittel nur auf der Oberfläche befindet, oder teilweise oder ganz in das massive Material penetriert ist. Der Ausdruck "kovalente Bindung" und dessen Variation schließen die Bindung des Anti- Verkalkungsmittels ausschließlich an die Prothesenoberfläche, wie auch die Bindung des Anti-Verkalkungsmittels an Teile oder die Gesamtheit des massiven Materials ein, aus dem die Prothese hergestellt ist.
Die Reaktionsbedingungen für die kovalente Bindung des Anti- Verkalkungsmittels an die Prothese können variieren, abhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit von Biomaterialien, dem Typ der in der Prothese vorliegenden funktionellen Gruppen, der Natur des Anti-Verkalkungsmittels und der zur Bindung verwendeten chemischen Umsetzung. Im allgemeinen wird die Bindungsreaktion in einer wäßrigen Lösung ausgeführt, die bei einem geeigneten pH gepuffert sein kann. Die Natur des Puffers wird nicht als kritisch angenommen. Beispiele geeigneter Puffer schließen ein Phosphat-, Tartrat-, Bicarbonat-, Borat-, Citrat-, Format-, Acetat-, N-2-Hydroxyethylpiperazin-'- ethansulfonsäure- (HEPES), Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan- (TRIS), 3-(N-Morpholin)-propansulfonsäure-Puffer (MOPS) ein. Zusätzliche Details von Puffern sind beispielsweise in Gerald D. Fasman, Herausgeber, "CRC Handbook of Biochemistry and Molecular Biology", 3. Auflage, Physical and Chemical Data Volume I, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, 1976, Seiten 354-377, beschrieben. Zusätzlich ist die Pufferkonzentration nicht kritisch und kann in einem weiten Bereich variieren. Der pH des Puffers kann außerdem in einem weiten Bereich variieren, typischerweise von 6 bis 14. Vorzugsweise ist der pH im Bereich von 7 bis 11, insbesondere 9 bis 11. In einem solchen Puffer liegt das Carbonsäure-Anti-Verkalkungsmittel in der Regel in Form seines Alkalimetallsalzes, beispielsweise des Natriumsalzes, vor.
Die Konzentration des Anti-Verkalkungsmittels in der wäßrigen Lösung kann beispielsweise von 0,1 Gew.-% oder weniger bis 20 Gew.-% oder mehr variieren. Praktischerweise sind niedrigere Konzentrationen bevorzugt, insbesondere Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 5%.
Die Bindungsreaktion kann bei jeder Temperatur ausgeführt werden, die die Prothese nicht nachteilig beeinflußt, wie von 0ºC bis 100ºC. Solange die Prothese zum Teil oder als Ganzes aus Biomaterial besteht, wie Gewebe, sollte die Temperatur typischerweise 40ºC nicht übersteigen. Aus praktischen Gesichtspunkten werden diese wäßrigen Lösungen Umgebungstemperatur haben. Einwirkzeiten können über einen weiten Bereich variieren, wie von 5 Minuten bis einer Woche, abhängig von den jeweilig eingesetzten Bindungsreaktionen und den anderen Bedingungen. Im allgemeinen scheinen lange Einwirkzeiten, wie mehr als eine Woche, nicht notwendig zu sein. So kann die Einwirkungszeit im Bereich von 10 Minuten bis 24 Stunden liegen. Für Gewebematerialien können jedoch im Gegensatz zu synthetischen polymeren Materialien Bindungsreaktionen bei Raumtemperatur für Zeiträume von 5 Tagen oder sogar länger ausgeführt werden, um sicherzustellen, daß eine geeignete Menge des Mittels kovalent an die Prothese gebunden ist.
Nach ausreichender Reaktionszeit (Inkubation) wird die Prothese abgespült oder gewaschen, um überschüssige Reaktionslösung zu entfernen. Die Spül- oder Waschlösung kann destilliertes Wasser, entsalztes Wasser, ein Puffer oder eine andere geeignete Flüssigkeit sein. Wenn die Prothese Biomaterial enthält, darf sie nicht trocken werden. Deshalb werden Biomaterialprothesen vorzugsweise in beispielsweise 0,2% gepufferter wäßriger Glutaraldehydlösung aufbewahrt.
Wird beispielsweise 2-Aminoölsäure oder dessen Salz kovalent an eine Bioprothese gebunden, so ist die Behandlungslösung typischerweise ein Puffer, wie ein Boratpuffer mit einem pH im Bereich von 8 bis 11. Die Inkubationszeit kann von 2 Stunden oder weniger bis 24 Stunden oder mehr betragen, vorzugsweise 48 Stunden bis 120 Stunden für Gewebeprothesen. Die Inkubationstemperatur kann im Bereich von 0ºC bis 40ºC liegen, vorzugsweise von 20ºC bis 35ºC.
Allgemein kann die kovalente Bindung des Anti- Verkalkungsmittels an die Prothese durch eine Vielzahl bekannter Verfahren erreicht werden. Solche Verfahren verwenden typischerweise reaktive Substituentengruppen wie Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl- und Mercaptogruppen. Beispielhafte Bindungsverfahren verwenden Carbonsäureazidgruppen, Carbonsäurechloride, Carbodiimide und Woodward's Reagenzien, Diazotierungen, Isothiocyanate, Cyanurchlorid, Cyanogenbromid, Titanchloridaktivierung, die Ugi-Reaktion, die Verwendung von Kupplungszwischenprodukten, wie organofunktionellen Silanen, Peptidbindungsbildung, die Bildung von Schiff'schen Basen, wie auch die Bildung einer Esterbindung zwischen einem Carboxylgruppensubstituenten und einer freien Hydroxylgruppe an der Prothese. Beispiele finden sich in Howard H. Weetall, "Immobilization by Covalent Attachment and by Entrapment", Kapitel 6 in Ralph A. Messing, Herausgeber, "Immobilized Enzymes for Industrial Reactors", Academic Press, New York, 1975, Seiten 99-123, und William H. Scouten, Herausgeber, "Solid Phase Biochemistry. Analytical and Synthetic Aspects", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1983. Darüber hinaus können nach der Bindung des Anti- Verkalkungsmittels an die Prothese weitere chemische Modifikationen durchgeführt werden. Beispielsweise kann die C- N-Doppelbindung der Schiff'schen Base reduziert werden, beispielsweise durch Umsetzung mit Natriumborhydrid unter milden Bedingungen, um die Stabilität des verbundenen Materials zu erhöhen, z.B. gegen Hydrolyse. Es ist bekannt, daß nicht alle Verfahren mit allen gegebenen Prothesen verwendet werden können. Die für die Bindung verwendete chemische Umsetzung ist teilweise abhängig von der Art der funktionellen Gruppen, die in der Prothese vorliegen.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung, schränken sie jedoch nicht ein. In den Beispielen sind alle Prozentangaben Gewichtsprozente und alle Temperaturen in ºCelsius angegebenen, wenn nicht anders vermerkt.

Beispiel 1

Das erfindungsgemäße Verfahren wird erläutert durch die Beschreibung der kovalenten Bindung eines Amino-substituierten Ölsäure-Anti-Verkalkungsmittels an Schweine-Perikard-Gewebe.

I. Bildung des Ölsäuremittels

Eine substituierte Ölsäureverbindung wird synthetisiert in einer Form, die geeignet ist zur kovalenten Bindung an Glutaraldehyd-behandeltes Schweine-Perikard-Gewebe oder andere natürliche Gewebe, durch Bindungen, die die Glutaraldehyd- Vorbehandlung des Gewebes vorteilhaft ausnutzen. Zur Herstellung der Verbindung, 2-Aminoölsäure, wurde im allgemeinen dem von F. Amat Guerri, in Grasas Aceites (Seville), 26,90 (1975) beschriebenen Verfahren gefolgt. Die Folge von nachstehend beschriebenen Reaktionsschritten wurde dreimal wiederholt, mit ähnlichen Ergebnissen, um eine Menge von Zwischenprodukten und das Endprodukt zu sammeln. Es ist allerdings nur eine Reaktionssequenz beschrieben.

A. Herstellung von 2-(Hexadec-7-enyl)-propandicarbonsäure

Ein 250 ml fassender Dreihalsrundkolben wurde mit einem 50 ml fassenden druckausgeglichenen Seitenarmtropftrichter, einem Kühler und einem Gummiseptum versehen. Der Tropftrichter und der Kühler waren mit Gummisepten versehen. Der Kolben wurde kontinuierlich mit trockenem Stickstoff gespült (Matheson extra dry grade), wobei der Stickstoff über eine Injektionsspritzennadel durch das auf einem der drei Hälse des Kolbens befindliche Gummiseptum eingeführt wurde. Der Stickstoff entwich durch eine weitere Injektionsspritzennadel, die durch das auf dem Kühler befindliche Septum geführt war. Unter Verwendung einer Injektionsspritze wurden im Kolben 21,5 ml (0,155 Mol) Diisopropylamin (99%, Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, Wisconsin) und 50 ml trockenes Tetrahydrofuran (THF) (Gold Label, 99,9%, Aldrich Chemical Company, Inc.) vorgelegt. Die erhaltene Lösung wurde in einem Eis-Salz-Bad unter Rühren mit einem Magnetrührer gekühlt. Zur kalten Lösung (im Bereich von -20 bis -10ºC) wurden langsam 60 ml m-Butyllithium in Hexan (Aldrich Chemical Company, Inc.) eingetragen, das durch eine Injektionsspritze in den Tropftrichter gegeben wurde. Das so erhaltene Gemisch wurde für zwei Stunden gerührt, wonach 20,0 g (0,071 Mol) Ölsäure (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania) tropfenweise mit dem Tropftrichter eingetragen wurden innerhalb einer Stunde (Befüllung durch Injektionsspritze). Im Verlauf der Zugabe wurde die Reaktionslösung dunkelrot, was die Bildung des Dianions anzeigt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend tropfenweise innerhalb etwa 30 Minuten mit einem Gemisch aus 51 g Hexamethylphosphoramid (Aldrich Chemical Company, Inc., 99%, getrocknet über Calciumhydrid und über Molekularsieb gelagert) und 50 ml THF eingetragen, wobei die beiden Flüssigkeiten zuvor mit einer Injektionsspritze in den Tropftrichter gegeben wurden. Das erhaltene Gemisch wurde für eine Stunde gerührt und in ein 600 ml fassendes Becherglas mit 100 g festem Kohlendioxid gegeben (die rote Farbe verschwand sofort beim Kontakt mit dem Trockeneis). Das Gemisch wurde sodann über Nacht gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch, nun eine blaßgelbe Lösung bei Raumtemperatur, mit etwa 40 ml konzentrierter Salzsäure angesäuert, einer Menge, die ausreicht, um blaues Lackmuspapier rot zu färben. Die angesäuerte Lösung wurde sodann dreimal mit 100 ml Anteilen Diethylether (Fisher Scientific) extrahiert. Die Etherextrakte wurden zusammengegeben, einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat (Reagenzqualität, J.T. Baker Chemical Co.) getrocknet. Die Etherlösung wurde sodann vom Trockenmittel dekantiert und unter vermindertem Druck mit Hilfe eines Rotationsverdampfers (Buchi Rotovap, Modell RE 120) verdampft. Der Rückstand war ein blaßgelber Halbfeststoff mit einem Gewicht von 20,2 g (87% Ausbeute).

B. Herstellung von Diethyl-2-(hexadec-7-enyl)- propandicarboxylat

In einem 250 ml fassenden Einhalsrundkolben, der mit einem Kühler ausgestattet war, wurde eine Lösung von 5 g (15,3 mMol) des in Schritt A erhaltenen Produkts mit 4 Tropfen konzentrierter Salzsäure als Katalysator und 100 ml 95%igen Ethanols (Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri) für zwei Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde mittels Destillation bei Atmosphärendruck entfernt. Der blaßgelbe Rückstand wurde sodann bei etwa 0,1 mm Hg destilliert, um 5,1 g (87%) eines klaren farblosen Öls zu erhalten mit einem Siedepunkt von 140 bis 143ºC bei 0,1 mm Hg. Durch Infrarotanalyse konnte das Produkt als Diethyl-2- (hexadec-7-enyl)-propandicarbonsäure nachgewiesen werden (Absorptionsmaxima bei 1735, 1710 und 1190 cm&supmin;¹)

C. Herstellung von Ethyl-2-Hydroxyiminooctadec-9-enoat

Es wurde das Verfahren von D.J. Drinkwater und P.W.G. Smith, J. Chem. Soc., 1971, 1305 angewendet. Ein 50 ml fassender Dreihalsrundkolben wurde mit einem druckausgeglichenen Tropftrichter versehen und mit 1,0 g (2,62 mMol) Diethyl-2- (hexadec-7-enyl)-propandicarboxylat beschickt. Die Verbindung wurde auf etwa -10ºC unter magnetischen Röhren abgekühlt. Sodann wurden 0,27 g (2,62 mMol) n-Butylnitrit (Aldrich Chemical Company, Inc.) eingetragen, anschließend innerhalb einer Stunde eine Natriumethoxidlösung, hergestellt durch Umsetzung von 0,06 g Natriumspähnen (Aldrich Chemical Company, Inc.) mit 1,8 ml absolutem Ethanol. Sodann wurde das Reaktionsgemisch über Nacht bei -10ºC gerührt. Ethanol wurde unter vermindertem Druck sodann entfernt und der Rückstand wurde mit gleichen Teilen Eiswasser gemischt. Die erhaltene Lösung wurde sodann mit Diethylether gewaschen und der pH durch Zugabe von Salzsäure unter Kühlen in einem Eisbad auf pH 5 eingestellt. Die angesäuerte Lösung wurde sodann zweimal mit 50 ml Anteilen Diethylether extrahiert. Die Etherextrakte wurden zusammengegeben, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und vom Trockenmittel dekantiert. Der Ether wurde unter vermindertem Druck entfernt, es wurden 0,79 g (85%) des gewünschten Produkts erhalten, bestimmt durch Infrarotanalyse (Absorptionsmaxima bei 3260 und 3734 cm&supmin;¹).

D. Herstellung von 2-Hydroxyiminooctadec-9-enonsäure

Ein Gemisch aus 0,6 g (1,77 mMol) Ethyl-2-hydroxyiminooctadec- 9-enoat und 20 ml 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung wurden unter Rückfluß 10 Minuten erhitzt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch abgekühlt, mit konzentrierter Salzsäure angesäuert und zweimal mit 50 ml Anteilen Diethylether extrahiert. Sodann wurden die Extrakte zusammengegeben, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und vom Trockenmittel dekantiert. Der Ether wurde entfernt, wobei ein leicht gelbes Öl erhalten wurde, was aus einem Ether-leichtes Petroleum- Gemisch (Siedepunkt 40 bis 60ºC, Fisher scientific) rekristallisiert wurde, um 0,5 g (91%) 2-Hydroxyiminooctadec- 9-enonsäure zu ergeben. Die Infrarotanalyse des Materials zeigte Absorptionsmaxima bei 3220, 3080 und 1695 cm&supmin;¹.

E. Herstellung von 2-Aminoölsäure

Ein Gemisch aus 0,7 g 2-Hydroxyiminooctadec-9-enonsäure, 0,77 g Zinkpulver (Fluka Chemical Corporation, Ronkonkoma, New York) und 12,3 ml eines 2:1 Eis-Essig:Wasser-Gemisches wurde für 90 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch durch einen feinen Glastrichter (fine scintered glass funnel) in heißem Zustand filtriert und das Filtrat wurde in einem Kühlschrank über Nacht abgekühlt, wobei ein Feststoff ausfällt, der durch einen Büchner-Trichter filtriert wird. Es werden 0,61 g (91%) weiße, pulverförmige 2- Aminoölsäure erhalten mit einem Schmelzpunkt von 216 bis 217ºC. Die Verbindung wurde durch Infrarotspektroskopie in einer Natriumbromidpille untersucht. Absorptionsmaxima waren bei 3200 bis 3500 und bei 1650 cm&supmin;¹ zu beobachten.

II. Kovalente Bindung von 2-Aminoölsäure an Schweine- Perikardzipfel

2-Aminoölsäure wird als Natriumsalz an 2 von 10 Gruppen Glutaraldehyd-vorbehandelter Schweine-Perikardzipfel (bovine pericardium cusps) gebunden (die Zipfel wurden von einer Schlachterei erhalten und in 0,2%iger wäßriger Glutaraldehydlösung gelagert) durch einfaches Inkubieren der Zipfel über Nacht bei Raumtemperatur in einer 1,0%igen Lösung des Anti-Verkalkungsmittels in 0,05 M Natriumboratpuffer bei pH 11. Die Bindung trat über übrige Aldehydgruppen durch Bildung einer Schiff'schen Base ein. Nach der Inkubation wurden die Zipfel 10mal mit 10 ml Anteilen physiologischer Kochsalzlösung gespült (0,9% wäßriger Kochsalzlösung).
Jede Gruppe der wie vorstehend behandelten Zipfel wurde subkutan in den ventralen mittel-abdominalen Bereich einer Gruppe von 5 drei Wochen alten Sprague-Dawley-Ratten (Charles River Breeding Laboratories, Inc., Wilmington, Massachusetts) implantiert, 2 Zipfel pro Ratte (einer an jeder Seite). Das Implantationsverfahren war im wesentlichen gleich dem in der US-PS 4 402 697 beschrieben Verfahren. Eine Gruppe von 10 nicht behandelten Zipfeln wurde im ersten Kontrollexperiment implantiert. Als zweites Kontrollexperiment wurde eine Gruppe von 10 Zipfeln in 0,05 M pH 11 Natriumboratpufferlösung inkubiert, die kein Anti-Verkalkungsmittel enthielt.
Zwei separate Studien wurden durchgeführt. Nach 21 Tagen wurden die implantierten Zipfel aus den Ratten entfernt und mittels Atomabsorptionsspektroskopie auf Calcium untersucht, wie von Federick J. Schoen et al., Am. J. Pathol. 123, 134-145 (1986), supra, beschrieben. Die Tiere wurden geopfert und autopsiert, keine Abnormitäten wurden beobachtet. Eine Gruppe von 10 unbehandelten Zipfeln, die nicht implantiert waren, wurden außerdem auf Calcium untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt. Tabelle I Einfluß der kovalenten Bindung von 2-Aminoölsäure auf die Verkalkung von Schweine-Perikardzipfeln, die subkutan in Ratten implantiert waren Gruppe Gewebe-Ca-Konzentration a unbehandelt implantiert nicht implantiert a Über Nacht inkubiert bei Umgebungstemperatur, 0,05 M pH 11 HEPES-Puffer.
Die Effektivität der kovalent gebundenen 2-Aminoölsäuren zur Inhibition der Mineralisierung ist aus Tabelle I klar ersichtlich. Die Calciumkonzentrationen in den behandelten Geweben waren im gleichen Bereich wie oder vielleicht sogar niedriger als die Bereiche der Calciumkonzentration, die normalerweise im Gewebe vorliegt.
Die Bedeutung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird deutlicher beim Betrachten des Effekts von im allgemeinen ähnlichen, aber nicht kovalent gebundenen Anti-Verkalkungsmitteln auf den Verkalkungsprozeß. Eine solche Studie ist detailliert in den Beispielen 2 und 3 beschrieben.

Beispiel 2

Zahlreiche Verfahrensvariablen wurden in bezug auf die Vorbehandlung von Gewebeprothesen vor den Implantationsexperimenten in bezug auf ein nicht-kovalent gebundenes Anti-Verkalkungsmittel durchgeführt.

Inkubationszeit

Glutaraldehyd-behandelte Schweine-Perikardzipfel wurden bei Umgebungstemperatur in 1 Gew.-%iger wäßriger Lösung von Natriumoleat inkubiert, die 14C-markiertes Natriumoleat enthielt, für 1 und 7 Tage. Der pH der Lösung betrug 10,6. Die Zipfel wurden 10mal mit 10 ml Anteilen 0,05 M HEPES-Puffer bei pH 7,4 gewaschen. Die Zipfel wurden in bezug auf die Natriumoleatanreicherung analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle II dargestellt. Tabelle II Natriumoleatkonzentration im Gewebe nach 1 und 7 Tagen Inkubationsperiode Gewebe-Na-Oleatkonzentration Tag Tage Gewebe
Die in Tabelle II dargestellten Daten zeigen im wesentlichen keinen Unterschied in der Aufnahme von Natriumoleat im Gewebe, woraus folgt, daß Inkubationszeiten von mehr als einem Tag mit nicht-kovalent gebundenem Natriumoleat die Aufnahme nicht wesentlich erhöht.

Effekt des pH des Waschwassers

Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde wiederholt, unter Verwendung einer Natriumoleatkonzentration von 10% anstatt von 1% und einer Inkubationszeit von einem Tag. Drei Gruppen von Zipfeln wurden verwendet. Eine Gruppe von Zipfeln wurde nicht gewaschen, sie wurden abgetupft, um überflüssige Flüssigkeit zu entfernen. Die zweite Gruppe wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und die dritte Gruppe mit pH 7,4 HEPES-Puffer, wie er vorstehend beschrieben ist. In Tabelle III sind die Ergebnisse zusammengefaßt. Tabelle III Natriumoleatkonzentration in Gewebe unter verschiedenen Waschbedingungen Waschmedium Gewebe-Na-Oleatkonzentration Keines (abgetupft) Destilliertes Wasser Puffer Gewebe
Man kann erkennen, daß das Waschen mit Puffer zu einer geringen Menge an entferntem Natriumoleat vom Gewebe während des Waschschrittes führt. Zusätzlich scheint die Verwendung von 10% Natriumoleatlösung die Aufnahme von Natriumoleat im Gewebe signifikant zu erhöhen, im Vergleich zu einer 1%igen Natriumoleatlösung.
Um den Einfluß eines ausgedehnten Waschzyklus zu ermitteln, wurde das vorstehende Experiment wiederholt. Nach dem Ende der Inkubationsperiode wurden Zipfel in 10 ml destilliertes Wasser oder pH 7,4 HEPES-Puffer eingetaucht. Die Zipfel wurden auf einer Schüttelfläche bei 37ºC für 16 Tage bewegt. Die Zipfel wurden dann auf Gewebenatriumoleat analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt. Tabelle IV Natriumoleatkonzentration in Gewebe unter verschiedenen Waschbedingungen Waschbedingungen Gewebe-Na-Oleatkonzentration Destilliertes Wasser Puffer Gewebe
Die Daten aus Tabelle IV zeigen nochmals die Vorteile einer pH 7,4 Waschlösung im Vergleich zum Waschen mit destilliertem Wasser.

Beispiel 3

Zwei Gruppen von jeweils 10 Glutaraldehyd-behandelten Schweine-Perikatzipfeln pro Gruppe wurden für zwei Stunden bei Raumtemperatur in Lösungen mit 1% Natriumoleat (Fisher Scientific) inkubiert. Die erste Lösung wurde durch Lösen des Natriumoleats in 0,05 M pH 7,4 HEPES-Puffer erhalten. Die zweite Lösung wurde durch Lösen des Natriumoleats in destilliertem Wasser erhalten, der pH der Lösung betrug 10,6.
Jede Gruppe von Zipfeln wurde subkutan Ratten implantiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Zwei Kontrollgruppen der gleichen Größe wurden außerdem mit Zipfeln versehen, die nicht mit Natriumoleat vorbehandelt waren.
Die erste Kontrollgruppe von Ratten erhielt täglich sterile Kochsalzinjektionen subkutan, eine Injektion von 500 ul pro Tier pro Tag. Die Kochsalzlösung war 0,9%ige wäßrige Natriumchloridlösung mit einem pH von 7,4. Die zweite Kontrollgruppe erhielt gleiche tägliche Injektionen von Natriumoleatlösung in einer Menge von 100 mg Natriumoleat pro Kilogramm Körpergewicht pro 24 Stunden-Periode.
Nach 14 Tagen wurden die Zipfel von allen vier Gruppen herausgenommen. Die Tiere wurden geopfert und autopsiert, wobei die Natriumoleat-injizierten Tiere niedrigere Blutcalciumwerte aufwiesen. Die Zipfel wurden auf Calcium mittels Atomabsorptionsspektroskopie untersucht, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Beispiele sind in Tabelle V zusammengefaßt. Tabelle V Einfluß der Natriumoleatbehandlung auf die Verkalkung von Schweine-Perikatzipfeln die subkutan in Ratten implantiert waren Gruppe Gewebe Ca-Konzentration a Erste Kontrollgruppe (Salzlösung-Injektion) Zweite Kontrollgruppe (Na-Oleat-Injektion) Na-Oleat-Vorbehandlung a Wiedergegeben als der mittlere Wert in ug Calcium pro mg Zipfelgewebe ± Standardabweichung
Die Daten in der vorstehenden Tabelle zeigen, daß die Vorbehandlung einer Prothese mit Natriumoleat die Verkalkung vermindert. Die Verminderung der Verkalkung betrug größenordnungsmäßig 30 bis 50%, basierend auf der ersten Kontrollgruppe. Eine solche Verminderung wird als ausreichend für die Langzeitverzögerung oder Verhinderung der Verkalkung betrachtet. Es ist wahrscheinlich, daß das Natriumoleat mit dem Prothesengewebe nur auf der Basis von Wasserstoffbindungen und Van der Waals-Kräften gehalten wird. Solche Assoziierung kann einfach unterbrochen werden, wobei die Wahrscheinlichkeit gegeben ist, daß Natriumoleat von der Implantationsstelle entfernt wird, wodurch es weniger effektiv ist als kovalent gebundene Anti-Verkalkungsmittel.

Beispiel 4

Behandlung von in Glutaraldehyd-konserviertem Schweinegewebe mit dem Natriumsalz von 2-Aminoölsäure (2-AOASS) und mit dem Natriumsalz von 12-Aminododecansäure (12-ADASS)

Die Zipfel oder Blättchen aus in Glutaraldehyd gelagerten Schweineklappen wurden seziert, für 5 Minuten mit steriler physiologischer Kochsalzlösung (0,9% NaCl, 10 Zipfel in 50 ml) gespült und in 10 mM Natriumborat plaziert, bei einem pH von 11,0. So kann der Überschuß an Glutaraldehyd aus dem Gewebe ausgewaschen werden, und der pH der Blättchen kann sich anpassen.
Die Zipfel wurden in 1%iger (Gewicht/Volumen) Lösung (1 Zipfel pro 2 ml) von entweder 2-AOASS oder 12-ADASS gelegt und ohne Schütteln für verschiedene Zeiten und bei verschiedenen Temperaturen, wie in Experiment A bis D nachstehend angegeben, inkubiert. Die Kontrollblättchen wurden unter ähnlichen Bedingungen, aber in Abwesenheit von aktiven Anti- Verkalkungsmitteln inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zipfel zweimal mit 50 ml von 10 mM Natriumborat-Puffer gespült bei einem pH von 11,0, um nicht-gebundenes Material zu entfernen. Sodann wurden sie zweimal mit 50 ml destilliertem Wasser gespült. Die Zipfel wurden anschließend in einer 0,2%igen gepufferten Glutaraldehydlösung gelagert. Es ist möglich, daß ein Teil des Anti-Verkalkungsmittels, das durch das Gewebe während der Inkubationszeit penetriert, aber ohne kovalente Bindung mit ihm assoziiert bleibt, während der Lagerung in der 0,2% Glutaraldehydlösung damit vernetzt werden kann und zum Anti-Verkalkungsschutz beiträgt. Zur Zeit haben Experimente noch nicht nachweisen können, daß die Vernetzung auftritt.
Unmittelbar vor der Implantation werden die Zipfel mit steriler physiologischer Kochsalzlösung gespült, um den Überschuß an Glutaraldehyd zu entfernen.
Eine Kontrollprobe und eine oder zwei behandelte Zipfel wurden subkutan in drei Wochen alte männliche Ratten (30 bis 50 g) implantiert, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Nach 21, 60, 90 oder 120 Tagen wurden die Implantate entnommen, von anhaftendem Gewebe gereinigt, 5mal mit steriler physiologischer Lösung gespült und 5mal mit destilliertem Wasser. Das explantierte Gewebe wude lyophilisiert, gewogen und in sauerstoffreier Atmosphäre hydrolysiert in 6 N HCl für 24 Stunden bei 110ºC. Das Hydrolysat wurde getrocknet und in verdünnter HCl wieder aufgenommen. Sodann wurde der Calciumgehalt durch induktiv gekoppeltes Plasma-Analyse bestimmt.

Experiment A

Die behandelten Proben waren Glutaraldehyd-konservierte Zipfel, die bei Raumtemperatur (etwa 22ºC) für 24 Stunden mit entweder 2-AOASS oder 12-ADASS bei einer Konzentration von 1% (Gewicht/Volumen) inkubiert wurden. Die Kontrollproben waren Glutaraldehyd-konservierte Zipfel, inkubiert in Abwesenheit von aktiven Mitteln. Behandelte und Kontrollzipfel wurden für 21, 60, 90 und 120 Tage implantiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle A nachstehend aufgeführt: Tabelle A Ca&spplus;&spplus; ug/mg trockenes Gewebe Mittelwert ± SEM Implantationszeit (Tage) Kontrollprobe behandelte Probe
Die vorstehend aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß die Behandlung von Schweinezipfeln mit 2-AOASS bei Raumtemperatur für 24 Stunden teilweise die Verkalkung der Implantate verhindert, während die Behandlung für eine ähnliche Zeit mit 12-ADASS einen weniger starken Effekt hat.

Experiment B

Die Glutaraldehyd-konservierten Zipfel wurden für 48 Stunden bei 33ºC in Puffer allein (Kontrollpuffer), Puffer mit 2-AOASS (1% Gewicht/Volumen) oder Puffer mit 12-ADASS (1% Gewicht/Volumen) inkubiert und für 21 Tage implantiert. Die Daten sind in Tabelle B wiedergegeben: Tabelle B Ca&spplus;&spplus; ug/mg trockenes Gewebe Mittelwert ± SEM Implantionszeit (21 Tage) Kontrollprobe behandelte Probe
Die vorstehend angegebenen Ergebnisse zeigen, daß Behandlung für 48 Stunden mit entweder 2-AOASS oder 12-ADASS die Verkalkung von Blättchen innerhalb 21 Tagen subkutaner Implantation in Ratten stark verhindert.

Experiment C

Die Glutaraldehyd-konservierten Zipfel wurden für 48 Stunden bei 33ºC in Puffer (Kontrollprobe) oder in Puffer mit 2-AOASS (1% Gewicht/Volumen) behandelt und für 21, 60, 90 oder 120 Tage in drei Wochen alte Ratten implantiert. Die Daten sind in Tabelle C wiedergegeben: Tabelle C Ca&spplus;&spplus; ug/mg trockenes Gewebe Mittelwert ± SEM Implantationszeit (Tage) Kontrollprobe behandelte Probe
Die in Tabelle C aufgeführten Daten zeigen, daß die Verkalkung von Glutaraldehyd-konservierten Schweinezipfeln nach 48 Stunden Inkubationszeit in Gegenwart von 1% (Gewicht/Volumen) Suspension des Natriumsalzes von 2-Aminoölsäure verhindert wird. Der Verlust vollständiger Inhibition in den 60 und 90 Tage-Implantaten kann Unterschieden in der Dicke von einigen der Zipfel zugeschrieben werden. Die Diffusion des aktiven Mittels durch das Schweinegewebe (d.h. Collagenbündel) kann geschwindigkeitsbestimmend sein, da andere Experimente zeigten, daß für dünnere natürliche Gewebematerialien, insbesondere Schweine-Perikatgewebe, kürzere Inkubationszeiten zu adäquater Absorption eines Anti-Verkalkungsmittels dieses Typs führte. Vollständige Inhibition wird in den Proben beobachtet, die für 21 und für 120 Tage implantiert wurden.

Experiment D

Drei Ratten wurde eine Kontrollprobe implantiert, eine 24- Stunden- und eine 120-Stunden-Probe von 2-AOASS-behandelten Zipfeln. Die Temperatur der Inkubation betrug 22ºC und die Konzentration von 2-AOASS betrug 1% (Gewicht/Volumen). Nach 60, 90 oder 120 Tagen wurden die Blättchen entnommen und auf den Calciumgehalt hin untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle D dargestellt: Tabelle D Ca&spplus;&spplus; ug/mg trockenes Gewebe Implantationszeit (Tage) Kontrollprobe behandelte Probe
Die in Tabelle D dargestellten Daten zeigen, daß 2-AOASS- Behandlung für 120 Stunden die Verkalkung von Glutaraldehydkonservierten Schweineblättchen für bis zu 120 Implantationstage in 3 Wochen alten Ratten verhindert, während Inkubation für 24 Stunden signifikant wirksam ist, obwohl nicht so gut.

Beispiel 5

Bindungsstudien, im allgemeinen ähnlich denen aus Beispiel 2, ausgeführt in bezug auf Natriumoleat, werden mit 2- Aminoölsäure unter Verwendung von Tritium-markierter 2- Aminoölsäure mit einer spezifischen Aktivität von etwa 23 cpm/nMol ausgeführt. Das radioaktive Anti-Verkalkungsmittel wird in drei unterschiedlichen Konzentrationen suspendiert, 0,1%, 0,5% und 1% Gewicht/Volumen in einem Natriumboratpuffer von 10 mMol Konzentration und einem pH von 11,0. Glutaraldehyd-konservierte Zipfel werden in der Lösung bei 33ºC für 24, 48 und 96 Stunden inkubiert. Die inkubierten Zipfel werden gespült im Bindungspuffer und in destilliertem Wasser, um ungebundenes Anti-Verkalkungsmittel zu entfernen. Die Hälfte jedes Zipfels wird für eine Retentionsstudie verwendet, während die andere Hälfte lyophilisiert, als Trockengewebe gewogen und dann auf die Radioaktivität untersucht wurde durch einen flüssigen Scintillationszähler. Wie erwartet, wurde eine maximale Aufnahme der Verbindung erhalten als Ergebnis einer Inkubation in der 1%igen Lösung für jede spezielle Inkubationszeit, eine größere Aufnahme der Verbindung wurde nach 24 Stunden in einer 1%igen Lösung erhalten im Vergleich zu 96 Stunden in einer 0,1%igen Lösung.
Die speziellen Ergebnisse sind in Tabelle E dargestellt: Tabelle E Bindung von 2-Aminoölsäure an Glutaraldehyd-konservierten Schweinezipfeln AOASS-Lösung (Gewicht/Volumen) % Inkubationszeit * Die Mengen werden als nMol AOASS pro mg Trockengewebe angegeben.
Die verbleibenden Hälften der Zipfel werden für die Retentionsstudien verwendet und in einen Phosphatpuffer mit pH 7,4 für zwei Monate bei 22ºC eingetaucht, anschließend lyophilisiert, gewogen und in ähnlicher Weise auf Radioaktivität untersucht. Die Ergebnisse zeigen die gleiche allgemeine Beziehung untereinander, wie in Tabelle E dargestellt. Alle halten einen großen Teil des gebunden AOASS zurück, in der Regel mehr als 75%. Die Proben, die in der 1%igen Lösung inkubiert wurden, zeigten allerdings die größte Verzögerung des Anti-Verkalkungsmittels mit Verzögerungen von mehr als 80% für Inkubationszeiten von 48 Stunden und mehr. Im allgemeinen hielten Proben, die für 96 Stunden inkubiert wurden, einen größeren Prozentsatz von AOASS zurück als solche, die für kürzere Zeitperioden inkubiert wurden. Aufgrund der vorstehenden Studien kann man allgemein annehmen, daß Prothesen aus im allgemeinen porösem Material, wie solche aus natürlichem Gewebe, mindestens etwa 15 nMol des Anti- Verkalkungsmittels pro mg Trockengewebe und vorzugsweise mindestens etwa 30 nMol einschließen sollten. Die Oberflächenanteile von Prothesen aus relativ undurchlässigen synthetischen Materialien sollten äquivalente Mengen gebunden haben.
Obwohl die vorstehenden Studien sich auf die Behandlung von Materialien aus natürlichem Gewebe bezogen, in denen die Verkalkung ein signifikantes Problem in bezug auf die gegenwärtig implantierten Prothesen ist, vorzugsweise in Menschen, wie früher angedeutet, ist die Erfindung auch anwendbar zur Verhinderung der Verkalkung von Prothesen aus synthetischem polymeren Material, wobei das Material entweder von sich aus potentiell chemisch aktive Gruppen beinhaltet, über die kovalente Bindungen hergestellt werden können, oder die in geeigneter Weise modifiziert werden können, um solche Gruppen zu beinhalten. Beispielsweise sind allgemein verwendete Materialien für Prothesen Polyurethane. Synthetische Materialien in Form von entweder Polyestern oder Polyetherurethanen können in dieser Weise behandelt werden. Beispiele hierfür schließen ein Biomer von Athicon, Inc., Lycra , T-127 von DuPont, Pellethane CPR 2363 vom Upjohn und Texin von Mobay Chemical Corporation (alles Warenzeichen). Die Polymere bestehen aus 4,4'-Diisocyanatodiphenylmethan (MDI) und einem Polyol, wie Polytetramethylenetherglykol (PTMEG). Ein weiteres Material ist das allgemein verwendete Cardiothan, das ein Polyurethan-polydimethylsiloxan (90% bis 10%)- Copolymer ist von Kontron, Inc.
Diese Polymere bestehen aus harten und weichen Segmenten. Nach der Implantation tritt die Verkalkung von segmentiertem Polyurethan hauptsächlich in den weichen Segmenten auf. Deshalb ist die Bindung oder das Anheften von Anti- Verkalkungsmitteln, wie 2-Aminoölsäure, 12-Aminododecansäure oder Analoga oder Derivaten davon am geeignetsten an den weichen Segmenten, obwohl das Binden an harte Segemente auch möglich ist. Beispielsweise werden die beiden nachstehenden Vorgehensweisen als durchführbar betrachtet, zur Versorgung von Urethanpolymeren mit solchem Anti-Verkalkungsschutz durch Einverleibung einer geeignet substituierten aliphatischen Carbonsäure. Die synthetischen Polymere können mit bestimmten Gruppen gepfropft werden, die als Bindungsstellen dienen und nachfolgend mit dem Anti-Verkalkungsmittel behandelt werden, sogar nach Herstellung der Prothese. Alternativ kann zunächst eine Umsetzung vom Anti-Verkalkungsmittel und einem Diol durchgeführt werden, das später als einer der Reaktanden in der Bildung des Polyurethans fungiert, wenn der letzte Polymerisationsschritt anschließend ausgeführt wird.
In bezug auf die Bildung von Polymeren mit geeigneten gepfropften Gruppen kann ein Diol verwendet werden, das funktionelle Gruppen enthält, wie Aldehyd-, Carboxyl- oder geschützte Isocyanatgruppen. Zwei solche Diole mit Carboxylgruppen sind 2,2-bis-Hydroxymethylpropionsäure und N,N-bis-Hydroxyethylglycin. Werden sie in der Umsetzung eingesetzt, so können die entstehenden Prepolymere eine der nachstehenden Strukturen aufweisen:
oder
Eine solche Polymerkette kann dann unter Verwendung eines kurzen Diols wie 1,4-Butandiol verlängert werden. Nach der Kettenverlängerung kann ein Anti-Verkalkungsmittel mit einem Aminosubstituenten über die gepfropften Carboxylgruppen gebunden werden unter Verwendung von Carbodiimid, um eine Peptidbindung zu bilden. Alternativ kann das Anti- Verkalkungsmittel mit dem Prepolymer umgesetzt werden, bevor die Kettenverlängerungsreaktion mit BDO stattfindet. Ganz allgemein können geeignete Polyurethane unter Verwendung von Reaktanden in folgenden ungefähren Verhältnissen für jeweils 3 Mol MDI verwendet werden: von etwa 1,3 bis 2 Mol PTMEG, von etwa 0,9 bis 1 Mol BDO, der Rest ist das gepfropfte Diol. Unter Anwendung der vorstehenden allgemeinen Reaktionsbedingungen wird sich das Anti-Verkalkungsmittel hauptsächlich in den weichen Bereichen des Polymers befinden, obwohl Teile sich nahe den harten Segmenten befinden können.
Ein weiteres Beispiel für den Einschluß eines Anti- Verkalkungsmittels in einer Urethanpolymer-Prothese ist die Bildung von PTMEG mit höherem Molekulargewicht, das eine geeignete Pfropfgruppe durch Umsetzung von PTMEG 1000 mit
enthält. Ein solches PTMEG mit höherem Molekulargewicht, das die freien Aldehydpfropfstellen enthält, sollte normalerweise bei der Polyurethanbildung reagieren. Danach dienen die freien Aldehydgruppen als kovalente Bindungsstellen für geeignete Amino-substituierte oder Mercapto-substituierte aliphatische Carbonsäuren oder deren Derivate.
Die Erfindung ist in bezug auf bevorzugte oder illustrative Ausführungsformen beschrieben worden, die die Erfindung erläutern, aber nicht einschränken.

Claims

1. Verfahren zur Verzögerung oder Verhinderung der Verkalkung einer in einen Säuger implantierten Prothese, dadurch gekennzeichnet, daß man an die Prothese vor der Implantation eine aliphatische unverzweigte oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Carbonsäure oder deren Derivat als Anti-Verkalkungsmittel kovalent bindet, wobei die Carbonsäure 8 bis 30 Kohlenstoffatome und mindestens einen Substituenten in Form einer Aminogruppe, einer Mercaptogruppe, einer Carboxylgruppe oder einer Hydroxylgruppe enthält, über die die kovalente Bindung der aliphatischen Carbonsäure erfolgt.

2. Verfahren nach Anspuch 1, wobei das Anti-Verkalkungsmittel eine Monocarbonsäure oder deren Derivat ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Monocarbonsäure eine monoolefinisch ungesättigte Carbonsäure ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Monocarbonsäure eine unverzweigte Monocarbonsäure ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Monocarbonsäure Ölsäure oder Dodecansäure ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei der Substituent eine Aminogruppe ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Anti-Verkalkungsmittel 2- Aminoölsäure ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Prothese eine Gewebeprothese ist, die zunächst mit Glutaraldehyd behandelt wird, und die kovalente Bindung über eine Kupplung an eine Aldehydgruppe des Glutaraldehyds bewirkt wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Anti-Verkalkungsmittel eine Carbonsäure ist, die 12 bis 24 Kohlenstoffatome und höchstens 3 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen enthält.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Carbonsäure 12 bis 22 Kohlenstoffatome und eine Kohlenstoff- Kohlenstoff-Doppelbindung enthält, und der Substituent an das Kohlenstoffatom benachbart zur Carboxylgruppe gebunden ist.

11. Eine Prothese zur Implantation in einen Säuger, wobei die Prothese eine solche Menge eines Anti-Verkalkungsmittel kovalent gebunden enthält, die ausreicht, die Verkalkung der Prothese zu verzögern oder zu verhindern, und wobei das Anti-Verkalkungsmittel eine aliphatische unverzweigte oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Carbonsäure oder deren Derivat umfaßt, die Carbonsäure 8 bis 30 Kohlenstoffatome enthält und mit einer Aminogruppe, einer Mercaptogruppe, einer Carboxylgruppe oder einer Hydroxylgruppe substituiert ist, und diese Gruppe kovalent an die Prothese gebunden ist.

12. Die Prothese nach Anspruch 11, wobei das Anti-Verkalkungsmittel eine durch eine Aminogruppe substituierte Monocarbonsäure ist, die Prothese eine Gewebeprothese ist, die kovalente Bindung an die Prothese über eine Aldehydgruppe von Glutaraldehyd erfolgt, der seinerseits an die Gewebeprothese gebunden ist.