DE68912661T2

DE68912661T2 - Verfahren und Vorrichtung für Zellkultur.

Info

Publication number: DE68912661T2
Application number: DE68912661T
Authority: DE
Inventors: Naoki Kobayashi; Eitaro Kumazawa; Yoshiaki Matsuda; Shinjiro Mitsuda; Hideo Sakuma
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1988-06-27
Filing date: 1989-06-23
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2009-06-24
Also published as: CA1306968C; DE68912661D1; EP0348827A1; EP0348827B1; US5079161A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur effizienten Vermehrung (Proliferation) und Fermentation einer Zellkultur gemäß dem Oberbegriff der Ansprüche 1 und 3.
Die Kultivierung adhäsiver Zellen wurde bislang unter gewissen Einschränkungen mit Hilfe verschiedener im folgenden erläuterter Kultivierungssysteile durchgeführt:
(a) Ein sogenanntes abgeschlossenes Flüssigkeitssystem (liquid tight svstem) umfaßt im allgemeinen eine Vielzahl von innerhalb eines Behälters parallel angeordneten Platten, mit dem Zweck, eine ausreichend große Oberfläche zur Zelladhäsion zu erhalten, nach Beendigung der genannten Zeitadhäsion auf den Platten läßt man im Behälter eine bestimmte Menge Kulturflüssigkeit unter Regelung von pH und pO2 (Gelöst-Sauerstoff) zirkulieren; und ein sogenanntes Rollkultur-System umfaßt im allgemeinen eine Vielzahl von ebenfalls parallel angeordneten Scheiben oder ähnlichem, die sich innerhalb eines Zylinders befinden, welcher zur Erzielung der Zelladhäsion auf den Scheiben aufrechtsteht und dann zur Rotation uingelegt wird.
(b) Ein anderes System umfaßt einen aufgerollten, mit einer Kunststoffmembran gefüllten Zylinder, in dem die Zellkultivierung in gleicher Weise wie bei der sogenannten Rollkultur durchgeführt wird, worauf man dann im aufrecht stehenden Zylinder eine bestimmte Menge Kulturflüssigkeit zirkulieren läßt, zum Beispiel durch Luftzifuhr in den Zylinder.
(c) Das Gärterrassenreaktorsystem (multitray system of box-nest construction) ähnelt dem oben unter (a) erläuterten System abgesehen davon, daß eine Gasphase vorhanden ist und daß die Kultivierung wie in der Rollkulturflasche stationär erfolgt, ohne daß eine Zirkulation der Kulturflüssigkeit erforderlich ist.
(d) Das Kunststoffbeutel-System (plastic bag system) umfaßt einen für Sauerstoff oder Kohlendioxid durchlässigen, feuerwehrschlauchartig aufgerollten Kunststoffbeutel, durch den eine bestimmte Menge Kulturflüssigkeit fliegt. Das System erleichtert die Regelung des pO2 und des pH.
(e) Das Hohlfasersystem (hollow fiber system) umfaßt Hohlfasern, wie sie gewöhnlich zur Dialyse in der künstlichen Niere benutzt werden, bei denen die Adhäsion und Vermehrung der Zellen auf der Außenseite erfolgen, während Nährstoffe von der Innenseite, d.h. von der der Zellshicht zugewandten Seite der Hohlfasern zugeführt werden.
(f) Bei dem System der mit Glasperlen gefüllten Säule erfolgen Adhäsion und Vermehrung der Zellen unter Zirkulation einer Kulturf lüssigkeit mit voreingestellten pH und pO2 auf der Oberfläche von Glasperlen, mit welchen ein Behälter gefüllt ist.
(g) Das Nikrocarrier-System verwendet statt der genannten Glasperlen winzige Kugeln mit einer solchen relativen Dichte, daß sie bei leichtem Schütteln von etwa 20 bis 40 Upm in der Kulturflüssigkeit schwimmen, wobei die Kultivierung sowie die Vermehrung der Zeilen auf ihrer Oberfläche erfolgt.
Die Systeme (a) bis (d) dienen ausschließlich zur Batch-Produktion und die Anzahl von Zellen, die bei jedem einzelnen Prozeß kultiviert werden können, d.h. also der Ertrag an Zielsubstanz, ist gering.
Die Systeme (e) bis (f) des Typs mit kontinuierlicher Zirkulation des Kujturmediums sind in der Anzahl der Zellen, die von ihnen kultiviert werden können, ebenfalls beschränkt und für Massenkuitivierung nicht geeignet.
Gegenwärtig beruht die Massenkultivierung zum größten Teil auf dem oben unter (g) erläuterten Mikrocarrier- System uiid es idt ein solches System mit einem Fassullgsvermögen von 8000 [ 1 ] ist bekannt.
Ein Beispiel für das Mikrocarrier-System wird in US-A- 4.203.801 offenbart. Die Vermehrung eukaryontischer Zellen wird in einem Haupt-kulturgefäß durchgeführt, welches ein flüssiges Medium und einen immobilisierenden, aus Glas oder Kieselerde bestehenden Carrier enthält.
Als weiteres Beispiel offenbart die [Japanese] Djsclosure Gazette Nr. 1985-259179 ein ähnliches Gefäß für Zellkultur des Submerstyps zur Massenkultivierung bei hoher Biomassekonzentration, das am Kopfteil mit einem Einlaß für frische Kulturflüssigkeit, am Boden mit einem Auslaß für verbrauchte Kulturflüssigkeit und neben dem Kopfteil mit einem Propellerrührer ausgestattet ist.
Die obengenannten Systeme nach dem bisherigen Stand der Technik sind deshalb unvorteilhaft, weil das Kultivierungsvermögen nur durch eine entsprechende Vergrößerung des Kulturgefäßvolumens erhöht werden kann, und weil eine Vermehrung der Zellen aus hier Anfangsstufe in einem solchen größeren Gefäß nicht nur zusätzliche Probleme mit sich brächte, wie zum Beispiel solche mit der Zirkulation und Regulierung der entsprechend größeren Kulturflüssigkeitsmenge, sondern auch mehr Zeit in Anspruch nähme.
Insbesondere wenn die Zellkultur eine physiologisch aktive Substanz produzieren soll, enthält das Kulturmedium für dies Zellvermehrung Bestandteile, die verschieden von denen für die Zellkultivierung sind, und [die Verwendung] des ersteren wird, insbesondere bei einem größeren Kulturgefäß, unwirtschaftlich.
Folglich und angesichts der die Mikrocarrier-Systeme iach dem wohlbekannten Stand der Technik betreffenden Probleme bezweckt das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung durch Durchführung der anfänglichen Zellvermehrung und der anschließenden Zellkultivierung zur Produktion der physiologisch aktiven Substanz in getrennten Gefäßen eine effiziente Zellkultivierung zu errreichen
Die Durchführung der Mikrocarrier-Kultivierung ist bei denjenigen Zellen sehr schwierig, die leicht durch Schherkräfte beschädigt werden und eine relativ geringe Koloniebildungseffizienz aufweisen. Um die Auswirkungen der genannten Scherkräfte zu mindern wird das Verfahren bevorzugt, bei dem die Zellen selbst auf einem bestimmten material adhäsiv fixiert sind, das bei dem stationären Kultivierungsverfahren eine größere Oberfläche aufweist und durch welches das Kulturmedium zirkuliert.
Das zuvor genannte Hohlfasersystem stellt eine Ausführungsform eines solchen Verfahrens dar. Genauer gesagt läßt man das Kulturmedium nicht nur durch das Innere sondern auch entlang der Außenseite der Hohlfasern, auf der die adhäsiven Zellen vermehrt werden sollen, kontinuierlich zirkulieren, so daß Nährstoffe und Stoffwechselprodukte zwischen der Innen- und Außenseite der Fasern effizient ausgetauscht werden, wodurch die Kultivierung der Zellen in hoher Dichte ermöglicht wird.
Jedoch macht dieses System die Vorrichtung unannehmbar kompliziert und es wurde zur Massenproduktion nicht kommerziell eingeführt.
Die Japanese Disclosure Gazette Nr. 1984-154984 offenbart ein vereinfachtes Hohlfasersystem, bei dem die Zellen vermehrt und auf einer keramischen Matrix kultiviert werden, und die Kulturflüssigkeit kontinuierlich zirkuliert.
Nacli dem bisherigen Stand der Technik werden Aluminiumoxid, Silika, Titan, Zirkon oder ähnliches oder eine bestimmte Mischung dieser Stoffe gesintert, so daß ein poröser keramischer Carrier hergestellt wird, der zylindrisch monolitisch ist und mindestens etwa 20 parallel zueinander verlaufende Durchgangslöcher pro Quadratzoll seiiies Querschnitts aufweist. Jedoch erweist sich dieses System in der Hinsicht als ungünstig, dar der Carrier bei ununterbrochenem Gebrauch leicht verstopft.
Wie aus der vorangehenden Beschreibung deutlich wird, erweisen sich alle herkömmlichen Systeme als unvorteilhaft zur Massenproduktion im kommerziellen Maßstab. Eine Lösung zur Überwindung solcher Probleme wurde von den Erfindern in der Japanese Disclosure Gazette Nr. 1987-236480 offenbart. Die Lösung ist ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:
- Beieitstellung von keramischen Partikeln, die zum größten Teil aus für Zelladhäsion geeignetem Aluminiumoxid bestehen und eine gleichmäßige Größe von etwa 5 bis 9 Meshes aufweisen;
- Zufuur des Kulturmediums in eine mit den genannten keramischen Partikeln gefüllte Säule;
- Austausch der Menge der nach dem Durchlauf durch die erste Hälfte der Säule aufgrund der Zellvermehrung verbrauchten Kulturflüssigkeit durch eine Menge frischer kulturflüssigkeit im mittleren Bereich der Säule; und
- Entfernung der genannten verbrauchten Kultur[füssigkeit] wird durch die zweite Hälfte der Säule fortgesetzt.
Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Einwirkung der Kulturflüssigkeit auf die Zellen relativ homogen ist, die Zellen nicht durch die Scherkräfte beschädigt werden und der Carrier die Zelladhäsion erleichtert, und somit ist das Verfahren zur Massenkultivierung von adhäsiven Zellen geeignet.
Dennoch bleibt noch ein wichtiges Problem, daß nämlicli, wenn die Kultivierung in einer Säule oder einem Gefäß, gefüllt mit körnigem, sedimentärem Immobilisierendem Carrier, ob keramisch oder nicht, durchgeführt wird, das Einfüllen und Entfernen des inmobilisierenden Carriers die gleichmäßige Adhäsion der Zellen auf dem genannten immobilisierenden Carrier nicht verhindern sollte.
Bei diesem Verfahren neigt jedoch die der inmobilisierenden Carrier-Säule zugeführten Zellsuspeijsionsmenge dazu, sich zunächst an der Seite für die Zufuhr der Zellsuspension auf der Säulenoberfläche und in dem Bereich in der Nähe der Zufuhrleitung zu stauen. Dieses ist insofern ungünstig, als es eine lange Zeit dauert, bis die Vermehrung der Zellen in der gesammten mmobilisierenden Carrier-Säule einsetzt.
Die Vorrichtung für Zellkultur der vorliegenden Erfindung bezweckt die Lösung solcher Probleme.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe dieser Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur effizienten Zellkultivierung bereitzustellen, bei dem die anfängliche Zellvermehrung iind die anschließende Zellkultivierung zur Produktion der Zielsubstanz in getreiinten Gefäßen durchgeführt werden.
Diese Aufgabe wird in Übereinstimmung mit der vorilegenden Erfindung durch ein Verfahren zur Fermentation einer Zellkultur gemäß dem obengenannten Oberbegriff des Anspruchs 1 und gekennzeichnet durch den kennzeichneden Teil des Anspruchs 1 gelöst
Das Verfahren wird durch eine Vorrichtung für Zellkultur effektiv durchgeführt, die ein vorgeschaltetes Kulturgefäß kleineren Formats, ein Haupt-Kulturgefäß, das mit immobilisierenden, als Hauptbestandteil keramisches Material enthaltenden, Carriern gefüllt ist, und ein zwischen dem vorgeschalteten Kulturgefäß und dem genannten Haupt-Kulturgefäß zwischengeschaltetes Reservoir umfaßt. Nach der Zellvermehrung kann eine bestimmte Menge der Zellsuspension dem genannten Haupt-Kulturgefäß zugeführt werden, das mit immobilisierenden, als Hauptbestandteil keramisches Material enthaltenden, Carriern gefüllt ist.
Eine effiziente Zelladhäsion auf den immobilisierenden Carriern wird durch die Ausstattung der obengenannten Vorrichtung für Zellkultur mit einem separaten Gefäß erreicht. Wenn die in dem vorgeschalteten Kulturgefäß kleinen Formats vermehrten Zellen von dein immobilisierenden Carriern abgestreift werden, so daß eine Zellsuspension erhalten wird, und letztere in das mit immobilisierenden Carriern gefüllte Haupt-Kulturgefäß überführt wird, wird die genannte Zellsuspension dem genannten Haupt-Kulturgefäß von oben und unten zugeführt, so daß einerseits die Zelladhäsion auf den genannten immobilisierenden Carriern homogenisiert wird, und andererseits der Nährstoff- und Gasgehalt der Kulturflijssigkeit eingestellt sowie die Zirkulation der geiianiiteii Kulturflüssigkeit im mit immobilisierenden, vorwiegend aus keramischem Material hergestellten, Carriern gefüllten Hauptgefäß reguliert wird.
Es sollte klar sein, daß das Kulturgefäß vom Mikrocarrier-Typ vorzugsweise von der Art des vorgesclia lt eten Kulturgefäßes kleinen Formats ist, da mögiichst viele Zellen dem sich anschließenden Gefäß zur Massenkultivierung zugeführt werden können.
Das Verfahren und die Vorrichtung für Zellkultur gemäß der vorliegenden Erfindung sind von einzigartiger Wirksamkeit, wie im folgenden beschrieben wird.
Im allgemeinen kann eine effektive Vermehrung sowie Kultivierung erreicht werden, indem man die im darauffolgenden Produktionsprozess-Schritt zu benutzenden Zellen im vorgeschalteten Kulturgefäß vermehrt, während im Hauptkulturgefäß die Zielsubstanz produziert wird, wobei die anfängliclie Zellvermehrung und die genannte Produktion der Zielsubstanz in getrennten Kulturgefäßen durchgeführt werden.
Genauer gesagt ist es möglich, die Anzahl der Zellen vorlier zu bestimmen, so dar die Zellvermehrung im vorgeschalteten Kulturgefäß effizient durchgeführt werden kann, die Zeit, während derer das Medium für die Vermehrung zugeführt wird, also minimiert werden kann. Ferner ist es möglich, von dem Medium für die Vermehrung zur Kulturflüssigkeit für die Produktion der physiologisch aktiven Substanz überzuwechseln, wodurch sich eine Verkürziing der Kultivierungsdauer ergibt.
Die oben erwähnte effiziente Zellkultivierung weist im Hinblick auf die Tatsache, dar das Leben der Zellen im allgemeineii relativ kurz ist, mehrere Vorzüge auf.
Außerdem ermöglicht die Tatsache, daß die Zellsuspension den immobilisierenden Carriern in dem Kulturgefäß von oben und unten zugeführt wird, daß sich die Zelladhäsion auf den genannten immobilisierenden Carriern gleichmäßig uiid effektiv vollzieht.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Kultivierungsvorrichtung, die zur gleichmäßigen Zufuhr der Zellsuspension auf die immobilisiereiiden Carrier dient und sowohl das Befüllen als auch das Entfernen der genannten immobilisierenden Carrier erleichtert.
Die gieichmäßige Zufuhr der Zellsuspension auf die immobilisierenden Carrier, die oben als ein Teil dieser Aufgabe dargestellt wurde, wird in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung durch eine Kultivierungsvorrichtung erzielt, die mit sedimentierenden immobilisierenden Carriern für adhäsive Zellen gefüllt ist und auf die Produktion einer Zielsubstanz abzielt; diese Kultivierungsvorrichtung umfaßt einen kopf stehendtrichterförmigen Einlaß, der oberhalb der immobilisierenden, die Vorrichtung füllenden Carrier angeordnet und mit einer perforierten Bodenplatte zur gleichmäßigen Verteilung der von oben den jmmobilisierenden Carriern zugeführten Zellsuspensionsmenge ausgestattet ist, eine unterhalb der immobilisierenden Carrier angebrachte Netzplatte, die den genannten immobilisierenden Carriern Halt gibt, und eine weitere ebenso unterhalb der immobilisierenden Carrier angebrachte perforierte Platte zur gleichmäßigen Verteilung der von unten den genannten immobilisierenden Carriern zugeführten Zellsuspensionsmenge.
Zui Erleichterung des Befüllens und Entfernens der immobilisierenden Carrier, d.h. zur Erfüllung einer weiteren Anforderung der obengenannten Aufgabe, stellt die vorliegeiide Erfindung eine Vorrichtung bereit, die einen Abdeckungsabschnitt, der den kopfstehend-trichterförmigen Flüssigkeitseinlaß mit der perforierten Bodenplatte zur gleichmäßigen Verteilung der den immobilisierenden, die Vorrichtung füllenden Carriern von oben zugeführten Zellsuspensionsmenge abnehmbar trägt, einen trommelartigen, einem Träger fest verbundenen Abschnitt und einen Bodenabschnitt, der die den immobilisierenden Carriern von der Unterseite her Halt gebende Netzplatte und die perforierte Platte zur gleichmäßigen Verteilung der von den unteren Abschnitten her zugeführten Zellsuspeiisionsmenge abnehmbar trägt.
Die Kultivierungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung funktioniert folgendermaßen:
Die Zellsuspension wird den immobilisierenden Carriern der mit den genannten Carriern gefüllten Vorrichtung sowohl von oben wie auch von unten zugeführt, so daß die von oben zugeführte Menge der genannten Zellsuspension durch die perforierte Platte als Teil des kopfstehendtrichterförmigen Einlasses gleichmäßig zugeführt wird und die vom unten her zugeführte Zellsuspensionsmenge durch die untere perforierte Platte und dann [durch] die die immobilisierenden Carrier haltende Netzplatte gleichmäßig verteilt wird. Auf diese Weise haften die Zellen gleichmäßig auf den immobilisierenden Carriern.
Außerdem kann der Bodenabschnitt der Kultivierungsvorrichtung mittels einer Schraubverbindung und eines Zylinders von dem Abdeckungsabschnitt und dem trommelförmigen Abschnitt der Kultivierungsvorrichtung abgetrennt iind wieder damit verbunden werden, so daß das Befüllen und Entfernen der immobilisierenden Carrier erleichtert und die von diesem Arbeitsvorgang in Anspruch genommene Zeit dadurch verkürzt wird.
Außerdem erleichtert die trennbare Bauart der Kultivierungsvorrichtung die manuelle Reinigung und Kontiotle. Auf diese Weise werden sowohl die Reinigung als auch die Kontrolle leichter als bei einem herkömmlichen Kulturgefäß vom einteiligen Typ.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Diese und andere Aufgaben sowie Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung deutlich:
Fig. 1 ist ein Flußdiagramm, das das Verfahren zur Zellkultivierung gemäß der vorliegenden Erfindung schematisch darstellt;
Fig. 2 ist. ein Flußdiagramm, das die Art und Weise der Zirkulation der Kulturflüssigkeit zur Zeltvermehrung erläutert, die der Kultivierungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung zugeführt wird;
Fig. 3 ist eine Schnittansicht, die die Kultivierungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung zeigt;
Fig. 4A ist eine perspektivische Ansiclit, die den Mechanismus zum Abnehmen des Bodenabschnitts der Kultivierungsvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt; und
Fig. 4B ist ein Diagramm, das die Arbeitsweise des Abnahmemechanismus erläutert.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUND

Zunächst wird das Verfahren zur Zellkuitivierung gemäß der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben.
Bezugsziffer 1 bezeichnet ein Kulturgefäß kleinen Formats zur Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung. Insbesondere wird hier als dieses Kulturgefäß kleinen Formats ein Mikrocarrier-Kulturgefäß eingesetzt, in dem die Vermehrung adhäsiver Zellen gemäß dem Mikrocarrier-Kulturprozeß erfolgt. Wenn auch in dem erfinderischen Verfahren das genannte Mikrocarrier- Kulturgefäß benutzt wird, so sollte doch klar sein, daß auch Kulturgefäße anderer Typen effektiv eingesetzt werden können
Bezugsziffer 2 bezeichnet ein Nährstoffreservoir zur Versorgung des genannten Mikrocarrier-Kulturgefäßes 1 mit Nährstoffen.
Die anfangs in dem Mikrocarrier-Kulturgefäß 1 vermehrten Zellen werden nach wohlbekannter Methode von den Mikrocarriern abgestreift, so daß man eine Suspension erhält, die dann durch eine Rohrleitung 13 in ein zwischengeschaltetes Reservoir 3 überführt wird. Die Zellsuspension wird zur Homogenisierung der Zellverteilung in diesem Reservoir 3 zwischengespeichert
Bezugsziffer 4 bezeichnet ein mit keramischen Carriern gefülltes Gefäß zur Massenkultivierung. Eine bestimmte Meiige dei Zellsuspension wird mittels einer Pumpe 17 aus dem genannten Reservoir für Zellsuspension 3 über eine Rohrleitung 14 und sodann über eine durch die Deckplatte des Kulturgefäßes 4 führende obere Rohrleitung 6 einer Mehrschichtkeramik 5 zugeführt, während ebenfalls eine bestimmte Menge der Zellsuspension über die von der Rohrleitng 14 abzweigende Rohrleitung 15A und 15B und sodann über eine untere mit dem Boden des Kulturgefäßes 4 verbundene Rohrleitung 7 der genannten Mehrschichtkeramik 5 zugefüiirt wird.
Die Zellsuspension wird in obengenannter Art und Weise auf zwei Wegen dem Kulturgefäß zugeführt; dadurch wird eine gleichmäßige Adhäsion der Zellen auf dem keramisclien immobilisierenden Carrier erreicht.
Die Menge der Zellsuspension, die dem Gefäß für Massenkultivierung auf zwei Wegen zugeführt werden soll, muß vorher in einer Stufe zur Regulierung des Kulturmediums innerhalb des zwischengeschalteten Reservoirs auf die optimale Menge eingestellt werden, da es unmöglich wäre, eine gleichmäßige Zelladhäsion auf den keramischen Carriern zu erreichen, wenn die genannte Menge der Zellsuspension die Menge der keramischen Carrier innerhalb des Gefäßes für Massenkultivierung erheblich übertrifft, und da eine effektive Ausnutzung aller keramischen Carrier nicht möglich wäre, wenn die genannte Menge der Zellsuspension kleiner als die Menge der keramisclien Carrier ist.
Bezugsziffer 8 bezeichnet ein Regulationsgefäß für Kulturflüssigkeit, das dazu dient, die Zirkulation der Kulturflüssigkeit innerhalb des Kulturgefäßes 4 zu beeinflussen und den Nährstoff- und Gasgehalt der Kulturflüssigkeit zu dosieren. Das Kulturgefäß 4 wird von oben uiid uinten aus dem zwischengeschalteten Reservoir 3 mit der Zellsuspension versorgt, so daß die Zellen auf den einzellnen, die Mehrschichtkeramik 5 bildenden, keramischen Carriern gleichmäßig haften, sodann wird das Kulturgefäß 4 durch Betrieb der Pumpe 9 aus dem Regulationsgefäß für Kulturflüssigkeit 8 mit Kulturflüssigkeit zur Zellvermehrung versorgt. Was das Verfahren zur effizienten Vermehrutig angeht, so kann man Kanalbildung im von den Carriern gefüllten Bereich verhindern, indem man Aufwärts- und Ahwärtszirkuiation einander abwechseln läßt. Abwärtszirkulation erfolgt in der Weise, daß die genannte Kulturflüssigkeit mit der Pumpe 9 aus dem Regulationsgefäß für Kulturflüssigkeit 8 über die Rohrleitungen 18, 48, 15A, 14, 6 iind den kopfstehend-trichterförmigen Einlaß 34 in das Kulturgefäß 4 gepumpt und über die Rohrleitungen 7, 46 und 16B in das genannte Gefäß 8 zurückgeführt wird. Aufwärtszirkulation erfolgt in der Weise, daß die genannte Kulturflüssigkeit mit der Pumpe 9 aus dem Regulationsgefäß für Kulturflüssigkeit 8 über die Rohrleitungen 18, 7 in das genannte Kulturgefäß 4 gepumpt und dann durch den kopfstehend-trichterförmigen Einlaß 34 über die Rohrleitungen 6, 14, 16A und 16B in das genannte Gefäß 8 zurückgeführt wird.
Jeweils nach Ablauf einer bestimmten Anzahl von Minuten wird automatisch zwischen Aufwärts- und Abwärtszirkulation abgewechselt und so werden gleichmäßige Verteilung und Vermehrung der Zellen erreicht, ohne daß Kanalbildung auftritt.
Ferner wird dem Kulturgefäß 4 gesteuert durch ein einem Fiillstandsregelstab funktionell zugeordnetes Luftventil 12 aus einem Lufteinlaß 11 Luftdruck zugeführt, so daß der Flüssigkeitsspiegel im Kulturgefäß nahe dem kopfstehend-trichterförmigen Einlasses 34 gehalten wird.
Außerdem kann statt der genannten abwechselnden Zirkulation sowohl die Aufwärts- als auch die Awärtszirkulation allein angewendet werden.
Nachdem sich die Zellen unter der Zirkulation der genannten Kulturflüssigkeit zur Vermehrung bis zu einer vorgegebenen Anzahl vermehrt haben, erfolgt die Umschaltung von der Kulturflüssigkeit zur Vermehrung zu der aus einem nicht abgebildeten Reservoir zugeführten Kulturflüssigkeit zur Produktion einer physiologisch aktiven Substanz. Jetzt wird dem Kulturgefäß 4 die Kulturflüssigkeit zur Produktion der physiologisch aktiven Substanz zugeführt und, nachdem die physiologisch aktive Substanz produziert wurde, wird die die genannte Substanz enthaltende Kulturflüssigkeit durch die Rohrleitung 10 ziirückgewonnen und einer Säule zur Elution der physiologisch aktiven Substanz zugeführt.
Nach Beendigung der Rückgewinnung wird die Zellsuspension aus dem zwischengeschalteten Reservoir 3 erneut dem Kulturgefäß 4 zugeführt und die Zellkultivierung wird wiederholt.
In dieser Weise erfolgt die anfängliche Zellvermehrung innerhalb des Mikrocarrier-Kulturgefäßes 1, während die abschließende Zellkultivierung zur Produktion der physiolugisch aktiveii Substanz im Kulturgefäß 4 erfolgt. werden die Vermehrung und die Kultivierung in getrentiten, über das zwischengeschaltete Reservoir miteinander verbundenen Kulturgefäßen durchgeführt.
Wie bereits beschrieben wurde, kann die Abstreifung der Zeilen in dem Kulturgefäß kleinen Formats mit einer bei iebigeii geeigneten, herkömmlichen Technik durchgeführt werden. Eine dieser verwendbaren Techniken wird nun genauer beschrieben. Nach Abschluß der Zellvermehrung wird die Zirkulation der Kulturflüssigkeit gestoppt, dann wird die gesamte Menge der Kulturflüssigkeit aus dem Kulturgefäß kleinen Formats entfernt und [dieses] mit Kochsalz-Phosphatpuffer (PBS) gewaschen; anschließend werden die Zellen durch Zugabe einer geeigneten Menge Trypsin oder Collagenase abgestreift. Es sollte hier bemerkt werden, daß ein längerandauernder Kontakt mit Trypsin oder Collagenase die Zellen zerstören würde. Um das zu verhindern, wird eine bestimmte Menge von Kulturflüssigkeit zugegeben, die Trypsininhibitor enthält, mit dem Zweck, das Trypsin oder die Collagenase zu hemmen uiid auf diese Weise eine Zellsuspension zu erhalten, in der die Zellen schwimmen. Wenn es sich nicht um eine serumslose Kultur handelt, kann der Trypsininhibitor durch eine serumhaltige Kulturflüssigkeit ersetzt werden, da das Serum selbst bereits den genannten Trypsininhibitor enthält.
Angesichts der Tatsache, dar die Zellen dazu neigen, inaktiviert zu werden oder zusammenzukleben, wenn sie für eine längere Zeit in Suspension gelassen werden, muß die Zellsuspension so schnell wie möglich auf die immobilisierenden Carrier übertragen werden. Die Speicherung der Suspension im zwischengeschalteten Reservoir ist daher nur eine Zwischenspeicherung zum Zwecke der Regulat ion.
Das genannte zwischengeschaltete Reservoir 3 weist eine zusätzliche wichtige Funktion auf, wie im folgenden beschrieben wird. Während der Zellvermehrung im Kulturgefäß kleinen Formats 1 dient das zwischengeschaltete Reservoir 3 der Zirkulation und Regulierung der Kulturflüssigkeit; nach Abschluß der Zellvermehrung und anschließender Unterbrechung der Zirkulation dient das Reservoir zur Regulierung der Menge der Kulturflüssigkeit, die für den anschließenden Prozeß dem Gefäß für Massenkultivierung 4 zugeführt wird. Die so reguiierte Menge der Kulturflüssigkeit wird jetzt zum Teil dem Kulturgefäß kleinen Formats 1 zugeführt, in dem zuvor die Entfernung der Kulturflüssigkeit und das Waschen und Abstreifen der Zellen bereits abgeschlossen wurden, so daß man eine Menge der Zellsuspension erhält, die wiederum im zwischengeschalteten Reservoir gesammelt wird, wo eine Menge der homogenen und regulierten Zellsuspension zur Versorgung des anschließenden Gefäßes zur Massenkultivierung benötigt wird. Das zwischengeschaltete Reservoir ist für einen solchen Prozeß unerläßlich.
Die veischiedenen, oben erwähnten Kulturgefäße bedürfen der zugeordneten Regulationsgefäße, um während der Zirkulation der Kulturflüssigkeit Temperatur und Nährstoffgehalt richtig einzustellen, dabei werden die Nährstoffe aus einem nicht abgebildeten Reservoir zugeführt.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung konstruierte Vorrichtung für Zellkultur wird jetzt anhand eines Beispiels erörtert. Die Vorrichtung der Erfindung wurde zur Überwindung der Nachteile der Vorrichtung für Zellkultivierung vom Mikrocarrier-Typ entwickelt und enthält eine mit zur Immobilisierung sedimentierender adliäsiver Zellen geeigneten Carriern gefüllte Vorrichtung für Zellkultur. Diese Vorrichtung für Zellkultur ist insbesondere als Kulturgefäß zur Produktion einer physiologisch aktiven Substanz geeignet, das bei dem oben beschriebenen Verfahren zur Zellkultivierung getrennt von iem vorgesclialteten Kulturgefäß kleinen Formats zur aufänglichen Zellvermehrung angeordnet ist; entsprechend wird die Vorrichtuiig der Erfindung in Verbindung mit einer bestimmten Ausführungsform beschrieben, die als ein solches kulturgefäß konstruiert ist. Dennoch ist die Anwendbarkeit der erfindungsgemäßen Vorrichtung nicht auf ein solches Kulturgefäß beschränkt.
Fig. 2 erläutert schematisch eine Ausführungsform der Kultivierungsvorrichtung gemäß dieser Erfindung.
Bezugsziffer 4 bezeichnet ein mit keramischen Carriern gefülltes Gefäß zur Massenkultivierung. Eine Rohrleitung 6 verlängert die Rohrleitung 14 zur Zufuhr der Zellsuspension. Wie in Fig. 3 gezeigt wird die Rohrleituiig 6 zur Zufuhr der Zellsuspension abnehmbar durch die Deckplatte 32 des Kulturgefäßes 4 geführt und gelit am Eiide in einen kopfstehend-trichterförmigen Einlaß 34 über, dessen Boden die perforierte, zur gleichmäßigen Zufiiiir der Zellsuspension auf die Oberseite der immobilisierenden Carrier dienende Platte 35 bildet.
Das Kulturgefäß 4 ist durch Rohrleitungen 16A, 16B, 18 mit dem Regulationsgefäß für Kulturflüssigkeit 8 verbunden, so daß eine in der Rohrleitung 18 angebrachte Pllmpe 9 eine bestimmte Menge der Kulturfiüssigkeit zirkuiieren läßt. Rohrleitung 18 ist mit einer Einlaßleitung 7 für das Kulturgefäß 4 verbunden, während die Rohrleitungen 16A und 16B mit der dem kopfstehendtrichterförmigen Einlaß 34 über ein schaltbares Ventil zugeordiieten Rohrleitung 6 verbunden sind. So wird mittels genannter Pumpe 9 eine vorgegebene Menge der Kulturflüssigkeit in das Kulturgefäß 4 gepumpt. Bei der obengenannten Aufwärtszirkulation wird die Kulturflüssigkeit vom kopfstehend-trichterförmigen Einlaß 34 dtirch die Rohrleitungen 6, 14, 16A, 16B in das Regulationsgefäß für Kulturflüssigkeit 8 zurückgefüiirt, weliil die Pumpe 9 mittels eines Füllstandsregelstab einund ausgeschaltet wird oder wenn keimfreie Luft durch eineii Einlaß 11 in das Kulturgefäß 4 eingeführt wird, um Überdruck zu erzeugen. Auf diese Weise wird der Füllstand eingestellt, so daß der Flüssigkeitsspiegel stets in der Nähe des kopfstehend-trichterförinigen Einlasses 34 bleibt.
Eine weitere Ausführungsform des Kulturgefäßes 4 wird uiter Bezugnahme auf Fig. 3 erörtert. Dieses Kulturgefäß 4 besteht aus einem oberen flanschartigen Abschnitt 4a, einem trommelartigen Zwischenabschnitt 4b und einem interen Abschnitt 4c, die voneinander trennbar sind. Der flanschartige Abschnitt 4a wird von einer Deckplatte 32 überdeckt. Die Zufuhrleitung 6 erstreckt sich abwärts bis zu dem kopfstehend-trichterförmigen Einlaß 34, dessen Boden von einer perforierten Platte 35 bedeckt wird. Ferner ist das Kulturgefäß 4 mitten über den gesamten Querschnitt seines unteren Abschnittes hinweg mit einer Netzplatte 36 zum [Halten] der immobilisierenden Carrier und mit einer perforierten, unmittelbar unter der Netzplatte 36 liegenden Platte 37 ausgestattet. Diese Netzplatte 36 und perforierte Platte 37 sind mit Klemmbolzen in dem unteren Abschnitt des Kulturgefäßes 4 befestigt.
Die Rohrleitung 7 ist mit dem unteren Ende des Kulturgefäßes 4 verbunden. Bezugsziffern 38, 39 bezeichnen Kühlmäntel für den unteren Abschnitt 4c und für den trommelartigen Abschnitt 4h des Kulturgefäßes 4.
Es wild nun besciirieben, wie sich das Kulturgefäß 4 der vorliegenden Erfindung insbesondere zur Produktion eiiier physiologisch aktiven Substanz einsetzen läßt.
Als erstes werden keramische Carrier in das genannte Kulturgefäß 4 eingefüllt und darin sterilisiert. Eine bestimmte Menge der Zellsuspension, die schwimmende adhäsive Zellen enthält, wird dann durch die Rohrleitung 14 und durch die Rohrleitung 6, die sich in den oberen Teil des Gefäßes 4 öffnet, dem Kulturgefäß 4 zugeführt, während eiiie weitere Menge der Zellsuspension durch die von der Rohrleitung 14 abzweigende Rohrleitung 15A, 15B sind dann durch die Einlaßleitung 7, die sich in den untereii Teil des Gefäßes 4 öffnet, dem Kulturgefäß 4 zugeführt wird.
Die Rohrleitung 6 endet im kopfstehendtrichterförmigen Einlaß 34, dessen Boden die perforierte Platte 35 bildet, so daß ein Teil der Zellsuspension dem Knlturgefäß 4 von oben gleichmäßig zugeführt wird und der andere Teil der Zellsuspension bewirkt durch die perforierte Platte 37 und die Netzplatte 36 dem Kniturgefaß 4 von unten gleichmäßig zugeführt wird.
Sodann läßt man, nachdem das Kulturgefäß 4 von oben und unten mit. Zellsuspension versorgt wurde und die Zellen auf dem keramischen Carriern gleichmäßig haften, mit dem Zweck dem Zellvermehrung mittels einer Pumpe 9 eine Menge der Kulturflüssigkeit zur Zellvermehrung aus dem Regulationsgefäß für Kulturflüssigkeit 9 durch die Rohrieitungen 18, 16B, 16A zirkulieren. Nach angemessener Vermehruiig wird von der Kulturflüssigkeit zur Zellvermehrung zu der aus einem nicht abgebildeten Reservoir stammenden Kulturflüssigkeit zui Produktion einer physiologisch aktiven Substanz umgeschaltet, und auf ]iese Weise wird die Zielsubstanz produziert.
Das Regnlationsgefäß für Kulturflüssigkeit 8 dient der Einstellung verschiedener Faktoren wie zum Beispiel des pH, der Temperatur und des Gas- und Nährstoffgehalts der Kulturflüssigkeit.
Nun wird ein Mechanismus zur Entfernung der immobilisierenden Carrier aus dem Kulturgefäß 4 anhand eines Beispiels und unter Bezugnahme auf Figg. 4A und 4B erläutert
Der untere Abschnitt 4c des Kulturgefäßes 4 ist mittels eines Verbindungsmechanismus und eines Zylinders von dem trommelartigen Zwischenabschnitt 4b abtrennbar, wie später im einzelnen beschrieben wird. Genauer gesagt wird der trommelartige Abschnitt 4b von Trägern 26 durch an den Trägern 26 angebrachte Verbindungsstücke 24a, 24h auf einer mittleren Höhe gehalten. Bezugsziffer 25 bezeichnet eine Trageachse, über die die Verbindungsstücke 24a und 24b von den Trägern 26 schwenkbar gehalten werden, und die Verbindungsstücke 24a und 24b sind über eine Koppelstange 20 zwischen den sich entsprechenden Winkelabschnitten der genannten Verbindungsstücke 24a, 24b miteinander verbunden. Wenn die genannte Koppelstange 20 von einer einem Zylinder 21 zugeordneten Kolbenstange 22 gezogen wird, senkt sich der untere Abschnitt 4c des Kulturgefäßes durch Schwenkung um die Tragachse 25; dadurch wird der untere Abschnitt 4c von dem trommelartigen Abschnitt 4b des Kulturgefäßes getrennt. Die Verbindungsstücke 24a, 24b sind mit ihren Vorderenden an dem unteren Abschnitt 4c des Kulturgefäßes 4 schwenkbar angebracht, so daß der untere Abschnitt 4c in waagerechter Position gehalten werden kann, wie in Fig. 4B gezeigt, was das Entfernen der immobilisierenden Carrier aus dem Kulturgefäß 4 erleichtert
Wie aus der vorangehenden Beschreibung ersichtlich wird, liegt der Vorteil der Vorrichtung für Zellkultivierung darin, dar ihr unterer Abschnitt abtrennbar ist und dar dadurch das Entfernen der immobilisierenden Carrier aus der Vorrichtung erleichtert wird.
Voranstehend wurde beschrieben, was zur Zeit als bevorzugte Ausführungsform der Erfindung gilt, es ist klar, daß verschiedene Abänderungen daran vorgenommen werden können.

Claims

1. Verfahren für die Fermentation einer Zellkultur, wobei die Fermentation die Vermehrung (Proliferation) adhäsiver Zellen in einem Haupt-Kulturgefäß (4) umfaßt, das ein flüssiges Medium und einen immobilisierenden, hauptsächlich aus keramischem Material bestehenden Carrier enthält, wobei die Zellen am Carrier haften und physiologisch aktive Substanz produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß

- vor dem Eintritt in das Haupt-Kulturgefäß (4) die genannten adhäsiven Zellen in einem vorgeschalteten Kulturgefäß (1), das, verglichen mit dem Haupt-Kulturgefäß (4), ein kleineres Format hat, vermehrt werden, und daß das vorgeschaltete Kulturgefäß (1) ein Nährmedium, das in einem intermediären Reservoir (3) eingestellt wurde, und einen immobilisierenden Carrier, insbesondere Mikrocarrier, enthält,

- nach der Vermehrung in dem vorgeschalteten Kulturgefäß (1) die Zellen vom Carrier abgestreift und in einem Medium gesammelt und suspendiert werden,

- die Verteilung der suspendierten Zellen im Medium homogenisiert wird und die Suspension in das intermediäre Reservoir überführt und im intermediären Reservoir (3) gesammelt wird,

- und daß die homogenisierte Zellsuspension, wie gewünscht und notwendig, vom intermediären Reservoir (3) in das Haupt-Kulturgefäß (4) überführt wird und dort weiter kultiviert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die homogenisierte Zellsuspension dem Kulturgefäß (4) gleichzeitig von dessen Kopf und Boden zugeführt wird, um es den Zellen zu ermöglichen, gleichmäßig auf dem immobilisierenden Carrier zu haften.

3. Vorrichtung für Zellkulturen zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, umfassend ein Haupt-Kulturgefäß (4), das ein flüssiges Medium und einen hauptsächlich aus keramischem Material bestehenden, immobilisierenden Carrier enthält, sowie zu kultivierende Zellen darin, die am Carrier haften und physiologisch aktive Substanz Produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß ein vorgeschaltetes Kulturgefäß (1), das, verglichen mit dem Haupt-Kulturgefäß (4), ein kleineres Format hat, vorgesehen ist, und daß ein intermediäres Reservoir (3) zwischen dem vorgeschalteten Kulturgefäß (1) und dem Haupt-Kulturgefäß (4) zwischengeschaltet ist.

4. Vorrichtung für die Zellkultur zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 und 2 und gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturgefäß (4) be-25 sitzt

- einen kopfstehend-trichterförmigen Einlaß (34), der oberhalb des immobilisierenden, die Vorrichtung ausfüllenden Carriers angeordnet ist und der eine perforierte Bodenplatte (35) für die gleichmäßige Verteilung einer Menge der Zellsuspension besitzt, die von oben auf den immobilisierenden Carrier eingegeben wird,

- eine Netzplatte (36), die unter dem immobilisierenden Carrier angebracht ist, um ihn zu stützen,

- und eine weitere perforierte Platte (37), die ebenfalls unter dem immobilisierenden Carrier angeordnet ist und die zur gleichförmigen Verteilung einer weiteren Menge an Zellsuspension dient, die vom Boden her dem immobilisierenden Carrier aufgegeben wird.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin besitzt:

- einen oberen Verschlußdeckel (32) der abnehmbar den kopfstehend-trichterförmigen Einlaß (34) trägt, der die perforierte Bodenplatte (35) für die gleichmäßige Verteilung einer Menge der Zellsuspension besitzt, die von oben auf den immobilisierenden Carrier eingegeben wird,

- einen den Mittelbereich bildenden trommelartigen Abschnitt (4b), der mit einem Träger (26) verbunden ist,

- einen unteren Abschnitt (4c), der abnehmbar mit der Netzplatte (36) verbunden ist, die den immobilisierenden Carrier von unten stützt, sowie die perforierte Platte (37), die zur gleichförmigen Verteilung einer weiteren Menge an Zellsuspension von unterhalb des Carriers dient,

- wobei der untere Abschnitt (4c) vom Deckel (32) und vom trommelartigen Abschnitt (4b) trennbar ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der trennbare untere Abschnitt (4c) so angetrieben ist, daß er gehalten oder getrennt ist von dem übrigen Abschnitt über Verbindungshebel (24a, 24 b) und einen Zylinder (21).

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungshebel mit dem trommelartigen Abschnitt, der mit dem Träger (26) fest verbunden ist, auf einer Seite verbunden sind, und daß der Zylinder (21) mit den Verbindungshebeln (24a, 24b) verbunden ist, so daß die Vorrichtung abgesenkt werden kann.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Einstellungstank (8) für das Kulturmedium dazu dient, den Nahrungs- und Gasgehalt in der Kulturflüssigkeit einzustellen, sowie dazu,

die Kulturflüssigkeit im Hauptgefäß, das mit immobilisierendem Carrier gefüllt ist, der hauptsächlich aus keramischem Material besteht, zirkulieren zu lassen.

9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das intermediäre Reservoir (3) für die Zirkulation und für die Einstellung für das flüssige Kulturmedium im vorgeschalteten Gefäß (1) dient und, nach Beendigung der Zellvermehrung und nachdem die Zirkulation des flüssigen Mediums angehalten ist, dazu dient, die Menge des flüssigen Kulturmediums einzustellen, die dem Haupt-Kulturgefäß (4) zugeführt wird.