DE68910828T2 - Ein verstärkungs-testverfahren für hydrolase-enzyme. - Google Patents

Ein verstärkungs-testverfahren für hydrolase-enzyme.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft enzymgebundene Assays.
  • Alkalische Phosphatase (EC 3.1.3.1.) ist eine weitverbreitet verwendete Enzymmarkierung für Immunoassays und kann auch zur Bestimmung von Gensonden verwendet werden.
  • Andere Hydrolasen haben teilweise aufgrund der Nichtverfügbarkeit geeigneter Substrate zur Verwendung mit ihnen in Diagnoseverfahren keine so weitverbreitete Verwendung genossen. Die vorliegende Erfindung offenbart eine Familie neuer Substrate für eine Reihe von Hydrolasen, einschließlich alkalischer Phosphatase, welche Substrate hydrolysiert werden, um eine prosthetische Gruppe für ein Detektorenzym zu erzeugen, wodurch eine große Verstärkung des durch die Hydrolase erzeugten Signals geschaffen wird.
  • Ein vor kurzem entwickeltes Verfahren zum Bestimmen dieses Enzyms beruht auf der Hydrolyse von NADP&spplus; in einem Primärschritt und dem darauffolgenden Zyklieren, in einem Sekundärschritt, des erzeugten NAD&spplus;, was zur Verstärkung des Signals führt (Johannsson et al., "J.Immun.Methods", (1986), 87, 7-11, durch Verweis hierin eingeschlossen). Die Technik hat aufgrund der relativen Instabilität des primären Substrats und der enzymatischen Kreuzkopplung zwischen Bestandteilen, die zu nicht akzeptablen Hintergrundsignalen führen kann, noch keine weitverbreitete Verwendung gefunden.
  • Eine neuere Technik zum sensitiven Nachweis von Ribonuklease, die GB-2156518A der Anmelderin der vorliegenden Erfindung, beruht auf der Herstellung einer prostethischen Gruppe oder ihres Vorläufers aus einem Prosthetogen. Typischerweise erzeugt das primäre Enzym bei dieser Methodik Riboflavin, das in der Folge unter Verwendung eines oder mehrerer Zusatzenzyme in FMN oder FAD umgewandelt wird. Eine dieser prosthetischen Gruppen wird mit einem Apoenzym kombiniert, um ein katalytisch aktives Holoenzym zu erzeugen, das wiederum die signalerzeugende Reaktion katalysiert. In einem Beispiel wandelt das FAD Apoglukoseoxidase (EC 1.1.3.4) in das entsprechende Holoenzym um, das die Oxidation von Glukose katalysiert, und dadurch Wasserstoffperoxid erzeugt, das durch Peroxidase (EC 1.11.1.7) verwendet werden kann, um ein farbiges Produkt (löslich oder unlöslich) oder Licht zu erzeugen (Thorpe und Kricka, "Methods Enzymol." (1986), 133, 331 353, durch Verweis hierin eingeschlossen). In einem weiteren Beispiel wandelt das FAD apo-D-Aminosäureoxidase (EC 1.4.5.3) in das entsprechende Holoenzym um, das die Oxidation von, beispielsweise, D-Alanin katalysiert, was wiederum zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid führt. Das kann kolorimetrisch (lösliches oder unlösliches Produkt), luminometrisch (Decker und Hinkkanen, "Methods Enzymol.", (1986), 122, 185-192, durch Verweis hierin eingeschlossen) oder unser Verwendung eines geeigneten elektrischen oder elektronischen Biosensors bestimmt werden.
  • Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweisen eines Hvdrolaseenzyms (E.C.Division 3), vorzugsweise einer alkalischen Phosphatase, geschaffen, welches die Verwendung des Enzyms umfaßt, um die Bildung aus einem Prosthetogen der prosthetischen Gruppe Flavinadenindinukleotid (FAD) oder eines Analogs davon zu katalysieren, das fähig ist, ein Holoenzym zu bilden, wobei das Prosthetogen in der Art eines substituierten FAD oder FAD-Analogs ist, wobei die prosthetische Gruppe durch enzymatisches hydrolytisches Entfernen des Substituenten erzeugt wird; das Kombinieren der prosthetischen Gruppe des FAD-Typs mit einem Apoenzym, um ein Holoenzym zu bilden, und das Verwenden des genannten Holoenzyms als einen Katalysator in einer Signalerzeugungsreaktion. Je nach der genauen Art des Substituenten kann die Erfindung auf den sensitiven Nachweis einer Reihe von Hydrolaseenzymen angewandt werden, einschließlich, aber ohne Beschränkung auf, Phosphatasen, Phosphodiesterasen, Esterasen, Nukleasen und Sulfatasen.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Prosthetogen ein FAD-Phosphat (FADP), und die Hydrolase ist eine Phosphatase. Dieses Verfahren hat den großen Vorteil, daß die prosthetische Gruppe, FAD, direkt durch Wirkung eines Phosphataseenzyms auf das Prosthetogen, FADP, gebildet wird, ohne daß es notwendig ist, irgendwelche zusätzlichen Umwandlungsenzyme hinzuzufügen. Die Wirksamkeit und die praktische Nützlichkeit der Erfindung bezogen auf Phosphataseenzyme werden durch die zusätzliche Entdeckung und Identifizierung von lagerstabilen Apoenzymen stark verbessert, von denen zwei als Beispiel angegeben sind, für die das Prosthetogen, FADP, trotz seiner einer prosthetischen Gruppe ähnlichen Struktur zwei wichtige Eigenschaften hat: es besitzt keine wesentliche Aktivität an sich als eine prosthetische Gruppe (was hohe Hintergrundsignale verursachen würde) und es stört nicht wesentlich die Bildung des Holoenzyms aus Apoenzym und FAD (was die Empfindlichkeit des Systems verringern würde).
  • Geeignete Apoenzyme umfassen apo-D-Aminosäureoxidase und Apoglukoseoxidase, wie oben erwähnt, sowie apo-L-Aminosäureoxidase, Apoxanthinoxidase und andere Apoenzyme, die Fachleuten klar sein werden. Apo-D-Aminosäureoxidase ist ein bevorzugtes Apoenzym für viele Anwendungen, da es sehr lagerstabil ist, und hat kinetische Eigenschaften, die es erlauben, die Technologie in "Eintopf"-Form zu verwenden, wobei der mit Analyt verbundenen alkalischen Phosphatase alle Bestandteile in einem einzigen Vorgemisch hinzugefügt werden. Geeignete Substrate dafür sind D-Alanin, D-Methionin und D-Prolin. Zum Maximieren der Empfindlichkeit der Erfindung ohne die Aufnahme von Schwanzend- Zyklierungsbestandteilen (siehe unten) ist die Verwendung von Apoglukoseoxidase vorteilhaft, obwohl dessen Verwendung ein zweistufiges Format erfordert, bei dem der erste Schritt, der die Hydrolyse von FADP umfaßt, bei pH 8,0 und der zweite Nachweis-Schritt bei einem geringeren pH-Wert durchgeführt wird.
  • Wenn gewünscht, kann die Empfindlichkeit des signalerzeugenden Nachweissystems auf der Basis von apo-D-Aminosäureoxidase stark verstärkt werden, jedoch auf Kosten einer höheren Komplexität, indem "Schwanzendzyklierung" verwendet wird. Bei diesem Verfahren kann das Holoenzym verwendet werden, um eine Reaktion zu katalysieren, welche zur Herstellung eines zyklierbaren Substrats führt, das ein nachweisbares Produkt erzeugt. Für die meisten Anwendungen, die die Bestimmung von mehr als 0,01 Attomol alkalischer Phosphatase in etwa einer Stunde umfassen, ist das zusätzliche Zyklierungsverfahren nicht erforderlich. Es wäre jedoch bei Diagnoseverfahren vorteilhaft, die den Nachweis einer sehr kleinen Anzahl von Viruspartikeln oder Genen erfordern (wie beispielsweise bei direkten Verfahren für HIV).
  • Die Reaktion, die zur Produktion des zyklierbaren Substrats führt, kann selbst ein nachweisbares Nebenprodukt entstehen lassen. Beispielsweise kann Wasserstoffperoxid erzeugt werden, das unter Verwendung von Meerrettichperoxidase nachgewiesen werden kann, um ein Signal zu erzeugen. Beispiele für holoenzymkatalysierte Reaktionen, die zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid führen, wurden oben ebenfalls angegeben.
  • Das erzeugte Nebenprodukt kann das gleiche wie das bei der Reaktion erzeugte sein, die zur Produktion des zyklierbaren Substrats führt, und kann daher auf die gleiche Art nachgewiesen werden, wobei von den beiden Verfahren eine zusätzliche Wirkung erzeugt wird.
    • Prosthetogensubstrate für Phosphatasen
  • FAD kann geeigneterweise an irgendeiner oder mehreren der in folgender Formel I mit A-E markierten Positionen eine Phosphatgruppe tragen.
  • Jedoch kann jedes phosphorylierte FAD-Analog verwendet werden, das nach Hydrolyse durch Phosphatase ein FAD-Analog ergibt, das als eine prosthetische Gruppe für ein Apoenzym wirkt. Möglichkeiten für FAD-Analoge umfassen jene, bei denen eine Hydroxygruppe zum Tragen von Phosphat auf dem aromatischen Kern von einem oder beiden von Flavin oder Adenin oder auf einem Substituenten dieser Kerne vorgesehen ist. Beispielsweise können Hydroxyalkylsubstituenten an den unsubstituierten Positionen des Flavinbenzolrings vorgesehen sein. Alternativ dazu könnten die Flavin- und/oder Adeninringe in FADP auf andere Arten strukturell verändert sein, die vorteilhaft sein könnten. Vorzugsweise wird jedoch ein FAD-Analog verwendet, bei dem eine Hydroxymethylgruppe anstelle von einer oder beiden der Flavinmethylgruppen vorgesehen ist. Für jedes Analog können die Phosphatgruppen dann an einer oder mehreren der vorhandenen Hydroxygruppen vorgesehen sein. Daher können, wenn zwei Hydroxymethylgruppen im Flavin von FAD vorhanden sind, eine, beide oder keine davon eine Phosphatgruppe im phosphorylierten Analog tragen.
  • Diese Verbindungen sind neu und schaffen einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung. Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Synthese dieser Verbindungen. Ein geeignetes Verfahren umfaßt die Ümwandlung eines FADP-Vorläufers mit einer geschützten Phosphatgruppe in FADP. Die Phosphatgruppe kann als eine Diphenylphosphatgruppe geschützt sein, beispielsweise wie im nachfolgend gezeigten Reaktionsschema.
  • Verbindungen, die eine Phosphatgruppe an der 2'- und/oder 3'-Position des Zuckermoleküls aufweisen, werden zur Verwendung in Assayverfahren gemäß vorliegender Erfindung bevorzugt.
  • Die Phosphatase kann selbst der primäre Analyt sein, oder sie kann Teil eines Assayverfahrens zum Nachweisen eines anderen Analyten sein.
    • Andere Hydrolaseenzyme und Substrate zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung
  • Einige geeignete Enzym/Substrat-Paare sind nur durch Beispiel in der folgenden Tabelle angeführt.
  • FADX ist das Substrat, wobei -OX ein -OH an einer oder mehreren der Positionen A, B, C, D oder E von Formel I oder die Hydroxylgruppe eines geeigneten hydroxylhältigen Analogs von FAD ersetzt (siehe oben). Enzym bevorzugte Position in Formel I (EC-Zahl) Phosphatase (3.1.3.1 und 3.1.3.2) Sulfatase (3.1.6.1) Carboxylesterase (3.1.1.1) Acetylesterase (3.1.1.6) Phosphat Sulfat Karbonsäure Essigsäure keine Toxinphosphodiesterase (3.1.15.1) Nukleosid- oder Deoxnukleosid-5'-Phosphat
  • Die Erfindung umfaßt auch Sets zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Ein geeignetes Set kann ein FAD-Substrat für das nachzuweisende Enzym und ein signalerzeugendes System zum Nachweis der Gegenwart von FAD umfassen. Beispiele für geeignete signalerzeugende Systeme umfassen die oben angeführten.
  • Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele nur beispielhaft im spezielleren veranschaulicht.
    • Beispiel 1: Herstellung von FAD-2' (3')-Phosphat Herstellung A
  • N-Benzoyladenosin (1) wurde durch Umsetzung mit einem Überschuß an Trimethylorthoacetat und p-Toluolsulfonsäure, gefolgt von Umlagerung des Zwischenstufen-Orthoesters mit 50% Essigsäure, in 3'-Acetat (3) umgewandelt. Das rohe 3'-Acetat wurde durch Blitzchromatographie über SiO&sub2;(230-400 Mesh) mit CHCl&sub3;-MeOH 93:7 gereinigt und nacheinander mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid und Diphenylphosphochloridat in Pyridin behandelt. Nach dem Einengen wurde der Rückstand in Dichlormethan aufgelöst und mit einem Überschuß an Dichloressigsäure umgesetzt. Das Rohprodukt wurde wie zuvor gereinigt [SiO&sub2; (230-400 Mesh) mit CHCl&sub3;-MeOH 96:4] und ergab N-Benzoyl-3'-acetyladenosin-2'-diphenylphosphat (5). Bei der Reaktion von (5) mit 4-Nitrophenyl-4-morpholinphosphochloridat und 1-Methylimidazol in CH&sub3;CN wurde das geschützte Morpholinphosphat (6) erhalten, das wie zuvor gereinigt wurde [SiO&sub2; (230-400 Mesh) mit CHCl&sub3;-MeOH 97:3]. Das Entfernen der Schutzgruppe wurde durch Umsetzung mit Tetra-n-butyl-ammoniumacetat erreicht und das gebildete Morpholinphosphat (7) wurde bei 50ºC 18 Stunden lang mit einem Überschuß an Triacetyl-FMN in DMF gekoppelt.
  • Entfernen der Schutzgruppe vom Rohprodukt wurde durch 36stündiges Umsetzen bei Raumtemperatur mit konzentriertem NH&sub3;-Äthanol erreicht. Die Reaktionsmischung wurde eingeengt, bis sie neutral war, in 0,01 N HCl aufgelöst und mit CHCl&sub3; (3x) extrahiert. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 1N HCl auf 2 eingestellt und die Lösung 2 h lang gerührt, um jegliches möglicherweise gebildetes 2',3'-zyklisches Phosphat zu hydrolysieren.
  • Nach dem Hinzufügen eines NH&sub3;-Überschusses wurde die Lösung eingeengt, bis sie neutral war, und dann lyophilisiert.
  • Rohes 2'(3')-FADP wurde durch FPLC auf einer Mono Q HR 10/10-Anionenaustauschsäule (Pharmacia) mit einem H&sub2;O/1 M Ammoniumformiat (pH 6,5)-Gradienten isoliert. Die mit 0,65-0,8 M Ammoniumformiat eluierenden Fraktionen wurden vereint und gefriergetrocknet. Dieses Material wurde weiter durch Anionenaustauschchromatographie gereinigt, was unter den gleichen Bedingungen wie oben eine Fraktion ergab, die bei 0,65-0,8 M Ammoniumformiat eluierte, auf die nach dem Gefriertrocknen und Wiederauflösen in 10 mM Tris-Puffer (pH 8,0, 1 mM Mg Cl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;) durch alkalische Phosphatase eingewirkt wurde, um ein Produkt zu ergeben, das an der gleichen Stelle wie FAD eluierte und fähig war, Apoglukoseoxidase zu rekonstituieren. FAD-Spuren konnten durch Behandlung mit einem geeigneten Apoenzym, gefolgt von Ultrafiltration, um die Makromoleküle zu entfernen, entfernt werden.
    • Herstellung B
  • Rohes 2'(3')-FADP kann auch hergestellt werden, indem Adenosin 2',3'-zyklisches Phosphat-5'-Phosphormorpholidat (9) (J.G. Moffatt und H.G. Khorana, "J.Amer.Chem.Soc.", 83 (1961) 663, durch Verweis hierin eingeschlossen) mit Triacetyl FMN gekoppelt wird, gefolgt von NH&sub3;-Schutzgruppenentfernung, HCl-Behandlung und Reinigung, wie oben beschrieben.
  • Alternativ dazu wurde Adenosin 2'3'-zyklisches Phosphat-5'-Phosphat (10) (A.Simoncsits und J.Tomasz, "Biochem.Biophys.Acta." 395 (1975) 74, durch Verweis hierin eingeschlossen) durch Umsetzung mit Dizyklohexylcarbodiimid und Morpholin in (9) umgewandelt und dann wie oben gekoppelt, von der Schutzgruppe befreit und gereinigt.
  • Diese Verfahren werden im folgenden Reaktionsschema gezeigt.
    • Beispiel 2: (Alkalische)Phosphataseassay A. Kolorimetrisches Assay unter Verwendung von Apoglukoseoxidasedetektor
  • Bei diesen Versuchen enthielt das verwendete FADP 0,036% FAD. Um das Hintergrundsignal auf ein annehmbares Maß zu verringern, wurde die Glukosekonzentration in der zweiten Inkubationsmischung auf 10% ihres optimalen Werts verringert.
  • Eine typische Mischung für die Bestimmung von alkalischer Phosphatase ist folgende:
  • 0,2 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, der 1 mM MgCl&sub2; und 0,1 mM ZnCl&sub2; enthält
  • 0,2 mM FAD-Phosphat
  • Alkalische Phosphatase
  • Gesamtvolumen 0,05 mL
  • Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert, und dann weitere 0,05 mL der folgenden Mischung hinzugefügt
  • 0,2 uM Apoglukoseoxidase
  • 0,01 M Glukose
  • 6 ug Peroxidase
  • 16 mM 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure
  • 1,6 mM 4-Aminoantipyrin
  • 0,3 M Bis-Tris pH 6,1
  • Gesamtvolumen 0,1 mL, pH 7,0. Die Farbentwicklung folgte bei 520 nm. Nach einer anfänglichen Verzögerung aufgrund der Rekonstitution der Apoglukoseoxidase ist die Farberzeugung in der Zeit linear. Figur 1 zeigt die dekadische Extinktion, die nach Subtraktion einer keine alkalische Phosphatase enthaltenden Kontrollprobe für eine Inkubationszeit von 1 Stunde bei Raumtemperatur mit unterschiedlichen Mengen alkalischer Phosphatase erhalten wurde. Unter diesen Bedingungen konnte 1 amol alkalische Phosphatase nachgewiesen werden.
    • B. Kolorimetrische Assayphosphatase unter Verwendung von apo-D-Aminosäureoxidasedetektor
  • Die Verwendung von apo-D-Aminosäureoxidase, deren Holoenzym ein pH-Optimum von 8,0-9,0 aufweist, ermöglicht es, das obige Assay in einem einzigen Topf durchzuführen:
  • 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, der 1 mM MgCl&sub2; und 0,1 mM ZnCl&sub2; enthielt
  • 0,1 mM FADP
  • 0,1 uM apo-D-Aminosäureoxidase
  • 35 mM D-Alanin
  • 8 mM 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure
  • 0,8 mM 4-Aminoantipyrin
  • 6 ug Peroxidase
  • Alkalische Phosphatase
  • Gesamtvolumen 0,1 mL
  • Die obigen Ingredienzien können im vorhinein gemischt und der alkalischen Phosphatase direkt hinzugefügt werden. Figur 2 zeigt, wie die dekadische Extinktion mit der Zeit bei 37ºC in der Gegenwart unterschiedlicher Mengen an alkalischer Phosphatase zunimmt. Die dekadische Endextinktion nach Subtraktion des Blindwerts für eine Inkubationszeit von 30 min wird in Figur 3 gezeigt. Wieder konnte 1 amol alkalische Phosphatase leicht nachgewiesen werden.
  • D-Aminosäureoxidase zeigt Wirkung bei einer Reihe von Aminosäuren, und eine höhere Oxidationsrate wurde unter Verwendung von D-Methionin oder D-Prolin in der gleichen Konzentration erreicht. Die Raten bezogen auf D-Alanin betrugen 2,5 bzw. 3,0.
    • Beispiel 3: Herstellung von Enzymen A. Herstellung von Apoglukoseoxidase
  • Apoglukoseoxidase wurde nach dem Verfahren von Morris und Buckler ("Methods Enzymol." (1983) 92, 413-425, durch Verweis hierin eingeschlossen) hergestellt und letzte Spuren von Holoenzym durch eine Behandlung mit Phenylessigsäure entfernt; ein Verfahren auf der Basis der von Hemmerich et al. ("Nature" (1967), 213, 728-730) durch Verweis hierin eingeschlossen) vorgelegten Information entfernt. Das Apoenzym kann mit einem geeigneten Antikörper gegen das Holoenzym stabilisiert werden (Morris, "Anal.Biochem." (1985) 151, 235-241, hierin durch Verweis eingeschlossen).
    • B. Herstellung von apo-D-Aminosäureoxidase
  • Apo-D-Aminosäureoxidase wurde nach dem von Brumby und Massey (Biochem.Prep. (1968), 12, 29-41, hierin durch Verweis eingeschlossen) beschriebenen Verfahren hergestellt. Restliches Holoenzym wurde durch Absorbieren des Apoenzyms an Blue Sepharose, Wegwaschen von ungebundenem Holoenzym und darauffolgendem Eluieren des Apoenzyms (Leonil et al. "J.Chromatography" (1985), 347, 316-319, hierin durch Verweis eingeschlossen) entfernt. Das Enzym wurde gegen 20 mM Bis Tris-Propanpuffer, pH 7,0, der 5 g/L Mannit enthielt, entsalzt, aliquotiert und gefriergetrocknet.
    • C. Herstellung von phosphatasefreier Peroxidase
  • Es wurde festgestellt, daß im Handel bezogene Peroxidase unterschiedliche Phosphatasemengen enthielt. Diese wurde entfernt, indem die Peroxidase in 20 mM Bis-Trispropan mit pH 7,0, die 5 g/L Mannit enthielt, aufgelöst und die Mischung durch ein mit dem gleichen Puffer äquilibriertes Kalziumphosphat/Zellulose-Gel hindurchgeschickt wurde, woraufhin die Phosphataseverunreinigungen entfernt wurden. Das Eluat wurde aliquotiert und gefriergetrocknet.
    • Beispiel 4: Entfernen von FAD-Spuren aus FADP
  • Verbleibende FAD-Spuren wurden unter Verwendung von Apoglukoseoxidase entfernt, die FAD fest bindet, aber FADP nicht bindet.
    • A. Rührtank-Ultrafiltrationsreaktor zur Verwendung von löslicher Apoglukoseoxidase
  • Apoglukoseoxidase (2,5 uM) wurde mit FADP (200 uM) bei Raumtemperatur gemischt. Die Abnahme der Menge an verbleibendem FAD im Verhältnis zur Menge an vorhandenem FADP mit der Zeit wird in Figur 4 gezeigt. Nach 30 Minuten wurde die Mischung ultrafiltriert, um eine FADP-Probe zu ergeben, die weniger als 0,002% FAD enthielt.
    • B. Festbett-Pfropfströmungsreaktor zur Verwendung von immobilisierter Apoglukoseoxidase
  • Freie Aminogruppen wurden in Glukoseoxidase eingebracht, wie von Royer ("Methods Enzymol." (1987), 135, 141-146, durch Verweis hierin eingeschlossen) beschrieben. Dieses derivatisierte Enzym (25 mg) wurde mit TresylSepharose 4B (5 mL) in 0,1 M Natriumbikarbonat gemischt, das 0,5 M NaCl enthielt, und 16 Stunden lang bei 4ºC leicht gerührt. Nach dem Blockieren von nicht umgesetzten Tresylgruppen wurde das Gel in eine Säule (6 mm x 10 mm Durchmesser) gepackt und mit 1 mL 25 mM Phosphat, pH 1,1 behandelt, das 20% Glycerin enthielt, um die prosthetische Gruppe zu entfernen. Dem folgte sofort 20 mL 1 M Phosphatpuffer, pH 7,0. Die Säule wurde mit 20 mM Bis Tris-Propan, pH 7,0 äquilibriert, und 10 mL 5 mM FADP im gleichen Puffer wurden durch die Säule bei 0,61 mL/min in einer Konfiguration mit geschlossener Schleife perkoliert. Der Anteil an FAD wurde nach 18 Minuten bei 4ºC von 0,034% auf 0,0034% des FADP verringert.
  • In den nächsten vier Beispielen wird alkalische Phosphatase verwendet, um die Hydrolyse von FADP zu katalysieren, um FAD zu erhalten. Das erzeugte FAD wird in der Folge mit apo-D-Aminosäureoxidase (apo DAO) kombiniert, um holo-D-Aminosäureoxidase (holo DAO) zu ergeben. In der Abwesenheit jeglichen Zyklierens greift das signalerzeugende System auf die Verwendung von holo-DAO zurück, um die Umwandlung von D-Alanin in Pyruvat mit der Erzeugung von Wasserstoffperoxid zu katalysieren. Mit dem Zyklieren (in den nachfolgenden graphischen Darstellungen in strichlierter Linie gezeigt) wird Pyruvat oder ein aus Pyruvat erzeugtes Produkt mit einer weiteren Verbindung zwischenumgewandelt, wobei die Zwischenumwandlungsreaktionen nachweisbares Wasserstoffperoxid erzeugen. Beispiel 5 Alkalische Phosphatase D-Alanin nachweisbares Produkt Laktatdehydrogenase Pyruvat Laktat Laktatoxidase
  • Das folgende Pyruvat-L-laktat-Zyklierungssystem wurde in einem Gesamtvolumen von 1 ml aufgebaut.
  • 0,2 m Tris HCl, pH 8,0
  • 1 mM Mg²&spplus;
  • 0,1 mM Zn²&spplus;
  • 1 mM NADH
  • 2 mM 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure
  • 0,2 mM 4-Aminoantipyrin
  • 60 ug/ml Meerrettichperoxidase
  • 10 Einheiten Lactatdehydrogenase
  • 1,3 Einheiten (0,1 mg) Lactatoxidase von Pediococcus sp.
  • Die dekadische Extinktion der Lösung bei 520 nm wurde überwacht. Dann wurde der Reaktionsmischung Pyruvat hinzugefügt und die Veränderungsrate der dekadischen Extinktion überwacht. Die Ergebnisse sind in nachfolgender Tabelle angegeben. Rate: Veränderung der dekadischen Extinktion/min Pyruvatkonzentration Hintergrund nach der Pyruvatzugabe Nettorate
  • Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß Pyruvat-Laktat-Zyklierung in der Gegenwart von Laktatdehydrogenase und Laktatoxidase möglich ist und zur Erzeugung von nachweisbarem Wasserstoffperoxid führt.
  • Andere Zyklierungssysteme, die verwendet werden könnten, umfassen die durch die folgenden Reaktionsschemata dargestellten. In jedem Fall umfaßt der schließlich stattfindende Farbbildungsvorgang das erzeugte H&sub2;O&sub2;, das an einer peroxidasekatalysierten Reaktion teilnimmt. Beispiel 6 D-Alanin D-Aminosäureoxidase Pyruvat Pyruvatdecarboxylase Acetaldehyd Alkoholoxidase (EC 1.1.3.13) Alkoholdehydrogenase (EC 1.1.1.1) Äthanol Beispiel 7 D-Alanin Pyruvat L-Malat Laktatoxidase (EC 1.13.12.4. 1.1.3.15) Laktat: Malatdehydrogenase (EC 1.1.99.7) L-Laktat Oxal acetat Beispiel 8 D-Alanin Pyruvat Pyruvatcarboxylase (EC 6.4.1.1) Oxaloacetat Malatoxidase (EC 1.1.3.3) Malatdehydrogenase (EC 1.1.1.37) Malat
  • Von den bisher beschriebenen Systemen werden die auf den Enzymen DAO und GOD basierenden zur Verwendung ohne Schwanzendenzyklierung bevorzugt.
  • DAO hat den Vorteil, daß es wirksam bei pH 8 funktionieren kann, der auch für alkalische Phosphatase geeignet ist. So können die Bestandteile des Assays alle vorgemischt werden und bilden ein "Eintopf"-Assaysystem, das sehr zweckmäßig ist.
  • GOD hat den Vorteil, daß es ein sehr stabiles Holoenzym mit einer hohen Umsatzzahl bildet. Seine Verwendung ergibt ein Assay mit sehr hoher Empfindlichkeit, wird aber am besten als ein Zweitopfsystem betrieben, da GOD am besten unterhalb pH-Wert 8,0 arbeitet, der für die nachzuweisende Phosphatase am besten geeignet ist.

Claims (21)

1. Verfahren zum Bestimmen eines Hydrolaseenzyms, welches die Verwendung des Enzyms, um die Bildung von Flavinadenindinukleotid (FAD) oder eines FAD-Analogs, das fähig ist, ein Holoenzym zu bilden, aus einem substituierten FAD- oder FAD-Analogsubstrat durch hydrolytisches Entfernen des Substituenten zu katalysieren, das Kombinieren des FAD oder FAD-Analogs mit einem Apoenzym, um ein Holoenzym zu bilden, und die Verwendung des genannten Holoenzyms als Katalysator in einer signalerzeugenden Reaktion umfaßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das nachzuweisende Enzym ein Phosphataseenzym ist, das die Bildung von FAD oder FAD-Analog aus einem FAD-Phosphatsubstrat katalysiert.
3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Apoenzym apo-D-Aminosäureoxidase (apo-DAO) ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das so gebildete holo-DAO auf ein Aminosäuresubstrat wirkt, um H&sub2;O&sub2; als nachweisbares Nebenprodukt zu erzeugen.
5. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Bestandteile des Assays vorgemischt und einer Probe hinzugefügt werden, von der vermutet wird, daß sie ein nachzuweisendes Enzym enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Substrat für DAO aus D-Alanin, D-Methionin und D-Prolin ausgewählt ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, worin das apo-Enzym apo-Glukoseoxidase (apo-GOD) ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das so in einem ersten Schritt gebildete FAD in einem zweiten Schritt verwendet wird, um holo-GOD zu erzeugen, das auf Glukose einwirkt, um H&sub2;O&sub2; als nachweisbares Produkt zu erzeugen.
9. Assayset zum Bestimmen eines Hydrolaseenzyms, welches Set ein substituiertes FAD- oder substituiertes FAD-Analogsubstrat umfaßt, das durch die genannte Hydrolase hydrolysierbar ist, um FAD oder ein Analog von FAD zu erzeugen, das fähig ist, ein Holoenzym zu bilden, ein zur Bildung eines Holoenzyms mit FAD oder dem genannten Analog fähiges Apoenzym und ein Reaktionssystem, das zur Initiation durch das genannte Holoenzym fähig ist, um ein nachweisbares Produkt zu erzeugen.
10. Assayset nach Anspruch 9, das ein FAD-Phosphatsubstrat oder FAD-Analogphosphatsubstrat zum Nachweisen einer Phosphatase, ein apo-Enzym, das zur Bildung eines Holoenzyms mit FAD oder dem genannten FAD-Analog fähig ist, und ein Reaktionssystem enthält, das zur Initiation durch das genannte Holoenzym, um ein nachweisbares Produkt zu erzeugen, fähig ist.
11. Assayset nach Anspruch 9, worin das Apoenzym apo-DAO ist.
12. Assayset nach Anspruch 11, welches ein Aminosäuresubstrat für holo-DAO und Mittel zum Nachweisen der Produktion von H&sub2;O&sub2; enthält.
13. Assayset nach Anspruch 11, worin das Substrat für DAO aus D-Alanin, D-Methionin und D-Prolin ausgewählt ist.
14. Assayset nach Anspruch 11, worin dessen Reaktionsbestandteile in einer vorgemischten Form vorliegen.
15. Assayset nach Anspruch 9, worin das Apoenzym apo-GOD ist.
16. Assayset nach Anspruch 15, worin die Bestandteile zum Bilden von FAD oder FAD-Analog von den Bestandteilen für die durch holo-GOD zu katalysierende Reaktion getrennt sind, sodaß die beiden Reaktionen als getrennte Schritte durchgeführt werden können.
17. Substituiertes FAD oder FAD-Analog, worin der genannte Substituent durch ein Hydrolaseenzym hydrolytisch entfernbar ist, um FAD oder ein FAD-Analog zu ergeben, das fähig ist, ein Holoenzym aus einem Apoenzym zu bilden.
18. Verbindung nach Anspruch 17, die einen genannten Substituenten an der 2'- und/oder 3'-Position ihrer Zuckergruppe enthält.
19. FAD-Derivatsubstrat für ein Hydrolaseenym, wobei das genannte Derivat die Formel
aufweist, worin jedes A, B, C, D und E unabhängig aus Hydroxy und Substituent X ausgewählt ist, jedes F und G unabhängig aus Wasserstoff, Hydroxy und Substituent X ausgewählt ist, mit der Maßgabe, daß zumindest eines aus A, B, C, D, E, F und G Substituent X ist, worin X ein Substituent ist, der durch ein Hydrolaseenzym entfernbar ist, um eine Hydroxygruppe zu bilden.
20. FAD-Derivat nach Anspruch 19, worin X ein Phosphat ist.
21. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 20, welches umfaßt:
das Hydrolysieren eines Vorläufers der genannten Verbindung, worin zumindest eines aus A-G eine geschützte Phosphatgruppe ist und jedes aus A-G, das keine geschützte Phosphatgruppe ist, eine zu einer Hydroxygruppe hydrolysierbare Gruppe ist; und
das Entfernen des Phosphatschutzes.
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