-
Verfahren zur Herstellung eines konzentrierten Kücken-Provitamin-D@präparats
aus einem Steringemisch Seit es bekannt ist, daß Cholesterin kleine Mengen Provibanun-D
enthält, hat man versucht, dieses Provitaniin-D-Sterin zu konzentrieren und so rein
wie möglich zu isolieren. Insbesondere nach der Entdeckung von W a d d e 11 (Journ.
of the Biol. Chemistry, Band io5, Juli 1934, Nr: 4, Seite 7i m739), daß dieses Provitamin
sich hinsichtlich der Aktivierbarkeit zu Kückenvitamin-D von pflanzlichem Ergosterin
unterscheidet, ist die Herstellung des praktisch reinen tierischen Provitamins-D
bedeutungsvoll geworden. Zur Konzentrierung dieses -Provitamins hat man verschiedene
Methoden anzuwenden versucht, z. B. fraktionierte Kristallisation, fraktionierte
Verdampfung im Hochvakuum, fraktionierte Extraktion des Digiboninkomplexes, fraktionierte
Adsorption mit bestimmten Adsorptign.sstoffen. Keine dieser Methoden hat jedoch
ein nennenswertes Resultat gehabt.
-
Es wurde nun gefunden, daß: ges möglich ist, das Kücken-Provitamin-D
erheblich zu konzentrieren und sogar in einem sehr reinen Zustand zu erhalten; wenn.
man von einem Ester eines Provitamin-D enthaltenden Steringemisches ausgeht und
den Provitamin-D-gehalt durch fraktionierte Adsorpti,on so weit, vorzugsweise bis
mindesdbens 4o bis 5o%, steigert, daß diese Steigerung mittels Umkristallisieren
aus einem Lösungsmittel, zweckmäßig aus Methylalkohol., fortgesetzt werden kann.
-
Für die Veresberung wird erfindungsgemäßeine Säure gewählt, die :an
und für sich nicht zu einer besonders starken Adsorption AnlaB gibt, weil dadurch
die Unterschiede in der Adsorbierbarkeit der verschiedenen im. Gemisch enthaltenen
Sberirne, wodurch die Trennurig überhaupt möglich wird, verdeckt werden könnten.
-
Vorzugsweise werden Steringemische als Ausgangsmaterial benutzt, die
bereits einen ziemlich hohen Gehalt an Kückm-Provitamin-D besitzen. Steringemische
mit einem besonders hohen Gehalt können aus wirbellosen Tieren, wie Salzwassermuscheln,
Teichmuscheln, Kreiselschnecken, Mehlwürmern, Erdschnecken, Wellhornschnecken, Regenwürmern
und anderen, erhalten werden:
Bei der Darstellung der für die Anwendung
der Erfindung zu benutzenden Ausgangsstoffe aus den obengenannten wirbellosen Tieren
muß man dem Umstand Rechnung tragen, daß das Kücken-Provitamin-D ein verhältnis-,
mäßig instabiler und gegen Sauerstoff empfindlicher Stoff ist.
-
Ein dafür geeignetes präparatives Verfahren, bei dem für das Provitamin-D
schädliche Handlungen unterlassen werden, ist beispielsweise das folgende.
-
Die zu behandelnde gemahlene Masse wird entweder im Vakuum bei nur
mäßig erhöhter Temperatur, z. B. etwa 5o°, getrocknet oder nach Zermahlen und gegebenenfalls
Zerreiben mit Sand mittels Nag SO", Alkohol oder Aceton getrocknet. Aus dem
auf diese Weise vorbehandelten. Grundstoff wird dann das Fett extrahiert, wobei
zweckmäßig niedrig siedende Fettlösungsmittel, wie Äther oder Petroläther, verwendet
und zweckmäßig halogenhaltige Extraktionsmittel, wie Chloroform oder Tetracblorkohlenstoff,
vermieden werden, da diese zur Bildung von Salzsäure Anlaß geben können. Eine länger
andauernde Berührung mit Äther ist zweckmäßig zu vermeiden, da er häufig Peroxyd
enthält oder wenigstens bei seiner Verwendung die Bildung von Peroxyden schwer zu
verhindern ist. Ist der Grundstoff mit Hilfe von Alkohol oder Aceton getrocknet
-worden, so kann der darin gelöste Teil des Fettes durch Eindampfen des Lösungsmittels,
im Vakuum oder durch Extrahieren mit Äther oder Petroläther nach Verdünnen mit Wasser
gewonnen werden. Die Fettlösung wird durch Filtrieren von gegebenenfalls suspendierten
Eiweißbestandteilen befreit und das Lösungsmittel durch Destillieren entfernt. Das
Fett -wird dann auf übliche Weise verseift, -wobei zweckmäßig -nieder sehr hohe
Temperaturen vermieden werden. und z. B.: eine Lösung von NaOH oder KOH in -wenigstens
8o%igemAlkohol verwendet wird. Die SeifenlösuDg kann. gewünschtenfalls durch Destillieren
von- einem Teil des Alkohols befreit -werden, -vorauf der unverseifbare Teil entweder
dadurch erhalten werden kann, daß die Seifenlösung reit Wasser verdünnt und dann
der unverseifbare Teil mit Hilfe von Äther oder Petroläther extrahiert wird oder
daß in der wässerigen Seifenlösung durch Behandlung mit einem Kalksalz die Kalkseifen
niedergeschlagen und die zusammen mit den Kalkseifen niedergeschlagmen tuiverseifbaren
Bestandteile z. B. mit Aceton aus ihnen extrahiert werden. Aus dem auf diese Weise
erhaltenen unverseifbaren Teil kann oft die Sterinfraktion durch Umkristallisieren,
z. B. aus Alkohol, abgeschieden werden; zur weiteren Reinigung kann mit Erfolg eine
Umkristallisierung aus Methylalkohol angewendet werden, in dem bestimmte verunreinigende,
z. B. ,ölhaltige Stoffe oder farbige Lipoidbestandteile sehr wenig löslich sind,
so daß sie auf diese Weise entfernt werden können. Insbesondere in denjenigen Fällen,
in denen die unverseifbaren Bestandteile erhebliche Mengen von Farbstoffen, -wie
Carotinßiden, enthalten, kann unter dem Einfluß von Licht und Luft ein Teil des
Provitamins verlorengehen; es ist daher erwünscht, auch diesem Umstand Rechnung
zu tragen. Beispiel 7- eines 6,70/0 Provitamihacetatenthaltenden Sterin-Acetat-Gemisches,
das aus einem aus Salzwassermuscheln (Mytilus edulis) gewonnenen Sterin hergestellt
worden ist, wurden in io5 ccm eines Gemisches von Benzol und Petroläther (Siedepunkt
4o bis 6o°, Verhältnis. i : z) gelöst. Die Lösung wurde ,auf eine ,aus 315 g Aluminiumoxyd
nach B r o ckmann hergestellte Adsorptionssäule von 33 mm Durchmesser gegossen,
die mit Petroläther vorbehandelt war. Die Herstellung einer solchen Adsorptionssäule
ist in der Arbeit von A. Wintersteiner und G. Stein (Z. f. Physiol. Chem., Bd. 22O,
Seite 247 ff., 1933) beschrieben worden. Nachdem die Lösung in der Säule aufgenommen
war, wurde mit im ganzen 520 ccm Lösungsmittel (Benzol-P,etroläther i: i)
entwickelt. Das gesamte Filtrat, 625 ccm, enthielt 4,43 g Acetatgemisch mit nur
sehr wenig Provitaminacetat. Nach Beendigung der Entwicklung wurden die oberen 2
cm der Säule, die durch Verunreinigungen gelblich gefärbt waren, mit einem Spate-
vorsichtig entfernt und dann die ganze Säule mit 6oo ccm eines Gemisches von Benzol
und Methylalkohol (i i : i) eluiert. Das Eluat enthielt 2,51 g Acetatge-misch mit
i 5 01o Provitammacetat. 2,47g dieses Präparats wurden in 37,5 ccm Benzol-Petroläther-Gemisch
(i : i ) gelöst und damit eine zweite Adsorption vorgenommen (Säule aus 112,5- A-203,
2o mm Durchmesser, Zoo ccm 'Entwicklungsflüssigkeit). Das Filtrat, 237,5 ccm, wurde
verworfen, die -oberen 2 cm der Säule entfernt und der Rest der Säule mit Zoo ccm
Benzol-Methylalkohol-Gemisch (i i : i) eluiert. Im Eluat befanden, sich
0,78 g Acetatgemisch mit etwa 30% Provitaminacetat. Mit diesem Präparat wurde
eine dritte Adsorption vorgenommen: 0,779 würden in 12 ccm Benzol-Petroläther-Gemisch
(i : i) gelöst (Säule aus 36g A1203, 1 i'mm Durchmesser, i 15 ccm Entwicklungsflüssigkeit).
Das Filtrat wurde in zwei Teilen gesondert aufgefangen; die ersten 8o ccm sowie
die oberen 2 cm der Säule wurden mach Vollendung der Entwicklung verworfen, die
restlichen 47 ccm des Filtrats wurden mit dem mit iooccm Benzol-Methylalkohol
-Gemisch
(i i : i) gewonnenen Eluat vereinigt. Die Ausbeute betrug 22¢m9 eines etwa 57%igen
Acet,atgemisches.
-
Dieses 57 o/oi,ge Acetatgemisch wurde dreimal aus Methylalkohol (2o,15
und 12 ccm) umkristallisiert und ergab dann q.9 mg gut kristallisiertes, praktisch
reines Provitaminacetat, das nach nochmaliger Kristallisation ans Methylalkohol
ganz rein ist. Im eva. kuierten Schmelzpunktröhrchen schmilzt es bei 16o bis i61°,
die Drehung beträgt [aID--78° (in Benzol).
-
Aus diesem Acetat kann durch Verseifung und Kristallisation aus Methylalkohol
das reine Kücken-Provitamin-D gewonnen werden. Es schmilzt im.Vakuum bei 149,5 bis
i 5o' ([aID- 118° [in Benzol), sein Adsorptionsspektrum unterscheidet sich fast'
nicht von. dem des Ergosterins. Dieses Kücken-Provitamn-D ist ein. bisher unbekannter
Stoff, der sich durch Schmelzpunkt und Drehung, durch Schmelzpunkt und Drehung seines
Acetats sowie durch seine Aktivierbarkeit mit ultraviolettem Licht zu einem speziell
für Kücken wirksamen Vitamin D von Ergosterin unterscheidet. Für die Herstellung
des verfahrensgemäß anzuwendenden Ausgangsstoffes wird im Rahmen der vorliegenden
Erfindung kein Schutz verlangt.