DE3446795C2

DE3446795C2 - Verfahren zur Herstellung einer Fettsäuremischung mit einer hohen Konzentration an Eicosapentaensäure

Info

Publication number: DE3446795C2
Application number: DE3446795A
Authority: DE
Inventors: Akira Seto; Shoko Yokohama Yamashita
Original assignee: Nisshin Oil Mills Ltd
Current assignee: Nisshin Oil Mills Ltd
Priority date: 1983-12-21
Filing date: 1984-12-21
Publication date: 1986-10-02
Also published as: JPH0159318B2; GB2152043A; GB8431527D0; US4615839A; GB2152043B; JPS60133094A; DE3446795A1

Abstract

Eine Fettsäuremischung wird hergestellt, indem eine Lipidmischung, die aus Chlorella extrahiert wurde, einer Lösungsmittelfraktionierung zur Entfernung der Neutralfette, des Chlorophyll, der Sterine und des größten Teils der Phospholipide unterworfen wird, wobei eine polare Lipidmischung erhalten wird. Die polare Lipidmischung wird dann der Hydrolyse zur Freisetzung der Fettsäure unterworfen. Schließlich werden die Fettsäuren abgetrennt, wobei eine Fettsäuremischung mit nicht weniger als 60 Gew.-% Eincosapentaensäure erhalten wird.

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Fettsäuregemischs, das Eicosapentaensäure enthält, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung einer Fettsäuremischung mit hoher Konzentration an Eicosapentaensäure aus einer Lipidkomponente, die aus der Meeresgrünalge (marine Chlorella) extrahiert wurde.

2, Beschreibung des Standes der Technik |

5,8,11,14,17-Eicosapentaensäure (nachfolgend EPA genannt) ist eine Substanz, die kürzlich als Mittel zur Verhinderung und Heilung von Zerebralthrombose und Arteriosklerose bekannt wurde. Es ist bekannt, daß EPA ^ in Fischölen und ölen und Fetten von Meerespflanzen (Algen) enthalten ist. Es wird heute vollständig aus ölen 'k von Fischen, wie Sardinen oder ähnlichen extrahiert und gereinigt. Unter den Fischölen enthalten diejenigen mit einer hohen Konzentration an EPA diese in einer Menge von annähernd 20 Gew.-% der Gesamtfettsäuren. Zur Verwendung als Gesundheitsnahrungsmittel wird eine Mischung der Fettsäuren angewandt, in der die Konzentration an EPA auf annähernd 25 bis 30% erhöht ist. Zur Verwendung als Pharmazeutika wurde experimentell eine Fettsäuremischung hergestellt, die mehr als 90% EPA enthält.

Da jedoch Fischöle eine hohe Konzentration an hochungesättigten Fettsäuren ( die eine Zahl von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen enthalten), wie Docosahexaensäure und ähnliche enthalten, deren Natur

50· und Struktur ähnlich der von EPA ist, ist es nicht leicht, die Konzentration an EPA in den aus Fischölen erhaltenen Fettsäuremischungen zu erhöhen. Besonders Pharmazeutika erfordern ein Fettsäuregemisch, welches EPA in einer Konzentration von 90% oder mehr enthält. Um eine solche hohe EPA-Konzentration zu § erreichen, ist eine komplexe Kombination von Behandlungsstufen wie Harnstoff-Addukt-Verfahren, Lösungsmittelextrakiion, fraktionierte Destillation und Säulenchromatographie erforderlich.

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Zusammenfassung der Erfindung

Ein Gegenstand der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens, das eine Mischung von Fettsäuren mit einer hohen Konzentration oder einer hohen Reinheit an EPA auf einfache Weise liefert.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Fettsäuremischung mit einem hohen Gehalt von nicht weniger als 60 Gew.-% an Eicosapentaensäure ist dadurch gekennzeichnet, daß man aus Chlorella mit einer im Volumenverhältnis 2 :1 bis 1 :1 vorliegenden Mischung aus nicht-polaren und polaren organischen Lösungsmitteln eine Lipidmischung extrahiert, das Lösungsmittel entfernt, aus dem Rückstand mit Hilfe von nicht-polaren organischen Lösungsmitteln die neutralen Fette Chlorophyl-Sterine und den größten Teil der Phospholipide

abtrennt, aus dem Rückstand die Glycolipide und Glycophospholipide mit Aceton herauslöst und diese nach Entfernung des Acetons der Hydrolyse zur Freisetzung der Fettsäuren unterwirft und die Fettsäuren gewinnt.

Die so hergestellten Fettsäuremischung kann dann dem Harnstoff-Addukt-Verfahren unterworfen werden, wobei eine Fettsäuremischung mit einer EPA-Konzentration von 90 Gew.-% oder mehr erhalten wird. Dabei

wird die erfindungsgemäß gewonnene Fettsäuremischung mit Harnstoff zur Entfernung der gesättigten Fettsäuren und der ungesättigten Fettsäuren mit einer Doppelbindung umgesetzt, wobei die Harnsäureanlagerung an die Fettsäuremischung in einem Lösungsmittel erfolgt die Lösungsmittelphase nach Stehenlassen der Reaktionsmischung bei niedriger Temperatur gesammelt, das Lösungsmittel entfernt und der verbleibende Harnstoff durch Behandlung des Rückstandes mit Chlorwasserstoffsäure zersetzt Nachfolgend wird unter Fettsäure eine aliphatische Monocarbonsäure verstanden.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Als Forschungsergebnis an Verfahren, die imstande sind, hochreine EPA aus natürlichen Quellen zu liefern, wurde gefunden, daß Meeresgrünalgen (marine Chlorella) eine hohe Konzentration an Gesamtlipiden (im Bereich von annähernd 30 bis 40 Gew.-%) und eine hohe Konzentration an EPA in den Gesamtfettsäuren (im Bereich von eiwa 35 bis 45 Gew.-°/o), sowie eine niedrige Konzentration an hochungesättigten Fettsäuren außer EPA in den Gesamtlipiden enthalten. Es wurde weiter gefunden, daß die Meeresgrünalge leicht gezüchtet werden kann. Aus diesen Ergebnissen wurde ein Verfahren zur Herstellung von hochreiner EPA aus marinen Grünalgen entwickelt

Die erfindungsgemäß verwendete Meeresgrünalge (marine Chlorella) ist eine einzellige Grünalge, die sehr gut bekannt ist öie Quelle der marinen Chlorella spielt keine Rolle. Natürliche marine Chlorella kann verwendet werden Jedoch wird die Züchtung bevorzugt wenn eine große Menge nötig ist Die Züchtung von Chlorella ist relativ einfach und Chlorella wird generell zum Beispiel als Nahrung für Rotifer (Rädertierchen) verwendet Die Züchtung kann im Freien unter Verwendung eines pools mit einer Tiefe von etwa 50 cm erfolgen, der mit Seewasser als Kulturmedium gefüllt ist, dem geringe Mengen an Stickstoff, Phosphor und Kalium zugefügt worden sind. Obwohl die Bebrütungstemperaturen und -zeiten im weiten Umfang mit der Jahreszeit und dem Ort schwanken, wird in Japan die Züchtung gewöhnlich im Frühjahr usd im Herbst durchgeführt

Lipide können aus der marinen Chlorella durch übliche Verfahren extrahiert werden. Die Extraktion kann ausgeführt werden mit einer Mischung aus nicht-polaren und polaren organischen Lösungsmittel. Das nicht-polare Lösungsmittel kann beispielsweise Hexan, Chloroform, Ether oder Gemische hiervon sein, während das polare Lösungsmittel zum Beispiel ein niederer Alkohol, wie Ethanol, Methanol, Isopropanol oder Gemische hiervon sein kann. Gewöhnlich werden nicht-polare und polare Lösungsmittel in einem Volumen-Verhältnis von etwa 2 :1 bis 1 :1 gemischt Die Extraktion kann in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 6O⁰C unter Verwendung von 5 bis 20 Volumenteilen des Lösungsmittelgemischs pro Volumenteil von gepulverter, trockener Chlorella durchgeführt werden. Obwohl keine Begrenzung existiert, beträgt die Extraktionsdauer gewöhnlich von 30 Minuten bis 3 Stunden. Um die Extraktion in großen Mengen auszuführen, kann ein Extraktionstank mit einer Rückflußvorrichtung, versehen mit einer Zellenhomogenisierungsvorrichtung, wie einem Polytronhomogenisator angewandt werden. Nach der Extraktion kann das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck bei Temperaturen von 40 bis 6O⁰C entfernt werden, wobei eine Lipidmischung erhalten wird, die Triglyceride, Phospholipide, Glykolipide, Glyko-Phospholipide, Chlorophyll, /?-Karotin, Sterine und ähnliche enthalten.

Die so hergestellte Lipidmasse wird dann der Lösungsmittelfraktionierung unterworfen. Dieser Prozess ermöglicht es, die Lipidmischung ausreichend in Berührung mit dem oben erwähnten, nicht-polaren organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch zu bringen, wodurch es den neutralen Fetten, Sterinen und Chlorophyll ermöglicht wird, in das Lösungsmittel überzugehen und so entfernt zu werden. Diese Extraktion kann im allgemeinen mit einem Lösungsmittel in einer Menge von 5 bis 20 Gew.-Teilen pro Gew.-Teilen der Lipidmasse bei Temperaturen von 20 bis 40° C für etwa 30 Minuten bis 1 Stunde durchgeführt werden. Nach der Extraktion wird die Lösungsmittelphase abfiltriert, worauf der Rückstand dann mit Aceton gewöhnlich bei einer Temperatur von annähernd 4°C zusammengebracht und über Nacht stehengelassen wird. Die verwendete Acetonmenge kann annähernd 10 bis 20Gew.-Teile pro Gew.-Teil Rückstand betragen. Die Extraktion mit Aceton verhindert beinahe vollständig die Auflösung des in der Lipidmischung enthaltenen Phospholipids im Aceton. Die Acetonphase wird dann gesammelt, worauf das Lösungsmittel Aceton durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt wird, wobei eine Fraktion von polaren Lipiden erhalten wird, die nahezu keine Phospholipide enthält und die im wesentlichen aus Glykolipiden und G'yko-Phospholipiden besteht. Im allgemeinen beträgt die Ausbeute an polarer Lipidfraktion annähernd 10 bis 30 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der Lipidmischung, die aus der Chlorella extrahiert wurde.

Die polare Lipidfraktion wird dann der Hydrolyse unterworfen, was gewöhnlich in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie einem Alkohol, zum Beispiel Methanol, mit Hilfe einer Säure, wie einer Mineralsäure, zum Beispiel Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, oder einem Alkali, wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, in einer Menge von etwa 0,3 Gew.-Teilen oder mehr pro Gew.-Teile der polaren Lipidfraktion vorgenommen wird. Die Hydrolysetemperatur kann im Bereich von 70 bis 80°C liegen, die Hydrolysezeit von 15 Minuten bis 2 Stunden betragen. Die Hydrolyse ermöglicht die Zersetzung der Glykolipide und Glyko-Phospholipide in der polaren Lipidfraktion unter Freisetzung der Fettsäuren. Wenn Phospholipide in der polaren Lipidfraktion verbleiben, werden sie ebenfalls zersetzt. Nach der Extraktion von nicht-verseiftem Material und Entfernung mit einem nicht-polaren Lösungsmittel, wie Petrolether unter alkalischen Bedingungen wird der Rückstand angesäuert und die Fettsäuren werden dann mit einem organischen Lösungsmittel, wie Petrolether, extrahiert. Die Extraktion der Fettsäuren wird bevorzugt bei Temperaturen von 20 bis 40° C durchgeführt. Nach der Extraktion liefert die Abtrennung des Lösungsmittels die gewünschte Fettsäuremischung.

Die resultierende Fettsäuremischung enthält 60% oder mehr an EPA. Die anderen Fettsäurekomponenten der Fettsäuremischung können Palmitinsäure, Palmitoleinsäure und Arachidonsäure als Hauptbestandteile ebenso sein wie Ölsäure, Myristinsäure, Tetradecensäure, Laurinsäure und Dodecensäure als weitere Kompo-

nenten.

Unter den oben erwähnten Komponenten, die in der Fettsäuremischung enthalten sind, können gesättigte Fettsäuren und Fettsäuren mit einer Doppelbindung, insbesondere Palmitinsäure und Palmitoleinsäure, vollständig durch das Harnstoff-Addukt-Verfahren entfernt werden. Dieses Verfahren kann durchgeführt werden unter Verwendung von Harnstoff in einer Menge von annähernd 2 bis 3 Gew.-Teilen und Methanol in einer Menge von annähernd 10 bis 15 Gew.-Teilen bei Temperaturen von etwa 60⁰C während 1 bis 2 Stunden. Nach der Reaktion wird das Reaktionsgemisch über Nacht bei Temperaturen von —20 bis +4⁰C stehengelassen. Die in Methanol nicht gelösten Materialien werden dann durch Filtration oder auf ähnliche Weise entfernt, worauf das Methanol aus der methanolischen Lösung abdestilliert wird. Der Rückstand wird dann mit wäßriger Chlorwasserstoffsäure zwecks Zersetzung des Harnstoffs behandelt und dann mit warmem Wasser gewaschen. Nach der Entfernung des Wassers wird der Rückstand der Extraktion mit einem polaren Lösungsmittel, wie Ether, unterworfen. Die Entfernung des Lösungsmittels aus der Lösungsmittelphase liefert eine Fettsäuremischung, die EPA in einer Menge von 90 Gew.-°/o oder mehr enthält Die erhaltene Fettsäuremischung kann als Reagens und als pharmazeutisches Rohmaterial verwendet werden.

Die Erfindung wird ausführlicher anhand der Ausführungsbeispiele beschrieben.

Beispiel 1

Eine Mischung aus Chloroform und Methanol in einem Volumenverhältnis von Chloroform : Methanol von 2:1 wurde zu annähernd 100 c ^von trockenen, durch Bebrütung von Chlorella minutissima in Meerwasser erhaltenen Zellen in einem Volumenverhältnis vom zehnfachen der trockenen Zellen zugegeben. Die Mischung wurde in einem Polytronhomogenisator bei einer Temperatur von 60⁰C während 1 Stunde zwecks Extrahierung der Lipide unter Zerstörung der Zellen behandelt Nach der Filtration des Inhalts wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck aus dem Filtrat entfernt, wobei eine Lipidmischung erhalten

1 kg eines Lösungsmittelgemischs aus Hexan und Ether in einem Volumenverhältnis von 1/1 wurde zu 100 g der erhaltenen Lipidmischung gegeben, worauf die Mischung 1 Stunde bei 20⁰C gerührt wurde. Nach der Filtration der Mischung wurde der Rückstand mit 1 kg Aceton vermischt und bei 4° C 12 Stunden stehengelassen. Die erhaltene Acetonphase wurde gesammelt, das Aceton unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei eine polare Lipidmischung erhalten wurde.

Ein Gemisch aus 2N wäßriger Natriumhydroxidlösung mit Methanol im Volumenverhältnis von 1 :9 wurde zu etwa 3 g der polaren Lipidmasse gegeben, worauf das Gemisch der Hydrolyse unter strömendem Stickstoff bei 80⁰C während 2 Stunden unterworfen wurde. Nachdem die nicht-verseiften Materialien mit Petrolether entfernt wurden, wurde der verbleibende Anteil unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure angesäuert und mit Petrolether extrahiert. Die Entfernung des Petrolethers aus der erhaltenen Petroletherphase ergab 2 g der gewünschten Fettsäuremischung. Die Analyse durch Gaschromatographie ergab die in Tabelle 1 gezeigten Komponenten:

Tabelle 1

—

Fettsäure (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) Andere

16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 20:4 20:5

Gewichtsprozent 7,0 7,0 0 0,3 0 4,6 69,5 11,6

Bemerkungen:

(1) Palmitinsäure

(2) Palmitoleinsäure

(3) Stearinsäure

(4) Oleinsäure
(5) Linolsäure

(6) Arachidonsäure

(7) EPA

Beispiel 2

1 g Fettsäuremischung, die in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde in 6 g Methanol gelöst, worauf die Lösung mit 0,8 g Harnstoff versetzt wurde. Nach einer Reaktionsdauer von 2 Stunden bei 6O⁰C wurde die Reaktionsmischung allmählich auf Raumtemperatur gekühlt und 1 Stunde bei der gleichen Temperatur und danach bei —20⁰C über Nacht stehengelassen. Nach der Filtration der Mischung wurde das Methanol aus dem Filtrat abdestilliert, worauf der verbliebene Rückstand 2 mal mit der fünffachen Menge von warmem Wasser, welches 0,7 Gew.- 6N Chlorwasserstoffsäure enthält und danach 4 bis 5 mal mit warmem Wasser gewaschen wurde. Nach der Trocknung des erhaltenen Rückstands wurde mit der zweifachen Menge an Ether behandelt und die Etherphase gesammelt. Nach der Entfernung des Ethers aus der Etherphase verblieb die gewünschte Fettsäuremischung. Die Mischung wurde wie in Beispiel 1 analysiert; die Komponenten sind in Tabelle 2 dargestellt:

Tabelle 2

i'ctlsäure 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 20:4 20:5 Andere «

Gewichtsprozent 0 0 0 0 0 5,9 93,0 1,1 5 fs

fe' Die Erfindung ermöglicht die Gewinnung von hochreiner EPA aus Chlorella marinen Ursprungs auf einfache r

Weise. ⁽

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer Fettsäuremischung mit einem hohen Gehalt von nicht weniger als 60 Gew.-°/o an Eicosapentaensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man aus Chioreiia mit einer im Volumenverhältnis von 2:1 bis 1 :1 vorliegenden Mischung aus nicht polaren und polaren organischen Lösungsmittel esae Lipidmischung extrahiert, das Lösungsmittel entfernt, aus dem Rückstand mit Hilfe von nicht-polaren organischen Lösungsmitteln die neutralen Fette, Chlorophyll, Sterine und den größten Teil der Phospholipide abtrennt, aus dem Rückstand die Glycolipide und Glycophospholipide mit Aceton herauslöst und diese nach Entfernung des Acetons der Hydrolyse zur Freisetzung der Fettsäuren unterwirft und die Fettsäuren gewinnt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da3 die Hydrolyse mit Säure oder Alkali durchgeführt wird, wobei Säure oder Alkali in einem Verhältnis von nicht weniger als 0,3 Gew.-Teilen polarer Lipidmischung zugegeben werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse bei einer Temperatur von 70 bis 80⁰C während etwa 15 Minuten bis 2 Stunden durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Fettsäuremischung mit einem hohen Gehalt von nicht weniger als 90 Gew.-% an Eicosapentaensäure, gekennzeichnet durch den weiteren Schritt der Umsetzung der Fettsäuremischung mit Harnstoff zur Entfernung der gesättigten Fettsäuren und der ungesättigten Fettsäuren mit einer Doppelbindung, wobei die Harnsäureanlagerung an die Fettsäuremischung mit einem Lösungsmittel erfolgt, die Lösungsmittelphase nach Stehenlassen der Reaktionsmischung bei niedriger Temperatur gesammelt, das Lösungsmittel entfernt und der verbleibende Harnstoff durch Behandlung des Rückstands mit Chlorwasserstoffsäure zersetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Harnstoff mit einem Verhältnis von 2 bis 3 Gew.-Teilen pro Gew.-Teil Fettsäuremischung zugegeben wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel M ethanol verwendet wird.