DE655506T1 - DNS Polymerase mit Veränderten Nukleotiden Bindungstelle. - Google Patents

DNS Polymerase mit Veränderten Nukleotiden Bindungstelle.

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DE655506T1 DE0655506T DE94203433T DE655506T1 DE 655506 T1 DE655506 T1 DE 655506T1 DE 0655506 T DE0655506 T DE 0655506T DE 94203433 T DE94203433 T DE 94203433T DE 655506 T1 DE655506 T1 DE 655506T1
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Claims (52)

Patentansprüche:
1. Modifiziertes Gen, das für eine modifizierte DNA-Polymerase codiert, wobei das modifizierte Gen dahingehend modifiziert ist, daß die Fähigkeit dieser Polymerase, ein dem entsprechenden Desoxynukleotids verwandtes Didesoxynukleotid einzubauen, verglichen mit der Fähigkeit der entsprechenden natürlich auftretenden DNA-Polymerase, um wenigstens das 20-fache gesteigert ist.
2. Modifiziertes Gen nach Anspruch 1, wobei die modifizierte DNA-Polymerase eine ausreichende DNA-Polymeraseaktivität zur Verwendung bei der DNA-Sequenzierung aufweist, wenn sie mit einem Faktor kombiniert wird, der für DNA-Polymeraseaktivität notwendig ist.
3. Modifiziertes Gen nach Anspruch 1 oder 2, wobei die modifizierte DNA-Polymerase eine ausreichend niedrige Exonukleaseaktivitat aufweist, die es dieser Polymerase gestattet, bei der DNA-Sequenzierung verwendet zu werden.
4. Modifiziertes Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die modifizierte DNA-Polymerase eine Didesoxynukleotidbindestelle trägt, die einen Tyrosinmolekülres,t aufweist.
5. Modifiziertes Gen nach Anspruch 4, wobei die Polymerase eine T7-Typ-DNA-Polymerase ist, die aus einer Gruppe ausgewählt ist, zu der T7, T3, Φ&Igr;, Φ&Igr;&Igr;, H, W31, gh-1, Y, A1122 und SP6 gehören.
6. Modifiziertes DNA-Polymerase, die durch das modifizierte Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert ist.
7. Modifizierte DNA-Polymerase nach Anspruch 6, wobei
_ 2 —
die Polymerase eine Pol-I-Typ-Polymerase ist, die an einer Aminosäurestelle in einer Region modifiziert ist, die aus jenen ausgewählt ist, die bei der DNA-Polymerase I von E. CoIi derjenigen in den Regionen 666-682, 710-755, 755-784, 798-867 und 914-928 entspricht.
8. Modifiziertes Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die modifizierte DNA-Polymerase ein thermostabiles Enzym ist.
9. Modifiziertes Gen nach Anspruch 8, wobei das thermostabile Enzym aus einer Gruppe ausgewählt ist, zu der die DNA-Polymerasen gehören, die durch Thermus aquaticus, Thermus thermophilis, Thermus flavus, Bacillus sterothermophilus, Thermococcus litoralis and Pyrococcus furiosis codiert sind.
10. Modifiziertes Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 8 und 9, wobei die Fähigkeit dieser Polymerase, ein dem entsprechenden Desoxynukleotids verwandtes Didesoxynukleotid einzubauen, um wenigstens das 25-fache gegenüber der entsprechenden natürlich auftretenden DNA-Polymerase und verglichen mit dem entsprechenden Desoxynukleotid gesteigert ist.
11. Modifiziertes Gen nach Anspruch 10, wobei diese Fähigkeit um wenigstens das 50-fache gesteigert ist.
12. Modifiziertes Gen nach Anspruch 10, wobei diese Fähigkeit um wenigstens das 100-fache gesteigert ist.
13. Modifiziertes Gen nach Anspruch 10, wobei diese Fähigkeit um wenigstens das 500-fache gesteigert ist.
14. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten DNA-Polymerase, die verglichen mit der Fähigkeit der entsprechenden natürlich auftretenden DNA-Polymerase eine gesteigerte Fähigkeit zum Inkorporieren eines mit dem
entsprechenden Desoxynukleotids verwandten Didesoxynukleotids hat, mit den Schritten: gemäß denen ein Nukleinsäuremolekül, das für eine DNA-Polymerase codiert, bereitgestellt und das Nukleinsäuremolekül mutagenisiert wird, um eine oder mehrere Basenänderungen in der Nukleotidbasensequenz an einer oder mehreren Stellen einzubauen, die die Fähigkeit dieser durch die Nukleinsäure codierten Polymerase ein Didesoxynukleotid einzubauen, um wenigstens den Faktor 20 ändert.
15. Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidbasensequenz eines DNA-Moleküls mit den Schritten, gemäß denen:
ein DNA-Molekül, das mit einem Primermolekül, das mit dem DNA-Molekül hybridisieren kann, hybridisiert ist, in einem Behälter inkubiert wird, der wenigstens ein Desoxynukleosidtriphosphat, eine DNA-Polymerase, die gegenüber einer natürlich auftretenden DNA-Polymerase dahingehend modifiziert ist, daß sie verglichen mit der Fähigkeit der entsprechenden natürlich auftretenden DNA-Polymerase eine gesteigerte Fähigkeit aufweist, ein Didesoxynukleotid einzubauen aufweist, wobei die Polymerase zur Verwendung bei der DNA-Sequenzierung eine ausreichende DNA-Polymeraseaktivität und eine ausreichend niedrige Exonukleaseaktivität aufweist, und der wenigstens ein die DNA-Synthese terminierendes Agens enthält, das die DNA-Synthese an einer speziellen Nukleotidbase beendet; und
die DNA-Produkte der Inkubationsreaktion nach der Größe getrennt werden, wodurch wenigstens ein Teil der Nukleotidbasensequenz des DNA-Moleküls ermittelt werden kann.
16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die DNA-Polymerase eine thermostabile DNA-Polymerase ist und die Sequenzierung bei einer Temperatur von über 50° C durchgeführt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die DNA-Polymerase eine thermostabile DNA-Polymerase ist und die Sequenzierung bei einer Temperatur über 60° C durchgeführt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das thermostabile Enzym aus einer Gruppe ausgewählt ist, zu der die DNA-Polymerasen gehören, die durch Thermus aquaticus, Thermus thermophilis, Thermus flavus, Bacillus sterothermophilus, Thermococcus litoralis und Pyrococcus furiosis codiert sind.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, bei dem die DNA-Polymerase zwischen Desoxynukleotiden und Didesoxynukleotiden um weniger als den Faktor 100 unterscheidet .
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, bei dem die DNA-Polymerase zwischen Desoxynukleotiden und Didesoxynukleotiden um weniger als einen Faktor 5 0 unterscheidet .
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20, bei dem die DNA-Polymerase eine Exonukleaseaktivität pro mg Polymerase von weniger als 1000 Einheiten hat.
22. Zusammenstellung zur DNA-Sequenzierung, mit einer modifizierten DNA-Polymerase, die dahingehend modifiziert ist, daß, verglichen mit der Fähigkeit der entsprechenden natürlich auftretenden DNA-Polymerase, die Fähigkeit dieser Polymerase ein Didesoxynukleotid einzubauen, um wenigstens das 20-fache gesteigert ist; und mit einem Agens, das zur Sequenzierung notwendig ist und aus einer Gruppe ausgewählt ist, zu der dITP gehört, ein kettenterminierendes Agens, deaza-GTP und eine Mangan enthaltende Verbindung.
23. Verfahren zur Sequenzierung eines DNA-Strangs mit
- 5 den Schritten, gemäß denen:
ein Strang bereitgestellt wird, der mit einem Primer hybridisiert ist, der in der Lage ist, mit dem Strang zu hybridisieren, um eine hybridisierte Mischung zu erhalten,
die hybridisierte Mischung mit einer oder mehreren Desoxyribonukleosidtriphosphaten, einer modifizierten DNA-Polymerase, die dahingehend modifiziert ist, daß, verglichen mit der Fähigkeit der entsprechenden natürlich auftretenden DNA-Polymerase, die Fähigkeit dieser Polymerase, ein Didesoxynukleotid einzubauen, gesteigert ist, und einem ersten kettenterminierenden Agens inkubiert wird, wobei die DNA-Polymerase bewirkt, daß der Primer verlängert wird, um eine erste Serie von ersten DNA-Produkten zu erzeugen, die sich untereinander in der Länge des verlängerten Primers unterscheiden, wobei jedes der ersten DNA-Produkte einen kettenterminierenden Wirkstoff an seinem verlängerten Ende trägt und bei allen ersten DNA-Produkten die Anzahl von Molekülen für im wesentlichen alle DNA-Produkte, die sich in der Länge um nicht mehr als 20 Basen unterscheidet, gleich ist; und ein zweites kettenterminierendes Agens in der hybridisierten Mischung mit einer Konzentration bereitgestellt ist, die sich von der des ersten kettenterminierenden Agens unterscheidet, wobei die DNA-Polymerase die Produktion einer zweiten Serie von zweiten DNA-Produkten hervorruft, die sich untereinander in der Länge des verlängerten Primers unterscheiden, wobei jedes der zweiten DNA-Produkte ein kettenterminierendes Agens an seinem verlängerten Ende trägt, bei allen zweiten DNA-Produkten die Anzahl von Molekülen für im wesentlichen alle zweite DNA-Produkte, die sich hinsichtlich der Länge um weniger als 1 bis 2 0 Basen voneinander unterscheiden, gleich ist und die klar von der Anzahl der Moleküle aller ersten DNA-Produkte unterscheidbar ist, die sich hinsichtlich der Länge um nicht mehr als 20 Basen von der der zweiten DNA-Produkte unterscheiden.
24. Verfahren zum Sequenzieren einer Nukleinsäure mit den Schritten gemäß denen:
(a) ein Oligonukleotidprimer, eine zu sequenzierende Nukleinsäure, zwischen einem und vier Desoxynukleosidtriphosphaten, eine modifizierte DNA-Polymerase, die dahingehend modifiziert ist, daß, verglichen mit der Fähigkeit der entsprechenden natürlich auftretenden DNA-Polymerase, die Fähigkeit dieser Polymerase, ein Didesoxynukleotid einzubauen, gesteigert ist, und wenigstens zwei kettenabbrechende Agenzien in unterschiedlicher Menge unter Bedingungen zusammengegeben werden, die die Verlängerung des Oligonukleotidprimers begünstigen, um Nukleinsäurefragmente zu bilden, die zu der zu sequenzierenden Nukleinsäure komplementär sind; die Desoxynukleinsäurefragmente nach der Größe unterschieden werden und die Nukleinsäuresequenz bestimmt wird, wobei die Agenzien voneinander durch die Intensität einer Markierung in den Primerverlängerungsprodukten unterscheidbar sind.
25. Automatisierte Einrichtung zum Sequenzieren von DNA,
mit einem Reaktor, der Reagenzien enthält, die wenigstens zwei Serien von DNA-Produkten liefern, die ausgehen von einem einzigen Primer und eines einzigen DNA-Strangs gebildet sind, wobei die Reagenzien eine modifizierte DNA-Polymerase umfassen, die dahingehend modifiziert ist, daß, verglichen mit der Fähigkeit der entsprechenden natürlich auftretenden DNA-Polymerase, die Fähigkeit dieser Polymerase, ein Didesoxynukleotid einzubauen, gesteigert ist, wobei jedes DNA-Produkt der Serien sich hinsichtlich des Molekulargewichtes unterscheidet und ein kettenterminierendes Agens an einem Ende aufweist, mit Trennmitteln zum Trennen der DNA-Produkte längs einer Achse des Separators, um eine Serien von Banden zu bilden, wobei die Dichte von im wesentlichen allen benachbarten Banden einer Serie im wesentlichen die gleiche ist und sich die Intensität im
wesentlichen aller benachbarter Banden aus jeder Serie von denen der anderen Serie unterscheidet, mit Bandenerkennungsmitteln, um die Position und die Intensität jeder Bande nach der Trennung längs der Achse zu erkennen, und mit Computereinrichtungen, die die DNA-Sequenz des DNA-Strangs ausschließlich aufgrund der Position und der Intensität der Banden längs der Achse und nicht aufgrund der Wellenlänge der Lichtemission einer Markierung unterscheiden, die in der Trenneinrichtung enthalten sein kann.
26. Verfahren zur in vitro Mutagenese eines geklonten DNA-Fragmentes, wobei gemäß dem Verfahren das zu klonende Fragment und eine modifizierte DNA-Polymerase bereitgestellt werden, die dahingehend modifiziert ist, daß, verglichen mit der Fähigkeit der entsprechenden natürlich auftretenden DNA-Polymerase, die Fähigkeit dieser Polymerase, ein Didesoxynukleotid einzubauen, gesteigert ist, das geklonte Fragment mit der Polymerase unter Bedingungen zum Synthethisieren eines DNA-Strangs aus dem Fragment zusammengebracht wird, wobei die Bedingungen, die Bildung des DNA-Strangs durch Inkorporation einer Vielzahl individueller fortlaufender Basen, die mit dem Fragment Basenpaare bilden, sowie die Inkorporation einer Nukleotidbase bewirken, die nicht in der Lage ist, mit dem Fragment Basenpaare zu bilden.
27. Verfahren zur in vitro Mutagenese einer DNA-Fragmentmatrize, wobei gemäß dem Verfahren ein Primer und die Matrize bereitgestellt werden, der Primer mit Ausnahme einer Base, die nicht in der Lage ist, zusammen mit der Matrize Basenpaare zu bilden, fortlaufend Basen aufweist, die mit den fortlaufenden Basen der Matrize Basenpaare bilden, und der Primer mit einer modifizierten DNA-Polymerase verlängert wird, die dahingehend modifiziert ist, daß, verglichen mit der Fähigkeit der entsprechenden natürlich auftretenden DNA-Polymerase, die Fähigkeit dieser Polymerase, ein Didesoxynukleotid einzubauen, gesteigert ist.
28. Verfahren zum Erzeugen einer glatt endenden zweisträngigen DNA aus einem linearen DNA-Molekül mit einer einsträngigen Region am 5'- Ende, wobei das 3'-Ende des Moleküls zweisträngig ist und keine vorstehenden 3'-Termini trägt, wobei gemäß dem Verfahren das DNA-Molekül mit einer modifizierten DNA-Polymerase inkubiert wird, die dahingehend modifiziert ist, daß, verglichen mit der Fähigkeit der entsprechenden natürlich auftretenden DNA-Polymerase, die Fähigkeit dieser Polymerase, ein Didesoxynukleotid einzubauen, gesteigert ist, und wobei die Polymerase auf die einsträngige Region einwirkt, um ein glatt endendes zweisträngiges DNA-Molekül zu erzeugen.
29. Verfahren zum Markieren des 3'-Endes eines DNA-Fragments, wobei gemäß dem Verfahren, ein DNA-Fragment mit einer modifizierten DNA-Polymerase, die dahingehend modifiziert ist, daß, verglichen mit der Fähigkeit der entsprechenden natürlich auftretenden DNA-Polymerase, die Fähigkeit dieser Polymerase, ein Didesoxynukleotid einzubauen, gesteigert ist, und die aus einer rekombinanten DNA hergestellt ist, sowie mit einer markierten Desoxynukleotid-Spezies unter Bedingungen inkubiert wird, unter denen das 3'-Ende des DNA-Fragments durch die Polymerase verlängert und dadurch durch Anfügen des markierten Desoxynukleotids an das DNA-Fragment markiert wird.
30. Verfahren zum Amplifizierung einer DNA-Sequenz, wobei gemäß dem Verfahren ein erster und ein zweiter Primer an die gegenüberliegenden Stränge einer zweisträngigen DNA-Sequenz angelagert wird, die hybridisierte Mischung mit einer modifizierten DNA-Polymerase inkubiert wird, die dahingehend modifiziert ist, daß, verglichen mit der Fähigkeit der entsprechenden natürlich auftretenden DNA-Polymerase, die Fähigkeit dieser Polymerase, ein Didesoxynukleotid einzubauen, gesteigert ist, wobei der erste und der zweite Primer mit den gegenüberliegenden Strängen der DNA-Sequenz hybridisieren, derart, daß ihre 3'-Enden nach dem Hybridisieren einander entgegengerichtet
sind die DNA-Sequenz, die zu modifizieren ist, sich zwischen den beiden angelagerten Primern befindet.
31. DNA-Polymerase von Thermus aquaticus, die Tyrosin beim Molekülbaustein 667 aufweist.
32. DNA-Polymerase I von E. CoIi, die Tyrosin beim Molekülbaustein 762 aufweist.
33. DNA-Polymerase vom Pol I-Typ mit einem Tyrosinmolekülbaustein an einer Stelle, die bei der DNA-Polymerase von E.CoIi dem Molekülbaustein 762 analog ist.
34. DNA-Polymerase vom Typ Pol I nach Anspruch 33, wobei die Stelle die Aminosäuresequenz K N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 Y G/Q aufweist und jedes N unabhängig eine Aminosäure bedeutet.
35. Alpha-DNA-Polymerase mit der Sequenz K N1 N2 N3 N4 N5 N6 Y G, wobei jedes N unabhängig eine Aminosäure bedeutet und eines der N mutiert ist, um eine Polymerase zu ergeben, die den Einbau von ddNMP verglichen mit dem Einbau von dNMP um nicht mehr als den Faktor 50 benachteiligt .
36. Nukleinsäure, die für eine der DNA-Polymerase nach den Ansprüchen 31 bis 3 5 codiert.
37. DNA-Polymerase, die in Anwesenheit von Magnesium als einzigem zugegebenem divalentem Kation eine mittlere Prozessivität von weniger als 100 hat und die Inkorporation ddNMP verglichen mit der Inkorporation von dNMP um weniger als den Faktor 100 benachteiligt, wobei die Polymerase keine Reversetranscriptase ist.
38. DNA-Polymerase, die in Anwesenheit von Magnesium als dem einzigen divalenten Kation eine mittlere Prozessivität von weniger als 50 hat und die Inkorporation von
ddNMP verglichen mit der Inkorporation von dNMP um weniger als dem Faktor 50 benachteiligt.
39. DNA-Polymerase, die in Anwesenheit von Magnesium als dem einzigen divalenten Kation eine mittlere Prozesivitat von weniger als 50 hat und die Inkorporation von ddNMP verglichen mit der Inkorporation von dNMP um weniger als dem Faktor 5 benachteiligt.
40. Thermophile DNA-Polymerase, die ddNMP verglichen mit dNMP um weniger als dem Faktor 100 benachteiligt.
41. Thermophile DNA-Polymerase, die in Anwesenheit von Magnesium als einzigem divalenten Kation ddNMP verglichen mit dNMP um weniger als dem Faktor 100 benachteiligt.
42. DNA-Polymerase nach Anspruch 41, bei der die Polymerase eine durchschnittliche Prozessivität von weniger als 100 hat.
43. Polymerase nach Anspruch 42, wobei die Polymerase von einer Primermatrize zu der nächsten schneller als einmal pro fünf Sekunden wechselt.
44. Nukleinsäure, die für die Polymerase nach einem der Ansprüche 37 bis 43 codiert.
45. Verfahren zum zyklischen Sequenzieren unter Verwendung einer DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 31 bis 35 und 37 bis 43.
46. Zelluläre DNA-Polymerase mit Tyrosin anstelle der natürlich auftretenden Aminosäure an einer Stelle, die bewirkt, daß die Polymerase ddNMP verglichen mit dNMP um mehr als den Faktor 50 benachteiligt.
47. Alpha-DNA-Polymerase nach Anspruch 35, die an
beliebiger Stelle zwischen N1 und N6 mutiert ist, um eine Polymerase zu erzeugen, die ddNMPs wenigstens um den Faktor 20 effizienter inkorporiert als die nicht mutierte Polymerase.
48. Verfahren zum zyklischen Sequenzieren, gemäß dem alle vier dNTPs in der gleichen Menge wie die vier ddNTPs oder mit Überschuß in einer zyklischen Sequenzierungsreaktion bereitgestellt werden und die zyklische Sequenzierungsreaktion durchgeführt wird.
49. Verfahren zum zyklischen Sequenzieren, gemäß dem mengenmäßig 10 mal weniger von allen vier fluoreszierend markierten Didesoxynukleotide als den entsprechenden Desoxynukleotide in einer zyklischen Sequenzierungsreaktion bereitgestellt werden und die zyklische Sequenzierungsreaktion durchgeführt wird.
50. Modifiziertes Gen, das für eine modifizierte DNA-Polymerase codiert, wobei das modifizierte Gen dahingehend modifiziert ist, die Fähigkeit dieser Polymerase, ein dem entsprechenden Desoxynukleotids verwandtes Didesoxynukleotid oder ein anderes Desoxynukleotidanalogon einzubauen, zu erhöhen, verglichen mit der Fähigkeit der entsprechenden natürlich auftretenden DNA-Polymerase.
51. Modifizierte DNA-Polymerase, die durch ein modifiziertes Gen nach Anspruch 50 codiert ist.
52. Modifizierte DNA-Polymerase, wobei die modifizierte DNA-Polymerase dahingehend modifiziert ist, die Fähigkeit dieser Polymerase, ein dem entsprechenden Desoxynukleotids verwandtes Didesoxynukleotid oder ein anderes Desoxynukleotidanalogon einzubauen, zu erhöhen, verglichen mit der Fähigkeit der entsprechenden natürlich auftretenden DNA-Polymerase.
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