DE60225788T2

DE60225788T2 - Immunreaktionsmessverfahren für die immunreaktionsmessung

Info

Publication number: DE60225788T2
Application number: DE60225788T
Authority: DE
Inventors: Akihito Yawata-shi KAMEI; Noriko Hirakata-shi KENJO; Tatsuro Kyotanabe-shi KAWAMURA; Mahito Kyotanabe-shi HIRAI
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 2001-12-27
Filing date: 2002-12-27
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2022-12-28
Also published as: JPWO2003056333A1; US20040121417A1; DE60225788D1; US7056682B2; JP3871677B2; WO2003056333A1; EP1369689A1; CN1507564A; CN1247996C; EP1369689A4; EP1369689B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Immunreaktionsmessverfahren, das zum Messen des Gehalts eines Antikörpers oder eines Antigens als einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe befähigt ist.
STAND DER TECHNIK
Auf dem medizinischen Gebiet wird für die Diagnose von zahlreichen Krankheiten und für die Untersuchung des Fortschritts eines Krankheitszustandes eine Messung des Gehalts eines Proteins, das charakteristisch für eine Erkrankung ist und in einer menschlichen Körperflüssigkeit vorliegt, in weitem Umfang durchgeführt. Für die Messung des Gehalts eines Proteins sind Immunreaktionsmessverfahren, die hauptsächlich die Reaktion eines Antikörpers verwenden, der spezifisch ein Zielprotein als Antigen erkennt (Antigen-Antikörper-Reaktion) in weit verbreiteter Verwendung. Derzeit sind Immunreaktionsmessverfahren, die verschiedene Prinzipien verwenden, entwickelt worden.
Unter anderen sind Messverfahren, wie Immunnephelometrie, Immunturbidimetrie und Slide-Agglutination, bekannt, in welchen Agglutinate von Antigen-Antikörper-Komplexen (hierin nachstehend einfach als Agglutinatkomplexe bezeichnet), gebildet durch Antigen-Antikörper-Reaktion, nachgewiesen werden. Diese Messverfahren werden in dem Zustand verwendet, dass ein Antigen und ein Antikörper gleichmäßig in einer Lösung dispergiert werden, die daher zusammenfassend als "homogene Immunreaktionsmessverfahren" bezeichnet werden.
In der Antigen-Antikörper-Reaktion wird das Reaktionssystem mit der Bildung von Agglutinatkomplexen trübe. Der Trübungsgrad, der in dem Reaktionssystem mit der Bildung von Agglutinatkomplexen erzeugt wird, hängt von der Menge des Antigens und der Menge des Antikörpers ab. Immunnephelometrie und Immunturbidimetrie sind Verfahren, welche diese Tatsache benutzten, in welchen der in dem Reaktionssystem erzeugte Trübungsgrad op tisch gemessen wird und die Menge des Antigens oder die Menge des Antikörpers aus dem gemessenen Wert berechnet wird.
Der in dem Reaktionssystem erzeugte Trübungsgrad wird auf der Grundlage der Menge von gestreutem Licht in dem Reaktionssystem für Immunnephelometrie oder auf der Grundlage von durchgelassenem Licht, das aufgrund der Streuung abnimmt, in dem Reaktionssystem für Immunturbidimetrie gemessen. Im Allgemeinen kann das gleiche Reaktionssystem für die Messung durch Immunnephelometrie und die Messung durch Immunturbidimetrie verwendet werden. Mit anderen Worten kann ein Reaktionssystem, das für die Messung durch entweder Immunnephelometrie oder Immunturbidimetrie verwendbar ist, für die Messung durch das andere Verfahren verwendet werden. Die Slide-Agglutination ist ein Verfahren, in welchem eine Lösung in einem Reaktionssystem mit einer Trübung auf einem Glasträger oder Ähnlichem gesammelt wird und der Trübungsgrad in dem Reaktionssystem durch visuelle Beobachtung und Ähnliches bestimmt wird. Das gleiche Reaktionssystem wie dasjenige, das für die Immunnephelometrie und Immunturbidimetrie verwendet wird, kann für das Slide-Agglutinationsverfahren verwendet werden.
ZU LÖSENDE AUFGABE
In den vorstehend beschriebenen üblichen homogenen Immunreaktionsmessverfahren ist die Verwendung von zahlreichen Zusätzen versucht worden, um die Antigen-Antikörper-Reaktion zu erleichtern, um dadurch eine hochempfindliche Messung einer Spurenkomponente zu erzielen. In einem bekannten Beispiel wird ein wasserlösliches Polymer, wie Polyethylenglycol, Dextran, Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylchlorid, in einem Reaktionssystem vermischt, um die Bildung von Agglutinatkomplexen aufgrund einer Antigen-Antikörper-Reaktion zu erleichtern. Dies verkürzt die Reaktionszeit und verbessert den gemessenen Wert, wodurch die Empfindlichkeit der Messung erhöht wird. Es ist bekannt, dass unter den vorstehend genannten wasserlöslichen Polymeren Polyethylenglycol eine hohe Wirkung der Verkürzung der Reaktionszeit und der Verbesserung des gemessenen Wertes bei einer relativ niedrigen Konzentration ergibt. Insbesondere ist ein Zusatz von Polyethylenglycol (PEG) mit einem mittleren Molekulargewicht von 6000 bis auf eine Konzentration von 2 bis 6 Gew.-% in einem Reaktionssystem in weitem Umfang bekannt. Es wird insbesondere angenommen, dass die Zugabe von Polyethylenglycol mit einem mittleren Molekulargewicht von 6000 bis auf eine Konzentration von 4 Gew.-% in einem Reaktionssystem eine geringe nicht-spezifische Trübung ergibt, die von der Trübung aufgrund von Agglutinatkomplexen verschieden ist und daher die vorstehende hohe Wirkung zeigt.
Die Wirkung eines wasserlöslichen Polymers zum Erleichtern der Antigen-Antikörper-Reaktion neigt allgemein dazu, größer zu werden, wenn das Molekulargewicht des wasserlöslichen Polymers größer ist und die Konzentration des wasserlöslichen Polymers höher ist (vgl. Automated Immunoanalysis, Teil 1, hrsg. von Ritchie, Seiten 67–112 (1978)).
Bei der Messung der Antigen-Antikörper-Reaktion kann – wenn die Signalintensität (d. h. der gemessene Wert), die von dem Grad der Antigen-Antikörper-Reaktion (d. h. der Konzentration des Antigens) abhängt – höher ist, ein gutes S/N-Verhältnis aufrechterhalten werden, und eine stabile Messung kann mit höherer Sicherheit durchgeführt werden. Wenn jedoch ein wasserlösliches Polymer in hoher Konzentration oder ein wasserlösliches Polymer mit einem hohen Molekulargewicht zu einem Reaktionssystem zugesetzt wird, wie es üblicherweise erfolgt, um zu versuchen, die Antigen-Antikörper-Reaktion weiter zu erleichtern, um die vorstehende Wirkung zu erhalten, steigt die Viskosität einer Lösung in dem Reaktionssystem an, in welchem das wasserlösliche Polymer aufgelöst ist. Dies verursacht ein Problem dahingehend, dass die Handhabung der Lösung während des Messvorganges schwierig wird. Als Ergebnis kann keine hohe Signalintensität (d. h. kein hoher gemessener Wert) erhalten werden, und dadurch kann eine stabile Messung in einigen Fallen schwierig werden.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Im Hinblick auf die vorstehend beschriebene Situation ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Immunreaktionsmessverfahren bereitzustellen, das befähigt ist, den gemessenen Wert in einfacher Weise zum Erhalt einer hohen Messempfindlichkeit zu verbessern, und es wird ein Reagenskit für die Immunreaktionsmessung beschrieben, der für dieses Verfahren verwendet wird.
Das Immunreaktionsmessverfahren der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Messen des Gehalts einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, umfassend die Schritte: (A) Konstruieren eines Reaktionssystems, das die Probe, eine spezifisch bindende Substanz, die spezifisch an die zu bestimmende Probe bindet, und Phthalsäure oder Phthalsäuresalz einschließt, und (B) Messen einer optischen Eigenschaft des Reaktionssystems, worin in dem Schritt (A) der pH des Reaktionssystems auf weniger als 7 eingestellt wird, und die Kombination der zu bestimmenden Substanz und der spezifisch bindenden Substanz eine Kombination eines Antigens und eines Antikörpers ist.
Gemäß dem Immunreaktionsmessverfahren der vorliegenden Erfindung kann der gemessene Wert einer optischen Eigenschaft des Reaktionssystems verbessert werden. Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Phthalsäure oder das Phthalsäuresalz, das eine Substanz mit niedrigem Molekulargewicht ist, erhöht auch nicht die Viskosität des Reaktionssystems, und daher wird die Handhabung der Lösung während des Messvorgangs einfach.
Die optische Eigenschaft kann eine gestreute Lichtintensität oder eine durchgelassene Lichtmenge sein.
In dem Schritt (A) kann das Reaktionssystem weiter einen Puffer enthalten.
In dem Schritt (A) wird der pH des Reaktionssystems bevorzugt auf einen Bereich von 4,5 bis 5,5 eingestellt.
In dem Schritt (A) beträgt die Konzentration der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes in dem Reaktionssystem bevorzugt 0,2 M oder weniger.
Das Phthalatsalz ist bevorzugt Kaliumhydrogenphthalat.
Das Reaktionssystem kann 2 bis 6 Gew.-% Polyethylenglycol enthalten.
Die zu bestimmende Substanz kann ein Antigen mit einer Struktur sein, die Metallionen im Inneren halten kann, und die spezifisch bindende Substanz kann ein Antikörper sein, der spezifisch an das Antigen bindet, das die Metallionen nicht hält.
Die zu bestimmende Substanz kann humanes C-reaktives Protein sein.
Die zu bestimmende Substanz kann ein Antigen mit einer Struktur sein, die Metallionen im Inneren halten kann, die spezifisch bindende Substanz kann ein polyklonaler Antikörper sein, und in dem Schritt (A) kann das Reaktionssystem weiter die Metallionen enthalten.
Die zu bestimmende Substanz kann humanes C-reaktives Protein sein.
Die zu bestimmende Substanz kann ein Antigen sein, und die spezifisch bindende Substanz kann ein monoklonaler Antikörper sein, der befähigt ist, an eine Mehrzahl von Bindungsstellen des Antigens zu binden.
Die zu bestimmende Substanz kann humanes C-reaktives Protein sein.
Der Reagenskit zur Immunreaktionsmessung ist ein Reagenskit zur Immunreaktionsmessung zum Messen des Gehalts einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe, umfassend: eine spezifisch bindende Substanz, die spezifisch an die zu bestimmende Substanz bindet, und Phthalsäure oder Phthalatsalz, worin der pH eines Reaktionssystems auf weniger als 7 eingestellt wird, wenn das Reaktionssystem, welches die Probe, die spezifisch bindende Substanz und die Phthalsäure oder Phthalatsalz einschließt, konstruiert wird, worin die Kombination der zu bestimmenden Substanz und der spezifisch bindenden Substanz eine Kombination eines Antigens und eines Antikörpers ist.
Gemäß dem Reagenskit für die Immunreaktion kann der gemessene Wert einer optischen Eigenschaft des Reaktionssystems verbessert werden. Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Phthalsäure oder das Phthalatsalz, das eine Substanz mit niedrigem Molekulargewicht ist, erhöht auch nicht die Viskosität des Reaktionssystems, und daher ist die Handhabung der Lösung während des Messvorgangs einfach.
Der pH des Reaktionssystems wird bevorzugt auf einen Bereich von 4,5 bis 5,5 eingestellt.
Der Reagenskit wird bevorzugt so hergestellt, dass die Konzentration der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes in dem Reaktionssystem 0,2 M oder weniger beträgt.
Das Phthalatsalz ist bevorzugt Kaliumhydrogenphthalat.
Der Reagenskit kann weiter Polyethylenglycol enthalten und kann so hergestellt werden, dass die Konzentration des Polyethylenglycols in dem Reaktionssystem in einem Bereich von 2 bis 6 Gew.-% liegt.
Die zu bestimmende Substanz kann ein Antigen mit einer Struktur sein, die im Inneren Metallionen hält, und die spezifisch bindende Substanz kann ein Antikörper sein, der spezifisch an das Antigen bindet, das die Metallionen nicht hält.
Der Antikörper kann ein antihumaner C-reaktiver Protein-Antikörper sein.
Der Reagenskit kann weiter eine Metallverbindung, die Metallionen liefert, enthalten, die zu bestimmende Substanz kann ein Antigen mit einer Struktur, die im Inneren Metallionen hält, sein, das Antigen kann eine Struktur haben, das im Inneren Metallionen hält, und die spezifisch bindende Substanz kann ein polyklonaler Antikörper sein.
Der Antikörper kann ein antihumaner C-reaktiver Protein-Antikörper sein.
Die zu bestimmende Substanz kann ein Antigen sein, und die spezifisch bindende Substanz kann ein polyklonaler Antikörper sein, der befähigt ist, an eine Mehrzahl von Bindungsstellen des Antigens zu binden.
Der monoklonale Antikörper kann ein antihumaner C-reaktiver Protein-Antikörper sein.
Die spezifisch bindende Substanz und die Phthalsäure oder das Phthalatsalz können vermischt vorliegen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Fließschema, welches Schritte eines Immunreaktionsmessverfahrens einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
2 ist ein Diagramm, welches die Annahme der Erfinder betreffend den Reaktionsmechanismus gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
3(a) und 3(b) sind Diagramme, die erläutern, wie ein Antigen und ein Antikörper in einem Reaktionssystem in einem homogenen Immunreaktionsmessverfahren reagieren.
4 ist eine grafische Wiedergabe, welche die Ergebnisse der Messung von Humanalbumin durch Immunnephelometrie zeigt, in einem Immunreaktionsmessverfahren unter Verwendung eines Reagenskits zur Immunreaktionsmessung, enthaltend Kaliumhydrogenphthalat, eines Beispiels der vorliegenden Erfindung und eines Vergleichsbeispiels.
5 ist eine grafische Wiedergabe, welche die Ergebnisse der Messung von Humanalbumin durch Immunnephelometrie zeigt, in einem Immunreaktionsmessverfahren unter Verwendung eines Reagenskits für die Immun reaktionsmessung, enthaltend Phthalsäure, des Beispiels der vorliegenden Erfindung und eines Vergleichsbeispiels.
6 ist eine grafische Darstellung, welche die Ergebnisse der pH-Abhängigkeit der Humanalbuminmessung durch Immunnephelometrie zeigt, in einem Immunreaktionsmessverfahren unter Verwendung eines Reagenskits für die Immunreaktionsmessung, enthaltend Kaliumhydrogenphthalat, eines anderen Beispiels der vorliegenden Erfindung.
7 ist eine grafische Darstellung, welche die Ergebnisse der Abhängigkeit der Messung von Humanalbumin durch Immunnephelometrie auf die Konzentration von Kaliumhydrogenphthalat zeigt, in einem Immunreaktionsmessverfahren unter Verwendung eines Reagenskits für die Immunreaktionsmessung, enthaltend Kaliumhydrogenphthalat, eines noch anderen Beispiels der vorliegenden Erfindung.
8 ist eine grafische Darstellung, welche die Ergebnisse der Messung von Humanalbumin durch Immunnephelometrie zeigt, in einem Immunreaktionsmessverfahren unter Verwendung eines Reagenskits für die Immunreaktionsmessung, enthaltend Phthalsäure und einen anderen Puffer, eines noch anderen Beispiels der vorliegenden Erfindung und eines Vergleichsbeispiels.
9 ist eine grafische Darstellung, welche die Ergebnisse der Messung von humanem CRP durch Immunnephelometrie zeigt, in einem Immunreaktionsmessverfahren unter Verwendung eines Reagenskits für die Immunreaktionsmessung, enthaltend einen antihumanen polyklonalen Ziege-CRP-Antikörper und Phthalsäure, eines noch anderen Beispiels der vorliegenden Erfindung und eines Vergleichsbeispiels.
10 ist eine grafische Darstellung, welche die Ergebnisse der humanen CRP-Messung durch Immunnephelometrie zeigt, in einem Immunreaktionsmessverfahren unter Verwendung eines Reagenskits für die Immunreaktionsmessung, enthaltend einen antihumanen monoklonalen Maus-CRP-Antikörper und Kaliumhydrogenphthalat, eines noch anderen Beispiels der vorliegenden Erfindung und eines Vergleichsbeispiels.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Wie vorstehend beschrieben, wird in einem Immunreaktionsmessverfahren zum Messen des Gehalts einer zu bestimmenden Substanz, die in einer Probe zu messen ist, eine Antigen-Antikörper-Reaktion, welche die zu bestimmende Substanz umfasst, ablaufen gelassen, und die Menge der zu bestimmenden Substanz wird aus dem gemessenen Wert einer optischen Eigenschaft eines Reaktionssystems nach der Reaktion berechnet.
Beim Durchführen der vorstehend beschriebenen Messung fanden die Erfinder der vorliegenden Erfindung ein Immunreaktionsmessverfahren, bei dem ein hoher Messwert (d. h. eine hohe Messempfindlichkeit) erhalten wird. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass das Immunreaktionsmessverfahren, das von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gefunden wurde, auch ein Zonenphänomen, das in einem Antigen-Überschussbereich auftritt, verringert werden konnte.
Hierin nachstehend wird eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mit Bezug auf 1 beschrieben. 1 ist ein Fließschema, welches Schritte eines Immunreaktionsmessverfahrens dieser Ausführungsform zeigt. Es wird darauf hingewiesen, dass der Ausdruck "gemessener Wert" verwendet wird als die gleiche Bedeutung ausdrückend wie die Signalintensität, falls nicht anders angegeben.
Zuerst wird in dem Schritt St1, der in 1 gezeigt ist, ein Reaktionssystem konstruiert, das eine Probe, für welche der Gehalt einer zu bestimmenden Substanz zu messen ist, eine spezifisch bindende Substanz, die spezifisch an die zu bestimmende Substanz bindet, und Phthalsäure oder Phthalatsalz enthält. Der pH des Reaktionssystems wird auf weniger als 7 eingestellt. Wenn die zu bestimmende Substanz ein Antigen ist, ist die spezifisch bindende Substanz ein Antikörper. Wenn umgekehrt die zu bestimmende Substanz ein Antikörper ist, ist die spezifisch bindende Substanz ein Antigen.
Wenn die zu bestimmende Substanz in der Probe enthalten ist, werden durch die vorstehende Konstruktion Agglutinatkomplexe aufgrund der Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen der zu bestimmenden Substanz und der spezifisch bindenden Substanz gebildet. Wenn die zu bestimmende Substanz nicht in der Probe enthalten ist, tritt keine Bildung von Agglutinatkomplexen aufgrund der Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen der zu bestimmenden Substanz und der spezifisch bindenden Substanz ein.
In dem Schritt St2, der in 1 gezeigt ist, wird eine optische Eigenschaft des Reaktionssystems gemessen. Wenn Agglutinatkomplexe in dem Schritt St1 gebildet werden, wird das Reaktionssystem trübe, was eine Änderung der gestreuten Lichtintensität, der durchgelassenen Lichtmenge und Ähnliches hervorruft. Dadurch kann durch Messen der gestreuten Lichtintensität, der durchgelassenen Lichtmenge oder Ähnlichem der Trübungsgrad des Reaktionssystems abgeschätzt werden. In dieser Messung ist es bevorzugt, eine optische Änderung des Reaktionssystems zu messen, d. h. eine Änderung der gestreuten Lichtintensität oder der durchgelassenen Lichtmenge unter Verwendung einer Referenz, erhalten durch Weglassen der spezifisch bindenden Substanz aus dem Reaktionssystem. Andererseits kann eine Referenz, erhalten durch Weglassen der Probe aus dem Reaktionssystem, verwendet werden.
Beim Durchführen der vorstehend beschriebenen Schritte ist es möglich, den gemessenen Wert einer optischen Eigenschaft des Reaktionssystems zu verbessern, der durch die Agglutinationskomplexe hervorgerufen wird, die durch die Antigen-Antikörper-Reaktion gebildet werden. Daher kann gemäß des Immunreaktionsmessverfahrens dieser Ausführungsform die Menge der zu bestimmenden Substanz mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden. Der Grund, weshalb diese Wirkung erhalten wird, ist derzeit nicht bekannt, aber die Erfinder der vorliegenden Erfindung nehmen an, dass diese Wirkung aus dem folgenden Grund, der mit Bezug auf 2 beschrieben wird, erhalten wird.
Es wird angenommen, dass Phthalsäure und Phthalatsalz in wässriger Lösung als Phthalsäure oder Phthalsäureionen vorliegen. Es wird angenommen, dass Phthalsäure und Phthalsäureionen, die eine Polarität haben, in einfacher Weise Wassermoleküle in der wässrigen Lösung anziehen. Es wird angenommen, dass durch Zugabe von Phthalsäure oder Phthalatsalz zu dem Reaktionssystem Wassermoleküle sich um die Phthalsäure und die Phthalsäureionen sammeln. Daher nimmt die Menge von Wassermolekülen, die um Antikörpermoleküle herum vorliegen, signifikant ab, wie in 2 gezeigt, und daher steigt das Verhältnis des lokalen Vorliegens von Antikörpermolekülen an. Dies erhöht vermutlich die Kollision zwischen dem Antigen und dem Antikörper und erleichtert so die Antigen-Antikörper-Reaktion. Als Ergebnis wird vermutlich die Bildung von Agglutinatkomplexen erleichtert, und daher verbessert sich der gemessene Wert einer optischen Eigenschaft des Reaktionssystems.
Wie vorstehend beschrieben, ist es in dem üblichen Verfahren, welches das Zusetzen eines wasserlöslichen Polymers umfasst, notwendig, ein wasserlösliches Polymer in einer höheren Konzentration oder ein wasserlösliches Polymer mit einem höheren Molekulargewicht zuzusetzen, um den gemessenen Wert zu verbessern, ein gutes S/N-Verhältnis aufrechtzuerhalten und um eine stabile Messung sicherzustellen. Dies ruft ein Problem des Viskositätsanstiegs der Lösung hervor und macht daher die Handhabung der Lösung während des Analysevorgangs schwierig. In dieser Ausführungsform erhöht jedoch Phthalsäure oder Phthalatsalz, die bzw. das eine Substanz mit niedrigem Molekulargewicht ist, nicht die Viskosität der Lösung, und daher ist die Handhabung der Lösung während des Messvorgangs einfach.
In dem Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform kann das Zonenphänomen, das auftritt, wenn ein Antigen in überschüssiger Menge vorliegt, verringert werden. Dies wird mit Bezug auf die 3(a) und 3(b) beschrieben. Die 3(a) und 3(b) sind Ansichten, die schematisch erläutern, wie ein Antigen und ein Antikörper in einem Reaktionssystem in einem homogenen Immunreaktionsmessverfahren reagieren.
Im Allgemeinen ist in einem homogenen Immunreaktionsmessverfahren das Auftreten eines Zonenphänomen genannten Phänomens bekannt. Wie in 3(a) gezeigt, wird normalerweise in einem homogenen Immunreaktionsmessverfahren ein Agglutinatkomplex als sehr große Molekülkette gebildet, der einen Antikörper und ein Antigen, die wechselseitig aneinander binden, umfasst. Das Zonenphänomen ist ein Phänomen, in welchem ein Agglutinatkomplex weniger einfach gebildet wird, wenn das Antigen bezüglich des Antikörpers in einer überschüssigen Menge vorliegt, wie in 3(b) gezeigt, im Vergleich mit der Menge in einem äquivalenten Bereich, in welchem das Antigen und der Antikörper die maximale Menge von Agglutinatkomplexen bildet. Was die Bindungsreaktion zwischen einem mehrwertigen Antikörper und einem zweiwertigen oder höherwertigen Antigen betrifft, so ist die Gittertheorie von Heidelberger und Anderen berühmt, wovon Einzelheiten in Fundamental Immunology, hrsg. von William E. Paul, 1984 (japanische Übersetzung, Kiso Men-ekigaku, übersetzt von Tomio Tada, Seiten 714–716 (1987)) beschrieben sind.
In den Antigen- und Antikörperkonzentrationsbereichen, die frei von dem Zonenphänomen sind, wird ein Agglutinatkomplex als sehr große Molekülkette gebildet, in welchem der Antikörper und das Antigen wechselseitig aneinander binden, wie in 3(a) gezeigt. Wenn die Antikörperkonzentration konstant ist, steigen die Menge und die Größe der Agglutinatkom plexe mit dem Ansteigen der Antigenkonzentration an. Daher kann durch Messen der Menge und der Größe der Agglutinatkomplexe als eine optische Änderung die Antigenkonzentration quantitativ gemessen werden. Die Agglutinatkomplexe sind groß genug, um ihr Vorliegen durch das bloße Auge als Trübung und Agglutinate in der Lösung zu bestätigen, abhängig von den Antikörper- und Antigenkonzentrationen. Daher ist auch die qualitative Bewertung durch visuelle Beobachtung und Ähnliches möglich.
In einem aktuellen homogenen Immunreaktionsmessverfahren wird in vielen Fällen die Antigenkonzentration unter Verwendung eines Antikörpers gemessen. Der gemessene Wert gibt auch in vielen Fällen einen wichtigen Hinweis, wenn die Antigenkonzentration hoch ist als wenn sie niedrig ist. Wenn das Antigen in einer überschüssigen Menge mit Bezug auf den Antikörper vorliegt, werden jedoch die Bindungsstellen des Antikörpers mit dem Antigen in einer großen Menge gesättigt, wie in 3(b) gezeigt, und daher wird die Bildung von Agglutinatkomplexen schwierig. Dies macht es schwierig, die Ergebnisse der Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen dem Fall, dass das Antigen in einer niedrigen Konzentration vorliegt, und dem Fall, dass das Antigen im Überschuss vorliegt, zu unterscheiden. Dies ruft ein Problem hervor, dass eine korrekte Quantifizierung und Bewertung entsprechend der Antigenkonzentration nicht erreicht werden kann oder dass der messbare Konzentrationsbereich beschränkt ist, um eine korrekte Quantifizierung und Bewertung entsprechend der Antigenkonzentration zu erreichen. Dieses Zonenphänomen, das auftritt, wenn ein Antigen in einer überschüssigen Menge vorliegt, ist häufig ein Grund für eine Schwierigkeit, die in einem homogenen Immunreaktionsmessverfahren auftritt.
Entsprechend dem Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform kann das Zonenphänomen, das auftritt, wenn ein Antigen in einer überschüssigen Menge mit Bezug auf einen Antikörper vorliegt, verringert werden. Der Grund ist, dass die Bildung von Agglutinatkomplexen durch die Zugabe von Phthalsäure oder Phthalatsalz zu dem Reaktionssystem, wie vorstehend beschrieben, erleichtert wird.
Entsprechend dem Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform wird auch mit der Verringerung des Zonenphänomens der Abfall des gemessenen Wertes für die zu bestimmende Substanz in einer hohen Konzentration verringert. Dies ermöglicht eine Verbreiterung des messbaren Konzentrationsbereichs, innerhalb dessen der Gehalt der zu bestimmenden Substanz genau gemessen werden kann.
Hierin nachstehend werden die jeweiligen Schritte im Einzelnen beschrieben. In dem Schritt St1, wie vorstehend beschrieben, wird ein Reaktionssystem konstruiert, das eine zu bestimmende Substanz, eine spezifisch bindende Substanz, die spezifisch an die zu bestimmende Substanz bindet, und Phthalsäure oder Phthalatsalz einschließt. Sowohl Phthalsäure als auch Phthalatsalz können in dem Reaktionssystem enthalten sein. Natürlich kann in dem Reaktionssystem Phthalsäure oder Phthalatsalz enthalten sein.
In dem Schritt St1 stellt die Phthalsäure oder das Phthalatsalz bevorzugt eine Pufferkapazität bereit, um den pH des Reaktionssystems auf weniger als 7 einzustellen. Dies eliminiert die Notwendigkeit der Zugabe eines anderen Puffers, um den pH des Reaktionssystems auf weniger als 7 einzustellen, und ermöglicht das wirksame Erzielen der Wirkungen, den gemessen Wert zu verbessern und das vorstehend beschriebene Zonenphänomen zu verringern. Um die Pufferkapazität des Reaktionssystems durch die Phthalsäure oder das Phthalatsalz bereitzustellen, beträgt die Konzentration der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes bevorzugt 0,01 M oder mehr.
In dem Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform liegt der pH des Reaktionssystems in dem Schritt St1 bevorzugt in dem Bereich von 4,5 bis 5,5, bevorzugter in dem Bereich von 4,5 bis 5,3, weiter bevorzugter in dem Bereich von 4,5 bis 5,0. Innerhalb des vorstehenden pH-Bereiches ist die Wirkung der Verbesserung des gemessenen Wertes hoch, und auch die Wirkung der Verringerung des Zonenphänomens ist hoch. Am bevorzugtesten sollte der pH des Reaktionssystems auf 4,5 eingestellt werden.
In dem Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform beträgt die Konzentration der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes in dem Reaktionssystem in dem Schritt St1 bevorzugt 0,2 M oder weniger. Mit dieser Konzentration ist die Wirkung der Verbesserung des gemessenen Wertes höher, und auch die Wirkung der Verringerung des Zonenphänomens ist höher. Um diese Wirkungen weiter zu erhöhen, ist es bevorzugter, die Konzentration der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes in dem Reaktionssystem auf 0,1 M oder weniger einzustellen. Insbesondere ist es weiter bevorzugter, die Konzentration der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes in dem Reaktionssystem auf etwa 0,1 M einzustellen, um diese Wirkungen signifikant zu erhöhen.
In dem Schritt St1 kann ein anderer Puffer zusätzlich zu dem Reaktionssystem zugesetzt werden. Der für das Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform verwendbare Puffer ist ein in der Technik bekannter Puffer, einschließlich z. B. Puffer vom Phosphorsäuretyp, wie Natriumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumacetat, Natriumcacodylat, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure und Bernsteinsäure. In dem Fall, dass ein Puffer zugesetzt wird, kann die Menge des in das Reaktionssystem einzubringenden Puffers in geeigneter Weise eingestellt werden, abhängig von der Art des verwendeten Puffers, der Menge der Probe (Analyt), welche die zu bestimmende Substanz enthält, der Art der Zufuhr des Antikörpers oder des Antigens gegen das Antigen oder den Antikörper als zu bestimmende Substanz in dem Reaktionssystem und Ähnlichem.
Beispiele der für das Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform verwendeten Phthalsäure und des Phthalatsalzes umfassen Phthalsäure, Phthalsäureanhydrid, Kaliumhydrogenphthalat, Kaliumphthalat, Dinatriumphthalat, Ammoniumphthalat und Kupfer(II)-phthalat. Diese sind alle auf dem Markt und daher in einfacher Weise erhältlich. Diese können allein oder in Kombination verwendet werden. Unter Anderen ist Kaliumhydrogenphthalat besonders als das für das Immunreaktionsmessverfahren und den Reagenskit für das Immunmessverfahren dieser Ausführungsform bevorzugt aus den Gründen, dass seine Wasserlöslichkeit hoch ist, und dass der pH seiner wässrigen Lösung, wenn es aufgelöst ist, etwa 4,0 beträgt.
Die Phthalsäure umfasst Isomere, d. h. o-Phthalsäure, m-Phthalsäure und p-Phthalsäure (Terephthalsäure). In dieser Ausführungsform können Mischungen von o-Phthalsäure, m-Phthalsäure und p-Phthalsäure verwendet werden. Die Verwendung von o-Phthalsäure allein, die eine hohe Wasserlöslichkeit hat, ist am bevorzugtesten. Bei der Verwendung von Phthalatsalz können, wie bei der Verwendung von Phthalsäure, Mischungen von m-Phthalatsalz, p-Phthalatsalz und p-Phthalatsalz verwendet werden. Die Verwendung von o-Phthalatsalz allein, das eine hohe Wasserlöslichkeit hat, ist am bevorzugtesten.
In dem Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform kann eine andere beliebige Komponente, die in der Technik bekannt ist, zu dem Reaktionssystem zugesetzt werden, abhängig von der Verwendung des Reaktionssystems, solange die vorstehenden Wirkungen erhalten werden. So kann z. B. in einer Anwendung auf ein homogenes Immunreaktionsmessverfahren, wie Immunnephelometrie, Immunturbidimetrie und Slide-Agglutination, Polyethylenglycol (PEG) zu dem Reaktionssystem in dem Immunreaktionsmessverfahren der vorliegenden Erfindung zugesetzt werden. Der Gehalt davon beträgt bevorzugt 2 bis 6 Gew.-%, bevorzugter 4 Gew.-%, als Konzentration in dem Reaktionssystem, da mit dieser Konzentration die nicht-spezifische Agglutination gering ist und die Wirkung der Verbesserung der Messempfindlichkeit hoch ist.
Um die durch Selbstagglutination des Antigens oder des Antikörpers hervorgerufene nichtspezifische Trübung zu verringern, kann ein oberflächenaktiver Stoff, wie Tween 20, Octylglucosid, Natriumlaurylsulfat (SDS), Sucrosemonolaurat und CHAPS zu dem Reaktionssystem in dieser Ausführungsform zugesetzt werden. Der Gehalt eines solchen oberflächenaktiven Stoffes in dem Reaktionssystem beträgt bevorzugt 0,3% (Gew./Vol.) oder weniger, bevorzugter 0,1% (Gew./Vol.) oder weniger in dieser Ausführungsform, da mit diesem Gehalt die Antigen-Antikörper-Reaktion weniger blockiert wird.
In dem Schritt St2 des Immunreaktionsmessverfahrens dieser Ausführungsform unterliegt das für die Messung einer optischen Eigenschaft des Reaktionssystems übernommene Verfahren keiner speziellen Beschränkung. Es wird jedoch insbesondere eine höhere Wirkung erwartet durch Übernehmen eines homogenen Immunreaktionsmessverfahrens, wie Immunnephelometrie, Immunturbidimetrie und Slide-Agglutination, in welchem das Zonenphänomen auftreten kann. Die Übernahme von Immunnephelometrie und Immunturbidimetrie, in welchen Verfahren die Verwendung einer automatischen Messvorrichtung weit verbreitet ist, ist besonders bevorzugt, da der für die Bewertung des Zonenphänomens erforderliche Schritt verkürzt oder vereinfacht werden kann.
In dem Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform sind die Antigen-Antikörper-Komplexe bevorzugt Agglutinatkomplexe. In dem Schritt St2 werden die Agglutinatkomplexe bevorzugt durch Messen der Änderung einer optischen Eigenschaft nachgewiesen, die durch die Agglutinatkomplexe hervorgerufen wird. Weiter bevorzugt ist die optische Änderung, die Größenänderung der gestreuten Lichtintensität oder der durchgelassenen Lichtmenge.
Das Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform kann typischerweise in der folgenden Weise durchgeführt werden. Phthalsäure oder Phthalatsalz wird zu einer Pufferlösung zugesetzt, die einen Puffer enthält, um den pH des Reaktionssystems sauer, bevorzugt auf 4,5 bis 5,5, bevorzugter auf 4,5, zu halten. Die Phthalsäure oder das Phthalatsalz wird so zugesetzt, dass ihre bzw. seine Konzentration davon während der Antigen-Antikörper-Reaktion 0,2 M oder weniger, bevorzugt 0,1 M oder weniger, insbesondere bevorzugt 0,1 M, beträgt. Die Phthalsäure oder das Phthalatsalz kann auch als Puffer dienen. Eine Probe (Analyt), für welche der Gehalt einer zu bestimmenden Substanz zu messen ist, und eine Lösung, die eine spezifisch bindende Substanz enthält, werden nacheinander der vorstehenden Pufferlösung zugesetzt und damit vermischt, um dadurch das Reaktionssystem zu konstruieren. Eine optische Änderung des Reaktionssystems wird unter Verwendung der Probe als Referenz gemessen.
Die Art und Weise des Zusetzens der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes, die Art und Weise des Zusetzens eines Puffers, um den pH des Reaktionssystems sauer zu halten, und die Art und Weise des Einstellens des pH des Reaktionssystems sind nicht auf die vorstehend beschriebenen beschränkt. So kann z. B. die Phthalsäure oder das Phthalatsalz vorher in der Lösung, welche die spezifisch bindende Substanz enthält, so vermischt werden, dass die vorstehend beschriebenen Erfordernisse erfüllt werden. Zusätzlich kann ein Puffer in die Lösung eingemischt werden.
Als Nächstes wird ein Reagenskit für die Immunreaktionsmessung beschrieben, der für das Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform verwendet wird.
Der Reagenskit für die Immunreaktionsmessung wird so hergestellt, dass er eine spezifisch bindende Substanz, die spezifisch an eine zu bestimmende Substanz bindet, Phthalsäure oder Phthalatsalz und einen Puffer zum Einstellen des pH des Reaktionssystems enthält, welches die zu bestimmende Substanz, die spezifisch bindende Substanz und die Phthalsäure oder das Phthalatsalz bei weniger als 7 enthält. Die Kombination der zu bestimmenden Substanz und der spezifisch bindenden Substanz ist eine Kombination eines Antigens und eines Antikörpers.
Der Reagenskit für die Immunreaktionsmessung wird zu einer Probe zugesetzt, für welche der Gehalt der zu bestimmenden Substanz zu messen ist. Durch diese Zugabe ist es möglich, das Reaktionssystem zu konstruieren, welches die Probe, für welche der Gehalt der zu bestimmenden Substanz zu messen ist, die spezifisch bindende Substanz, die spezifisch an die zu bestimmende Substanz bindet, und Phthalsäure oder Phthalatsalz enthält. Falls die zu bestimmende Substanz in der Probe enthalten ist, werden Agglutinatkomplexe aufgrund der Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen der zu bestimmenden Substanz und der spezifisch bindenden Substanz gebildet. Falls die zu bestimmende Substanz nicht in der Probe enthalten ist, tritt keine Bildung von Agglutinatkomplexen aufgrund der Antigen-Antikörper- Reaktion zwischen der zu bestimmenden Substanz und der spezifisch bindenden Substanz auf.
Demgemäß ist es beim Durchführen der in 1 gezeigten Schritte unter Verwendung des Reagenskits für die Immunreaktionsmessung möglich, den gemessenen Wert einer optischen Eigenschaft des Reaktionssystems, hervorgerufen durch die Agglutinatkomplexe, die aufgrund der Antigen-Antikörper-Reaktion gebildet wurden, zu verbessern. Mit anderen Worten ermöglicht der Reagenskit für die Immunreaktionsmessung die Messung der Menge der zu bestimmenden Substanz mit hoher Messempfindlichkeit. Darüber hinaus erhöht die verwendete Phthalsäure oder das Phthalatsalz, die bzw. das eine Substanz mit niedrigem Molekulargewicht ist, nicht die Viskosität der Lösung, und daher wird die Handhabung der Lösung während des Messvorgangs vereinfacht.
Darüber hinaus kann das Zonenphänomen, das auftritt, wenn das Antigen in überschüssiger Menge bezüglich des Antikörpers vorliegt, verringert werden. Mit der Verringerung des Zonenphänomens wird der Abfall des für die zu bestimmende Substanz in hoher Konzentration gemessenen Werts verringert. Dies ermöglicht die Verbreiterung des messbaren Konzentrationsbereichs, innerhalb dessen der Gehalt der zu bestimmenden Substanz genau gemessen werden kann.
Der Reagenskit für die Immunreaktionsmessung kann sowohl Phthalsäure als auch Phthalatsalz enthalten. Die Phthalsäure oder das Phthalatsalz stellt bevorzugt eine Pufferfähigkeit bereit, so dass das Reaktionssystem in dem Schritt St1 so hergestellt wird, dass es einen pH von weniger als 7 hat. Mit anderen Worten dient die Phthalsäure oder das Phthalatsalz bevorzugt auch als Puffer.
Der Reagenskit für die Immunreaktionsmessung kann weiter einen anderen Puffer enthalten. Als ein solcher Puffer kann ein in der Technik bekannter Puffer verwendet werden, einschließlich z. B. Puffer vom Phosphorsäuretyp, wie Natriumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumacetat, Natriumcacodylat, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure und Bernsteinsäure. Die Menge des Puffers kann in geeigneter Weise abhängig von der Art des verwendeten Puffers, der Menge der Probe (Analyt), welche die zu bestimmende Substanz enthält, der Art und Weise der Zugabe des Antikörpers oder des Antigens gegen das Antigen oder den Antikörper als zu bestimmende Substanz in dem Reaktionssystem und Ähnlichem eingestellt werden.
Der Reagenskit für die Immunreaktionsmessung wird bevorzugt so hergestellt, dass der pH des Reaktionssystems in dem Schritt St1 in dem Bereich von 4,5 bis 5,5, bevorzugter in dem Bereich von 4,5 bis 5,3, weiter bevorzugter in dem Bereich von 4,5 bis 5,0 liegt. Innerhalb des vorstehenden pH-Bereichs ist die Wirkung der Verbesserung des gemessenen Wertes hoch, und die Wirkung der Verringerung des Zonenphänomens ist hoch. Insbesondere wird der Reagenskit bevorzugt so hergestellt, dass der pH des Reaktionssystems etwa 4,5 beträgt.
Der Reagenskit für die Immunreaktionsmessung wird bevorzugt so hergestellt, dass die Konzentration der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes in dem Reaktionssystem in dem Schritt St1 0,2 M oder weniger beträgt. Mit dieser Konzentration ist die Wirkung der Verbesserung des gemessenen Wertes höher, und die Wirkung der Verringerung des Zonenphänomens ist höher. Um diese Wirkungen weiter zu erhöhen, ist es bevorzugter, den Reagenskit so herzustellen, dass die Konzentration der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes in dem Reaktionssystem 0,1 M oder weniger beträgt. Um diese Wirkungen signifikant zu erhöhen, ist es weiter insbesondere bevorzugter, den Reagenskit so herzustellen, dass die Konzentration der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes in dem Reaktionssystem etwa 0,1 M beträgt.
Beispiele der Phthalsäure und des Phthalatsalzes, die in dem Reagenskit für die Immunreaktionsmessung enthalten sind, umfassen Phthalsäure, Phthalsäureanhydrid, Kaliumhydrogenphthalat, Kaliumphthalat, Dinatriumphthalat, Ammoniumphthalat und Kupfer(II)-phthalat. Diese Verbindungen sind alle auf dem Markt und daher in einfacher Weise erhältlich. Sie können allein oder in Kombination verwendet werden. Kaliumhydrogenphthalat ist unter anderen als das für das Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform verwendete Phthalatsalz besonders bevorzugt, da es eine hohe Wasserlöslichkeit hat und der pH seiner wässrigen Lösung etwa 4,0 beträgt.
Phthalsäure umfasst Isomere, d. h. o-Phthalsäure, m-Phthalsäure und p-Phthalsäure (Terephthalsäure). In dieser Ausführungsform können Mischungen von o-Phthalsäure, m-Phthalsäure und p-Phthalsäure verwendet werden. Die Verwendung von o-Phthalsäure allein, die eine hohe Wasserlöslichkeit hat, ist am bevorzugtesten. Bei Verwendung von Phthalatsalz können, wie bei der Verwendung von Phthalsäure, ebenfalls Mischungen von m-Phthalatsalz, p-Phthalatsalz und p-Phthalatsalz verwendet werden. Die Verwendung von o-Phthalatsalz allein, das eine hohe Wasserlöslichkeit hat, ist am bevorzugtesten.
Eine andere beliebige Komponente, die in der Technik bekannt ist, kann zu dem Reagenskit für die Immunreaktionsmessung, abhängig von seiner Verwendung und Ähnlichem, zugesetzt werden, solange die vorstehenden Wirkungen erhalten werden. In einer Anwendung auf ein homogenes Immunreaktionsmessverfahren, wie Immunnephelometrie, Immunturbidimetrie und Slide-Agglutination, kann z. B. Polyethylenglycol (PEG) zu dem Reagenskit für die Immunreaktionsmessung zugesetzt werden. Sein Gehalt beträgt bevorzugt 2 bis 6 Gew.-%, bevorzugter 4 Gew.-%, als Konzentration in dem Reaktionssystem, da mit dieser Konzentration eine nicht-spezifische Agglutination gering ist und die Wirkung der Verbesserung der Messempfindlichkeit hoch ist.
Um die nicht-spezifische Trübung, hervorgerufen durch Selbstagglutination des Antigens oder des Antikörpers, zu verringern, kann ein oberflächenaktiver Stoff, wie Tween 20, Octylglucosid, Natriumlaurylsulfat (SDS), Sucrosemonolaurat und CHAPS zu dem Reagenskit für die Immunreaktionsmessung zugesetzt werden. Der Gehalt eines solchen oberflächenaktiven Stoffes in dem Reagenskit für die Immunreaktionsmessung beträgt bevorzugt 0,3% (Gew./Vol.) oder weniger, bevorzugt 0,1% (Gew./Vol.) oder weniger in dem Reaktionssystem, da mit diesem Gehalt die Antigen-Antikörper-Reaktion weniger blockiert wird.
Das Messsystem, auf welches der Reagenskit für die Immunreaktionsmessung angewandt wird, unterliegt keiner speziellen Beschränkung. Insbesondere wird jedoch eine höhere Wirkung erwartet durch Verwendung eines homogenen Immunreaktionsmessverfahrens, wie Immunnephelometrie, Immunturbidimetrie und Slide-Agglutination, in welchem das Zonenphänomen auftreten kann. Die Übernahme eines Messverfahrens, wie Immunnephelometrie und Immunturbidimetrie, in welchen Verfahren die Verwendung einer automatischen Messvorrichtung üblich ist, ist besonders bevorzugt, da der für die Beurteilung des Zonenphänomens erforderliche Schritt verkürzt oder vereinfacht werden kann.
Typischerweise kann der Reagenskit für die Immunreaktionsmessung auf die folgende Weise hergestellt werden.
Eine Lösung, die eine spezifisch bindende Substanz (in diesem Fall ein Antikörper) enthält, die spezifisch an eine zu bestimmende Substanz (in diesem Fall ein Antigen) bindet, kann getrennt von einer Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltenden Lösung hergestellt werden. Das Verfahren ist in diesem Fall wie folgt.
Die Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltende Lösung wird unter Verwendung eines Puffers so hergestellt, dass der pH des Reaktionssystems auf unter 7 gehalten wird. Die Lösung wird bevorzugt so hergestellt, dass der pH in dem Bereich von 4,5 bis 5,5, bevorzugter in dem Bereich von 4,5 bis 5,3, weiter bevorzugter in dem Bereich von 4,5 bis 5,0 liegt. Am bevorzugtesten wird die Lösung so hergestellt, dass der pH des Reaktionssystems 4,5 beträgt. Die Menge der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes und des Puffers wird so eingestellt, dass die Konzentration der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes in dem Reaktionssystem 0,2 M oder weniger, bevorzugt 0,1 M oder weniger, insbesondere bevorzugt etwa 0,1 M beträgt, und die eingestellte Menge wird in reinem Wasser zum Herstellen der Lösung aufgelöst.
Der Puffer und die Phthalsäure oder das Phthalatsalz können getrennt durch Auflösen in getrennten Lösungen hergestellt werden, solange die vorstehenden Erfordernisse erfüllt sind. Alternativ kann eine Lösung, die keinen Puffer enthält, in welcher die Phthalsäure oder das Phthalatsalz als Puffer dient, hergestellt werden, solange der vorstehende pH-Bereich erfüllt ist.
Die Lösung, welche die spezifisch bindende Substanz enthält, kann eine beliebige Zusammensetzung haben, solange das Reaktionssystem die vorstehend beschriebenen Erfordernisse erfüllt, wenn die Lösung mit der Lösung, welche die Phthalsäure oder das Phthalatsalz enthält, vermischt wird.
Die spezifisch bindende Substanz und die Phthalsäure oder das Phthalatsalz können vorher miteinander vermischt werden. In diesem Fall kann die Lösung, welche die spezifisch bindende Substanz enthält, einer Dialyse oder Gelfiltration mit der hergestellten Lösung, welche die Phthalsäure oder das Phthalatsalz enthält, unterworfen werden, um Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht zu ersetzen, so dass die vorstehend beschriebenen Erfordernisse erfüllt werden.
Das Antigen oder der Antikörper als die zu bestimmende Substanz in den Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform unterliegt keiner besonderen Beschränkung, und kann gewöhnlich jede Substanz sein, die unter Verwendung einer Antigen-Antikörper-Reaktion gemessen werden kann. Beispiele einer solchen Substanz umfassen Proteine, Nukleinsäuren, Lipid, Bakterien, Viren und Haptene. Proteine sind unter anderen die Hauptgegenstände, die in klinischen Prüfungen unter Verwendung einer Antigen-Antikörper-Reaktion zu messen sind. Wenn die zu bestimmende Substanz ein Protein ist, kann daher das Immunreaktionsmessverfahren und der Reagenskit für die Immunreaktionsmessung dieser Ausführungsform in geeigneter Weise übernommen werden. Beispiele solcher Proteine umfassen Hormone, wie luteinisierendes Hormon (LH), follikelstimulierendes Hormon (FSH) und humanes Choriongonadotropin (hCG), verschiedene Immunglobulinklassen und -unterklassen, Komplementkomponenten, Marker von verschiedenen Infektionskrankheiten, CRPs, Albumine, Rheumafaktoren und Blutgruppenantigene. Insbesondere kann das Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform in geeigneter Weise für die Messung eines Humanalbumins oder eines humanen C-reaktiven Proteins (humanes CRP) unter anderen als zu bestimmende Substanz verwendet werden.
Die Phthalsäure und das Phthalatsalz haben eine chelatbildende Funktion, worin zweiwertige und dreiwertige Metallionen, wie Ca²⁺ und Fe³⁺, die in dem Reaktionssystem vorliegen, wirksam entfernt werden. Wenn das Antigen eine Struktur hat, die Metallionen im Inneren hält, sollte daher der Antikörper, der spezifisch an das Antigen bindet, bevorzugt noch in der Lage sein, spezifisch an das Antigen in dem Zustand zu binden, wo die Metallionen daraus freigesetzt worden sind. Unter Verwendung eines solchen Antikörpers ist eine Messung möglich, selbst wenn das Antigen eine Substanz ist, deren Molekülstruktur sich aufgrund der Freisetzung von Metallionen ändert.
Wenn das Antigen eine Struktur hat, die Metallionen im Inneren hält, und sich die molekulare Struktur des Antigens aufgrund der Freisetzung von Metallionen ändert, können die gleichen Metallionen, wie diejenigen, die von dem Antigen gehalten werden, zu dem Reaktionssystem zugesetzt werden, um Metallionen in dem Reaktionssystem vorliegen zu lassen. Dies unterdrückt eine Änderung in der molekularen Struktur des Antigens aufgrund der Freisetzung von Metallionen in dem Reaktionssystem, was dem Antikörper erlaubt, an das Antigen zu binden, um die Messung zu ermöglichen.
Die Menge von zugesetzten Metallionen kann auf der Grundlage der chelatbildenden Fähigkeit der verwendeten Phthalsäure oder des Phthalatsalzes, ihrer bzw. seiner Konzentration, der Fähigkeit, Metallionen des Antigens zu halten, und Ähnlichem bestimmt werden.
Ein Beispiel des Antigens mit einer molekularen Struktur, die zum Halten von Metallionen befähigt ist, ist CRP, das seine Struktur abhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von Ca²⁺ ändert. In dem Fall, dass das für das Immunreaktionsmessverfahren dieser Aus führungsform verwendete Antigen humanes CRP ist, dass ein antihumaner polyklonaler Ziege-CRP-Antikörper, der einen Antikörper enthält, der nicht an humanes CRP, der kein Ca²⁺ hat, bindet, als Antikörper verwendet wird, und dass Phthalsäure als Phthalsäure oder Phthalatsalz verwendet wird, wird 0,02 M Ca²⁺ bevorzugt zu dem Reaktionssystem für 0,02 M Phthalsäure zugesetzt.
In dem Fall, dass das Antigen eine Substanz mit mehreren Bindungsstellen für wenigstens eine Art Antikörper ist, ist der Antikörper bevorzugt ein monoklonaler Antikörper, der an die mehreren Bindungsstellen des Antigens bindet. Der monoklonale Antikörper wird von einer Hybridomzelllinie gebildet. Die Hybridomzelllinie wird hergestellt durch Abtrennen von lediglich einer Zelle aus einer verschmolzenen Zellgruppe mit sowohl Antikörperherstellungsfähigkeit als auch starker Wachstumsfähigkeit, die durch Zellfusion zwischen reinem B-Zellen produzierenden Antikörper und einer Myelomzelle und Wachsenlassen der abgetrennten Zelle erhalten wird. Hergestellte Antikörper haben die gleiche Eigenschaft. Da die Hybridomzelllinie eine starke Wachstumsfähigkeit hat und in gefrorenem Zustand aufbewahrt werden kann, wird sie unter einer geeigneten Kontrolle nie ausgehen. Daher können durch Kultivieren des Hybridomzellstammes in einem Medium oder in einer Bauchhöhle und Reinigung des kultivierten Hybridomzellstammes Antikörper mit der gleichen Eigenschaft kontinuierlich ewig erhalten werden.
Ein polyklonaler Antikörper wird in der folgenden Weise erhalten. Ein Antigen wird einem Tier verabreicht, um einen an das Antigen bindenden Antikörper in dem Blut in großer Menge entstehen zu lassen. Das gesamte Blut oder ein Teil davon wird gesammelt und gereinigt. Daher hängt die Natur des polyklonalen Antikörpers von der Individualität, der Wachstumsumgebung, den Bedingungen und Ähnlichem des Tieres ab. Es ist daher schwierig, kontinuierlich Antikörper mit der gleichen Eigenschaft zu erhalten.
Durch Verwendung eines monoklonalen Antikörpers können Antikörper, die unverändert die gleiche Eigenschaft haben, verwendet werden, und dies stabilisiert die Lieferung des Antikörpers als Reagenz. Dies führt zum Stabilisieren der Ergebnisse der Immunreaktionsmessung durch das Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform.
Der für das Immunreaktionsmessverfahren dieser Ausführungsform verwendete Antikörper unterliegt keiner speziellen Beschränkung, sondern kann jeder aus den Klassen von IgG, IgM, IgE, IgA und IgD sein, solange der Antikörper spezifisch an das Antigen bindet. Unter anderen ist der IgG-Antikörper bevorzugt, weil der IgG-Antikörper weniger zu einer nichtspezifischen Reaktion neigt und weil der IgG-Antikörper auf dem Markt in relativ großer Anzahl und daher leicht erhältlich ist. Die Tierart, aus welchem der Antikörper abgeleitet ist, unterliegt keiner besonderen Beschränkung, aber von Kaninchen, Ziegen und Mäusen abgeleitete Antikörper sind bevorzugt, da sie relativ leicht erhältlich sind und in zahlreichen Fällen verwendet worden sind.
Beispiele
Hierin nachstehend werden Beispiele der vorliegenden Erfindung beschrieben. Es wird darauf hingewiesen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.
(Beispiel 1)
Hierin nachstehend wird die Konstruktion eines Reagenskits für die Immunreaktionsmessung beschrieben, der zu verwenden ist, wenn die zu bestimmende Substanz Humanalbumin ist. In diesem Beispiel wird ein Verfahren zum Herstellen eines Reagenskits für die Immunreaktionsmessung beschrieben, der eine Antikörperlösung und eine Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltende Pufferlösung enthält, der für die Messung durch Slide-Agglutination, Immunnephelometrie und Immunturbidimetrie verwendbar ist.
Zur Herstellung einer nachstehend beschriebenen Pufferlösung wurde mit Milli-Q SP TOC (von Millipore Corp.) filtriertes reines Wasser verwendet. Es wird darauf hingewiesen, dass Reagenzien, wie Salz und Puffer, solche von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., verwendet wurden, falls nicht anders angegeben, und der garantierte Reagensgrad wurde für Polyethylen 5000 und trans-Aconitsäure verwendet, während für die anderen Reagenzien der extrareine Grad verwendet wurde.
Als Erstes wurde eine Antikörperlösung hergestellt. Ein antihumaner polyklonaler Kaninchen-Albumin-Antikörper wurde erhalten durch Reinigen eines Antiserums, gesammelt von einem gegen Humanalbumin (von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) immunisierten Kaninchens durch Protein A-Säulenchromatografie. Die Säule wurde mit stationärem Protein A-Gel von Amersham Pharmacia befüllt. Eine Äquilibrierungspufferlösung, zusammengesetzt aus 1,5 M Glycin und 3,0 M NaCl, pH 8,9, wurde für die Reinigung verwendet, und eine Elutionspufferlösung, zusammengesetzt aus 0,1 M Zitronensäure, pH 4,0, wurde verwendet.
Die Reinigung wurde in der folgenden Weise durchgeführt. Die Säule wurde äquilibriert, indem die Äquilibrierungspufferlösung in 5-fachem Volumen gegenüber dem in die Säule gefüllten Gelvolumen durch die Säule fließen gelassen wurde. Das Antiserum, das den Antikörper in einer Menge von 10 bis 20% der gesamten Säulenbindungskapazität enthält, wurde mit der Äquilibrierungspufferlösung auf das zweifache Volumen verdünnt, und die verdünnte Lösung wurde durch die Säule fließen gelassen, damit der Antikörper in dem Serum an das Protein A binden kann. Die Äquilibrierungspufferlösung wurde fließen gelassen, bis Serumkomponenten, die nicht an das Protein A gebunden wurden, nicht mehr aus der Säule herauskamen, um die Säule zu waschen. Anschließend wurde die Elutionspufferlösung durch die Säule fließen gelassen, um den an das Protein A bindenden Antikörper zu eluieren. Die eluierte Antikörperfraktion wurde in einen Dialyseschlauch mit einem Fraktionsmolekulargewicht von 10000 eingebracht und mehrmals mit etwa einem hundertfachen Volumen einer Pufferlösung, die aus 0,05 M 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (von Dojin, hierin nachstehend als MOPS bezeichnet), 0,15 M NaCl und 0,04 Gew.-% NaN₃, pH 7,4, zusammengesetzt war, zum Ersatz von Pufferkomponenten dialysiert. Danach wurde die Antikörperkonzentration durch Messung der Absorption bei 280 nm abgeschätzt und mit der gleichen Pufferlösung, wie sie für die Dialyse verwendet wurde, zum Erhalt einer Antikörperkonzentration von 3,0 mg/ml eingestellt, um dadurch die Antikörperlösung zu erhalten. Die Antikörperkonzentration ist nicht darauf beschränkt. Die hergestellte Antikörperlösung kann bei Raumtemperatur gelagert werden, wird aber bevorzugt bei niedriger Temperatur, bevorzugter bei 4°C, unter dem Gesichtspunkt der Verhinderung der Denaturierung des Antikörpers gelagert.
Eine Phthalsäure oder Phthalat enthaltende Pufferlösung wurde auf die folgende Weise hergestellt. Als Phthalsäure und Phthalatsalz wurden Phthalsäure und Kaliumhydrogenphthalat verwendet, und Pufferlösungen, die diese Substanzen enthalten, wurden hergestellt.
Die Kaliumhydrogenphthalat enthaltende Pufferlösung wurde auf die folgende Weise hergestellt. Kaliumhydrogenphthalat bzw. Polyethylenglycol 6000, gemessen als mit Endkonzentrationen von 0,05 M bzw. 4 Gew.-%, wurden in reinem Wasser von etwa 90% des Zielvolumens aufgelöst. Dann wurde eine wässrige NaOH-Lösung zu der erhaltenen Lösung zugesetzt, um den pH auf 4,5 einzustellen, und die erhaltene Lösung wurde mit reinem Was ser auf das Zielvolumen eingestellt. Die hergestellte Pufferlösung wurde bei Raumtemperatur gelagert.
Die Phthalsäure enthaltende Pufferlösung wurde auf die folgende Weise hergestellt. Phthalsäure bzw. Polyethylenglycol 6000, gemessen als mit Endkonzentrationen von 0,03 M bzw. 4 Gew.-%, wurden in reinem Wasser mit etwa 90% des Zielvolumens aufgelöst. Dann wurde eine wässrige NaOH-Lösung zu der erhaltenen Lösung zugesetzt, um den pH auf 4,5 einzustellen, und die erhaltene Lösung wurde mit reinem Wasser auf das Zielvolumen eingestellt. Die hergestellte Pufferlösung wurde bei Raumtemperatur gelagert.
Wenigstens eine der Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltenden Pufferlösungen wird mit der Antikörperlösung vereinigt, um dadurch den Reagenskit für die Immunreaktionsmessung zu bilden.
(Beispiel 2)
Als Nächstes wird die Konstruktion eines Reagenskits für die Immunreaktionsmessung beschrieben, die zu verwenden ist, wenn die zu bestimmende Substanz humanes CRP ist. Humanes CRP, zusammengesetzt aus fünf Untereinheiten mit der gleichen Struktur, ist eine Substanz mit mehreren Bindungsstellen für eine Antikörperart. Daher ist es durch die Verwendung von einer Art von monoklonalem Anti-CRP-Antikörper möglich, einen Reagenskit für die Immunreaktionsmessung herzustellen, der für eine homogene Immunreaktionsmessung verwendbar ist. Es können zwei oder mehrere Arten von monoklonalen Antikörpern verwendet werden.
In diesem Beispiel wurde daher ein Reagenskit für die Immunreaktionsmessung hergestellt, der zwei Arten von Antikörperlösungen enthält, enthaltend eine polyklonale Antikörperlösung und eine monoklonale Antikörperlösung und eine Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltende Pufferlösung.
Zuerst wird ein Verfahren zum Herstellen der polyklonalen Antikörperlösung beschrieben.
Ein antihumaner polyklonaler CRP-Ziege-Antikörper wurde erhalten durch Reinigen eines von einer Ziege, immunisiert gegen humanes CRP, gesammelten Antiserums durch Protein G-Säulenchromatografie erhalten. Die Säule wurde mit stationärem Protein G-Gel von Amersham Pharmacia befüllt. Eine Äquilibrierungspufferlösung, zusammengesetzt aus 0,02 M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄, pH 7,0, wurde für die Reinigung verwendet, und eine Elutionspufferlösung, zusammengesetzt aus 0,1 M Glycin, pH 2,7, wurde verwendet. Die Reinigung durch Säulenchromatografie und der Ersatz der Pufferlösung durch Dialyse wurden auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt. Die Antikörperkonzentration wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm abgeschätzt und mit der gleichen Pufferlösung wie diejenige, die für die Dialyse verwendet wurde, zum Erhalt einer Antikörperkonzentration von 1,0 mg/ml eingestellt, um dadurch die polyklonale Antikörperlösung zu erhalten.
Humanes CRP ändert sich strukturell abhängig davon, ob oder ob nicht Ca²⁺ gehalten wird. Falls ein Antikörper, der nicht an humanes CRP, das Ca²⁺ hält, bindet, in der Antikörperlösung, welche den Reagenskit für die Immunreaktionsmessung darstellt, enthalten ist, kann daher die Reaktionsrate der Antigen-Antikörper-Reaktion möglicherweise abnehmen, da humanes CRP, das kein Ca²⁺ hält, aufgrund der Chelatfunktion der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes ansteigt. Da die polyklonale Antikörperlösung in diesem Beispiel hergestellt wird, ist ein Antikörper, der kein humanes CRP bindet, das kein Ca²⁺ hält, in der polyklonalen Antikörperlösung enthalten. Im Hinblick darauf wird bei der Herstellung der nachstehend beschriebenen Pufferlösung, die Phthalsäure oder Phthalatsalz enthält, Ca²⁺ zu der Pufferlösung zugesetzt, um die Struktur des humanen CRP aufrecht zu erhalten.
Spezieller wurde die Herstellung der Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltenden Pufferlösung auf die folgende Weise durchgeführt. In diesem Beispiel wurde Phthalsäure als Phthalsäure oder Phthalatsalz verwendet.
Phthalsäure, CaCl₂ bzw. Polyethylenglycol 6000, gemessen als mit Endkonzentrationen von 0,02 M, 0,02 M bzw. 4 Gew.-%, wurden in reinem Wasser von etwa 90% des Zielvolumens aufgelöst. Dann wurde eine wässrige NaOH-Lösung zu der erhaltenen Lösung zugesetzt, um den pH auf 4,5 einzustellen, und die erhaltene Lösung wurde mit reinem Wasser auf das Zielvolumen eingestellt. Die hergestellte Pufferlösung wurde bei Raumtemperatur gelagert.
Als Nächstes wird ein Verfahren zum Herstellen der monoklonalen Antikörperlösung beschrieben.
Als monoklonaler Antikörper wurde ein Antikörper verwendet, der die Bindungsfähigkeit an humanes CRP selbst bei Zugabe eines chelatbildenden Mittels (z. B. 0,02 M Phthalsäure oder Ethylendiamintetraessigsäure) zu dem Reaktionssystem nicht verliert, d. h. der spezi fisch selbst an humanes CRP, das kein Ca²⁺ hält, binden kann. Speziell wurde die monoklonale Antikörperlösung auf die folgende Weise hergestellt.
Ein antihumaner monoklonaler CRP-Mausantikörper, der in diesem Beispiel verwendet wurde, wurde wie folgt erhalten. Zuerst wurden Hybridomzellen (Hinterlegungsnummer FERM BP-6620 des National Institute of Bioscience and Human Technology), die einen antihumanen monoklonalen CRP-Mausantikörper produzieren, in die Bauchhöhle einer Maus injiziert und zum Erhalt von Aszites wachsen gelassen. Die erhaltene Aszites wurde durch in Beispiel 1 beschriebene Säulenchromatografie gereinigt zum Erhalt der antihumanen monoklonalen CRP-Mausantikörperprobe.
Konkret wurde Aszites auf die folgende Weise erhalten. Retirierte weibliche BALB/c-Mäuse wurden zur Herstellung von Aszites verwendet. In die Bauchhöhlen der Mäuse wurden 0,5 bis 1 ml Pristan injiziert, und nach etwa 7 Tagen wurden 0,5 bis 1 ml der folgenden Zellsuspension injiziert. Aszites wurden von den in den Mäusen nacheinander in der Reihenfolge gesammelt, in welcher die Produktion von Aszites beobachtet wurde. Die in die Bauchhöhlen injizierte Hybridomzellsuspension wurde auf die folgende Weise erhalten. Die Hybridomzellen wurden durch Kultivieren in einem Medium wachsen gelassen, das durch Vermischen von 5 bis 15 Vol-% eines Rinderfötusserums in RPMI 1640-Medium (von SIGMA) erhalten wurde, und die gewachsenen Zellen wurden durch Zentrifugation mit dem RPMI 1640-Medium gewaschen und in dem RPMI 1640-Medium wieder suspendiert zum Erhalt einer Konzentration von 1 × 10⁶ bis 10⁷ Zellen/ml.
Die durch Säulenchromatografie gereinigte antihumane monoklonale CRP-Mausantikörperprobe wurde in einen Dialyseschlauch mit einem Fraktioniermolekulargewicht von 10000 verbracht und einige Male mit einer PBS-Pufferlösung, die etwa das 100-fache Volumen von 0,04 Gew.-% NaN₃ (8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,15 g/l Na₂HPO₄·12H₂O und 0,2 g/l KH₂PO₄, pH 7,4) enthielt, zum Ersatz der Pufferlösungskomponenten dialysiert. Anschließend wurde die Antikörperkonzentration durch Messung der Absorption bei 280 nm abgeschätzt und mit der gleichen Pufferlösung wie diejenige, die für die Dialyse verwendet wurde, zum Erhalt einer Antikörperkonzentration von 1,0 mg/ml eingestellt, um dadurch die monoklonale Antikörperlösung zu erhalten.
Die Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltende Pufferlösung wurde auf die folgende Weise hergestellt. Kaliumhydrogenphthalat wurde als die Phthalsäure oder das Phthalatsalz zum Herstellen der Pufferlösung verwendet. Der Antikörper der monoklonalen Antikörperlösung in diesem Beispiel wird durch eine Änderung der Struktur abhängig davon, ob oder ob nicht humanes CRP Ca²⁺ hält, nicht beeinträchtigt. In diesem Fall erfolgte daher keine Zugabe von Ca²⁺ zu der Pufferlösung.
Die Kaliumhydrogenphthalat enthaltende Pufferlösung wurde auf die folgende Weise hergestellt. Kaliumhydrogenphthalat bzw. Polyethylenglycol 6000, gemessen als mit Endkonzentrationen von 0,05 M bzw. 4 Gew.-%, wurden in reinem Wasser von etwa 90% des Zielvolumens aufgelöst. Dann wurde eine wässrige NaOH-Lösung zu der erhaltenen Lösung zum Einstellen des pH auf 4,5 zugesetzt, und die erhaltene Lösung wurde mit reinem Wasser auf das Zielvolumen eingestellt. Die hergestellte Pufferlösung wurde bei Raumtemperatur gelagert.
Die Konzentrationen der wie vorstehend hergestellten Antikörperlösungen sind nicht auf die vorstehend beschriebenen beschränkt. Die hergestellten Antikörperlösungen können bei Raumtemperatur gelagert werden, werden aber bevorzugt bei niedriger Temperatur, bevorzugter bei 4°C, unter dem Gesichtspunkt der Verhinderung der Denaturierung der Antikörper gelagert.
Die Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltende Pufferlösung, hergestellt wir vorstehend beschrieben, wird mit der Antikörperlösung kombiniert, um den Reagenskit für die Immunreaktionsmessung zu bilden.
Die in den Beispielen 1 und 2 hergestellten Reagenzien werden auf die folgende Weise verwendet. Eine ein Antigen, die Antikörperlösung und die Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltende Pufferlösung enthaltende Probe (Analyt) werden zum Herstellen eines Reaktionssystems vermischt. Das Vermischen kann in beliebiger Weise durchgeführt werden. Das Mischungsverhältnis kann in Abhängigkeit von dem Messbereich der erforderlichen Antigenkonzentration bestimmt werden. Die Antigen-Antikörper-Reaktion erfolgt in dem durch das Vermischen hergestellten Reaktionssystem unter Bildung von Agglutinatkomplexen. Der durch die Agglutinatkomplexe hervorgerufene Trübungsgrad wird abgeschätzt durch Messen der Änderung von gestreuter Lichtintensität oder Ähnlichem. Die Antigenkonzentration des Analyts kann auf der Grundlage der Abschätzungsergebnisse bekannt sein.
Durch das Vermischen werden die Konzentrationen des Puffers, der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes und der Zusätze, wie Polyethylenglycol 6000, gegenüber den Ausgangskon zentrationen verdünnt. Solange der Unterschied zwischen der verdünnten Konzentration und der Ausgangskonzentration innerhalb von etwa 10% liegt, sind die Messergebnisse nicht so stark von den Messergebnissen verschieden, die für die Ausgangskonzentration erwartet werden, und beeinträchtigt somit die Verdünnung nicht sehr stark. Um eine Konzentrationsänderung aufgrund der Verdünnung zu vermeiden, können die Antikörperlösung und die Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltende Pufferlösung so hergestellt werden, dass die Substanzen in dem Reagens die Zielkonzentrationen während des Vermischens haben.
Obwohl es in den Beispielen 1 und 2 nicht gezeigt ist, kann der Antikörper an teilchenförmigen Trägern, wie Latex, Goldkolloide und magnetische Teilchen, immobilisiert werden oder kann mit einem Enzym, einem Pigment, einer fluoreszierenden Substanz, einer lumineszierenden Substanz und Ähnlichem markiert werden.
Der für die Herstellung der Antikörperlösung verwendete Puffer und der pH der Antikörperlösung sind nicht auf die vorstehend beschriebenen beschränkt. So ist z. B. in dem Fall der Herstellung eines Reagens vom Einflüssigkeitstyp Phthalsäure oder Phthalatsalz in der Antikörperlösung enthalten. In diesem Fall kann die Dialyse mit einer Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltenden sauren Pufferlösung durchgeführt werden, um den pH des Reaktionssystems auf weniger als 7 zu halten.
In den Beispielen 1 und 2 wurde NaOH für die pH-Einstellung verwendet. Alternativ können Hydroxide, wie KOH, LiOH, NH₄OH, Ca(OH)₂ und Mg(OH)₂, verwendet werden.
In den Beispielen 1 und 2 werden Kaliumhydrogenphthalat und Phthalsäure zur Herstellung der Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltenden Pufferlösung verwendet. Alternativ können andere Arten von Phthalsäure oder Phthalatsalz verwendet werden. So kann z. B. jede Verbindung aus der Gruppe von Phthalsäureanhydrid, Kaliumphthalat, Dinatriumphthalat, Ammoniumphthalat und Kupfer(II)-phthalat verwendet werden. Eine Kombination jeder dieser Arten kann ebenfalls verwendet werden. Die pH-Einstellung kann in diesem Fall unter Verwendung von HCl und Ähnlichem, wenn der pH in dem in reinem Wasser aufgelösten Zustand alkalischer ist als der Ziel-pH, oder unter Verwendung eines vorstehend beschriebenen Hydroxids und Ähnlichem, wenn der pH saurer ist als der Ziel-pH, durchgeführt werden. Die pH-Einstellung kann auch durch Einstellen des Mischungsverhältnisses der vorstehend beispielhaft beschriebenen Arten von Phthalsäure und Phthalatsalz durchgeführt werden.
In den in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Herstellungsverfahren wird die Hauptpufferkapazität der Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltenden Pufferlösung durch die Phthalsäure oder das Phthalatsalz bereitgestellt. Die Konzentration der zu der Pufferlösung zugesetzten Phthalsäure oder des Phthalatsalzes unterliegt jedoch keiner besonderen Beschränkung. Die Hauptpufferkapazität der Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltenden Pufferlösung kann ebenfalls durch einen anderen Puffer bereitgestellt werden, oder die Pufferkapazität kann durch Koordination zwischen der Phthalsäure oder dem Phthalatsalz und einem anderen Puffer bereitgestellt werden.
(Beispiel 3)
In diesem Beispiel wird die Wirkung der Antigenmessung in dem sauren, Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltenden Reaktionssystem gemäß der vorliegenden Erfindung im Vergleich mit einer Antigenmessung in einem neutralen Reaktionssystem beschrieben, das gewöhnlich in Immunreaktionsmessverfahren verwendet wird. Der Vergleich erfolgte durch Messen von Humanalbumin durch Immunnephelometrie. Als Reagens zur Herstellung des sauren, Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltenden Reaktionssystems wurde das in Beispiel 1 hergestellte Reagens verwendet.
Hierin nachstehend werden die Pufferlösungen, die Kaliumhydrogenphthalat verwenden bzw. die Phthalsäure verwenden, hergestellt in Beispiel 1, als Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung und Phthalsäure-Pufferlösung bezeichnet.
Als Vergleichsbeispiele wurde MOPS für Pufferlösungen zur Herstellung neutraler Reaktionssysteme verwendet. Speziell wurden Pufferlösungen mit einer Zusammensetzung von 0,05 M MOPS und 4 Gew.-% Polyethylenglycol 6000, pH 7,4, und eine Zusammensetzung von 0,03 M MOPS und 4 Gew.-% Polyethylenglycol 6000, pH 7,4, hergestellt. Hierin nachstehend werden diese Pufferlösungen als 0,05 M MOPS-Pufferlösung und 0,03 M MOPS-Pufferlösung bezeichnet. Die Pufferlösungen werden bei Raumtemperatur gelagert.
Humanalbuminlösungen mit Humanalbuminkonzentrationen von 0, 5, 10, 20, 30, 50, 70, 100, 200, 300 und 500 mg/dl wurden unter Verwendung von Humanalbumin (von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als Antigen und eine Pufferlösung mit einer Zusammensetzung von 0,05 M MOPS und 0,4 Gew.-% NaN₃, pH 7,4, hergestellt. Diese Humanalbuminlösungen wurden bei 4°C gelagert, bis sie verwendet werden.
Für die Messung wurde ein Spektrofluorometer (von Shimadzu Corporation, Modell RF-5300PC) verwendet. Ein Zellenhalter mit konstanter Temperatur (von Shimadzu Corporation, Modell 206-15440), der mit einem Wasserbad mit konstanter Temperatur (von TAITEC, Produktbezeichnung: COOLNIT BATH EL-15) verbunden war, wurde in eine Probekammer des Spektrofluorometers verbracht. Auf 25°C gehaltenes Wasser wurde in dem Wasserbad zirkulieren gelassen, so dass die Temperatur in der Quarzzelle während der Messung konstant gehalten werden konnte. Die Messbedingungen des Spektrofluorometers waren wie folgt: sowohl die Anregungs- als auch die Emissionswellenlängen wurden auf 670 nm eingestellt, die Bandbreite wurde auf 3 nm sowohl auf der Emissions- als auch auf der Anregungsseite eingestellt, und die Empfindlichkeit wurde hoch eingestellt.
Die Messung wurde auf die folgende Weise durchgeführt. Die in Beispiel 1 hergestellte Antikörperlösung, 0,1 ml, wurde zu jeweils 2,87 ml der Pufferlösungen zugesetzt und gerührt. Zu den erhaltenen vermischten Lösungen wurden jeweils 0,03 ml der Humanalbuminlösungen mit den vorstehenden Konzentrationen zugesetzt und gerührt. Dadurch beträgt die Konzentration des antihumanen polyklonalen Kaninchenalbuminantikörpers in dem Reaktionssystem etwa 0,10 mg/ml, und die Konzentration des Humanalbumins ist ein Wert, erhalten durch Multiplizieren der Konzentration der Humanalbuminlösung, die für die Messung verwendet wird, mit 0,01. Jede der erhaltenen Mischungen wurde in die Quarzzelle für die Fluoreszenzanalyse eingebracht, die in das Spektrofluorometer verbracht wurde. Ein T-förmiges Thermoelement (von RS Components, Modell 219-4696) wurde in die Quarzzelle eingetaucht. Die Messung des zeitlichen Verlaufs wurde von dem Zeitpunkt 2 Minuten nach dem Vermischen des Humanalbumins in Intervallen von 0,04 Sekunden 300 Sekunden durchgeführt. Die Temperatur in der Quarzzelle während der Messung wurde durch Verbinden des T-förmigen Thermoelements mit einem digitalen Multithermometer (von Advantest, Modell TR2114) überwacht. Um den Einfluss der Kontamination der Quarzzelle auf die Messung zu verhindern, wurde eine Korrektur mit einem Wert durchgeführt, der durch Einbringen von reinem Wasser in die Zelle vor der Messung jeder Reaktion gemessen wurde. Ein Mittelwert von gemessenen Werten, die während 200 bis 300 Sekunden erhalten wurden, wurde berechnet, und der erhaltene Mittelwert wurde als der gemessene Wert für die Humanalbuminlösung mit jeder Konzentration bestimmt. Nach der Messung wurde der pH jeder gemischten Lösung des Reaktionssystems mit einem pH-Meter gemessen, um den Einfluss des Vermischens jeder Pufferlösung, der Antikörperlösung und der Humanalbuminlösung mit jeder Konzentration auf den pH des Reaktionssystems zu untersuchen.
Die Ergebnisse der Messung sind wie folgt. Der pH der gemischten Lösung des Reaktionssystems, zusammengesetzt aus jeder Pufferlösung, der Antikörperlösung und der Humanalbuminlösung mit jeder Konzentration, war etwa der gleiche wie der pH der Pufferlösung. Die Temperatur in der Zelle während der Messung, gemessen mit dem Thermoelement, blieb bei 25,5 ± 1°C.
4 ist eine Ansicht, erhalten durch Auftragen der Ergebnisse der Messung, durchgeführt nach der Zugabe der Humanalbuminlösungen mit den Konzentrationen bis zu 500 mg/dl zu dem Reaktionssystem, das die 0,05 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung enthält, und dem Reaktionssystem, das die 0,05 M MOPS-Pufferlösung enthält. Die Y-Achse gibt die gestreute Lichtintensität wieder, und die X-Achse gibt die Konzentration der für die Messung verwendeten Humanalbuminlösung wieder. Eine höhere gestreute Lichtintensität zeigt einen höheren Trübungsgrad des Reaktionssystems und die Bildung einer großen Menge von Agglutinatkomplexen an. Jeder der aufgetragenen Werte ist ein Wert, erhalten durch Subtrahieren des Werts, gemessen wenn die Humanalbuminkonzentration 0 mg/dl beträgt, von dem gemessenen Wert für die Humanalbuminlösung mit jeder Konzentration.
Wie in 4 gezeigt, wurden ersichtlich höhere gemessenen Werte erhalten, wenn die 0,05 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung für die Messung verwendet wurde als wenn die 0,05 M MOPS-Pufferlösung verwendet wurde. Wenn die 0,05 M MOPS-Pufferlösung verwendet wurde, hatte auch der gemessene Wert eine Spitze nahe 50 mg/dl und nahm mit dem Anstieg der Konzentration des Humanalbumins aufgrund des Zonenphänomens stark ab. Wenn jedoch die 0,05 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung verwendet wurde, hatte der gemessene Wert eine Spitze nahe 70 bis 100 mg/dl und nahm mit dem Anstieg der Konzentration des Humanalbumins aufgrund des Zonenphänomens nicht so stark ab.
5 ist eine Ansicht, erhalten durch Auftragen der Ergebnisse der Messung, die nach der Zugabe der Humanalbuminlösungen mit Konzentrationen bis zu 500 mg/dl zu dem Reaktionssytem, das die 0,03 M Phthalsäure-Pufferlösung enthält, und dem Reaktionssystem, das die 0,03 M MOPS-Pufferlösung enthält, durchgeführt wurde. Die Y-Achse gibt die gestreute Lichtintensität wieder, und die X-Achse gibt die Konzentration der für die Messung verwendeten Humanalbuminlösung wieder. Jeder der aufgetragenen Werte ist ein Wert, erhalten durch Subtrahieren des gemessenen Wertes, wenn die Humanalbuminkonzentration 0 mg/dl beträgt, von dem gemessenen Wert für die Humanalbuminlösung mit jeder Konzentration.
Wie in 5 gezeigt, wurden ersichtlich höhere gemessene Wert erhalten, wenn die 0,03 M Phthalsäure-Pufferlösung zur Messung der Antigen-Antikörper-Reaktion verwendet wurde, als wenn die 0,03 M MOPS-Pufferlösung verwendet wurde. Wenn die 0,03 M MOPS-Puffer-lösung verwendet wurde, hatte auch der gemessene Wert eine Spitze nahe 50 mg/dl und nahm mit der Konzentration des Humanalbumins aufgrund des Zonenphänomens stark ab. Wenn jedoch die 0,03 M Phthalsäure-Pufferlösung verwendet wurde, hatte der gemessene Wert eine Spitze nahe 70 bis 100 mg/dl und nahm mit dem Anstieg der Konzentration des Humanalbumins aufgrund des Zonenphänomens nicht so stark ab.
Wie aus den vorstehend beschriebenen Ergebnissen festgestellt wurde, wurde bestätigt, dass das Immunreaktionsmessverfahren der vorliegenden Erfindung einen höheren gemessenen Wert ergeben konnte als das herkömmliche Immunreaktionsmessverfahren und der Reagenskit für die Immunreaktionsmessung. Es wurde auch bestätigt, dass das Zonenphänomen im Vergleich mit dem Fall des herkömmlichen Immunreaktionsmessverfahrens und des Reagenskits für die Immunreaktionsmessung verringert werden konnte.
In klinischen Prüfungen ist eine Spurenmenge von in Urin ausgeschiedenem Humanalbumin eine zu messende Substanz als früher Diagnosemarker von diabetischer Nephropathie. In zahlreichen Immunreaktionsmessverfahren und Reagenskits für die Immunreaktionsmessung wird der Bereich von 0,1 bis 20 mg/dl als der quantitative Bereich eingestellt (vgl. New Diabetic Nephropathy – For Protection of Crisis and Prevention of Progress, hrsg. von Yukio Shigeta und Kazo Kaizu, Seite 131 (1992)). Bei dem herkömmlichen Messverfahren durch Immunnephelometrie und dem für das Verfahren verwendeten Reaktionskit ist es zum Verringern des Zonenphänomens notwendig, die Antikörperkonzentration in der neutralen Pufferlösung, die als Reaktionssystem hergestellt ist, zu erhöhen oder die Antigenkonzentration durch Verdünnung der neutralen Pufferlösung oder andere Maßnahmen zu erniedrigen, wobei von der Tatsache Gebrauch gemacht wird, dass die homogene Immunreaktion eine Gleichgewichtsreaktion ist.
Durch Übernehmen des Immunreaktionsmessverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung kann jedoch das Zonenphänomen verringert werden, selbst wenn die Antikörperkonzentration niedrig ist und die Antigenkonzentration hoch ist. Daher ist, um auf der Grundlage der Messergebnisse in diesem Beispiel zu diskutieren, es z. B. möglich, einen weiten Messbereich bis zu 500 mg/dl für das aus 0,05 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung hergestellte Reaktionssystem oder das aus der 0,03 M Phthalsäure-Pufferlösung hergestellte Reaktions system zu haben, indem ein Bewertungsbereich betreffend gemessene Werte gleich oder größer als derjenige für 20 mg/dl als positive Werte genommen wird. In dem neutralen Pufferlösungssystem in dem Vergleichsbeispiel ist jedoch der Messbereich auf bis zu etwa 120 bis 130 mg/dl beschränkt.
Wie vorstehend beschrieben, kann in dem Immunreaktionsmessverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung Humanalbumin in einem breiteren Konzentrationsbereich im Vergleich mit dem Fall der Messung in dem herkömmlichen neutralen Pufferlösungssystem gemessen werden, ohne die Notwendigkeit, den Einfluss des Zonenphänomens zu berücksichtigen.
(Beispiel 4)
Die pH-Abhängigkeit des durch das Immunreaktionsmessverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen gemessenen Wertes unter Verwendung von Kaliumhydrogenphthalat als Phthalsäure oder Phthalatsalz wurde durch Immunnephelometrie untersucht. Einzelheiten dieser Untersuchung sind wie folgt. Humanalbumin wurde als zu bestimmende Substanz verwendet. Humanalbuminlösungen wurden in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise mit Konzentrationen von 0, 5, 10, 20, 30, 50, 70, 100, 200, 300 und 500 mg/dl hergestellt. Die in Beispiel 1 verwendete Antikörperlösung wurde ebenfalls in diesem Beispiel verwendet.
Als Pufferlösung, die das Reaktionssystem zum Untersuchen der pH-Abhängigkeit des gemessenen Wertes bildet, wurden 0,05 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösungen hergestellt, die 0,05 M Kaliumhydrogenphthalat und 4 Gew.-% Polyethylenglycol 6000 enthielten, wobei die pH-Werte auf 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 und 6,0 eingestellt wurden.
Als Vergleichsbeispiel wurde eine 0,05 M MOPS-Pufferlösung verwendet, die 0,05 M MOPS und 4 Gew.-% Polyethylen 6000 enthielt, wobei der pH auf 7,4 eingestellt war. Die in Beispiel 3 verwendete Vorrichtung und das Messverfahren wurden ebenfalls in diesem Beispiel verwendet.
Die Ergebnisse sind wie folgt. Der pH der gemischten Lösung des Reaktionssystems, die für jede Messung verwendet wurde, bestehend aus jeder Pufferlösung, der Antikörperlösung und der Humanalbuminlösung mit jeder Konzentration, war der gleiche wie der pH der Pufferlösung. Die Temperatur in der Quarzzelle während der Messung blieb auf 25,5 ± 1°C.
Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. 6 ist eine Ansicht, erhalten durch Auftragen der Ergebnisse der Messung, die nach der Zugabe der Humanalbuminlösungen mit den Konzentrationen bis zu 500 mg/dl zu den Reaktionssystemen durchgeführt wurden, die aus den 0,05 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösungen mit den jeweiligen pH-Werten hergestellt waren. Die Y-Achse gibt die gestreute Lichtintensität wieder, und die X-Achse gibt die Konzentration der für die Messung verwendeten Humanalbuminlösung wieder. Jeder der aufgetragenen Werte ist ein Wert, erhalten durch Subtrahieren des Wertes, der gemessen wurde, wenn die Humanalbuminlösung 0 mg/dl betrug, von dem gemessenen Wert für die Humanalbuminlösung mit jeder Konzentration. Das Ablesen der grafischen Darstellung ist gleich wie in 4.
Wenn die Messung unter Verwendung der Reaktionssysteme durchgeführt wurde, die mit den 0,05 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösungen mit pH-Werten in dem Bereich von 4,5 bis 5,5 hergestellt wurden, waren die gemessenen Werte höher als diejenigen, die durch die Messung unter Verwendung des Reaktionssystems hergestellt wurde, das aus der 0,05 M MOPS-Pufferlösung als Vergleichsbeispiel hergestellt wurde. Darüber hinaus zeigte sich die Wirkung der Verringerung des Zonenphänomens, das mit einem Anstieg der Antigenkonzentration auftritt. Diese Wirkung war am größten für das Reaktionssystem, das aus der 0,05 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung mit einem pH von 4,5 hergestellt wurde. Aus den Ergebnissen in 6 wurde entnommen, dass die Wirkungen der Verbesserung des gemessenen Wertes und die Verringerung des Zonenphänomens in signifikant stabiler Weise durch Verwenden des Reaktionssystems, hergestellt aus der 0,05 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung mit einem pH von 4,5 bis 5,3, bevorzugt einem pH von 4,5 bis 5,0, erhalten werden konnte.
Wenn das Reaktionssystem aus der 0,05 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung mit einem pH von 6,0 hergestellt war, waren die gemessenen Werte niedriger als diejenigen, die durch die Messung unter Verwendung des Reaktionssystems, hergestellt aus der 0,05 M MOPS-Pufferlösung, erhalten wurden. In diesem Fall war die Kurve des gemessenen Wertes in der Form ähnlich zu derjenigen, die erhalten wurde, wenn das Reaktionssystem aus der 0,05 M MOPS-Pufferlösung hergestellt war, wobei die Wirkung der Verringerung des Zonenphänomens, das mit dem Anstieg der Antigenkonzentration auftritt, nicht erhalten wurde.
Wenn das Reaktionssystem aus der 0,05 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung mit einem pH von 4,0 hergestellt war, waren die gemessenen Werte niedriger als diejenigen, die durch die Messung unter Verwendung des aus der 0,05 M MOPS-Pufferlösung hergestellten Reaktionssystems in dem Fall der Zugabe von bis zu 100 mg/dl Humanalbumin zu dem Reaktionssystem erhalten wurden. In dem Fall der Zugabe von 200 mg/dl oder mehr Humanalbumin zu dem Reaktionssystem waren jedoch die gemessenen Werte höher als diejenigen, die durch die Messung unter Verwendung des Reaktionssystems, hergestellt aus der 0,05 M MOPS-Pufferlösung, erhalten wurden, was die Wirkung der Verringerung des Zonenphänomens zeigt, das mit dem Anstieg der Antigenkonzentration auftritt.
Aus den vorstehend beschriebenen Ergebnissen wurde festgestellt, dass in dem Immunreaktionsmessverfahren unter Verwendung von Phthalsäure oder Phthalatsalz der pH des Reaktionssystems bevorzugt auf 4,5 bis 5,5, bevorzugter auf 4,5 bis 5,3, weiter bevorzugter auf 4,5 bis 5,0, eingestellt werden sollte. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass die größte Wirkung durch Einstellen des pH des Reaktionssystems auf 4,5 erhalten wurde.
In ähnlicher Weise wurde festgestellt, dass der Reagenskit für die Immunreaktionsmessung unter Verwendung von Phthalsäure oder Phthalatsalz bevorzugt so hergestellt werden sollte, dass der pH des Reaktionssystems auf 4,5 bis 5,5, bevorzugter auf 4,5 bis 5,3, weiter bevorzugter auf 4,5 bis 5,0, eingestellt wird. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass die größte Wirkung durch Herstellen des Reagenskits derart erhalten wurde, dass der pH des Reaktionssystems auf 4,5 eingestellt wurde.
(Beispiel 5)
Die Abhängigkeit des durch das Immunreaktionsmessverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen gemessenen Wertes unter Verwendung von Kaliumhydrogenphthalat als Phthalsäure oder Phthalatsalz von der Konzentration der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes wurde durch Immunnephelometrie untersucht. Einzelheiten dieser Untersuchung sind wie folgt. Humanalbumin wurde als zu bestimmende Substanz verwendet. Humanalbuminlösungen wurden auf die in Beispiel 3 beschriebene Weise mit Konzentrationen von 0, 5, 10, 20, 30, 50, 70, 100, 200, 300 und 500 mg/dl hergestellt. Die in Beispiel 1 verwendete Antikörperlösung wurde auch in diesem Beispiel verwendet.
Als die Pufferlösung, welche das Reaktionssystem zum Untersuchen der Abhängigkeit des gemessenen Wertes auf die Konzentration der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes bildet, wurden Kaliumhydrogenphosphat-Pufferlösungen mit Konzentrationen von Kaliumhydrogenphthalat von 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2 und 0,3 M, die 4 Gew.-% Polyethylenglycol 6000 enthielten und einen pH von 4,5 hatten, hergestellt.
Als Vergleichsbeispiel wurde eine 0,05 M MOPS-Pufferlösung verwendet, die 0,05 M MOPS und 4 Gew.-% Polyethylenglycol 6000 enthielt und einen auf 7,4 eingestellten pH hatte. Die in Beispiel 3 verwendete Vorrichtung und das Messverfahren wurden ebenfalls in diesem Beispiel verwendet.
Die Ergebnisse sind wie folgt. Der pH der für jede Messung verwendeten gemischten Lösung, zusammengesetzt aus jeder Pufferlösung, der Antikörperlösung und der Humanalbuminlösung mit jeder Konzentration, betrug 4,7, wenn die 0,01 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung verwendet wurde, 4,6, wenn die 0,025 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung verwendet wurde, und 4,5, wenn die anderen Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösungen verwendet wurden. Die Temperatur in der Quarzzelle während der Messung blieb bei 25,5 ± 1°C.
Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. 7 ist eine Ansicht, erhalten durch Auftragen der Ergebnisse der Messung, die nach der Zugabe der Humanalbuminlösungen mit den Konzentrationen bis zu 500 mg/dl zu den Reaktionssystemen, hergestellt aus den Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösungen mit den jeweiligen Konzentrationen und einem pH von etwa 4,5, durchgeführt wurde. Die Y-Achse gibt die gestreute Lichtintensität wieder, und die X-Achse gibt die Konzentration der für die Messung verwendeten Humanalbuminlösung wieder. Jeder der aufgetragenen Werte ist ein Wert, erhalten durch Subtrahieren des Wertes, gemessen wenn die Humanalbuminkonzentration 0 mg/dl beträgt, von dem gemessenen Wert für die Humanalbuminlösung mit jeder Konzentration. Die Ablesung der grafischen Darstellung ist gleich wie in 4.
In dem Fall der Reaktionssysteme, hergestellt aus den Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösungen mit Konzentrationen von Kaliumhydrogenphthalat von 0,2 M oder weniger, waren die gemessenen Werte höher als diejenigen, die aus dem Reaktionssystem erhalten wurden, hergestellt aus der 0,05 M MOPS-Pufferlösung als Vergleichsbeispiel, was die Wirkung der Verbesserung des gemessenen Wertes bestätigt. Darüber hinaus wurde die Wirkung der Verringerung des Zonenphänomens erhalten, das mit dem Anstieg der Antigenkonzentration auftritt. Die Wirkung der Verringerung des Zonenphänomens war insbesondere hoch, wenn das Reaktionssystem mit einer der Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösungen mit Konzentrationen von 0,1 M oder weniger hergestellt war. Obwohl kein so großer Unterschied in der Wirkung der Verbesserung des gemessenen Wertes unter den Reaktionssystemen, hergestellt aus den Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösungen mit Konzentrationen von 0,1 M oder weniger, festgestellt wurde, war die Wirkung der Verringerung des Zonenphänomens am höchsten, wenn das Reaktionssystem mit der Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung hergestellt war.
Wenn das Reaktionssystem mit der 0,3 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung hergestellt war, waren die gemessenen Werte niedriger als diejenigen, die erhalten wurden, wenn das Reaktionssystem mit der 0,05 M MOPS-Pufferlösung als Vergleichsbeispiel hergestellt war, in dem Fall der Humanalbuminkonzentrationen bis zu 100 mg/dl. In dem Fall der Humanalbuminkonzentrationen von 200 mg/dl oder mehr waren jedoch die gemessenen Werte höher als diejenigen in dem Vergleichsbeispiel, wobei die Wirkung der Verringerung des Zonenphänomens erhalten wird, das mit dem Anstieg der Antigenkonzentration auftritt.
Aus den vorstehend beschriebenen Ergebnissen wurde festgestellt, dass in dem Immunreaktionsmessverfahren unter Verwendung von Phthalsäure oder Phthalatsalz gemäß der vorliegenden Erfindung die Konzentration von Kaliumhydrogenphthalat in geeigneter Weise auf 0,2 M oder weniger eingestellt werden sollte, um eine Wirkung zu erhalten, die höher ist als diejenige, die mit der gewöhnlichen neutralen Pufferlösung erhalten wird. Insbesondere wurde festgestellt, dass die Konzentration von Kaliumhydrogenphthalat bevorzugter auf 0,1 M oder weniger, am bevorzugtesten auf 0,1 M, eingestellt werden sollte.
In ähnlicher Weise wurde festgestellt, dass der Reagenskit für die Immunreaktionsmessung unter Verwendung von Phthalsäure oder Phthalatsalz gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt so hergestellt werden sollte, dass die Konzentration von Kaliumhydrogenphthalat auf 0,2 M oder weniger eingestellt wird. Es wurde insbesondere festgestellt, dass der Reagenskit bevorzugter so hergestellt werden sollte, dass die Konzentration von Kaliumhydrogenphthalat auf 0,1 M oder weniger eingestellt wird, am bevorzugtesten so hergestellt werden sollte, dass die Konzentration von Kaliumhydrogenphthalat auf 0,1 M eingestellt wird.
(Beispiel 6)
Der durch das Immunreaktionsmessverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltene gemessene Wert unter Verwendung der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes zusammen mit einem anderen Puffer wurde durch Immunnephelometrie untersucht. Einzelheiten dieser Untersuchung sind wie folgt.
Humanalbumin wurde als zu bestimmende Substanz verwendet. Humanalbuminlösungen wurden in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise mit Konzentrationen von 0, 5, 10, 20, 30, 50, 70, 100, 200, 300 und 500 mg/dl hergestellt. Die in Beispiel 1 verwendete Antikörperlösung wurde auch in diesem Beispiel verwendet.
Phthalsäure wurde als die Phthalsäure oder das Phthalatsalz verwendet, und Bernsteinsäure wurde als der mit der Phthalsäure koexistierende Puffer verwendet, um eine gemischte Bernsteinsäure/Phthalsäure-Pufferlösung herzustellen, die 0,1 M Bernsteinsäure und 0,02 M Phthalsäure und 4 Gew.-% Polyethylenglycol 6000, pH 4,5, enthielt. Als Vergleichsbeispiel ohne Phthalsäure oder Phthalatsalz wurde eine Bernsteinsäure-Pufferlösung hergestellt, die 0,12 M Bernsteinsäure und 4 Gew.-% Polyethylenglycol 6000, pH 4,5, enthielt.
Die Ergebnisse sind wie folgt. Der pH der für jede Messung verwendeten gemischten Lösung, zusammengesetzt aus jeder Pufferlösung, der Antikörperlösung und der Humanalbuminlösung mit jeder Konzentration, war etwa der gleiche wie der pH der Pufferlösung. Die Temperatur in der Quarzzelle während der Messung blieb bei 25,5 ± 1°C Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. 8 ist eine Ansicht, erhalten durch Auftragen der Ergebnisse der Messung, die nach der Zugabe der Humanalbuminlösungen mit den Konzentrationen bis zu 500 mg/dl zu den jeweiligen Reaktionssystemen, hergestellt aus der gemischten Bernsteinsäure/Phthalsäure-Pufferlösung und der Bernsteinsäure-Pufferlösung, durchgeführt wurde. Die Y-Achse gibt die gestreute Lichtintensität wieder, und die X-Achse gibt die Konzentration der für die Messung verwendeten Humanalbuminlösung wieder. Jeder der aufgetragenen Werte ist ein Wert, erhalten durch Subtrahieren des gemessenen Wertes, wenn die Humanalbuminkonzentration 0 mg/dl beträgt, von dem gemessenen Wert für die Humanalbuminlösung mit jeder Konzentration. Die Ablesung der grafischen Darstellung ist gleich wie in 4.
Als Ergebnis verbesserten sich die gemessenen Werte, wenn die gemischte Bernsteinsäure/Phthalsäure-Pufferlösung verwendet wurde, im Vergleich mit dem Vergleichsbeispiel unter Verwendung der Bernsteinsäure-Pufferlösung. Die Wirkung wurde daher bestätigt. Darüber hinaus wurde die Wirkung der Verringerung des Zonenphänomens erhalten, das mit dem Anstieg der Antigenkonzentration auftritt.
Aus den vorstehend beschriebenen Ergebnissen wurde bestätigt, dass in dem Immunreaktionsmessverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die Wirkung der Verbesserung des gemessenen Wertes und die Wirkung der Verringerung des Zonenphänomens erhalten werden konnte, wenn die Phthalsäure oder das Phthalatsalz zusammen mit anderem Puffer verwendet wurde.
(Beispiel 7)
Unter Verwendung der in Beispiel 2 hergestellten antihumanen polyklonalen CRP-Ziege-Antikörperlösung wurde die Wirkung der humanen CRP-Messung gemäß der vorliegenden Erfindung untersucht durch Vergleichen mit der humanen CRP-Messung unter Verwendung eines gewöhnlich bei dem herkömmlichen Immunreaktionsmessverfahren verwendeten neutralen Reaktionssystems. Die Ergebnisse werden wie folgt beschrieben.
Humane CRP-Lösungen mit jeweiligen Konzentrationen, die für die Messung verwendet wurden, wurden durch Verdünnen von gereinigtem humanem CRP (von Chemicon International, Lot Nr. 21042246) mit einer aus 0,05 M MOPS und 0,04 Gew.-% NaN₃, pH 7,4, bestehenden Pufferlösung hergestellt. Die Konzentrationen der humanen CRP-Lösungen betrugen 0, 10, 20, 30, 50, 70, 100 und 200 mg/dl.
Als Antikörperlösung wurde die in Beispiel 2 hergestellte antihumane polyklonale CRP-Ziege-Antikörperlösung verwendet.
Als Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltende Pufferlösung wurde die in Beispiel 2 hergestellte Pufferlösung (0,02 M Phthalsäure, 0,02 M CaCl₂ und 4 Gew.-% Polyethylenglycol 6000, pH 4,5) verwendet.
Als Vergleichsbeispiel ohne Phthalsäure oder Phthalatsalz wurde eine 0,05 M MOPS-Pufferlösung verwendet, die 0,05 M MOPS und 4 Gew.-% Polyethylenglycol 6000 enthielt und deren pH auf 7,4 eingestellt war.
Es wurde eine selbst hergestellte Messapparatur, wie folgt, verwendet. Ein Halbleiter-Laserpointer, moduliert auf 270 Hz, Wellenlänge: 680 nm, Ausgangsleistung: 15 mW (von Kikoh Giken, Modell MLXS-D-12-680-35) wurde als Lichtquelle verwendet. Eine Siliciumfotodiode für sichtbare bis infrarote Präzisionsfotometrie (von Hamamatsu Photonics, Modell S2387-66R) wurde als Detektor verwendet. Als Zelle wurden 0,1 cm dicke optische Glasplatten zusammengefügt, so dass sie einen Quadratpol mit einer Kapazität von etwa 200 μl ergaben. Die Zelle wurde in eine Position 0,5 cm von der Lichtquelle entfernt verbracht, so dass eine Seite der Zelle vertikal zu der Lichtquelle ist. Der Detektor wurde in eine Position verbracht, die einen Winkel von 90° mit der Lichtquelle bildet und sich 5,5 cm von der Zelle entfernt befindet. Ein Schattierungszylinder wurde zwischen dem Detektor und der Zelle angeordnet, um zu vermeiden, dass Streulicht auf den Detektor einfällt. Die Anordnung wurde so hergestellt, dass ein Stromsignal entsprechend der von dem Detektor nachgewiesenen Lichtmenge auf ein 100-faches Spannungssignal über eine Verstärkungsschaltung, die einen Strom-Spannungs-Umwandler (10⁶ V/A) und einen Verstärker enthielt, verstärkt und dann einem phasenempfindlichen Nachweis über einen Lock-in-Verstärker (von NF Corporation, Modell 5610B) unterworfen wurde, um eine Datenerfassung in einem Computer unter GPIB-Kontrolle zu ermöglichen.
Die Messung des humanen CRP mit den jeweiligen Konzentrationen wurde in der folgenden Weise für jede Pufferlösung durchgeführt. Jedes Reaktionssystem wurde mit einem Mischungsverhältnis von 178 μl der Pufferlösung, 9 μl der humanen CRP-Lösung und 7 μl der Antikörperlösung hergestellt. Daher beträgt die Endkonzentration des antihumanen polyklonalen CRP-Ziege-Antikörpers in dem Reaktionssystem etwa 0,036 mg/ml, und die Endkonzentration des humanen CRP hat einen Wert, der durch Multiplizieren der Konzentration der für die Messung verwendeten humanen CRP-Lösung mit 0,046 erhalten wird.
Zuerst wurden die Pufferlösung und die humane CRP-Lösung durch Rühren in der Zelle vermischt. Anschließend wurde die Antikörperlösung mit dem vorstehenden Volumen zu der gemischten Lösung zugesetzt und gerührt, wodurch eine Antigen-Antikörper-Reaktion hervorgerufen wurde. Die Messung des gestreuten Lichts wurde 10 Sekunden vor der Zugabe der Antikörperlösung begonnen und 300 Sekunden in Intervallen von 0,5 Sekunden durchgeführt. Die gemessenen Werte wurden als Spannungswerte erhalten. Um den Einfluss einer Kontamination der Zelle auf die Messung zu verhindern, wurde eine Korrektur mit einem Wert durchgeführt, der gemessen wurde, indem reines Wasser in die Zelle vor der Messung jeder Reaktion eingebracht wurde. Ein Mittelwert von gemessenen Werten, die während 200 bis 300 Sekunden erhalten wurden, wurde berechnet, und der erhaltene Mittelwert wurde als der gemessene Wert für die humane CRP-Lösung mit jeder Konzentration bestimmt. Wenn das Auftreten von Selbstagglutination des Antigens von den gemessenen Werten, erhalten für 10 Sekunden vor der Zugabe der Antikörperlösung, beobachtet wurde, wurde der Mittelwert dieser gemessenen Werte von dem vorstehend gemessenen Wert für die humane CRP-Lösung mit jeder Konzentration subtrahiert. Die Messung wurde bei Raumtemperatur (etwa 20°C) durchgeführt.
Die Ergebnisse sind wie folgt. 9 ist eine Ansicht, die durch Auftragen der Ergebnisse der Messung erhalten wurde, die nach der Zugabe der humanen CRP-Lösungen mit Konzentrationen bis zu 100 mg/dl zu den jeweiligen Pufferlösungen durchgeführt wurde. Die Y-Achse gibt den gemessenen Spannungswert wieder, und die X-Achse gibt die Konzentration der für die Messung verwendeten humanen CRP-Lösung wieder. Ein höherer gemessener Spannungswert zeigt eine größere Menge von auf den Detektor eingefallenen gestreuten Licht an, und dies zeigt an, dass die Trübung des Reaktionssystems höher ist, d. h. dass eine größere Anzahl von Agglutinatkomplexen durch die Antigen-Antikörper-Reaktion gebildet wurde. Jeder der aufgetragenen Werte ist ein Wert, der durch Subtrahieren des gemessenen Wertes, wenn die humane CRP-Konzentration 0 mg/dl ist, von dem gemessenen Wert für die humane CRP-Lösung mit jeder Konzentration erhalten wurde.
Wie aus 9 festgestellt wird, wurde bestätigt, dass höhere gemessene Werte auftraten in der Messung der humanen CRP-Lösungen mit den jeweiligen Konzentrationen in dem Fall der Verwendung des Reagenskits, der die antihumane polyklonale CRP-Ziege-Antikörperlösung und die 0,02 M CaCl₂ und Phthalsäure enthaltende Pufferlösung, beide hergestellt in Beispiel 2, enthält im Vergleich mit dem Fall der Verwendung der MOPS-Pufferlösung als Vergleichsbeispiel.
(Beispiel 8)
Unter Verwendung der in Beispiel 2 hergestellten antihumanen monoklonalen CRP-Maus-Antikörperlösung wurde die Wirkung der humanen CRP-Messung gemäß der vorliegenden Erfindung untersucht im Vergleich mit einer humanen CRP-Messung unter Verwendung eines gewöhnlich in dem herkömmlichen Immunreaktionsmessverfahren verwendeten neutralen Reaktionssystems. Die Ergebnisse werden wie folgt beschrieben.
Für die Messung verwendete humane CRP-Lösungen wurden in der in Beispiel 7 beschriebenen Weise mit Konzentrationen von 0, 10, 20, 30, 50, 70 und 100 mg/dl hergestellt.
Als Antikörperlösung wurde die in Beispiel 2 hergestellte antihumane monoklonale CRP-Maus-Antikörperlösung verwendet.
Als Phthalsäure oder Phthalatsalz enthaltende Pufferlösung wurde die in Beispiel 2 hergestellte Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung (0,05 M Kaliumhydrogenphthalat und 4 Gew.-% Polyethylenglycol 6000, pH 4,5) verwendet.
Als Vergleichsbeispiel ohne Phthalsäure oder Phthalatsalz wurde eine 0,05 M MOPS-Pufferlösung verwendet, die 0,05 M MOPS und 4 Gew.-% Polyethylenglycol 6000 enthielt und deren pH auf 7,4 eingestellt war.
Für die Messung wurden die Apparatur mit der gleichen Konstruktion und die gleichen Messbedingungen verwendet wie diejenigen, die in Beispiel 7 beschrieben sind. Das Messverfahren, das Verfahren zum Verarbeiten gemessener Daten und Ähnliches, beschrieben in Beispiel 7, wurden ebenfalls in diesem Beispiel verwendet. Daher betrug die Endkonzentration des antihumanen monoklonalen CRP-Maus-Antikörpers in dem Reaktionssystem etwa 0,036 mg/ml, und die Endkonzentration des humanen CRP ist ein Wert, erhalten durch Multiplizieren der für die Messung verwendeten Konzentration der humanen CRP-Lösung mit 0,046.
Die Ergebnisse sind wie folgt. 10 ist eine Ansicht, erhalten durch Auftragen der Ergebnisse der Messung, die nach der Zugabe der humanen CRP-Lösungen mit Konzentrationen bis zu 100 mg/dl zu der 0,05 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung, hergestellt in Beispiel 2, unter Verwendung von Kaliumhydrogenphthalat als Phthalsäure oder Phthalatsalz und der 0,05 M MOPS-Pufferlösung als Vergleichsbeispiel durchgeführt wurde. Die Y-Achse gibt den gemessenen Spannungswert wieder, und die X-Achse gibt die Konzentration der für die Messung verwendeten humanen CRP-Lösung wieder. Jeder der aufgetragenen Werte ist ein Wert, erhalten durch Subtrahieren des gemessenen Wertes, wenn die humane CRP-Konzentration 0 mg/dl beträgt, von dem gemessenen Wert für die humane CRP-Lösung mit jeder Konzentration. Die Ablesung der grafischen Darstellung ist gleich wie in 9.
Aus 10 wurde festgestellt, dass bei der humanen CRP-Messung unter Verwendung der 0,05 M MOPS-Pufferlösung als Vergleichsbeispiel kein ausreichender Unterschied zwischen dem gemessenen Wert für die humane CRP-Lösung mit 10 mg/dl und demjenigen für die humane CRP-Lösung mit 0 mg/dl erhältlich war, und daher die Messung eines Unterschieds in der humanen CRP-Konzentration im Wesentlichen versagte. Im Gegensatz dazu wurden bei der Messung unter Verwendung der 0,05 M Kaliumhydrogenphthalat-Pufferlösung ersichtlich höhere gemessene Werte für die humanen CRP-Lösungen mit den jeweiligen Konzentrationen erhalten, und ein ausreichender Unterschied war zwischen dem gemessenen Wert für die humane CRP-Lösung mit 10 mg/dl und demjenigen für die humane CRP-Lösung mit 0 mg/dl erhältlich. Das heißt, die Messung eines Unterschieds in der humanen CRP-Konzentration war möglich.
Wie in den Beispielen 7 und 8 beschrieben, wurde bestätigt, dass das Immunreaktionsmessverfahren und der für dieses Verfahren verwendete Reagenskit für die Immunreaktionsmessung gemäß der vorliegenden Erfindung auch die Wirkung hatten, den gemessenen Wert für die humane CRP-Messung zu verbessern.
Wie vorstehend beschrieben, liegt in dem Immunreaktionsmessverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung Phthalsäure oder Phthalatsalz in einem Reaktionssystem für die Immunreaktion vor, und das Reaktionssystem hat einen sauren pH. Daher kann der gemessene Wert der Immunreaktion aufgrund einer Antigen-Antikörper-Bindung verbessert werden, und auch das in einem Bereich des Antigenüberschusses auftretende Zonenphänomen kann verringert werden.
In dem herkömmlichen Verfahren, in welchem ein wasserlösliches Polymer zugesetzt wird, ist es notwendig, ein wasserlösliches Polymer in einer hohen Konzentration oder ein wasserlösliches Polymer mit einem hohen Molekulargewicht zuzusetzen, um den gemessenen Wert zu verbessern, ein gutes S/N-Verhältnis aufrechtzuerhalten und um eine stabile Messung sicherzustellen. Dies verursacht ein Ansteigen der Viskosität der Lösung und macht somit die Handhabung der Lösung während des Analysevorgangs schwierig. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird jedoch die Viskosität der Lösung nicht erhöht, da Phthalsäure oder Phthalatsalz eine Substanz mit niedrigem Molekulargewicht ist, und somit ist die Handhabung der Lösung während des Messvorgangs einfach.
Darüber hinaus wird in dem Immunreaktionsmessverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ein Abfallen der gemessenen Werte für hohe Konzentrationen der zu bestimmenden Substanz verringert, da das Zonenphänomen verringert wird. Dies ermöglicht eine Verbreiterung des messbaren Konzentrationsbereichs, in welchem der Gehalt der zu bestimmenden Substanz genau gemessen werden kann.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Wie vorstehend beschrieben, kann gemäß der vorliegenden Erfindung ein Immunreaktionsmessverfahren, das zum einfachen Verbessern des gemessenen Wertes befähigt ist, und ein Reagenskit für die für dieses Verfahren verwendete Immunreaktionsmessung bereitgestellt werden. Darüber hinaus kann ein Immunreaktionsmessverfahren, das zur Verringerung des in einem Antigenüberschussbereich auftretenden Zonenphänomens befähigt ist, und ein für dieses Verfahren verwendeter Reagenskit für die Immunreaktionsmessung bereitgestellt werden.

Claims

Immunreaktionsmessverfahren zum Messen des Gehalts einer zu bestimmenden Substanz in einer Probe durch optische Messung, umfassend die Schritte: (A) Konstruieren eines Reaktionssystems, das die Probe, eine spezifisch bindende Substanz, die spezifisch an die zu bestimmende Substanz bindet, und Phthalsäure oder Phthalatsalz einschließt, und (B) Messen einer optischen Eigenschaft des Reaktionssystems, worin in dem Schritt (A) der pH des Reaktionssystems in einen Bereich von 4,5 bis 5,5 eingestellt wird, die Kombination der zu bestimmenden Substanz und der spezifisch bindenden Substanz eine Kombination eines Antigens und eines Antikörpers ist, und in dem Schritt (B) ein Trübungsgrad des Reaktionssystems gemessen wird.
Immunreaktionsmessverfahren nach Anspruch 1, worin die optische Eigenschaft eine gestreute Lichtintensität oder eine durchgelassene Lichtmenge ist.
Immunreaktionsmessverfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin in dem Schritt (A) das Reaktionssystem weiter einen Puffer enthält.
Immunreaktionsmessverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin in dem Schritt (A) die Konzentration der Phthalsäure oder des Phthalatsalzes in dem Reaktionssystem 0,2 M oder weniger beträgt.
Immunreaktionsmessverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Phthalatsalz Kaliumhydrogenphthalat ist.
Immunreaktionsmessverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Reaktionssystem 2 bis 6 Gew.-% Polyethylenglycol enthält.
Immunreaktionsmessverfahren nach Anspruch 1, worin die zu bestimmende Substanz ein Antigen mit einer Struktur ist, die im Inneren Metallionen hält, und die spezifisch bindende Substanz ein Antikörper ist, der spezifisch an das Antigen bindet, das die Metallionen nicht hält.
Immunreaktionsmessverfahren nach Anspruch 7, worin die zu bestimmende Substanz humanes C-reaktives Protein ist.
Immunreaktionsmessverfahren nach Anspruch 1, worin die zu bestimmende Substanz ein Antigen mit einer Struktur ist, die im Inneren Metallionen hält, die spezifisch bindende Substanz ein polyklonaler Antikörper ist, und in dem Schritt (A) das Reaktionssystem weiter die Metallionen enthält.
Immunreaktionsmessverfahren nach Anspruch 9, worin die zu bestimmende Substanz humanes C-reaktives Protein ist.
Immunreaktionsmessverfahren nach Anspruch 1, worin die zu bestimmende Substanz ein Antigen ist, und die spezifisch bindende Substanz ein monoklonaler Antikörper ist, der befähigt ist, an eine Mehrzahl von Bindungsstellen des Antigens zu binden.
Immunreaktionsmessverfahren nach Anspruch 11, worin die zu bestimmende Substanz humanes C-reaktives Protein ist.