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TECHNISCHES GEBIET
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Die
Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung einer
mit stabilen Bakositen angereicherten Fraktion in einer nicht-hygroskopischen Form
aus dem Kraut Bacopa monniera.
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DEN HINTERGRUND DARSTELLENDER
STAND DER TECHNIK
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Auf
Pflanzen basierende Arzneimittel und Formulierungen zeigen global
einen ansteigenden Trend für
die medizinische Versorgung aufgrund der biologischen Sicherheitsattribute,
die sie gegenüber modernen
synthetischen Arzneimitteln aufweisen. Unter den zahlreichen traditionellen
indischen Heilkräutern
findet ein standardisierter Extrakt von Bacopa monniera, in Hindi
bekannt als „Brahmi", zunehmende Verwendung
als ein Bestandteil von modernen auf Kräutern basierenden Nutrazeutika,
die darauf abzielen, Gehirn- und Nervenfunktion zu unterstützen und
Gedächtnis,
Aufmerksamkeit & mentale Konzentration
zu verbessern (Ray Sahelian, M.D. „Mind Boosters", 1999, Amazon Publishing
House, USA).
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Bacopa
monniera ist in Indien seit alter Zeit in ayurvedischen Zubereitungen
als ein Gehirn- und Nerventonikum verwendet worden (Chunekar, K.C., „Bhav Prakasha
Nighantu", Hindi-Übersetzung,
Varanasi, 1960:372). In einer klinische Studie, die an der Banaras
Hindu University ausgeführt
worden ist (Singh, R.H., und Singh, Lallan, „Studies on the Antianxiety
effect of the Medhya Rasayana Drug, Brahmi Bacopa monniera Wettst.
Part 1, Journal of Res. Ayurveda & Sidha,
Band 1: 133-148, 1980), wurde geschlossen, dass, wenn Bacopa monniera
in Form von Brahmi-Sirup
an 35 Patienten, die unter einer Angstneurose litten, verabreicht
wurde, eine vierwöchige Behandlung
mit Brahmi das Angstniveau unter den Patienten signifikant verringerte
mit einer Verbesserung der mentalen Leistung und des Gedächtnisses der
behandelten Patienten. Die vorteilhaften Wirkungen von Bacopa monniera
auf die Intelligenz und die mentale Leistung wurden an der Banaras
Hindu University weiter untersucht im Rahmen einer Studie, die an
20 Schulkindern über
einen Zeitraum von drei Monaten ausgeführt wurde (Sharma, R., Chaturvedi,
C., Tewari, P.V., „Efficacy
of Bacopa monniera in revitalizing intellectual functions in Children", Journal Res. Edu.
Ind. Med., Jan.-Juni: 1-12, 1987).
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Über die
systematische chemische Untersuchung von Bacopa monniera wurde erstmals
von N. Chatterjee, R.P. Rastogi & M.L.
Dhar (Indian Journal of Chemisfry, Band 1, Mai 1963) berichtet.
Sie berichteten über
das Vorkommen von zwei Saponinen, die als Bakosid A & B bezeichnet
wurden, die in einer Konzentration von über 2% in der trockenen Pflanze vorhanden
sind. Die molekulare Struktur der Bakoside A & B wurde nachfolgend aufgeklärt (Chatterjee, N.,
Rastogi, R.P., und Dhar, M.L., Indian J. Chem., Band 3:24, 1965
und Basu, N., Rastogi, P., und Dhar, M.L., Indian J Chem, Band 5:
84, 1967). Diese Untersuchungen berichteten auch über die
physikalischen Eigenschaften der Bakoside A & B: Bakosid A, Schmelzpunkt = 250,6°C (Zersetzung),
Optische Drehung αD =(-) 42° in
Ethanol Bakosid B, Schmelzpunkt = 203°C (Zersetzung), Optische Drehung αD = (+)
8° in Ethanol
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Über ein
auf Hochleistungsdünnschichtchromatographie
(HPTLC) basierendes Analysenverfahren zur Bestimmung des Bakosid
A-Gehalts in Bacopa monniera ist von Gupta et al. berichtet worden (A.P.
Gupta, S. Mathur, M.M. Gupta & Shushil
Kumar, „Effect
of the method of drying on the bacoside-A content of the harvested
Bacopa monraiera shoots revealed using a high performance thin layer
chromatography method",
Journal of Medicinal and Aromatic Plants, Band 20: 1052-1055, 1998).
Die biologische Aktivität
eines Bacopa monniera-Extrakts ist untersucht worden, indem die
Vermeidungsreaktionen bei Ratten ausgewertet wurden im Rahmen einer
umfassenden Studie, die am Central Drug Research Institute, Lucknow,
Indien ausgeführt
wurde (H.K. Singh, R.P. Rastogi, R.C. Srimal und B.N. Dhawan, Phytotherapy
Research, Band 2(2):70-75, 1988). In dieser Studie ist geschlossen
worden, dass die Bakoside A & B
die aktiven Bestandteile von Bacopa monniera sind, die für die verbesserte mentale
Leistung und das verbesserte Retentionsvermögen verantwortlich sind.
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Die
Authentisierung der traditionellen Ansprüche von Brahmi wurde am Central
Drug Research Institute untersucht, indem die Wirkung eines alkoholischen
Extrakts dieser Pflanze auf Erlernen, Konsolidierung und Retention
der drei mit dem Gedächtnis
in Verbindung stehenden Verhaltensreaktionen bei Albino-Ratten untersucht
wurde (Singh, H.K., und Dhawan, B.N., „Neuropsychopharmacological effects
of the Ayurvedic nootropic Bacopa monniera Linn (Brahmi)", Indian Journal
of Pharmacology, Band 29 (5): S359-S365, 1997). Im Rahmen dieser Untersuchung
wurde auch festgestellt, dass Bakoside in regulatorischen, pharmakologischen
und toxikologischen Untersuchungen, die an normalen gesunden männlichen
Freiwilligen ausgeführt
wurden, sicher waren. Diese Untersuchung wurde als Phase I-klinische
Studie bezeichnet. Bacopa-Extrakt
wurde an menschliche Freiwillige 4 Wochen in einzelnen und mehrfachen
Dosen im Rahmen einer regulatorischen klinischen Doppelblind-, Placebo-kontrollierten und
Nicht-Crossover-Studie verabreicht. Der Wirkungsmechanismus der
Facilitationswirkung von Bakosiden wurde deren verstärkter Proteinkinase-Aktivität und der
Produktion einer erhöhten
Proteinkonzentration im Hippocampus zugeschrieben. Eine andere Schlussfolgerung
dieser Untersuchung war, dass die Bakoside die retrograde Amnesie,
die durch durch Immobilisierung induzierten Stress und Scopolamin
erzeugt wurde, abschwächten.
P.A. Thakurdesai, P.L. Kole und A.N. Nagappa (www.Pharmabiz.com/newsfeat/feat112.com)
haben die Notwendigkeit einer Verwendung von standardisierten Extrakten,
um gewünschte
Wirksamkeit zu erzielen, betont.
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Berücksichtigt
man die große
Bedeutung und das große
Potential von von Bacopa monniera abgeleiteten Bakosiden im Rahmen
der menschlichen Gesundheit, stehen in der Literatur keine Informationen über ein
effizientes Verfahren, welches für eine
industrielle Produktion geeignet ist, zur Verfügung. Auch die Patentliteratur
offenbart keinerlei Informationen zum Thema einer effizienten Produktionstechnologie
von Bakosiden. Die Literatur enthält einige wenige im Labormaßstab ausgeführte Verfahren
zur Herstellung eines Bakoside enthaltenden Extrakts von Bacopa
monniera. Das Isolierungsverfahren, das von Chatterjee et al. herangezogen
(N. Chatterjee, R.P. Rastogi & M.L.
Dhar, Indian Journal of Chemistry, Band 1, Mai 1963; Chatterjee,
N., Rastogi, R.P., und Dhar, M.L., Indian J. Chem., Band 3: 24,
1965) und von Singh et al. weiter modifiziert worden ist (H.K. Singh,
R.P. Rastogi, R.C. Srimal und B.N. Dhawan, Phytotherapy Research,
Band 2 (2) : 70-75, 1988), beschreibt die Extraktion des getrockneten
Bacopa monniera-Krauts mit Alkohol, wobei das getrocknete Kräutermaterial
zuerst mit Wasser angefeuchtet und dann mit Alkohol extrahiert wird, welcher
unter verringertem Druck aufkonzentriert und wiederholt mit Benzol
zur Entfettung mazeriert wird. Das Filtrat wird bis zu einer 60%-igen
Alkoholkonzentration verdünnt
und wird mit einem Überschuss
von Bleiacetat behandelt. Die Bleisalze werden abfiltriert und das
restliche Blei wurde aus dem Filtrat mit Schwefelwasserstoff entfernt.
Das pH des Filtrats wird mit Natriumcarbonat auf 6,4 eingestellt und
bei 50°C
unter Vakuum auf ein Drittel von dessen Volumen aufkonzentriert
und wiederholt mit Butanol & Wasser
verteilt. Aus der Butanol-Fraktion scheidet sich bei einer Aufkonzentrierung
unter Vakuum ein die Bakoside A & B
enthaltendes Pulver ab. Das Pulver wird dann in Alkohol als farblose
Nadeln kristallisiert. Eine zusätzliche
Menge Bakoside wird aus dem Filtrat erhalten, indem es von Lösungsmittel
befreit wird und der Rückstand
mit Aceton mazeriert wird. Dieses Verfahren umfasst abgesehen davon,
dass es sehr weitschweifig und zeitaufwändig ist, die Verwendung von
Benzol (potentiell kanzerogen) und Bleisalzen (hochgradig giftig).
Obwohl das Verfahren versucht, das restliche Blei mit Schwefelwasserstoff-Gas
zu entfernen, ist die vollständige
Entfernung zweifelhaft angesichts der Beteiligung eines Gas-Flüssigkeits-Massentransfers,
wo hohe Effizienzen schwierig zu erzielen sind. Das Vorhandensein dieser
toxischen Chemikalien sogar in Spuren wird die Qualität des Endprodukts
fragwürdig
machen. Dieses Verfahren ist für
eine maßstäbliche Vergrößerung hin
zu einer industriellen Produktion nicht geeignet, da es weitschweifig
und gesundheitsgefährdend ist.
In dem Verfahren, das für
die von H.K. Singh und B.N. Dhawan (Journal of Ethanopharmacology,
Band 5: 205-214, 1982) ausgeführte
Untersuchung, um die Wirkung von Brahmi-Extrakt auf Vermeidungsreaktionen
bei Ratten auszuwerten, herangezogen worden ist, wird das luftgetrocknete
Pflanzenmaterial mit 90% Ethanol durch einen Soxhlet-Extraktionsapparat extrahiert
und der erhaltene Extrakt wird mit 10% Gummiarabicum für die Fütterung
der Ratten gemischt. In dieser Untersuchung wurde kein Versuch unternommen,
den Bakosid-Gehalt der Extrakte zu überwachen. In einer anderen
Untersuchung, die an der University of Madras über die Antikrebs-Aktivität von Bacopa
monniera ausgeführt
wurde (V. Elangovan, S. Govindasamy, N. Ramamoorthy und K.
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Balasubramanian, „In vitro
studies on the anticancer activity of Bacopa monniera, Filoterapia, Band
LXVI (3): 211-215, 1995), besteht die Vorgehensweise zur Extraktion
von Bakosiden darin, das pulverisierte Pflanzenmaterial in 95% Ethanol
48 h einzuweichen, den Extrakt unter Vakuum aufzukonzentrieren und
diesen durch Lyophilisation zu trocknen. Es wurde kein Versuch unternommen,
die Bakosid-Konzentration des Extrakts zu messen. Ein standardisierter
Extrakt von Bacopa monniera, welcher 20-30% Bakoside A & B enthält, wird
von einigen kommerziellen Firmen hergestellt und vertrieben, aber
das Herstellungsverfahren wird nicht offenbart (Produktinformationsbroschüre von M/s
Sabinsa Corporation, 121, Ethel Road West, Piscataway, NJ 08854,
USA, und M/s Himalaya USA, M/s Velvette International, Chennai,
Indien, M/s Dalmia Industries Ltd., Indien).
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Ein
Hauptproblem, auf welches man während
des Verfahrens stößt, war
die Schwierigkeit, das stabile Endprodukt in Form eines trockenen
rieselfähigen
Pulvers zu erhalten, da die aktiven Bestandteile (Bakoside) hochgradig
hygroskopisch sind.
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GEGENSTÄNDE DER
ERFINDUNG
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Der
Hauptgegenstand der Erfindung besteht darin, ein verbessertes Verfahren
zur Herstellung einer mit Bakositen angereicherten Fraktion in einer nicht-hygroskopischen
Form aus dem Kraut Bacopa monniera bereitzustellen, welches die
Nachteile der bislang bekannten Verfahren überwindet.
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Ein
anderer Gegenstand der Erfindung besteht darin, ein verbessertes
Verfahren zur Herstellung einer mit Bakositen angereicherten Fraktion
aus Bacopa monniera unter Verwendung von relativ nicht-toxischen Lösungsmitteln,
wie Hexan, Aceton und Methanol, bereitzustellen.
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Noch
ein anderer Gegenstand der Erfindung besteht darin, ein verbessertes
Verfahren zur Entfernung von unerwünschten Bestandteilen des Bacopa monniera-Krauts
durch Extrahieren des entfetteten Krauts mit Aceton bereitzustellen.
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Noch
ein anderer Gegenstand der Erfindung besteht darin, ein verbessertes
Verfahren zur Stabilisierung eines Bakosid enthaltenden Extrakts
durch Zugabe von nicht-toxischen stabilisierenden Agentien, wie
Mannitol, Maltodextrin, β-Cyclodextrin
oder Polyvinylalkohol, bereitzustellen.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung besteht darin, ein verbessertes
Verfahren zur Reinigung des Bacopa monniera-Extrakts unter Verwendung
einer Gegenstrom-„KARR"-Flüssig-Flüssig-Extraktionssäule, die
mit einem hin- und hergehenden Mischwerk oder Kolbenmischer ausgestattet
ist, bereitzustellen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Dementsprechend
stellt die Erfindung ein effizientes Verfahren zur Herstellung einer
mit stabilen Bakositen angereicherten Fraktion in einer nicht-hygroskopischen
Form aus dem Kraut Bacopa monniera bereit.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zur Herstellung einer
mit stabilen Bakosiden angereicherten Fraktion in einer nicht-hygroskopischen Form
extrahiert aus dem Kraut Bacopa monniera bereit, wobei das Verfahren
die Schritte umfasst:
- (i) Trocknen des frisch
geernteten Krauts Bacopa monniera in einem Ofen in einem Temperaturbereich
von 37-42°C
für einen
Zeitraum von 4-6 Stunden;
- (ii) Zermahlen und Sieben des getrockneten Krauts aus Schritt
(i) in einem Schredder oder Disintegrator, um das gemahlene Kraut
zu erhalten;
- (iii) Extrahieren des gemahlenen Krauts aus Schritt (ii) mit
Hexan in einem abgeänderten
Soxhlet-Extraktionsapparat, um einen Hexanextrakt zu erhalten;
- (iv) Entfernen des Hexanextrakts, der in Schritt (iii) gebildet
wurde, aus dem Soxhlet-Extraktionsapparat und Trocknen des Krauts,
indem man heißes
Wasser zirkulieren lässt;
- (v) Extrahieren des getrockneten Krauts aus Schritt (iv) mit
Aceton über
einen Zeitraum von 4 bis 8 Stunden, um einen Acetonextrakt zu erhalten,
der ungewünschte
Farbstoffe und nicht-bakosidische Bestandteile enthält;
- (vi) Extrahieren des mit Aceton extrahierten Krauts aus Schritt
(v) mit Methanol, um einen Methanolextrakt zu erhalten, der Bakoside
enthält;
- (vii) Aufkonzentrieren des Methanolextrakts aus Schritt (vi)
unter verringertem Druck;
- (viii) allmähliches
Zugeben des aufkonzentrierten Methanolextrakts aus Schritt (vii)
unter Rühren
zu Aceton, um die bevorzugte Präzipitation
von rohen Bakosiden herbeizuführen;
- (ix) Filtern der rohen Bakoside aus Schritt (viii) in einem
Vakuumfilter vom Typ Nutsche, um einen rohen Bakosidrückstand
zu erhalten;
- (x) Auflösen
des rohen Bakosidrückstands
aus Schritt (ix) mit Wasser, um eine wässrige Lösung zu erhalten;
- (xi) Extrahieren der wässrigen
Lösung
aus Schritt (x) mit n-Butanol, um einen n-Butanolextrakt zu erhalten;
- (xii) Aufkonzentrieren des n-Butanolextraktes aus Schritt (xi)
in einem Rotationsvakuumverdampfer unter hohem Vakuum, um einen
Trockenrückstand
zu erhalten, der reich an Bakosiden ist;
- (xiii) Auflösen
des Trockenrückstands
aus Schritt (xii) in 2 bis 10 Teilen Wasser, Zugabe von 1 bis 5 Gew.-%
an nichttoxischem stabilisierendem Agens unter konstantem Rühren, um
eine stabile Bakosidlösung
zu erhalten, und
- (xiv) Sprühtrocknen
der stabilen Bakosidlösung aus
Schritt (xiii) bei einer Temperatur im Bereich zwischen 90 und 110°C, um Bakoside
in der Form eines rieselfähigen,
stabilen und nicht-hygroskopischen Pulvers zu erhalten.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung, wobei in Schritt (ii) die Partikelgröße des gemahlenen Krauts
im Bereich von 30-40 Mesh liegt.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung, wobei in Schritt (iii) das getrocknete Bacopa monniera-Kraut
in einem abgeänderten
Soxhlet-Extraktionsapparat
extrahiert wird, wobei die Extraktionshülse mit einer Heißwasser-Ummantelung
ausgestattet ist.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der Erfindung, wobei in Schritt (iii) das getrocknete Kraut mit
Hexan extrahiert wird, um ein Entfetten des Krauts zu bewirken.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der Erfindung, in welcher in Schritt (iv) das Kraut getrocknet wird,
indem man durch die Ummantelung heißes Wasser in einem Temperaturbereich
von 70-75°C
zirkulieren lässt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung, in welcher in Schritt (vii) der Extrakt, der Bakoside
enthält,
auf ein Zwanzigstel von dessen ursprünglichem Volumen aufkonzentriert
wird.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird der Extrakt unter Verwendung eines Dünnschichtverdampfers
(„wiped
film evaporator")
mit Rührwerk
unter hohem Vakuum in einem Temperaturbereich von 45 bis 55°C aufkonzentriert.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung, in welcher in Schritt (viii) rohe Bakoside aus dem
aufkonzentrierten Methanolextrakt durch Rühren mit einer Überschussmenge
an Aceton präzipitiert
werden.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung liegt das Gewichtsverhältnis des Methanolextrakts
und des Acetons in einem Bereich von 1:4 bis 1:10. In einer anderen
Ausführungsform
der Erfindung, in welcher in Schritt (xi) n-Butanol als selektives
Lösungsmittel
verwendet wird, um die Konzentration von Bakosiden anzureichern,
was somit zu einer höheren Produktreinheit
führt.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der Erfindung, in welcher in Schritt (xi) der Extrakt von Bacopa
monniera wirksam gereinigt werden kann unter Verwendung einer Gegenstrom-„KARR"-Flüssig-Flüssig-Extraktionssäule, welche
mit einem hin- und hergehenden Mischwerk oder Kolbenmischer ausgestattet
ist.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der Erfindung, in welcher in Schritt (xiii) das verwendete nichttoxische
stabilisierende Agens ausgewählt
wird aus der Gruppe bestehend aus Mannitol, Maltodextrin, β-Cyclodextrin oder
Polyvinylalkohol.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung liegt der Ertrag an Bakosiden in Bezug auf das Trockengewicht
von Bacopa monniera im Bereich von 1,5 bis 2,5%.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung enthält
das Pulver, welches erhalten wird, 20-30% Bakoside A und B.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird der Prozentsatz an Bakosiden in dem Pulver mithilfe
von HPTLC-Analyse abgeschätzt.
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Gemäß dem Verfahren
der Erfindung besteht der anfängliche
Verfahrensschritt aus einem Trocknen des frisch geernteten Krauts
in einem Heißluftofen
vom Tablett-Typ bei 37-42°C
für 4-8
h. Es wird Sorgfalt darauf verwandt, das Kraut in einer dünnen Schicht
von 2-3 Zoll Dicke gleichförmig über das perforierte
Trocknungstablett für
ein gleichmäßiges Trocknen
auszubreiten. Eine Probe des Krauts wird hinsichtlich des Feuchtigkeitsgehalts,
der vorzugsweise zwischen 3,5 und 5,5% liegen sollte, getestet. Das
getrocknete Kraut wird dann in einem Schredder oder Disintegrator
pulverisiert. Das resultierende grobe Pulver wird in einem 30 Mesh-Sieb
gesiebt und Material mit Übergröße wird
in den Schredder bzw. Disintegrator zurückgeführt. Das pulverisierte getrocknete
Kraut wird in die Extraktionshülse
des abgeänderten
Soxhlet-Extraktionsapparats
zusammen mit dem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel „Hexan" gefüllt. Dieses
Lösungsmittel
ist gewählt
worden aufgrund seiner Fähigkeit,
die unerwünschten
Lipide, Pflanzenwachse und einen Teil des färbenden Materials zu entfernen.
Auch sind Bakoside vollständig
unlöslich
in Hexan und werden in dem Pflanzenmaterial intakt gelassen. Es
werden mehrere Perkolationen ausgeführt, um eine vollständige Entfettung
des Bacopa monniera-Krauts über
einen Zeitraum von 4-8 h zu erzielen. Nach dem Abschluss der Extraktion
wird der Hexanextrakt für
eine Rückgewinnung
von Lösungsmittel
entfernt und das Bett von Bacopa monniera wird getrocknet, indem
heißes
Wasser bei 70-75°C
durch die Ummantelung der Extraktionshülse hindurchgeleitet wird.
Das gleiche Bett von Kraut wird dann mit einem mäßig polaren Lösungsmittel „Aceton" über einen Zeitraum von 4-8
h extrahiert. Die zweite Extraktion des Krauts mit Aceton, in welchem
die Bakoside unlöslich
sind, wird ausgeführt, um
die größtmögliche Menge
an verbleibenden unerwünschten
Bestandteilen und färbenden
Materialien aus dem Kraut zu entfernen. Nach der Extraktion wird der
Acetonextrakt für
eine Rückgewinnung
von Lösungsmittel
entfernt und das Bett wird getrocknet, indem der vorigen Vorgehensweise
gefolgt wird. Das Bett wird als nächstes für einen weiteren Zeitraum von
4-8 h unter Verwendung eines hohe Polarität aufweisenden Lösungsmitels „Methanol", welches die Bakoside
und auch andere, in geringerem Ausmaß vorhandene Bestandteile löst, extrahiert.
Der methanolische Extrakt wird dann aus dem Soxhlet-Extraktionsapparat
entfernt und auf ein Zwanzigstel von dessen ursprünglichem
Volumen unter Vakuum in einem Rotationsvakuumverdampfer bei einer
Temperatur von 45-55°C
aufkonzentriert. Der Bakoside enthaltende konzentrierte Extrakt
wird langsam zu einem gerührten
Gefäß, welches
1-4 Teile Aceton enthält, zugegeben,
um die Bakoside A & B
zusammen mit einigen anderen, in Aceton unlöslichen Materialien zu präzipitieren.
Die Aufschlämmung
wird in einem Vakuumfilter vom Typ Nutsche filtriert, um das Lösungsmittel
zu entfernen. Das Präzipitat
wird als nächstes
in 2-10 Teilen Wasser gelöst.
Diese Lösung wird
mit einem Lösungsmittel
von hoher Polarität,
das mit Wasser unmischbar ist, extrahiert, um die Bakoside in die
Lösungsmittelphase
zu transferieren. Wir haben n-Butanol als das Lösungsmittel für diesen Schritt
ausgewählt,
da es die Erfordernisse von hoher Selektivität für Bakoside erfüllt und
es auch mit Wasser unmischbar ist. Der Butanolextrakt wird unter
hohem Vakuum bei einer Temperatur von 50-55°C in einem Rotationsvakuumverdampfer
aufkonzentriert. Die effektiv getrocknete Masse wird in 2-10 Teilen Wasser
in einem gerührten
Gefäß gelöst und β-Cyclodextrin
(1-5%) wird als Stabilisator zugesetzt. Andere stabilisierende Agentien,
wie Mannitol, Maltodextrin, Polyvinylalkohol, sind für diesen
Zweck ebenfalls geeignet. Das Rühren
wird 1-2 h fortgesetzt. Die Lösung
wird als nächstes
in einen Heißluft-Sprühtrockner,
der mit einer Sprühdüse und einer Zyklon-Vorrichtung
zum Sammeln des Produkts ausgestattet ist, eingespeist. Die Strömungsraten
der Luft und der Lösung
und die Heißlufttemperatur
werden sorgfältig
gesteuert, um die Mischung von Bakosiden als ein gelbbraun gefärbtes, rieselfähiges und nicht-hygroskopisches Pulver
zu erhalten. Der Prozentsatz der Bakoside in dem Endprodukt wird
mithilfe einer HPTLC-Prozedur abgeschätzt, wie von Gupta et al. berichtet
(A.P. Gupta, S. Mathur, M.M. Gupta & Sushil Kumar, Journal of Medicinal
and Aromatic Plants, 20: 1052-1055, 1998). Indem dem Verfahren dieser
Erfindung gefolgt wird, wird ein Produkt, welches 20-30% Bakoside A & B enthält, erhalten.
Der Ertrag des Produkts basierend auf dem Trockengewicht von Bacopa
monniera liegt im Bereich von 1,5 bis 2,5%. Dieser standardisierte
Extrakt von Bacopa monniera ist relativ stabil und für eine Formulierung zu
Nutrazeutika geeignet.
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Das
Verfahren der Erfindung wird veranschaulicht durch folgende Beispiele,
die nicht so aufgefasst werden sollten, dass sie den Umfang der
Erfindung einschränken.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen auch die speziellen Ausführungsformen
des Verfahrens der Erfindung.
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BEISPIEL 1
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1,0
kg Bacopa monniera-Kraut, das auf der CIMAP-Farm kultiviert worden
war, wurde im Schatten bei 30°C
24 h und dann in einem Heißluftofen vom
Tablett-Typ bei 42°C
für einen
Zeitraum von 8 h getrocknet. Das Kraut wurde gleichmäßig in 3''-Schichten auf den perforierten Tabletts
des Ofens ausgebreitet. Nach dem Trocknen wurde der Feuchtigkeitsgehalt
einer Probe des Krauts überprüft und zu
4,5% ermittelt. Das getrocknete Kraut wurde dann in einem Schredder
oder Disintegrator pulverisiert und das grobe Pulver wurde durch
ein Sieb mit 30 Mesh Maschenweite gesiebt. Das Material mit Übergröße wurde
in den Schredder bzw. Disintegrator zurückgeführt. 400 g des pulverisierten
getrockneten Krauts wurden in die Extraktionshülse des abgeänderten
Glas-Soxhlet-Extraktionsapparats gefüllt. 2,5 l Hexan wurden in
den Reboiler-Kolben gegeben und über
einem Wasserbad erwärmt,
um das Lösungsmittel
zum Kochen zu bringen und die Zirkulation des Lösungsmittels durch das Kräuterbett
zu beginnen. Der Soxhlet-Apparat wurde auf diese Weise kontinuierlich
für einen
Zeitraum von 5 h betrieben, um das Kräutermaterial zu entfetten.
Der Hexanextrakt wurde für
eine Rückgewinnung
des Lösungsmittels
entfernt. Dann wurde heißes
Wasser bei 70-75°C
durch die Ummantelung der abgeänderten
Extraktionshülse
des Soxhlet-Extraktionsapparats geleitet, um das Kräuterbett
zu trocknen, indem das restliche Lösungsmittel verdampft wurde.
Als nächstes
werden 2,5 l des Lösungsmittels
Aceton in den Reboiler-Kolben gegeben und über dem Wasserbad erwärmt, um die
Zirkulation des Lösungsmittels
durch das Kräuterbett
zu beginnen. Der Soxhlet-Apparat wurde für einen Zeitraum von 5 h betrieben,
um die unerwünschten
Bestandteile und färbenden
Materialien aus dem Kraut zu entfernen. Der Acetonextrakt wurde
dann aus dem Reboiler-Kolben für
eine Rückgewinnung des
Lösungsmittels
entfernt und das Kräuterbett
wurde auf die gleiche Weise wie oben getrocknet. Nach dem Trocknen
wurde das Kräuterbett
dann einer dritten Extraktion mit 2,5 l Methanol-Lösungsmittel
unterworfen. Der Soxhlet-Apparat
wurde für
einen Zeitraum von 6 h betrieben, um die Bakoside vollständig zu
lösen.
Der methanolische Extrakt wurde dann aus dem Soxhlet-Apparat entfernt
und zu einem Rotationsvakuumverdampfer überführt, um das Lösungsmittel
zurückzugewinnen.
Der Extrakt wurde auf ein Endvolumen von ungefähr 100 ml aufkonzentriert. Der
aufkonzentrierte Extrakt, welcher Bakoside enthielt, wurde langsam
zu einem gerührten
Gefäß, welches
400 ml Aceton enthielt, zugegeben, um Bakoside zusammen mit einigen
anderen in Aceton unlöslichen
Materialien zu präzipitieren.
Die Aufschlämmung
wurde in einem Vakuumfilter vom Typ Nutsche filtriert, um das Lösungsmittel
zu entfernen. Das Präzipitat
wurde als nächstes
in 50 ml Wasser gelöst. Diese
Lösung
wurde dann mit 5 × 15
ml n-Butanol extrahiert, um die Bakoside in die Lösungsmittelphase zu
transferieren. Die beiden Phasen wurden getrennt und der Butanolextrakt
wurde zu einem Rotationsvakuumverdampfer transferiert und unter
hohem Vakuum bei einer Temperatur von 50-55°C aufkonzentriert. Die effektiv
getrocknete Masse (9,80 g), welche Bakoside enthielt, wurde in einem
gerührten
Gefäß in 100
ml Wasser gelöst
und es wurde 0,2 g β-Cyclodextrin zu der
Lösung
als Stabilisator zugegeben. Das Rühren wurde für einen
weiteren Zeitraum von 1,5 h fortgesetzt. Die Lösung wurde als nächstes in
einen Heißluft-Sprühtrockner,
der mit einer Sprühdüse und einer
Zyklon-Vorrichtung zum Sammeln des Produkts ausgestattet war, eingespeist.
Die Heißlufttemperatur
bei dem Zyklon wurde bei 100-110°C
gehalten. Das Endprodukt (7,80 g) wurde als ein gelbbraun gefärbtes, rieselfähiges und
nicht-hygroskopisches Pulver gewonnen. Der Prozentsatz des Bakosids
A in dem Produkt wurde mithilfe einer HPTLC-Prozedur abgeschätzt. 5,0 mg der Probe wurden
in 2 ml Methanol gelöst.
Die Probe wurde zusammen mit Bakosid A-Standard auf DSC-Platten
(60F254, Kieselgel, Merck) aufgetragen und
man ließ sie
in Ethylacetat:Methanol:destilliertes Wasser (60:14:10) laufen.
Die Platten wurden bis zu einer Höhe von 8 cm entwickelt und
Flecken wurden sichtbar gemacht, indem die Platte in Vanillin-Schwefelsäure-Reagens
(Vanillin: Schwefelsäure:
Ethylacetat – 1
g: 5 ml: 5 ml) eingetaucht wurde, gefolgt von einem Erwärmen der
Platten bei 110°C
für 15
min. Der blau gefärbte
Bakosid A-Fleck wurde bei 620 nm und 430 nm gescannt unter Verwendung
des Doppel-Wellenlänge-Adsorptions-Reflexions-Modus
mit Hintergrund-Subtraktion und unter Verwendung eines Lichtspalts
1 × 2
(0,4 mm Höhe × 1,2 mm
Breite: unter Verwendung eines Shimadzu CS930-Densitometers). Es wurde eine Kalibrierungskurve,
die unter Verwendung von variierenden Mengen von Bakosid A graphisch
erstellt wurde, für
das Abschätzen
des prozentualen Bakosid A-Gehalts in der Probe verwendet. Indem
diesem Verfahren dieser Erfindung gefolgt wurde, wurde ein Produkt,
welches 28% Bakosid A enthielt, erhalten. Der Ertrag des Produkts
basierend auf dem Trockengewicht von Bacopa monniera betrug 1,95%.
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BEISPIEL 2
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Das
gleiche Verfahren wurde im Pilot-Anlagen-Maßstab unter Verwendung von
35 kg getrocknetem Bacopa monniera-Kraut, aber unter Verwendung
von Pilot-Anlagen-Gerätschaften
aus rostfreiem Stahl ausgeführt.
150 kg Bacopa monniera-Kraut, das auf der CIMAP-Farm kultiviert
worden war, wurde im Schatten bei 32°C 24 h getrocknet und weiter
in einem Heißluftofen
vom Tablett-Typ bei 40-42°C
8 h bis zu einem Feuchtigkeitsendgehalt von 4% getrocknet. Das getrocknete
Kräutermaterial
wurde in dem Schredder bzw. Disintegrator auf ungefähr 30 Mesh Größe zermahlen.
35 kg des getrockneten Kräutermaterials
wurden in die Extraktionshülse
der Soxhlet-Anlage aus rostfreiem Stahl eingefüllt. 200 l Hexan-Lösungsmittel
wurden in die Extraktionshülse gepumpt,
um das Kräutermaterial
vollständig
einzutauchen. Nach einer Kontaktzeit von 2,0 h ließ man den
Extrakt in den Rebiler-Kessel ablaufen (Vol. des Extrakts: 165 l).
In die Ummantelung des Reboiler-Kessels wurde Dampf bei 10 psig-Leitungsdruck geleitet,
um das Hexan zu destillieren, das zurück auf die Extraktionshülse bis
zu einem Niveau von 2'' oberhalb des Kräuterbettniveaus
gesprüht
wurde. Es wurde eine Kontaktzeit von 2,0 h für die zweite Wäsche zugelassen.
Es erfolgte eine dritte und vierte Wäsche, indem der gleichen Vorgehensweise
wie oben gefolgt wurde. Hexan wurde aus dem Extrakt durch Destillation
zurückgewonnen
und dunkel gefärbter
Rückstand
wurde verworfen. Das restliche Lösungsmittel,
das an dem Kraut anhaftete, wurde zurückgewonnen, indem man heißes Wasser
bei 75°C in
der Ummantelung der Extraktionshülse
zirkulieren ließ.
Nach dem Trocknen des Kräuterbetts
wurden als nächstes
200 l Aceton bei 27°C
in die Extraktionshülse
gepumpt, um das trockene, entfettete Kraut vollständig einzutauchen.
Man unterzog das Kraut vier Wäschen
mit einer Kontaktzeit von jeweils 2,0 h für die Entfernung der unerwünschten
Bestandteile & färbenden
Materialien. Der Acetonextrakt wurde für eine Rückgewinnung von Lösungsmittel
destilliert. Das Kräuterbett
wurde getrocknet, indem der gleichen Vorgehensweise wie oben gefolgt
wurde. Nach dem Trocknen wurden 200 l Methanol in die Extraktionshülse gepumpt.
Das Kraut wurde vier Wäschen von
jeweils 2,0 h unterzogen, um die Bakoside zu lösen. Der Methanolextrakt wurde
auf die Hälfte
von dessen Volumen in dem Reboiler-Kessel des Soxhlet-Apparats aufkonzentriert.
Das Konzentrat wurde zu einem aus rostfreiem Stahl hergestellten
Dünnschichtverdampfer
(„wiped
thin film evaporator"; WFE)
mit Rührwerk
zur weiteren Verarbeitung geleitet. Das System wurde unter Vakuum
von 275 mbar gehalten. Die Upm der Teflon-Verteilerbürste wurden auf
290 Upm eingestellt und man ließ heißes Wasser bei
60°C in
der Ummantelung des Verdampfers zirkulieren. Aus der WFE-Verarbeitung
wurden 10,5 l aufkonzentrierter Extrakt erhalten: Der Extrakt wurde dann
langsam in ein mit einem mechanischen Rührer ausgestattetes Gefäß aus rostfreiem
Stahl, das 45 l Aceton enthielt, transferiert. Das Rühren der
Lösung wurde
1 h fortgesetzt. Der Inhalt wurde dann in einen geschlossenen Vakuumfilter
aus rostfreiem Stahl transferiert, um das Lösungsmittel Aceton zu entfernen.
Der Filterkuchen wurde entfernt und in 8 l Wasser gelöst. Die
Lösung
wurde dann zu einer „KARR"-Flüssig-Flüssig-Extraktionssäule, die
mit einem hin- und hergehenden Mischwerk oder Kolbenmischer ausgestattet
war, transferiert. Die wässrige Lösung wurde
mit 10 l n-Butanol in der Flüssig-Flüssig-Extraktionssäule im Gegenstrom-Modus
kontaktiert, um die Bakoside in die Butanol-Phase zu transferieren.
Die Butanolphase wurde dann in den aus rostfreiem Stahl hergestellten
Dünnschichtverdampfer
mit Rührwerk
zum Aufkonzentrieren des Extrakts unter hohem Vakuum von 5-10 Torr
bei einer Temperatur von 45-50°C
gepumpt. Die aufkonzentrierte Masse, die die Bakoside enthielt (1,00
kg), wurde in 4,0 l Wasser in einem gerührten Gefäß aus rostfreiem Stahl gelöst und 18
g β-Cyclodextrin
wurden zu der Lösung
als Stabilisator zugegeben und es wurde für einen Zeitraum von 1,5 h
gerührt.
Die Lösung
wurde als nächstes
in den Heißluft-Sprühtrockner,
der mit einer Sprühdüse und einer
Zyklon-Vorrichtung zum Sammeln des Produkts ausgestattet war, eingespeist.
Die Heißlufttemperatur
an dem Zyklon wurde bei 100-110°C gehalten.
Das Produkt (710 g), welches Bakoside enthielt, wurde als ein gelbbraun
gefärbtes,
rieselfähiges
und nicht-hygroskopisches Pulver erhalten. Ertrag basierend auf
der Grundlage des trockenen Krauts: 2,02%. Der Gehalt der Bakoside
in dem Produkt wurde mithilfe der HPTLC-Methode abgeschätzt, indem der Analysenprozedur;
wie in Beispiel 1 veranschaulicht, gefolgt wurde: der Prozentsatz
an Bakosid A in dem Produkt beträgt
26%.
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NEUHEIT DER ERFINDUNG
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- 1. Das verbesserte Verfahren erzielt die Produktion
eines an Bakosiden reichen Extrakts aus Bacopa monniera durch Verwendung
von relativ nicht-toxischen Lösungsmitteln,
wie Hexan, Aceton und Methanol, anders als das Verfahren des Standes
der Technik, das die Verwendung von toxischen und potentiell kanzerogenen
Chemikalien, wie Benzol und Bleisalzen, erfordert.
- 2. Bei dem verbesserten Verfahren wird das Entfetten des Krauts
ausgeführt,
indem Hexan anstelle von Benzol verwendet wird. Hexan hat den Vorteil,
dass es einen niedrigeren Siedepunkt und 18% weniger latente Verdampfungswärme aufweist,
was zu weniger Prozeßwärme-Kosten
und, was signifikanter ist, einer geringeren Konzentration von restlichem
Lösungsmittel
im Falle von Hexan führt.
- 3. Das verbesserte Verfahren setzt einen abgeänderten
Soxhlet-Extraktionsapparat
ein, in welchem die Extraktionshülse
mit einer Heißwasser-Ummantelung
ausgestattet ist. Diese Anordnung ist nützlich, um das restliche erste
Lösungsmittel
aus dem Kräuterbett
durch Verdampfen zu entfernen, bevor die Extraktion mit dem zweiten Lösungsmittel
begonnen wird, wodurch eine Extraktion mit einer Mehrzahl von Lösungsmitteln
in dem gleichen Extraktionssystem ermöglicht wird. Keines der Verfahren
des Standes der Technik stellt irgendwelche Angaben bereit über die
Extraktionsvorrichtung und -techniken, die durch sie verwendet wurden.
- 4. Es ist beobachtet worden, dass der aus Bacopa monniera erhaltene,
Bakoside enthaltende Extrakt eine hochgradig hygroskopische Natur
hat, die sehr schwierig zu trocknen ist und dessen weitere Formulierung
extrem schwierig und ungenau macht. Das Verfahren des Standes der
Technik, über
welches von V. Elangovan et al. berichtet wurde, verwendete eine
Lyophilisation zum Trocknen des Bacopa monniera-Extrakts für eine Verwendung
in deren experimentellen Untersuchungen. Lyophilisation ist als
Trocknungstechnik zeitaufwändig
und erfordert die Erzeugung von sehr niedrigen Temperaturen und
hohem Vakuum in der Größenordnung
von 10-3-10-4 mbar,
welche mit kapital-intensiven Gerätschaften und einem energie-intensiven
Betrieb erzielt werden müssen.
Das verbesserte Verfahren dieser Erfindung setzt eine Sprühtrocknung
eines stabilisierten Extrakts als eine schnellere, geringe Kosten
aufwertende Alternative ein, um das Endprodukt als ein nicht-hygroskopisches
und rieselfähiges
Pulver mit gleichförmiger
Partikelgröße zu erhalten.
- 5. Die Stabilisierung des Bakosid enthaltenden Extrakts wird
in dem verbesserten Verfahren erzielt durch die kluge Verwendung
(in einer Konzentration von 1-5%) von nichttoxischen stabilisierenden
Agentien, wie Mannitol, Maltodextrin, β-Cyclodextrin, Polyvinylalkohol,
die als Vehikel in pharmazeutischen Formulierungen gut akzeptiert sind. Über die
Stabilisierung des Bakosid enthaltenden Extrakts von Bacopa monniera
ist bislang noch nicht berichtet worden.
- 6. Das Verfahren des Standes der Technik führt zu einem Extrakt, der einen
unangenehmen bitteren Geschmack hat. Er weist auch eine dunkelgrüne Farbe
auf. Da der Bacopa monniera-Extrakt zum Formulieren von Nutrazeutika & der Gesundheit dienenden
Nahrungsmitteln verwendet werden soll, sind ein schmackhafter Geschmack
und ein hellerer Farbton des Extrakts von hervorragender Bedeutung,
um eine fertige Formulierung zu erzielen, die einen angenehmen Geschmack
und ein ästhetisches
Aussehen aufweist. Das Verfahren dieser Erfindung ist in der Lage,
die bitteren Geschmacksbestandteile durch die Verwendung von selektiven
Lösungsmitteln
zu entfernen.