DE60214828T2 - Kombi-moleküle, welche eine inhibierende wirkung auf die signalübertragung und dna-schädigende eigenschaften haben - Google Patents

Kombi-moleküle, welche eine inhibierende wirkung auf die signalübertragung und dna-schädigende eigenschaften haben Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe von neuen chemischen Mitteln, die Antitumoraktivität zeigen. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung Moleküle, die hier als "Kombimoleküle" bezeichnet werden, die zwei Hauptmechanismen der Antitumorwirkung kombinieren. Spezifischer betrifft die vorliegende Erfindung Moleküle, die die durch den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) vermittelte Signalübertragung blockieren können und DNA schädigen können.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Krebs ist ein Krankheitszustand, der durch unkontrollierte Vermehrung von genetisch veränderten Gewebezellen gekennzeichnet ist. Es wurden verschiedene chemotherapeutische Ansätze entwickelt, um Krebs zu behandeln. Diese schließen alkylierende und antimitotische Mittel, Antimetaboliten und Antitumorantibiotika ein. Solche therapeutischen Mittel wirken hauptsächlich auf schnell sich vermehrende Zellen, wie Krebszellen.
  • Eine erworbene Resistenz, die durch DNA-Reparaturenzyme vermittelt wird, hat oft die Verwendung von DNA-interaktiven Mitteln stark eingeschränkt und in vielen Fällen konnte bei Verabreichung von Mehrfach-Antitumorwirkstoffen mit verschiedenen Wirkungsmechanismen eine nützliche klinische Antitumoraktivität nicht beobachtet werden.
  • In den letzten 10 Jahren hat das Verständnis der zellulären Resistenz gegenüber DNA-Reparaturprozessen auf molekularer Basis ebenso wie der spontanen Reparatur natürlich vorkommender Fehler bei der DNA-Polymerisation erheblich zugenommen. Bis heute wurde dies jedoch nicht in eine Zunahme der Wirksamkeit von DNA-reaktiven den Krebs einschließlich von Brust-, Lungen- und Eierstockcarcinoma gezielt ansteuernden Wirkstoffen übersetzt.
  • Die Selektion vieler DNA-reaktiver Wirkstoffe für weitere in-vivo-Tests basierte hauptsächlich auf ihrer hohen Reaktivität mit DNA-Basen, ihrer DNA-Bindungsaffinität und auf der signifikanten Cytotoxizität, die sie in Tumorzellen induzieren. Struktur-Aktivitäts-Beziehungsstudien waren oft auf Zellwachstum und/oder in-vivo-Aktivität in Mausmodellen gerichtet.
  • Die Überexpression und Funktionsstörung von Tyrosinkinasen (TKs), die direkt oder indirekt Einfluss auf die mitogene Signalgebung in Tumorzellen haben, wurde weitreichend untersucht und wird nun als hauptsächlicher funktioneller Unterschied zwischen normalen Zellen und Tumorzellen angesehen (1). Wegen der erheblichen Beteiligung am Fortschreiten des Tumors wurden überexprimierte Rezeptor-TKs nun die Ziele für Wirkstoffdesign und selektive chemotherapeutische Interventionen (2). Ein solches Ziel ist der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), der bei vielen Patienten mit einem aggressiven Voranschreiten des Tumors und einer Tumorinvasion in Beziehung steht (3). Es wurde bereits gezeigt, dass die Blockierung der Signalübertragung unter Vermittlung der TK-Aktivität des EGFR zu signifikanter Antitumoraktivität sowohl in vitro als auch in vivo führt und zwei neue Mittel sind nun in Phase II der klinischen Versuche (4). Obwohl sie erheblich weniger toxisch sind als frühere cytotoxische Mittel, haben die meisten TK-Inhibitoren, die derzeit in klinischen Versuchen sind, den Nachteil, dass sie cytostatische Mittel sind, die eine reversibel hemmende Wachstumsaktivität induzieren (5).
  • Viele menschliche Tumoren, einschließlich Lungen-, Brust- und Hirntumoren, exprimieren hohe Anteile an EGFR (6). Es wurde bereits gezeigt, dass die Blockade des EGFR-Stoffwechselwegs durch verschiedene Methoden die Vermehrung einer Vielzahl von Tumorzelllinien sowohl in vitro als auch in vivo hemmt (7-10). Obwohl kürzlich gezeigt wurde, dass EGFR-Antikörper die Apoptose in Tumorzellen anschalten (11), ist die antiproliferative Aktivität von EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitoren häufig cytostatisch und nicht cytotoxisch.
  • Die Antitumorwirksamkeit von EGFR-TK-Inhibitoren wurde bereits in vivo gezeigt. Eine Hauptbeschränkung derzeitiger EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitoren ist jedoch die hohe intrazelluläre Konzentration von ATP, die eine Hauptbarriere für die fortgesetzte Hemmung der durch EGF stimulierten Signalübertragung in Tumorzellen darstellt. Wenn sie keine Apoptose induzieren können, sind EGFR-TK-Inhibitoren cytostatische Mittel, die reversible Antitumorwirkungen induzieren. Es wurde nun der Synthese von irreversiblen Inhibitoren erhebliche Beachtung geschenkt. Kürzlich wurden irreversible Inhibitoren der EGFR-Familie synthetisiert, die eine höhere Potenz zeigen als ihre reversiblen Vorgänger (12, 40, 41). Die irreversible Hemmung von TKs kann nichtsdestotrotz ungenügend sein, um den Zelltod zu induzieren. Unglücklicherweise ist möglicherweise die irreversible Hemmung von EGFR nicht ausreichend, um eine fortgesetzte Antitumoraktivität zu induzieren, wenn die Zellen alternative Wachstumsmechanismen besitzen. Die Kombination mit cytotoxischen Wirkstoffen, um die Wirkung der EGFR-TK-Hemmung zu potenzieren, wird nun als nützliche Alternative angesehen (13).
  • Anilinochinazoline sind eine neue Klasse von hochspezifischen Rezeptorverbindungen, von denen gezeigt wurde, dass sie die mit EGRF in Beziehung stehende Signalübertragung durch kompetitive Bindung an der ATP-Stelle des EGFRs hemmen (14). Es wurde bereits gezeigt, dass die Blockade der durch EGFR vermittelten Signalübertragung durch Anilinochinazoline der Typen A und B zu einer signifikanten Antitumoraktivität (7, 8) führt. Die signifikante Zahl von Struktur-Aktivitäts-Beziehungs-(SAR)-Studien für 4-Anilinochinazoline und Pyrido[d]pyrimidine als EGFR-TK-Inhibitoren ist konsistent mit den Verbindungen, die an die ATP-Stelle des EGFR binden (7-10, 15).
  • Figure 00020001
  • Molekülmodelle deuten darauf hin, dass das N-1-Atom eine H-Bindung von Met-769 akzeptiert, wohingegen das N-3-Atom eine H-Bindung von der Seitenkette von Thr-766, die an Strang 5 tief im Bindungsspalt angeordnet ist, akzeptiert (8, 9, 16). Der Anilinoanteil bindet in einer benachbarten hydrophoben Tasche. Molekülmodelle deuten weiterhin darauf hin, dass die einzigen Positionen an den Inhibitoren, wo Substituenten verändert werden könnten, ohne ihre Bindungsaffinität zu beeinflussen, die Positionen 6 und 7 sind, die am Eingang des Bindungsspalts angeordnet sind (17). Eine Vielzahl von Verbindungen mit sperrigen Seitenketten an den Positionen 6 und 7 wurden synthetisiert und es wurde gefunden, dass sie eine signifikante Bindungsaktivität für die EGFR-ATP-Bindungsstelle behalten. Die Toleranz sperriger Substituenten in der SAR von Anilinochinazolinen wurde durch signifikante Aktivitäten der Strukturen A und B gezeigt, die nun in klinischen Versuchen der Phase II sind.
  • Nitrosoharnstoffe gehören zu den ältesten Wirkstoffen, die bei der klinischen Betreuung von Leukämien und vielen festen Tumoren verwendet werden (18-20). Die Leitverbindung dieser Klasse, Bis-chlorethyl-N-nitrosoharnstoff (BCNU) war eines der potentesten Mittel, das zur Behandlung von Hirntumoren mehr als 30 Jahre lang verwendet wurde (19, 20). Ihr Wirkungsmechanismus basiert auf der Induktion von cytotoxischen DNA-Einzelstrangbrüchen und DNA-Vernetzungen, die schließlich zum Krebszelltod führen (21, 22).
  • Figure 00030001
    BCNU
  • Alkyldiazoniumverbindungen und Vorläufer, wie Dacarbazin und TEM (Schema 1) sind cytotoxische Mittel, deren Wirkungsmechanismus hauptsächlich auf der Alkylierung von DNA an den Positionen 6 und 7 von Guanin basiert (23). TEM ist nun für die Behandlung von Melanomen und Hirntumoren zugelassen.
  • Figure 00030002
    Schema 1
  • Es gibt viele biochemische Unterschiede zwischen normalen Zellen und Tumorzellen. Unsere Kenntnis von diesen Unterschieden hat erheblich zugenommen. Ein solcher Unterschied ist die Überexpression und Mutation verschiedener Signalübertragungsproteine. Die Funktionsstörung des EGFR und verwandter Rezeptoren tritt bei vielen Tumoren auf, einschließlich Lungen-, Brust- und Eierstockkrebs. Es würde erwartet, dass Verbindungen mit mehreren intrazellulären Zielen effektiver gegen resistente Tumoren wären. Genauer wäre die Entwicklung von chemischen Mitteln, die das Potenzial haben, gleichzeitig ein solches Protein, hier EGFR, und genomische DNA anzusteuern, hocherwünscht. Verbindungen mit mehreren intrazellulären Zielen würden Krebs aggressiver bekämpfen und wären demzufolge effektiver. Diese Mischzielstrategie wird als "Kombiziel-Konzept" bezeichnet und ihre Entwicklung liefert eine Alternative zu klassischen Therapien, die das nichtselektive Cisplatin und viele andere Alkylierungsmittel betreffen. In anderen Worten sollte das Kombinieren solcher nichtselektiver DNA schädigender Mittel mit einem onkogene Tyrosinkinase ansteuernden Molekül zu neuen Molekülen führen, die selektiver und effektiver gegenüber Tumoren sind, die diese Onkogene exprimieren.
  • Es bleibt daher ein Bedarf für cytotoxische Mittel, die mit Liganden, die die Zellproliferation oder Onkogenese hemmen, eine Synergie zeigen. Genauer bleibt ein Bedarf für chemische Mittel, die gleichzeitig ein spezifisches Molekül, z.B. den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) und auch genomische DNA ansteuern können.
  • Die vorliegende Erfindung versucht diese und weitere Bedürfnisse zu erfüllen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe von neuen Molekülen, die sowohl eine cytotoxische Einheit als auch eine cytostatische Einheit aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe von Molekülen, die nützlich sind zur Behandlung von refraktären festen Tumoren, wie Brust-, Lungen-, Epithel-, Eierstock-, Vulva-, Prostata- oder Kopf- und Halscarcinoma.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe von neuen Molekülen, die als "Kombimoleküle" bezeichnet werden mit einer hohen Affinität für Proteine, die an den Zellproliferationssignalstoffwechselwegen beteiligt sind und die auch DNA schädigen können.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe von neuen Molekülen, die zwei Hauptmechanismen der Antitumorwirkung kombinieren, nämlich Blockierung der Signalübertragung, die durch EGFR vermittelt wird (indem sie die EGFR-TK hemmen) und durch Induktion einer DNA-Schädigung.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt auch die Synthese der neu entwickelten Verbindungen, um gleichzeitig die EGFR-TK und genomische DNA anzusteuern, was das Potenzial zeigt, eine Vielzahl von Krankheitszuständen effizienter zu behandeln als mit einer getrennten Verabreichung jeder Zielverbindung.
  • Das "Kombiziel"-Konzept fordert, dass ein Molekül, das als "Kombimolekül" (C-Molekül) bezeichnet wird mit binären den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) ansteuernden Eigenschaften und DNA schädigenden Eigenschaften und zusätzlich mit der Fähigkeit, zu einem weiteren EGFR-Inhibitor hydrolysiert zu werden, eine längere antiproliferative Aktivität in Zellen, die EGFR überexprimieren, induzieren sollte.
  • Wenn nicht anders definiert, haben die wissenschaftlichen und technologischen Ausdrücke und die Nomenklatur, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie sie allgemein von einem Fachmann auf diesem Gebiet verstanden wird.
  • Die Terminologie "cytotoxischer Anteil" bzw. "cytotoxische Einheit", wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das den Zelltod induziert.
  • Die Terminologie "cytostatischer Anteil" bzw. "cytostatische Einheit", wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das das Zellwachstum blockiert, ohne den Zelltod zu verursachen.
  • Die Terminologie "Kombimolekül", wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf ein biologisch aktives Molekül mit gemischten oder mehreren Zielen. Es kann viele Ziele ansteuern, wobei es zu Substanzen abgebaut wird, die auch bioaktiv sind.
  • Die Kombiziel-Strategie soll die Signalübertragung hemmende Mechanismen für Rezeptor-TK-Inhibitoren mit den cytotoxischen Wirkungen von DNA schädigenden Fragmenten in einem einzigen Mittel, das als Kombimolekül bezeichnet wird, kombinieren. Dieses Kombimolekül wird dazu entwickelt, um (a) die Rezeptor-TK selbst zu hemmen und (b) bei Hydrolyse in einen weiteren Inhibitor der gleichen Rezeptor-TK und eine DNA schädigende Molekülart umgewandelt zu werden. Dieses Prinzip führt einfach zu einem Rezeptor-affinen TZ-I, das einen weiteren Inhibitor I/+ ein cytotoxisches Molekül (TZ) (Schema 2) erzeugen kann.
  • Figure 00050001
    Schema 2
  • Eine Verbindung wie SMA41 zeigt zwei distinkte strukturelle Eigenschaften: (a) eine 1,2,3-Triazenbindung, das Pharmacophor der aktiven Metaboliten von Dacarbazine oder TEM (einem DNA schädigenden Mittel) und (b) eine 4-Anilinochinazolineinheit, das Pharmacophor der potenten Chinazolinklasse von EGFR-7K-Inhibitoren, die nun klinische Versuche durchlaufen (24).
  • Wie vorher in Schema 1 gezeigt, ist es bekannt, dass 3-Alkyl-1,2,3-triazene, wie TEM (von dem gezeigt wurde, dass es klinische Aktivität bei der Behandlung fester Tumoren, wie Glioma und malignen Melanoma hat und von dem gezeigt wurde, dass es signifikant inaktiv in Mer+-Zellen ist) oder sein Metabolit MTIC, unter hydrolytischen Bedingungen zu einem aromatischen Amin (siehe AIC, Schema 1) und einer Alkyldiazoniummolekülart (z.B. Methyldiazonium) heterolysieren. Wesentliche Hinweise deuten darauf hin, dass die Alkylierung der DNA an der Position O-6 von Guanin der cytotoxischen Läsion entspricht, die durch 3-Methyl- oder 3-(2-Chlorethyl)-1,2,3-triazene induziert wird (23).
  • Mer+-Zellen, die erhöhte Anteile an MGMT, einem Enzym, das die O6-Alkylguaninläsion reparieren kann, exprimieren, zeigen eine signifikante Resistenz gegenüber der Wirkung von alkylierenden Mitteln, wie TEM oder seinem Metaboliten MTIC (25).
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt Moleküle, die erzeugt werden, indem der Alkyltriazenanteil an die Position 6 des Chinazolinheterocyclus angehängt wird. Basierend auf dem Mechanismus der hydrolytischen Spaltung von 1,2,3-Triazenen und auf dem SAR von Chinazolinen wurde SMA41 synthetisiert, um (a) einen bekannten kompetitiven Inhibitor der ATP-Bindungsstelle von EGFR, der im Folgenden als SMA52 bezeichnet wird, und (b) die DNA schädigende Methyldiazoniummolekülart freizusetzen (Schema 2).
  • Erste Hinweise auf die Fähigkeit eines gemischten auf EGFR/DNA gerichteten Moleküls, das einen 3-Methyl-1,2,3-triazen-Anteil, der an die Position 6 eines 4-Anilinochinazolin-Anteils angehängt ist, enthält, wurden kürzlich berichtet (26). Von der Verbindung (SMA41) wurde gezeigt, dass sie selbst gemischte EGFR/DNA-ansteuernde Eigenschaften besitzt (IC50-kompetitive Bindung = 0,2 μM) und es wurde erläutert, dass sie zu einem weiteren Inhibitor (SMA52) abgebaut wird (IC50-kompetitive Bindung = 1,0 μM). Die Auswahl von 3-Alkyl-1,2,3-triazenen als DNA alkylierende Einheit wurde hauptsächlich durch die kleine Größe inspiriert und durch ihre Fähigkeit, zu einem aromatischen Amin und einer Alkyldiazoniummolekülart zu heterolysieren, die Zellen töten kann, indem die DNA an Position 6 von Guanin alkyliert wird (27). Im Vergleich zu Temozolomid (TEM), einem cyclischen Wirkstoff des Monoalkyltriazens 5-(3-Methyltriazen-1-yl)imidazol-4-carboxamid (MTIC) (28), wurde gezeigt, dass die Wirksamkeit von SMA41 der klassischen Kombination aus SMA52 und TEM bei equitoxischen Dosen überlegen war. Während SMA41 eine signifikante EGFR-TK hemmende Aktivität hat, besitzt das stabile Molekül, das es freisetzt (SMA52), nur eine schwache EGFR-TK hemmende Aktivität (IC50 = 1,0 μM).
  • Da der Abbau von TZ-I zu einem stabilen Inhibitor führt, der länger im Zellmedium verbleibt, wird angenommen, dass die Wirksamkeit des letzteren eine kritische Rolle in der antiproliferativen Gesamtaktivität spielen kann. In einem Versuch, ein TZ-I zu erzeugen, das ein I erzeugen kann mit einer stärkeren Affinität als SMA52, wurde die Anilinomethylgruppe durch einen weniger sperrigen Chlorsubstituenten ersetzt, was ein TZ-I mit der Bezeichnung BJ2000 erzeugte (Schema 2). Es wurde beobachtet, dass dieses Kombimolekül (BJ2000) eine zweifach stärkere Affinität als SMA41 besitzt und ein I erzeugen kann, das eine fünffach stärkere Affinität als SMA52 besitzt.
  • Es wurde gezeigt, dass das Kombimolekül BJ2000 in einem Zellkulturmedium, das mit Serum ergänzt ist, ein I freisetzen kann, das als FD105 bezeichnet wird (Ausbeute 87%). Dieses Modell zeigte: 1) eine gemischte DNA schädigende und EGFR-phosphotyrosinhemmende Aktivität, 2) eine im Vergleich zu PDGF und Serum bevorzugte Hemmung des durch EGF induzierten Wachstums und 3) eine signifikant potentere DNA-Schädigung und Cytotoxizität in einem EGFR-Transfektanten im Vergleich zur Stammlinie. Was wichtiger ist, es wurde gezeigt, dass BJ2000 irreversibel die Hemmung der Autophosphorylierung induzierte, was Weg 4 von Schema 2 bestätigt und teilweise irreversibel das Zellwachstum 5 Tage nach Behandlung hemmte.
  • Der "Kombi-Ziel"-Ansatz basiert auf den in Schema 3 aufgeführten Gleichgewichten.
  • Figure 00070001
    Schema 3
  • Wie in Schema 3 dargestellt, diffundieren die extrazellulären Kombimoleküle (TZ-I') durch die Zellmembran in das Cytosol (siehe TZ-I). Wie vorher erwähnt, enthalten Kombimoleküle eine cytotoxische Komponente (TZ) und eine EGFR-hemmende Komponente (I' oder I). Sobald sie im Cytosol sind, können die Kombimoleküle entweder direkt an die EGFR-ATP-Bindungsstelle binden, um einen TZ-I-EGFR-Komplex zu schaffen (Weg 3), sie können zu einem cytotoxischen Molekül (TZ) und einem EGFR-TK-Inhibitormolekül (I) abgebaut werden (Weg 2) oder, noch wichtiger, sie können direkt EGFR alkylieren (Weg 4). Im letzteren Fall wird ein inaktivierter kovalent modifizierter irreversibel gehemmter Rezeptor (I-TZ-EGFR) gebildet. Wenn I seine Affiniät für den geschädigten Rezeptor verliert, wird davon ausgegangen, dass es freigesetzt wird, so dass es anschließend an eine weitere nicht geschädigte EGFR-ATP-Bindungsstelle binden kann, um I-EGFR zu liefern (Weg 7). Während TZ seine cytotoxische Aktivität ausübt durch Schädigung der DNA (siehe DNA-TZ), ist der erzeugte Inhibitor I dazu vorgesehen, das durch EGFR induzierte Wachstum zu hemmen durch Bindung an die EGFR-ATP-Bindungsstelle, um I-EGFR zu schaffen (siehe Weg 5). Die Blockade der Signalübertragung, die durch EGFR vermittelt wird, reguliert auch die DNA-Reparaturenzyme nach unten (29). Die kombinierten cytostatischen und cytotoxischen Wirkungen führen zu einer verbesserten antiproliferativen Aktivität des TZ-I-Kombimoleküls in stark EGFR-positiven Zellen. Im Gegensatz dazu werden in EGFR-defizienten Zellen (siehe EGFR(-))keine auf EGFR gerichteten wachstumshemmenden Wirkungen erwartet wegen der Abwesenheit eines Hemmziels für TZ-I und I. Diese Zellen sind daher weniger empfindlich für den insgesamt additiven oder synergistischen Doppelmechanismus der Wirkung der TZ-I-Moleküle. Drei kritische Parameter scheinen zur Selektivität eines TZ-I-Konjugats beizutragen: (a) die Stabilität des Konjugats, (b) die Affinität des Konjugats für den Rezeptor und (c) die Potenz des freigesetzten cytotoxischen Anteils I.
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf Molekülen mit einer Affinität für den EGFR und der Fähigkeit, DNA anzusteuern. Diese neuen Verbindungen besitzen die Fähigkeit, eine Vielzahl von Ereignissen einzuschalten, deren Kombination sich zu irreversiblen wachstumshemmenden Wirkungen addiert. Das erste Ereignis stellt die Wechselwirkung des sperrigen Konjugats mit dem Rezeptor dar, wohingegen das zweite Ereignis die hydrolytische Umwandlung des Konjugats in einen weniger sperrigen Inhibitor mit gleichzeitiger Erzeugung einer potenten DNA schädigenden Molekülart bildet.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthalten einen Anilinochinazolinkopf, an dem ein Alkylnitrosoharnstoffschwanz an Position 6 angehängt ist. Die Verbindungen wurden entwickelt, um bei Hydrolyse in die freien Aminochinazolinvorläufer (die potente Inhibitoren von EGFR sind) und einen DNA schädigenden Alkyldiazonium-Anteil umgewandelt zu werden. Außerdem wurden diese Verbindungen so entwickelt, dass sie eine verbesserte Aktivität für Tumorzellen beitragen, die gegenüber Mitteln, die die gleichen Pharmacophore enthalten, resistent sein können.
  • Die gleichen Prinzipien treffen wahrscheinlich für alle kombinierten Verbindungen zu, die aus einem Liganden für ein Protein, das an einem Zellproliferationssignal-Stoffwechselweg beteiligt ist, und einem DNA schädigenden Mittel aufgebaut sind. Der Ligand scheint nicht nur die Internalisierung des Kombimoleküls zu erleichtern, sondern auch die Signalleitung zu blockieren, die durch das Onkoprotein vermittelt wird und die intrazelluläre Konzentration der DNA schädigenden Fragmente zu erhöhen. Zusätzlich kann die Blockade der Signalübertragung die DNA-Reparaturenzyme herunterregeln, wodurch die cytotoxischen Wirkungen des DNA schädigenden Anteils verbessert werden. Andere Moleküle als EGFR [z.B. Her2-Genprodukt p185, Her3-, Her4-Genprodukte, von Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGFR), ber-abl-Tyrosinkinase, Fibroblastenwachstumsfaktor (FGFR), angiogener Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF), die Rezeptorfamilienmitglieder Flkl oder KDR, src-Familienmitglieder und andere Liganden als SMA52 (z.B. Chinazoline, Tyrphostine, Phenylaminopyrimidine, Pyridopyrimidine, Pyrrolopyrimidinderivate)] liegen auch im Schutzbereich der Erfindung.
  • Die Ausdrücke und Beschreibungen, die hier verwendet werden, sind bevorzugte Ausführungsformen, die nur zur Erläuterung angegeben sind und keine Beschränkungen irgendwelcher Variationen, die der Fachmann auf diesem Gebiet erkennen kann, wenn er die Erfindung durchführt, sein sollen.
  • Weitere Gegenstände, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich beim Lesen der folgenden nicht beschränkenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt eine Dosis-Wirkungs-Kurve der Hemmung von Poly(L-glutaminsäure-L-tyrosin, 4:1) durch FD137 unter Verwendung eines ELISA, um die kompetitive Bindung an der ATP-Stelle zu messen.
  • 2 erläutert einen Vergleich zwischen dem Ausmaß der DNA-Schädigung, die durch BCNU und FD137 induziert wird unter Verwendung eines alkalischen Einzelzellmikroelektrophorese-Komettests.
  • 3 zeigt ein HPLC-Chromatogramm der Teilumwandlung von FD137 in den Inhibitor FD110 nach Inkubation in serumhaltigem Medium bei 37°C.
  • 4 zeigt einen Vergleich zwischen den antiproliferativen Aktivitäten von FD137 und dem klinischen Wirkstoff BCNU bei AGT-exprimierenden Carcinoma der Vulvazelllinie A431 unter Verwendung eines 4-Tage-SRB-Tests.
  • 5a zeigt einen Vergleich zwischen den Wirkungen von SMA41, SMA52 und TEM auf das Wachstum von A431-Zellen unter Verwendung eines 3-Tage-SRB-Tests.
  • 5b zeigt einen Vergleich zwischen den Wirkungen von SMA41, SMA52 und TEM auf das Wachstum von A431 unter Verwendung eines Koloniebildungstests.
  • 5c zeigt eine Reihe von Dosis-Wirkungs-Kurven, die die antiproliferativen Wirkungen einer SMA52+TEM-Kombination in A431-Zellen zeigen unter Verwendung des SRB-Tests.
  • 6 zeigt einen Vergleich zwischen der Reversibilität der antiproliferativen Wirkungen von SMA41, SMA52 und TEM auf A431-Zellen nach kurzem 2-stündigem Kontakt und 3-tägiger Erholung oder kontinuierlichem 72-stündigem Kontakt unter Verwendung des SRB-B-Tests.
  • 7 zeigt eine einphasige exponentielle Abbaukurve, die den Abbau von SMA41 in RPMI-Medium, das mit 10% Serum ergänzt ist, bei 37°C beschreibt.
  • 8 zeigt ein Chromatogramm der Teilumwandlung von SMA41 in SMA52 in RPMI-Medium, das mit 10% Serum ergänzt ist, bei 37°C. Peak 1 zeigt SMA52 und Peak 2 zeigt SMA41.
  • 9 zeigt einen Vergleich der EGFR-TK-hemmenden Aktivitäten von SMA41, SMA52 und TEM in einem ELISA unter Verwendung von PGT als Substrat.
  • 10 zeigt einen Western Blot, der die Fähigkeit von SMA41 zeigt, durch EGF stimulierte EGRF-Autophosphorylierung in der A431-Zelllinie zu blockieren.
  • 11 zeigt einen Vergleich der durch SMA41 (11a), TEM (11b) und SMA52 (11c) nach 30-minütiger und 2-stündiger Wirkstoffexposition induzierten DNA-Schädigung unter Verwendung des alkalischen Komet-Tests.
  • 12 zeigt den Abbau von BJ2000 zu FD105 mit UV-Spektroskopie (A) und Reverse-Phase-HPLC-Analyse (B).
  • 13 zeigt die Selektivität von BJ2000 und FD105 für EGFR-TK (A); die Selektivität von BJ2000 und FD105 für c-src-Kinase (B) und die Selektivität von BJ2000 und FD105 für Insulinrezeptorkinase (C).
  • 14 zeigt die Hemmung von EGFR und PDGFR-Autophosphorylierung in A431-Zellen (A) und NIH3T3-Zellen (B) durch BJ2000.
  • 15 erläutert die reverse EGFR-Autophosphorylierung in Gegenwart von BJ2000, FD105 oder TEM in A431-Zellen.
  • 16 zeigt die Wirkung von FD105 und BJ2000 auf die durch Wachstumsfaktoren stimulierte Proliferation bei NIH3T3HER14-Zellen: FD105 + (EGF, TGFα oder PDGF) (A); BJ2000 + (EGF, TGFα oder PDGF) (B); FD105 oder BJ2000 + Serum (C).
  • 17 zeigt die Reversibilität der antiproliferativen Wirkung von BJ2000 (A), FD105 (B) und TEM (C) in A431-Zellen.
  • 18 ist ein Western Blot, der die Wirkung von BJ2000 auf die MAPK-Aktivierung in A431-Zellen erläutert.
  • 19 zeigt eine grafische quantitative Auswertung der DNA-Schädigung unter Verwendung des alkalischen Komet-Tests. Die DNA-Schädigung wurde in A431-, NIH3T3- und NIH373HER14-Zellen nachgewiesen, die FD105 (A) und BJ2000 (B) 30 Minuten lang ausgesetzt waren.
  • 20 erläutert die cytotoxische Wirkung von TEM (A), BJ2000 (B) und FD105 (C) in NIH3T3- und NIH373HER14-Zellen.
  • 21 ist ein Western Blot, der die Wirkung von FD137 (A) und BCNU (B) auf die Hemmung der durch EGF stimulierten EGFR-Autophosphorylierung in A431-Zellen erläutert.
  • 22 zeigt die Hemmung der durch Heregulin stimulierten Phosphorylierung des HER2-Genprodukts p185neu durch BJ2000 in der MDA-MB453-Brustkrebszelllinie.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung umfasst eine Reihe neuer chemischer Mittel, die die durch EGFR vermittelte Signalübertragung blockieren können und DNA schädigen können, was das Potenzial zeigt, eine Vielzahl von Krankheitszuständen zu behandeln, an denen EGFR und Familienmitglieder, wie HER2-, HER3- und HER4-Genprodukte beteiligt sind.
  • Die neuen chemischen Mittel werden dargestellt in den Formeln I und II und zeigen eine Blockierung der durch EGFR vermittelten Signalübertragung und verursachen eine DNA-Schädigung. Es wurde gefunden, dass Verbindungen der Formel I (R1 = Me, Et, Chlorethyl; Z = NO, H; R2 = H, Me, Et, Chlorethyl, Hydroxyethyl; X = Cl, Br, I, Methyl) und Formel II (R1 = Me, CH2OY (Y = H, Acyl, Thiophenol), Acyl,
    Figure 00100001
    MeOCH2CH2-; R2 = H, Me; X = Cl, Br, I, Methyl) gemischte EGFR-TK und DNA ansteuernde Eigenschaften haben und überlegene antiproliferative Eigenschaften im Vergleich zu ihren klinischen Gegenstücken TEM oder BCNU haben.
  • Figure 00100002
    Formel I
  • Figure 00100003
    Formel II
  • Unten ausgeführt ist ein bevorzugtes Syntheseschema zur Herstellung der Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Synthesestufen sind nur als Beispiel angegeben. Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt sofort alternative Synthesewege und Variationen, die eine Vielzahl von Derivaten der in Formel I und II dargestellten Verbindungen erzeugen können.
  • Beispiel 1
  • Verfahren zur Herstellung von Anilinochinazolinen
  • Eine Reaktionsmischung, die aus 2-Amino-5-nitrobenzonitril 1, Ameisensäure und Schwefelsäure zusammengesetzt war, wurde erhitzt, was die cyclische Verbindung 2 lieferte. Das Zwischenprodukt 3 wurde nach einer Reaktion mit Phosphorpentachlorid erhalten und wurde dann weiter umgesetzt mit 3-Toluidin, was Nitroanilinochinazolin 4 lieferte. Das gewünschte Aminoanilinochinazolin 5 wurde schließlich über eine Hydrierung erhalten (Schema 4).
  • Figure 00110001
    Schema 4
  • Beispiel 2
  • Verfahren zur Synthese einer ersten Reihe von Nitrosoharnstoffkombimolekülen
  • Aminoanilinochinazolin 5 wurde mit einem Alkylisocyanatderivat versetzt, was die entsprechenden Harnstoffderivate 6 (FD-89) und 8 (FD-141) ergab, die anschließend unter Verwendung von NOBF4 in Acetonitril nitrosyliert wurden, was die Nitrosoharnstoffe 7 (FD-94) und 9 (FD-143) lieferte.
    Figure 00120001
    Schema 5 Beispiel 3 Verfahren zur Synthese einer zweiten Reihe von Nitrosoharnstoffkombimolekülen
    Figure 00130001
    Schema 6
  • Um die mögliche Bildung von Isocyanaten durch hydrolytische Spaltung des Ureidoanteils zu vermeiden, die bei den Derivaten vom Typ 7 und 9 auftreten könnte, wurden die N3-methylierten Analoga 13 und 15 synthetisiert. Standardmethodologie wurde angewendet für die Synthese von Aminoanilinochinazolin 11, das im Folgenden als FD110 bezeichnet wird. Kurz gesagt wurde Aminanilinochinazolin 5 mit Ethylchlorformiat behandelt, was das Carbamatderivat 10 lieferte, das dann mit LiAlH4 zu FD110 reduziert wurde.
  • Chinazolin 11 wurde mit einem Alkylisocyanatderivat umgesetzt, was die entsprechenden Harnstoffderivate 12 (FD-127) und 14 (FD-145) ergab, die anschließend unter Verwendung von NOBF4 in Acetonitril nitrosyliert wurden, was die Nitrosoharnstoffe 13 (FD-137) und 15 (FD-147) ergab. HPLC-Studien der Zersetzung von FD137 zeigten, dass es bei Hydrolyse FD110 regenerieren konnte.
  • Beispiel 4
  • Detaillierte Synthese von FD-137
  • 6-N-Methylaminochinazolin 11 (0,4 g, 1,5 mmol) wurde in Pyridin (3 ml) unter Argon bei 0°C gelöst. Nach 15 Minuten wurde 2-Chlorethylisocyanat (0,13 ml, 1,1 Äq.) zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht gerührt und 5 n HCl zugegeben. Der entstehende Niederschlag wurde filtriert, mit Dichlormethan gewaschen und weiter im Vakuum getrocknet, was den N-(2-Chlorethyl)-N'-methyl-N'-(4-m-tolylaminochinazolin-6-yl)harnstoff 12 als weißes Pulver lieferte (0,27 g, 48% Ausbeute):
    Schmelzpunkt 150-151 °C (Zers.);
    1H-NMR (DMSO) δ: 9,61 (s, 1H, NH), 8,56 (s, 1H, H2), 8,45 (s, 1H, H5), 7,75 (d, 1H, H7), 7,65 (d, 2H, H8), 7,24 (d, 2H, J = 8 Hz, H6', H2'), 6,95 (d, 1H, J = 8 Hz, H4'), 6,63 (t, 1H, J = 8 Hz, H5'), 3,57 (m, 2H, CH2), 3,30 (s, 3H, NCH3), 3,27 (m, 2H, CH2), 2,33 (s, 3H, Anilin CH3);
    13C-NMR 158,4, 156,4, 143,2, 140,0, 139,2, 134,0, 130, 126,0, 124,0, 120,8, 120,4, 116,8, 44,0, 43,2, 37,6, 21,6;
    FABMS M+1 (1%), 369 (25), 263 (23), 154 (100), 136 (76).
  • Der Harnstoff 12 (0,215 g, 0,6 mmol) wurde in Acetonitril (1 ml) und Essigsäure (0,035 ml, 1 Äq.) bei 0°C unter Argon gelöst. Nach 15 Minuten wurde NOBF4 (0,102 g, 1,5 Äq.) zugegeben und die entstehende rote Lösung 4 Stunden bei 0°C gerührt. Das Lösungsmittel wurde eingedampft und gesättigtes NaHCO3 (15 ml) wurde auf Eis zugegeben. Nach der Extraktion der entstehenden trüben Lösung wurde die organische Phase entfernt, über wasserfreiem Kaliumcarbonat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der entstehende fahlgelbe Rückstand wurde auf Silicagel gereinigt unter Verwendung von 1% Triethylamin in Ethylacetat als Elutionsmittel, was N-(2-Chlorethyl)-N'-methyl-N'-(4-m-tolylaminochinazolin-6-yl)-N-nitrosoharnstoff (FD137) als fahlgelbes Pulver ergab (0,07 g, 30%):
    Schmelzpunkt 150-151°C (Zers.)
    1H-NMR (DMSO) δ: 9,80 (s, 1H, NH), 8,60 (s, 1H, H2), 8,55 (s, 1H, H5), 7,82 (d, J = 8 Hz, 1H, H7), 7,76 (d, 1H, J = 8 Hz, H8), 7,72 (t, 1H, J = 8 Hz), 7,60 (d, 2H, J = 8 Hz, H6', H2'), 6,95 (d, 1H, J = 8 Hz, H4'), 4,13 (m, 2H, CH2), 3,70 (m, 2H, CH2), 3,60 (s, 3H, NCH3), 2,35 (s, 3H, Anilin CH3);
    13C-NMR 155,8, 142,5, 139,3, 134,0, 131,8, 131,1, 129,2, 125,9, 122,6, 119,1, 118,3, 115,5, 42,2, 41,7, 40,7, 21,8;
    FABMS M+1 (1%) 399, 263 (25), 54 (100), 136 (82).
  • Beispiel 5
  • Synthese des Kombitriazens SMA41
  • Zu einer Lösung von 6-Amino-4-[(m-tolyl)amino]chinazolin 5 (1 g, 4 mmol) in Acetonitril (50 ml) wurden 5 ml Essigsäure zugefügt. Die Mischung wurde 1 Stunde lang auf 0°C gehalten und danach eine Suspension von NOBF4 (2 Äq.) in Acetonitril tropfenweise zugegeben. Methylamin wurde dann zugefügt. Die rötliche Lösung wurde durch Zugabe von gesättigtem Natriumcarbonat neutralisiert, bis sich eine Zweiphasenmischung bildete. Ethylacetat (200 ml) wurde zugegeben und die wässrige Phase entfernt. Die entstehende fahlbraune Ethylacetatlösung wurde über wasserfreiem Kaliumcarbonat getrocknet und im Vakuum zu einem braunen Öl eingedampft, das in einem minimalen Volumen des gleichen Lösungsmittels wieder aufgelöst wurde. Hexan wurde in Anteilen zugegeben, bis sich ein bestehender fahlbrauner Niederschlag bildete. Die Mischung wurde filtriert und der entstehende Niederschlag durch Filtration gesammelt, im Vakuum getrocknet, was das Monoalkyltriazen SMA41 als fahlbraunes Pulver lieferte (0,7, 60%):
    Schmelzpunkt 75-80°C (Zers.)
    1H-NMR (DMSO) δ: 10,67 (br q, 1H, NHCH3), 9,74 (s, 1H, NH), 8,51 (s, 1H, H2), 8,47 (s, 1H, H5), 7,9 (d, 1H, J = 9, H7), 7,70 (br s d, 3H, H2', H6', H8, Überlappung), 7,24 (t, 1H, J = 7,5 Hz, H5'), 6,90 (d, 1H, J = 7,5 Hz, H4'), 3,07 (d, 3H, J = 4, HNCH3), 2,31 (s, 3H, ArCH3);
    13C-NMR 158,4, 154,1, 149,9, 148,7, 140, 138,1, 129,4, 128,879, 125,3, 124,8, 123,7, 123,4, 120,0, 116,4, 115,3, 31,3, 21,9;
    FABMS M+1 (1%) 293 (43), 250 (14), 234 (12).
  • Beispiel 6
  • Mischzieleigenschaften
  • (i) Hydrolytische Umwandlung des sperrigen Konjugats in einen weniger sperrigen Inhibitor
  • Die Fähigkeit von FD137, den intakten Inhibitor zu erzeugen, wurde mit HPLC-Analyse gezeigt, die das Erscheinen eines Peaks entsprechend dem bekannten Inhibitor 11 (FD110) zeigte, nachdem FD137 in einem Zellkulturmedium über Nacht zersetzt worden war.
  • (ii) Wechselwirkungen des Konjugats mit dem EGF-Rezeptor
  • Die Fähigkeit der Kombimoleküle, EGFR-TK-Aktivität zu blockieren, wurde mit einem ELISA-Test unter Verwendung von Poly(L-glutaminsäure-L-tyrosin, 4:1)-PGT als Substrat und von im Handel erhältlichem EGFR bestimmt.
  • Nunc MaxiSorp-96-Napfplatten wurden über Nacht bei 37°C mit 100 μl/Napf 0,25 mg/ml PGT in PBS inkubiert. Überschüssiges PGT wurde entfernt und die Platten wurden dreimal mit Tween 20 (0,1%) in PBS gewaschen. Die Kinasereaktion wurde wie vorher beschrieben durchgeführt unter Verwendung von 15 ng/Napf EGFR, das aus A431-Zellen (30) durch Affinität gereinigt worden war (großzügige Spende von Pfizer Inc., NJ und kommerziellen Zulieferern von BIOMOL, Plymouth Meeting, CA). Die Verbindung wurde zugegeben und die Phosphorylierung durch Zugabe von ATP (20 μM) gestartet. Nach 8 Minuten bei Raumtemperatur unter konstantem Schütteln wurde die Reaktion beendet durch Absaugen der Reaktionsmischung und viermaliges Spülen der Platte mit Waschpuffer (Tween 20 (0,1%) in PBS). Phosphoryliertes PGT wurde nach 25-minütiger Inkubation mit 50 μl/Napf HRP-konjugiertem PY54-Antiphosphotyrosin-Antikörper, verdünnt auf 0,2 μg/ml in Blockierungspuffer (3% BSA; 0,05% Tween 20 in PBS) nachgewiesen. Der Antikörper wurde durch Absaugen entfernt und die Platten wurden viermal mit Waschpuffer gewaschen. Die Signale wurden entwickelt durch Zugabe von 50 μl TMB-Peroxidasesubstrat (Kierkegaard und Perry Laboratories, Gaithersberg, MD) pro Napf. Nachdem sich eine blaue Farbe entwickelt hatte, wurden 50 μl H2SO4 (0,09 M) pro Napf zugegeben und die Platten bei 450 nm unter Verwendung eines Bio-Rad ELISA-Lesegeräts (Modell 2550) abgelesen.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass das Kombimolekül FD137 EGFR-TK (IC50 ~ 1 μM) in dosisabhängiger Weise hemmt (1). Es ist bemerkenswert, dass die EGFR-TK-Bindungsaffinität für FD137 geringer ist als die des freien Liganden 11 (FD110) (IC50 ~ 0,05 μM). Dies zeigt die Fähigkeit eines rezeptoraffinen Konjugats TZ-I (z.B. FD137), das zu einem weniger sperrigen Inhibitor I(FD110) abgebaut werden kann, der eine stärkere Affinität für den gleichen Rezeptor besitzt (wie für SMA41 in Schema 2 gefordert).
  • (iii) Erzeugung einer potenten DNA schädigenden Molekülart
  • Die DNA schädigenden Eigenschaften von FD137 wurden mit dem Komet-Test bei A431-Carcinoma der Vulvazelllinie, die EGFR überexprimiert und das DNA-Reparaturenzym O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase (AGT) coexprimiert, bestimmt. Zellen, die AGT exprimieren, sind resistent gegenüber BCNU. Die Ergebnisse zeigen, dass FD137 einen dosisabhängigen Anstieg von DNA-Einzelstrangbrüchen in diesen Zellen erzeugen könnte. Dies zeigt, dass FD137 erfolgreich die Zellresistenz für DNA alkylierende Mittel überwinden kann.
  • (iv) Alkalischer Komet-Test zur quantitativen Auswertung der DNA-Schädigung
  • Eine modifizierte alkalische Komet-Testtechnik (31) wurde verwendet, um die DNA-Schädigung, die durch SMA41, SMA52 und TEM induziert wird, quantitativ auszuwerten. A431-Zellen wurden 30 Minuten oder 2 Stunden lang den Wirkstoffen ausgesetzt und mit Trypsin-EDTA geerntet. Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation gesammelt und wieder in PBS suspendiert. Die entstehende Zellsuspension wurde auf ungefähr 106 Zellen verdünnt und mit Agarose (1%) in PBS bei 37°C in einer Verdünnung von 1:10 vermischt. Die Gele wurden auf Gelbond-Streifen (Mandel Scientific, Guelph, Kanada) gegossen unter Verwendung von Gelgießkammern, wie vorher beschrieben (32), und dann sofort in Lysepuffer gestellt [2,5 M NaCl, 0,1 M Tetranatrium-EDTA, 10 mM Tris-Base, 1% (G/V) N-Laurylsarcosin, 10% (V/V) DMSO und 1% (V/V) Triton X-100]. Die Gele wurden, nachdem sie 30 Minuten lang auf Eis gehalten worden waren, vorsichtig mit destilliertem Wasser gespült und dann bei 37°C 60 Minuten lang in einen zweiten Lysepuffer [2,5 M NaCl, 0,1 M Tetranatrium-EDTA, 10 mM Tris-Base], der 1 mg/ml Proteinase K enthielt, eingetaucht. Danach wurden die Gele mit destilliertem Wasser gespült, in alkalischem Elektrophoresepuffer 30 Minuten bei 37°C inkubiert und mit 300 mA 60 Minuten lang elektrophoretisch aufgetrennt. Die Gele wurden anschließend mit destilliertem Wasser gespült und 30 Minuten lang in 1 M Ammoniumacetat gestellt. Sie wurden weiterhin 2 Stunden lang in 100% Ethanol eingeweicht, über Nacht getrocknet und anschließend mit SYBR Gold (1/10000 Verdünnung der von Molecular Probes, OR gelieferten Vorratslösung) 20 Minuten lang angefärbt. Für die Auswertung der Kometen wurde die DNA-Schädigung beurteilt unter Verwendung des Tail-Momentparameters (d.h. das Produkt des Abstands zwischen den Baryzentren von Kopf und Schwanz des Kometen. Minimal 50 Zellkometen wurden für jede Probe analysiert unter Verwendung der ALKOMET-v3.1-Software und die Werte sind Durchschnittswerte für die Tail-Momente für die gesamte Zellpopulation).
  • Die Ergebnisse zeigen, dass FD137 einen dosisabhängigen Anstieg von DNA-Einzelstrangbrüchen in diesen Zellen erzeugen könnte, was darauf hindeutet, dass FD137 zusätzlich zu seiner Fähigkeit, EGFR-Tyrosinkinase zu hemmen, erhebliche DNA schädigende Eigenschaften besitzt (2). Im Gegensatz zu BCNU scheint das Kombimolekül FD137 ein mildes alkylierendes Mittel zu sein, was DNA-Läsionen in geringerem Ausmaß als BCNU erzeugt (2).
  • Diese zwei Versuchslinien (EGFR-TK-Hemmung) und Komet-Test zeigen, dass FD137 gemischte EGFR-DNA-Zieleigenschaft besitzt.
  • (v) Wirksamkeit zur Hemmung des Tumorzellwachstums im Vergleich zu dem klinischen Leitwirkstoff BCNU
  • Alle wachstumshemmenden Aktivitäten wurden ausgewertet unter Verwendung des SRB-Tests (33). Kurz gesagt wurden nach Wirkstoffbehandlung Zellen unter Verwendung von 50 μl kalter Trichloressigsäure (50%) 60 Minuten lang bei 4°C fixiert, fünfmal mit Leitungswasser gewaschen und 30 Minuten bei Raumtemperatur mit SRB (0,4%) gelöst in Essigsäure (0,5%) gefärbt. Die Platten wurden fünfmal mit 1% Essigsäure gespült und dann an der Luft trocknen gelassen. Der entstehende gefärbte Rückstand wurde in 200 μl Tris-Base (10 mM) gelöst und die optische Dichte für jeden Napf bei 540 nm unter Verwendung eines Bio-Rad-Mikroplattenlesegeräts (Modell 2550) abgelesen. Jeder Punkt bedeutet den Durchschnitt von mindestens zwei unabhängigen Versuchen, die dreifach durchgeführt wurden.
  • Unter Verwendung eines 4-Tage-Sulforhodamin-B-Tests wurde gezeigt, dass FD137 (IC50, 0,8 μM) bei der resistenten AGT exprimierenden A431-Zelllinie, die auch hohe Anteile an EGFR coexprimiert (siehe 1) und ihrem Liganden TGFα, der ein aggressives autokrines kontrolliertes Wachstum induziert, 50-fach potenter ist als der klinische Wirkstoff BCNU (IC50, 40 μM). Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit einer Nitrosoharnstoffverbindung, die Mischzieleigenschaften besitzt bei der Hemmung des Tumorzellwachstums in einem Sulforhodamin-B-Test. Vielleicht aufgrund der Fähigkeit von FD137 und seines Metaboliten FD110, die durch TGFα vermittelte Signalgebung in diesen Zellen zu blockieren, können die DNA-Reparaturenzyme herabgeregelt werden, die DNA-Läsionen, die durch das N-Nitroso-N-2-chlorethyl-Fragment induziert werden, das nach der Hydrolyse von FD137 erzeugt wird, umkehren können. Dies kulminiert in einer verbesserten Wirksamkeit des Kombimoleküls im Vergleich zu seinem klinischen Nitrosoharnstoff-Gegenpart BCNU. Die verbesserte Wirksamkeit von FD137 kann auch begründet werden durch eine zusätzliche oder synergistische Wirkung, die durch den binären Mechanismus der Wirkung erzeugt wird: Cytostatische Wachstumshemmung verbunden mit der Blockade der durch EGFR vermittelten Signalgebung und Cytotoxizität, die durch DNA-Läsionen induziert wird.
  • Zusätzlich blockiert das Kombimolekül FD137 im Gegensatz zu BCNU die EGFR-Autophosphorylierung in A431-Zellen in dosisabhängiger Art und Weise (21).
  • Beispiel 7
  • Wirkstoffbehandlung
  • SMA41 und SMA52 wurden in unseren Laboratorien mit bekannten Verfahren synthetisiert (34). TEM, der Leitwirkstoff der triazenhaltigen Imidazotetrazinklasse, ist nun in den USA zur Behandlung von Hirntumoren zugelassen und in Europa zur Behandlung sowohl von Glioma als auch Hirntumoren (siehe TEM, Schema 1). TEM wurde von Shering-Plough Inc. (Kenilworth, NJ) bereitgestellt. In allen Tests wurden Kombimoleküle oder TEM in DMSO gelöst und anschließend in sterilem RPMI-1640-Medium, das 10% fötales Rinderserum enthielt (Life Technologies, Burlington, Kanada) direkt vor der Behandlung der Zellkulturen verdünnt. Bei allen Tests überschritt die Konzentration von DMSO niemals 0,2% (V/V).
  • BJ2000 und FD105 wurden in unseren Laboratorien mit bekannten Verfahren synthetisiert (34). Temozolomid wurde von Shering-Plough Inc. (Kenilworth, NJ, USA) bereitgestellt. In allen Tests wurde der Wirkstoff in DMSO gelöst und anschließend in sterilem RPMI-1640, das 10% fötales Rinderserum enthielt (FBS) (Wisent Inc., St-Bruno, Kanada), oder in DMEM, das 10% Rinderkalbserum enthielt (GIBCO BRL, Burlington, Kanada) direkt vor der Behandlung der Zellkulturen gelöst. Bei allen Tests überschritt die Konzentration von DMSO nie 0,2% (V/V).
  • Beispiel 8
  • Zellkultur
  • Die in dieser Studie verwendeten Zelllinien, die das Humanepidermoidkarzinom von Vulva-A431-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, RF33613) erhalten. Die A431-Zelllinie wurde in einer Monolayerkultur bei 37°C in befeuchteter Umgebung von 5% CO2-95% Luft gehalten. Die Kulturen wurden in RPMI-1640, das mit fötalem Rinderserum (10%), Penicillin (50 U/ml) und Streptomycin (50 mg/ml) (Life Technologies, Burlington, Kanada) ergänzt war, gehalten. Die Zellen wurden bei logarithmischem Wachstum gehalten, indem mit einer Trypsin-EDTA-Lösung, die 0,5 mg/ml Trypsin und 0,2 mg/ml EDTA enthielt, geerntet wurde und wieder ausplattiert wurde vor dem Zusammenfließen. Bei allen Tests wurden die Zellen 24 Stunden vor der Wirkstoffverabreichung plattiert. Die Mausfibroblasten NIH3T3 und NIH3T3HER14 (NIH3T3-Zellen, die stabil mit EGFR-Gen transfiziert sind) waren großzügige Geschenke von Dr. Moulay Aloui-Jamali vom Montreal Jewish General Hospital. NIH3T3- und NIH3T3HER14-Zellen wurden in DMEM, das mit 10% Rinderkalbserum und Antibiotika ergänzt war, gehalten.
  • Beispiel 9
  • Wachstumshemmstudien
  • (i) Vergleich mit freiem Inhibitor SMA52 und TEM
  • Der SRB-Test wurde verwendet, um die antiproliferative Aktivität verschiedener Verbindungen bei menschlichen Stachelzellcarcinoma der Vulva-Zelllinie A431 auszuwerten, bei denen gezeigt wurde, dass die EGFR-konstitutive Aktivität, die sich durch Tyrosinphosphorylierung unter Basalbedingungen widerspiegelt, empfindlich ist für antiproliferative Mittel, die EGFR in vitro oder in vivo ansteuern (35). Zusätzlich exprimiert diese Zelllinie nachweisbare Anteile des DNA-Reparaturenzyms MGMT (36). Der MGMT-Status unserer A431-Zelllinie wurde auch mit Western Blot bestätigt unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Anti-MGMT-Antikörpers (Pharmingen International, Toronto, Kanada) (Daten nicht gezeigt). Nach 72 Stunden kontinuierlichem Kontakt zeigten die in 5a dargestellten Ergebnisse, dass bei der MGMT-profizienten Zelllinie A431 SMA41 1,8-fach potenter ist (IC50 = 36 μM) als der Metabolit SMA52 allein (IC50 = 59 μM) und 10-fach potenter als TEM (IC50 = 366 μM).
  • Kolonogene Tests wurden durchgeführt wie vorher beschrieben (37). Kurz gesagt wurden Zellen auf eine Dichte von 500 Zellen/Napf plattiert und kontinuierlich jedem Wirkstoff 6 Tage lang ausgesetzt. Die Kolonien wurden mit Methanol (100%) fixiert und mit Methylenblau (0,5%) gefärbt, wonach sie mit dem SynGene-GeneTools-Koloniezähl-Softwareprogramm (Cambridge, GB) gezählt wurden. Nur Kolonien mit Pixelflächen von 4 oder mehr wurden gezählt. Die Daten sind Mittelwerte und SDs von zwei unabhängigen Bestimmungen.
  • Wie in 5b gezeigt, war die antiproliferative Aktivität von SMA41 im gleichen Bereich wie die von SMA52 (IC50 SMA41 4 μM, IC50 SM52 3,7 μM), aber signifikant größer als die von TEM, das keine Aktivität über den gesamten Dosisbereich zeigte.
  • (ii) Vergleich mit einer Kombination aus SMA52 + TEM
  • Für die Kombination aus SMA52 + TEM wurden die Wirkstoffe in einem molaren Verhältnis von 1:7 (SMA52/TEM) vermischt, seriell verdünnt und den Monolayers 72 Stunden lang zugefügt. Die Art der Wirkstoffwechselwirkungen wurde bestimmt unter Verwendung von Gleichung 1, wobei CI50 > 1, = 1 oder < 1 Antagonismus, Additivität bzw. Synergismus bedeutet (38). Gleichung 1
    Figure 00190001
  • Um die antiproliferativen Vorteile einer Kombination von EGFR- und DNA-Zielmechanismen in einem einzelnen Molekül zu zeigen, wurde die kombinierte Wirkung von SMA52 (unabhängig synthetisiert) mit der von TEM untersucht unter Verwendung des SRB-Tests (5c). Unter Verwendung von Gleichung 1, um die Art der Wechselwirkungen zwischen diesen zwei Wirkstoffen zu bestimmen, zeigten die Ergebnisse, dass der Kombinationindex bei 50% Wirkung (CI50) für SMA52 + TEM ungefähr 0,6 ist, was auf eine subadditive Wechselwirkung hindeutet. Unter identischen Bedingungen war die antiproliferative Aktivität des Kombimoleküls SMA41 4-fach stärker als die der Zwei-Wirkstoff-Kombination, was darauf hindeutet, dass die Kombination der zwei Wirkungsmechanismen in einem einzigen Kombimolekül einen signifikanten pharmakologischen Vorteil liefert.
  • (iii) Reversibilität der antiproliferativen Aktivität von SMA41
  • Zellmonolayers wurden kontinuierlich verschiedenen Konzentrationen jeden Wirkstoffs 72 Stunden lang ausgesetzt. Bei kurzem Kontakt wurden sie mit jedem Wirkstoff 2 Stunden lang behandelt und 72 Stunden lang in wirkstofffreiem Medium sich erholen gelassen. Wenn die Zellen nur 2 Stunden lang behandelt worden waren und weiter in wirkstofffreiem Medium inkubiert worden waren, wurde ein fast vollständiger Verlust der Aktivität für SMA52 beobachtet (IC50 > 100 μM, 6b), was darauf hindeutet, dass es signifikante reversible wachstumshemmende Aktivitäten induzierte. Im Gegensatz dazu zeigte SMA41 eine signifikante Retention der Aktivität bei einer geringen Veränderung der IC50-Werte [IC50 (2 h) = 36 μM, IC50 (72 h) = -30 μM] 6a). Temozolomid war sowohl bei kurzem als auch kontinuierlichem Kontakt inaktiv (6c).
  • Beispiel 10
  • Abbau
  • SMA41 (1 mg) wurde in DMSO (500 μl) gelöst, zu RPMI mit 10% fötalem Rinderserum (2 ml) zugegeben und 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Proteine durch Zugabe von Acetonitril (3,5 ml) ausgefällt und der Überstand durch Zentrifugation gesammelt. Die Konzentration von SMA52, das durch den Abbau von SMA41 entstand, wurde berechnet unter Verwendung einer Standardkurve, die durch serielle Verdünnung von unabhängig synthetisiertem SMA52 erhalten worden war, das in serumhaltigem Medium unter identischen Bedingungen inkubiert worden war. HPLC-Analysen wurden durchgeführt mit einem Hewlett-Packard-1090-Flüssigchromatographen unter Verwendung einer Deltapak C4 15 μm 300 × 3,9 mm Säule (Reverse Phase), um die Produkte, die durch den Abbau von SMA41 entstanden, zu charakterisieren und quantitativ auszuwerten. Der Betriebsmodus war isokratisch und zwei Lösungen "A" (50% Acetonitril) und "B" (50% Wasser) wurden verwendet mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min und einem Injektionsvolumen von 5 μl. Unter diesen Bedingungen zeigten unabhängig synthetisiertes SMA52 und SMA41 Retentionszeiten von 11 bzw. 15 Minuten. Für die schnelle quantitative Auswertung der Metaboliten wurde ein weniger polares Acetonitril-Wasser-(70:30)-Elutionsmittel verwendet. Unter diesen Bedingungen zeigte SMA52 eine Retentionszeit von 7,49 Minuten. Für die LC-MS-Analyse des Abbaus von SMA41 wurde die Säule auf ein Spectra System P1500 HPLC, das mit einem Finnigan-LCQDUO-Massenspektrometer gekoppelt war, gegeben.
  • Die Halbwertszeit von SMA41 unter physiologischen Bedingungen wurde mit UV-Spektrophotometrie unter Verwendung eines Ultrospec-2000-Pharmacia-Biotech-Spektrophotometers untersucht. SMA41 wurde in einem minimalen Volumen von DMSO gelöst, mit RPMI-Medium, das mit 10% Serum ergänzt war, verdünnt und die Extinktionen wurden bei 340 nm in einer UV-Zelle, die mit einem zirkulierenden Wasserbad auf 37°C gehalten wurde, abgelesen. Die Halbwertszeit wurde mit einer Methode abgeschätzt, bei der eine einphasige exponentielle Abbaukurve unter Verwendung des GraphPad-Software-Pakets (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) erstellt wurde.
  • Es wurde gefunden, dass SMA41 signifikant stabil war mit einer t1/2 von ungefähr 30 Minuten in serumhaltigem Zellkulturmedium bei 37°C (7). SMA41 zersetzte sich fast ausschließlich zu SMA52 (8), dessen Struktur sowohl mit HPLC-Analyse des unabhängig synthetisierten SMA52 als auch LCMS-Analysen bestätigt wurden, die eine Masse von M+1 = 251 für den Chromatogramm-Peak zeigten, dessen Retentionszeit der von SMA52 entsprach. Die quantitative Auswertung dieses Peaks und die Berechnungen unter Verwendung von Standardkurven zeigten, dass SMA41 in einer Ausbeute von ungefähr 81% in SMA52 umgewandelt worden war.
  • Die Halbwertszeit von BJ2000 unter physiologischen Bedingungen wurde untersucht mit UV-Spektrophotometrie. BJ2000 wurde in einem minimalen Volumen von DMSO gelöst, mit RPMI 1640, das mit 10% FBS ergänzt war, verdünnt und die Extinktionen bei 340 nm in einer UV-Zelle, die mit einem zirkulierenden Wasserbad auf 37°C gehalten wurde, abgelesen. Die Halbwertszeit wurde mit einer Methode geschätzt, bei der eine Einphasen-Exponential-Abbaukurve unter Verwendung des GraphPad-Softwarepakets (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) erstellt wurde.
  • Die HPLC-Untersuchung der Umwandlung von BJ2000 in FD105 wurde durchgeführt, indem BJ2000 (625 μM) zu RPMI-1640 mit 10% FBS (2 ml) zugegeben wurde, woran sich unterschiedliche Inkubationszeiträume bei 37°C anschlossen. Proteine wurden danach durch Zugabe von Acetonitril (3,5 ml) ausgefällt und der Überstand durch Zentrifugation gesammelt. Die Konzentration von FD105, die durch den Abbau von BJ2000 entstand, wurde berechnet unter Verwendung einer Standardkurve, die durch serielle Verdünnung von unabhängig synthetisiertem FD105 erhalten worden war, das in serumhaltigem Medium unter identischen Bedingungen inkubiert worden war. HPLC-Analysen wurden durchgeführt an einem Hewlett-Packard-1090-Flüssigchromatographen unter Verwendung einer Waters C4 15 μm 300 × 3,9 mm Reverse-Phase-Säule, um die Produkte, die durch den Abbau von BJ2000 entstanden, zu charakterisieren und quantitativ auszuwerten. Der Betriebsmodus war isokratisch und zwei Lösungen "A" (53% Acetonitril) und "B" (47% Wasser) wurden verwendet mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min und einem Injektionsvolumen von 10 μl. Die Peaks wurden bei 250 nm detektiert. Unter diesen Bedingungen zeigten unabhängig synthetisiertes FD105 und BJ2000 Retentionszeiten von ungefähr 10,5 bzw. 15,2 Minuten.
  • Die Halbwertszeit von BJ2000, gemessen mit UV-Spektrophotometrie bei 340 nm, war bei 37°C 34 Minuten in RPMI-1640, das mit 10% FBS ergänzt war. Es ist jedoch anzumerken, dass die Extinktion bei dieser Wellenlänge eine frühe Sättigung bei hohen Extinktionseinheiten, z.B. 0,6, erreichte (12A). Die Halbwertszeitstudie wurde daher mit HPLC-Analyse durchgeführt, wodurch abnehmende und zunehmende Peaks, die dem Verschwinden von BJ2000 und dem Erscheinen von FD105 zugeordnet werden konnte, eindeutig überwacht werden konnten. Wie erwartet, wurde eine umgekehrte Beziehung beobachtet zwischen den Flächen der Peaks, die mit diesen zwei Molekülarten verbunden waren, mit einer beobachteten Halbwertszeit von 75 Minuten für BJ2000. Berechnungen basierend auf der Fläche pro Konzentration in der Standardkurve [Fläche = 2,796 × (Konzentration) – 38,65; R2 = 0,99] deuteten darauf hin, dass BJ2000 in einer Ausbeute von 87% nach 24 Stunden Inkubation in RPMI-1640, das mit 10% FBS ergänzt war, bei 37°C in FD105 umgewandelt worden war (12B).
  • Beispiel 11
  • Kinasetests für BJ2000
  • (i) EGFR-Kinasetest
  • Dieser Test ist ähnlich dem vorher beschriebenen. Nunc MaxiSorp-96-Napf-Platten wurden über Nacht bei 37°C mit 100 μl/Napf 25 ng/ml PGT in PBS inkubiert. Überschüssiges PGT wurde entfernt und die Platten wurden dreimal mit Waschpuffer (Tween 20 (0,1%) in PBS) gewaschen. Die Kinasereaktion wurde durchgeführt unter Verwendung von 4,5 ng/Napf EGFR, affinitätsgereinigt aus A431-Zellen (29). Die Verbindung wurde zugegeben und die Phosphorylierung durch Zugabe von ATP (20 μM) gestartet. Nach 8 Minuten bei Raumtemperatur unter konstantem Schütteln wurde die Reaktion gestoppt, indem die Mischung abgesaugt wurde und die Platten viermal mit Waschpuffer (Tween 20 (0,1%) in PBS) gespült wurden. Phosphoryliertes PGT wurde detektiert nach 25-minütiger Inkubation mit 50 μl/Napf HRP-konjugiertem PY20-Antiphosphotyrosin-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, CA), der auf 0,2 μg/ml in Blockierungspuffer (3% Rinderserumalbumin; 0,05% Tween 20 in PBS) verdünnt war. Der Antikörper wurde durch Absaugen entfernt und die Platte viermal mit Waschpuffer gewaschen. Die Signale wurden durch Zugabe von 50 μl/Napf 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin-(TMB)-Peroxidasesubstrat (Kierkegaard und Perry Laboratories, Gaithersberg, MD, USA) entwickelt. Nach Entwicklung der blauen Farbe wurden 50 μl H2SO4 (0,09 M) pro Napf zugegeben und die Platten bei 450 nm unter Verwendung eines Bio-Rad-ELISA-Lesegeräts (Modell 2550) abgelesen. Die Ergebnisse zeigen, dass das Kombimolekül BJ2000 EGFR-TK in einer dosisabhängigen Art und Weise hemmt (IC50 = 0,1 μM). Es ist bemerkenswert, dass die EGFR-TK-Bindungsaffinität von BJ2000 geringer ist als die des freien Liganden (FD105) (IC50 = 0,2 μM). Dies zeigt die Möglichkeiten eines rezeptoraffinen Konjugats TZ-I (z.B. BJ2000), das fähig ist zu einem weniger sperrigen Inhibitor I (FD105) abgebaut zu werden, der eine stärkere Affinität für den gleichen Rezeptor besitzt (wie für BJ2000 in Schema 2 gefordert).
  • (ii) c-Src- und Insulinkinasetests
  • Die Bedingungen für die c-src- und Insulinkinasetests waren wie die für den EGFR-Kinasetest mit der Ausnahme, dass 1 mM Manganchlorid dem Testpuffer zugegeben wurde und die endgültige ATP-Konzentration 100 μM war. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 50 μl einer 250 mM Lösung von EDTA vor dem Absaugen. In Versuchen, bei denen die Hemmung von EGFR mit c-src-Kinase oder Insulinrezeptor verglichen wurde, ersetzte in Baculovirus exprimiertes menschliches c-src (1,2 Einheiten/Napf, Upstate NY) oder die in Baculovirus exprimierte cytoplasmatische Domäne der Insulinrezeptor-β-Untereinheit (15 ng/ml, Biomol Research Laboratories Inc., USA) den EGFR. Als positive Kontrollen wurden PP1 (Biomol Research Laboratories Inc.), ein selektiver Inhibitor von c-src (IC50 = 170 nM) und HNPMA-(AM)3 (Biomol Research Laboratories Inc.), ein Inhibitor des Insulinrezeptors (IC50 = 100 μM) verwendet.
  • In einem kompetitiven EGFR-Bindungstest zeigte BJ2000 (IC50 = 0,1 μM) eine zweifach größere Bindungsaffinität als sein Metabolit FD105 (IC50 = 0,2 μM) für die ATP-Stelle von gereinigtem EGFR. Daher zeigten sowohl der Wirkstoff als auch die entsprechenden Prodrugs eine signifikante Affinität für EGFR. Wie vorher beobachtet, zeigte TEM keine Wirkung auf die Tyrosinkinaseaktivität dieses Rezeptors (IC50 > 100 μM) (13A). Weiterhin wurde die EGFR-Selektivität dieser beiden Mittel getestet durch Vergleich ihrer EGFR hemmenden Aktivitäten mit denen von anderen TKs, wie c-src und dem Insulinrezeptor. In ELISA-Tests blockierten BJ2000 und sein Metabolit FD105 die c-src-TK-Aktivität nicht noch übten sie irgendeine Wirkung auf den Insulinrezeptor TK im Bereich von 1 bis 100 μM aus, was auf die Selektivität dieser Mittel für EGFR hindeutet (13B und 13C).
  • Beispiel 12
  • Test zu der durch EGF induzierten Autophosphorylierung (SMA41 und SMA52)
  • Die Hemmung der Rezeptorautophosphorylierung in lebensfähigen Zellen wurde mit Antiphosphotyrosin-Western-Blots bestimmt. A431-Zellen wurden über Nacht bei 37°C in einer 6-Napf-Platte (1 × 106) mit 0,1% Serum 24 Stunden lang vorinkubiert, wonach sie einem Dosisbereich für jeden Wirkstoff 2 Stunden lang ausgesetzt wurden und anschließend mit 50 ng/ml EGF 30 Minuten lang bei 37°C behandelt wurden. Die Zellen wurden danach mit PBS gewaschen und in kaltem Lysepuffer [50 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl; 1% NP40, 1 mM EDTA; 5 mM NaF; 1 mM Na3VO4; Proteaseinhibitortablette (Roche Biochemicals, Laval, Kanada)] wieder suspendiert. Die Lysate wurden 30 Minuten lang auf Eis gehalten und durch Zentrifugation mit 10.000 U/min 20 Minuten lang bei 4°C gesammelt. Die Proteinkonzentrationen wurden gegen eine standardisierte Kontrolle unter Verwendung eines Bio-Rad-Proteintestkits (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) bestimmt. Gleiche Mengen an Protein (40 μg/ml) aus jedem Lysat wurden auf eine 12% SDS-PAGE gegeben und auf eine PVDF-Membran (Millipore, Bedford, MA) überführt. Die nichtspezifische Bindung an der PVDF-Membran wurde minimiert mit einem Blockierungspuffer, der fettfreie Trockenmilch (3%) in PBS enthielt. Die Membran wurde mit primären Antikörpern [entweder Antiphosphotyrosin-Antikörper (UBI, Lake Placid, NY) zum Nachweis von Phosphotyrosin oder Anti-EGFR (Neomarkers, Fremont, CA) zur Bestimmung der entsprechenden Rezeptorgehalte] und mit Anti-β-Tubulin (Neomarkers, Fremont, CA) zum Nachweis einer gleichmäßigen Beladung geblottet. Danach wurden die Blots mit HRP-Ziege-Antimaus-Antikörper (1:200 Verdünnung; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) inkubiert und die Banden sichtbar gemacht mit einem verstärkten Chemilumineszenzsystem (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, GB). Die Bandenintensitäten wurden gemessen unter Verwendung des SynGene-GeneTools-Softwarepakets (Cambridge, GB).
  • Beispiel 13
  • Mischzieleigenschaften (BJ2000)
  • (i) Autophosphorylierungstest
  • Die Hemmung der Rezeptorautophosphorylierung in lebensfähigen Zellen wurde mit Antiphosphotyrosin-Western-Blots bestimmt. A431- und NIH3T3-Zellen wurden bis zum Zusammenfließen in 6-Napf-Platten gezüchtet, zweimal mit PBS gewaschen und serumfreiem Medium 18 Stunden lang ausgesetzt. Sie wurden anschließend mit den Verbindungen 90 Minuten lang behandelt und dann mit EGF (100 ng/ml) 10 Minuten lang (A431-Zellen) oder mit PDGF (100 ng/ml) 10 Minuten lang (NIH3T3-Zellen). Sie wurden danach mit PBS gewaschen und wieder in kaltem Lysepuffer [50 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl; 1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA; 5 mM NaF; 1 mM Na3VO4; Proteaseinhibitortablette (Roche Biochemicals, Laval, Kanada)] wieder suspendiert. Die Lysate wurden 30 Minuten lang auf Eis gehalten und durch Zentrifugation mit 10.000 U/min 20 Minuten lang bei 4°C gesammelt. Die Proteinkonzentrationen wurden gegen eine standardisierte Kontrolle unter Verwendung des Bio-Rad-Proteintestkits (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) bestimmt. Gleiche Mengen an Protein (40 μg/ml) aus jedem Zelllysat wurden für eine 8% SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) zugefügt und auf eine Polyvinylidendifluoridmembran (PVDF) (Millipore, Bedford, MA) überführt. Die nichtspezifische Bindung an der Membran wurde minimiert mit einem Blockierungspuffer, der fettfreie Trockenmilch (3%) in PBS enthielt. Die Membran wurde 1 Stunde lang mit primären Antikörpern [entweder Antiphosphotyrosin-Antikörper PY20 (NeoMarkers, Fremont, CA) oder Anti-EGFR-Antikörper (Neomarkers, Fremont, CA)] und mit Anti-β-Tubulin-Antikörpern (Neomarkers, Fremont, CA) zum Nachweis der gleichen Beladung geblottet. Die Membran wurde anschließend mit HRP-Ziege-Antimaus-Antikörper (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) inkubiert und die Banden mit einem verstärkten Chemilumineszenzsystem (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, GB) sichtbar gemacht. Bandenintensitäten wurden gemessen unter Verwendung des SynGene-GeneTools-Softwarepakets (Cambridge, GB).
  • Für die Untersuchung der Hemmung der durch Mitogen aktivierten Proteinkinase-(MAPK)-Aktivierung durch BJ2000 wurden Proteinlysate, wie oben beschrieben, erhalten und ein Western Blot wurde durchgeführt (39). Die Membran wurde mit Anti-phosphorylierten MAPK-Antikörpern oder Antikörpern, die für MAPK spezifisch waren (Cell Signaling, Beverly, MA, USA) inkubiert.
  • Um zu bestimmen, ob die Blockade der EGFR-Autophosphorylierung zu einer Hemmung der Signalgebung stromabwärts führt, wurde die Wirkung des Kombimoleküls auf durch EGF induzierte Phosphorylierung von MAPK in A431-Zellen analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass BJ2000 eine vollständige Hemmung der MAPK-Phosphorylierung in Konzentrationen von nur 1 μM induzierte, ohne die Pegel von MAPK zu beeinflussen, was darauf hindeutet, dass dieses Kombimolekül EGFR- und MAPK-abhängige stromabwärts stattfindende Signalgebung signifikant blockieren kann (18).
  • Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass BJ2000 die durch EGF induzierte EGFR-Autophosphorylierung in A431-Zellen blockierte in einer dosisabhängigen Weise mit einer IC50 von ≈ 6 μM, ohne die Pegel von EGFR zu beeinflussen (14A). Bei Konzentrationen von bis zu 30 μM hat es keine Wirkung auf durch PDGF induzierte PDGFR-Autophosphorylierung in NIH3T3-Zellen. Diese Ergebnisse sind ein weiterer Hinweis auf die Selektivität von BJ2000 für EGFR (14B). Außerdem kann BJ2000 nicht nur durch EGF induzierte EGFR-TK-Autophosphorylierung blockieren, sondern auch die durch Heregulin (HRG) stimulierte Phosphorylierung des HER2-(erbB2)-Genprodukts p185neu (22).
  • Anders als FD105 ist BJ2000 ein reaktives Molekül, das Nucleophile alkylieren kann. So wurde daher unterstellt, dass es eine kovalente Schädigung der ATP-Stelle von EGFR beeinflussen könnte, wodurch eine irreversible Hemmung induziert würde. Um diese Hypothese zu testen, wurde der Reversibilitätstest (40, 41) verwendet, bei dem die Zellen mit dem Wirkstoff 90 Minuten lang behandelt werden, wonach das Kulturmedium wiederholt entfernt und dreimal ersetzt wird und anschließend die EGFR-Autophosphorylierung gemessen wird. Wie erwartet unterdrückten BJ2000 und FD105 bei 30 μM die EGF-abhängige EGFR-Autophosphorylierung in A431-Zellen direkt nach Wirkstoffkontakt vollständig. Bei einer 8-stündigen Nachbehandlung in wirkstofffreiem Medium (gefolgt von wiederholten Auswaschungen) wurden jedoch nur 40% der EGFR-Autophosphorylierungsaktivität in Zellen, die mit BJ2000 behandelt worden waren, wieder hergestellt, was darauf hindeutet, dass letzteres eine teilweise irreversible Hemmung der EGFR-Autophosphorylierung induzieren kann. Im Gegensatz dazu wurden 96% der EGFR-Autophosphorylierungsaktivität in Zellen wiederhergestellt, die mit FD105 bei der gleichen Dosis behandelt worden waren. Wie erwartet, zeigte TEM sofort nach der 90-minütigen Behandlung keine hemmende Aktivität noch induzierte es irgendeine Wirkung nach 8-stündiger Nachbehandlung (15).
  • (ii) Reverser EGFR-Autophosphorylierungstest
  • A431-Zellen wurden bis zum Zusammenfließen in 6-Napf-Platten wachsen gelassen und dann in serumfreiem Medium 18 Stunden lang inkubiert (41). Doppelte Ansätze von Zellen wurden dann jeweils mit 30 μM jeder Verbindung 90 Minuten lang behandelt. Ein Satz von Zellen wurde dann mit EGF (100 ng/ml) 10 Minuten lang stimuliert und die Extrakte wurden hergestellt, wie bei dem oben ausgeführten Western-Blot-Verfahren beschrieben. Der andere Satz von Zellen wurde von jeder Verbindung mit erwärmtem serumfreien Medium freigewaschen und 2 Stunden lang inkubiert. Danach wurden die Zellen gewaschen, weitere 2 Stunden lang inkubiert, wiederum gewaschen und dann weitere 4 Stunden lang inkubiert. Dieser Satz von Zellen wurde dann mit EGF stimuliert und die Extrakte wurden präpariert wie bei dem ersten Satz.
  • (iii) In-vitro-Wachstumshemmtest
  • Um die Wirkung unserer Verbindungen auf eine durch Wachstumsfaktoren stimulierte Proliferation zu untersuchen, wurden Zellen bis zu 70% Zusammenfließen in 48-Napf-Platten gezüchtet und zweimal mit PBS gewaschen, wonach sie serumfreiem Medium 18 Stunden lang ausgesetzt wurden. Die Zellen wurden dann jedem Wirkstoff und den Wachstumsfaktoren (EGF, TGFα, PDGF oder Serum) 72 Stunden lang ausgesetzt und das Zellwachstum unter Verwendung des Sulforhodamin-B-(SRB)-Tests gemessen (33). Kurz gesagt wurden nach der Wirkstoffbehandlung die Zellen unter Verwendung von 50 μl kalter Trichloressigsäure (50%) 60 Minuten lang bei 4°C fixiert, fünfmal mit Leitungswasser gewaschen und 30 Minuten bei Raumtemperatur mit SRB (0,4%) gelöst in Essigsäure (0,5%) gewaschen. Die Platten wurden fünfmal mit 1% Essigsäure gespült und an der Luft trocknen gelassen. Der entstehende gefärbte Rückstand wurde in 200 μl Tris-Base (10 mM) gelöst und die optische Dichte für jeden Napf bei 450 nm unter Verwendung eines Bio-Rad-Mikroplatten-Lesegeräts (Modell 2550) abgelesen. Jeder Punkt bedeutet einen Durchschnittswert von mindestens zwei unabhängigen Versuchen, die dreifach durchgeführt wurden.
  • Um die Reversibilität der antiproliferativen Wirkungen unserer Verbindungen zu untersuchen, wurden Zellen bis zu 70% Zusammenfließen in 96-Napf-Platten gezüchtet und anschließend zweimal mit PBS gewaschen, wonach sie serumfreiem Medium 18 Stunden lang ausgesetzt wurden. Unter kontinuierlichem Kontakt wurden die Zellen verschiedenen Konzentrationen jeden Wirkstoffs 120 Stunden lang ausgesetzt. Bei kurzem Kontakt wurden sie jedem Wirkstoff 2 Stunden lang ausgesetzt, wonach sie sich 120 Stunden lang in wirkstofffreiem Medium erholen gelassen wurden. Wachstumshemmende Aktivitäten wurden ausgewertet unter Verwendung des oben beschriebenen SRB-Tests.
  • Die cytotoxischen Wirkungen unserer Verbindungen wurden ausgewertet unter Verwendung des 3-(4,5-Dimethylthiazo-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-(MTT)-Tests (42) mit kleineren Modifikationen. Kurz gesagt wurden Zellen in 24-Napf-Platten gezüchtet und dann den Verbindungen 96 Stunden lang ausgesetzt. MTT (50 μl) (5 mg/ml in steriler PBS) wurde zu 500 μl Medium zugegeben und die Platten wurden 2 bis 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Der entstehende gefärbte Rückstand wurde in DMSO gelöst und die optische Dichte für jeden Napf bei 570 nm unter Verwendung eines Bio-Rad-Mikroplatten-Lesegeräts (Modell 2550) abgelesen. Jeder Punkt bedeutet den Durchschnitt von mindestens zwei unabhängigen Versuchen, die zweifach durchgeführt wurden.
  • In einem MTT-Cytotoxizitätstest zeigte TEM keine unterschiedliche Cytotoxizität bei dem isogenen Paar der Zelllinien NIH3T3/NIH3T3HER14 (20A). Im Gegensatz dazu induzierte BJ2000 eine mehr als fünffach höhere Cytotoxizitätsaktivität in dem EGFR-Transfektanten NIH373HER14 (20B). Eine ähnliche differenzielle Antwort wurde auch für den abgeleiteten Metaboliten FD105 beobachtet, der unabhängig getestet wurde, was darauf hindeutet, dass die Selektivität nach vollständiger Umwandlung von BJ2000 in FD105 erhalten bleibt (20C). Dies bietet den ersten Beweis für eine durch EGFR vermittelte selektive Cytotoxizität, die durch ein Alkylierungsmittel der Triazenklasse induziert wird.
  • SRB-Tests zeigten, dass BJ2000 (16B) wie FD105 (16A) BJ2000 die durch EGF oder TGFα induzierte Proliferation in NIH3T3-Zellen, die stabil mit dem EGFR-Gen transfiziert waren (NIH3T3HER14) (100% Wachstumshemmung bei 1 μM) selektiv blockieren konnte. Dieses Kombimolekül und sein Metabolit (BJ2000 und FD105) waren ungefähr 30-fach weniger effektiv bei der Hemmung des durch PDGF stimulierten Wachstums (16A und B) (100% Hemmung bei ungefähr 30 μM). In gleicher Weise zeigten diese Wirkstoffe eine geringere Wirkung auf durch Serum stimuliertes Wachstum bei NIH3T3HER14-Zellen (100% Wachstumshemmung bei Konzentrationen > 30 μM) (16C). Diese EGFR-selektiven Wirkungen stimmen überein mit denen, die mit ELISA und Vollzellautophosphorylierungstests beobachtet wurden.
  • Die A431-Zellen exprimieren TGFα und überexprimieren den Kognatrezeptor EGFR, was zu einem aggressiven autokrinen Zellwachstum führt. Es wurde gezeigt, dass diese Zellen empfindlich sind für antiproliferative Mittel, die EGFR ansteuern, sowohl in vitro als auch in vivo (35). Außerdem exprimieren sie auch das DNA-Reparaturenzym O6-Alkylguanintransferase (AGT), von dem bekannt ist, dass es für die Resistenz gegen Monoalkyltriazene der gleichen Klasse, wie BJ2000 verantwortlich ist (43). Daher wurde gefunden, dass diese Zelllinie ein geeignetes Modell ist, um die Empfänglichkeit für die antiproliferativen Wirkungen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu testen. Nach 120 Stunden kontinuierlichem Kontakt zeigten die Ergebnisse, die im SRB-Test erhalten wurden (17A), dass BJ2000 ungefähr dreifach potenter (IC50 = 15 μM) war als der Metabolit FD105 alleine (IC50 = 47 μM) (17B) in der AGT-kompetenten Zelllinie A431. Im Gegensatz dazu zeigte TEM bei Konzentrationen bis zu 200 μM keine signifikante antiproliferative Aktivität in diesen Zellen (17C). Was noch wichtiger ist, in einem kurzen Kontakttest (2 Stunden) gefolgt von einer 120-stündigen Erholungsperiode wurde ein fast vollständiger Verlust der Aktivität für FD105 in der A431-Zelllinie beobachtet (IC50 > 100 μM) (17B), was darauf hindeutet, dass es eine signifikante reversible wachstumshemmende Aktivität induzierte. Im Gegensatz dazu zeigte BJ2000 eine signifikante Retention der Aktivität (IC50 = 38 μM) (17A), das darauf hindeutet, dass es eine länger andauernde Wirkung hat als sein Metabolit FD105.
  • (iv) Alkali-Komettest zur quantitativen Auswertung der DNA-Schädigung
  • Der Alkali-Komettest wurde durchgeführt, wie vorher beschrieben (26). Die Zellen wurden den Wirkstoffen (BJ2000, FD105 oder TEM) 30 Minuten lang ausgesetzt, mit Trypsin-EDTA geerntet und anschließend durch Zentrifugation gesammelt und in PBS resuspendiert. Zellsuspensionen wurden auf ungefähr 106 Zellen verdünnt und mit Agarose (1%) in PBS bei 37°C in einer Verdünnung von 1:10 gemischt. Die Gele wurden auf Gelbond-Streifen (Mandel Scientific, Guelph, Kanada) gegossen unter Verwendung von Gelgießkammern, wie vorher beschrieben (31), und dann sofort in einen Lysepuffer [2,5 M NaCl, 0,1 M Tetranatrium-EDTA, 10 mM Tris- Base, 1% (G/V) N-Laurylsarcosin, 10% (V/V) DMSO und 1% (V/V) Triton X-100, pH 10,0] gestellt. Nachdem die Gele 30 Minuten lang auf Eis geblieben waren, wurden sie vorsichtig mit destilliertem Wasser gespült und in einen zweiten Lysepuffer (2,5 M NaCl, 0,1 M Tetranatrium-EDTA, 10 mM Tris-Base), der 1 mg/ml Proteinase K enthielt, 60 Minuten bei 37°C eingetaucht. Danach wurden die Gele mit destilliertem Wasser gespült, in alkalischem Elektrophoresepuffer 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert und bei 300 mA 60 Minuten lang elektrophoretisch aufgetrennt. Die Gele wurden anschließend mit destilliertem Wasser gespült und 30 Minuten lang in 1 M Ammoniumacetat gestellt. Sie wurden in 100% Ethanol 2 Stunden lang eingeweicht und über Nacht getrocknet und anschließend mit SYBR Gold (1/10.000 Verdünnung der von Molecular Probes, Eugene, OR gelieferten Vorratslösung) 20 Minuten lang gefärbt. Kometen wurden mit einer Vergrößerung von 330 x sichtbar gemacht und die DNA-Schädigung wurde quantitativ ausgewertet unter Verwendung des Tail-Moment-Parameters (d.h. der Abstand zwischen dem Massenmittelpunkt des Kopfes und des Schwanzes des Kometen multipliziert mit dem Prozentanteil an DNA in dem Schwanz des Kometen). Minimal 50 Zellkometen wurden für jede Probe analysiert unter Verwendung der ALKOMET-Version-3.1-Bildanalyse-Software und die Werte sind Durchschnittswerte der Tail-Momente für die gesamte Zellpopulation pro Probe.
  • Unter Verwendung des Alkali-Komettests wurde gezeigt, dass im Gegensatz zu FD105 (19A) und wie bei TEM BJ2000 eine dosisabhängige DNA-Schädigung in A431-Zellen nach 30 Minuten Wirkstoffkontakt induzierte (19B), was einen indirekten Beweis liefert für die Bildung einer metastabilen Methyldiazoniummolekülart. Interessanterweise induzierte dann, wenn der Test in einem isogenen Paar von Zelllinien durchgeführt wurde, bei denen der einzige Unterschied EGFR war, BJ2000 eine mehr als zweifach höhere DNA-Schädigung in dem EGFR-Tranfektanten, was darauf hindeutet, dass die EGFR-Affinität (wie in Stoffwechselweg 3 in Schema 2, EGFR+ vorhergesagt) eine Rolle spielen könnte bei der Ansteuerung der EGFR exprimierenden Zellen durch den Wirkstoff (19B).
  • Beispiel 14
  • Binäre Zielführungseigenschaften von SMA41
  • Die signifikante antiproliferative Aktivität von SMA41 in einer methyltriazinresistenten Zelle führte zu weiteren Studien der binären (EGFR und DNA) Zieleigenschaften. Dies wurde durch zwei Arten von Tests erreicht: EGF-stimulierte Tyrosinphosphorylierung und DNA-Schädigung.
  • (i) Hemmung der EGFR-TK-Aktivität
  • In einem kompetitiven EGFR-Bindungstest zeigte SMA41 (IC50, 0,2 μM) eine fünffach stärkere Bindungsaffinität als SMA52 (1,02 μM) für die ATP-Stelle des gereinigten Rezeptors. TEM zeigte keine signifikante Aktivität für diesen Rezeptor (IC50 > 100 μM) (9). Dies ist ein Beispiel eines Konjugats CYT-I (z.B. SMA41), das eine stärkere Affinität für seinen Kognatrezeptor hat als sein Metabolit I (z.B. SMA52) (siehe Schema 2).
  • Eine Western-Blot-Analyse (10) zeigte, dass beide Wirkstoffe fast den gleichen Grad an Hemmung der durch EGF induzierten EGFR-Autophosphorylierung induzierten [IC50 SMA52 = 8,44 μM, IC50 SMA41 12,5 μM]. Im Gegensatz zu SMA41 und SMA52 zeigte TEM weder eine EGFR-Bindungsaffinität, noch hemmte es die durch EGF induzierte Autophosphorylierung in A431-Zellen [IC50 > 100 μM] in den spezifizierten Dosisbereichen.
  • (ii) Quantitative Auswertung der DNA-Schädigung
  • Unter Verwendung des Alkali-Komettests wurde gezeigt, dass im Gegensatz zu SMA52 (11) sowohl SMA41 als auch TEM eine DNA-Schädigung in dosisabhängiger Weise induzieren konnten. Unterschiede wurden jedoch in der Kinetik der dosisabhängigen DNA-Schädigung beobachtet, die durch SMA41 induziert wurde im Vergleich zu TEM. Für SMA41 war der Trend, eine schnelle Kernkondensation bei den höchsten Dosen zu induzieren (25 bis 100 μM), was zu einer Reduktion der Kometschwanzbildung führte. Für SMA41 konnte ein signifikantes Kometschwanzmoment bzw. Komet-Tail-Moment nur in dem Bereich von 6 bis 25 μM beobachtet werden nach kurzem Wirkstoffkontakt von 30 Minuten und 2 Stunden (11). Bei 2-stündigem Kontakt wurde eine Verringerung des Tail-Moments beobachtet, bei Konzentrationen über 6 μM, bei gleichzeitig beobachtbarer Kernkondensation, wahrscheinlich aufgrund des schnellen Einsetzens der Apoptose. Im Gegensatz dazu zeigte TEM (11) einen dosisabhängigen Anstieg des Komet-Tail-Moments bei 30 Minuten Kontakt mit einer bemerkenswerten Verstärkung bei dem längeren 2-stündigen Wirkstoffkontakt (11). Dies ist ein prima-facie-Beweis, dass trotz der Tatsache, dass sie beide methylierende Mittel sind, der Wirkungsmechanismus von SMA41 deutlich verschieden ist von dem von TEM.
  • Diskussion
  • Mittel, die EGFR und sein engstes Homologon p185neu, das HER2-Genprodukt, ansteuern, bieten zwei Hauptvorteile: 1) Sie induzieren zielselektive Antitumoraktivitäten und 2) sie zeigen gute Toxizitätsprofile. Wenn sie keine Apoptose induzieren können, sind sie jedoch cytostatische Mittel, die reversible Antitumorwirkungen induzieren. Für längere Antitumoraktivität haben sich Kombinationen mit anderen cytotoxischen Wirkstoffen (z.B. Cisplatin, Doxorobucin, Taxans) als nützliche Alternative erwiesen (13). Die mangelnde Selektivität der letzteren Mittel kann jedoch die Gesamttoxizitätsprofile dieser Pläne negativ verändern. Ein neuer Ansatz für dieses Problem wird vorgeschlagen, bei dem versucht wird, EGFR-TK-Inhibitoren mit Pharmacophoren mit bekannten cytotoxischen DNA schädigenden Eigenschaften zu einzelnen Kombimolekülen, die EGFR ansteuern, zu kombinieren.
  • Wie in Schema 3 ausgeführt, basiert die Komponente mit gezielter Selektivität auf unserem Ansatz der starken Affinität des Kombimoleküls für die cytosolische Domäne von EGFR, die das Gleichgewicht zwischen TZ-I' (extrazelluläres Kompartiment)/TZ-I (cytosolisch) (Stoffwechselweg 1) und TZ-I (cytosolisch)/TZ-I-EGFR (Stoffwechselweg 3) beeinflussen kann. Sowohl gebundene als auch ungebundene Fraktionen von TZ-I werden schließlich abgebaut unter Erzeugung von I, das weiterhin EGFR TK blockieren kann (Stoffwechselwege 5 und 7). Fraktionen von ungebundenem TZ-I können durch den Kern diffundieren, wo die erzeugte Methyldiazoniumart (TZ) DNA alkylieren und schädigen kann (Stoffwechselweg 6). Zusätzlich kann TZ-I mit Aminosäureresten an der aktiven Stelle des Rezeptors reagieren, wodurch dieser ineversibel gehemmt wird, was zur Bildung von I-TZ-EGFR führt, das I freisetzen kann. Wenn in situ erzeugtes I seine Affinität für den geschädigten Rezeptor verliert, kann es an andere nicht geschädigte Rezeptormoleküle binden, was dann zu einer verlängerten EGFR-TK-Hemmung führt (Stoffwechselweg 4). Was noch wichtiger ist, TZ-I kann eine Hydrolyse durchlaufen, was zu der in-situ-Freisetzung von nicht umgesetzten Fraktionen von TZ führt, die von dem Rezeptor wegdiffundieren können. Diese Postulate wurden gestützt durch prima-facie-Versuchsdaten, die mit BJ2000 erhalten wurden.
  • Die Überexpression von EGFR kommt häufig vor bei einer Vielzahl der hauptsächlich vorkommenden menschlichen festen Tumoren mit Ursprung im Epithel, wie Brust-, Colorektal-, Kopf- und Hals-, Eierstock- und Blasenkarzinome (44). Eine EGF-Bindung induziert eine Rezeptordimerisierung, Autophosphorylierung und Aktivierung der mitogenen Signalgebung. Die A431-Zelllinie exprimiert eine große Anzahl von EGF-Bindungsstellen und auch den EGFR-Liganden TGF mit hoher Affinität (35). Dies führt zu einem aggressiven autokrin kontrollierten Wachstum in vitro. Die Blockierung der A431-Zellproliferation ist zu einem Standardscreening für antiproliferative Inhibitoren der EGFR-TK-Aktivität geworden (35, 45). Diese Zelllinie exprimiert auch das mit der Alkyltriazenresistenz in Beziehung stehende DNA-Reparaturenzym MGMT und ist, wie hier gezeigt (5B), resistent gegen das cyclische 1-Methyl-1,2,3-triazen TEM (IC50 = 366 μM). Daher bietet es ein gutes Modell zur Bestimmung der pharmakologischen Vorteile der gleichzeitigen Ansteuerung von EGFR und DNA in EGF exprimierenden refraktären Tumoren.
  • Dacarbazine und TEM, zwei Prodrugs von Monomethyltriazenen sind die aktivsten Wirkstoffe bei der Behandlung von malignen Melanomen und Gliomen (46). Wie in Schema 1 ausgeführt, wird das cytotoxische Monoalkyltriazen MTIC unter physiologischen Bedingungen abgebaut unter Erzeugung einer Vielzahl von Metaboliten, wobei die kritische Reaktion die Heterolyse des nicht konjugierten Tautomers zu dem Arylamin AIC und der Alkyldiazoniummolekülart ist (47). Es wurde bereits durch isotopische Markierung gezeigt, dass letztere Molekülart DNA an den Positionen 6 und 7 von Guanin oder Position 3 von Adenin alkyliert. Wie gezeigt kann SMA41 wie MTIC ein freies Arylamin (SMA52) erzeugen und ein gleichzeitig erzeugtes metastabiles Methyldiazonium, das die gleiche Art von alkalilabilen DNA-Läsionen induzieren kann, wie solche, die mit TEM oder anderen klassischen Triazenen verbunden sind. Tatsächlich wurde im Gegensatz zu SMA52 ausgesetzten Zellen ein erhebliches Ausmaß an DNA-Schädigung bei solchen beobachtet, die mit SMA41 behandelt worden waren im Bereich von 6,25 bis 25 μM. Da dieser Test die alkalische Elektrophorese der gesamten Zellkerne betraf, wird angenommen, dass diese Fragmentierung hauptsächlich auf N7-Methylguanin beruht, eine Art von Läsion mit bekannten alkalilabilen Eigenschaften (48). Die quantitative Auswertung dieser Art der alkalilabilen DNA-Läsion durch klassischen alkalischen Elutionstest ist nun gut dokumentiert (49).
  • Einzelzellmikroelektrophorese-(Komet)-Tests zeigten eindeutig, dass wie TEM die klinische Prodrug von MTIC, SMA41 stark DNA schädigende Eigenschaften besitzt. Die bemerkenswerten Unterschiede zwischen den Dosis-Wirkungs-Profilen von SMA41 und TEM [DNA-Schädigung, SRB und klonogene Tests] deuten jedoch darauf hin, dass diese beiden methylierenden Mittel die Zellproliferation mit verschiedenen Mechanismen blockieren können. Es ist bemerkenswert, dass die Aktivität von SMA41 in dem klonogenen Test ungefähr 8-fach größer war als im SRB-Test. Dies kann einer erhöhten Kontaktzeit zugerechnet werden (6 Tage kontinuierlicher Kontakt).
  • Das zweite Ziel von SMA41 wurde zuerst beleuchtet, indem seine Fähigkeit gemessen wurde, die EGFR-TK-Phosphorylierung eines PGT-Substrats in einem ELISA-Test zu blockieren. Es sollte zuerst daran erinnert werden, dass die Entwicklung von SMA41 hauptsächlich auf der vorher identifizierten Beziehung von Struktur und Aktivität in der Chinazolinreihe beruhte, die zeigte, dass sperrige Substituenten an den Positionen 6 und 7 toleriert werden. Außerdem erhöhen Elektronendonatorsubstituenten die Bindungsaktivität für die ATP-Bindungsstelle von EGFR. Da die Delokalisierung von Elektronen von N3 der Triazenkette nur geringe Elektronendonatoreigenschaften beitragen kann für SMA41, wird angenommen, dass die stärker EGFR-TK hemmende Aktivität im Vergleich zu SMA52 (das eine stärkere Elektronendonatorgruppe an Position 6 enthält (Hammett-Konstante σp = -0,57, σm = -0,09) (50)) auf der Fähigkeit beruhen könnte, eine Methylierung nucleophiler Aminosäureseitenketten in der ATP-Bindungsstelle des Rezeptors (z.B. Thiolfunktion eines Cysteinrests) zu induzieren. Es wurde kürzlich gezeigt, dass Chinazoline, die eine Acrylamidgruppe an Position 6 tragen, Cystein 773 an der TK-aktiven Stelle alkylieren können (5, 51) und dass die Position 64 Angstrom näher zu dem Cysteinrest ist als die Position 7. Die nicht konjugierte Form des Alkyltriazenrests, die ungefähr die gleiche Länge hat wie die Acrylamideinheit und ein starker Alkylator ist, kann eine ähnliche Art von Alkylierung an der aktiven Stelle von EGFR durchlaufen. Da eine Kontaktzeit (8 Minuten) verwendet wurde, die kürzer war als t1/2 bei dem ex-vivo-Tyrosinkinasetest (1, 9) scheint die beobachtete hemmende Aktivität hauptsächlich auf der Bindung des intakten Moleküls zu beruhen mit minimalem Beitrag des restlichen SMA52-Metaboliten.
  • Nachdem gezeigt wurde, dass SMA41 isolierte Rezeptoren ansteuern kann, wurde eine Untersuchung durchgeführt, ob dieses Mittel eine Signalübertragung in A431-Zellen blockieren könnte. Ein EGF-induzierter Gesamtphosphorylierungstest zeigte, dass wie SMA52 auch SMA41 die durch EGF induzierte Gesamt-TK-Phosphorylierung in dosisabhängiger Weise in A431-Zellen hemmen kann. Außerdem ist SMA41 fähig, die durch EGF induzierte Autophosphorylierung von EGFR zu blockieren. Es ist wichtig anzumerken, dass keine nachweisbaren Anteile einer Tyrosinkinase hemmenden Aktivität mit TEM über den gesamten Dosisbereich beobachtet wurden. Der Nachweis der die Autophosphorylierung hemmenden Aktivitäten für SMA41 und SMA52 ist ein indirekter Beweis für den normalen Transport dieser Verbindungen durch die Zellmembran, obwohl es nicht klar ist an dieser Stelle, ob SMA41 in den Zellen sequestriert wird vor seiner hydrolytischen Spaltung zu SMA52 oder ob eine signifikante extrazelluläre Spaltung auftritt vor dem Zelleintritt dieser beiden Molekülarten. Einige Schlüsse können im Licht der makromolekularen Ansteuerungsergebnisse jedoch gezogen werden.
  • Im Gegensatz zu dem isolierten Enzymtest, der eine fünffach überlegene hemmende Aktivität für SMA41 im Vergleich zu SMA52 zeigte, ergaben die Gesamtzellphosphorylierungstests ähnliche Aktivitätsgrade für diese zwei Wirkstoffe. Wenn keine DNA-Schädigung beobachtet würde, könnten diese Ergebnisse auf eine vollständige extrazelluläre Umwandlung von SMA41 in SMA52 vor dem Eintritt in die Zelle hindeuten. Die signifikante Kernfragmentierung und die bemerkenswerte Retention der Aktivität, die beobachtet wurde, wenn SMA41 nach 2 Stunden entfernt wurde (6A) sind jedoch ein indirekter Beweis der intrazellulären Sequestrierung von SMA41, da, wie gezeigt, SMA52 alleine keine DNA schädigenden Eigenschaften besitzt (11). Der Verlust der TK hemmenden Aktivität von SMA41 im Vergleich zu SMA52 (von dem isolierten Enzym zu dem Gesamtzelltest) kann auf Unterschieden in den intrazellulären Verteilungen dieser Wirkstoffe beruhen. Nichtsdestotrotz liefern die Ergebnisse insgesamt den prima-facie-Beweis, dass SMA41 ein neues Triazen mit einer signifikanten EGFR-Tyrosinkinase hemmenden Aktivität ist, einer Eigenschaft, die niemals vorher für irgendeine Klasse von Mono- oder Dialkyltriazenen beobachtet wurde.
  • Basierend auf bekannten Prinzipien der medizinischen Onkologie, die vorschlagen, dass schnell sich vermehrende Zellen empfindlicher für DNA schädigende Mittel sind als langsam wachsende, wurde befürchtet, dass die cytostatische Wirkung der EGFR-TK-Hemmung die Vermehrung anfangs blockieren würde und dadurch die Zellempfindlichkeit der DNA-Schädigung, die mit der gleichzeitig erzeugten Methyldiazoniummolekülart verbunden ist, herabsetzen könnte. Dies würde zu einer ziemlich antagonistischen Wirkung führen. Um diese Hypothese zu testen, wurde die kombinierte Wirkung der zwei Wirkungsmechanismen nachgeahmt, indem ein Zwei-Wirkstoff-Kombinationsmodell mit SMA52 (einem EGFR-TK-Inhibitor) und TEM (einem DNA schädigenden Mittel) entwickelt wurde. Die Ergebnisse zeigten eine subadditive Wechselwirkung und keine antagonistische Wirkung zwischen diesen beiden Wirkstoffen. Außerdem ist bemerkenswert, dass SMA41 potenter war als die Kombinationen aus zwei Wirkstoffen. Dies deutet darauf hin, dass ein einzelnes Molekül, das als maskierte Form dieser beiden Arten von Mitteln formuliert ist, wirksamer sein könnte als eine Kombination aus zwei Wirkstoffen, die einzelne Monoalkyltriazene und EGFR-TK-Inhibitoren umfassen.
  • Da SMA41 sowohl die Phosphorylierung, die durch EGF induziert wird, blockieren kann als auch genomische DNA schädigen kann, kann seine mehr als 8-fach (SRB-Test) und mehr als 90-fach (klonogener Test) größere Potenz im Vergleich zu TEM aus den kombinierten Wirkungen dieser beiden unterschiedlichen Mechanismen der antiproliferativen Aktivitäten entstehen. Die binäre Zielfindung kann die Signalübertragung anschalten, die mit der Induktion der Apoptose verbunden ist. Tatsächlich wurde im Gegensatz zu SMA52 und TEM eine signifikante Kernkondensation bei Zellen beobachtet, die mit SMA41 2 Stunden in einem Bereich von 25 bis 100 μM behandelt worden waren.
  • Signifikante Hinweise deuten darauf hin, dass eine Überexpression von EGFR ein Hinweis auf eine schlechte Prognose bei vielen festen Tumoren ist. Selektive Inhibitoren der Tyrosinphosphorylierung durch EGFR werden nun als wichtige Klasse von Antikrebswirkstoffen angesehen und zwei Mitglieder der 4-(Phenylamino)chinazolin-Klasse befinden sich nun in klinischen Versuchen. Trotz der signifikanten EGFR hemmenden Aktivität dieser reversiblen Inhibitoren sind hohe intrazelluläre Konzentrationen von ATP eine Hauptbarriere der anhaltenden Hemmung der durch EGF stimulierten Signalübertragung in Tumorzellen. Dieses Problem wurde kürzlich adressiert (5) und es wurde erläutert, dass Chinazoline, die eine Acryloylfunktion an Position 6 enthalten, eine irreversible Hemmung von EGFR durch Alkylierung des Cysteins 773 des Enzyms induzieren könnten. Ein kürzlich synthetisiertes wasserlösliches Analogon dieser Klasse wurde nun ausgewählt für klinische Versuche in Phase 1 (51). Es ist anzumerken, dass diese Verbindungen, obwohl sie irreversible Inhibitoren von EGFR sind, dann, wenn die Apoptose nicht angeschaltet wird, wenn die Zellen auf alternative Wachstumshormone ansprechen (z.B. Heregulin oder PDGF), immer noch keine anhaltende wachstumshemmende Aktivität induzieren können.
  • Das neue SMA41-Molekül der vorliegenden Erfindung bietet den Vorteil, dass es nicht nur die durch EGF stimulierte Signalübertragung selbst blockieren kann, sondern auch eine DNA alkylierende Molekülart erzeugen kann, die irreversible cytotoxische DNA-Läsionen bewirken kann. Außerdem wurde diese Verbindung so entwickelt, dass sie ein weiteres intaktes EGFR-TK hemmendes Molekül (z.B. SMA52) freisetzen kann, das die wachstumshemmende Aktivität weiter verbessern kann. Die Ergebnisse zeigen, dass diese vereinten Eigenschaften zu einer erhöhten Potenz eines Monoalkyltriazens gegen eine MGMT-kompetente Tumorzelllinie beitragen, mit bemerkenswerter Resistenz gegen den klinischen Wirkstoff TEM (IC50, 366 μM).
  • Die derzeitige Studie, die hauptsächlich entwickelt wurde, um die Hauptziele von SMA41 zu finden, hat schlüssig gezeigt, dass diese Ein-Molekül-Kombination eine überlegene Aktivität zeigte im Vergleich zu einer Zwei-Wirkstoff-Kombination mit TEM + SMA52. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein weiteres Kombimolekül (BJ2000) entwickelt, das auch zwei Hauptkomponenten besitzt: Eine EGFR hemmende Komponente, die in die Chinazolineinheit eingebettet ist und eine DNA schädigende Methyldiazoniummolekülart, die durch die angehängte 3-Methyl-1,2,3-Triazen-Einheit maskiert ist. Die Wirkungen der EGFR-Komponente wurden sowohl in Enzym- als auch Gesamtzelltests gezeigt, wobei die Fähigkeit des Kombimoleküls, das Substrat (ELISA) und die EGFR-Autophosphorylierung zu blockieren (Western Blotting) deutlich gezeigt wurden. Weiterhin wurde gezeigt, dass BJ2000 eine Selektivität für EGFR aufwies sowohl mit ELISA als auch mit durch Wachstumsfaktor stimulierten Vermehrungstests. Der wichtigste Beweis der direkten Wechselwirkung mit EGFR wurde jedoch erhalten durch den Reversibilitätstest, der nur eine 40%ige Erholung der Autophosphorylierungsaktivität 8 Stunden nach Zellkontakt zeigte, trotz mehrerer Auswaschungen. Im Gegensatz dazu wurde eine fast vollständige Erholung nach anfänglicher EGFR-Autophosphorylierungsaktivität beobachtet bei Zellen, die mit FD105 bei gleicher Dosis behandelt worden waren (15). Es ist derzeit nicht klar, ob die teilweise Inaktivierung der EGFR-TK durch Alkylierung von Aminosäureresten, die an der aktiven Stelle angeordnet sind, auftrat. Es wurde nichtsdestotrotz gezeigt (40, 41), dass Acryloyleinheiten, die an Position 6 von Chinazolin gebunden sind, mit Cystein 773 von EGFR reagieren, was einen irreversibel gehemmten Rezeptor zurücklässt.
  • Weitere Kombimoleküle der Triazenklasse, wie D und E wurden entwickelt und auf ihre Hemmung der EGFR-Tyrosinkinaseaktivität getestet. Die Hemmung der EGFR-Tyrosinkinaseaktivität durch Verbindung C, die die hemmende Einheit (I) eines Kombimoleküls "I-TZ" ist, wird auch gezeigt.
  • Figure 00320001
  • Tabelle 1 zeigt die IC50-Werte für die Kombimoleküle, die in den Formeln D und E dargestellt sind, die IC50-Werte für Verbindung C ebenso wie die, die für SMA41 und BJ2000 erhalten wurden, im Vergleich. Die beobachteten IC50-Ergebnisse deuten auf eine sehr hohe Bindungsaktivität für den EGFR-Tyrosinkinaserezeptor und das Potenzial dieser Klasse von Verbindungen, genauer der Kombimoleküle der Triazenklasse zur Behandlung von Krankheiten, unter Beteiligung von EGFR und Familienmitgliedern, wie HER2-, HER3- und HER4-Genprodukten. Tabelle 1 Hemmung der EGFR-Tyrosinkinaseaktivität durch Kombimoleküle mit hoher Affinität
    Figure 00330001
    • Anmerkung: Die Daten sind Mittelwerte und SE's von zwei getrennten Versuchen
  • Da die Triazenkette des vorliegenden C-(BJ2000) an der gleichen Position angehängt ist und ungefähr die gleiche Länge besitzt, wie der Acryloylanteil, ist es wahrscheinlich, dass sie dieselbe Art von Wechselwirkung durchläuft. Wie in Schema 7 dargestellt, kann das nicht konjugierte Tautomer von BJ2000 durch das Cystein 773 in einer Orientierung angegriffen werden, die ähnlich der ist, die von Smaill berichtet wurde (40). Die verzögerte Erholung der Autophosphorylierung kann daher Stoffwechselweg 4 unterstützen (Schema 3), der eine mögliche kovalente Inaktivierung des Rezeptors postuliert (siehe TZ-EGFR in den Schemata 3 und 7).
  • Figure 00340001
    Schema 7
  • Die DNA schädigenden Eigenschaften von BJ2000 wurden verglichen mit dem klinischen Wirkstoff TEM. Wie TEM induzierte BJ2000 eine signifikante DNA-Schädigung bei A431-Zellen nach 30-minütigem Wirkstoffkontakt (19B). Dies liefert die indirekte Bestätigung der Erzeugung der DNA schädigenden Methyldiazoniummolekülart (TZ), wie in Stoffwechselpfad 6 postuliert (Schema 2). Die vollständige Bestätigung des letzteren Stoffwechselwegs (Stoffwechselweg 6), der die hydrolytische Umwandlung von TZ-I in TZ + I vorhersagt, wurde durch HPLC-Detektion von I (FD105) und durch kinetische Analyse geliefert. Die Ergebnisse zeigen klar eine umgekehrte Beziehung zwischen dem Abbau von BJ2000 (t1/2 = 75 Minuten) und der Bildung von FD105 in einer Ausbeute von 87% nach vollständigem Abbau (4 bis 24 Stunden, 12B). Bisher stützen die Ergebnisse insgesamt fast alle Postulate, die in Schema 3 dargestellt sind (Stoffwechselwege 1 bis 7). Gemäß Schema 3 kann ein TZ-I (oder Kombimolekül) an EGFR binden (Stoffwechselwege 1 und 3) oder zu einem wei teren Inhibitor I mit hoher Affinität (Stoffwechselwege 2 und 5) und einer reaktiven Molekülart, die DNA (Stoffwechselweg 6) oder vielleicht den Rezeptor schädigen kann, abgebaut werden. Zusätzlich kann das Kombimolekül TZ-I direkt die aktive Stelle von EGFR alkylieren durch Angriff auf den Triazenanteil über Cystein 773, was einen inaktivierten kovalent modifizierten irreversibel gehemmten Rezeptor I-TZ-EGFR (Stoffwechselweg 4) erzeugt. Wenn I seine Affinität für den geschädigten Rezeptor verliert, wird es wohl freigesetzt werden, wonach es an eine weitere nicht geschädigte EGFR-ATP-Bindungsstelle binden kann, was I-EGFR liefert (Stoffwechselweg 7). Zusätzlich kann TZ-I einer Hydrolyse unterliegen, was zur in-situ-Freisetzung von nicht umgesetzten Fraktionen von TZ führt, die von dem Rezeptor wegdiffundieren können.
  • Andererseits wird in Schema 3 vorhergesagt, dass EGFR-defiziente Zellen (siehe EGFR-) aufgrund der Abwesenheit eines Ziels nicht in ihrem Wachstum durch TZ-I noch durch erzeugtes I gehemmt würden. Im Gegensatz zu den EGFR-kompetenten Zellen (EGFR+) wird daher zusätzlich postuliert, dass EGFR--Zellen entsprechende DNA-Läsionen zeigen, deren antiproliferative Wirkungen nicht durch Hemmung der durch EGFR vermittelten Signalgebung potenziert würden. Es wird daher erwartet, dass sie weniger empfindlich für die Kombimoleküle der vorliegenden Erfindung sind, als EGFR+-Zellen, was durch die beobachtete 5-fach stärkere cytotoxische Aktivität bestätigt wurde, die durch BJ2000 in dem EGFR-Transfektanten (NIH3T3HER14) im Vergleich zur Stammlinie (NIH3T3) induziert wurde. Da der einzige Unterschied zwischen den zwei Zellarten der EGFR-Gehalt ist, deuten die Ergebnisse darauf hin, dass der binäre Mechanismus der EGFR-TK-Hemmung (TZ-I + I) und der DNA-Schädigung (TZ), wie vorhergesagt, signifikant wirksamer gegen die das Ziel exprimierende Zellart ist. Obwohl der Beitrag der DNA-Läsionen zu den Mechanismen, denen diese selektive Cytotoxizität unterliegt, nicht klar ist, ist es bemerkenswert, dass BJ2000 eine mehr als zweifach stärkere DNA-Schädigung bei dem EGFR-Transfektanten induzierte. Diese offensichtlich durch EGFR vermittelte Verstärkung der DNA-Schädigung kann im Licht einer teilweisen Hydrolyse des Kombimoleküls, während es an die ATP-Stelle des Rezeptors gebunden ist, erklärt werden. An der ATP-Stelle des Rezeptors ist bei den vorgeschlagenen Modellen (52) die Position 6 des Chinazolinrings am Eingang des Bindungsspalts angeordnet. Fraktionen der von BJ2000 abgeleiteten Methyldiazoniummolekülarten können daher auch frei von dem Rezeptor wegdiffundieren und erreichen vielleicht den Kern. Deuteriummarkierungsversuche haben derzeit festgestellt, dass das von 1,2,3-Triazen abgeleitete Methyldiazonium, das im Gleichgewicht mit Diazomethan ist (Schema 8) die reaktive Molekülart, die DNA alkyliert, ist (53). Versuche gehen derzeit weiter, die zum Ziel haben, die beobachtete durch EGFR vermittelte Verstärkung der DNA-Schädigung zu erhellen, indem Arten und Ausmaß dieser Läsionen mit der EGFR-Affinität einer Reihe von Kombimolekülen, die derzeit synthetisiert werden, korreliert werden. Obwohl es kein DNA schädigendes Mittel ist, zeigte FD105 EGFR-selektive Cytotoxizität. Obwohl der der FD105-induzierten Cytotoxizität unterliegende Mechanismus noch untersucht wird, deuten Ergebnisse darauf hin, dass die Selektivität sogar nach vollständiger hydrolytischer Umwandlung des Kombimoleküls in FD105 erhalten bleiben kann.
  • Figure 00360001
    Schema 8
  • Das Prinzip, mit dem die vielfachen Eigenschaften von BJ2000 zu einer fortgesetzten Wachstumshemmung kulminieren sollten, wurde im Vergleich mit dem davon abgeleiteten Inhibitor FD105 gezeigt. Im Gegensatz zu FD105 wurde die antiproliferative Aktivität von BJ2000 in A431-Zellen teilweise bis zu 5 Tage nach 2-stündigem Wirkstoffkontakt aufrechterhalten. Der vollständige Verlust der Aktivität von FD105 und die bemerkenswerte Inaktivität von TEM, einem bekannten DNA schädigenden Mittel, in den A431-Zellen deuten darauf hin, dass die andauernde antiproliferative Aktivität des Kombimoleküls (BJ2000) durch eine Wechselwirkung zwischen der DNA schädigenden Komponente und der die Signalübertragung hemmenden Komponente entstehen könnte. Diese Annahme wurde weiter bestätigt durch experimentellen Beweis, der die Fähigkeit des Kombimoleküls (BJ2000), die MAPK-Phosphorylierung in einer Konzentration von nur 1 μM zu blockieren, zeigte. Da MAPK ein kritisches Signalübertragungsprotein ist, von dem bekannt ist, dass es die mitogenen Wirkungen der durch EGF aktivierten Signal-(54)-Blockade der EGFR-Autophosphorylierung durch BJ2000 und den davon abgeleiteten Inhibitor I vermittelt, könnte dies zu einer Hemmung der Signalwirkung, die mit der Expression von Genen verbunden ist, die erforderlich sind, um die Zellen zu retten, stromabwärts führen. Ein Mechanismus, mit dem die Blockade der durch EGF induzierten Signalübertragung durch das TK hemmende Element die DNA-Reparaturenzyme (z.B. AGT, DNA-Glycosylasen) oder andere kritische Proteine herunterreguliert, kann daher hervorgerufen werden, um die durch EGFR vermittelte anhaltende Hemmung der Proliferation, die durch BJ2000 induziert wird, zu erklären. Es wird derzeit darauf hingearbeitet, diese Hypothese zu verifizieren, genauer die Expressionen kritischer Transkriptionsfaktoren (z.B. c-jun und c-fos) und spezifischer DNA-Reparaturgene, die als Antwort auf den Zellkontakt mit BJ2000 induziert werden, zu charakterisieren.
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Claims (27)

  1. Kombimolekül der allgemeinen Formel I
    Figure 00410001
    Formel I oder pharmazeutisch annehmbares Salz davon, worin a) R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methyl, Ethyl und Chlorethyl (ClCH2CH2-); b) R2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Chlorethyl (ClCH2CH2-) und Hydroxyethyl; c) Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nitroso und Wasserstoff und d) X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methyl, Chlor, Brom und Iod.
  2. Kombimolekül nach Anspruch 1, wobei R1 eine Chlorethylgruppe ist, R2 Wasserstoff ist, Z eine Nitrosogruppe ist und X eine Methylgruppe ist.
  3. Kombimolekül nach Anspruch 1, wobei R1 eine Methylgruppe ist, R2 Wasserstoff ist, Z eine Nitrosogruppe ist und X eine Methylgruppe ist.
  4. Kombimolekül nach Anspruch 1, wobei R1 eine Chlorethylgruppe ist, R2 eine Methylgruppe ist, Z eine Nitrosogruppe ist und X eine Methylgruppe ist.
  5. Kombimolekül nach Anspruch 1, wobei R1 eine Methylgruppe ist, R2 eine Methylgruppe ist, Z eine Nitrosogruppe ist und X eine Methylgruppe ist.
  6. Kombimolekül der allgemeinen Formel II
    Figure 00410002
    Formel II worin a) R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methyl, CH2OY, Acyl, MeOCH2CH2- und
    Figure 00420001
    wobei Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Acyl und Thiophenol; b) R2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und Methyl und c) X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chlor, Brom, Iod und Methyl.
  7. Kombimolekül nach Anspruch 6, wobei R1 Methyl ist, R2 Wasserstoff ist und X eine Methylgruppe ist.
  8. Kombimolekül nach Anspruch 6, wobei R1 Methyl ist, R2 Wasserstoff ist und X Chlor ist.
  9. Kombimolekül nach Anspruch 6, wobei R1 Methyl ist, R2 Wasserstoff ist und X Brom ist.
  10. Kombimolekül nach Anspruch 6, wobei R1 MeOCH2CH2- ist, R2 Wasserstoff ist und X Brom ist.
  11. Kombimolekül nach Anspruch 6, wobei R1 MeOCH2CH2- ist, R2 Wasserstoff ist und X eine Methylgruppe ist.
  12. Kombimolekül nach Anspruch 6, wobei R1
    Figure 00420002
    ist, R2 Wasserstoff ist und X Brom ist.
  13. Kombimolekül nach Anspruch 6, wobei R1
    Figure 00420003
    ist, R2 Wasserstoff ist und X Brom ist.
  14. Kombimolekül, wie in einem der Ansprüche 1 und 6 definiert, enthaltend einen Liganden für ein Molekül, das an Zellsignalwegen beteiligt ist und ein Mittel, das DNA schädigen kann.
  15. Kombimolekül, wie in Anspruch 14 definiert, wobei das Molekül, das an den Zellsignalwegen beteiligt ist, eine Rezeptortyrosinkinase ist.
  16. Kombimolekül, wie in Anspruch 15 definiert, wobei die Rezeptortyrosinkinase Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) ist.
  17. Kombimolekül, wie in Anspruch 16 definiert, wobei die Rezeptorkinase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HER2-, HER3- und HER4-Genprodukten.
  18. Kombimolekül, wie in Anspruch 14 definiert, wobei der Ligand ein Inhibitor des Epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) ist.
  19. Kombimolekül, wie in Anspruch 18 definiert, wobei der Ligand ein Inhibitor eines Molekül ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HER2-, HER3- und HER4-Genprodukten.
  20. Kombimolekül, wie in Anspruch 19 definiert, wobei der Ligand eine Verbindung ist, die kompetitiv an eine ATP-Stelle bindet.
  21. Kombimolekül, wie in Anspruch 14 definiert, wobei das Mittel, das die DNA schädigen kann, eine Alkyldiazoniumart oder ein Vorläufer davon ist.
  22. Kombimolekül, wie in Anspruch 14 definiert, wobei der Ligand ein Inhibitor von EGFR ist und wobei das Mittel, das die DNA schädigen kann, eine Allcyldiazoniummolekülart oder ein Vorläufer davon ist.
  23. Kombimolekül, wie in Anspruch 14 definiert, wobei der Ligand ein Inhibitor eines Moleküls ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HER2-, HER3- und HER4-Genprodukten und wobei das Mittel, das die DNA schädigen kann, eine Alkyldiazoniummolekülart oder ein Vorläufer davon ist.
  24. Verwendung eines Kombimoleküls, wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumoren.
  25. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Kombimolekül, wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert, und mindestens einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  26. Verwendung eines Kombimoleküls, wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs.
  27. Kombimolekül, wie in Anspruch 14 definiert, das einen Liganden abbauen kann, der an Zellsignalwegen beteiligt ist und ein Mittel, das DNA schädigen kann.
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