DE60214046T2

DE60214046T2 - Ein einfaches verfahren zur gewinnung von beta-aescin aus der indischen rosskastanie (aesculus indica)

Info

Publication number: DE60214046T2
Application number: DE60214046T
Authority: DE
Inventors: Bikram Singh
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2002-03-25
Filing date: 2002-03-25
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2022-03-26
Also published as: AU2002247935B2; AR039120A1; AU2002247935A1; EP1487847B1; DE60214046D1; EP1487847A1; BR0205771A; WO2003080636A1; US20060030697A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Entwicklung eines einfachen Verfahrens zum Erhalt von β-Aescin aus der indischen Roßkastanie (Aesculus indica).
Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf die Trennung von β-Aescin aus der indischen Roßkastanie durch eine wäßrige Alkoholextraktion, Lösungsmittel – Lösungsmitteltrennung, Behandlung mit einer Base, gefolgt durch das Passieren der organischen Schicht durch saures Aluminiumoxid. Noch spezieller bezieht sich diese Erfindung auf die Reinigung von β-Aescin aus der indischen Roßkastanie (A. indica) in 2,0 – 3,0 % Ausbeute der gewünschten Spezifikationen.
Stand der Technik
Aesculus indica Hook. (Hippocastanaceae) (indische Roßkastanie) ist als Bankhor in Hindi bekannt. Ein großer, Laub abwerfender Baum, mit einem kurzen, geraden, zylindrischen Stamm und einer sich ausbreitenden Krone, an günstigen Orten 30 m in der Höhe und 7,5 m im Umfang, verteilt im Himalaya von Kashmir bis nach Westnepal, in Höhen von 900 – 3600 m. Der Baum ist sehr hübsch und üblicherweise in fetten, feuchten, schattigen Schluchten von Kashmir, Himachal Pradesh und Uttar Pradesh bis zum Nepal. Er wird oftmals zierend auf den Hügeln angepflanzt. Der Baum wirft die Blätter von Oktober bis zum frühen Dezember ab und die neuen Blätter erscheinen im April, und blühen während April bis Juni, während er extrem gut aussieht. Die Pflanzensprossen und Blätter werden als Futter verwendet und Rinder essen die Früchte. In Zeiten des Mangels werden sie auch die Bergsvolksstämmen gegessen, nachdem sie in Wasser eingeweicht wurden, um die bitteren Komponenten zu entfernen, oder manchmal werden gepulverte Samen mit Weizenmehl gemischt. Die gemahlenen Früchte werden zum Waschen der Kleidung verwendet. Die Analyse der Samen ergab: Feuchtegehalt, 3,5; reduzierende Zucker (wie Dextrose),.83; Saccharose, 9,07; Stärke, 38.3; Wassersol, 36.4; und für gemahlene Samen, wenn an Rinder verfüttert, wird berichtet, dass sie die Qualität und Quantität von Milch verbessern. Die Samen werden auch gegen Koliken den Pferden gegeben. Die Samen enthalten Öl, welches gegen Rheumatismus verwendet wird; es wird auch auf Wunden aufgetragen. Das Holz ist creme-stichig oder hell blaßrosa-weiß, wenn es frisch geschnitten ist, es wird blaßrosa-braun bei Belichtung, mit Licht bekommt es braune Linien; das Kernholz ist nicht unterschiedlich. Das Holz ist matt, mit einer gleichmäßigen Griffigkeit und ohne jeglichen charakteristischen Duft. Es ist leicht bis mäßig schwer (Sp. Gr. 0.43 – 0.57; wt, 479 – 560 kg/cum), weich, gradlinig- oder begrenzt und oberflächlich ineinander verzahnt gemasert und manchmal wachsartig gemasert. Es ist leicht zu sägen, zu einer glatten Oberfläche aufzuarbeiten und nimmt einen guten Glanz an. Das Holz härtet gut ohne viel Zerfall.
Das Holz wird größtenteils für Gebäude verwendet, für Packkisten, Wassertröge, Verschalung, Faßbinderei, Platten, Teeboxen, Schiffsausstattung, in der Schreinerei und für Drexlerarbeiten; es ist auch für mathematische Instrumente geeignet, Schuhabsätze und Streichhölzer. Das Holz wird auch für Spulenkörper verwendet. Für das Hartholz, nach geeigneter Trocknung und Wachsung, wurde gefunden, dass es für hochqualitative Bleistifte geeignet ist. Ausgewählte Teile sind für hochwertige Täfelung in Eisenbahnwagen und für Sportwaren nützlich. Die Rinde wird in eine Paste für die Auftragung auf schmerzhafte, verrenkte Gelenke gemacht. Für Extrakte aus der Stammrinde wird berichtet, fungizide Eigenschaften zu haben. Die Wurzeln werden als Heilmittel für Leucorrhoea verwendet. (Annon., 1985 The Wealth of India, Raw Material, CSIR, New Delhi, 1,95).
A. indica ist durch unterschiedliche Gruppen in chemischen und biologischen Studien untersucht worden. Stärke (25 %) aus der indischen Roßkastanie auf trockener Basis ist berichtet worden (Uppal, I. S., 1952, Starch from Indian horse chestnuts and its chemical examination, J. Ind. Chem. Soc., 15, 178 – 80). Zwei Flavonoid-Glycoside, nämlich Rutin und Astralagin aus dem Chloroformextrakt aus den Stängeln, ein Flavonoid-Glycosid-Quercitrin, β-Sitosterol und ein Triterpenoid-Saponin, Aescin aus den Blättern (Ikram, M., Khan M. I., Kawano, N., 1978, Chemical investigation of Aesculus indica, Planta Medica, 34, 337 – 338; Ikram, M., Khan M. I., 1978, Chemical investigation of Aesculus indica Part-II, Fitoterapia, 49, 247 – 248). Aliphatische Verbindungen, und zwar n-Hentriacontane, n-Hentriacontanol und Palmiton, zusammen mit β-Sitosterol aus verschiedenen Extrakten von Blättern und ein Coumarin Glycosid (Aesculin) und Quercetin L-Rhamnosid (Mukherjee, K. S., Bhattacharya, M. K., Ghosh, P. K., 1983, Phytochemical investigation of Aesculus indica Linn. and Fragaria indica Andr. J. Indian Chem. Soc., 60, 507 – 508). Unterschiedliche triterpene Glycoside (3 – 5) aus der indischen Roßkastanie sind auch von anderen Kollegen berichtet worden (Singh, B., Agrawal, P. K. Thakur, R. S., 1986, Aesculuside-A, a new triterpene glycoside from Aesculus indica, Planta Medica, 52, 409 – 410; Sati, O. P., Rana, U., 1987, A new molluscicidal triterpenic glycoside from Aesculus indica, Int. J. Crude Drug Res., 25, 158 – 160; Singh, B., Agrawal, P. K., Thakur, R. S., 1986, Aesculuside-B, a new triterpene glycoside from Aesculus indica, J. Nat. Prod., 50, 781 – 783). In einer vergleichenden Studie von Phytochemikalien in Aesculus indica und A. hippocastanum Samen beschreiben husk & leaves die Unterschiede zwischen den Arten. Aesculin und sein Aglycon, Aesculetin, sind nicht in den Blättern und Schoten der beiden Arten nachgewiesen worden. Die Samen und Blätter hatten ähnliche Bestandteile, wobei sie in der Schote variierten. Der Gehalt an Aescin, der in A. indica gefunden wurde, ist 13,4 % (w/w), wohingegen A. hippocastanum 9,5 % enthielt. Laurin, Palmitin, Myristin, Arachin und Ölsäure sind durch Kapillaren GC nachgewiesen worden (Srijayanta S.; Raman A.; Goodwin B. L. A comparative study of the constituents of Aesculus hippocastanum and A. indica, Jour. Med. Food, Vol. 2 (2), 1999, 45 – 50). Frühere Berichte gaben das Vorhandensein von Aescin in A. hippocastanum zu mehr als 13 % an (Shibata, S., 1977, New natural products and plant drugs with pharmacological, biological and therapeutical activity (Wagner H., Wulff, P. (ed) p 177, Springer, Berlin), wohingegen berichtet worden ist, dass es in A. hippocastanum 3 – 6 % ist (Hostettmann, K. Marston, 1995, A., Saponins, in Chemistry and Pharmacology of Natural Products, Cambridge University Press).
Die Samen der Aesculus An sind als Kastanien bekannt und werden als Nahrungsmittel, Futter und Trockenfutter, für die Herstellung von Alkohol verwendet. Sie verfügen über eine therapeutische Bedeutung in der Humanen und Veterinären Medizin, zum Beispiel bei der Behandlung von Fieber, für die Verwendung in der Heilung von Hämorrhoiden, eine hartnäckige Obstipation, der Brust in einer Zeitdauer und Krebs. Das Mehl der Kastanie wird zur Reinigung von öliger Haut angewendet. Aufgrund ihres Saponin-Gehaltes haben die Samen toxische Eigenschaften. Alkoholische Extrakte der Samen von A. hippocastanum zeigen hoemolytische, antiödemische und andere pharmakologische Eigenschaften. Extrakte sind auch in Kosmetika angewendet worden, wobei das aus A. indica Samen extrahierte Öl eine signifikante anti-inflammatorische Aktivität in Carrageenin-induzierten Ödemen in Ratten zeigt. Mitunter erhöht die Zugabe von anderen pflanzlichen Extrakten oder chemischen Verbindungen ihre Aktivität oder verursachen eine Änderung der biologischen Effekte (Hostettmann, K. Marston, 1995, A., Saponins, in Chemistry and Pharmacology of Natural Products, Cambridge University Press; Kirtikar, K. R., Basu, B. D., 1935, Glossary of Indian Medicinal Plants L. M. Basu, Allahabad, India Vol. I. p. 626; Singh, B. Agrawal, P. K., 1996, Chemistry and Biological Activity of Aescin, in Supplements to Cultivation and Utilization of Medicinal Plants, (eds.) S. S. Handa and M. K. Kaul, PP 457 – 476 (RRL Jammu, CSIR).
Aescin ist für seine anti-inflammatorische und anti-ödemische Aktivität bekannt und wird in der tropischen Anwendung von Salben und oralen Herstellung für die Behandlung von peripheren vaskulären Erkrankungen verwendet (Bruneton, J., 1995, Pharmacognosy, Phytochemistry and medicinal plants, Paris, France, Lavoisier). Hypoglykämische und anti-inflammatorische Aktivitäten von unterschiedlichen Derivaten von Aescin, isoliert aus Kastaniensamen, ist gezeigt worden (Yoshikawa, M., Murakami, T., Yamahara, J., 1998, Bioactive saponins and glycosides. XII horse chestnut (2), structure of escin IIIb, IV and VI and isoescins Ia, Ib and V, acylated polyhydroxy oleanane triterpene oligoglycosides, from the seeds of horse chestnut tree (Aesculus hippocastanum L., Hippocastanaceae), Chemical and pharmaceutical bulletin 46, 1764 – 1769).
Für Kastanienextrakte ist berichtet worden, dass sie heilsame Effekte auf Venen-Insuffizienz und damit verbundenen Zuständen haben. Aescin zeigte eine potente anti-inflammatorische Aktivität, reduziert auch die Kapillarfragilität und hat daher geholfen, ein Auslaufen der Flüssigkeit in die umgebenden Gewebe, was eine Schellung verursachen kann, zu verhindern. Es ist auch gefunden worden, dass Kastanienextrakt ein leistungsfähiges Anti-Oxidationsmittel wie Vitamin E ist. Unter 65 getesteten pflanzlichen Extrakten ist für Kastanienextrakt gezeigt worden, dass es eins von den höchsten 'aktiven Sauerstoff Radikalfänger-Eigenschaften hat. Er zeigte starke Zellschützende Effekte. Diese Aktivitäten sind mit Anti-Alterungs-Eigenschaften von Anti-Oxidationsmitteln verknüpft. Der Extrakt ist auch reich an einer Anzahl von Flavonoiden, wie zum Beispiel Derivaten von Quercetin und Kaempferol. Flavonoide haben auch schützende Effekte auf die Blutgefäße und sind als starke Anti-Oxidationsmittel sehr gut bekannt (Wilkinson, J. A., Brown, A. M. G., 1999, Horse chestnut-Aesculus hippocastanum. Potential application in cosmetic skin-care products, International Journal of Cosmetic Science, Vol. 21 (6), 437 – 447). Pharmazeutische Herstellungen, die Aescin enthalten, sind für die Behandlung verschiedener Arten von Ödemen und Funktionsstörungen des venösen Kreislaufsystems hergestellt worden. Das Trockensamenextrakt wird verarbeitet, um Pellets mit Dextrin zu bilden. Die endgültigen Produkte können am besten als harte Gelatinenkapseln oder Bindemitteltabletten, die das Extrakt enthalten, zur Verfügung gestellt werden (Tobin, J., Heese, G. U., 1999, Production of pharmaceutical formulation containing aescin for treatment of edema & venous disorder EP, 900563 A1 ). Eine kosmetische und medizinische Hilfszusammensetzung (paramedical composition), die wässrige Ethanol Extrakte von Ringelblume, Kastanien, Süßholz, wäßrige Extrakte von Gänsefingerkraut, Walnußbaumblättern, Lavendelharzen und Römischer Kamille enthält mit Ethanol-Wasserträgern in festen Anteilen. Die obige Vorstellung dient als Grundmaterial für hervorragende kosmetische Zusammensetzungen, heilende Kosmetik & heilende Produkte. (Hangay, G., Kelen, A., Ranky, S. K., Gulyas, A., Simonovits, E., Vinezenee, K. J., Szepesi, G., Kesera, P., Selmeczi, A., Putz, P., 1992, Cosmetic and paramedical composition containing plant extracts, US 5080901 ). Die Verwendung von Aescin-Komplexen mit β-Sitosterol oder Cholesterin und Phospholipiden als pharmazeutische Zusammensetzung ähnlich wie anti-inflammatorische sauer vasotonische Mittel ist beschrieben worden (Bombardelli E., Patri G., Pozzi R., Complexes of aescin, β-sitosterol or cholesterol and phospholipids and pharmaceutical compositions containing them, US 5118671 , 1992).
In einer weiteren, welche sich auf ein Medikament bezieht, das einen Standard-Trockenextrakt von Kastaniensamen umfasst, die gegen verschiedene Arten von Ödemen und Erkrankungen des venösen Kreislaufsystems wirksam ist und ein Verfahren zur Herstellung von diesem Medikament. In diesem Verfahren wird das Puder mit Alkohol und Wasser extrahiert, um eine alkoholische Tinktur zu erhalten. Die Tinktur wird mit Dextrin gemischt und Spray getrocknet für die weitere Bildung von Pellets mit Polyvinyl Pyrrolidon, Talcum. Dieses wird weiter mit Alkohol benetzt und eine Palletierung wird mit der Hilfe von einem Mixer/einer Granulatorvorrichtung oder einem Marumerizer vorgenommen, einem Spheronisierer oder anderen palletierendem Material. Die obige Herstellung umfasst ein Standard-Extrakt für die Behandlung von venösen Kreislauffunktionsstörungen venöser Insuffizienz Entzündungen, Ödeme, einschließlich Gehirnödeme oder Schwellungen (Toblin, J., Heese, G. U., 2000, Production of pharmaceutical formulations for treatment of edema and venous disorders, US 6077534 ).
Aescin, auch bekannt als Escin, ist ein Gemisch von Triterpen-Saponinen und ist der bioaktive Hauptbestandteil von Kastaniensamen, Zweigen, Keimen und Blättern (Mete, K. O., Kara, M., Kara, S., 1994, Quantitative determination of escin. A comparative study of HPLC and TLC-densitometry, Fitoterapia, 65, 439 – 443). Ein verseifter Teil der Samen zeigte das Vorhandensein von verschiedenen Fettsäuren, einschließlich Arachinsäure, Stearinsäure, Ölsäure und Laurinsäure (Srijanyanta S.; Raman A.; Goodwin B. L.). Aescin ist in zwei Formen als β-Aescin und α-Aescin vorhanden. β-Aescin, welches aus Protoaescingenun und Barringtogenol erhalten wird, kommt im Verhältnis von 8:2 vor (Bombardelli, E., Morazzoni, P., Griffini, A., 1996, Aesculus hippocastanum L., Fitoterapia, 67, 483 – 511). Samenöl enthält 65 – 70 % Ölsäure. Andere Bestandteile umfassen Phenolsäure, das Coumarin-Derivat Aesculin, Kohlenwasserstoffe, wie zum Beispiel Squalen und Nonacosan und Cyclitol (Stankovic, S. K. Bastic, M. B. Jovanovic, J. A., 1987, Ontogenetic distribution of hydrocarbons in horse chestnut seed (Aesculus hippocastanum L.), Herba Polonica, 33, 3 – 8). Aesculin, aus der Rinde von Kastanien extrahiert, wird in Herstellungen für die Behandlung von peripheren vaskulären Erkrankungen, Hämorrhoiden und Kosmetika verwendet, die entwickelt worden sind, um die Hautalterung zu verbessern (Bombardelli, E., Morazzoni, P., Griffini, A., 1996, Aesculus hippocastanum L., Fitoterapia, 67, 483 – 511). Insgesamt enthalten Samen 3 % Wasser, 3 % Asche, 11 % unverarbeitetes Protein, 5 % Öl und 74 % Kohlenhydrate (Duke, J. A., 1985, CRC Handbook of medicinal herbs, Boca Raton, FL, CRC Press). Kürzlich sind acht bioaktive Saponine aus Aesculus chinensis berichtet worden, einschließlich vier neuer Verbindungen. Die wichtigsten sind Escin Ia (6), Escin Ib (7), Isoescin Ia (8) und Isoescin Ib (9) und die neuen Verbindungen Escin IVc (22αtigloyl-28-acetyl protoaescigenin-3β-O-[β-D-glucopyranosyl(1 – 2)][β-D-glucoppyranosyl(1 -4)]-β-D-glucopyranosiduronsäure)(10), Escin IVd (2α-Angeloyl-28-acetylprotoaescigenin-3β-O-[β-D-glucopyranosyl(1 – 2)][β-D-glucopyranosyl(1 – 4)]-β-D-glucopyranosiduronsäure)(11), Escin IVe (28-tigloylproaescingenin-3β-O-[β-D-glucopyranosyl(1 – 2)][β-D-glucopyranosyl(1 – 4)]-β-D-gluco-pyranosiduronsäure)(12), Escin IVf (28-angeloylprotoaescigenin-3β-O-[β-D-glucopyranosyl(1 – 2)][β-D-glucopyranosyl(1 – 4)]-β-D-glucopyranosiduronsäure)(13). Über diese Verbindung ist berichtet worden, dass sie eine inhibitorische Aktivität gegenüber HIV-1 Proteasen aufweisen. Einige der Hauptbestandteile, die in Aescin vorhanden sind, sind in 1 aufgelistet (Yang X – W.; Zhao J.; Cin Y – X.; Lin X – H.; Mac-M.; Hattori M.; Zhang L – H.; 1999, Anti-HIV-1 Protease Triterpenoid saponins from the seeds of Aesculus chinesis, Jour. Nat. Prod., 62 (11) 1510 – 1513). Ein antiinflammatorisches Mittel, das Aescin Ib & IIb mit Angeloyl-Gruppen umfasst, welches ein Saponin-Bestandteil von Aesculus hippocastanum ist, ist hergestellt worden. Die Reinigung von Aescin Ib & IIb ist aus einer Butanol-Fraktion eines Methanol-Extrakts nach einer Säulen-Chromatographie ausgeführt worden, gefolgt durch eine Hochleistungsflüssigkeit-Chromatography (high performance liquid chromatography) (Yamahara, J., Araki, N., Otsuji, K., 1998, Antiinflammatory Agent, JP 10017591 A2 ).
Das Aescin ist aus Kastaniensamenextrakt durch Absorbieren der wäßrigen Lösung der Samen auf synthetische Polymere (polar und medium polar) gereinigt worden. Das Harz, welches das absorbierte Aescin enthält, ist gründlich mit Wasser gewaschen worden und eine Verbindung ist mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel hergestellt worden oder sein Gemisch mit Wasser, um die Aescin-Fraktion von Unreinheiten getrennt zu erhalten. Ein Nachteil der Erfindung war, dass das synthetische Harz in Form von Polymeren für die Reinigung von Aescin verwendet worden ist, somit eine Erhöhung der Produktionskosten bedeutet (Ogawa, S., Maruzeu, K. K. K., 1987, Purification of aescin, JP 62081325 A2 ). Ein Verfahren für die Herstellung von Aescin-reichen Konzentraten aus Kastaniensamen durch Entfettung der Samen und Extraktion mit schwachen Säuren wie Essigsäure/Ameisensäure, gefolgt durch das Freimachen des Samen von Fetten mit nieder-molekularem Alkohol oder Aceton. Das Extrakt ist weiter getrocknet worden, um eine Aescin-reiche Fraktion zu erhalten. In diesem Verfahren war der Nachteil, dass die pulvrigen Samen zuerst mit Hexan behandelt worden sind, um das Material zu entfetten, und dann mit einer schwachen Säure, gefolgt durch Trocknung. Das getrocknete Pulver ist dann mit einem nieder-molekularen Alkohol extrahiert worden, um ein Aescin-reiches Konzentrat zu ergeben (Menssen, H. G., Geyen, M., 1971, Process for the production of an aescin rich concentrate of active material from Korse chestnut seeds, US 3609137 ).
Wahlweise ist das Aescin aus der Kastanie durch Bildung von Komplexen extrahiert worden. Auf diese Weise sind entfettete Kastanien mit Propylen-Glycol, 1, 3, Bulylen-Glycol oder Glycerol mit wäßrigem Ethanol oder einer wäßrigen Isopropanollösung behandelt worden, um 2,5 % Aescin zu erhalten, was als noch stabilere Komponente betrachtet wird. Der Nachteil dieses Verfahrens war, dass die pulvrigen Kastanien zunächst entfettet worden sind, gefolgt durch die Bildung eines Komplexes mit Propylen-Glycol, 1, 3, Bulylen-Glycol oder Glycerol und dann eine Extraktion mit wäßrigen organischen Lösungsmitteln, Befreiung des Aescin aus dem Komplex, gefolgt durch Kristallisierung, um 2,5 % Aescin zu erhalten. Dieses Verfahren erhöhte die Anzahl der involvierten Reinigungsschritte, dadurch die Produktionskosten erhöhend (Dzienget, K., 1964, Stable saponin containing extract from Korse chestnut Ger. 1,182,385). In einem noch anderen Verfahren ist das Aescin in Form von Cholesterin extrahiert worden, indem die Samen mit 10 % wäßrigem Alkohol mit Cholesterin in Ether behandelt wurden und für eine Stunde bei 90 °C gerührt wurde. Das Ether ist abgedampft worden und der Rest zentrifugiert und mit Wasser bis zur Farblosigkeit gewaschen worden. Der Rest ist mit Methanol behandelt worden und das Material ist abgefiltert worden. Die Lösung ist mit aktivem Kohlenstoff entfärbt worden. Das Methanol ist im Vakuum entfernt worden und der Rest getrocknet worden, um Aescin zu ergeben. Der Hauptnachteil in diesem Verfahren war, dass das Puder einer Anzahl von Schritten unterworfen war, durch Bildung eines Komplexes mit Cholesterin, entfettendem Extrakt, Befreiung aus dem Komplex, Zentrifugation des extrahierten Materials, Entfärbung des Extrakts, etc. Somit sind die Produktionskosten erhöht worden (Wagner, J., bosse, J., 1964, Genuine aescin from horse chestnut extract, US 3163636 ).
Aescin aus A. hippocastanum ist auch in kristalliner Form durch Extraktion der gemahlenen Samen mit Wasser-mischbaren getrennt worden und durch den Lauf des Extraktes über einen Kationenaustauscher Harz. Das Elutionsmittel ist präzipitiert worden, um rohes Aescin durch Neuauflösung in Methanol zu erhalten und Präzipitation mit Wasser. Der Nachteil dieses Verfahrens war, dass das Extrakt hergestellt wurde, um über ein Kationenaustauscher Harz zu laufen, was ein sehr kostspieliges Geschäft ist. Somit sind die Kosten der Herstellung erhöht (Rolf, M., 1977, Aesculus hippocastanum saponin and salts, Ger. 2530941). In einem weiteren Verfahren für die Isolation von β-Escin sind die getrockneten, gemahlenen Früchte der Kastanie mit C_4-5 aliphatischen Alkohol behandelt worden und Wasser, gesättigt mit Alkohol. Das Aescin ist aus der organischen Phase extrahiert worden, nachdem auf eine Änderung der Polarität durch Hinzugabe eines C_4-5 aliphatischen Esters, bevorzugt Ethylacetat mit Bicarbonat bei pH 5,0 – 5,5, gewirkt worden ist. Das Verhältnis von α:β variierte von 10:90 bis 20:80 in Abhängigkeit von der Quelle und den Landwirtschaftsbedingungen. Der Nachteil dieses Verfahrens war, dass die Anzahl von Extrahierungsschritten erhöht worden ist, somit macht es das Verfahren noch länger und Kosten-ineffektiv (Rudolf, R., Stanstav, J., 1978, Isolation of escin from horse chestnuts Span. 455, 693). In einem noch anderen Verfahren ist das Aescin aus gemahlenen Kastanien mit einem Gemisch aus Wasser-gesättigtem Alkohol und Alkohol, gesättigt mit Wasser extrahiert worden. Die organische Phase ist durch Polaritätenänderung mit Ethylacetat gereinigt worden, weitere Behandlung mit Natrium-Bicarbonat bei einem pH von 5,0 – 5,5, was ein Natriumsalz von Escin ergab. Dieses ist mit aktivem Kohlenstoff entfärbt worden und gefolgt durch den Lauf über einen Kationenaustauscher Harz, um Aescin in einer Ausbeute von 2,2 % mit 220 – 30 °C mp zu erhalten. Nachteil dieses Verfahrens war auch hier, dass die Anzahl der Extrahierungsschritte durch Polaritätenänderung mit Ethylacetat, Behandlung mit Natrium-Bicarbonat, dem Lauf über einem Kationenaustauscher Harz erhöht worden war, um Aescin in einer Ausbeute von 2,2 % zu erhalten, auf diese Weise das Verfahren in die Länge ziehend, mühsam und Kosten-ineffektiv (LEK, Tovarm, 1976, isolation of aescin from horse chestnut, Ger. 233204). In einem noch weiteren Verfahren sind die Kastanien mit einer wäßrigen Lösung bei pH < 3 mit Salzsäure behandelt worden, gefolgt durch wiederholte Extraktion mit aliphatischem Alkohol C_3-6 und mit chloriertem C_1-2 Kohlenwasserstoff, um reines Aescin zu erhalten. Der Nachteil von diesem Verfahren war, dass die Säure und eine Anzahl von organischen Lösungsmitteln verwendet worden sind, um Aescin in geringer Ausbeute zu erhalten (weniger als 3 %) (Knoll, A. G., 1967, Quantitative recovery of pure escin from horse chestnut extract, Fr. 1,587,868).
In sämtlichen oben genannten Verfahren für die Extraktion und Reinigung von Aescin aus der Kastanie (Aesculus species) ist entweder die verwendete Methodik lang und mühsam, wodurch die Anzahl der involvierten Schritte erhöht wird oder andere Komponenten verwendet werden, um die Extraktion und Reinigung zu erreichen wie Komplexbildung, die Verwendung von Harzen (Kation/Anion), aktivem Kohlenstoff, Aufrechterhaltung des pH's durch Verwendung von Säuren/Basen und Polaritätenänderung sind involviert und die Produktionskosten sind erhöht. Dahingegen beschreiben wir ein vereinfachtes, leichtes und bequemes Verfahren für die Extraktion und Reinigung von Aescin aus der indischen Roßkastanie (Aesculus indica).
Ziele der Erfindung
Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist, ein einfaches Verfahren für die Reinigung von Aescin aus der indischen Roßkastanie (Aesculus indica) zu entwickeln.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein einfaches und wirtschaftlich günstiges Extraktionsverfahren für Aescin aus der indischen Roßkastanie (Aesculus indica Samen) zu entwickeln, einer Komponente mit pharmazeutischer Bedeutung, welche wild in den hohen Bergen des Himalayas wächst und nicht genutzt jedes Jahr in Hunderten von Tonnen vergeht.
Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein einfaches und günstiges Verfahren für die Reinigung von Aescin aus der indischen Roßkastanie in 2,0 – 3,0 % Ausbeute der gewünschten Spezifikation bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein einfaches Verfahren für die Herstellung von β-Aescin aus der indischen Rosskastanie zur Verfügung, welches die Nachteile des Standes der Technik überwindet. Die Reinheit des Produktes β-Aescin ist mehr als 90 % und vergleichbar zum Standard-β-Aescin, das kommerziell erhältlich ist.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhalt von β-Aescin aus der indischen Roßkastanie (Aesculus indica) zur Verfügung, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) Extrahieren von pulverisiertem Samen der indischen Roßkastanie mit einer Mischung aus Wasser und einem Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht, wobei der Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methanol und Ethanol,
b) Filtrieren der Lösung von Schritt (a), um einen wäßrigen Alkanolextrakt bereitzustellen,
c) Entfernen des Alkanols aus Schritt (b), um einen im wesentlichen wäßrigen Extrakt bereitzustellen,
d) Trennen des wäßrigen Extraktes aus Schritt (c) mit Wasser-unmischbarem niederem Alkanol, gesättigt mit Wasser, wobei der Wasser-unmischbare Alkanol ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus n-Butanol und n-Propanol oder ihren Mischungen, bevorzugt n-Butanol,
e) Trennen der organischen Schicht und wäßrigen Schicht aus Schritt (d),
f) Behandeln der organischen Schicht aus Schritt (e) mit 0,5 bis 1,0 % wäßriger Alkalihydroxidlösung und Trennen der organischen Schicht,
g) Waschen der organischen Schicht aus Schritt (f) unter Verwendung von Wasser, gesättigt mit Wasser-unmischbarem Alkanol, wobei der Wasser-unmischbare Alkanol ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus n-Butanol und n-Propanol oder ihrer Mischung davon, bevorzugt n-Butanol,
h) Passieren der gewaschenen organischen Schicht aus Schritt (g) durch saures Aluminiumoxid, um eine organische Lösung zu erhalten, und
i) Konzentrieren der organischen Lösung aus Schritt (h), um ein weißes amorphes Pulver von β-Aescin mit einem Schmelzpunkt von 220 – 225 ° C, [α]_D–25 – –30, pH 3,0 – 4,5, zu erhalten.

Eine noch weitere Ausführungsform der Erfindung, das in dem Extraktionsverfahren verwendete Verhältnis von Alkanol zu Wasser im Bereich zwischen 1:1 und 8:2 liegt.
Eine noch weitere Ausführungsform der Erfindung, das für das Trennen der organischen Schicht verwendete Alkalihydroxid ist ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Lithiumhydroxid, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, bevorzugt Natriumhydroxid.
Eine noch weitere Ausführungsform der Erfindung, das aus der indischen Roßkastanie (Aesculus indica) erhaltende Produkt β-Aescin ist in reiner Form.
Eine noch weitere Ausführungsform der Erfindung, die Ausbeute von β-Aescin aus der indischen Roßkastanie (A. indica) liegt in dem Bereich von 2,0 – 3,0 %.
Eine noch weitere Ausführungsform der Erfindung, die Reinigung von dem aus der indischen Roßkastanie (A. indica) erhaltenen β-Aescin ist im Bereich von 90 – 95 %.
Eine noch weitere Ausführungsform der Erfindung, das β-Aescin, das in dem besagten Verfahren erhalten wird, wird für die kommerzielle Herstellung von β-Aescin für verschiedene, pharmazeutische Herstellungen verwendet.
Das obige besagte Verfahren kann für die Verwendung von wild wachsenden und erneuerbaren Quellen der indischen Roßkastanie für die kommerzielle Herstellung von β-Aescin verwendet werden, welche ansonsten jedes Jahr in Hunderten von Tonnen aus der Himalayischen Region ungenutzt verbleibt.
Die vorliegende Untersuchung stellt ein vereinfachtes Verfahren für die Reinigung von β-Aescin aus der indischen Roßkastanie (Aesculus indica) zur Verfügung, welches umfasst (a) Sammeln, Trocknen und Mahlen der indischen Roßkastanie (Aesculus indica Samen) (b) Extraktion der pulverisierten Samen mit wäßrigen nieder-molekularen Alkoholen (Methanol/Ethanol und Wasser, 1:1 – 8:2) (c) Fraktionierung des Alkohol-freien Extrakts mit n-Butanol oder Isopropanol gesättigt mit Wasser (d) Behandlung des n-Butanols/Isopropanolextraktes mit einer Base 0,5 – 1,0 % Natrium/Kaliumhydroxid und Trennung der wäßrigen und organischen Schicht in trennenden Trichtern (e) Waschen der organischen Schicht mit Wasser gesättigt mit Butanol (f) Passieren der organischen Schicht durch saures Aluminiumoxid (g) Konzentrierung der organischen Schicht, um ein weißes amorphes Pulver zu erhalten, mit einem Schmelzpunkt (mp) von 220 – 225 °C, [α]_D –25 – –30, pH 3,0 – 4,5 und einem gleichen Rf.-Wert wie β-Aescin, wie auf einer TLC (thin later chromatography, beschichtet mit Silica-Gel) Platte gesehen wird (Lösungsmittelsystem: Chloroform, Essigsäure, Methanol, Wasser; 60,32,12,6). Standardproben sind von Sigma Chemicals bezogen worden. Aescin ist aus der indischen Roßkastanie (Aesculus andica Samen) durch Trocknen, Mahlen und Extrahieren mit Wasser und einem Ethl/Methyl-Alkoholgemisch erhalten worden, gefolgt durch die Entfernung des organischen Lösemittels und Fraktionierung der wäßrigen Schicht mit Butanol/Isopropanol, gesättigt mit Wasser. Behandeln der organischen Schicht, das heißt, Butanol/Isopropanol-Fraktion mit einer Base in einem trennenden Trichter mit behutsamem Schütteln. Waschen der Basen-behandelten organischen Schicht mit Wasser, gesättigt mit Butanol, gefolgt durch Passieren der organischen Schicht durch saures Aluminiumoxid. Destillieren der organischen Schicht, um Aescin als weißes amorphes Puder zu erhalten.
In noch weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist Aescin in gereinigter Form erhalten worden, mit einem Schmelzpunkt (mp) von 220 – 225 °C, [α]_D –25 – –30, pH 3,0 – 4,5 und einem gleichen Rf.-Wert wie β-Aescin, wie auf einer TLC (thin later chromatography, beschichtet mit Silica-Gel) Platte gesehen wurde (Lösungsmittelsystem: Chloroform, Essigsäure, Methanol, Wasser; 60,32,12,6).
Kurze Beschreibung der beigefügten Zeichnung
1 zeigt einige der Haupt-Triterpen-Glycoside, die in Aescin vorhanden sind.
Das folgende Beispiel wird als Beispiel der Veranschaulichung gegeben und sollte daher nicht als Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung ausgelegt werden.
Beispiel
Getrocknete und gemahlene indische Roßkastanie (Aesculus indica Samen) 1,0 kg sind in einen Perkolator plaziert worden und mit einem wäßrigen nieder-molekularen Alkohol wie Methanol/Ethanol in dem Verhältnis von 1:1 – 2:8 (V/V), jedes Mal 1,5 – 2,0 lit., kalt extrahiert worden. Das Verfahren der Extraktion ist sechs- bis achtmal wiederholt worden. Nach Entfernung des Lösungsmittels in einem Rotavapour unter reduziertem Druck, ist das Extrakt mit wäßrigem Natriumhydroxid (0,5 – 1,0 %) behandelt worden und nacheinander mit n-Butanol oder Isopropanol, gesättigt mit Wasser, acht- bis zwöfmal fraktioniert worden. Eine verbundene organische Schicht, welche das β-Aescin enthält, ist mit wäßrigem Natriumhydroxid gewaschen worden und die Wäschen sind mit der wäßrigen Schicht gemischt worden. Die Butanol-Schicht ist weiter mit Wasser, gesättigt mit Butanol/Isopropanol, drei- bis viermal gespült worden. Die organische Schicht ist dann durch saures Aluminiumoxid (300 – 400 gm) in einem gesinterten Trichter unter Vakuum passiert worden. Sämtliche Trennungen und Fraktionierungen sind in einem trennenden Trichter mit behutsamem Schütteln ausgeführt worden, um die Bildung einer Emulsion zu vermeiden. Das Filtrat ist in einem Rotavapour unter Vakuum konzentriert worden, um ein weißes amorphes Puder in 2,0 – 3,0 % Ausbeute zu erhalten, mit einem Schmelzpunkt (mp) von 220 – 225 °C, [α]_D –25 – –30, pH 3,0 – 4,5 und einem gleichem Rf.-Wert wie β-Aescin, wie auf einer TLC (thin later chromatography beschichtet mit Silica-Gel) Platte (Lösungsmittelsystem: Chloroform, Essigsäure, Methanol, Wasser; 60,32,12,6) gesehen wurde, von Standardproben erhalten von Sigma Chemicals, die eine Reinheit von 90 – 95 % haben.
Die Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung sind:

1. Aesculus indica Pflanzen wachsen wild in gemäßigten und sub-gemäßigten Regionen der Himalaya-Zone von Jammu & Kashmir, Himachal Pradesh, Uttranchal und der Nord-Ost-Staaten, ist infolge dessen in großen Mengen leicht erhältlich.
2. Die Samen werden für die Herstellung von β-Aescin verwendet, die eine erneuerbare Quelle aus der Pflanze sind und infolgedessen keine Gefährdung der Artenvielfalt.
3. β-Aescin ist ein natürliches Produkt und infolgedessen keine Gefährdung für die Umwelt.
4. Sie stellt ein einfaches Verfahren für die Reinigung von β-Aescin aus der indischen Roßkastanie zur Verfügung (Aesculus indica Samen).
5. Sie stellt ein einfaches und sehr günstiges Extraktionsverfahren für β-Aescin zur Verfügung, eine Komponente mit pharmazeutischer Bedeutung aus der indischen Roßkastanie (Aesculus indica Samen), welche wild in den hohen Bergen des Himalayas wächst und jedes Jahr in Hunderten von Tonnen ungenutzt vergeht.
6. Sie stellt eine Möglichkeit zur Verfügung, um Einstellungen von Hügel/Stammesleuten als Samensammler zu generieren.
7. Eine andere Verwendung der vorliegenden Erfindung ist der Umfang der kommerziellen Herstellung von Aescin für verschiedene pharmazeutische Herstellungen.

Claims

Verfahren zum Erhalt von β-Aescin aus indischer Roßkastanie (Aesculus indica), wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Extrahieren von pulverisierten Samen der indischen Roßkastanie mit einer Mischung aus Wasser und einem Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht, wobei der Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Methanol und Ethanol, b) Filtrieren der Lösung von Schritt (a), um einen wäßrigen Alkanolextrakt bereitzustellen, c) Entfernen des Alkanols aus Schritt (b), um einen im wesentlichen wäßrigen Extrakt bereitzustellen, d) Trennen des wäßrigen Extraktes aus Schritt (c) mit Wasser-unmischbarem niederem Alkanol, gesättigt mit Wasser, wobei der Wasser-unmischbare Alkanol ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus n-Butanol und n-Propanol oder ihren Mischungen, bevorzugt n-Butanol, e) Trennen der organischen Schicht und wäßrigen Schicht aus Schritt (d), f) Behandeln der organischen Schicht aus Schritt (e) mit 0,5 bis 1,0% wäßriger Alkalihydroxid-Lösung und Trennen der organischen Schicht, g) Waschen der organischen Schicht aus Schritt (f) unter Verwendung von Wasser, gesättigt mit Wasser-unmischbarem Alkanol, wobei der Wasser-unmischbare Alkanol ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus n-Butanol und n-Propanol oder Mischungen davon, bevorzugt n-Butanol, h) Passieren der gewaschenen organischen Schicht aus Schritt (g) durch saures Aluminiumoxid, um eine organische Lösung zu erhalten, und i) Konzentrieren der organischen Lösung aus Schritt (h), um ein weißes amorphes Pulver von β-Aescin mit einem Schmelzpunkt von 220 – 225 °C, [α]_D–25 – –30, pH 3,0 – 4,5, zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verhältnis von Alkanol zu Wasser im Bereich zwischen 1:1 und 8:2 liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (f) das Alkalihydroxid ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus Lithiumhydroxid, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, bevorzugt Natriumhydroxid.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das obige Verfahren ein einfaches Verfahren zur Aufreinigung von β-Aescin aus indischer Roßkastanie (Aesculus indica) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ausbeute von β-Aescin aus indischer Roßkastanie (A. indica) im Bereich von 2,0 – 3,0% liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Aufreinigung von β-Aescin aus indischer Roßkastanie (A. indica) im Bereich von 90 – 95% liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das obige Verfahren zur kommerziellen Herstellung von β-Aescin für verschiedenen pharmazeutische Zubereitungen verwendet werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das obige Verfahren zur Verwendung von wildwachsenden und erneuerbaren Quellen von indischer Roßkastanie zur kommerziellen Herstellung von β-Aescin verwendet werden kann, welche ansonsten jährlich in Hunderten von Tonnen aus der Himalaya-Region verschwendet werden.