DE602004011814T2 - Benzoylaminopyridylcarbonsäurederivate als glucokinaseaktivatoren - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Gruppe von Benzoylaminopyridylcarbonsäuren, die bei der Behandlung oder Prävention einer durch Glucokinase (GLK) vermittelten Erkrankung bzw. von einem durch GLK vermittelten medizinischen Leiden, wodurch die Glucoseschwelle für die Insulinsekretion erniedrigt wird, nützlich sind. Weiterhin wird vorhergesagt, daß die Verbindungen den Blutglucosespiegel durch Erhöhung der Glucoseaufnahme in der Leber erniedrigen. Derartige Verbindungen können für die Behandlung von Typ-2-Diabetes und Fettleibigkeit von Nutzen sein. Außerdem betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Verbindungen enthalten, und Verfahren zur Behandlung von durch GLK vermittelten Krankheiten mit diesen Verbindungen.
  • In den Pankreas-β-Zellen und Leberparenchymzellen ist GLUT2 der wichtigste Glucosetransporter durch die Plasmamembran. Unter physiologischen Glucosekonzentrationen ist die Rate, mit der GLUT2 Glucose durch die Membran transportiert, für die Gesamtrate der Glucoseaufnahme in diesen Zellen nicht geschwindigkeitslimitierend. Die Rate der Glucoseaufnahme wird durch die Rate der Phosphorylierung von Glucose zu Glucose-6-phosphat (G-6-P) limitiert, die durch Glucokinase (GLK) katalysiert wird [1]. GLK weist einen hohen (6–10 mM) Km-Wert für Glucose auf und wird durch physiologische G-6-P-Konzentrationen nicht gehemmt [1]. Die GLK-Expression ist auf einige wenige Gewebe- und Zelltypen beschränkt, insbesondere Pankreas-β-Zellen und Leberzellen (Hepatozyten) [1]. In diesen Zellen ist die GLK-Aktivität für die Glucoseverwertung geschwindigkeitslimitierend und reguliert daher das Ausmaß der glucoseinduzierten Insulinsekretion und der Glycogensynthese in der Leber. Diese Vorgänge sind bei der Aufrechterhaltung der Glucosehomöostase des Körpers insgesamt kritisch, und beim Diabetes ist die Funktion von beiden gestört [2].
  • Bei einer Unterart des Diabetes, nämlich dem Typ-2-Diabetes mellitus bei Jugendlichen (MODY-2), wird der Diabetes durch Funktionsverlustmutationen der GLK verursacht [3, 4]. Die Hyperglykämie bei MODY-2-Patienten ist das Ergebnis einer defizienten Glucoseverwertung sowohl im Pankreas als auch in der Leber [5]. Eine defiziente Glucoseverwertung im Pankreas von MODY-2-Patienten führt zu einer erhöhten Schwelle für die glucosestimulierte Insulinsekretion. Umgekehrt erniedrigen seltene aktivierende Mutationen der GLK diese Schwelle, was zu familiärem Hyperinsulinismus führt [6, 6a, 7]. Zusätzlich zu der bei MODY-2-Diabetikern beobachteten verringerten GLK-Aktivität ist die Glucokinaseaktivität in der Leber auch bei Typ-2-Diabetikern verringert [8]. Sehr wichtig ist die Tatsache, daß die GLK-Überexpression, entweder im ganzen Körper oder selektiv in der Leber, die Entwicklung des Diabetiker-Phänotyps sowohl in ernährungsbedingten als auch in genetischen Modellen dieser Krankheit verhindert oder aufhebt [9–12]. Weiterhin verbessert die akute Behandlung von Typ-2-Diabetikern mit Fructose die Glucosetoleranz durch Stimulation der Glucoseverwertung in der Leber [13]. Es wird angenommen, daß dieser Effekt durch einen fructoseinduzierten Anstieg der zytosolischen GLK-Aktivität in Leberzellen durch den im folgenden beschriebenen Mechanismus vermittelt wird [13].
  • Die GLK-Aktivität in der Leber wird durch Assoziation mit dem GLK-regulierenden Protein (GLKRP) gehemmt. Der GLK/GLKRP-Komplex wird durch Bindung von Fructose-6-phosphat (F6P) an das GLKRP stabilisiert und durch Verdrängung dieses Zuckerphosphats durch Fructose-1-phosphat (F1P) destabilisiert. F1P entsteht durch die fructokinasevermittelte Phosphorylierung von Fructose in der Nahrung. Demzufolge werden die Integrität des GLK/GLKRP-Komplexes und die GLK-Aktivität der Leber ernährungsabhängig reguliert, da F6P im postresorptiven Status erhöht ist, während F1P überwiegend im postprandialen Status vorliegt. Im Gegensatz zu Leberzellen exprimieren die β-Zellen des Pankreas GLK in Abwesenheit von GLKRP. Die GLK-Aktivität in β-Zellen wird daher ausschließlich durch die Verfügbarkeit ihres Substrats Glucose reguliert. Kleine Moleküle können die GLK direkt oder durch Destabilisierung des GLK/GLKRP-Komplexes aktivieren. Die erstgenannte Verbindungsklasse soll die Glucoseverwertung sowohl in der Leber als auch im Pankreas stimulieren, wohingegen die letztgenannte Klasse ausschließlich in der Leber wirken soll. Es kann jedoch vorhergesagt werden, daß Verbindungen mit jedem dieser Profile bei der Behandlung von Typ-2-Diabetes von therapeutischem Nutzen sein werden, da diese Erkrankung durch eine gestörte Glucoseverwertung in beiden Geweben gekennzeichnet ist.
  • GLK und GLKRP sowie der KATP-Kanal werden in Neuronen des Hypothalamus exprimiert, einer für die Regulierung des Energiehaushaltes und die Steuerung der Nahrungsmittelaufnahme wichtigen Hirnregion [14–18]. Es ist gezeigt worden, daß diese Neuronen appetitfördernde sowie appetitzügelnde Neuropeptide exprimieren [15, 19, 20], und es ist angenommen worden, daß es die glucosewahrnehmenden Neuronen im Hypothalamus sind, die durch Veränderungen der Glucosekonzentrationen in der Umgebung entweder gehemmt oder angeregt werden [17, 19, 21, 22]. Die Fähigkeit dieser Neuronen, Veränderungen des Glucosespiegels wahrzunehmen, ist bei verschiedenen genetischen und experimentell induzierten Modellen der Fettleibigkeit gestört [23–28]. Die intrazerebroventrikuläre (icv) Infusion von Glucoseanaloga, die kompetitive Hemmer der Glucokinase darstellen, stimulieren die Nahrungsmittelaufnahme bei schlanken Ratten [29, 30]. Im Gegensatz dazu unterdrückt die icv-Infusion von Glucose die Nahrungsaufnahme [31]. Kleinmolekulare Aktivatoren der GLK könnten daher die Nahrungsmittelaufnahme und die Gewichtszunahme durch die zentralen Effekte auf die GLK verringern. GLK-Aktivatoren könnten daher nicht nur bei Diabetes, sondern auch bei der Behandlung von Eßstörungen, darunter auch Fettleibigkeit, von therapeutischem Nutzen sein. Die Effekte im Hypothalamus werden additiv oder synergistisch zu den Effekten derselben Verbindungen in der Leber und/oder im Pankreas bei der Normalisierung der Glucosehomöostase zur Behandlung von Typ-2-Diabetes sein. Das GLK/GLKRP-System kann daher als potentieller „Diabesitas"-Angriffspunkt beschrieben werden (das heißt, es ist sowohl bei Diabetes als auch bei Adipositas bzw. Fettleibigkeit von Vorteil).
  • In WO0058293 und WO01/44216 (Roche) werden eine Reihe von Benzylcarbamoylverbindungen als Glucokinaseaktivatoren beschrieben. Der Mechanismus, mit Hilfe dessen solche Verbindungen die GLK aktivieren, wird dadurch untersucht, daß der direkte Effekt solcher Verbindungen in einem Test gemessen wird, in dem die GLK-Aktivität mit der NADH-Produktion verknüpft ist, was wiederum optisch gemessen wird – siehe Einzelheiten des in-vitro-Assays, der in Beispiel A beschrieben ist. Verbindungen der vorliegenden Erfindung können die GLK direkt oder durch Hemmung der Interaktion von GLKRP mit der GLK aktivieren. Der letztgenannte Mechanismus bietet insofern einen wichtigen Vorteil gegenüber direkten Aktivatoren der GLK, als er keine schweren hypoglykämischen Episoden verursacht, wie sie nach direkter Stimulation prognostiziert werden. Im Vergleich zu bekannten GLK-Aktivatoren könnten viele Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine vorteilhafte Selektivität zeigen.
  • WO9622282 , WO9622293 , WO9622294 , WO9622295 , WO9749707 und WO9749708 beschreiben eine Reihe von Zwischenstufen, die bei der Herstellung von Verbindungen verwendet werden, die sich als Vasopressinmittel eignen, und die den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verbindungen strukturell ähnlich sind. Strukturell ähnliche Verbindungen sind auch in WO9641795 und JP8143565 (Vasopressinantagonismus), in JP8301760 (Vorbeugung von Hautschädigung) und in EP619116 (Osteopathie) beschrieben.
  • WO01/12621 beschreibt die Herstellung von Isoxazolylpyrimidinen und verwandten Verbindungen als Hemmstoffe von cJUN-N-terminalen Kinasen sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Verbindungen enthalten.
  • Cushman et al. [Bioorg Med Chem Lett (1991) 1 (4), 211–14] beschreiben die Synthese von pyridinhaltigen Stilbenen und Amiden und deren Auswertung als Proteintyrosinkinase-Hemmer. Rogers et al. [J Med Chem (1981) 24(11) 1284–7] beschreiben mesoionische Purinonanaloga als Hemmer der cyclischen AMP-Phosphodiesterase.
  • WO00/26202 beschreibt die Herstellung von 2-Aminothiazolderivaten als Antitumormittel. GB 2331748 beschreibt die Herstellung von insektiziden Thiazolderivaten. WO96/36619 beschreibt die Herstellung von Aminothiazolderivaten als Linderungsmittel für Bewegungen des Verdauungstrakts. US 5466715 und US 5258407 beschreiben die Herstellung von 3,4-disubstituierten Phenolimmunstimulanzien. JP 58069812 beschreibt hypoglykämische Pharmazeutika, die Benzamidderivate enthalten. US 3950351 beschreibt 2-Benzamido-5-nitrothiazole, und bei Cavier et al. [Eur J Med Chem – Chim Ther (1978) 13(6), 539–43] wird die biologische Bedeutung dieser Verbindungen diskutiert.
  • WO03/000262 offenbart Vinylphenylderivate als GLK-Aktivatoren, WO03/015774 offenbart Benzamidverbindungen als GLK-Aktivatoren und WO03/066613 offenbart N-Phenyl-2-pyrimidinaminderivate als GLK-Aktivatoren.
  • Die schwebende internationale Anmeldung Nummer PCT/GB02/02873 ( WO03/000267 ) beschreibt eine Gruppe von Benzoylaminopyridylcarbonsäuren, bei denen es sich um Aktivatoren des Enzyms Glucokinase (GLK) handelt. Überraschenderweise wurde eine kleine Auswahl dieser Verbindungen gefunden, bei denen es nach einer oralen Verabreichung aufgrund einer verbesserten Löslichkeit in Wasser und niedrigeren Plasmabindungsspiegeln zu höheren Konzentrationen von Arzneimittel im Plasma kommt, unter Beibehaltung der hohen Wirksamkeit am GLK-Enzym. Hierdurch eignet sich diese Untergruppe von Verbindungen insbesondere für die Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer durch GLK vermittelten Krankheit bzw. eines durch GLK vermittelten medizinischen Leidens.
  • Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung werden daher Verbindungen der Formel (I):
    Figure 00060001
    Formel (I) in welcher:
    R1-X- ausgewählt ist aus: Methyl, Methoxymethyl und
    Figure 00060002
    R2 ausgewählt ist aus Wasserstoff, Methyl, Chlor und Fluor;
    n für 1 oder 2 steht;
    und deren Salze, in vivo hydrolysierbare Ester und Solvate bereitgestellt.
  • Um Zweifel auszuschließen: R2 steht für eine einzelne Gruppe, die sich, bezogen auf das Sauerstoffatom zwischen den beiden Phenylringen, entweder in der 2-, der 3- oder der 6-Stellung befinden kann.
  • Die Verbindungen der Formel (I) können Salze bilden, die innerhalb des Erfindungsumfangs liegen. Pharmazeutisch annehmbare Salze sind bevorzugt, obwohl sich auch andere Salze beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung von Verbindungen eignen können.
  • Es versteht sich, daß, insofern als bestimmte oben definierte Verbindungen der Formel (I) aufgrund eines oder mehrerer asymmetrischer Kohlenstoffatome in optisch aktiven oder racemischen Formen vorkommen können, die Erfindung in ihrer Definition alle solche optisch aktiven oder racemischen Formen umfaßt, welche die Eigenschaft besitzen, GLK direkt zu stimulieren oder die GLK/GLKRP-Wechselwirkung zu hemmen. Die Synthese optisch aktiver Formen kann nach Standardverfahren der organischen Chemie erfolgen, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, beispielsweise durch Synthese aus optisch aktivem Startmaterial oder durch Auflösung einer racemischen Form. Es versteht sich auch, daß bestimmte Verbindungen in tautomeren Formen vorkommen können und daß die Erfindung auch jede und alle tautomeren Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen umfaßt, welche GLK aktivieren.
  • Bevorzugte Verbindungen der Formel (I) sind die, auf die eine oder mehrere der folgenden Bedingungen zutreffen:
    • (1) bei der Gruppe in der 3-Stellung in der Formel (I) handelt es sich um:
      Figure 00080001
    • (2) R2 steht für Wasserstoff;
    • (3) R2 steht für Fluor oder Chlor;
    • (4) R2 steht für Methyl
    • (5) R2 steht für Fluor;
    • (6) R2 steht für Chlor;
    • (7) n steht für 1;
    • (8) n steht für 2;
    • (9) R2 ist an den Phenylring gebunden, an der er in der 3-Stellung bezogen auf das Sauerstoffatom gebunden ist.
  • Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung werden die folgenden bevorzugten Gruppen von erfindungsgemäßen Verbindungen bereitgestellt:
    • (I) Verbindungen der Formel (Ia)
      Figure 00080002
      Formel (Ia) in welcher: n und R2 wie oben für eine Verbindung der Formel (I) definiert sind; und deren Salze, Solvate und in vivo hydrolysierbare Ester.
    • (II) Verbindungen der Formel (Ib)
      Figure 00090001
      Formel (Ib) in welcher: n und R2 wie oben für eine Verbindung der Formel (I) definiert sind; und deren Salze, Solvate und in vivo hydrolysierbare Ester.
    • (III) Verbindungen der Formel (Ic)
      Figure 00090002
      Formel (Ic) in welcher: n und R2 wie oben für eine Verbindung der Formel (I) definiert sind; und deren Salze, Solvate und in vivo hydrolysierbare Ester.
    • (IV) Verbindungen der Formel (Id)
      Figure 00100001
      Formel (Id) in welcher: n und R2 wie oben für eine Verbindung der Formel (I) definiert sind; und deren Salze, Solvate und in vivo hydrolysierbare Ester.
    • (V) Verbindungen der Formel (Ie)
      Figure 00100002
      Formel (Ie) in welcher: n, X, R1 und R2 wie oben für eine Verbindung der Formel (I) definiert sind; und deren Salze, Solvate und in vivo hydrolysierbare Ester.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen schließen eine oder mehrere der folgenden ein:
    6-{[(3-(2,3-Dihydro-1,4-benzodioxin-6-yloxy)-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amino}pyridin-3-carbonsäure und
    6-{[(3-(1,3-Benzodioxol-5-yloxy)-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amino}pyridin-3-carbonsäure
    und deren Salze, Solvate und in vivo hydrolysierbare Ester.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Form eines Prodrug verabreicht werden. Ein Prodrug ist eine Biovorstufe oder pharmazeutisch annehmbare Verbindung, die im Körper zu einer erfindungsgemäßen Verbindung abgebaut werden kann (wie ein Ester oder Amid einer erfindungsgemäßen Verbindung, insbesondere ein in vivo hydrolysierbarer Ester). Verschiedene Formen von Prodrugs sind im Stand der Technik bekannt. Für Beispiele für deratige Prodrugderivate siehe:
    • a) Design of Prodrugs, Herausgeber H. Bundgaard, (Elsevier, 1985), und Methods in Enzymology, Band 42, S. 309–396, Herausgeber K. Widder et al. (Academic Press, 1985);
    • b) A Textbook of Drug Design and Development, Herausgeber Krogsgaard-Larsen;
    • c) H. Bundgaard, Kapitel 5 „Design and Application of Prodrugs", von H. Bundgaard, S. 113–191 (1991);
    • d) H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8, 1–38 (1992);
    • e) H. Bundgaard et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, 285 (1988); und
    • f) N. Kakeya et al., Chem. Pharm. Bull., 32, 692 (1984).
  • Der Inhalt der oben zitierten Dokumente wird hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
  • Beispiele für Prodrugs sind wie folgt. Ein in vivo hydrolysierbarer Ester einer erfindungsgemäßen Verbindung mit einer Carboxy- oder Hydroxygruppe ist beispielsweise ein pharmazeutisch annehmbarer Ester, der im menschlichen oder tierischen Körper unter Bildung der zugrundeliegenden Säure bzw. des zugrundeliegenden Alkohols hydrolysiert wird. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Ester für Carboxy sind u. a. C1-6-Alkoxymethylester, beispielsweise Methoxymethyl, C1-6-Alkanoyloxymethylester, beispielsweise Pivaloyloxymethyl, Phthalidylester, C3-8-Cycloalkoxycarbonyloxy-C1-6-alkylester, beispielsweise 1-Cyclohexylcarbonyloxyethyl; 1,3-Dioxolen-2-onylmethylester, beispielsweise 5-Methyl-1,3-dioxolen-2-onylmethyl; und C1-6-Alkoxycarbonyloxyethylester.
  • In vivo hydrolysierbare Ester einer erfindungsgemäßen Verbindung mit einer Hydroxygruppe sind u. a. anorganische Ester wie Phosphatester (einschließlich cyclischer Phosphorsäureamidester) und α-Acyloxyalkylether und verwandte Verbindungen, die infolge der In-vivo-Hydrolyse des Esters unter Bildung der zugrundeliegenden Hydroxygruppe(n) abgebaut werden. Beispiele für α-Acyloxyalkylether sind Acetoxymethoxy und 2,2-Dimethylpropionyloxymethoxy. Als Auswahl für Gruppen für Hydroxy, die in vivo hydrolysierbare Ester bilden, seien Alkanoyl, Benzoyl, Phenylacetyl und substituiertes Benzoyl und Phenylacetyl, Alkoxycarbonyl (zur Bildung von Alkylcarbonatestern), Dialkylcarbamoyl und N-(Dialkylaminoethyl)-N-alkylcarbamoyl (zur Bildung von Carbamaten), Dialkylaminoacetyl und Carboxyacetyl genannt.
  • Ein geeignetes pharmazeutisch annehmbares Salz einer erfindungsgemäßen Verbindung ist beispielsweise ein Säureadditionssalz einer erfindungsgemäßen Verbindung mit ausreichender Basizität, beispielsweise ein Säure additionssalz mit beispielsweise einer anorganischen oder organischen Säure, beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Trifluoressigsäure, Citronensäure oder Maleinsäure. Ein geeignetes pharmazeutisch annehmbares Salz eines erfindungsgemäßen Benzoxazinonderivats mit ausreichender Azidität ist außerdem ein Alkalimetallsalz, beispielsweise ein Natrium- oder Kaliumsalz, ein Erdalkalimetallsalz, beispielsweise ein Calcium- oder Magnesiumsalz, ein Ammoniumsalz oder ein Salz mit einer organischen Base, die ein physiologisch annehmbares Kation liefert, beispielsweise ein Salz mit Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Piperidin, Morpholin oder Tris-(2-hydroxyethyl)amin.
  • Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung der Formel (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) oder (Ie) gemäß obiger Definition oder ein Salz, ein Solvat oder ein in vivo hydrolysierbarer Ester davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger.
  • Gegenstand der Erfindung ist gemäß einem anderen Aspekt eine wie oben definierte Verbindung der Formel (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) oder (Ie) zur Verwendung als Medikament.
  • Gegenstand der Erfindung ist gemäß einem weiteren Aspekt eine Verbindung der Formel (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) oder (Ie) zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer durch GLK vermittelten Krankheit, insbesondere Typ-2-Diabetes.
  • Für diese Verwendung wird die Verbindung geeigneterweise als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert.
  • Zu speziellen Erkrankungen, die mit der erfindungsgemäßen Verbindung oder Zusammensetzung behandelt werden können, gehören: Blutzuckersenkung bei Diabetes mellitus Typ 2 ohne schweres Risiko von Hypoglykämie (und Möglichkeit zur Behandlung von Diabetes mellitus Typ 1), Dyslipidämie, Fettleibigkeit, Insulinresistenz, metabolisches Syndrom X, eingeschränkte Glucosetoleranz.
  • Wie oben beschrieben, kann das GLK/GLKRP-System somit als ein potentieller „Diabesitas"-Angriffspunkt beschrieben werden (sowohl bei Diabetes als auch bei Fettleibigkeit von Vorteil). Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird daher die Verwendung einer Verbindung der Formel (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) oder (Ie) oder eines Salzes, Solvats oder eines in vivo hydrolysierbaren Esters davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der kombinierten Behandlung oder Prävention von Diabetes und Obesitas bereitgestellt.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung der Formel (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) oder (Ie) oder eines Salzes, Solvats oder eines in vivo hydrolysierbaren Esters davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Obesitas bereitgestellt.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in einer für die orale Verwendung (beispielsweise als Tabletten, Lutschtabletten, Hart- oder Weichkapseln, wäßrige oder ölige Suspensionen, Emulsionen, dispergierbare Pulver oder Granulate, Sirupe oder Elixiere), für die topische Verwendung (beispielsweise als Cremes, Salben, Gele oder wäßrige oder ölige Lösungen oder Suspensionen), zur inhalativen Verabreichung (beispielsweise als feinteiliges Pulver oder flüssiges Aerosol), zur Verabreichung durch Insufflation (beispielsweise als feinteiliges Pulver) oder zur parenteralen Verabreichung (beispielsweise als sterile wäßrige oder ölige Lösung zur intravenösen, subkutanen, intramuskulären oder intramuskulären Dosierung oder als Suppositorium für die rektale Dosierung) geeigneten Form vorliegen.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind nach herkömmlichen Verfahrensweisen unter Verwendung herkömmlicher pharmazeutischer Hilfsstoffe, die an sich gut bekannt sind, erhältlich. So können für die orale Verwendung vorgesehene Zusammensetzungen beispielsweise einen oder mehrere Farbstoffe, Süßstoffe, Geschmacksstoffe und/oder Konservierungsstoffe enthalten.
  • Beispiele für geeignete pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe für eine Tablettenformulierung sind inerte Verdünnungsmittel wie Lactose, Natriumcarbonat, Calciumphosphat oder Calciumcarbonat, Granulier- und Sprengmittel wie Maisstärke oder Algensäure; Bindemittel, wie Stärke; Gleitmittel wie Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talk; Konservierungsmittel wie p-Hydroxybenzoesäureethylester oder -propylester und Antioxidantien, wie Ascorbinsäure. Tablettenformulierungen können gegebenenfalls zur Modifizierung ihres Zerfalls und der anschließenden Resorption des Wirkstoffs im Magen-Darm-Trakt oder zur Verbesserung ihrer Stabilität und/oder ihres Aussehens beschichtet werden oder nicht, wobei jeweils an sich gut bekannte und übliche Beschichtungsmittel und Verfahrensweisen angewandt werden.
  • Zusammensetzungen zur oralen Verwendung können in Form von Hartgelatinekapseln vorliegen, in denen der Wirkstoff im Gemisch mit einem inerten festen Verdünnungsmittel, beispielsweise Calciumcarbonat, Calciumphosphat oder Kaolin, vorliegt, oder als Weichgelatinekapseln, in denen der Wirkstoff im Gemisch mit Wasser oder einem Öl wie Erdnußöl, Flüssigparaffin oder Olivenöl vorliegt.
  • Wäßrige Suspensionen enthalten den Wirkstoff im allgemeinen in fein gepulverter Form zusammen mit einem oder mehreren Suspendiermitteln, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Traganth und Gummi arabicum; Dispergier- oder Netzmitteln wie Lecithin oder Produkten der Kondensation eines Alkylenoxids mit Fettsäuren (beispielsweise Polyoxyethylenstearat) oder Produkten der Kondensation von Ethylenoxid mit langkettigen aliphatischen Alkoholen, beispielsweise Heptadecaethylenoxycetanol, oder Produkten der Kondensation von Ethylenoxid mit von Fettsäuren und einem Hexit abgeleiteten Partialestern, wie Polyoxyethylensorbitmonooleat, oder Produkten der Kondensation von Ethylenoxid mit langkettigen aliphatischen Alkoholen, beispielsweise Heptadecaethylenoxycetanol, oder Produkten der Kondensation von Ethylenoxid mit von Fettsäuren und einem Hexit abgeleiteten Partialestern, wie Polyoxyethylensorbitmonooleat, oder Produkten der Kondensation von Ethylenoxid mit von Fettsäuren und Hexitanhydriden abgeleiteten Partialestern, beispielsweise Polyethylensorbitanmonooleat. Die wäßrigen Suspensionen können außerdem einen oder mehrere Konservierungsstoffe (wie p-Hydroxybenzoesäureethylester oder -propylester), Antioxidantien (wie Ascorbinsäure), Farbstoffe, Geschmacksstoffe und/oder Süßstoffe (wie Saccharose, Saccharin oder Aspartam) enthalten.
  • Zur Formulierung von öligen Suspensionen kann man den Wirkstoff in einem Pflanzenöl (wie Erdnußöl, Olivenöl, Sesamöl oder Kokosnußöl) oder in einem Mineralöl (wie Flüssigparaffin) suspendieren. Die öligen Suspensionen können auch ein Verdickungsmittel wie Bienenwachs, Hartparaffin oder Cetylalkohol enthalten. Zur Bereitstellung einer schmackhaften oralen Zubereitung kann man Süßstoffe, wie die oben angeführten, und Geschmacksstoffe zusetzen. Diese Zusammensetzungen können durch Zugabe eines Antioxidans wie Ascorbinsäure konserviert werden.
  • Dispergierbare Pulver und Granulate, die zur Herstellung einer wäßrigen Suspension durch Zugabe von Wasser geeignet sind, enthalten den Wirkstoff im allgemeinen zusammen mit einem Dispergier- oder Netzmittel, Suspendiermittel und einem oder mehreren Konservierungsmitteln. Als Dispergier- oder Netzmittel und Suspendiermittel eignen sich beispielsweise die oben bereits aufgeführten. Es können auch noch zusätzliche Hilfsstoffe zugegen sein, wie Süßstoffe, Geschmacksstoffe und Farbstoffe.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch in Form von Öl-in-Wasser-Emulsionen vorliegen. Bei der Ölphase kann es sich um ein Pflanzenöl, wie Olivenöl oder Erdnußöl, oder ein Mineralöl, wie beispielsweise Flüssigparaffin, oder ein Gemisch von beliebigen dieser Substanzen handeln. Als Emulgatoren eignen sich beispielsweise natürlich vorkommende Gummen, wie Gummi arabicum oder Traganth, natürlich vorkommende Phosphatide wie Sojabohnen, Lecithin, von Fettsäuren und Hexitanhydriden abgeleitete Ester oder Partialester (beispielsweise Sorbitanmonooleat) und Produkte der Kondensation dieser Partialester mit Ethylenoxid sowie Polyoxyethylensorbitanmonooleat. Die Emulsionen können außerdem Süßstoffe, Geschmacksstoffe und Konservierungsmittel enthalten.
  • Sirupe und Elixiere können mit Süßstoffen wie Glycerin, Propylenglykol, Sorbit, Aspartam oder Saccharose formuliert werden und außerdem ein Demulcens, ein Konservierungsmittel, einen Geschmacksstoff und/oder einen Farbstoff enthalten.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch in Form von sterilen injizierbaren wäßrigen oder öligen Suspensionen vorliegen, die nach bekannten Verfahrensweisen unter Verwendung eines oder mehrerer der oben aufgeführten entsprechenden Dispergier- oder Netzmittel und Suspendiermittel formuliert werden können. Bei einer sterilen injizierbaren Zubereitung kann es sich auch um eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nichttoxischen parenteral annehmbaren Verdünnungs- oder Lösungsmittel handeln, beispielsweise eine Lösung in 1,3-Butandiol.
  • Zusammensetzungen zur Verabreichung durch Inhalation können in Form eines herkömmlichen Druckaerosols zur Abgabe des Wirkstoffs entweder als Aerosol mit feinteiligem Feststoff oder Flüssigkeitströpfchen vorliegen. Es können herkömmliche Aerosoltreibmittel wie leichtflüchtige Fluorkohlenwasserstoffe oder Kohlenwasserstoffe verwendet werden, und die Aerosolvorrichtung wird zweckmäßigerweise so arrangiert, daß eine dosierte Wirkstoffmenge abgegeben wird.
  • Bezüglich weiterer Informationen zur Formulierung wird der Leser auf Kapitel 25.2 in Band 5 von Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990, verwiesen.
  • Die Wirkstoffmenge, die zur Herstellung einer Einzeldosisform mit einem oder mehreren Hilfsstoffen kombiniert wird, variiert zwangsläufig je nach dem behandelten Wirt und dem jeweiligen Verabreichungsweg. Beispielsweise enthält eine Formulierung, die für die orale Verabreichung an Menschen bestimmt ist, im allgemeinen beispielsweise 0,5 mg bis 2 g Wirkstoff, hergestellt mit einer geeigneten und zweckmäßigen Menge von Hilfsstoffen, die von etwa 5 bis etwa 98 Gewichtsprozent, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung, variieren kann. Einheitsdosisformen enthalten im allgemeinen etwa 1 mg bis etwa 500 mg eines Wirkstoffes. Bezüglich weiterer Informationen zu Verabreichungswegen und Dosierungsschemata wird der Leser auf Kapitel 25.3 in Band 5 von Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990, verwiesen.
  • Die Größe der Dosis einer Verbindung der Formel (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) oder (Ie) für therapeutische oder prophylaktische Zwecke wird natürlich gemäß gut bekannten medizinischen Prinzipien je nach Art und Schwere der Leiden, dem Alter und Geschlecht des Tiers bzw. Patienten und dem Verabreichungsweg variieren.
  • Bei Verwendung einer Verbindung der Formel (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) oder (Ie) für therapeutische oder prophylaktische Zwecke wird die Verbindung im allgemeinen so verabreicht, daß die gegebenenfalls in Teildosen verabreichte Tagesdosis beispielsweise im Bereich von 0,5 mg bis 75 mg pro kg Körpergewicht liegt. Bei parenteraler Verabreichung werden im allgemeinen niedrigere Dosen gegeben. So wird beispielsweise für die intravenöse Verabreichung im allgemeinen eine Dosis im Bereich von beispielsweise 0,5 mg bis 30 mg pro kg Körpergewicht verwendet. Ganz analog wird bei inhalativer Verabreichung eine Dosis im Bereich von beispielsweise 0,5 mg bis 25 mg pro kg Körpergewicht verwendet. Bevorzugt ist jedoch die orale Verabreichung.
  • Die im vorliegenden Text beschriebene Erhöhung der GLK-Aktivität kann als alleinige Therapie angewandt werden oder außer dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere weitere Substanzen und/oder Behandlungen umfassen. Eine solche Kombinationsbehandlung kann mittels gleichzeitiger, aufeinanderfolgender oder separater Verabreichung der einzelnen Bestandteile der Behandlung erreicht werden. Die gleichzeitige Behandlung kann in Form einer einzelnen Tablette oder in separaten Tabletten erfolgen. Beispielsweise kann eine Chemotherapie bei der Behandlung von Diabetes mellitus die folgenden Hauptbehandlungskategorien umfassen:
    • 1) Insulin und Insulinanaloga;
    • 2) Insulinsekretagogen, u. a. Sulfonylharnstoffe (beispielsweise Glibenclamid, Glipizid) und prandiale Glucoseregulatoren (beispielsweise Repaglinid, Nateglinid);
    • 3) Mittel, die die Wirkung von Incretin verbessern (zum Beispiel Dipeptidylpeptidase-IV-Inhibitoren und GLP-1-Agonisten);
    • 4) Insulinsensitizer, u. a. PPARgamma-Agonisten (beispielsweise Pioglitazon und Rosiglitazon) und Mittel mit kombinierter PPARalpha- und -gamma-Wirkung;
    • 5) Mittel, die das hepatische Glucosegleichgewicht modulieren (zum Beispiel Metformin, Fructose-1,6-bisphosphatase-Inhibitoren, Glycogenphosphorylase-Inhibitoren, Glycogensynthasekinase-Inhibitoren);
    • 6) Mittel, die auf die Verringerung der Resorption von Glucose aus dem Darm ausgelegt sind (beispielsweise Acarbose);
    • 7) Mittel, die die Wiederaufnahme von Glucose durch die Niere verhindern (SGLT-Inhibitoren);
    • 8) Mittel zur Behandlung der Komplikationen von länger andauernder Hyperglykämie (zum Beispiel Aldosereduktase-Inhibitoren);
    • 9) Mittel gegen Fettleibigkeit (beispielsweise Sibutramin und Orlistat);
    • 10) Antidyslipidämie-Mittel wie HMG-CoA-Reduktasehemmer (z. B. Statine); PPARα-Agonisten (Fibrate, z. B. Gemfibrozil); Gallensäure-Komplexbildner (Cholestyramin); Cholesterinresorptionshemmer (Pflanzenstanole, synthetische Inhibitoren); Inhibitoren der Gallensäureresorption (IBATi) und Nicotinsäure und Analoga (Niacin und Retardformulierungen);
    • 11) Antihypertonika wie Betablocker (z. B. Atenolol, Inderal); ACE-Hemmer (z. B. Lisinopril); Calciumantagonisten (z. B. Nifedipin); Angiotensinrezeptorantagonisten (z. B. Candesartan), Antagonisten und Diuretika (z. B. Furosemid, Benzthiazid);
    • 12) Hämostasemodulatoren wie Antithrombotika, Aktivatoren der Fibrinolyse und Thrombozytenhemmstoffe; Thrombinantagonisten; Faktor-Xa-Inhibitoren; Faktor-VIIa-Inhibitoren); Thrombozytenhemmstoffe (z. B. Aspirin, Clopidogrel); Antikoagulantien (Heparin und niedermolekulare Analoga, Hirudin) und Warfarin;
    • 13) Mittel, die die Wirkungen von Glukagon antagonisieren; und
    • 14) Entzündungshemmer wie nichtsteroidale Antiphlogistika (z. B. Aspirin) und steroidale Antiphlogistika (z. B. Cortison).
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden einzelne Verbindungen, die als Endprodukte in den nachstehend aufgeführten Beispielen hergestellt wurden, und Salze, Solvate und Prodrugs davon bereitgestellt.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen und ihre Salze können durch jeden Prozeß hergestellt werden, der bekannterweise auf die Herstellung solcher Verbindungen oder strukturell verwandter Verbindungen angewandt werden kann. Funktionelle Gruppen können durch herkömmliche Verfahren geschützt oder entschützt werden. Beispiele für Schutzgruppen wie Amino- und Carbonsäure-Schutzgruppen (sowie Mittel der Bildung und gegebenenfalls der Entschützung) finden sich in T. W. Greene und P. G. M. Wuts, „Protective Groups in Organic Synthesis", 2. Auflage, John Wiley & Sons, New York, 1991.
  • Als weiteres Merkmal der Erfindung werden Verfahren zur Synthese der Verbindungen der Formel (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) oder (Ie) bereitgestellt. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird somit ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formeln (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) und (Ie) bereitgestellt, bei dem man:
    • (a) eine Säure der Formel (IIIa) oder ein aktiviertes Derivat davon mit einer Verbindung der Formel (IIIb)
      Figure 00220001
      wobei P1 für Wasserstoff oder eine Schutzgruppe steht, umsetzt oder
    • (b) eine Verbindung der Formel (IIIc)
      Figure 00230001
      Formel (IIIc) wobei P2 für eine Schutzgruppe steht, entschützt; oder
    • (c) eine Verbindung der Formel (IIId) mit einer Verbindung der Formel (IIIe)
      Figure 00230002
      wobei X1 für eine Abgangsgruppe steht und X2 für eine Hydroxylgruppe steht oder X1 für eine Hydroxylgruppe steht und X2 für eine Abgangsgruppe steht und wobei P1 für Wasserstoff oder eine Schutzgruppe steht, umsetzt; oder
    • (d) eine Verbindung der Formel (IIIf) mit einer Verbindung der Formel (IIIg)
      Figure 00230003
      wobei X3 für eine Abgangsgruppe oder ein metallorganisches Reagens und X4 für eine Hydroxylgruppe oder X3 für eine Hydroxylgruppe und X4 für eine Abgangsgruppe oder ein metallorganisches Reagens steht, wobei P1 für Wasserstoff oder eine Schutzgruppe steht, umsetzt; oder
    • (e) eine Verbindung der Formel (IIIh) mit einer Verbindung der Formel (IIIi)
      Figure 00240001
      wobei X5 für eine Abgangsgruppe steht und wobei P1 für Wasserstoff oder eine Schutzgruppe steht, umsetzt;
    und anschließend, falls erforderlich:
    • i) eine Verbindung der Formel (I) in eine andere Verbindung der Formel (I) umwandelt;
    • ii) gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppen entfernt;
    • iii) ein Salz, einen in vivo hydrolysierbaren Ester oder ein Solvat davon bildet.
  • Geeignete Abgangsgruppen für die Verfahren a) bis e) sind dem Fachmann gut bekannt und schließen zum Beispiel aktivierte Hydroxyl-Abgangsgruppen (wie Mesylat- und Tosylatgruppen) und Halogen-Abgangsgruppen wie Fluor, Chlor oder Brom ein.
  • Die Verbindungen der Formeln (IIIa) bis (IIIi) sind im Handel erhältlich oder können nach einem zweckmäßigen, im Stand der Technik bekannten Verfahren und/oder wie hier in den Beispielen erläutert hergestellt werden. Es wird allgemein klar sein, daß sich Aryl-O- bzw. Alkyl-O-Bindungen durch nukleophile Substitution oder metallkatalysierte Verfahren, gegebenenfalls in Gegenwart eine geeigneten Base, bilden lassen.
  • Die spezifischen Reaktionsbedingungen für die obigen Reaktionen sind wie folgt, wobei, wenn P1 für eine Schutzgruppe steht, P1 vorzugsweise für C1-4-Alkyl, zum beispiel Methyl oder Ethyl, steht:
    • Verfahren a) – Kupplungsreaktionen von Aminogruppen mit Carbonsäuren unter Bildung eines Amids sind im Stand der Technik gut bekannt. Zum Beispiel (i) unter Anwendung einer geeigneten Kupplungsreaktion wie einer Carbodiimidkupplungsreaktion, die mit EDAC in Gegenwart von DMAP in einem geeigneten Lösungsmittel wie DCM, Chloroform oder DMF bei Raumtemperatur durchgeführt wird; oder (ii) eine Umsetzung, bei der die Carbonsäuregruppe durch Umsetzung mit Oxalsäurechlorid in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels wie Methylenchlorid zu einem Säurechlorid aktiviert wird. Das Säurechlorid kann dann in Gegenwart einer Base wie Triethylamin oder Pyridin in einem geeigneten Lösungsmittel wie Chloroform oder DCM bei einer Temperatur zwischen 0°C und Raumtemperatur mit einer Verbindung der Formel IIIb umgesetzt werden.
    • Verfahren b) – Entschützungsreaktionen sind im Stand der Technik gut bekannt. Beispiele für P1 schließen C1-6-Alkyl und Benzyl ein. Steht P1 für C1-6-Alkyl, so kann die Umsetzung in Gegenwart von Natriumhydrid in einem geeigneten Lösungsmittel wie THF/Wasser durchgeführt werden.
    • Verfahren c) – Verbindungen der Formeln (IIId) und (IIIe) können in einem geeigneten Lösungsmittel wie DMF oder THF in Gegenwart einer Base wie Natriumhydrid oder Kalium-tert.-butanolat bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 100°C miteinander umgesetzt werden, gegebenenfalls unter Einsatz von Metallkatalyse wie Palladium(II)-acetat, Palladium auf Aktivkohle, Kupfer(II)-acetat oder Kupfer(I)-iodid; alternativ dazu kann man Verbindungen der Formeln (IIId) und (IIIe) in einem geeigneten Lösungsmittel wie THF oder DCM, in Gegenwart eines geeigneten Phosphins wie Triphenylphosphin und Azodicarboxylats wie Diethylazodicarboxylat miteinander umsetzen;
    • Verfahren d) – Verbindungen der Formeln (IIId) und (IIIe) können in einem geeigneten Lösungsmittel wie DMF oder THF in Gegenwart einer Base wie Natriumhydrid oder Kalium-tert.-butanolat bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 100°C miteinander umgesetzt werden, gegebenenfalls unter Einsatz von Metallkatalyse wie Palladium(II)-acetat, Palladium auf Aktivkohle, Kupfer(II)-acetat oder Kupfer(I)-iodid;
    • Verfahren e) – die Umsetzung einer Verbindung der Formel (IIIh) mit einer Verbindung der Formel (IIIi) kann in einem polaren Lösungsmittel wie DMF oder einem unpolaren Lösungsmittel wie THF in Gegenwart einer starken Base wie Natriumhydrid oder Kalium-tert.-butanolat bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 100°C durchgeführt werden, gegebenenfalls unter Einsatz von Metallkatalyse wie Palladium(II)-acetat, Palladium auf Aktivkohle, Kupfer(II)-acetat oder Kupfer(I)-iodid.
  • Beim Herstellungsverfahren kann die Verwendung einer Schutzgruppe für eine funktionelle Gruppe in dem Molekül vorteilhaft sein. Schutzgruppen können nach einer beliebigen zweckmäßigen Methode abgespalten werden, die sich gemäß Literaturangaben oder den Kenntnissen des Chemikers zur Abspaltung der betreffenden Schutzgruppe eignet, wobei derartige Methoden so gewählt werden, daß die Abspaltung der Schutzgruppe unter minimaler Störung von an anderer Stelle im Molekül vorhandenen Gruppen erfolgt.
  • Der Zweckmäßigkeit halber werden nachstehend spezielle Beispiele für Schutzgruppen aufgeführt, wobei „Nieder" bedeutet, daß die so bezeichnete Gruppe vorzugsweise 1–4 Kohlenstoffatome aufweist. Es versteht sich, daß diese Beispiele nicht erschöpfend sind. Wenn nachstehend spezielle Beispiele für Methoden zur Abspaltung von Schutzgruppen aufgeführt werden, so sind diese ebenfalls nicht erschöpfend. Die Verwendung von nicht speziell aufgeführten Schutzgruppen und Entschützungsmethoden fällt natürlich in den Schutzbereich der Erfindung.
  • Bei einer Carboxyschutzgruppe kann es sich um den Rest eines esterbildenden aliphatischen oder araliphatischen Alkohols oder eines esterbildenden Silanols handeln (wobei der Alkohol bzw. das Silanol vorzugsweise 1–20 Kohlenstoffatome enthält). Beispiele für Carboxyschutzgruppen sind gerad- oder verzweigtkettige (C1-12)-Alkylgruppen (z. B. Isopropyl, t-Butyl); Niederalkoxyniederalkylgruppen (z. B. Methoxymethyl, Ethoxymethyl, Isobutoxymethyl); Acyloxyniederalkylgruppen mit niederaliphatischem Acyloxyrest (z. B. Acetoxymethyl, Propionyloxymethyl, Butyryloxymethyl, Pivaloyloxymethyl); Niederalkoxycarbonyloxyniederalkylgruppen (z. B. 1-Methoxycarbonyloxyethyl, 1-Ethoxycarbonyloxyethyl); Arylniederalkylgruppen (z. B. p-Methoxybenzyl, o-Nitrobenzyl, p-Nitrobenzyl, Benzhydryl und Phthalidyl); Tri(niederalkyl)silylgruppen (z. B. Trimethylsilyl und t-Butyldimethylsilyl); Tri(niederalkyl)silylniederalkylgruppen (z. B. Trimethylsilylethyl) und (C2-6)-Alkenylgruppen (z. B. Allyl und Vinylethyl).
  • Zu den für die Abspaltung von Carboxylschutzgruppen besonders gut geeigneten Methoden gehören beispielsweise die säure-, metall- oder enzymkatalysierte Hydrolyse.
  • Beispiele für Hydroxyschutzgruppen sind Niederalkenylgruppen (z. B. Allyl); Niederalkanoylgruppen (z. B. Acetyl); Niederalkoxycarbonylgruppen (z. B. t-Butoxycarbonyl); Niederalkenyloxycarbonylgruppen (z. B. Allyloxycarbonyl); Arylniederalkoxycarbonylgruppen (z. B. Benzoyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, o-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl); Triniederalkyl/arylsilylgruppen (z. B. Trimethylsilyl, t-Butyldimethylsilyl, t-Butyldiphenylsilyl); Arylniederalkylgruppen (z. B. Benzyl) und Triarylniederalkylgruppen (z. B. Triphenylmethyl).
  • Beispiele für Aminoschutzgruppen sind Formyl, Aralkylgruppen (z. B. Benzyl und substituiertes Benzyl, z. B. p-Methoxybenzyl, Nitrobenzyl und 2,4-Dimethoxybenzyl und Triphenylmethyl); Di-p-anisylmethyl- und Furylmethylgruppen; Niederalkoxycarbonylgruppen (z. B. t-Butoxycarbonyl); Niederalkenyloxycarbonylgruppen (z. B. Allyloxycarbonyl); Arylniederalkoxycarbonylgruppen (z. B. Benzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, o-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl); Trialkylsilylgruppen (z. B. Trimethylsilyl und t-Butyldimethylsilyl); Alkylidengruppen (z. B. Methyliden), Benzylidengruppen und substituierte Benzylidengruppen.
  • Zu den für die Abspaltung von Hydroxy- und Aminoschutzgruppen geeigneten Methoden gehören beispielsweise die säure-, basen-, metall- oder enzymkatalysierte Hydrolyse, für Gruppen wie o-Nitrobenzyloxycarbonyl die photolytische Abspaltung und für Gruppen wie Silylgruppen die Abspaltung mittels Fluoridionen.
  • Beispiele für Schutzgruppen für Amidgruppen sind Aralkoxymethyl (z. B. Benzyloxymethyl und substituiertes Benzyloxymethyl); Alkoxymethyl (z. B. Methoxymethyl und Trimethylsilylethoxymethyl); Trialkyl/arylsilyl (z. B. Trimethylsilyl, t-Butyldimethylsilyl, t-Butyldiphenylsilyl); Trialkyl/arylsilyloxymethyl (z. B. t-Butyldimethylsilyloxymethyl, t-Butyldiphenylsilyloxymethyl); 4-Alkoxyphenyl (z. B. 4-Methoxyphenyl); 2,4-Di(alkoxy)phenyl (z. B. 2,4-Dimethoxyphenyl); 4-Alkoxybenzyl (z. B. 4-Methoxybenzyl); 2,4-Di(alkoxy)benzyl (z. B. 2,4-Di(methoxy)benzyl) und Alk-1-enyl (z. B. Allyl, But-1-enyl und substituiertes Vinyl, z. B. 2-Phenylvinyl).
  • Aralkoxymethylgruppen können durch Reaktion der Amidgruppe mit dem entsprechenden Aralkoxymethylchlorid in erstere eingeführt und durch katalytische Hydrierung abgespalten werden. Alkoxymethyl-, Trialkyl/arylsilyl- und Trialkyl/silyloxymethylgruppen können durch Reaktion des Amids mit dem entsprechenden Chlorid eingeführt und mit Säure oder im Fall der silylhaltigen Gruppen mit Fluoridionen abgespalten werden. Die Alkoxyphenyl- und Alkoxybenzylgruppen werden zweckmäßigerweise durch Arylierung oder Alkylierung mit einem entsprechenden Halogenid eingeführt und durch Oxidation mit Cer(IV)-ammoniumnitrat abgespalten. Schließlich können Alk-1-enylgruppen durch Reaktion des Amids mit dem entsprechenden Aldehyd eingeführt und mit Säure abgespalten werden.
  • Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sollen den Umfang dieser Anmeldung nicht einschränken. Jede in den Beispielen genannte Verbindung stellt einen bestimmten und unabhängigen Aspekt der Erfindung dar. In den folgenden nicht einschränkenden Beispielen gilt folgendes, sofern nicht anders angegeben:
    • (i) Verdampfungen wurden durch Rotationsverdampfung im Vakuum durchgeführt und die Aufarbeitung erfolgte nach Entfernung von festen Rückständen, beispielsweise Trocknungsmitteln, durch Filtrieren;
    • (ii) Arbeitsschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, das heißt im Bereich von 18–25°C und in einer Atmosphäre eines inerten Gases wie Argon oder Stickstoff;
    • (iii) die Ausbeuten sind nur zur Veranschaulichung angegeben und entsprechen nicht zwingend dem maximal Erreichbaren;
    • (iv) die Strukturen der Endprodukte der Formel (I) wurden durch Kernmagnetresonanz (in der Regel durch Protonenmagnetresonanz) (NMR) und Massenspektraltechniken bestätigt; Werte der chemischen Verschiebung bei der Protonenmagnetresonanz wurden auf der Delta-Skala gemessen und Peakmultiplizitäten werden wie folgt angegeben: s, Singulett; d, Duplett; t, Triplett; m, Multiplett; br, Breit; q, Quartett; Quin, Quintett;
    • (v) Zwischenstufen wurden im allgemeinen nicht vollständig charakterisiert, und die Reinheit wurde durch Dünnschichtchromatographie (Thin Layer Chromatography, TLC), Hochleistungsflüssigchromatographie (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC), Infrarot-(IR) oder NMR-Analyse untersucht; und
    • (vi) Biotage-Kartuschen beziehen sich auf abgepackte Silica-Kartuschen (von 40 g bis 400 g), Elution mit einer Biotage-Pumpe und einem Fraktionssammlersystem; Biotage UK Ltd, Hertford, Herts, GB.
    Abkürzungen
    DCM Dichlormethan;
    DEAD Diethyldiazocarboxylat;
    DIAD Di-i-propylazodicarboxylat;
    DMAP 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin;
    DMSO Dimethylsulfoxid;
    DMF Dimethylformamid;
    EDAC 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid;
    HPMC Hydroxypropylmethylcellulose;
    LCMS Liquid Chromatography (Flüssigchromatographie)/Massenspektroskopie;
    RT Raumtemperatur und
    THF Tetrahydrofuran
  • BEISPIEL 1
  • 6-{[(3-(2,3-Dihydro-1,4-benzodioxin-6-yloxy)-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amino}pyridin-3-carbonsäure
    Figure 00310001
  • Eine Lösung von 6-{[(3-(2,3-Dihydro-1,4-benzodioxin-6-yloxy)-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amino}pyridin-3-carbonsäuremethylester (0,05 mmol) in THF (4 ml) wurde mit Lithiumhydroxidmonohydrat (2,5 Äquivalente) in Wasser (2 ml) versetzt. Die Mischung wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Der pH-Wert des Ansatzes wurde auf < 7,0 eingestellt, und das THF wurde im Vakuum entfernt und mit Wasser (8 ml) ersetzt. Der auf diese Weise erhaltene Feststoff wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch man 6-{[(3-(2,3-Dihydro-1,4-benzodioxin-6-yloxy)-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amino}pyridin-3-carbonsäure erhielt.
    m/z 481 (M+H)+. 6-{[(3-(2,3-Dihydro-1,4-benzodioxin-6-yloxy)-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amin}pyridin-3-carbonsäuremethylester
    Figure 00320001
  • Eine Lösung von 6-{[3-Hydroxy-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amino}pyridin-3-carbonsäuremethylester (0,75 mmol), 1,4-Benzodioxin-6-boronsäure (0,75 mmol), Kupfer(II)-acetat (0,75 mmol), Triethylamin (3,75 mmol) und frisch aktivierten 4A-Molekularsieben (1 g) in DON (10 ml) wurde 2 Tage lang bei Raumtemperatur und unter Normaldruck gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert, das DCM wurde im Vakuum entfernt und das verbliebene Öl wurde zwischen Essigsäureethylester und Salzsäure (1 N) verteilt. Die Essigsäureethylesterphase wurde abgetrennt, mit wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO4) und zu einem Rückstand eingedampft, der mit 40% Essigsäureethylester in Isohexan als Laufmittel an Kieselgel chromatographiert wurde, wodurch man 6-{[(3-(2,3-Dihydro-1,4-benzodioxin-6-yloxy)-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amino}pyridin-3-carbonsäuremethylester erhielt.
    m/z 495 (M+H)+. 1H-NMR (CDCl3): 1,3 (d, 3H); 3,4 (s, 3H); 3,5 (m, 2H); 4,0 (s, 3H); 4,3 (s, 4H); 4,6 (m, 1H); 6,6 (m, 2H); 6,75 (m, 1H); 6,85 (dd, 1H); 7,0 (m, 1H); 7,2 (m, 1H); 8,3 (m, 2H); 8,7 (s, 1H); 8,95 (s, 1H).
  • BEISPIEL 2
  • 6-{[(3-(1,3-Benzodioxol-5-yloxy)-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amino}pyridin-3-carbonsäure
    Figure 00330001
  • Eine 0,1 M Lösung von 6-{[(3-(1,3-Benzodioxol-5-yloxy)-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amino}pyridin-3-carbonsäuremethylester wurde mit einer 0,5 N Lösung von Natriumhydroxid (5 Äquivalente) versetzt. Die Mischung wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die organischen Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Wasser verdünnt und mit Salzsäure (2 N) angesäuert. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, wodurch man 6-{[(3-(1,3-Benzodioxol-5-yloxy)-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amino}pyridin-3-carbonsäure erhielt.
    m/z 467 (M+H)+, 465 (M-H)–; 1H-NMR δ (d6-DMSO): 1,22 (d, 3H); 3,28 (s, 3H, verdeckt durch den Lösungsmittelpeak); 3,46 (m, 2H); 4,74 (s, 1H); 6,04 (s, 2H); 6,56 (d, 1H); 6,73 (d, 1H); 6,92 (d, 1H); 7,09 (s, 1H); 7,37 (s, 1H); 8,26 (s, 2H); 8,86 (s, 1H); 11,15 (s, 1H); 13,12 (brs, 1H). 6-{[(3-(1,3-Benzodioxol-5-yloxy)-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amino}pyridin-3-carbonsäuremethylester
    Figure 00340001
  • Eine Lösung von 6-{[3-Hydroxy-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amino}pyridin-3-carbonsäuremethylester (0,5 mmol), 1,3-Benzodioxol-5-ylboronsäure (1,0 mmol), Kupfer(II)-acetat (0,5 mmol), Triethylamin (2,5 mmol) und frisch aktivierten 4A-Molekularsieben (500 mg) in DCM (5 ml) wurde 2 Tage lang bei Raumtemperatur und unter Normaldruck gerührt, weiteres Lösungsmittel, Molekularsiebe und Boronsäure (1 Äqv.) wurden zugesetzt und der Ansatz wurde weitere 4 Tage lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum eingeengt, der Rückstand wurde mit Essigsäureethylester verrieben, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit 20% Essigsäureethylester in Isohexan als Laufmittel an Kieselgel chromatographiert, wodurch man 6-{[(3-(1,3-Benzodioxol-5-yloxy)-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amino}pyridin-3-carbonsäuremethylester erhielt.
    m/z 481 (M+H)+.
  • Boronsäuresynthese
  • Die in den Beispielen 1 und 2 verwendeten Boronsäuren waren entweder im Handel erhältlich oder wurden wie folgt aus im Handel erhältlichen Materialien synthetisiert. Eine Lösung des entsprechenden Bromids (10 mmol) in Ether (25 ml) wurde bei –78°C mit einer 1,6 M Lösung von n-Butyllithium in Hexan (11 mmol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 Minuten lang bei –78°C gerührt, Borsäuretriisopropylester (11 mmol) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten lang bei –78°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, weitere 30 Minuten lang gerührt und dann mit Wasser (20 ml) gequencht. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt, mit Ether (25 ml) gewaschen und mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 1 angesäuert. Der auf diese Weise erhaltene Feststoff wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch man die gewünschte Boronsäure erhielt. 6-{[(3-Hydroxy-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl}amino}pyridin-3-carbonsäuremethylester
    Figure 00350001
  • Eine gerührte Lösung von 6-[({3-{[(1S)-1-Methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}-5-[(phenylmethyl)oxy]phenyl}carbonyl)amino]pyridin-3-carbonsäuremethylester (0,038 mol) in THF (85 ml) wurde mit Methanol (85 ml) versetzt. Unter einer Argonatmosphäre wurde Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator (1,7 g, 10 Gew.-%) zugegeben, und die auf diese Weise erhaltene Suspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter einer Wasserstoffatmosphäre gerührt. Der Katalysator wurde über Celite abfiltriert und mit THF gewaschen, und das Filtrat wurde zu einem hellbraunen Feststoff eingedampft. Dieser wurde mit Ether verrieben, wodurch man die gewünschte Verbindung (72% Ausbeute) erhielt.
    m/z 361 (M+H)+, 359 (M-H)–; 1H-NMR δ (d6-DMSO): 1,25 (d, 3H); 3,3 (s, 3H); 3,45 (m, 2H); 3,85 (s, 3H); 4,65 (m, 1H); 6,55 (m, 1H); 6,95 (m, 1H); 7,1 (m, 1H); 8,3 (m, 2H); 8,9 (m, 1H); 11,0, (s, 1H). 6-{({3-{[(1S)-1-Methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}-5-[(phenylmethyl)oxy]phenyl}carbonyl)amino]pyridin-3-carbonsäuremethylester
    Figure 00360001
  • Eine gerührte Lösung von 3-{[(1S)-1-Methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}-5-[(phenylmethyl)oxy]benzoesäure (75,9 mmol) in DCM (250 ml) mit DMF (1 ml) wurde unter Argon tropfenweise mit Oxalsäurechlorid (151,7 mmol) versetzt, und die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde 4 Stunden lang gerührt. Die Lösung wurde dann im Vakuum eingedampft und mit weiterem DCM (3 × 100 ml) azeotrop eingedampft, und der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet, was das Säurechlorid lieferte, das ohne weitere Charakterisierung verwendet wurde.
  • Das obige Säurechlorid (etwa 75,9 mmol) wurde in THF (100 ml) gelöst und unter Argon zu einer gerührten Lösung von 6-Aminonicotinsäuremethylester (91,1 mmol) in einer Mischung aus THF (100 ml) und Pyridin (100 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt, und das meiste Lösungsmittel wurde dann im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Essigsäureethylester (250 ml) aufgenommen, und die Suspension wurde dann nacheinander mit 1 M Citronensäure (2 Portionen, bis die Waschlösungen sauer blieben) und Kochsalzlösung gewaschen; die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde getrocknet (MgSO4) und eingedampft, wodurch man das Rohprodukt als einen braunen Gummi erhielt. Dieser wurde chromatographiert (400 g Biotage Kieselgelkartusche, unter Verwendung von Hexan mit 20 Vol.-% Essigsäureethylester als Laufmittel), was die gewünschte Verbindung (50 Ausbeute) lieferte.
    m/z 451,47 (M+H)+, 449,48 (M-H)–; 1H-NMR δ (d6-DMSO) 1,21 (d, 3H); 3,47 (m, 2H); 3,86 (s, 3H); 3,72 (m, 1H); 5,16 (s, 2H); 6,78 (t, 1H); 7,23 (s, 1H); 7,29 (s, 1H); 7,31-7,49 (m, 5H); 8,32 (s, 2H); 8,90 (scheinbares t, 1H); 11,15 (s, 1H). 3-{[(1S)-1-Methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}-5-[(phenyl methyl)oxy]benzoesäure
    Figure 00370001
  • Eine Lösung von 3-{[(1S)-1-Methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}-5-[(phenylmethyl)oxy]benzoesäuremethylester (77,4 mmol) in einer Mischung von THF (232 ml) und Methanol (232 ml) wurde mit einer Lösung von Natriumhydroxid (2 N) (232 mmol) versetzt, und die Reaktionsmischung wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde mit Wasser (250 ml) verdünnt, und der größte Teil des organischen Lösungsmittels wurde im Vakuum entfernt. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wurde mit Diethylether (3 × 200 ml) gewaschen, und die Waschlösungen wurden verworfen. Die auf diese Weise erhaltene wäßrige Lösung wurde mit Salzsäurelösung (2 M) auf einen pH-Wert von 4 angesäuert und mit Essigsäureethylester (2 × 200 ml) extrahiert; die Extrakte wurden vereinigt, mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingedampft, wodurch man die gewünschte Verbindung (99% Ausbeute) erhielt.
    1H-NMR δ (d6-DMSO): 1,20 (d, 3H); 3,46 (m, 2H); 4,64 (m, 1H); 5,15 (s, 2H); 6,83 (scheinbares t, 1H); 7,06 (s, 1H); 7,13 (s, 1H); 7,30-7,49 (m, 5H); 12,67 (brs, 1H). 3-{[(1S)-1-Methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}-5-[(phenylmethyl)oxy]benzoesäuremethylester
    Figure 00380001
  • Eine Lösung von 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)oxy]benzoesäuremethylester (77,4 mmol) in THF wurde mit polymergeträgertem Triphenylphosphin (51,7 g, Beladung 3 mmol/g, 155 mmol) und (R)-(-)-1-Methoxy-2-propanol (102 mmol) versetzt. Die gerührte Lösung wurde unter Argon gesetzt und auf einem Eisbad abgekühlt; eine Lösung von Diisopropylazodicarboxylat (116 mmol) wurde aus einer Spritze über 10 Minuten zugetropft. Nach der Zugabe der Lösung wurde 20 Minuten lang gerührt und dann filtriert, wobei der Rückstand mit THF (500 ml) gewaschen wurde; das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und eingedampft, wodurch man die rohe gewünschte Verbindung erhielt, die ohne weitere Aufreinigung in den nächsten Schritt eingesetzt wurde.
    1H-NMR δ (d6-DMSO): 3,26 (s, 3H); 3,44 (m, 2H); 3,82 (s, 3H); 4,63 (m, 1H); 5,14 (s, 2H); 6,85 (s, 1H); 7,05 (s, 1H); 7,11 (s, 1H); 7,30-7,47 (m, 5H); das Spektrum enthielt auch Signale, die auf eine kleine Menge an Bis(1-methylethyl)hydrazin-1,2-dicarboxylat hindeuten. 3-Hydroxy-5-[(phenylmethyl)oxy]benzoesäuremethylester
    Figure 00380002
  • Eine gerührte Lösung von 3,5-Dihydroxybenzoesäuremethylester (5,95 mol) in DMF (6 l) wurde mit Kaliumcarbonat (9 mol) versetzt, und die Suspension wurde unter Argon bei Raumtemperatur gerührt. Diese Mischung wurde im Verlauf von 1 Stunde langsam mit Benzylbromid (8,42 mol) versetzt, wobei es zu einer leicht exothermen Reaktion kam, und die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde dann vorsichtig mit Ammoniumchloridlösung (5 l) gefolgt von Wasser (35 l) gequencht. Die wäßrige Suspension wurde mit DCM (1 × 3 l und 2 × 5 l) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser (10 l) gewaschen und über Nacht getrocknet (MgSO4). Die Lösung wurde im Vakuum eingedampft, und das Rohprodukt wurde zum Entfernen des Ausgangsmaterials in drei Chargen chromatographiert (Flash-Säule, 3 × 2 kg Kieselgel, unter Anwendung eines Gradienten aus Hexan mit 10% DCM, bis reinem DCM, bis DCM mit 50% Essigsäureethylester als Laufmittel); das rohe Eluat wurde dann in 175-g-Chargen chromatographiert (Amicon HPLC, 5 kg Normalphasen-Kieselgel, unter Verwendung von Isohexan mit 20 Vol.-% Essigsäureethylester als Laufmittel), wodurch man die gewünschte Verbindung (21% Ausbeute) erhielt.
    1H-NMR δ (d6-DMSO): 3,8 (s, 3H); 5,1 (s, 2H); 6,65 (m, 1H); 7,0 (m, 1H); 7,05 (m, 1H); 7,3-7,5 (m, 5H); 9,85 (brs, 1H).
  • BIOLOGISCHER TEIL
  • Tests:
  • Die biologischen Effekte der Verbindungen der Formel (Ia), (Ib), (Ic), (Id) oder (Ie) können folgendermaßen geprüft werden:
    • (1) Die Enzymaktivität der GLK kann durch Inkubierung von GLK, ATP und Glucose bestimmt werden. Die Rate der Produktbildung kann durch Kopplung des Assays mit einem G-6-P-Dehydrogenase-NADP/NADPH-System und Messen des linearen Anstiegs der optischen Dichte bei 340 nm bestimmt werden (Matschinsky et al. 1993). Die Aktivierung von Verbindungen durch GLK läßt sich unter Anwendung dieses Assays in Gegenwart oder Abwesenheit von GLKRP (dem GLK-regulierenden Protein) wie in Brocldehurst et al. (Diabetes 2004, 53, 535–541) beschrieben untersuchen.
    • (2) GLK/GLKRP-Bindungsassay zur Messung der Bindungswechselwirkungen zwischen GLK und GLKRP. Das Verfahren kann zur Identifizierung von Verbindungen, die GLK modulieren, indem sie die Wechselwirkung zwischen GLK und GLKRP modulieren, verwendet werden. GLKRP und GLK werden mit einer hemmenden F-6-P-Konzentration, gegebenenfalls in Gegenwart der Testverbindung, inkubiert, und das Ausmaß der Wechselwirkung zwischen GLK und GLKRP wird gemessen. Verbindungen, die entweder F-6-P verdrängen oder auf andere Weise die GLK/GLKRP-Wechselwirkung verringern, werden über eine Verringerung der Menge an gebildetem GLK/GLKRP-Komplex detektiert. Verbindungen, die die F-6-P-Bindung fördern oder auf andere Weise die GLK/GLKRP-Wechselwirkung verstärken, werden durch eine Erhöhung der Menge an gebildetem GLK/GLKRP-Komplex detektiert. Ein spezielles Beispiel für einen derartigen Bindungsassay wird nachstehend beschrieben.
  • GLK/GLKRP-Szintillations-Proximitätsassay
  • Für die Entwicklung eines wie in WO01/20327 (auf deren Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird) beschriebenen 96-Well-SPA (Szintillations-Proximitätsassay) vom „Mix-and-Measure"-Typ wurden rekombinante(s) menschliche(s) GLK und GLKRP verwendet. GLK (biotinyliert) und GLKRP werden mit Streptavidinkonjugierten SPA-Perlen (Amersham) in Gegenwart einer hemmenden Konzentration von radioaktiv markiertem [3H]F-6-P (Amersham Custom Synthesis TRQ8689) inkubiert, was ein Signal ergibt. Verbindungen, die das F-6-P entweder verdrängen oder die die GLK/GLKRP-Bindungswechselwirkung auf andere Art und Weise stören, führen zu einem Verlust dieses Signals.
  • Die Bindungsassays wurden über einen Zeitraum von 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Reaktionsmischungen enthielten 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM ATP, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, rekombinante biotinylierte GLK (0,1 mg), rekombinantes GLKRP (0,1 mg), 0,05 mCi [3H] F-6-P (Amersham), was ein Endvolumen von 100 ml ergab. Nach der Inkubation wurde das Ausmaß der GLK/GLKRP-Komplexbildung durch Zugabe von 0,1 mg mit Avidin konjugierten SPA-Perlen (Amersham) pro Näpfchen und Szintillationszählung auf einem Packard TopCount NXT bestimmt.
    • (3) F-6-P/GLKRP-Bindungsassay zur Messung der Bindungswechselwirkung zwischen GLKRP und F-6-P. Mit dieser Methode können weitere Informationen über den Wirkmechanismus der Verbindungen erhalten werden. Im GLK/GLKRP-Bindungsassay identifizierte Verbindungen können die Wechselwirkung von GLK und GLKRP modulieren, und zwar entweder dadurch, daß sie das F-6-P verdrängen, oder dadurch, daß sie die GLK/GLKRP-Wechselwirkung auf andere Art und Weise modifizieren. So ist beispielsweise allgemein bekannt, daß Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Wechselwirkungen über mehrere Bindungsstellen auftreten. Es ist daher möglich, daß eine Verbindung, die die Wechselwirkung zwischen GLK und GLKRP modifiziert, durch Bindung an eine oder mehrere verschiedene Bindungsstellen wirken könnte.
  • Im F-6-P/GLKRP-Bindungsassay werden nur diejenigen Verbindungen identifiziert, die die Wechselwirkung von GLK und GLKRP dadurch modulieren, daß sie F-6-P von seiner Bindungsstelle am GLKRP verdrängen.
  • GLKRP wird mit der Testverbindung und einer hemmenden F-6-P-Konzentration in Abwesenheit von GLK inkubiert, und das Ausmaß der Wechselwirkung zwischen F-6-P und GLKRP wird gemessen. Verbindungen, die die Bindung von F-6-P an das GLKRP verdrängen, können durch eine Veränderung der Menge des gebildeten GLKRP/F-6-P-Komplexes nachgewiesen werden. Ein spezielles Beispiel für einen derartigen Bindungsassay wird nachstehend beschrieben.
  • F-6-P/GLKRP-Szintillations-Proximitätsassay
  • Für die Entwicklung eines gemäß WO01/20327 (auf deren Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird) beschriebenen 96-Well-Szintillations-Proximitätsassays vom „Mix-and-Measure"-Typ wurde rekombinantes menschliches GLKRP verwendet. FLAG-markiertes GLKRP wird mit Protein-A-beschichteten SPA-Perlen (Amersham) und einem Anti-FLAG-Antikörper in Gegenwart einer hemmenden Konzentration von radioaktiv markiertem [3H] F-6-P inkubiert. Es wird ein Signal erzeugt. Verbindungen, die F-6-P verdrängen, führen zum Verlust dieses Signals. Eine Kombination dieses Assays und des GLK/GLKRP-Bindungsassays ermöglicht dem Beobachter die Indentifizierung von Verbindungen, die die GLK/GLKRP-Bindungswechselwirkung dadurch unterbrechen, daß sie F-6-P verdrängen.
  • Die Bindungsassays wurden über einen Zeitraum von 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Reaktionsmischungen enthielten 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM ATP, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, rekombinantes FLAG-markiertes GLKRP (0,1 mg), Anti-FLAG-M2-Antikörper (0,2 mg) (IBI Kodak), 0,05 mCi [3H] F-6-P (Amersham), was ein Endvolumen von 100 ml ergab. Nach der Inkubation wurde das Ausmaß der F-6-P/GLKRP-Komplexbildung durch Zugabe von 0,1 mg mit Protein A konjugierten SPA-Perlen (Amersham) pro Näpfchen und Szintillationszählung auf einem Packard TopCount NXT bestimmt.
  • Herstellung von rekombinanter GLK und rekombinantem GLKRP:
  • mRNA-Präparation
  • Gesamt-mRNA aus menschlicher Leber wurde durch Polytron-Homogenisierung in 4 M Guanidinisothiocyanat, 2,5 mM Citrat, 0,5% Sarkosyl, 100 mM b-Mercaptoethanol, gefolgt von Zentrifugation durch 5,7 M CsCl, 25 mM Natriumacetat bei 135.000 g (max) gewonnen, wie bei Sambrook J, Fritsch EF & Maniatis T, 1989, beschrieben.
  • Poly-A+-mRNA wurde direkt mittels eines FastTrackTM-mRNA-Isolierungskits (Invitrogen) gewonnen.
  • PCR-Amplifikation von cDNA-Sequenzen von GLK und GLKRP
  • cDNA von humaner GLK und humanem GLKRP wurde aus humaner Leber-mRNA anhand etablierter Techniken durch PCR gewonnen, die in Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989 beschrieben sind. PCR-Primer wurden entsprechend den in Tanizawa et al. 1991 und Bonthron, D. T. et al. 1994 (später berichtigt in Warner, J. P. 1995) gezeigten cDNA-Sequenzen von GLK und GLKRP entwickelt.
  • Klonierung in Bluescript-II-Vektoren
  • GLK- und GLKRP-cDNA wurde mit pBluescript II, (Short et al. 1998) einem rekombinanten Vektorklonierungssystem, das dem von Yanisch-Perron C et al. (1985) angewandten ähnelt und ein auf E. coli basierendes Replikon mit einem Polylinker-DNA-Fragment mit mehreren einmal vorkommenden Restriktionsschnittstellen, flankiert von Promotorsequenzen der Bakteriophagen T3 und T7, einen Replikationsursprung filamentöser Phagen und ein Ampicillinresistenzmarkergen enthält, in E. coli kloniert.
  • Transformationen
  • Transformationen in E. coli wurden im allgemeinen mittels Elektroporation durchgeführt. 400-ml-Kulturen der Stämme DH5a oder BL21 (DE3) wurden in L-Bouillon bis zu einer OD600 von 0,5 gezüchtet und durch Zentrifugation bei 2.000 g geerntet. Die Zellen wurden zweimal in eiskaltem entionisiertem Wasser gewaschen, in 1 ml 10%igem Glycerin resuspendiert und in Aliquots bei –70°C aufbewahrt. Die Ligationsmischungen wurden mit Membranen der Millipore V SeriesTM (Porengröße 0,0025 mm) entsalzt. 40 ml der Zellen wurden mit 1 ml Ligationsmischung oder Plasmid-DNA 10 Minuten auf Eis in 0,2-cm-Elektroporationsküvetten inkubiert und anschließend mit einem Gene PulserTM-Apparat (BioRad) bei 0,5 kVcm–1, 250 mF gepulst. Transformanten wurden auf L-Agar, ergänzt mit 10 mg/ml Tetracyclin oder 100 mg/ml Ampicillin, selektiert.
  • Expression
  • GLK wurde von dem Vektor pTB375NBSE in E. coli-BL21-Zellen exprimiert, wodurch ein rekombinantes Protein mit einem 6-His-Marker direkt neben dem N-terminalen Methionin entstand. Ein alternativer anderer geeigneter Vektor ist pET21 (+) DNA, Novagen, Kat.-Nr. 697703. Der 6-His-Marker diente zur Reinigung des rekombinanten Proteins auf einer Säule, die mit Nickelnitrilotriessigsäure-Agarose, die von Qiagen (Kat.-Nr. 30250) bezogen wurde, gepackt war.
  • GLKRP wurde von dem Vektor pFLAG CTC (IBI Kodak) in E. coli-BL21-Zellen exprimiert, wodurch ein rekombinantes Produkt mit einem C-terminalen FLAG-Marker entstand. Das Protein wurde zunächst mittels DEAE-Sepharose-Ionenaustausch und anschließend mit Hilfe des FLAG- Markers zur Endreinigung auf einer M2-Anti-FLAG-Immunaffinitätssäule, die von Sigma-Aldrich (Kat.-Nr. A1205) bezogen wurde, gereinigt.
  • Biotinylierung von GLK:
  • GLK wurde durch Umsetzung mit Biotinamidocaproat-N-hydroxysuccinimidester (Biotin-NHS), der von Sigma-Aldrich (Kat.-Nr. B2643) bezogen wurde, biotinyliert. Kurz gesagt werden freie Aminogruppen des Zielproteins (GLK) in einem definierten molaren Verhältnis mit Biotin-NHS umgesetzt, um stabile Amidbindungen zu bilden, was ein Produkt mit kovalent gebundenem Biotin ergibt. Überschüssiges, nicht konjugiertes Biotin-NHS wird durch Dialyse aus dem Produkt entfernt. Im einzelnen wurden 7,5 mg GLK zu 0,31 mg Biotin-NHS in 4 ml 25 mM HEPES pH 7,3, 0,15 M KCl, 1 mM Dithiothreitol, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2 (Puffer A) gegeben. Diese Reaktionsmischung wurde gegen 100 ml Puffer A dialysiert, der weitere 22 mg Biotin-NHS enthielt. Nach 4 Stunden wurde überschüssiges Biotin-NHS durch ausgiebige Dialyse gegen Puffer A entfernt.
  • Messung von Plasmaspiegeln und Plasmaproteinbindung nach oraler Verabreichung an Ratten
  • Verabreichung von Verbindungen an Ratten und Entnahme von Plasmaproben
  • In einer Planetenmühle gemahlene Verbindungen [15 min, 500 U/min, 5 Zirconiumkugeln, in einer Puluerisette-7-Mühle (Glen Creston Ltd, Stanmore, Middlesex, Großbritannien)] wurden in 0,5% HPMC-Tween suspendiert und an mit Futter mit hohem Fettgehalt (High Fat Fed von Research Diets, D12451, ad-lib-Fütterung 14 Tage) gefütterte weibliche Alderley-Park-Zucker- or Alderley-Park-Wistar-Ratten mit einer Rate von 5 ml/kg mit Dosierungen zwischen 0,3 und 10 mg/kg durch Schlundsonde verabreicht.
  • Plasmaproben wurden entweder durch Blutentnahme am wachen Tier oder durch Blutentnahme vom toten Tier wie folgt entnommen:
    • Blutentnahme am wachen Tier (für die Bestimmung der Verbindungskonzentrationen oder der Blutchemie) – Intravenöse Blutproben wurden mit einer 600R1 Starstedt Multiwette (EDTA) und einer 22G-Nadel zum erforderlichen Zeitpunkt aus der Schwanzvene entnommen. Die Proben wurden auf Eis aufbewahrt und innerhalb von 15–30 Minuten nach der Entnahme 10 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Das Plasma wurde aspiriert und bei –20°C aufbewahrt.
    • Blutentnahme vom toten Tier für die Bestimmung der Verbindungskonzentrationen oder der Blutchemie – Zum Ende des Experiments wurden die Tiere mit CO2/O2 getötet. Die Blutproben wurden durch Herzpunktion entnommen. Die Proben wurden auf Eis aufbewahrt und innerhalb von 15–30 Minuten nach der Entnahme 10 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Das Plasma wurde aspiriert und bei –20°C aufbewahrt.
  • Messung von Verbindungskonzentrationen in Rattenplasma
  • 25 μl Rattenplasma wurde in die Vertiefungen einer Ausfällungsplatte mit 96 Vertiefungen (Varian inc. Palo Alto, Kalifornien, USA) gegeben. In jede Vertiefung wurden 500 μl Acetonitril mit 1 μg/ml (3-Isopropoxy-5-benzyoxybenzoyl)aminopyridin-3-carbonsäure als interner Standard zum Ausfällen der Plasmaproteine gegeben. Die Plasma/Lösungsmittel-Mischung wurde dann im Vakuum durch die Ausfällungsplatte gezogen, und das Eluat wurde gesammelt. Das Eluat wurde mit einem Zentrifugaleindampfer zur Trockne eingedampft und in 200 μl Methanol:Wasser:Ameisensäure (60:40:0,1) rekonstituiert.
  • Die rekonstituierten Proben wurden dann mittels Hochleistungsflüssigchromatographie mit Nachweis durch Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS-MS)" analysiert. Die HPLC wurde unter Verwendung einer Phenomenex Prodigy C8, 50 × 4,6, 5-μm-Säule (Phenomenex, Macclesfield, Großbritannien) mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min mit einem Injektionsvolumen von 10 μl unter Anwendung des folgenden Gradienten-Elutionsprofils durchgeführt:
    Mobile Phase A 0,1% Ameisensäure in Wasser
    Mobile Phase B 0,1% Ameisensäure in Methanol
    Mobile Phase Gradient 0 min 50% A
    0,5 min 5% A
    2,5 min 5% A
    2,6 min 50% A
    3,0 min 50% A.
  • Die Massenspektroskopie wurde mit einem Applied Biosystems API3000 Massenspektrometer (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) durchgeführt. Vor dem Messen der Proben wurde das Massenspektrometer für die Struktur der Testverbindungen optimiert.
  • Die Konzentration der Testproben wurde aus dem Verhältnis der Peakhöhe der Testprobe zur Peakhöhe des internen Standards bestimmt. Die Konzentration der Testprobe wurde unter Bezug auf eine Standardkurve zum Konzentrationsverhältnis, die angefertigt wurde, indem man bekannte Konzentrationen an Testproben zu Proben von Rattenplasma gab, unter Verwendung von (3-Isopropoxy-5-benzyoxybenzoyl)aminopyridin-3-carbonsäure als interner Standard, behandelt wie oben beschrieben, berechnet.
  • Messung der Plasmaproteinbindung von Verbindungen
  • Die Plasmaproteinbindung von Verbindungen wurde unter Anwendung des Gleichgewichtsdialyseverfahrens (W. Lindner et al, J. Chromatography, 1996, 677, 1–28) gemessen. Die Verbindung in einer Konzentration von 20 μM wurde bei 37°C 18 Stunden lang gegen Plasma und isotonischen Phosphatuffer mit einem pH-Wert von 7,4 (jeweils 1 ml in der Dialysezelle) dialysiert. Verwendet wurde ein Spectrum® Gleichgewichtsdialysegerät mit 20 Zellen zusammen mit Teflon, Halbmikro-Dialysezellen und Spectra/Por®2-Membranscheiben mit einem Molekulargewicht-Cutoff von 12–14000 Dalton, 47 mm (von PerBio Science UK Ltd, Tattenhall, Cheshire, Großbritannien). Plasma- und Pufferproben wurden nach der Dialyse entnommen und mittels HPLCUV/MS (Hochleistungsflüssigchromatographie mit Nachweis durch UV und Massenspektroskopie) analysiert, wodurch man die prozentuale Konzentration an ungebundener Verbindung im Plasma erhielt.
  • Abschätzung der Plasma-Halbwertszeit
  • Die Plasma-Halbwertszeit ist die Zeit, die vergeht, bis die Konzentration einer Verbindung im Plasma auf die Hälfte ihres ursprünglichen Werts gefallen ist. Dies wird typischerweise nach einer intravenösen Verabreichung der Testverbindung bestimmt, an die sich eine wie oben beschriebene Messung der Verbindungskonzentrationen in Plasmaproben anschließt. Die Plasma-Halbwertszeit wird aus einer halblogarithmischen Auftragung, bei der der log der Plasmakonzentration (lnCp) gegen den Zeitpunkt der Probenentnahme (t, linear) aufgetragen wird, abgeschätzt. Die Eliminierungsgeschwindigkeitskonstante k, die scheinbar erster Ordnung ist, entspricht der Steigung der Linie, und die Eliminierungs-Halbwertszeit (t½) ist der Kehrwert der Geschwindigkeitskonstante (Gibaldi, M und Perrier, D, 1975 Pharmacokinetics, Marcel Dekker, New York, USA): t½ = 1k
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben die folgenden Eigenschaften:
    • (i) eine aktivierende Wirkung auf Glucokinase mit einem EC50 von weniger als 200 nM;
    • (ii) einen frei im Plasma befindlichen Prozentsatz zwischen etwa 0,04% und etwa 1%;
    • (iii) Blut-Spitzenwerte (die sowohl gebundene als auch freie Verbindung einschließen) von zwischen etwa 0,3 μM und etwa 10 μM bei einer normalisierten Dosis von 1 mg Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht der Ratte; und
    • (iv) eine Plasma-Halbwertszeit (t½) von wenigstens etwa 1 Stunde.
  • Beispiel 2 zum Beispiel hat die folgenden Werte:
    EC50 % frei im Plasma Blut-Spitzenwerte t½
    60 nM 0,26% 2,7 μM 6,4 Stunden
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Claims (13)

  1. Verbindungen der Formel (I):
    Figure 00530001
    Formel (I) in welcher: R1-X- ausgewählt ist aus: Methyl, Methoxymethyl und
    Figure 00530002
    R2 ausgewählt ist aus Wasserstoff, Methyl, Chlor und Fluor; n für 1 oder 2 steht; und deren Salze, in vivo hydrolysierbare Ester und Solvate.
  2. Verbindungen nach Anspruch 1 der Formel (Ia)
    Figure 00540001
    Formel (Ia) in welcher: n und R2 wie oben für eine Verbindung der Formel (I) definiert sind; und deren Salze, Solvate und in vivo hydrolysierbare Ester.
  3. Verbindungen nach Anspruch 1 der Formel (Ib)
    Figure 00540002
    Formel (Ib) in welcher: n und R2 wie oben für eine Verbindung der Formel (I) definiert sind; und deren Salze, Solvate und in vivo hydrolysierbare Ester.
  4. Verbindungen nach Anspruch 1 der Formel (Ic)
    Figure 00550001
    Formel (Ic) in welcher: n und R2 wie oben für eine Verbindung der Formel (I) definiert sind; und deren Salze, Solvate und in vivo hydrolysierbare Ester.
  5. Verbindungen nach Anspruch 1 der Formel (Id)
    Figure 00550002
    Formel (Id) in welcher: n und R2 wie oben für eine Verbindung der Formel (I) definiert sind; und deren Salze, Solvate und in vivo hydrolysierbare Ester.
  6. Verbindungen nach Anspruch 1 der Formel (Ie)
    Figure 00560001
    Formel (Ie) in welcher: n, X, R1 und R2 wie oben für eine Verbindung der Formel (I) definiert sind; und deren Salze, Solvate und in vivo hydrolysierbare Ester.
  7. Verbindungen, ausgewählt aus einer oder mehreren der folgenden: 6-{[3-(2,3-Dihydro-1,4-benzodioxin-6-yloxy)-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amino}pyridin-3-carbonsäure und 6-{[(3-(1,3-Benzodioxol-5-yloxy)-5-{[(1S)-1-methyl-2-(methyloxy)ethyl]oxy}phenyl)carbonyl]amino}pyridin-3-carbonsäure und deren Salzen, Solvaten und in vivo hydrolysierbaren Estern.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein Salz, ein Solvat oder einen in vivo hydrolysierbaren Ester davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger.
  9. Verbindungen der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und deren Salze, Solvate und in vivo hydrolysierbare Ester zur Verwendung als Medikament.
  10. Verbindungen der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und deren Salze, Solvate und in vivo hydrolysierbare Ester zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer durch GLK vermittelten Krankheit, insbesondere Typ-2-Diabetes.
  11. Verwendung einer Verbindung der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines Salzes, eines Solvates oder eines in vivo hydrolysierbaren Esters davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der kombinierten Behandlung oder Prävention von Diabetes und Obesitas.
  12. Verwendung einer Verbindung der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines Salzes, eines Solvates oder eines in vivo hydrolysierbaren Esters davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Obesitas.
  13. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1 oder eines Salzes, eines in vivo hydrolysierbaren Esters oder eines Solvates davon, bei dem man: (a) eine Säure der Formel (IIIa) oder ein aktiviertes Derivat davon mit einer Verbindung der Formel (IIIb)
    Figure 00580001
    wobei P1 für Wasserstoff oder eine Schutzgruppe steht, umsetzt oder (b) eine Verbindung der Formel (IIIc)
    Figure 00580002
    Formel (IIIc) wobei P2 für eine Schutzgruppe steht, entschützt; oder (c) eine Verbindung der Formel (IIId) mit einer Verbindung der Formel (IIIe)
    Figure 00590001
    wobei X1 für eine Abgangsgruppe steht und X2 für eine Hydroxylgruppe steht oder X1 für eine Hydroxylgruppe steht und X2 für eine Abgangsgruppe steht und wobei P1 für Wasserstoff oder eine Schutzgruppe steht, umsetzt; oder (d) eine Verbindung der Formel (IIIf) mit einer Verbindung der Formel (IIIg)
    Figure 00590002
    wobei X3 für eine Abgangsgruppe oder ein metallorganisches Reagens und X4 für eine Hydroxylgruppe oder X3 für eine Hydroxylgruppe und X4 für eine Abgangsgruppe oder ein metallorganisches Reagens steht, wobei P1 für Wasserstoff oder eine Schutzgruppe steht, umsetzt; oder (e) eine Verbindung der Formel (IIIh) mit einer Verbindung der Formel (IIIf)
    Figure 00600001
    wobei X5 für eine Abgangsgruppe steht und wobei P1 für Wasserstoff oder eine Schutzgruppe steht, umsetzt; und anschließend, falls erforderlich: i) eine Verbindung der Formel (I) in eine andere Verbindung der Formel (I) umwandelt; ii) gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppen entfernt; iii) ein Salz, einen in vivo hydrolysierbaren Ester oder ein Solvat davon bildet.
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