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Die
Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die Behandlung
von Krankheiten bestimmt sind, die mit einer Funktionsstörung der
CFTR-Kanäle
verbunden sind, wie insbesondere Mukoviszidose, Asthma und Diarrhöe. Diese
Verbindungen enthalten ein Molekül,
das bei einem physiologischen pH-Wert in der Form eines Zwitterions
vorliegt, der Formel:
worin X = N oder P;
Y
= O oder S;
R
1 bis R
7 darstellen: –, H oder
substituierte oder nicht substituierte Kohlenstoffketten, die Heteroatome
enthalten können;
mit
Ausnahme von Betain.
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Das
CFTR-Protein oder "cystic
fibrosis transmembrane conductance regulator" ist ein transmembranes Protein, das
im Rahmen der Suche nach dem für
die Mukoviszidose (oder zystische Fibrose) verantwortlichen Gen
nachgewiesen wurde. Der CFTR-Kanal scheint einer der Schlüssel der
Regulierung des Chloridionentransports in den Epithelialzellen zu
sein. Die Epithelien bilden eine kontinuierliche Barriere zwischen
der äußeren Umgebung
und dem inneren Medium, wobei sie gleichzeitig den Transport von
Ionen, von Gelöstem und
von Makromolekülen
zwischen diesen Kammern gestatten. Die Na+-Absorption
und die Cl–-Sekretion
sind wichtige Elemente der Epithelfunktion.
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Die
Chloridionen gelangen in die Epithelialzelle durch die basolaterale
Oberfläche über einen
Cotransporter in Form (Na+, K+,
2 Cl–)
und verlassen diese unter Verwendung der CFTR-Kanäle der apikalen
Oberfläche
[1].
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Zwei
Krankheitstypen können
entgegengesetzten Funktionsstörungen
der CFTR-Kanäle
zugeordnet werden.
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Eine
Hemmung der Funktion ist verantwortlich für die mit der Mukoviszidose
verbundenen Probleme. Bei dieser Krankheit wird das codierte CFTR-Protein
aufgrund genetischer Mutationen entweder nicht an der apikalen Oberfläche geliefert
oder kann nicht aktiviert werden, so dass es für die Chloridionen unmöglich ist, die
Epithelialzelle zu verlassen. Diese Erscheinung induziert eine Adsorption
der Natriumionen und äußert sich in
einer Verdickung des Mukus, der die Atemwege verstopft.
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Umgekehrt
ist eine Überaktivität des CFTR-Kanals
Ursache von Diarrhöen.
Die übermäßige Ausscheidung
von Salzen ist von einem Wasserverlust begleitet, also mit Problemen,
die mit dieser Dehydratisierung verbunden sind. Die Übersteigerung
des Funktionierens der CFTR-Kanäle
kann die Folge des Vorhandenseins von Bakterientoxinen, wie Escherichia
coli oder Vibrio cholerae sein.
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Das
CFTR-Protein ist Teil der großen
Familie der ABC-Transporter (ATP-Binding Cassettes). Es besteht
aus 1480 Aminosäuren
[2, 3, 4], die zwei homologe Teile bilden, die miteinander durch
eine regulierende cycloplasmische Domäne (R) verbunden sind. Jeder
Teil umfasst sechs transmembrane Domänen (M1 bis M6 und M7 bis M12)
und eine Nucleotidbin dungsdomäne
(NBD-1 und NBD-2). Zwischen den transmembranen Domänen M7 und
M8 gibt es zwei N-glycosylierte Stellen.
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Die
zwölf transmembranen
Domänen
bilden einen Kanal, dessen Aktivität durch die Phosphorylierung der
R-Domäne
bestimmt ist, sowie durch die Hydrolyse von in den NBDs gebundenen
ATP-Molekülen.
In dem extrazellulären
Kegel gibt es Anionen und Kationen. Die Selektivität dieses
Kanals für
die Anionen soll hauptsächlich
auf das Vorhandensein eines Argininrests Arg-352 (R352) am Ende
des Cytoplasmakegels zurückzuführen sein.
Der Mindestdurchmesser dieser Poren soll etwa 5,3 Å betragen.
Diese Größe wurde
ausgehend von den größten Anionen
bestimmt, die in die Zelle eintreten. Der Kanal soll sich jedoch
vorübergehend
bis zu einem Durchmesser von 13 Å ausdehnen können.
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Die
verschiedenen bisher bekannten Aktivatoren der CFTR-Kanäle wirken
auf verschiedene Weisen. Unter anderem kann man drei Wirkungsweisen
nennen:
- – diejenigen,
die direkt auf die NBD einwirken: das Genistein, das die Öffnung des
Kanals verlängert;
das NS-004 oder die MPB (substituierte Benzo[c]chinolizinium);
- – diejenigen,
die durch Erhöhung
der Menge des cyclischen AMP wirken, das für die Aktivierung der Regulator-Domäne R erforderlich
ist: das Forskolin, das die Biosynthese des cyclischen AMP aktiviert;
das Milrinon, von dem angenommen wird, dass es durch seine hemmende
Wirkung auf die Phosphodiesterasen wirkt;
- – diejenigen,
die die Phosphataseproteine hemmen, Enzyme, die die Schließung des
Kanals durch die Phosphorylierung der R-Domäne regulieren, und zwar Bromotetramisol
oder gewisse Xanthine.
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Was
die Hemmer der CFTR-Kanäle
betrifft, so besteht ihre Wirkungsweise im Allgemeinen in der Blockierung
der Pore, wodurch die Ionen daran gehindert werden, den Kanal zu
passieren [3]. Man kann unter anderem nennen: Carbonsäuren, wie
IAA-94 (Indanyloxyessigsäure),
DPC (Diphenylamin-2-carboxylat)
und NPPB (5-Nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoat),
DIDS (4,4'-Diisothiocyanostylben-2,2'-disulfonsäure) oder Sulfonylharnstoffe,
zu denen Glibenclamin gehört:
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Diese
Moleküle
hemmen die CFTR-Kanäle
bei hohen Konzentrationen und sind für diese Kanäle nicht spezifisch. Die Konzentration,
die erforderlich ist, um 50% der Aktivität des CFTR-Kanals durch Lonidamin
zu hemmen (IC50), beträgt
58 μM. Diese
Hemmer wirken auch auf die anderen Chloridkanäle und die Kaliumkanäle.
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Im
Jahr 2002, haben Ma et al. über
eine neue Klasse von Hemmern und neuen Familien von Aktivatoren
berichtet, die beide sehr hohe Aktivitäten bezüglich derjenigen besitzen,
die bisher berichtet wurden [5, 6]:
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Diese
neuen Hemmer sind vom Typ 2-Thiooxo-4-thiazolidinon. Sie besitzen
eine spezifische Aktivität für CFTR.
Einer von ihnen, CFTRinh-172, besitzt
eine Hemmung von 50% (IC50) bei einer Konzentration von 0,2 μM sowie ein
Fehlen von Toxizität
in 7 Tagen bei der Maus bei einer Injektion von 10 mg/kg. Er besitzt
also die für
eine therapeutische Anwendung erforderlichen Vorteile. So reduziert
eine bei der Maus injizierte Dosis (250 μg/kg) Diarrhöen, die durch das Choleratoxin
verursacht werden, um mehr als 90% während 6 Stunden.
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Was
die neuen Aktivatoren betrifft, so wurden sie durch "Screening" einer Kollektion
von 60 000 Verbindungen nachgewiesen. Manche von ihnen haben sich
als für
CFTR spezifisch und besonders wirksam mit einer Konzentration, die
erforderlich ist, um 50% der maximalen Aktivität zu erhalten (EC50), von weniger
als 200 nM sowie einem Fehlen von Toxizität an Zellen nach 24 h Inkubation
herausgestellt. Unter diesen Derivaten kann man das Vorhandensein
von heterocyclischen Verbindungen wie CFTRact-O7
und CFTRact-14 nennen.
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Trotz
des Erscheinens dieser vielversprechenden Moleküle und des bereits vorhandenen
Arsenals besteht ein echter Bedarf daran, Moleküle zu entwickeln, die das Funktionieren
der CFTR-Kanäle
modulieren können
und eine Spezifität,
eine Wirksamkeit und ein Fehlen von Toxizität aufweisen, die an therapeutische Anwendungen
angepasst sind.
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Im
Rahmen der Erfindung haben die Anmelder nachgewiesen, dass Moleküle, die
bei einem physiologischen pH-Wert in der Form eines Zwitterions
von einer genau bestimmten Formel vorliegen, eine solche Aktivität und solche
Eigenschaften besitzen.
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Die
Erfindung betrifft nun die Verwendung eines Moleküls, das
bei einem physiologischen pH-Wert in der Form eines Zwitterions
vorliegt, der Formel:
worin X = N oder P;
Y
= O oder S;
R
1 bis R
7 darstellen: –, H oder
substituierte oder nicht substituierte Kohlenstoffketten, die Heteroatome
enthalten können;
mit
Ausnahme von Betain,
für
die Herstellung eines Medikaments, das für die Behandlung von Krankheiten
bestimmt ist, die mit einer Funktionsstörung der CFTR-Kanäle verbunden
sind.
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Die
von dieser therapeutischen Anwendung betroffenen Moleküle sind
also durch ihre biologische Aktivität, im vorliegenden Fall ihre
Fähigkeit,
das Funktionieren der CFTR-Kanäle zu modulieren,
gekennzeichnet. Außerdem
ist die therapeutische Nutzung dieser Moleküle durch ihre Ungiftigkeit
gewährleistet.
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Man
versteht unter CFTR-Kanälen
gleichzeitig den isolierten menschlichen Kanal, aber auch alle Varianten,
die Mutationen aufweisen. Dies umfasst insbesondere die Proteine
von anderen Tierarten, aber auch natürlich mutierte Proteine. Eine
sehr wichtige Kategorie von mutierten menschlichen CFTR-Kanälen betrifft die
Formeln, die bei der Mukoviszidose angetroffen werden, und zwar
insbesondere die Mutanten ΔF508
(Deletion eines Phenylalanins in Position 508) und G551D (Ersetzung
eines Glycinrests durch eine Asparaginsäure in Position 551).
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Diese
Moleküle
können
eine hemmende oder aktivierende Wirkung auf die CFTR-Chloridkanäle haben.
Ihre Wirkung ist für
diesen Typ von Kanälen
spezifisch, d. h. diese Moleküle
haben dagegen keine oder wenig Wirkung auf die Aktivität der anderen
Ionenkanäle
(andere Chloridkanäle,
Kaliumkanäle,
...).
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Aktivatoren
haben eine günstige
Wirkung auf die mutierten Kanäle,
die für
die Mukoviszidose verantwortlich sind. Im Fall von nicht mutierten
Kanälen
haben die aktivierenden Moleküle
Bronchien erweiternde Eigenschaften, die im Fall von zahlreichen
die Atemwege verstopfenden Krankheiten, wie Asthma, günstig sind.
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Dagegen
werden die Hemmer im Fall von Diarrhöen eingesetzt, die beispielsweise
durch den für
die Cholera verantwortlichen Bazillus induziert werden.
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Betain
ist von den von der Erfindung betroffenen Molekülen ausgeschlossen, da die
Schrift
US 5,516,798 bereits
seine Verwendung für
die Behandlung von Diarrhöen
lehrt. Der Wirkungsmechanismus wird jedoch in dieser Schrift überhaupt
nicht aufgeklärt
und es lässt
sich keine allgemeine Formel für
die aktiven Moleküle
daraus ableiten.
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Im
Rahmen der Erfindung bezieht sich der Begriff "physiologischer pH-Wert" auf den pH-Wert
des Körpers
des zu behan delnden Organismus, und insbesondere auf den pH-Wert
in Nähe
der Wirkungsstelle des erfindungsgemäßen Moleküls, und zwar in der Umgebung
des gescreenten CFTR-Kanals. Praktisch handelt es sich um einen
pH-Wert zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6 und 8, insbesondere
pH 7,4.
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Das
erfindungsgemäße Molekül liegt
bei diesem pH-Wert in der Form eines Zwitterions vor. Ein Zwitterion
ist als eine Einheit definiert, die gleichzeitig eine positive Ladung
und eine negative Ladung trägt.
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Unter
den besonderen Bedingungen der Erfindung wird eine positive Ladung
von einem Stickstoffatom (N+) oder Phosphoratom
(P+) getragen, während die negative Ladung mit
dem Vorhandensein einer Funktion Carboxylat, Hydroxyl oder deprotoniertes
Thiol (O– oder
S–)
verbunden ist, wobei die beiden diese entgegengesetzten Ladungen
tragenden Atome durch zwei Kohlenstoffatome getrennt sind.
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Wenn
sich das Molekül
bei der beanspruchten Verwendung bei einem physiologischen pH-Wert
in der Form eines Zwitterions befindet, kann es dagegen in einer
nicht zwitterionischen Form, insbesondere in einer anderen Säure/Base-Form,
hergestellt und/oder geliefert werden.
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In
der Definition der von Anspruch 1 betroffenen Moleküle bedeutet
die Tatsache, dass R
1 bis R
7 "–" darstellen kann, dass das R benachbarte
Atom mindestens eine Doppelbindung besitzt, wie nachstehend dargestellt
wird:
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Die
Anmelder haben nachgewiesen, dass das Vorhandensein mindestens eines
Rings in den in Anspruch 1 definierten Molekülen im Rahmen der Erfindung
vorteilhaft ist. Infolgedessen bilden bei einer bevorzugten Ausführungsform
R1 und/oder R2 und/oder
R3 und/oder R4 und/oder
R5 und/oder R6 und/oder
R7 einen aromatischen oder nicht aromatischen
Ring. Es ist zu bemerken, dass diese Definition Betain ausschließt. Es sind
zahlreiche Fälle
von Figuren möglich,
und zwar insbesondere:
- – das Atom X ist in einen oder
zwei aromatische oder nicht aromatische Ringe eingeschlossen;
- – das
Atom Y ist von einem aromatischen oder nicht aromatischen Ring getragen
oder ist ein Substituent von diesem;
das Atom X ist in einen
oder zwei aromatische oder nicht aromatische Ringe eingeschlossen
und das Atom Y ist von einem aromatischen oder nicht aromatischen
Ring getragen;
- – das
Atom X ist in einen oder zwei aromatische oder nicht aromatische
Ringe eingeschlossen und das Atom Y ist von einem der aromatischen
oder nicht aromatischen Ringe, die das Atom X enthalten, getragen.
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In
diesem Rahmen weist eine erste Familie von erfindungsgemäß verwendbaren
Molekülen
die folgende Formel auf:
worin R'
1 bis R'
8 darstellen: –, H oder
substituierte oder nicht substituierte Kohlenstoffketten, die Heteroatome enthalten
können;
wobei
R'
1 und
R'
2 einen
aromatischen oder nicht aromatischen Ring bilden können.
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Vorzugsweise
besitzen diese Moleküle:
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- – R'4 =
R'5 =
OH;
- – R'6 =
R'8 =
H;
und vorteilhafterweise:
- – R'3 =
R'7 =
CH3.
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Die
positive Ladung wird von der Iminfunktion getragen, während die
negative Ladung mit dem Vorhandensein einer Carboxylatgruppe verbunden
ist.
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Die
Synthesemethode von manchem Molekül dieser Familie wird in Routaboul
et al. (2000) beschrieben [7]. Diese Schrift beschreibt speziell
die Reaktion zwischen zwei Methylglyoxalmolekülen und 2-Aminopyridin oder
Adenin oder Adenosin oder 2'-Desoxyadenosin
oder 9-Propyladenin oder Cytosin o der Polyadenylsäure (PolyA).
Eine analoge Reaktion zwischen Methylglyoxal und den Argininresten
der Proteine (Arginin oder seine an der α-Aminosäure-Gruppe geschützten Derivate)
wurde bereits berichtet [8]. Diese bereits offenbarten Addukte sind
nachstehend dargestellt:
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Dagegen
wurde bei diesen Molekülen
keine biologische Aktivität
berichtet. Nun haben die Anmelder festgestellt, dass diese Verbindungen
mit einer solchen Formel Modulatoren der Aktivität der CFTR-Kanäle sind
und dass diese Verbindungen infolgedessen im Rahmen der Erfindung
therapeutisch verwendet werden können.
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Ferner
haben die Anmelder neue Moleküle
auf der Basis dieser selben Reaktion entwickelt. Diese neuen Addukte
wurden, genauer gesagt, durch Kondensation von 2-α-Ketoaldehydmolekülen erhalten,
die enolisierbare Wasserstoffatome besitzen, an einem Molekül, das zwei
durch einen Kohlenstoff getrennte Stickstoffatome besitzen, die
mit α-Ketoaldehyd
reagieren können,
in Gegenwart von H
2O und/oder einem organischen Lösungsmittel,
wie Ethanol, bei einem pH-Wert von 1 bis 10 und bei einer Temperatur
von 25°C
und 80°C.
Diese Reaktion führt
zu α-Iminosäuren mit
der folgenden Formel bei physiologischem pH:
worin R'
1, R'
2,
R'
3 und
R'
7 H
oder substituierte oder nicht substituierte, cyclische oder nicht
cyclische, aromatische oder nicht aromatische Kohlenstoffketten
darstellen, die Heteroatome enthalten können.
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Das
an dieser Reaktion beteiligte α-Ketoaldehyd
ist vorzugsweise Methylglyoxal, Ethylglyoxal, Benzylglyoxal oder
eine Mischung von zwei dieser α-Ketoaldehyde.
Im Fall einer Mischung werden die beiden verschiedenen α-Ketoaldehyde in die
Reaktionsmischung gleichzeitig oder sequentiell eingeführt.
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Das
Molekül,
an dem die 2 α-Ketoaldehydmoleküle kondensieren,
ist vorzugsweise eine Nucleinbase (Adenin oder Cytosin) oder ihre
Derivate (substituierte wie 9-Propyladenin, 1-Propylcytosin oder
PolyA), 2-Aminopyridin oder seine Derivate (substituierte, 2-Amino-3-hydropyridin,
Aminopyrazin oder 1-Aminoisochinolein), 2-Aminobenzothiazol oder
Benzamidin.
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Die
neuen erfindungsgemäßen Addukte
haben vorzugsweise die folgende Formel:
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Bei
allen diesen bekannten oder neuen Molekülen ist zu bemerken, dass die
von den Zuckern getragenen Hydroxylfunktionen (beispielsweise im
Fall der Addukte von Adenosin oder 2'-Desoxyadenosin) insbesondere durch
Acetylierung modifiziert werden können.
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Beispielsweise
wurden die pKa-Werte des Produkts der Reaktion zwischen Methylglyoxal
und 2-Aminopyridin von den Anmelder in wässriger Lösung bei 25°C gemessen: er beträgt etwa
2 bei der Carbonsäurefunktion
und etwa 10 bei der Iminfunktion, was den zwitterionischen Charakter
des Moleküls
bei physiologischem pH bestätigt.
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Während dieser
Reaktion beobachtet man die Bildung von Stereoisomeren, die in Form
von zwei Mischungen von Enantiomeren trennbar sind, wenn das aminierte
Ausgangsderivat nicht chiral ist. Wenn es chiral ist, werden vier
Diastereoisomere gebildet und können
in Form von zwei Mischungen isoliert werden.
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Die
Anmelder haben nachgewiesen, dass im Fall der getesteten Addukte,
und zwar derjenigen von 9-Propyladenin, Adenin und 1-Propylcytosin,
die biologische Aktivität
jeder der getrennten Diastereoisomere (in Form von zwei Mischungen
von Enantiomeren), verglichen mit derjenigen ihrer Mischung, im
Wesentlichen dieselbe war.
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Die
Moleküle,
die im Rahmen der Erfindung wegen ihrer Aktivität gegenüber den CFTR-Kanälen verwendet
werden, sind vorteilhafterweise die Addukte, die ausgehend von zwei
Methylglyoxalmolekülen
und 2-Amino-3-hydroxypyridin oder Adenin oder 2'-Desoxyadenosin oder 9-Allyladenin oder
9-Propyladenin oder 1-Propylcytosin
oder 1-Aminoisochinolein erhalten werden. Das Addukt zwischen Ethylglyoxal
und 2-Aminopyridin
wird ebenfalls bevorzugt.
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Die
Erfindung betrifft allgemeiner die Gesamtheit der durch diese Reaktion
erzeugten Addukte mit Ausnahme derjenigen, die in den Quellen 7
und 8 beschrieben werden, sowie die Verwendung aller dieser Moleküle als Medikament.
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Die
erste therapeutische Verwendung dieser Moleküle impliziert ihre Formulierung
in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, in die sie als Wirkstoff
integriert sind.
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In
der gesamten Anmeldung versteht man unter pharmazeutischer Zusammensetzung
eine Zusammensetzung, die mindestens ein erfindungsgemäßes Molekül als Wirkstoff
bzw. Wirkstoffe in Kombination mit einem physiologisch annehmbaren
Träger
enthält.
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Eine
erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung kann auf oralem Weg (Tabletten oder Gelatinekapseln),
auf parenteralem Weg (intravenös,
intramuskulär
oder subkutan) oder auf dem Luftweg verabreicht werden.
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Erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzungen sind außerdem
dadurch gekennzeichnet, dass sie Mengen an Wirkstoff bzw. Wirkstoffen
enthalten, die an die Posologie, insbesondere an die Masse der Patienten
und an die Anzahl der Gaben angepasst sind.
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Eine
zweite Reihe von Molekülen
wird aus dieser ersten Familie von Molekülen durch eine von den Anmeldern
vorgelegte neue Reaktion erhalten.
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Diese
neuen Moleküle
sind Derivate, die bei physiologischem pH-Wert in der Form eines
Zwitterions vorliegen, mit der allgemeinen Formel:
Worin R'
1 und R'
2 darstellen: –, H, oder
substituierte oder nicht substituierte Kohlenstoffketten, die Heteroatome enthalten
können;
und einen aromatischen oder nicht aromatischen Ring bilden können;
R'
3 und
R'
7 darstellen:
H oder substituierte oder nicht substituierte Kohlenstoffketten,
die Heteroatome enthalten können;
Y
= O oder S.
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Die
positive Ladung wird von einem vierwertigen Stickstoffatom getragen,
während
die negative Ladung mit der Hydroxylfunktion (Phenolfunktion) oder
der deprotonierten Thiolfunktion verbunden ist.
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Wie
bereits gesagt, werden die Moleküle
der ersten Familie durch Kondensation von 2 α-Ketoaldehydmolekülen, die
enolisierbare Wasserstoffatome besitzen, an einem Molekül, das zwei
durch einen Kohlenstoff getrennte Stickstoffatome besitzt, die mit α-Ketoaldehyd
reagieren können,
in Gegenwart von H
2O und/oder einem organischen
Lösungsmittel
wie Ethanol bei pH 1 bis 10 und einer Temperatur zwischen 25°C und 80°C erhalten,
was eine α-Iminosäure ergibt:
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Um
die Moleküle
der zweiten Familie zu erhalten, wird die α-Iminosäure zwischen 40 und 90°C in einer wässrigen
Soda- oder Kalilösung 1 bis
2 M erhitzt, was zu einer oxidierenden Decarboxylierung und einer
Dehydratisierung nach der folgenden Reaktion führt:
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Diese
zweite Reaktion kann auch in einem basischen organischen Medium
durchgeführt
werden, beispielsweise in Gegenwart von Natriumethanolat in Ethanol
oder Natriumpropanolat in Propanol. Der Oxidationsschritt kann von
selbst an der Luft stattfinden oder mit Hilfe eines Oxidationsmittels
wie 2,3-Dichlor-5,6-dicyanochinon durchgeführt werden.
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Bei
der Ausführungsform,
bei der Y=S, ist das Sauerstoffatom (O) durch ein Schwefelatom (S)
substituiert.
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Bei
einem eventuellen nachfolgenden Schritt ist es möglich, neue Moleküle vom Typ
Aldehyd auf Höhe der
Reste R'3 und/oder R'7 zu kondensieren.
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Auf
diese Weise wurden die aus Methylglyoxal und 2-Aminopyridin erhaltenen Addukte unter
diesen Bedingungen behandelt. Diese Reaktion führt zur Bildung des folgenden
Derivats:
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Als
Beispiel wurde der pKa-Wert dieser Verbindung
mit 4 gemessen. Das bedeutet, dass diese Verbindung in wässriger
Lösung
mit pH 7 hauptsächlich
in zwitterionischer Form vorliegt, sowie im Fall von sehr verdünnten Lösungen,
wie sie für
die biologischen Tests verwendet werden.
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Diese
Reaktion, obwohl nicht vollständig,
fand auch beispielsweise statt mit:
- – den Addukten
von 1-Aminoisochinolein:
- – den
Addukten von 2-Aminobenzothiazol:
- – den
Addukten von Benzamidin:
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Aus
diesen Verbindungen kann eine neue Serie von Molekülen erhalten
werden:
- – durch
Substitution des Sauerstoffatoms (O) mit einem Schwefelatom (S),
was eine Schwefelverbindung ergibt. Diese Reaktion wird nachstehend
als Beispiel dargestellt:
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Diese
Umwandlung findet in zwei Schritten statt: eine Sulfonylierung an
dem Sauerstoffatom und dann die Substituierung der Arylsulfonylgruppe
durch Reaktion mit einem Hydrogensulfidion.
- – und/oder
durch Kondensation auf Höhe
der zu beiden Seiten der Hydroxylgruppe gelegenen -CH3-Gruppen
beispielsweise mit Formaldehyd:
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Die
Wasserstoffatome der Methylgruppen sind nämlich sauer und können durch
Reaktion mit Elektrophilen in basischem Medium substituiert werden.
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So
kann eine äquivalente
Reaktion beispielsweise mit Benzaldehyd durchgeführt werden:
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Die
Reaktion (Kondensation und Dehydratisierung) wird in der Dunkelheit
durchgeführt,
indem das Sauerstoffderivat in einer wässrigen Sodalösung 2M
gelöst
wird und indem dann Benzaldehyd (oder ein Derivat) in leichtem Überschuss
zugesetzt wird. Das reine gesuchte Derivat wird in Form eines roten
Pulvers nach Chromatographie auf Siliciumoxidsäule erhalten, indem mit einer
Mischung Dichlormethan-Methanol eluiert wird. Die Reaktion kann
in Gegenwart eines reichlichen Überschusses
an Benzaldehyd oder eines Derivats so durchgeführt werden, dass man auf ähnliche
Weise die zweite Methylgruppe reagieren lässt und auf diese Weise das
disubstituierte Derivat erhält.
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Auf
diese Weise wurde ein Molekül
der folgenden Formel erhalten:
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Abgesehen
davon, dass sie neu sind, haben die Anmelder nachgewiesen, dass
die Moleküle,
die bei einem physiologischen pH-Wert in der Form eines Zwitterions
vorliegen, der allgemeinen Formel:
worin R'
1, R'
2,
R'
3 und
R'
7 darstellen: –, H oder
substituierte oder nicht substituierte Kohlenstoffketten, die Heteroatome
enthalten können;
wobei
R'
1 und
R'
2 einen
aromatischen oder nicht aromatischen Ring bilden können;
Y
= O oder S,
therapeutische Anwendungsmöglichkeiten besitzen können, und
zwar insbesondere bei der Herstellung von Medikamenten für die Behandlung
von Krankheiten, die mit einer Funktionsstörung der CFTR-Kanäle verbunden
sind.
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Bei
dieser letztgenannten therapeutischen Anwendung haben die Moleküle dieser
zweiten Familie vorteilhafterweise eine Formel, die aus der Gruppe
ausgewählt
ist, die umfasst:
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Schließlich gibt
es eine gewisse Anzahl von als solche bereits bekannten Molekülen, die
bei einem physiologischen pH-Wert in der Form eines Zwitterions
der beanspruchten Formel vorliegen, die eine erfindungsgemäße biologische
Aktivität
besitzen kann.
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Ein
Molekül,
das dieser Definition entspricht, ist das 7-Methylguanosin, das unter anderem in
der Schrift Ermolinsky et al. beschrieben wird [9]:
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Auch
hier können
die von den Zuckern getragenen Hydroxylfunktionen insbesondere durch
Acetylierung modifiziert werden.
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Nach
Kenntnis der Anmelder wurden die einer solchen Definition entsprechenden
Moleküle
nie im Zusammenhang mit therapeutischen Anwendungen beschrieben.
Derartige Moleküle
für ihre
Verwendung als Medikament, das insbesondere für die Behandlung von Krankheiten,
die mit einer Störung
der CFTR-Kanäle verbunden
sind, bestimmt ist, sind ebenfalls Teil der Erfindung.
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Die
Vorteile, die sich aus der vorliegenden Erfindung ergeben, sind
in den nachstehend vorgelegten Ausführungsbei spielen unter Bezugnahme
auf die beiliegenden Figuren dargestellt.
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1:
Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen
(Verbindung 1 bis 4, 6 bis 7 und 9 bis 10) bei einer Konzentration
von 1 μM
auf den in den Zellen CHO-WT überexprimierten
CFTR-Rezeptor. Der Bezug 100 Aktivierung entspricht der bei Vorhandensein
von 1 μM
Forskolin beobachteten Aktivierung.
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2:
Kurven zur Bestimmung:
- A) der EC50-Werte bei
den aktivierenden Verbindungen (Verbindungen 9 bis 10) in Gegenwart
von 1 μM Forskolin;
- B) der IC50-Werte bei den hemmenden Verbindungen (Verbindungen
1 bis 4 und 6 bis 7) bei Vorhandensein von 5 μM Forskolin.
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I. GERÄTE
UND METHODEN
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1. Synthese der Verbindungen der Familie
I (Verbindungen 1 bis 5 und 9 bis 10):
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- a) Allgemeine Vorgehensweise: Das Prinzip dieser
Synthese wurde im Wesentlichen in Routaboul et al. (2002) [7] beschrieben.
Ein 2-Aminopyridin wird in der handelsüblichen 40%-igen wässrigen
Methylglyoxallösung
gelöst.
Die Mischung wird unter Argon auf 50°C erhitzt. Nach Eindampfen unter
vermindertem Druck wird die Mischung der beiden Isomere vom Reaktionsmedium
durch Chromatographie auf C18-Umkehrphasen-Kartusche
getrennt, indem mit Wasser eluiert wird. Nach Abdampfen des Lösungsmittels
wird die Mischung von Diastereoisomeren in einem Minimum an Methanol
gelöst und
in wasserfreiem Ether ausgefällt. Bei
manchen Addukten werden die Diastereoisomere durch Chromatographie
auf Siliciumoxidgelsäule
getrennt (trockener Auftrag; Elution: Gradient CH2Cl2/MeOH [9:1] bis [7:3]). Nach Abdampfen des
Lösungsmittels
unter vermindertem Druck werden sie in Wasser gelöst und durch
eine neuerliche Chromatographie auf C18-Umkehrphasen-Kartusche
gereinigt (Eluierungsmittel: Wasser). Die Verbindungen liegen in
Form von weißen
Pulvern vor.
- b) Verbindung 1: Addukte von 2'-Desoxyadenosin Die Ausbeute
der Reaktion betrug 20% bei dem Hauptaddukt (150 m oder 0,35 mmol)
und 7% bei dem Nebenaddukt (53 mg oder 0,12 mmol).
- c) Verbindung 2: Addukte von 1-Propylcytosin Eine Mischung der diastereoisomeren
Addukte wurde mit einer Ausbeute von 74 erhalten (73 mg oder 0,25 mmol)
- d) Verbindung 3: Addukte von 2-Amino-3-hydroxypyridin Eine Mischung der distereoisomeren
Addukte wurde mit einer Ausbeute von 73 (77 mg oder 0,30 mmol) erhalten.
- e) Verbindung 4: Addukte von 1-Aminoisochinolein Die Mischung der diastereoisomeren
Addukte fällt
aus und wird vom Reaktionsmedium durch Filtrieren und Waschen mit
einem Minimum an wasserfreiem Diethylether getrennt. Sie wird mit
einer Ausbeute von 82 (2,065 g oder 7,2 mmol) erhalten.
- f) Verbindung 5: Addukte von Adenin Die Ausbeute der Reaktion
betrug 46% bei dem Hauptaddukt (0,950 g oder 3,4 mmol) und 20% bei
dem Nebenaddukt (0,413 g oder 1,48 mmol).
- g) Verbindung 9: Addukte von 9-Propyladenin Die Ausbeute der Reaktion
betrug 24% bei dem Hauptaddukt (109 mg oder 0,34 mmol) und 17% bei
dem Nebenaddukt (76 mg oder 0,24 mmol).
- h) Verbindung 10: Addukte von 9-Allyladenin
-
Nach
Trennung des Reaktionsmediums auf C16-Umkehrphasen-Kartusche wird das
Hauptaddukt isoliert und in Propan-2-ol kristallisiert. Man erhält 390 mg
oder 1,22 mmol, d. h. eine Ausbeute von 43%.
-
2. Synthese der Verbindungen der Familie
II (Verbindungen 6 und 7):
-
- a) Allgemeine Vorgehensweise: Die Verbindungen
der Familie II werden aus Verbindungen der Familie I durch Erhitzen
in basischem Medium erhalten.
- b) Verbindung 6: Derivat von 2-Aminopyridin
1. Schritt:
Synthese der Addukte von 2-Aminopyridin
2. Schritt: Synthese
des Derivats von 2-Aminopyridin Die Mischung
der Diastereoisomere (200 mg, 0,84 mmol) in Lösung in Soda (1 mol L–1,
25 mL) wird während
4,5 Stunden auf 70°C
erhitzt. Nach Abkühlen
wird die Lösung
mit einer Salzsäurelösung neutralisiert (pH
7,2). Das Produkt wird durch Filtrieren über C18-Umkehrphasen-Kartusche
(Eluierungsmittel Wasser und dann Methanol) entsalzt und dann durch
eine neuerliche Chromatographie auf Umkehrphasen-Kartusche gereinigt. Nach Abdampfen
des Lösungsmittels
wird das Produkt in Form eines gelben Feststoffs (119 mg; 0,68 mmol)
mit einer Ausbeute von 81 erhalten.
- c) Verbindung 7: Derivat von 1-Aminoisochinolein Die im
Abschnitt 1-e (Verbindung 4) beschriebene Mischung der Diastereoisomeren
(150 mg, 0,52 mmol) in Lösung
in Soda (1 mol L–1, 2 mL) wird auf 70°C während 5
Stunden erhitzt. Nach Abkühlen
wird die Lösung
mit einer Phosphorsäurelösung neutralisiert
(pH 7,2). Nach Extraktion mit Dichlormethan (3 mal 10 mL) und Abdampfen
des Lösungsmittels
wird der Rückstand
auf Siliciumoxidsäule
chromatographiert (Auftrag: Dichlormethan, Elution: Mischung Dichlormethan/Methanol).
Nach Abdampfen des Lösungsmittels werden
zwei Produkte isoliert: das erwartete Derivat in Form eines gelben
Feststoffs (8 mg, 0,04 mmol, 8%) sowie 1-Aminoisochinolein (21 mg,
0,15 mmol, 28%), das durch 1H und 13C-NMR-Spektroskopie charakterisiert wird.
3.
Erhalten der Verbindung 8: Die für die Herstellung von 7-Methylguanosin
erforderlichen Informationen sind in der Schrift Ermolinsky et al.
[9] verfügbar.
4.
Zellkulturen: CHO-Zellen (Zelllinie aus den Ovarien von chinesischen
Hamstern) wurden durch einen Vektor stabil transfektiert, der das
den wilden CFTR-Rezeptor codierende Gen (CHO-WT) oder ein mutiertes
Gen enthält,
das einen Rezeptor codiert, dessen Glycinrest in Position 551 durch
eine Asparaginsäure substituiert
ist (CHO-G551D). Die Zellen wurden bei 37°C in Gegenwart von 5% CO2 kultiviert und in MEM-Medium gehalten,
das 7% Rinderfötusserum,
0,5% Antibiotika (50 UI/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin) sowie 100 μM oder 20 μM Methotrexat
enthält.
Die
Versuche wurden auch an Calu-3-Zellen vorgenommen, einer Zelllinie
der menschlichen Lunge, die das wilde CFTR-Protein natürlich exprimiert, die wie oben
beschrieben kultiviert wurden, sowie an Zellen CF15, die Zellen
des menschlichen Epithels nasalen Ursprungs sind, die das mutierte
Gen F508-CFTR exprimieren (Deletion eines Phenylalaninrests in Position
508).
5. Biologische Aktivität der CFTR-Kanäle: Die
Aktivität
der Chloridionenkanäle
wurde mit Hilfe der Messung des Effluxes von radioaktivem Iodid 125I, das aus den transfektierten CHO-Zellen
auftritt, gemessen. Alle Tests wurden mit einem Robotsystem ausgeführt (Perkin
Elmer Life Sciences, Courtaboeuf, Frankreich). Die Zellen wurden
in Platten mit 24 Vertiefungen kultiviert, um parallele Tests durchzuführen und
eine vergleichende Studie vorzunehmen. Zu Beginn jedes Tests wurden
die Zellen mit Efflux-Puffer gewaschen, der (in mM) enthält: 137
NaCl, 5,36 KCl, 0,8 MgCl2, 5,5 Glucose und
10 HEPES, pH 7.4. Die Zellen wurden dann in Efflux-Puffer, der 1 um
KI und 1 μCi
Na125 I/ml (NEN, Boston, MA) enthält, während 30
min bei 37°C inkubiert,
um dem 125I zu gestatten, das Gleichgewicht
zu erreichen. Die Zellen wurden dann mit Efflux-Medium gewaschen,
um das extrazelluläre 125I zu entfernen. Der Verlust von intrazellulärem 125I wurde bestimmt, indem das Medium während 11
min jede Minute mit Efflux-Puffer entnommen wurde. Die ersten 4 Teilmengen
wurden verwendet, um in dem Efflux-Puffer allein eine stabile basale
Linie herzustellen. Die Restradioaktivität wurde mit Hilfe von NaOH
0,1 N extrahiert und mit Hilfe eines Gammazählers Packard Cobra II (Perkin
Elmer Life Sciences, Courtaboeuf, Frankreich), bestimmt. Die Ergebnisse
stellen den Mittelwert ± die
Standardabweichung (SD) von 4 unabhängigen Tests dar.
6. Zytotoxizitätstest:
Der MTT-Toxizitätstest
ist ein kolorimetrischer Test, der auf der Kapazität der mitochondrialen
Deshydrogenasen beruht, MTT (gelbes Tetrazoliumsalz) zu Formazan
(purpur) zu metabolisieren. Die Absorbanz, die zur Konzentration
an umgewandeltem Farbstoff proportional ist, kann nun durch Spektrophotometrie
gemessen werden. Die CHO-Zellen
werden auf Platten mit 96 Vertiefungen in Gegenwart des zu testenden
Mittels während
2 h zum Inkubieren gebracht. Es wurden 3 Kontrollen durchgeführt: 100% lebende
Zellen: Zellen ohne Mittel; 0% lebende Zellen: an der freien Luft
gelassene Zellen; weiß:
Medium ohne Zellen. Die Zellen werden mit RPMI-Medium ohne Phenolrot
gespült,
damit die Farbe des Mediums in den Messungen der Absorbanz nicht
interferiert. Dann werden sie während
4 h mit 100 μl
RPMI-Lösung inkubiert,
die mit MTT (0,5 mg/ml) ergänzt
ist. Das Medium wird nun entfernt, der Zusatz von 100 μl DMSO gestattet
die Solubilisierung des umgewandelten Farbstoffs (Formazan). Die
Absorbanz wird durch Spektrophotometrie bei 570 nm (purpur) und
bei 630 nm (Hintergrundrauschen) gemessen. Um sich von dem Hintergrundrauschen
zu befreien, wird folgende Rechnung vorgenommen: DOreal =
DO570nm – DO630nm.
Dann werden die Ergebnisse bezüglich
der Kontrollen (100% und 0% lebende Zellen) normalisiert und werden
in Form von Mittelwert +/– SEM
dargestellt.
7. Zusatz von pharmakologischen Mitteln: Die erfindungsgemäßen Moleküle (Verbindungen
1 bis 10) sowie bereits bekannte Aktivatoren der CFTR-Kanäle (Forskolin
und Genistein) wurden in den angegebenen Konzentraitonen zugesetzt.
-
II. ERGEBNISSE
-
1. Wirkung der getesteten Verbindungen
auf die Aktivität
des CFTR-Rezeptors:
-
Die
Wirkung der verschiedenen synthetisierten Verbindungen auf die Aktivität der CFTR-Chloridkanäle wurde
an CHO-Zellen, die
den wilden Rezeptor überexprimieren
(CHO-WT), getestet. Ein Aktivierungsbezugspegel 100% wurde bei einer Aktivierung
in Gegenwart von 1 μM
Forskolin (Fsk) gewählt.
Die getesteten Verbindungen wurden in einer Konzentration von 1 μM zugesetzt.
Im Fall einer signifikanten Erhöhung
wurde die Verbindung als ein Aktivator repertoriert. Im Fall einer
Aktivierung, die signifikant kleiner als 100 in Gegenwart der Verbindung
ist, wurde diese als ein Hemmer repertoriert.
-
Erhaltene
Diagrammbeispiele sind in 1 dargestellt.
-
Zur
Verfeinerung der Studien wurden die Werte von IC50 bei den Hemmern
und von EC50 bei den Aktivatoren bestimmt. Der Aktivierungsprozentsatz
wurde in Gegenwart von steigenden Konzentrationen der Testverbindung
verfolgt. Im Fall der Hemmer wurde die Aktivierung 100 in Gegenwart
von Forskolin 5 μM
erhalten. Im Fall der Aktivatoren wurde der Aktivierungsprozentsatz
in Gegenwart von Forskolin 1 μM
verfolgt.
-
Beispiele
von Wirkung/Dosis-Kurven, die die Bestimmung der Werte EC50 und
IC50 gestatten, sind in 2 dargestellt.
-
Eine
Studie wurde für
die 11 synthetisierten Verbindungen an 4 verschiedenen Zelllinien
durchgeführt (CHO-wt,
CHO-G551D, Calu3,
CF15). Die Hemmer Glibenclamid und Betain wurden ebenfalls in dieser
Studie aufgenommen. Es ist zu bemerken, dass bei den Wirkungen auf
die Zellen CF15 der Iodidionenfluss nach 24 h Inkubation bei 27°C gemessen
wurde. Alle Messungen wurde in Gegenwart von Fsk 5 μm (CHO-wt
und Calu-3) oder 10 μm
Fsk + 30 μm
Genistein (G551D-CFTR und CF15) durchgeführt. Die getesteten Derivate
wurden direkt in Lösung
zugesetzt, während
die Vergleichssubstanz Glibenclamid 30 Minuten vor der Messung des
Iodidionenflus ses inkubiert wurde. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden
Tabelle I angeführt:
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die beobachteten Wirkungen sowohl in qualitativer
als auch in quantitativer Hinsicht beibehalten werden:
- – zwischen
Zellen, die den wilden Rezeptor exprimieren (Calu3), und Zellen,
die dasselbe Protein in einer tierischen Zelllinie überexprimieren
(CHO-WT),
- – bei
der Verbindung 9 der ersten Familie zwischen den getrennten Haupt-
und Nebenaddukten und der Mischung der 2 Diastereoisomeren.
-
Ferner
hat man festgestellt, dass die Mehrzahl der Moleküle eine
das CFTR-Protein hemmende Aktivität besitzen. Es ist zu bemerken,
dass die gemessene hemmende Wirkung im Allgemeinen besser als diejenige
der bisher in der Literatur beschriebenen Hemmer ist. Ferner haben
die Aktivatoren eine signifikante Wirkung und könnten wegen ihrer induzierten
bronchienerweiternden Wirkungen eingesetzt werden.
-
Schließlich haben
parallel durchgeführte
Tests an anderen Ionenkanälen
ergeben, dass diese Verbindungen keine oder wenig Wirkung gegenüber diesen
Kanälen
aufweisen (nicht dargestellte Ergebnisse). Ihre Wirkung auf die
CFTR-Kanäle
ist also spezifisch und gescreent, was therapeutische Potentiale
bietet.
-
2. Wirkung der getesteten Verbindungen
auf die Zellviabilität:
-
Die
Toxizität
der Verbindungen, die die biologische Aktivität von Interesse aufweisen,
wurde getestet. Zu diesem Zweck wurden CHO-Zellen mit diesen Verbindungen
während
einer Dauer von 2 bis 24 Stunden und in einer Konzentration von
10 bis 100 μM
inkubiert. Ihre Toxizität
wurde durch Messung der Zellviabilität, verglichen mit derjenigen
von Zellen ohne Mittel (100% lebende Zellen) und derjenigen von
an der freien Luft gelassenen Zellen (0% lebende Zellen), ermittelt.
-
Die
bei den erfindungsgemäßen Verbindungen
1 bis 4, 6 bis 7 und 9 bis 10 erhaltenen Ergebnisse (nicht dargestellt)
haben ergeben, dass sie unabhängig
von der verwendeten Inkubationsdauer und -konzentration keine merkliche
Zytotoxizi tät
aufweisen. Ihre therapeutische Anwendung kann deshalb durchaus in
Betracht kommen.
-
3. Wirkung der getesteten
Verbindungen auf mutierte Rezeptoren oder in Gegenwart von verschiedenen
pharmakologischen
-
Verbindungen:
-
In
einer detaillierteren Studie haben sich die Anmelder mit der Wirkung
eines Hemmers (Verbindung 1) oder eines Aktivators (Verbindung 9)
gemäß der Erfindung
auf den CFTR-Rezeptor beschäftigt:
- – auf
einen wilden Rezeptor (CHO-WT) oder auf einen mutierten Rezeptor
(CHO-G551D), der in manchen Mukoviszidoseformen angetroffen wird;
- – in
Gegenwart von bereits bekannten Aktivatoren, wie Forskolin, das
die Verfügbarkeit
an AMPc erhöht, das
bei der Aktivierung der Regulator-Domäne R beteiligt ist, oder Genistein,
das direkt auf die Domänen der
Bindung der Nucleotide wirkt und die Öffnung der Kanäle verlängert.
-
Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle II angeführt:
Aktivator
Zugesetzte Verbindung(en) | CHO-WT | CHO-G551D |
1 μM Fsk (Aktivator) | Aktivierung | Keine
Wirkung |
1 μM Fsk + 1 μM Verbindung
1 (Hemmer) | Hemmung | Keine
Wirkung |
5 μM Fsk + 1 μM Verbindung
1 (Hemmer ) | Hemmung | Keine
Wirkung |
1 μM Fsk + 1 μM Verbindung
9 (Aktivator) | Aktivierung
(Potentialisierung) | Keine
Wirkung |
10 μM fsk + 30 μM Genistein | Aktivierung | Aktivierung |
10 μM fsk + 30 μM Genistein
+ 1 μM Verbindung
1 (Hemmer) | Hemmung | Hemmung |
10 μM fsk + 30 μM Genistein
+ 1 μM Verbindung
9 (Aktivator) | Aktivierung | Aktivierung |
Tabelle
II: Wirkungen der Verbindungen 1 und der Verbindung 9 auf die Aktivierung
von wildem CFTR (CHO-WT) oder mutiertem CFTR (CHO-G551D) in Anwesenheit
von verschiedenen Aktivatoren.
-
Diese
Untersuchungen ergeben, dass:
- – die Verbindung
1 die Wirkung der Aktivatoren Forskolin und Genistein wirksam antagonisiert,
und zwar an den wilden Rezeptoren wie an den mutierten Rezeptoren;
- – die
Verbindung 9 eine aktivierende Wirkung auf den wilden Rezeptor hat,
jedoch nicht in der Lage ist, den mutierten Rezeptor G551D zu aktivieren.
Dagegen ist sie in der Lage, eine andere mutierte Form des Rezeptors
zu aktivieren, ΔF508
(nicht gezeigte Ergebnisse).