DE60132893T2

DE60132893T2 - Antigene polypeptide

Info

Publication number: DE60132893T2
Application number: DE60132893T
Authority: DE
Inventors: Simon Foster; Philip Mcdowell; Kirsty Dept. Molecu BRUMMELL; Simon Dept. Molecu CLARKE
Original assignee: University of Sheffield; Biosynexus Inc
Current assignee: University of Sheffield; Biosynexus Inc
Priority date: 2000-06-20
Filing date: 2001-06-20
Publication date: 2009-03-12
Anticipated expiration: 2021-06-21
Also published as: CN1437653A; AU7424801A; EP2287316A1; AU2010200510A1; AU2007200937B8; AU2001274248B2; CA2805216A1; US20060140979A1; JP2012044991A; CA2412504A1; US20100166792A1; AU2007200937A1; EP2269634A3; EP1292681B1; HK1051873A1; AU2007200937B2; EP1710311A3; NO20025838D0; AU2007200937A8; US7585658B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von antigenischen Polypeptiden, die von pathogenen Mikroben exprimiert werden; Impfstoffe, die diese Polypeptide umfassen; rekombinante Verfahren zur Herstellung dieser Polypeptide; und therapeutische Antikörper, die sich gegen diese Polypeptide richten.
Mikrobielle Organismen verursachen mehrere tödliche oder schwächende Erkrankungen, die mehrere Millionen Menschen weltweit betreffen. Die gegenwärtigen Verfahren zur Kontrolle von mikrobiellen Organismen umfassen die Verwendung von antimikrobiellen Mitteln (Antibiotika) und Desinfektionsmitteln. Es hat sich gezeigt, dass diese Mittel problematisch sind, da die Verwendung dieser Mittel einen signifikanten Selektionsdruck mit sich bringt, der zur Entstehung von resistenten Mikroben führt, welche sich den Wirkungen des antimikrobiellen Mittels (der antimikrobiellen Mittel) entziehen können. Beispielsweise ist kürzlich herausgefunden worden, dass mikrobielle Organismen resistent gegenüber Triclosan geworden sind, ein Mittel, das zahlreichen Desinfektionsmitteln, die in häuslicher und industrieller Umgebung verwendet werden, zugesetzt wird.
Ein wohl noch größeres Problem ist die Bildung von Antibiotika-resistenten Stämmen bei mehreren signifikant pathogenen Mikroben.
Beispielsweise (jedoch nicht einschränkend zu verstehen) ist geschätzt worden, dass bis zu 50 Millionen Menschen weltweit mit Wirkstoff-resistenter Tuberkulose (TB) infiziert sind (Zahlen der Weltgesundheitsbehörde, 1998). In der Vergangenheit beruhte die Verwendung von Antibiotika zur Behandlung von TB auf der Verabreichung einzelner Wirkstoffe (z. B. Ethionamid), die relativ häufig zu einer Frequenz Resistenz führten. Aus diesem Grund werden nunmehr Kombinationen von Wirkstoffen verwendet, um Tuberkulose zu behandeln. Die Todesrate liegt jedoch in Fällen, die von Stämmen verursacht werden, welche resistent gegen mindestens einen der zur Behandlung der Tuberkulose verwendeten Wirkstoff sind, immer noch bei etwa 50%, selbst wenn eine Behandlung erfolgt. Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der TB, ist ein langsam wachsendes Bakterium und man benötigt eine längere Zeit, um es abzutöten. Aus diesem Grund muss eine Person mit TB für mindestens 6 Monate täglich eine Wirkstoffkombination einnehmen, damit diese Wirkstoffkombination wirksam ist. Demgemäß müssen Patienten häufig zwei oder mehrere Tabletten täglich einnehmen, und dies erfordert eine reglementierte Dosierung über einen verhältnismäßig langen Behandlungszeitraum. Zahlreiche Patienten nehmen die Medikationen nur mit Unterbrechungen ein und schließen somit den vollständigen Behandlungsverlauf nicht ab, um die M. tuberkulosis-Infektion vollständig zu beseitigen. Darüber hinaus ist TB stark mit einer HIV-Infektion assoziiert, und folglich ist die Ausbildung von TB stark mit einer Immunsuppression korreliert.
Eine Impfung gegen TB ist seit mehreren Jahren erhältlich. Die Bacillus-Calmette-Gutirin (BCG)-Impfung wird weltweit seit langer Zeit verwendet, da es ein sicheres und billiges Mittel ist, um eine große Zahl von Menschen zu impfen, die sich möglicherweise mit TB infizieren. BCG wird von lebendigen, attenuierten Stämmen von Mycobacterium bovis erhalten. Die Auswirkung der Impfung auf die infektiösen Formen von TB ist jedoch minimal, und BCG hat folglich nur in geringem Maße zur Gesamtkontrolle der Erkrankung beigetragen.
Ein weiteres Beispiel für einen pathogenen Organismus, der eine Resistenz gegen Antibiotika entwickelt hat, ist Staphylococcus aureus. S. aureus ist ein Bakterium, dessen normales Habitat die epitheliale Auskleidung der Nase ist, wird in etwa 20–40% der normal gesunden Menschen gefunden, und es wird darüber hinaus regelmäßig auf der Haut des Menschen gefunden, wobei dies normalerweise keinen Schaden verursacht. Unter bestimmten Bedingungen jedoch, insbesondere wenn die Haut beschädigt wird, kann dieser Keim eine Infektion verursachen. Dies ist ein speziell in Krankenhäusern vorkommendes Problem, wo Patienten sich chirurgischen Eingriffen unterziehen und/oder immunsuppressive Mittel einnehmen. Diese Patienten sind aufgrund der Behandlung, die sie erhalten haben, stärker empfänglich für eine Infektion mit S. aureus. Resistente Stämme von S. aureus sind in den vergangenen Jahren aufgetreten. Methicillin-resistente Stämme sind vorherrschend, und zahlreiche dieser resistenten Stämme sind darüber hinaus gegen weiteren Antibiotika resistent. Gegenwärtig gibt es kein wirksames Impfverfahren für S. aureus. In den USA verursachen Infektionen mit S. aureus 13% der 2 Millionen Krankenhausinfektionen jährlich. Dies stellt eine Anzahl von 260000 Menschen mit einer Infektion von S. aureus dar, von denen 60–80000 sterben.
S. aureus ist somit ein wichtiges Pathogen für den Menschen, das in der Lage ist, eine große Vielzahl von lebensbedrohlichen Erkrankungen zu verursachen, einschließlich Sepsis, Endokarditis, Arthritis und toxischen Schock. Diese Fähigkeit wird durch die Vielseitigkeit des Organismus und sein Arsenal von Bestandteilen, die an der Virulenz beteiligt sind, bestimmt. Die Pathogenizität ist multifaktoriell, und es hat sich gezeigt, dass kein einzelner Bestandteil für eine bestimmte Infektion ist verantwortlich, siehe Projan, S. J. & Novick, R. P. (1997) in "The Staphylococcci in Human Disease" (Crossley, K. B. & Archer, G. L., Hrsg.), Seiten 55–81.
Der EMBL-Datenbankeintrag SAATL1, Zugriffsnummer L41499, der am 21. April 1995 veröffentlicht wurde, offenbart eine Sequenz von S. aureus, die für die Proteine ORF2, ORF3 und Autolysin kodieren. Die Funktion dieser Proteine wird nicht erwähnt.
Zu Beginn einer Infektion und in ihrem weiteren Verlauf verändern sich die Bedürfnisse und die Umgebung des Organismus, und dies spiegelt sich durch entsprechende Veränderungen der Virulenzdeterminanten wieder, die von S. aureus produziert werden. Zu Beginn der Infektion ist es für das Pathogen wichtig, am Wirtsgewebe anzuhaften, und somit wird ein großes Repertoire von Zelloberflächen-assoziierten Anheftungsproteinen hergestellt. Diese umfassen Kollagen-, Fibrinogen- und Fibronektinbindende Proteine. Das Pathogen hat darüber hinaus die Fähigkeit, die Abwehrmechanismen des Wirts durch Produktion von Faktoren zu umgehen, welche die Phagozytose verringern oder die Fähigkeit der Zellen stören, durch zirkulierende Antikörper erkannt zu werden.
Oftmals entwickelt sich ein Infektionsherd als Abszess, und die Anzahl der Organismen nimmt zu. S. aureus hat die Fähigkeit, seine eigene Zelldichte durch die Erzeugung eines Quorum-Sensing-Peptids zu verfolgen. Die Ansammlung des Peptids, die mit physiologischen Veränderungen assoziiert ist, welche zu Beginn der Hungerphase der Zellen auftreten, verursacht ein Umschalten in der Produktion der Virulenz-Determinanten von Adhäsinen zu Bestandteilen, die an der Invasion und an der Gewebepenetration beteiligt sind. Diese umfassen eine große Vielzahl von Hämolysinen, Proteasen und anderen degradativen Enzymen.
Während des Prozesses einer beliebigen Infektion werden die Virulenz-Determinanten, die von S. aureus hergestellt werden, als Antwort auf Umweltstimuli oder auf physiologische Stimuli produziert. Diese Stimuli werden von der Nische innerhalb des Körpers abhängen, und sie werden sich im weiteren Verlauf der Infektion ändern. Es ist nur wenig über die Bedingungen in vivo bekannt, und es ist wahrscheinlich, dass einige Bestandteile lediglich in dieser Umgebung erzeugt werden. Diese sind so mit potentielle Impfstoff-Bestandteile, die mittels früherer Verfahren nicht entdeckt werden konnten.
Eine der wichtigsten Entwicklungen in der jüngeren medizinischen Geschichte ist die Entwicklung von Impfstoffen, die einen prophylaktischen Schutz vor einer großen Vielzahl von pathogenen Organismen bereitstellen. Zahlreiche Impfstoffe werden durch inaktivierte oder attenuierte Pathogene erzeugt, die in ein Individuum injiziert werden. Das immunisierte Individuum reagiert durch Erzeugung einer humoralen Antwort (Antikörper) sowie auch einer zellulären Antwort (zytolytische T-Zellen, CTLs). Beispielsweise werden Hepatitis-Impfstoffe durch Hitzeinaktivierung des Virus und durch Behandlung desselben mit einem quervernetzenden Mittel, wie beispielsweise Formaldehyd, hergestellt. Ein Beispiel für ein attenuiertes Pathogen, das als Impfstoff nützlich ist, sind Polio-Impfstoffe, die durch Attenuierung eines lebenden Pathogens hergestellt werden.
Die Verwendung von attenuierten Organismen in Impfstoffen ist jedoch bei bestimmten Erkrankungen problematisch, da keine Kenntnisse bezüglich der Pathologie des Zustands und der Art der Attenuierung vorliegen. Für bestimmte virale Erreger ist dies ein besonderes Problem, da Viren, insbesondere Retroviren, einen fehleranfälligen Replikationszyklus aufweisen, der lebensfähige Mutationen in den Genen hervorbringt, die das Virus umfassen. Dies kann zu Veränderungen der antigenischen Determinanten führen, die zuvor als Impfstoffe verwendet wurden. Eine Alternative zur Verwendung von inaktivierten oder attenuierten Pathogenen ist die Identifizierung von pathogenen Epitopen, für die das Immunsystem besonders sensitiv ist. In dieser Hinsicht sind zahlreiche pathogene Toxine, die von pathogenen Organismen während der Infektion produziert werden, bei der Entwicklung von Impfstoffen nützlich, die das Individuum vor einem bestimmten pathogenen Organismus schützen.
Die Entwicklung von sogenannten Subunit-Impfstoffen (Impfstoffen, bei denen das Immunogen ein Fragment oder eine Untereinheit eines Proteins oder eines Komplexes ist, das/der von einem bestimmten pathogenen Organismus produziert wird) stand im Zentrum beträchtlicher medizinischer Forschung. Die Notwendigkeit zur Identifizierung von Kandidatenmolekülen, die bei der Entwicklung von Subunit-Impfstoffen nützlich sind, ist offensichtlich, nicht zuletzt weil konventionelle chemotherapeutische Ansätze für die Kontrolle von pathogenen Organismen kürzlich durch die Entwicklung von Antibiotikaresistenzen ausgeschaltet wurden. Mehrere Verfahren sind entwickelt worden, um potentielle antigenische Polypeptide zu identifizieren, die als Impfstoff verwendet werden können. Ein solches Verfahren wird vorliegend offenbart.
Es ist seit mehreren Jahren bekannt, dass Tumorzellen mehrere für Tumorzellen spezifische Antigene produzieren, von denen einige auf der Tumoroberfläche vorhanden sind. Das Immunsystem erkennt diese Antigene als fremd, was zur Produktion von Antikörpern gegen Selbst-Antigene führt, sogenannten Autoantikörpern oder autologem Antiserum.
Eine solche Methode ist die serologische Identifizierung von Antigenen durch rekombinante Expressionsklonierung, die als SEREX abgekürzt wird.
Üblicherweise umfasst dieses Verfahren die Extraktion von RNA aus Tumorgewebe, und eine anschließende selektive Anreicherung von mRNA aus der isolierten Gesamt-RNA. Die mRNA wird revers in cDNA transkribiert, wobei eine virale reverse Transkriptase verwendet wird. Die so synthetisierte cDNA wird in einen Expressionsvektor subkloniert und in einen geeigneten Bakterienstamm transformiert. Die transformierten Bakterien werden auf einem geeigneten Nährstoffagar ausplattiert, und unter geeig neten Wachstumsbedingungen wird die subklonierte cDNA von dem Expressionsvektor in der bakteriellen Zelle exprimiert. Die Zellen werden auf natürliche Weise lysiert, indem auf Phagen basierende Expressionsvektoren, beispielsweise λ-Phage, oder auf Phagemiden basierende Vektoren verwendet werden, die aufgrund ihres lytischen. Zyklus die Zelllyse verursachen. Die freigesetzten Polypeptide werden auf einen geeigneten Membranträger überführt (d. h. Nitrocellulose, Nylon), und mit autologem Antiserum des Patienten in Kontakt gebracht, aus dem das Tumorgewebe ursprünglich isoliert wurde. Das Immunscreening-Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Genen, die in einem ausgewählten Tumorgewebe von einem Patienten überexprimiert oder in ungeeigneter Weise exprimiert werden.
Wir haben dieses Verfahren genutzt, um antigenische Polypeptide zu identifizieren, die von pathogenen Organismen während einer Infektion exprimiert werden. Autologes Antiserum, das während der Infektion produziert wird, wird dazu verwendet, eine ausgehend von genomischer DNA erstellte Expressionsbibliothek mittels Screening zu untersuchen, um Antigene zu identifizieren und zu klonieren.
Die Anmeldung offenbart die Identifizierung von antigenischen Polypeptiden, die während einer Infektion durch eine pathogene Mikrobe exprimiert werden.
Die Anmeldung offenbart ein Verfahren zur Identifizierung von antigenischen Polypeptiden, bei dem man:

(i) eine Nukleinsäurebibliothek bereitstellt, die für Gene oder Teile von Gensequenzen eines pathogenen Organismus kodiert;
(ii) die Bibliothek in eine Wirtszelle transformiert/transfiziert;
(iii) Bedingungen bereitstellt, die für die Expression der transformierten/transfizierten Gene oder der Teile von Gensequenzen förderlich sind;
(iv) die von den Genen/Teilen von Gensequenzen exprimierten Polypeptide mit autologem Antiserum in Kontakt bringt, das von einem Tier erhalten wurden, welches mit dem pathogenen Organismus infiziert ist oder mit diesem infiziert wurde; und
(v) die Nukleinsäure, die für das Polypeptid oder den Teil des Polypeptids kodiert, welches an das autologe Antiserum bindet, reinigt.

In einem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst die Bibliothek genomische DNA eines pathogenen Organismus.
Idealerweise ist der pathogene Organismus bakteriell.
Noch stärker bevorzugt ist es, dass der bakterielle Organismus ausgewählt ist aus den folgenden Organismen:
Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis; Enterococcus faecalis; Mycobacterium tuberculosis; Streptococcus Gruppe B; Streptococcus pneumoniae; Helicobacter pylori; Neisseria gonorrhoeae; Streptococcus Gruppe A; Borrelia burgdorferi; Coccidiodes immitis; Histoplasma sapsulatum; Neisseria meningitidis Typ B; Shigella flexneri; Escherichia coli; Haemophilus influenzae.
Weiterhin ist es bevorzugt, dass der pathogene Organismus aus der Gattung Staphylococcus spp. stammt. Idealerweise ist der Organismus Staphylococcus aureus oder Staphylococcus epidermidis.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Offenbarung ist die Nukleinsäurebibliothek eine Lambda-Bibliothek, idealerweise eine Lambda-Expressionsbibliothek.
Gemäß eines zweiten Aspektes der Erfindung wird die Verwendung eines Polypeptids bereitgestellt, das von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches eine DNA-Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus:

(i) der in SEQ ID NO: 2 dargestellten DNA-Sequenz;
(ii) DNA-Sequenzen, die mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz, welche in (i) oben angegeben ist, hybridisieren und die für ein Polypeptid kodieren, das von einem pathogenen Organismus exprimiert wird; und
(iii) DNA-Sequenzen, die aufgrund des genetischen Codes in Bezug auf die in (i) und (ii) definierten DNA-Sequenzen degeneriert sind,

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül genomische DNA.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die in den SEQ ID NOs: 1–13 dargestellten Sequenzen hybridisiert.
Stringente Hybridisierung/Waschbedingungen sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise Nukleinsäure-Hybride, die nach Waschen in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 60°C stabil sind. Es ist im Stand der Technik hinreichend bekannt, dass optimale Hybridisierungsbedingungen errechnet werden können, sofern die Sequenz der Nukleinsäure bekannt ist. Beispielsweise können Hybridisierungsbedingungen durch den GC-Gehalt der zu hybridisierenden Nukleinsäure bestimmt werden. Siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning; A Laboratory Approach. Eine übliche Formel zur Errechnung der Stringenzbedingungen, die zur Erreichung einer Hybridisierung zwischen Nukleinsäuremolekülen einer bestimmten Homologie erforderlich sind, lautet: Tm = 81,5°C + 16,6 Log [Na+] + 0,41 [%G + C] – 0,63 (% Formamid).
Gemäß eines dritten Aspektes der Offenbarung wird mindestens ein Polypeptid bereitgestellt, das durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifiziert wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist dieses Polypeptid mit einer infektiösen Pathogenität eines Organismus nach einem beliebigen zuvor erwähnten Aspekt oder nach einer beliebigen zuvor erwähnten Ausführungsform der Erfindung assoziiert.
Ferner bevorzugt ist es, dass das Polypeptid mindestens eine oder ein Teil von SEQ ID NO: 15 ist.
Gemäß eines vierten Aspektes der Offenbarung wird ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das dadurch charakterisiert ist, dass das Nukleinsäuremolekül Teil eines Vektors ist, der angepasst ist, um die rekombinante Expression des Polypeptids, welches von dem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, zu ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Offenbarung ist der Vektor ein Expressionsvektor, der für die prokaryontische Gen expression angepasst ist. Alternativ dazu ist der Expressionsvektor für die eukaryontische Genexpression angepasst.
Üblicherweise umfasst die Anpassung beispielsweise die Bereitstellung von Transkriptionskontrollsequenzen (Promotorsequenzen), welche die Zell-spezifische Expression vermitteln, ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Diese Promotorsequenzen können zellspezifisch, induzierbar oder konstitutiv sein.
"Promotor" ist ein im Stand der Technik anerkannter Begriff und umfasst im Wege der Klarstellung die nachfolgenden Merkmale, die lediglich beispielhaft und nicht als Beschränkung zu verstehen sind. Enhancer-Elemente sind cis-agierende Nukleinsäuresequenzen, die oftmals 5' von der Transkriptions-Initiationsstelle des Gens gefunden werden (Enhancer können auch 3' von der Gensequenz oder sogar innerhalb von Intron-Sequenzen gefunden werden, und sind daher positionsunabhängig). Enhancer funktionieren, indem sie die Transkriptionsrate des Gens, mit dem der Enhancer verbunden ist, erhöhen. Die Enhanceraktivität reagiert auf trans-agierende Transkriptionsfaktoren (Polypeptide), von denen gezeigt wurde, dass sie spezifisch an Enhancerelemente binden. Die Bindung/Aktivität von Transkriptionsfaktoren (siehe "Eukaryontic Transcription Factors David S. Latchman, Academic Press Ltd., San Diego) reagiert auf mehrere Umweltsignale, die beispielsweise intermediäre Metaboliten (z. B. Glucose, Lipide), Umwelteffektoren (z. B. Licht, Hitze) umfassen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind.
Promotorelemente umfassen ferner die sogenannte TATA-Box und RNA-Polymerase-Initiations-Selektions (RIS)-Sequenzen, die so funktionieren, dass sie eine Stelle für die Transkriptionsinitiation auswählen. Diese Sequenzen binden darüber hinaus Polypeptide, die unter anderem so funktionieren, dass die Transkriptions-Initiations-Selektion durch die RNA-Polymerase ermöglichen.
Anpassungen umfassen ferner die Bereitstellung von selektierbaren Markern und autonomen Replikationssequenzen, die beide den Erhalt des Vektors entweder in der eukaryontischen Zelle oder im prokaryontischen Wirt ermöglichen. Vektoren die autonom beibehalten werden, werden auch als episomale Vektoren bezeichnet.
Anpassungen, welche die Expression von Vektor-kodierten Genen ermöglichen, umfassen die Bereitstellung von Transkriptionsterminations-/Polyadenylierungssequenzen. Dies umfasst ferner die Bereitstellung von internen Ribosomeneintrittsstellen (IRES), die dazu dienen, die Expression von Vektor-kodierten Genen zu maximieren, welche in bicistronischen oder multicistronischen Expressionskassetten angeordnet sind.
Diese Anpassungen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Es gibt eine signifikante Menge veröffentlichter Literatur in Bezug auf die Konstruktion von Expressionsvektoren und rekombinanten DNA-Verfahren im Allgemeinen. Siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY und die darin zitierte Literatur; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques; A Practical Approach, Vol III, IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
Gemäß eines weiteren Aspekts der Offenbarung wird ein Verfahren für die Herstellung der Polypeptide nach einem beliebigen vorhergehenden Aspekt oder nach einer Ausführungsform der Erfindung bereitgestellt, bei dem man:

(i) eine Zelle bereitstellt, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert/transfiziert ist;
(ii) die Zelle unter Bedingungen anzüchtet, die für die Herstellung der Polypeptide förderlich sind; und
(iii) das Polypeptid aus der Zelle oder ihrer Wachstumsumgebung aufreinigt.

In einem bevorzugten Verfahren der Offenbarung kodiert dieser Vektor für ein Sekretionssignal, das die Aufreinigung des Polypeptids ermöglicht, und somit ist das rekombinante Polypeptid mit einem solchen Sekretionssignal ausgestattet.
Gemäß eines fünften Aspektes der Offenbarung wird eine Zelle oder eine Zelllinie bereitgestellt, die mit dem erfindungsgemäßen Vektor transformiert oder transfiziert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Offenbarung ist die Zelle eine prokaryontische Zelle. Alternativ dazu ist die Zelle eine eukaryontische Zelle, die ausgewählt ist aus: Pilz-, Insekten-, Amphibien-, Säugetier-, Pflanzen-Zelle.
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird ein Impfstoff bereitgestellt, der mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid umfasst.
Idealerweise umfasst dieser Impfstoff ferner einen Träger und/oder ein Adjuvans.
Die Begriffe Adjuvans und Träger werden in folgender Weise ausgelegt. Einige Polypeptide oder Peptidantigene enthalten B-Zell-Epitope, jedoch keine T-Zell-Epitope. Immunantworten können durch Einbeziehen eines T-Zell-Epitops in das Polypeptid/Peptid oder durch Konjugation des Polypeptids/Peptids an ein immunogenes Trägerprotein, wie beispielsweise Keyhole-Limpet-Hämocyanin oder Tetanustoxoid, welche mehrere T-Zell-Epitope umfassen, in hohem Maße verstärkt werden. Das Konjugat wird durch Antigen-präsentierende Zellen aufgenommen, prozessiert und durch humane Leukozyten-Antigene (HLA)-Klasse II-Moleküle präsentiert. Dies ermöglicht es, dass T-Zellen, die spezifisch für Epitope sind, welche vom Träger abgeleitet sind, der 8-Zelle, die spezifisch für das ursprüngliche antigenische Polypeptid/Peptid ist, helfen. Dies kann zur Verstärkung der Antikörper-Produktion, der Antikörper-Sekretion und des Antikörper-Isotopen-Switching führen.
Ein Adjuvans ist eine Substanz oder eine Vorgehensweise, die spezifische Immunantworten gegen Antigene verstärkt, indem sie die Aktivität von Immunzellen moduliert. Beispiele für Adjuvantien umfassen (lediglich beispielhaft) agonistische Antikörper gegen co-stimulatorische Moleküle, Freudsches Adjuvans, Muramyl-Dipeptide, Liposomen. Ein Adjuvans ist somit ein Immunmodulator. Ein Träger ist ein immunogenes Molekül, das – wenn es an ein zweites Molekül gebunden hat – die Immunantworten gegen dieses Molekül verstärkt.
In einem noch weiteren Aspekt der Offenbarung wird ein Verfahren zur Immunisierung eines Tieres gegen eine pathogene Mikrobe bereitgestellt, bei dem man mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder einen Teil davon oder den erfindungsgemäßen Impfstoff an das Tier verabreicht.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids bei der Herstellung eines Medikamentes zur Immunisierung eines Tiers gegen eine pathogene Mikrobe bereitgestellt, bei der die pathogene Mikrobe die bakterielle Gattung Staphylococcus spp. ist.
In einer bevorzugten Verwendung der Erfindung ist das Tier ein Mensch.
Vorzugsweise kann der Impfstoff oder das antigenische Polypeptid durch direkte Injektion zugeführt werden, entweder intravenös, intramuskulär, subkutan. Des Weiteren kann der Impfstoff oder das antigenische Polypeptid oral eingenommen werden.
Vorzugsweise ist der Impfstoffe gegen die bakterielle Spezies Staphylococcus aureus.
Der Impfstoff kann ferner gegen die bakterielle Spezies Staphylococcus epidermidis sein. Es wird ferner ersichtlich sein, dass die Impfstoffe und antigenischen Polypeptide wirksam bei der Verhinderung oder Linderung von Zuständen in Tieren sind, bei denen es sich nicht um Menschen handelt, beispielsweise (jedoch nicht beschränkt auf) Haustiere, Vieh und Pferde.
Gemäß eines weiteren Aspekts der Offenbarung wird ein Antikörper bereitgestellt oder mindestens ein bindender Teil davon, der mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid bindet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Antikörper ein polyklonaler oder ein monoklonaler Antikörper, wobei der Antikörper spezifisch gegen das Polypeptid ist.
Alternativ dazu ist der Antikörper ein chimärer Antikörper, der durch rekombinante Verfahren hergestellt wird, so dass er die variable Region des Antikörpers mit einer nicht-variablen oder konstanten Region eines humanen Antikörpers aufweist.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform der Offenbarung ist der Antikörper durch rekombinante Verfahren humanisiert, so dass er die komplementaritätsbestimmenden Regionen des Antikörpers sowohl mit den konstanten (C) Regionen als auch mit den Gerüstregionen der variablen (V) Regionen eines humanen Antikörpers kombiniert.
Vorzugsweise wird der Antikörper mit einem Marker bereitgestellt, einschließlich eines herkömmlichen Markers oder eines Anhangs (tag), beispielsweise ein(e) radioaktive(r) Markierung und/oder ein(e) fluoreszente(r) Markierung und/oder eine Epitop-Markierung oder ein Epitop-Anhang.
Vorzugsweise wird der humanisierte monoklonale Antikörper gegen das Polypeptid als Fusionspolypeptid in einem Expressionsvektor produziert, der in geeigneter Weise für die Transfektion oder Transformation von prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen angepasst ist.
Antikörper, die auch als Immunglobuline bekannt sind, sind Proteinmoleküle, die eine Spezifität für fremde Moleküle (Antigene) aufweisen. Immunglobuline (Ig) sind eine Klasse von strukturell verwandten Proteinen, die aus zwei Paaren von Polypeptidketten bestehen, einem Paar leichten (L) Ketten (mit geringem Molekulargewicht) (κ oder λ) und einem Paar schweren (H) Ketten (γ, α, μ, δ oder ε), wobei alle vier durch Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Sowohl H- als auch L-Ketten umfassen Regionen, die zur Bindung des Antigens beitragen und die sich von einem Ig-Molekül zum anderen stark unterscheiden. Darüber hinaus umfassen H- und L-Ketten Regionen, die nicht-variabel oder konstant sind.
Die H-Ketten der Ig-Moleküle stammen aus verschiedenen Klassen, α, μ, σ, α und γ (von denen es mehrere Unterklassen gibt). Ein zusammengesetztes Ig-Molekül, das aus einer oder aus mehreren Einheiten von zwei identischen H- und L-Ketten besteht, erhält seinen Namen von der H-Kette, die es enthält. Es gibt somit fünf Ig-Isotypen: IgA, IgM, IgD, IgE und IgG (mit vier Subklassen, die auf den Unterschieden in den H-Ketten basieren, d. h. IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4). Weitere Ausführungen zur Struktur von Antikörpern und ihren verschiedenen Funktionen können in Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, gefunden werden.
Chimäre Antikörper sind rekombinante Antikörper, in denen die gesamten V-Regionen eines Maus- oder Ratten-Antikörpers mit C-Regionen eines humanen Antikörpers kombiniert sind. Humanisierte Antikörper sind rekombinante hybride Antikörper, die die komplementaritätsbestimmenden Regionen aus der V-Region eines Nagetier-Antikörpers mit den Gerüstregionen der V-Regionen aus dem humanen Antkörper kombinieren. Die C-Regionen des humanen Antikörpers werden ebenfalls verwendet. Die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) sind die Regionen innerhalb der N-terminalen Domäne der schweren und leichten Kette des Antikörpers, auf die der Hauptteil der Variation der V-Region beschränkt ist. Diese Regionen bilden Schleifen an der Oberfläche des Antikörpermoleküls. Diese Schleifen stellen die Bindungsoberfläche zwischen dem Antikörper und dem Antigen her.
Antikörper aus nicht-humanen Tieren führen zu einer Immunantwort gegen den fremden Antikörper und zu seiner Entfernung aus dem Blutkreislauf. Sowohl Chimäre als auch humanisierte Antikörper weisen eine verringerte Antigenität auf, wenn sie in ein menschliches Subjekt injiziert werden, da die Menge an Nagetier-(d. h. Fremd-)Antikörper innerhalb des rekombinanten Hybridantikörpers verringert ist, während die humanen Antikörperregionen keine Immunantwort hervorrufen. Dies führt zu einer schwächeren Immunantwort und zu einer Verringerung bei der Beseitigung des Antikörpers. Dies ist eindeutig erwünscht, wenn therapeutische Antikörper bei der Behandlung von humanen Erkrankungen verwendet werden. Humanisierte Antikörper werden so erstellt, dass sie weniger "fremde" Antikörperregionen aufweisen und daher als weniger immunogen angesehen werden als Chimäre Antikörper.
In einem weiteren Aspekt der Offenbarung wird ein Vektor bereitgestellt, der für die Expression des erfindungsgemäßen humanisierten oder chimären Antikörpers angepasst ist.
In einer noch weiteren Ausführungsform der Offenbarung wird eine Zelle oder eine Zelllinie bereitgestellt, die mit dem Vektor, welcher für den erfindungsgemäßen humanisierten oder chimären Antikörper kodiert, transformiert und transfiziert ist.
In einem noch weiteren Aspekt der Offenbarung wird ein Verfahren für die Herstellung des erfindungsgemäßen humanisierten oder chimären Antikörpers bereitgestellt, bei dem man:

(i) eine Zelle bereitstellt, die mit einem Vektor transformiert oder transfiziert ist, welcher ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das für den erfindungsgemäßen humanisierten oder chimären Antikörper kodiert;
(ii) die Zelle unter Bedingungen anzüchtet, die für die Herstellung des Antikörpers förderlich sind; und
(iii) den Antikörper aus der Zelle oder aus ihrer Wachstumsumgebung aufreinigt.

In einem weiteren Aspekt der Offenbarung wird eine Hybridomzelllinie bereitgestellt, die den zuvor beschriebenen monoklonalen Antikörper produziert.
In einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern bereitgestellt, bei dem die erfindungsgemäßen Hybridomzelllinien verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt der Offenbarung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Hybridomzelllinie bereitgestellt, die die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produziert, bei dem man

i) ein immunkompetentes Säugetier mit einem Immunogen immunisiert, das mindestens ein Polypeptid mit der in SEQ ID NOS: 14–19 dargestellten Aminosäuresequenz oder Fragmente davon umfasst;
ii) Lymphozyten eines immunisierten immunkompetenten Säugetiers mit Myelomzellen fusioniert, um Hybridomzellen zu bilden;
iii) monoklonale Antikörper, die von den Hybridomzellen von Schritt (ii) gebildet werden, in einem Screening auf Bindungsaktivität für die Aminosäuresequenzen von (i) untersucht;
iv) die Hybridomzellen kultiviert, um den monoklonalen Antikörper zu proliferieren und/oder zu sekretieren; und
v) den monoklonalen Antikörper aus dem Kulturüberstand gewinnt.

Vorzugsweise ist das immunkompetente Säugetier eine Maus. Alternativ dazu ist das immunkompetente Säugetier eine Ratte.
Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern unter Verwendung von Hybridomzellen ist im Stand der Technik hinreichend bekannt. Die Verfahren, die zur Produktion monoklonaler Antikörper verwendet werden, sind von Köhler und Milstein in Nature 256, 495–497 (1975) und auch von Donillard und Hoffman, "Basic Facts about Hybridomas" in Compendium of Immunology V.II, hrsg. von Schwartz, 1981, beschrieben worden, die vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
In einem weiteren Aspekt der Offenbarung wird die Verwendung von Antikörpern zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Staphylococcus aureus-assoziierter Septikämie, Lebensmittelvergiftung oder Hautkrankheiten bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt der Offenbarung wird die Verwendung von erfindungsgemäßen Antikörpern zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Staphylococcus epidermidis-assoziierter Sepsis, Peritonitis oder Endokarditis bereitgestellt.
Es wird ersichtlich sein, dass die Polypeptide, welche durch die erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert werden, die Herstellung von therapeutischen Antikörpern für eine Vielzahl von Erkrankungen ermöglichen werden, die aus pathogenen Infektionen resultieren, beispielsweise Septikämie; Tuberkulose; Bakterien-assoziierte Lebensmittelvergiftung; Blutinfektionen; Peritonitis, Endokarditis; Sepsis; Meningitis; Pneumonie; Magengeschwüre; Gonorrhoe; Streptokokken-Halsentzündung; Streptokokken-assoziierter toxischer Schock, nekrotisierende Fasziitis; Impetigo; Histoplasmose; Lyme-Erkrankung; Gastroenteritis; DUrchfall; Shigellose.

Wie bereits zuvor erwähnt wurde, verursachen mikrobielle Organismen eine große Vielzahl von Erkrankungen. Nachstehend sind mehrere Mikroorganismen sowie einige der von ihnen verursachten Erkrankungen aufgeführt (nicht einschränkend zu verstehen).

Mikroorganismen	Verursachte Erkrankung(en)
Staphylococcus aureus	Sepsis, Lebensmittelvergiftung, Septikämie,
Staphylococcus epidermidis	Peritonitis, Septikämie, Endokarditis, andere Krankenhaus-assoziierte Erkrankungen
Enterococcus faecalis	Endokarditis, Zystitis, Wundinfektionen
Mycobacterium tuberculosis	Tuberkulose
Streptococcus Gruppe B	Sepsis, Meningitis, Pneumonie, Blasenentzündungen
Streptococcus pneumoniae	Pneumonie, Meningitis
Helicobacter pylori	Magengeschwüre
Neisseria gonorrhoeae	Gonorrhoe
Streptococcus Gruppe A	Streptokokken-Halsentzündung, nekrotizierende Fasziitis, Impetigo, Strep. Toxischer Schock-Syndrom
Borrelia burgdoferi	Lyme-Erkrankung
Coccidiodes immitis	Pneumonie
Histoplasma sapsulatum	Histoplasmose, Pneumonie
Neisseria meningitidis Typ B	Meningitis
Shigella flexneri	Gastroenteritis, Shigellose, Durchfall
Escherichia coli	Lebensmittelvergiftung, Gastroenteritis
Haemophilus influenzae	Meningitis, Pneumonie, Arthritis, Cellulitis

Eine Ausführungsform der Erfindung wird nunmehr lediglich beispielhaft mit Bezug auf die nachfolgenden Materialien, Verfahren und die SEQ ID NO: 1 bis 19 sowie Tabelle 1 beschrieben.
Materialien und Verfahren
Eine λZAP Express-Bibliothek aus genomischer DNA von S. aureus 8325/4 wurde verwendet. Sie enthält Fragmente von 2–10 kB aus einem partiellen Sau3A-Verdau von gesamtgenomischer DNA. Diese wurde in die BamHI-Schnittstelle des Vektors kloniert. Die Bibliothek enthält > 10x die Abdeckung des Genoms. Die Bibliothek wurde durch Plaquelift unter Verwendung eines anfänglichen Screenings von ungefähr 20000 Plaque-bildenden Einheiten auf einer Petrischale mit 9 cm Durchmesser untersucht. Die verwendeten plattierten Zellen, ihre Behandlung, das Plattierungsverfahren sowie Puffer entsprachen exakt denjenigen, die im Handbuch des Herstellers beschrieben sind (Stratagene). Die plattierten Zellen, Escherichia coli XL1-Blue MRF', wurden mit Phagen infiziert und in 3 ml Top LB-Agar, der 10 mM MgSO₄ enthielt, auf LB-Platten ausplattiert, die 10 mM MgSO₄ enthielten. Die Platten wurden anschließend bei 42°C für 4 Stunden inkubiert. Eine Filterscheibe mit 8,5 cm Durchmesser aus Nitrocellulose (zuvor in 10 mM IPTG getränkt und an der Luft getrocknet) wurde auf jede Platte aufgebracht und seine Lage wurde markiert. Die Platten wurden anschließend für weitere 3,5 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Filter wurden entfernt und in TEST-Puffer gewaschen, bevor über Nacht eine Blockierung bei 4°C in TEST durchgeführt wurde, der 6% w/v getrocknete Magermilch und 3% v/v Schweineserum (Sigma) enthielt. Das Serum wurde verwendet, um sämtliche Protein A-Klone mit dem Filter zu blocken. Die Filter wurden dann mit Patientenserum 1/5000-Verdünnung) in Blockierungslösung für 90 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Antiserum wurde von Patienten erhalten, die sich von schweren Infektionen mit S. aureus erholten. Die Filter wurden anschließend 3 × 10 Minuten in TEST gewaschen. Der verwendete sekundäre Antikörper war nein vollständiger Ziege-Anti-Mensch IgG, der mit alkalischer Phosphatase gekoppelt war (Sigma), in einer Verdünnung von 1/30 000 in Blockierungslösung bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Die Filter wurden anschließend wie oben gewaschen und unter Verwendung einer standardgemäßen kolorimetrischen Methode entwickelt.
Kreuzreaktive Plaques wurden auf den Agarplatten lokalisiert und in 0,2 ml Phagenpuffer mit 0,02 ml Chloroform entkernt. Der Titer jedes Kernstücks wurde bestimmt, und die Phagen wurden bei ungefähr 200 Plaques pro Platte ausplattiert. Ein Plaquelift und ein Screening wurden wie oben beschrieben durchgeführt, um einzelne, reine, kreuzreaktive Klone zu erhalten.
Die reinen Klone wurden (1 μl) auf Platten aufgetropft, um eine konfluenten Plaque von 0,5 cm Durchmesser zu erhalten. 30 individuelle Klone können auf jede Platte aufgetropft werden. Ein Plaquelift wird durchgeführt, und der Filter wird mit einem geeigneten Serum untersucht. Dadurch können Klone auf ihre Kreuzreaktivität mit anderen Patientenseren, Donor-Seren von nicht-infizierten Individuen und Anti-Protein A-Seren untersucht werden.
Einzelne Klone wurden dann ausgeschnitten, um ein Phagemid in E. coli XLOLR bereitzustellen, wobei das Protokoll des Herstellers (Stratagene) verwendet wurde. Eine Plasmid-Miniprep wurde von jedem durchgeführt, und die Größe des genomischen Inserts wurde durch Restriktionskartierung bestimmt. Die Identität des klonierten Inserts wurde durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung von Primern gegen die Vektorsequenz bestimmt, was eine Sequenzierung über das Insert ermöglicht. Durch Vergleich der erhaltenen Sequenz gegen öffentliche Datenbanken kann die Art der klonierten Gene (des klonierten Gens) bestimmt werden.
Hybridisierungslösungen/-Bedingungen
Üblicherweise verwenden Hybridisierungsbedingungen 4–6 × SSPE (20 × SSPE enthält 175,3 g NaCl, 88,2 g NaH₂PO₄ H₂O und 7,4 g EDTA gelöst in 1 Liter, wobei der pH-Wert auf 7,4 eingestellt ist); 5–10 × Denhardt-Lösung (50 × Denhardt-Lösung enthält 5 g Ficoll (Typ 400, Pharmacia), 5 g Polyvinylpyrrolidon ad 5 g bovines Serumalbumin; 100 μg–1,0 mg/ml Ultraschall-behandelte Lachs-/Hering-DNA; 0,1–1,0% Natriumdodecylsulfat; wahlweise 40–60% deionisiertes Formamid. Die Hybridisierungstemperatur wird abhängig vom GC-Gehalt der Nukleinsäurezielsequenz variieren, wird jedoch üblicherweise zwischen 42°–65°C betragen.

Staphylococcus aureus Klone, die in einem Screening von humanem Serum identifiziert wurden. TABELLE 1

Patientenserum	Klon	Kodiertes Protein	Locusnummer
A	1	γ Hämolysin B und C Untereinheit	1
A	3	Atl	2
A	4	γ Hämolysin B und C Untereinheit	1
A	5	γ Hämolysin B und C Untereinheit	1
A	7	Neue putative Protease (ORF1 ähnlich zu einem neuen Antigen)	7
A	8	Neue Nuklease (YisK)	5
A	9	Neues Autolysin	6
A	10	γ Hämolysin B und C Untereinheit	1
A	11	Atl	2
A	14	γ Hämolysin B und C Untereinheit	1
A	15	γ Hämolysin B und C Untereinheit	1
A	S1	Neue putative Protease (ORF1 ähnlich zu einem neuen Antigen)	7
A	S5	Neues Oberflächenprotein	12
A	S17	γ Hämolysin B und C Untereinheit	1
A	S18	Neue putative Protease (ORF1 ähnlich zu einem neuen Antigen)	7
A	S19	Neues Autolysin	6
A	S20	Neues Oberflächenprotein/Toxin	13
A	S21	γ Hämolysin B und C Untereinheit	1
A	S25	γ Hämolysin B und C Untereinheit	1
A	S29	Fibrinogen-Bindungsprotein	3
A	S44	Neues Oberflächenprotein	12
A	S45	Atl	2
A	S55	Atl	2
A	S64	Atl	2
A	S66	Atl	2
B	2	Neues Exotoxin (ähnlich zum Exotoxin 2)	8
C	1	Koagulase	4
C	2	Koagulase	4
C	3	Koagulase	4
C	4	Koagulase	4
C	5	Koagulase	4
C	6	Koagulase	4
C	7	Koagulase	4
C	8	Koagulase	4
C	9	Koagulase	4
C	10	Koagulase	4
C	11	Koagulase	4
C	13	Koagulase	4
C	14	Koagulase	4
C	15	Koagulase	4
C	19	Koagulase	4
C	20	Koagulase	4
C	25	Koagulase	4
E	6	Neue Oberflächenproteine	9/10
E	7	Neue Oberflächenproteine	9/10
E	11	γ Hämolysin B und C Untereinheit	1
F	1	Neues Exotoxin (ähnlich zum Exotoxin 2)	8
F	2	Neues Exotoxin (ähnlich zum Exotoxin 2)	8
F	3	Neues Exotoxin (ähnlich zum Exotoxin 2)	8
F	4	Neues Exotoxin (ähnlich zum Exotoxin 2)	8
F	5	Neues Hämolysin (YjfD)	11

Sequenzprotokoll

Claims

Polypeptid, das von einem isolierten Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches eine DNA-Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) der in SEQ ID NO: 2 dargestellten DNA-Sequenz; (ii) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz, welche in (i) oben angegeben ist, hybridisieren, und die für ein Polypeptid kodieren, das von einem pathogenen Organismus exprimiert wird; und (iii) DNA-Sequenzen, die aufgrund des genetischen Codes in Bezug auf die in (i) und (ii) definierten DNA-Sequenzen degeneriert sind, zur Verwendung als Impfstoff.
Polypeptid zur Verwendung als Impfstoff nach Anspruch 1, das von der in SEQ ID NO: 2 dargestellten DNA-Sequenz kodiert wird.
Impfstoff, der mindestens ein Polypeptid umfasst, das von einem isolierten Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches eine DNA-Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) der in SEQ ID NO: 2 dargestellten DNA-Sequenz; (ii) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz, welche in (i) oben angegeben ist, hybridisieren, und die für ein Polypeptid kodieren, das von einem pathogenen Organismus exprimiert wird; und (iii) DNA-Sequenzen, die aufgrund des genetischen Codes in Bezug auf die in (i) und (ii) definierten DNA-Sequenzen degeneriert sind.
Impfstoff nach Anspruch 3, bei dem das Polypeptid von der in SEQ ID NO: 2 dargestellten DNA-Sequenz kodiert wird.
Impfstoff nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, der ferner einen Träger und/oder ein Adjuvans umfasst.
Verwendung von mindestens einem Polypeptid, das von einem isolierten Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches eine DNA-Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) der in SEQ ID NO: 2 dargestellten DNA-Sequenz; (ii) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz, welche in (i) oben angegeben ist, hybridisieren, und die für ein Polypeptid kodieren, das von einem pathogenen Organismus exprimiert wird; und (iii) DNA-Sequenzen, die aufgrund des genetischen Codes in Bezug auf die in (i) und (ii) definierten DNA-Sequenzen oder Teilen derselben degeneriert sind, bei der Herstellung eines Medikamentes für die Immunisierung eines Tiers gegen eine pathogene Mikrobe, wobei die pathogene Mikrobe die bakterielle Gattung Staphylococcus spp. ist.
Verwendung nach Anspruch 6, bei der das Polypeptid von der in SEQ ID NO: 2 dargestellten DNA-Sequenz kodiert wird.
Verwendung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, bei der das Tier ein Mensch ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, bei der die pathogene Mikrobe die bakterielle Spezies Staphylococcus aureus ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, bei der die pathogene Mikrobe die bakterielle Spezies Staphylococcus epidermidis ist.