ES2537437T3 - Anticuerpos o fragmentos de éstos dirigidos contra un epítopo del Staphylococcus aureus de IsaA o IsaB - Google Patents

Abstract

Los anticuerpos o fragmentos de éstos que son dirigidos contra un epítopo de Staphylococcus aureus que es reconocido por otros anticuerpos monoclonales que son segregados por la línea celular de hibridoma depositada en el DSMZ con el número de registro DSM ACC2987, donde el epítopo contiene al menos una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos 13 aminoácidos a una de las secuencias SEQ ID NO: 15, 17 a 19, 21 a 26, 32 a 34 y 57 o donde cada uno de los anticuerpos tiene una cadena pesada con una primera región variable y una cadena ligera con una segunda región variable, donde la primera región variable contiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia SEQ ID NO: 2 y donde la segunda región variable contiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia SEQ ID NO: 4.

Description

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afinidades de unión de más de un factor de dos se consideran, por tanto, significativas.

En las condiciones de medida descritas antes, los anticuerpos MAB-UK-66 interaccionan con los antígenos de 29 kDa IsaA de manera irreversible debido a las velocidades de disociación lentas no evaluables. Dado que la evaluación de la constante de velocidad cinética está limitada a 10-5 s-1 la velocidad de disociación observada debe ser menor que este valor. Fijando la velocidad de disociación en 10-5 s-1 se pudo determinar que la velocidad de asociación era de 5.6 105 M-1s-1 lo que resulta en un valor para la constante de disociación de1.8 10-11 M. Por lo tanto, el valor de KD para esta interacción es ≤ 1.8 10-11 M. Es de destacar, que el anticuerpo no pudo ser eliminado de la superficie del chip después de la interacción con el antígeno usando todas las soluciones de regeneración descritas antes. Esto indica una interacción muy fuerte y altamente específica.

Para confirmar la alta afinidad del anticuerpo monoclonal MAB-UK-66 por IsaA se determinó la cinética de la unión de IsaA a anticuerpos inmovilizados mediante resonancia de plasmones superficiales sin marcador utilizando el sistema BIACORE® 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Munzinger Strasse 5, 79111 Freiburg, Alemania). Se realizó la inmovilización reversible del anticuerpo MAB-UK-66 empleando un anticuerpo anti-Fc de ratón acoplado covalentemente en alta densidad (18700 unidades de resonancia UR) a una superficie de sensor CM5 según las instrucciones del fabricante (Mouse Antibody Capture Kit, GE Healthcare). La cantidad promedio de anticuerpo MABUK-66 capturado sobre la superficie del anti-Fc de ratón corresponde a aproximadamente 640 UR. Se usó un blanco de superficie anti-Fc de ratón como superficie de control para monitorear uniones inespecíficas y realizar la sustracción de referencia. Se realizaron análisis de interacción usando tampón HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7.4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tween 20 0.005%). Se registraron sensorgramas a una velocidad de flujo de 30 µl/min a 25 °C. Los tiempos de asociación y disociación se fijaron en 3 y 15 min, respectivamente. Las superficies de captura anti-Fc se regeneraron después de cada ciclo usando pulsos cortos de glicina 10 mM pH 1.7. La cinética de la unión de IsaA a anticuerpos monoclonales MAB-UK-66 inmovilizados se muestra en la figura 7.

Se calcularon las afinidades y las constantes de velocidad para la asociación (kon) y la disociación (koff) usando el software BIAevaluation 4.0.1 ajustando los sensorgramas obtenidos a un modelo de unión de Langmuir 1:1. De esta manera se determinó una constante de disociación KD de 1.7 nM en dos mediciones independientes. Se determinó que las constantes de velocidad para la asociación y la disociación de la interacción entre MAB-UK-66 e IsaA eran

1.8 105 M-1s-1 (kon) y 2.9 10-4 s-1 (koff), respectivamente.

En las condiciones de medición descritas antes, el anticuerpo MAB-UK-66 interacciona con el antígeno de 29 kDa IsaA con una alta afinidad y velocidad de disociación lenta lo que confirma una interacción fuerte y altamente específica como ya se determinó mediante la unión de los anticuerpos MAB-UK-66 a IsaA inmovilizado.

Para caracterizar el epítopo de IsaA que es reconocido por los anticuerpos o fragmentos según la invención se realizó un mapeo de epítopos. Para esto se sintetizaron oligopéptidos de 15 aminoácidos de longitud. La secuencia de cada uno de los oligonucleótidos es idéntica a una secuencia de 15 aminoácidos de IsaA. Cada oligonucleótido tiene una superposición de 11 aminoácidos con el oligonucleótido que representa una parte subsiguiente de la secuencia total. Las secuencias de los oligonucleótidos son las secuencias SEQ ID NO: 9 a 64 del listado de secuencias.

Cada oligonucleótido se inmovilizó en un pequeño punto sobre un portaobjetos de vidrio. Se examinó la unión de los anticuerpos monoclonales segregados por la línea celular de hibridoma DSM ACC2987 y de los anticuerpos de control a estos puntos luego de la incubación con estos anticuerpos mediante unión de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia y detección de las intensidades de fluorescencia. Los resultados se muestran en la tabla siguiente:

SEC. ID. Nº:

Unión de ACC2987 anticuerpos segregados por la línea celular DSM Unión de anticuerpos de control

9

273,3 imagen6 70

10

227,7 imagen7 159,7

11

101,3 imagen8 -11

12

679,7 imagen9 -22

13

5748 imagen10 366,7

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3190 imagen11 -35

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11718,3 imagen12 107

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