MXPA03011701A - Anticuerpos monoclonales y policlonales de reaccion que reconocen las proteinas de superficie a partir de estafilococos coagulasa-negativos y staphylococcus aureus. - Google Patents
Anticuerpos monoclonales y policlonales de reaccion que reconocen las proteinas de superficie a partir de estafilococos coagulasa-negativos y staphylococcus aureus.Info
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Abstract
Se proporcionan anticuerpos policlonales y monoclonales que son de reaccion cruzada para bacteria de estafilococo coagulasa-positivo, tal como S. hemolyticus, los cuales pueden reconocer proteinas de superficie a partir de bacteria de estafilococo coagulasa-positivo y coagulasa-negativo. Los anticuerpos pueden ser generados a partir de proteinas de superficie que han sido aisladas en base a las caracteristicas que pueden ser comunes entre el S. aureus y los estafilococos coagulasa-negativos, y estas proteinas de superficie recombinantes se utilizan para generar los anticuerpos de la invencion. Se proporcionan tambien vacunas y metodos que usan esas proteinas y anticuerpos para el tratamiento o proteccion contra una amplia variedad de infecciones por estafilococos.
Description
ANTICUERPOS MONOCLONALES Y POLICLONALES DE REACCIÓN
CRUZADA QUE RECONOCEN LAS PROTEÍNAS DE SUPERFICIE A PARTIR DE ESTAFILOCOCOS COAGULASA-N EGATIVOS Y STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas
La presente solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de los Estados Unidos de Norteamérica No. de Serie 60/298,098 presentada el 15 de junio de 2001.
Campo de la Invención
La presente invención se refiere de manera general a las proteínas de superficie a partir de Staphylococcus aureus y sus regiones negativas tales como sus dominios A los cuales tienen proteínas homologas en estafilococos coagulasa-negativos tales como S. epidermis y S. hemolyticus así como anticuerpos que reconocen dichas proteínas y, de manera particular, a anticuerpos monoclonales y policlonales aislados que reconocen proteínas específicas a partir de Staphylococcus aureus y estafilococos coagulasa-negativos y por lo tanto se pueden utilizar en vacunas y métodos útiles para prevenir o tratar una amplia variedad de infecciones ocasionadas por bacterias de estafilococos.
Antecedentes de la Invención
La colonización exitosa del anfitrión es un proceso requerido por la mayoría de los microorganismos para ocasionar infecciones en animales y seres humanos. La adhesión microbiana es la primera etapa crucial en un a serie de eventos de que pueden conducir finalmente a la enfermedad. Los microorganismos patógenos colonizan al anfitrión uniéndose a los tejidos del anfitrión o biomateriales implantados condicionados por el suero, tales como catéteres, articulaciones artificiales e injertos vasculares, a través de adhesinas específicas presentes en la superficie de la bacteria. MSCRAMM® (Componentes de Superficie Microbiana que Reconocen Moléculas de Matriz Adhesiva) son una familia de adhesinas de superficie celular que reconocen y se unen de manera específica a distintos componentes en la matriz extracelular del anfitrión. Una vez que la bacteria se ha adherido de manera exitosa y ha colonizado los tejidos del anfitrión, su fisiología se altera de manera drástica y se secretan los componentes nocivos como las toxinas y las enzimas proteolíticas. Además, las bacterias adherentes producen con frecuencia una biopelícula y rápidamente se vuelven más resistentes al efecto eliminador de la mayoría de los antibióticos. S. aureus ocasiona un espectro de infecciones que varían desde lesiones cutáneas tales como infecciones en heridas, impetigo y furúnculos hasta condiciones que ponen en riesgo la vida que incluyen neumonía, artritis específica, sepsis, endocarditis e infecciones relacionadas con biomaterial. El S. aureus es conocido por expresar un repertorio de diferentes MSCRAMMs que pueden actuar en forma individual o en conjunto para facilitar la adhesión microbiana a componentes de tejido del anfitrión específicos. De manera adicional, otro tipo de bacterias de estafilococos es identificado como la bacteria coagulasa-negativa, que incluye especies tales como S. epidermis y S. hemolyticus que también se han conocido por expresar MSCRA Ms y que también, son responsables de una amplia gama de infecciones bacteriales y enfermedades relacionadas. A este respecto, los MSCRAMMs proporcionan de manera general un excelente objetivo para el ataque inmunológico de los anticuerpos, tanto anticuerpos monoclonales como policlonales. Sin embargo, debido a que por naturaleza los anticuerpos son muy específicos y en el caso de diferentes tipos de estafilococos, tales como el S. aureus por una parte (coagulasa-positivo) y S. epidermis por la otra (coagulasa-negativo) se ha mantenido un problema importante para desarrollar anticuerpos que exhiben reactividad cruzada a través de los diferentes tipos de bacteria. Dichos anticuerpos de reacción cruzada son particularmente deseables debido a su potencial en la Inmunización de pacientes humanos y animales y a fin de proporcionar protección contra las infecciones ocasionadas por ambos tipos de bacterias de estafilococos, a saber bacterias coagulasa-positivas tales como S. aureus y la bacteria coagulasa-negativa, tal como S. epidermis y S.
hemolyticus. Por lo tanto, dichos anticuerpos serán útiles de manera externa para prevenir o tratar una amplia variedad de infecciones ocasionadas por bacterias de estafilococos.
Breve Descripción de la Invención
En consecuencia, es un objeto de la presente invención proporcionar anticuerpos monoclonales que reconocen MSCRAM Os a partir tanto de bacterias coagulasa-positivas como S. aureus como de MSCRAMM®s a partir de bacterias coagulasa-negativas, tales como S. epidermis y S. hemolyticus. También es un objeto de la presente invención identificar y asilar MSCRAMM®s a partir de bacterias de estafilococos, así como sus regiones activas tales como el dominio A, las cuales pueden ser utilizadas para generar anticuerpos monoclonales y policlonales que serán de reacción cruzada tanto en contra de estafilococos coagulasa-positivos como coagulasa-negativos. Es un objeto más de la presente invención el proporcionar anticuerpos aislados que pueden reconocer el dominio A de las proteínas de superficie tales como la proteína DgsK a partir de estafilococos coagulasa-negativos y al mismo tiempo reconocen las proteínas de superficie tales como la proteína SasA a partir del Staphylococcus aureus. Es un objeto más de la presente invención utilizar las proteínas aisladas, los dominios A y los anticuerpos de la invención para producir vacunas útiles en el tratamiento o prevención de infecciones de estafilococos, y proporcionar métodos en donde las vacunas y anticuerpos de la invención sean utilizados para prevenir o tratar una infección de estafilococos. Estos y toros objetos se proporcionan en virtud de la presente invención que comprende la identificación y aislamiento de proteínas de superficie a partir de un tipo de bacterias de estafilococo, tales como estafilococos coagulasa- negativos o coagulasa-positivos, lo cual puede dar origen a anticuerpos de reacción cruzada que pueden reconocer las proteínas de superficie de ambos tipos de estafilococos y que pueden por lo tanto ser utilizados en vacunas y métodos de tratamiento o prevención de una amplia gama de infecciones de estafilococos. La presente invención también se refiere a la generación de anticuerpos monoclonales y policlonales a partir de esas proteínas de superficie y su uso en la prevención o tratamiento de infecciones de estafilococos. Esas modalidades y otras alternativas y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención descrita se volverán fácilmente evidentes para aquellos con experiencia en la técnica a partir de la lectura de la presente especificación y/o las referencias citadas en la presente, todas ellas que están incorporadas mediante referencia.
Breve Descripción de los Dibujos
La figura 1 es una ilustración de la estructura primaria de las proteínas pronosticadas en sílice de acuerdo con la presente invención. La figura 2 muestra un gel Coomassie de las proteínas etiquetadas-His recombinantes N-terminales purificadas que expresan los marcos de lectura abiertos (orfs) de la presente invención. Las figuras 3A-3C muestran la tinción Western de extractos de pared celular de S. aureus que muestran sondeo con anticuerpos anti-KesK (figura 3A), anticuerpos anti-KnkA (figura 3B) y anticuerpos DsqA (figura 3C) respectivamente. Las figuras 4A-4B muestran la tinción Dot e inmunotinción Western de Lactococcus lactis que expresa S. aureus MSCRAMM®s, a saber KnkA (figura 4A) y KesK (Figura 4B). Las figuras 5A-5D representan el sondeo de proteínas LPXTG recombinantes de acuerdo con la presente invención con suero convaleciente que examina la expresión ¡n vivo, incluyendo RrKn y RrKN2 (figura 5A), Keskl y Kesk2A (figura 5B), KnkA (figura 5C) y DsqA2 (figura 5D). La figura 6 muestra un análisis de tinción Western que demuestra que los anticuerpos policlonales de conejo contra S. aureus SasA reaccionan de manera cruzada con una proteína liberada desde la superficie celular de S. epidermis HB así como la región A recombinante a partir de DsgK clonada a partir de S. epidermis.
Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas
De acuerdo con la presente invención, se proporciona proteínas de superficie específicas a partir de bacterias de estafilococos coagulasa-positivos, tales como S. aureus así como a partir de estafilococos coagulasa-negativos tales como S. epidermis y S. hemolyticus, incluyendo fragmentos activos de los mismos tales como los dominios A de esas proteínas u otras regiones epitóticas que pueden generar anticuerpos que reconocen la proteína completa. De acuerdo con la invención, la identificación y aislamiento de secuencias de péptido y proteínas candidatas se llevó acabo en base a algunas de las características comunes de los MSCRAMMOs (Componentes de Superficie Microbiana que Reconocen moléculas de Matriz Adhesiva) los cuales en la mayoría de los casos están anclados de manera covalente al peptidoglicano de pared celular. Esas proteínas de superficie tuvieron las siguientes características comunes que se utilizaron en la identificación y aislamiento de las secuencias de la presente invención, a saber: (i) un péptido de señal N-terminal (aproximadamente 40 residuos de longitud) requerido para secreción Sec-dependiente, (¡i) un dominio que se extiende a la pared ya sea rico en residuos de prolina y glicina o compuesto de serina y repeticiones de dlpéptido de aspartato, (iii) un motivo LPXTG requerido para anclaje covalente de la proteína a al puente cruzado de pentaglicina en peptidoglicano, (iv) un dominio que se extiende a la membrana hidrofóbico seguido por (v) varios residuos de carga positiva. De acuerdo con la invención, al explotar todo el genoma del S. aureus a la luz de las propiedades antes establecidas, por lo menos ocho estructuras de lectura abierta novedosas que codifican proteínas con motivos de secreción y anclaje indicativos de MSCRAMMOs fueron identificadas (es decir que tienen un péptido de señal N-terminal y un motivo LPXTG C-terminal seguido por un dominio hidrofóbico y un extremo cargado positivamente). El Cuadro 1 ilustra la lista de proteínas identificadas que incluyen su distribución entre genomas S. aureus, su tamaño de proteína y secuencia de clasificación de pared celular C-terminal.
Cuadro 1
Abreviaturas: eMRSA-16; N, 8325; C, COL; S, MSSA; J, N315, M, Mu50. Seis de ocho se conservan en los seis genomas de estafilococo actualmente secuenciados y los dos restantes están presentes en 5/6 de esos genomas. De acuerdo con la invención, se obtuvieron las secuencias de amino ácido y ácido nucléico que codifican las proteínas anteriores, y estas fueron como sigue: Ekes MRSA - SEQ ID NO:1 (secuencia ADN); EkeS_MRSA - SEQ ID NO:2 (secuencia de Proteína); DsqA (8325) - SEQ ID NO: 3 (secuencia ADN); DsqA (8325) - SEQ ID NO:4 (secuencia de proteína); KesK1 (8325) - SEQ ID NO: 5 (secuencia ADN); KesK1 (8325) - SEQ ID NO: 6 (secuencia de proteína); KrkN2 (8325) - SEQ ID NO:7 (secuencia ADN); KrkN2 (8325) - SEQ ID NO:8 (secuencia de proteína); rkN (8325) - SEQ ID NO:9 (secuencia ADN); KrkN (8325) - SEQ ID NO: 10 (secuencia de proteína); RkaS (COL) - SEQ ID NO:11 (secuencia ADN); RkaS (COL) - SEQ ID NO: 11 (secuencia ADN); RkaS (COL) - SEQ ID NO: 12 (secuencia de proteína); RrkN (8325) - SEQ ID NO: 13 (secuencia ADN); RrkN (8325) - SEQ ID NO: 14 (secuencia de proteína); KnkA (8325) - SEQ ID NO: 15 (secuencia ADN); KnkA (8325) - SEQ ID NO: 16 (secuencia de proteína). De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos aislados pueden ser generados a partir de la s proteínas anteriores o sus regiones activas tales como el dominio A para ser capaces de reconocer dichas proteínas y lo dichos dominios. Esos anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. En caso de que se deseen anticuerpos policlonales, estos pueden ser generados en cualquiera de un número de formas convencionales bien conocidas en la técnica. En un proceso típico, la proteína de superficie deseada o región activa de la misma puede ser inyectada en un animal anfitrión adecuado, por ejemplo un ratón o un conejo, y después de un período adecuado, se pueden aislar los anticuerpos y ser recuperados a partir del animal anfitrión. Con respecto a los anticuerpos monoclonales, de acuerdo con la presente invención, estos pueden ser producidos en cualquier número de formas incluyendo, por ejemplo, el método bien conocido de Kohler y Milstein, Nature 256:495-497 (1975), u otras formas adecuadas conocidas en el campo, tales como aquellos métodos descritos en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos: 6,331,415; 5,981,216; 5,807,715; y 4,816,567; Solicitud de Patente Europea 519,596; y la publicación PCT WO 00/71585, todas estas publicaciones de patente incorporadas a la presente mediante referencia. Esos métodos incluyen su preparación como anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o humanos en formas que serían bien conocidas en este campo. Además, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar a partir de una sola cadena, tal como las cadenas ligeras o pesadas y, además, se pueden preparar a partir de fragmentos activos de un anticuerpo que retiene las características de unión (por ejemplo, especificidad y/o afinidad) de todo el anticuerpo. Por fragmentos activos se representa un fragmento de anticuerpo que tiene la misma especificidad de unión que un anticuerpo completo que se une ala proteína de superficie particular o su homólogo desde el tipo diferente de bacteria de estafilococo (por ejemplo, coagulasa negativo o coagulasa positivo), y el término "anticuerpo" como se usa en la presente incluye dichos fragmentos. De manera adicional, el antisuero que se prepara utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales de acuerdo con la invención también están considerados y se pueden preparar en un número de formas adecuadas como lo reconocería alguien con experiencia en la técnica. Como se indico con anterioridad, los anticuerpos para las proteínas de superficie aisladas y/o sus regiones activas de acuerdo con la invención se pueden preparar en un número de formas adecuadas que serían bien conocidas en la técnica, tal como el método bien establecido de Kohler y Milstein antes descrito que se puede emplear para generar los anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, en etapas preliminares utilizadas en dicho proceso, se puede inyectar a ratones en forma intraperitoneal una vez a la semana durante un período prolongado con MSCRA ® recombinante purificado de acuerdo con la invención o una porción activa de la misma, seguida por una prueba de sangre obtenida a partir de los ratones inmunizados para determinar la reactividad a la proteína purificada. Después de la identificación de los ratones reactivos a la proteína, los linfocitos aislados a partir de bazos de ratón se fusionaron a células de mieloma de ratón a fin de producir hibridomas positivos para los anticuerpos contra las proteínas de superficie de la invención que son aisladas y cultivadas después, seguidas por la purificación e isotipificación.
A fin de generar anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención se prefiere que éstos sean generados utilizando MSCRAMM® preparados de manera recombinante de acuerdo con la invención, y éstos recombinantes se pueden generar y aislar utilizando un número de métodos estándar bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, uno de esos métodos emplea el uso del vector de expresión E. coli pQE-30 como un vector de expresión para clonar y expresar proteínas recombinantes y péptidos. En un método preferido, utilizando PCR, el dominio A de la proteína de superficie identificado como DgsK o SasA fue amplificado a partir de las secuencias antes descritas y subclonado dentro del vector de expresión E.coli PQE-30 (Qiagen), lo que permite la expresión de una proteína de fusión recombinante que contiene seis residuos de histidína. Este vector fue transformado de manera subsecuente en la cepa E.coli ATCC 55151, cultivado en un fermentador de 15 litros hasta una densidad óptica (OD6oo) de 0.7 e inducido con 0.2 mM de ¡sopropil-1 -beta-D galactosida (IPTG) durante 4 horas. Las células fueron cultivadas utilizando un ensamble de fibra hueca de AG Technologies (tamaño de poro 0.45 µ??) y ¡as pasta celular congelada a -80°C. Se causó la lisis de las células en 1X PBS (10 ml_ regulador de pH/1g de pasta celular) utilizando 2 pasadas a través de la Prensa Francesa @ 1100 psi (77.33 kg/cm2). Las células sometidas a lisis fueron centrifugadas a 17,000 rpm durante 30 minutos para remover los desechos celulares. Los sobrenadantes fueron pasados sobre una columna HiTrap Chelating (Pharmacia) de 5-mL cargada con 0.1 NiCI2. Después de la carga, la columna fue lavada con 5 volúmenes de columna de 10mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCI Regulador de pH A). La proteína fue eluida utilizando un gradiente 0-100% de 10 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCI, 200 mM de imidazol (Regulador de pH B) durante 30 volúmenes de columna. SdrGN1N2N3 o SdrGN2N3 eluidos a -13% Regulador de pH B (~26mM imidazol). Se monitoreo la absorbancia a 280 nm. Las fracciones que contienen SdrGN 1 N2N3 o SdrGN2N3 fueron dializadas en 1x PBS. A continuación, cada proteína fue colocada después a través de un protocolo de remoción de endotoxina. Los reguladores de pH utilizados durante este protocolo fueron liberados de la endotoxina al pasar sobre una columna de Mono-Q sefarosa de 5-mL (Pharmacia). La proteína fue dividida uniformemente entre tubos 4x 15 mL. El volumen de cada tubo fue llevado hasta 9 mL con el Regulador de pH A. Se agregó 1 mL de 10% Tritón X-114 a cada tubo y se incubo con rotación durante 1 hora a 4°C. Los tubos fueron colocados en un baño de agua a 37°C para separar las fases. Los tubos fueron girados a 2,000 rpm durante 10 minutos y la fase acuosa superior desde cada uno de los tubos fue recolectada y se repitió la extracción de detergente. Las fases acuosas a partir de la 2da extracción se combinaron y se pasaron sobre una columna de quilatado IDA de 5-mL (Sigma), cargada con 0.1M NiCI2 para remover el detergente restante. La columna fue lavada con 9 volúmenes de columna del Regulador de pH A antes de que se fluyera la proteína con 3 volúmenes de columna del Regulador de pH B. El eluyente fue pasado sobre una columna de Detoxigel de 5-mL (Sigma) y el flujo de paso recolectado y reaplicado a la columna. El flujo de paso desde la segunda pasada fue recolectado y dializado en 1x PBS. El producto purificado fue analizado para concentración, pureza y nivel de endotoxina antes de la administración en los ratones. En el proceso preferido, los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la presente invención se pueden preparar a partir de las proteínas recombinantes antes identificadas de la siguiente manera. En este proceso, se utilizaron el E, coli expresado las proteínas recombinantes purificadas SasA y DsgK para generar un panel de anticuerpos monoclonales de murina en tanto que el suero de los ratones se utilizó como una fuente de anticuerpos policlonales. En resumen, un grupo de ratones Balb/C o SJL recibió una serie de inmunizaciones subcutáneas de 1-10 mg de proteína en solución o mezclada con adyuvante como se describe a continuación en el Cuadro 2.
Cuadro 2. Esquemas de Inmunización Inyección RIM S Día Cantidad ( iq) Ruta Adyuvante
#1 0 5 Subcutánea FCA/RIBI
#2 2 1 Subcutánea FCA/RIBI
#3 4 1 Subcutánea FCA/RIBI #4 7 1 Subcutánea FCA/RIBI
#5 9 1 Subcutánea FCA/RIBI Inyección Convencional Día Cantidad (µa) Ruta Adyuvante
Primaria 0 5 Subcutánea FCA Impulsor #1 14 Intraperitoneal RIBI Impulsor #2 28 Intraperitoneal RIBI Impulsor #3 42 Intraperitoneal RIBI
En el momento del sacrificio (RIMMS) o siete días después de que se recolectó un suero impulsor convencional y se tituló en pruebas ELISA contra proteínas MSCRAMM® o en células completas (S. epidermis y S. aureus). Tres días después del impulsor final, se retiraron los bazos o nodos linfáticos, se desmenuzaron en una sola suspensión celular y se cultivaron los linfocitos. Los linfocitos se fusionaron después a la línea celular de mieloma P3X63Ag8.653 (ATCC #CRL-1580). La fusión celular, la colocación en placas posterior y la alimentación se ejecutaron de acuerdo con el protocolo de Producción de Anticuerpos onoclonales a partir de Current Protocols in Immunoloqy (Cápitulo 2, Unidad 2), incorporados en la presente mediante referencia. Cualesquiera clones que fueron generados a partir de la fusión fueron tamizados para producción de anticuerpo anti-SasA específico utilizando una prueba ELISA estándar. Los clones positivos fueron expandidos y probados de manera adicional para actividad en un ensayo de unión celular bacterial a través de citometría de flujo y unión SasA mediante análisis Biacore. A través del análisis Biacore, la velocidad de flujo permaneció constante a 10 ml/min. Antes de la inyección SasA o DgsK, la prueba de anticuerpo fue adsorbida hacia el fragmento por medio de unión RAM-Fc. En el tiempo 0, se inyectó SasA o DgsK a una concentración de 30 mg/ml sobre el fragmento durante 3 minutos seguido por 2 minutos de disociación. Esta fase del análisis midió la asociación reactiva y la cinética de disociación de la interacción Mab/SasA o DgsK. A continuación, los anticuerpos preparados como se estableció antes fueron probados para unión a toda la bacteria. En esas pruebas, las muestras bacteriales S. aureus Newman, S. aureus 67-0, S. aureus 397 (Sal6), S. aureus Wood, S. aureus 8235-4, S. aureus MRSA 16 resistente a meticilina, S. epidermis ATCC 35984, s. epidermis HB, S. epidermis CN-899 y S. haemolyticus ATCC 43253 fueron recolectadas, lavadas e incubadas con Mab o PBS solo (control) a una concentración de 2 µg/ml después del bloqueo con IgG de conejo (50 mg/ml). Después de la incubación con anticuerpo, las células bacteriales fueron incubadas con Cabra-F-Anti-Ratón-F(ab )2-FITC que sirvió como el anticuerpo de detección. Después del etiquetado de anticuerpo, las células bacteriales fueron aspiradas a través del citómetro de flujo calibre FACS para analizar la emisión de fluorescencia (excitación: 488, emisión: 570). Para cada cepa bacterial, se recolectaron y midieron 10,000 eventos. Esos datos indican que los anticuerpos contra S. aureus SasA fueron capaces de reconocer una proteína homologa sobre la superficie de estafilococos coagulasa-negativos. Los datos soportan el análisis de tinción Western que demuestra que los anticuerpos policlonales de conejo contra S. aureus SasA reaccionan de manera cruzada con una proteína liberada desde la superficie de la célula de S. epidermlsHB así como la región-A recombinante a partir de DsgK clonada a partir de S. epidermis (ver figura 6 y Cuadro 3 a continuación).
Cuadro 3. Reactividad de Sueros Policlonales
Aunque se prefiere la producción de anticuerpos que usan formas recombinantes de las proteínas de superficie de la presente invención, los anticuerpos pueden ser generados a partir de versiones asiladas naturales y purificadas de esas proteínas o sus regiones activas tales como el dominio A, y los anticuerpos monoclonales o policlonales se pueden generar utilizando esas proteínas o regiones activas de la misma manera como se describió antes a fin de obtener dichos anticuerpos. Incluso están disponibles otras formas convencionales para genera los anticuerpos de la presente invención utilizando proteínas purificadas recombinantes o naturales o sus regiones activas, como lo reconocería alguien con experiencia en la técnica. Como lo reconocería alguien con experiencia en la técnica, los anticuerpos de la presente invención también pueden formarse en composiciones farmacéuticamente aceptables para administración a pacientes humanos o animales a fin de tratar o evitar una infección ocasionada por bacterias de estafilococos. Las composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos de la presente invención, o fragmentos efectivos de los mismos, pueden ser formuladas en combinación con cualquier vehículo, excipiente o portador farmacéutico adecuado que sería utilizado de manera común en esta técnica, incluyendo solución salina, dextrosa, agua, glicerol, etanol, otros compuestos terapéuticos y combinaciones de los mismos. Como lo reconocería alguien con experiencia en la técnica, el vehículo, excipiente o portador particular utilizado variará dependiendo del paciente y la condición del paciente, y una variedad de modos de administración serían adecuados para las composiciones de la invención, como lo reconocería alguien con experiencia ordinaria en esta técnica. Los métodos adecuados de administración cualquier composición farmacéutica descritos en esta solicitud incluyen, aunque no están limitados a administración tópica, oral, rectal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal e intradérmica. Para administración tópica, la composición está formulada en la forma de un ungüento, crema, gel, loción, gotas (tales como gotas para los ojos y gotas para los oídos), o solución (tal como enjuagues bucales). Los vendajes para heridas o quirúrgicos, suturas u aerosoles se pueden impregnar con la composición. La composición puede contener aditivos condicionales, tales como conservadores, solventes para promover la penetración, y emolientes. Las formulaciones tópicas pueden contener también portadores convencionales tales como crema o bases de ungüento, etanol, o alcohol oléico. Las formas adicionales de composiciones de anticuerpo y otra información que se refiere a las composiciones, vacunas, métodos y aplicaciones con respecto a otros SCRA M®s también serán aplicables de manera general a la presente invención que involucran a los MSCRAM ®s antes mencionados y sus regiones activas y anticuerpos de los mismos, y esos otros MSCRAMMOs se describen por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica 5,175,096; 5,320,951; 5,416,021; 5,440,014; 5,571,514; 5,652,217; 5,707,702; 5,789,549; 5,840,846; 5,980,908; 6,086,895; 6,008,341; 6,177,084; 5,851,794 y 6,288,214; todas esas patentes están incorporadas a la presente mediante referencia. Las composiciones de anticuerpos de la presente invención pueden también ser administradas con un adyuvante adecuado en una cantidad efectiva para mejorar la respuesta inmunogénica. Por ejemplo, los adyuvantes adecuados pueden incluir alud (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio), el cual se utiliza ampliamente en los seres humanos, y otros auxiliares tales como saponina y su componente purificado Quil A, adyuvante completo de Freund, adyuvante RIBBI, y otros adyuvantes utilizados en la investigación y aplicaciones veterinarias. Otras preparaciones químicamente definidas tales como dipéptido de muramilo, lipido de monofosforilo A, conjugados de fosfolípido tales como aquellos descritos por Goodman-Snitkoff et al. J. Immunol. 147:410-415 (1991) e incorporados por referencia en la presente, el encapsulado del conjugado dentro de un proteoliposoma como lo describen Millar et al., J. Exp. Med. 176:1739-1744 (1992) e incorporado a la presente mediante referencia, y el encapsulado de la proteína en vesículas de lipido tales como vesículas de lipido Novasome™ (Micro Vesicular Systems, Inc., Nashua, NH) también pueden ser útiles. En cualquier caso, las composiciones de anticuerpo de la presente invención que pueden reconocer las proteínas o sus regiones activas como se estableció anteriormente serán útiles en los métodos de prevención o tratamiento de infección por estafilococos, y en inhibir la unión de bacterias de estafilococos al tejido y/o células del anfitrión. De acuerdo con la presente invención, se proporcionan métodos para prevenir o tratar una infección por estafilococo que comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo para las proteínas de superficie como se establece en la presente o sus subregiones activas para tratar o prevenir la infección por estafilococo. Además, esos anticuerpos monoclonales serán útiles para deteriorar la unión de bacterias de estafilococos a las células del anfitrión. En consecuencia, de acuerdo con la invención, la administración de los anticuerpos de la presente invención en cualquiera de las formas convencionales antes descritas (por ejemplo, tópica, parenteral, intramuscular, etc.) proporcionará por lo tanto un método extremadamente útil para tratar o presentir las infecciones por estafilococo en pacientes humanos o animales cuando una cantidad efectiva de las composiciones de anticuerpo son administradas a un paciente humano o animal. Mediante cantidad efectiva se representa que el nivel de uso, tal como de un título de anticuerpo, que será suficiente para prevenir la adherencia de la bacteria, para inhibir la unión de la bacteria de estafilococo a las células del anfitrión y por lo tanto serán útiles en el tratamiento o prevención de una infección por estafilococo. Como lo reconocería alguien con experiencia ordinaria en esta técnica, el nivel de título de anticuerpo necesario para ser efectivo en el tratamiento o prevención de infección por estafilococo variará dependiendo de la naturaleza y condición del paciente, y/o la severidad de la infección por estafilococo pre-existente. Además del uso en los métodos de tratamiento o prevención de una infección por estafilococo, los anticuerpos de la invención también pueden ser utilizados para la detección específica de proteínas de estafilococo, o como herramientas de investigación. El término "anticuerpos" como se usa en la presente incluye anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, de cadena simple, bioespecíficos, simianizados, y humanizados o privatizados así como fragmentos Fab, tales como aquellos fragmentos que mantienen la especificidad de los anticuerpos para las proteínas de superficie antes especificadas, incluyendo los productos de una biblioteca de expresión de inmunoglobulina Fab. En consecuencia, la invención contempla el uso de cadenas simples tales como las cadenas pesadas y ligeras variables de los anticuerpos. La generación de cualquiera de esos tipos de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo es bien conocida por aquellos con experiencia en la técnica. En el caso actual, los anticuerpos para las proteínas de superficie o sus regiones activas como se refirieron antes pueden ser generados, aislados y/o purificados y después utilizados para tratamiento o protección contra infección por estafilococo. Cualquiera de los anticuerpos antes descritos puede ser etiquetado directamente con una etiqueta detectable para Identificación y cuantificación de la bacteria de estafilococo. Las etiquetas para uso en inmunoensayos son conocidas de manera general por aquellos con experiencia en la técnica e incluyen enzimas, radioisótopos y sustancias fluorescentes, luminiscentes y cromogénicas, incluyendo partículas de color tales como oro coloidal o esferas de látex. Los inmunoensayos adecuados incluyen ensayos inmunoabsorbentes enlazados por enzima (ELISA).
De manera alternativa, el anticuerpo puede ser etiquetado de manera indirecta mediante una reacción con sustancias etiquetadas que tienen una afinidad para la ¡nmunoglobulina. El anticuerpo puede ser conjugado con una segunda sustancia y detectado con una tercera sustancia etiquetada que tiene una afinidad para la segunda sustancia conjugada para el anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser conjugado para biotina y el conjugado anticuerpo-biotina detectado utilizando avidita o estreptavidina. De manera similar, el anticuerpo puede ser conjugado para un haptén y el conjugado anticuerpo-haptén detectado utilizando anticuerpo anti-haptén etiquetado. Estos y otros métodos de etiquetado de anticuerpos y conjugados de ensayo son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. De acuerdo con la presente invención, se proporcionan también vacunas ya sea para inmunización activa o pasiva designada para tratar o proteger contra infecciones por estafilococo, y esas vacunas se pueden preparar a partir de las proteínas de superficie o sus regiones activas como se estableció antes utilizando un número de los métodos de preparación de vacuna convencionales Bine conocidos en este campo. En la vacuna típica, una cantidad inmunogénica de una proteína de superficie adecuada o fragmento activo de la misma se combina con un vehículo, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, y una cantidad de esta vacuna efectiva para inmunizar a un paciente humano o animal se puede administrar según sea adecuado. Por cantidad inmunogénica, alguien con experiencia en esta técnica comprendería que se hace referencia a cualquier cantidad de la proteína o fragmento activo o subregión de la misma que es capaz de elevar una respuesta inmunogénica en el paciente humano o animal. Además de las vacunas activas en donde los anticuerpos son generados en el paciente en virtud de la introducción o administración de una cantidad inmunogénica de una proteína o fragmento activo de acuerdo con la presente invención, los anticuerpos aislados de la presente invención, o fragmentos activos de los mismos, se pueden utilizar también en el desarrollo de vacunas para inmunización pasiva contra infecciones por estafilococo. En dicho caso, las composiciones de anticuerpo como se describieron antes, a saber una cantidad efectiva del anticuerpo y un vehículo, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, se pueden administrar según sea apropiado a un paciente humano o animal. En consecuencia, de acuerdo con la invención, las proteínas o fragmentos activos de las mismas se pueden utilizar como vacunas activas, y los anticuerpos de la invención se pueden utilizar como una vacuna pasiva que será útil para proporcionar anticuerpos adecuados para tratar o prevenir una infección por estafilococo. Como lo reconocería alguien con experiencia en esta técnica, una vacuna puede ser empacada para administración en un número de formas adecuadas, tales como administración parenteral (es decir, intramuscular, intradérmica o subcutánea) o administración nasofaríngea (es decir, intranasal). Uno de esos modos es cuando una vacuna es inyectada de manera intramuscular, por ejemplo dentro del músculo deltoides, aunque, el modo particular de administración dependerá de la naturaleza de la infección bacterial que se va a tratar y la condición del paciente. La vacuna se combina de manera preferible con un vehículo, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable para facilitar la administración y el portador es usualmente agua o una solución salina regulada en su pH, con o sin un conservador. La vacuna puede ser liofilizada para resuspensión en el momento de la administración o en solución. Además, en ciertos casos, los anticuerpos de la presente invención, pueden ser modificados según sea necesario de manera que, cuando lo es, se vuelven menos inmunogénicos en el paciente al que se le administran. Por ejemplo, si el paciente es un ser humano, el anticuerpo puede ser "humanizado" trasplantando las regiones determinantes complementarias del anticuerpo derivado del hibridoma en un anticuerpo monoclonal humano como se describe por ejemplo, en Jones et al., Nature 321:522-525 (1986) o Tempest et al., Biotechnology 9:266-273 (1991) o "ocultado" a través de cambio de los residuos de marco de murina expuestos superficiales en las regiones variables de ¡nmunoglobulina para imitar una contraparte de marco humano homologa como lo describe, por ejemplo, Parlan, Molecular Imm. 28:489-498 (1991), esas referencias que se incorporan a la presente mediante referencia. Además, cuando se desea, los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden ser administrados en conjunción con un antibiótico adecuado para mejorar en forma adicional la capacidad de las composiciones de la presente para luchar contra las infecciones bacteriales cuando sea necesario. Además de tratar pacientes humanos o animales, las composiciones de la presente también se pueden utilizar para detener o prevenir la infección de un dispositivo médico u otros biomateriales tales como un implante. Los dispositivos médicos o biomateriales poliméricos que se recubrirán con los anticuerpos, proteínas o fragmentos activos descritos en la presente incluyen, pero no se limitan a, grapas, suturas, válvulas cardíacas de reemplazo, dispositivos de apoyo cardíaco, lentes de contacto suaves y rígidos, implantes de lente infraocular (cámara anterior o cámara posterior), otros implantes tales como incrustación cornea, querato-prótesis, stents-vasculares, dispositivos de epiqueratofalia, derivadotes de glaucoma, grapas retínales, bridas para esclerótica, prótesis dentales, dispositivos tiroplásticos, dispositivos laringoplásticos, injertos vasculares, prótesis de tejido suave y duro que incluye, pero no se limita a, bombas, dispositivos eléctricos incluyendo estimuladores y registradores, prótesis auditivas, marcapasos, laringe artificial, implantes dentales, implantes mamarios, implantes penianos, tendones cráneo/faciales, articulaciones artificiales, tendones, ligamentos, meniscos y discos, huesos artificiales, órganos artificíales que incluyen páncreas artificiales, corazones artificiales, miembros artificiales y válvulas cardíacas; stents, cables, cables guía, catéteres intravenosos y venosos centrales, dispositivos de angioplastía láser y de balón, dispositivos cardíacos y vasculares (tubos, catéteres, balones), auxiliares ventriculares, componentes de diálisis sanguínea, oxigenadores de sangre, dispositivos uretrales/ureterales/urinarios (catéteres de Foley, stents, tubos y balones), catéteres de vías aéreas (tubos y dobleces endotraqueales y de traqueotomía), tubos de alimentación enteral (incluyendo tubos nasogástricos, intragástricos y yeyunales), tubos de drenado de herida, tubos utilizados para drenar las cavidades corporales tales como cavidades de la pleura, peritoneal, craneal y pericardial, bolsas para sangre, tubos de ensayo, tubos de recolección de sangre, recipientes al vacío, jeringas, agujas, pipetas, puntas de pipeta y tubería para sangre. Aquellos con experiencia en la técnica comprenderán que el término "recubierto" o "recubrimiento", como se usa en la presente, significa aplicar el anticuerpo o fragmento activo, o composición farmacéutica derivada del mismo, a una superficie de un dispositivo, de preferencia una superficie externa que estará expuesta a la infección bacterial por estafilococo. La superficie del dispositivo no necesita ser cubierta por completo por el anticuerpo de proteína o fragmento activo. La dosis de administración preferida de una composición de anticuerpo de acuerdo con la presente invención es aquella cantidad que será efectiva para prevenir o tratar una infección por estafilococo, y se reconocería fácilmente que esta cantidad variará dependiendo en gran medida de la naturaleza de la infección y la condición de un paciente. Como se indicó antes, una "cantidad efectiva" de anticuerpo agente farmacéutico para ser utilizado de acuerdo con la invención está destinada para representar una cantidad no tóxica aunque suficiente del agente, de manera que se produce efecto profiláctico o terapéutico deseado. Como se señalara a continuación, la cantidad exacta del anticuerpo o un agente particular que se requiere variará de un sujeto a otro, dependiendo de las especies, edad, y condición general del sujeto, la severidad de la condición que se trata, el portador o adyuvante particular utilizado y su modo de administración, y similares. En consecuencia, la "cantidad efectiva" de cualquier composición particular variará en base a las circunstancias particulares y, una cantidad efectiva apropiada puede ser determinada en cada caso de aplicación por alguien con experiencia en la técnica utilizando solamente experimentación de rutina. La dosis debe ser ajustada para adaptarse al individuo a quien se le administra la composición y variará con la edad, peso y metabolismo del individuo. Las composiciones pueden contener también estabilizadores o conservadores farmacéuticamente aceptables, tales como trimerosal (etil(2-mercaptobenzoato-S)sal sódica de mercurio)(Sigma Chemical Company, St. Louis, O). Cuando se usa con etiquetas adecuadas u otras biomoléculas o agentes químicos detectables, los anticuerpos monoclonales descritos en la presente son útiles para fines tales como diagnóstico in vivo e in vitro de infecciones por estafilococo o detección de bacterias de estafilococo. La investigación de laboratorio también se puede facilitar a través del uso de dichos anticuerpos. Varios tipos de etiquetas y métodos de conjugación de las etiquetas a los anticuerpos de la invención son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica, tales como los establecidos a continuación. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser conjugado (directamente o por medio de quelatacion) a una radioetiqueta tal como, aunque no restringido a, 32P, 3H, 14C, 35S, 125l, o 131l. La detección de una etiqueta puede ser a través de métodos tales como conteo por escintilación, espectrometría de rayos gama o autoradiografía. Las etiquetas bioluminiscentes, tales como derivados de luciferina de luciérnaga, también son útiles. La sustancia bioluminiscente está unida de manera covalente a la proteína través de métodos convencionales, y la proteína etiquetada es detectada cuando una enzima, tal como la luciferasa, cataliza una reacción con ATP ocasionando que la molécula bioluminiscente emita fotones de luz. Los fluorogenos también se pueden utilizar para etiquetar proteínas. Los ejemplos de fluorogenos incluyen fluoresceína y derivados, picoeritrina, alo-ficocianina, ficocianina, rodamina y Texas Red. Los fluorogenos son detectados de manera general por un detector de fluorescencia. La ubicación de un ligando en células se puede determinar etiquetando un anticuerpo como se describió antes y detectando la etiqueta de acuerdo con los métodos conocidos por alguien con experiencia en la técnica, tal como microscopía de inmunofluorescencia utilizando procedimientos tales como aquellos descritos por Warren et al. (Mol. Cell. Biol., 7: 1326-1337, 1987). Como se indicó antes, los anticuerpos monoclonales de la presente invención, o las porciones activas o fragmentos de las mismas, son particularmente útiles para interferir con la interacción física inicial entre un patógeno de estafilococo responsable de la infección y un anfitrión mamífero, y esta interferencia con la interacción física puede ser útil tanto en el tratamiento de pacientes como en la prevención o reducción de la infección bacterial o en dispositivos médicos internos para hacerlos más seguros para el uso.
En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un equipo que puede ser útil en el aislamiento e identificación de bacteria de estafilococo e infección el cual comprende los anticuerpos de la presente invención de una manera adecuada, tal como Iiofilizados en un recipiente individual los cuales se vuelven activos mediante la adición de una muestra acuosa que se supone que contiene las bacterias de estafilococo. Dicho equipo incluirá comúnmente un recipiente adecuado para alojar los anticuerpos de una manera adecuada junto con un reactivo de inmunodetección adecuado que permitirá la identificación de complejos que unen a las proteínas de superficie o los anticuerpos de la invención. En general, esos equipos pueden contener un anticuerpo de acuerdo con la invención y medios para identificar la unión de es anticuerpo cuando una muestra de un paciente es introducida al anticuerpo. Por ejemplo, un reactivo de inmunodetección adecuado puede comprender una señal o etiqueta detectable, tal como una biotina o una enzima que produce un color detectable, etc., la cual puede estar enlazada al anticuerpo o ser utilizadas de otras muchas formas a fin de proporcionar un resultado detectable cuando el anticuerpo se une al antígeno. En resumen, los anticuerpos de la presente invención que se reconocen y se unen a las proteínas de superficie de la invención, o fragmentos activos de las mismas, serán útiles por lo tanto en el tratamiento de una amplia variedad de infecciones por estafilococo en pacientes humanos y animales y en dispositivos médicos u otros internos. De acuerdo con la invención, debido a la naturaleza de esas proteínas y el hecho de que contienen epítopes en común con las proteínas del otro tipo de bacterias de estafilococo, es decir, una proteína a partir de un estafilococo coagulasa-negativo dará origen a anticuerpos que reconocen una proteína homologa a partir del S. aureus y viceversa, los anticuerpos de la invención exhibirán reactividad cruzada y serán efectivos contra una amplia gama de infecciones por estafilococo. En consecuencia, la presente invención proporciona métodos y composiciones para métodos mejorados para tratar o proteger contra una amplia variedad de infecciones por estafilococo.
EJEMPLOS
Se proporcionan los siguientes ejemplos que ejemplifican aspectos de las modalidades preferidas de la presente invención. Aquellos con experiencia en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes representan técnicas descubiertas por los inventores para funcionar de manera adecuada en la práctica de la invención, y por lo tanto se considerarán que constituyen los modos preferidos de su práctica. Sin embargo, aquellos con experiencia en la técnica, a la luz de la presente descripción, apreciarán que se pueden hacer muchos cambiasen las modalidades específicas que se describen y obtendrán aún un resultado idéntico o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.
Ejemplo 1. Aislamiento y Secuenciamiento de MSCRAMM's a partir de S. aureus
Se sabe que el Staphylococcus aureus expresa una clase de proteínas asociadas a superficie que juegan un roles importantes en la patogenicidad al permitir que las bacterias eviten las defensas del anfitrión y al actuar como adhesinas. Esas proteínas son conocidas como MSCRAMMs (Componentes de Superficie Microbiana que Reconocen Moléculas de Matriz Adhesiva) y en la mayoría de los casos son ancladas de manera covalente al peptidoglicano de la pared celular. Tienen varias características comunes: (i) un péptido de señal N-terminal (aproximadamente 40 residuos de longitud) requerido para secreción Sec-dependiente, (ii) un dominio que se extiende a la pared celular ya sea rico en residuos de prolina y glicina o compuestos de repeticiones de serina y dipéptido de aspartato, (iii) un motivo LPXTG requerido para anclaje covalente de la proteína al puente cruzado en el peptidoglicano, (iv) un dominio que se extiende a la membrana hidrofóbica seguido por (v) varios residuos cargados positivamente. Al explotar todas las secuencias de genoma de S. aureus, se identificaron ocho marcos de lectura abiertos que codifican proteínas con motivos de secreción y anclaje indicativos de MSCRAMMs (es decir que tienen un péptido de señal N-terminal y un motivo LPXTG C-terminal seguido por un dominio hidrofóbico y un extremo cargado positivamente). El siguiente Cuadro ilustra la lista de proteínas identificadas incluyendo su distribución entre genomas S. aureus, su tamaño de proteína y la secuencia de clasificación de pared celular C-terminal.
Nombre Distribución Tamaño C-término EkeS ENCSJ 2189 aa LPNTGSEENDLPL ELALITGAALLARRRS KKEKES DsqA ENCSJM -1363- LPDTGDSIKQNGLLGGVMTLLVGLGLMKR 2283 aa K KDENDQDDSQA KesK ENCSJM -909 aa LPKTGETTSSQSWWGLYALLGMLALFIPK FRKESK KrkN2 ENCSJM -278 aa LPKTGLTSVDN FISTVAFATLALLGSLSLLLF (Cowan) KRKESK KrkN ENCSJM -661 aa LPQTGEES KDMTLPLMALIALSSIVAFVLP RKRKN RkaS ENCSJM -801 aa LPKTGTNQSSSPEAMFVLLAGIGLIATVRR RKAS RrkN ENCSJM 1629 aa LP KTG LESTQKG Ll FSS 11 G I AG LM LLARRRK N KnkA ENCSJM 629 aa LPKAGETIKEHWLPI SViVGAMGVL I WLS RRNKLKNKA Ab reviaturas : Emrsa- 1 6 ; , 8325 ; C, CO L; S M SSA; J , N31 5 , M , Mu50. Seis d e ocho se conse rva ron e n los seis genomas de estafilococo actual me nte secuen ci ados y los dos resta ntes están p resentes en 5/6 d e esos g en omas .
La s ig u iente es u na lista de secuencias de AD N y proteína:
Ekes MRSA (SEQ ID NO:1) acaacacagcagagaatagacaaccaggaggaaaacgaaatgaatttgttaaagaaaaataaatatagtattag aaaatataaagtagggatattctctactttaatcgggacagttttattactttcaaacccaaatggtgcacaagctttaac tacggatcataatgtgcaaggtggttcaaatcaagcattacctggcaactcacaaaatacaaatgccgatactaatc gagacatagtaaatgattcgcaaaatactcctaatgcacatgcaacagacaatacatcaacaaatcaagcattgac taatcatcaaaacgttgatgtggcaaatcaagtcgggcctgctccaatacagcctagcgcgtcgcctgcgcaaaata ataataattctaatgctaattcaacagcaacagagccagcggcgaatacaaataataatttagcatcaaataacaat acattaaacgtgcctaataatacagataacaatgattcagcgcgtcatctgactttaaaagaaattcaagaagatgtt cgtcattcgtctgataagccagagttagttgcgattgctgaagaagcatctaatagacc¾aaaa¾gagaágdagác gtgctgcgccaacagatcctaatgcaacaccagcagatccaacggctacaccagcagatccaacggcaggaaat ggtagtgcaccagttgcaattacagcgccatacacgccaacaactgatcccaatgccaataatataggacaaaatg cacctaacgaagtgctttcatttgatgataacaacattagaccaagtacgaaccgttcígígcctacagíaactgítgtt gataatttaccaggctacacactgattaatggtggtaaagtaggggtgtttagtcatgcaatggtaagaacgagcatgt 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Análisis de estructura primaria:
Se utilizó un enfoque bioinformática para la estructura primaria y el pronóstico de función (Figura 1). Las proteínas RrkN y DsqA poseían una organización estructural similar a los MSCRAMMs descritos con anterioridad. RrkN es similar en estructura a las proteínas Pls/Aap de S. aureus y S. epidermis, respectivamente. Contienen un dominio de residuo-200 en su término-N que muestra 40% de identidad para Pls y Aap. El término-C de la proteína está compuesto de manera predominante de un dominio de repetición de residuo 128, el cual varía en los números de repeticiones de una cepa a otra. Esas repeticiones también están presentes en Pls y Aap. Un homólogo sar putativo y fnbpA y fnbpB se ubican directamente corriente arriba desde RrkN en el genoma. DsqA es similar en organización estructural a la familia de proteínas Sdr. Contiene un dominio A típico seguido por un motivo TYYFTDVK que es similar a un motivo TYTFTVYVD encontrado en todas las proteínas Sdr. La función de este motivo aún no se ha determinado. Dos dominios de repetición 88 residen en el centro de la proteína seguidos por un motivo de repetición-SX C-terminal similar al motivo de repetición-SD encontrado en las proteínas Sdr. El tamaño de esta repetición varía de una cepa a otra. DsqA se ubica cerca de secY y secA en el genoma. Un homólogo DsqA (>90% idéntico) se encuentra también en S. epidermis. KnkA no contiene dominios de repetición en su secuencia. El análisis de pronóstico de estructura secundaria indica que esta proteína está compuesta de manera predominante de hélices alfa. RkaS no contiene dominios de repetición en su secuencia. El análisis BLAST indica que es similar a una 5' nucléotidasa UDP-hidrolaza de azúcar. El gen que codifica RkaS se ubica directamente corriente arriba del marco de lectura abierto orfX, el sitio de inserción del elemento mee. Kesk contiene dos dominios de repetición de residuo 140 en el término-N de la proteína que son 38% idénticos. El análisis de gráfica de hidropatía (Kyte y Doolittle, 1982)indica que existe un dominio hidrofílico grande en el centro de la proteína (residuo 500-560). EkeS contiene dos dominios de repetición de residuo 300 en el centro de la proteína que son 38% idénticos. El análisis Blast indica que el término-N de la proteína (residuos 1-1268), que tienen ambas repeticiones) es 49% idéntico a FmtB, una proteína LPXTG con 17 repeticiones tándem. FmtB está propuesto para estar involucrado de manera indirecta en la resistencia a la meticilina como inactivación de fmtB que elimina la resistencia a la meticilina. Esto parece deberse a que afecta la composición de la pared celular ya que la sensibilidad a la meticilina puede disminuirse a través del incremento de la producción del glucosamin-1 -fosfato precursor de pared celular (Komatsuzawa et al., 2000). KrkN y KrkN2 colindan uno con el otro en el genoma.
Análisis de expresión:
Debido a la falta de homología de la secuencia con las bases de datos de proteínas, una función putativa para cada una de esas proteínas podría no ser pronosticada y por lo tanto se tomaría un enfoque molecular. Las regiones únicas de cuatro de los orfs se expresaron en E.coli como proteínas de fusión etiquetadas-his recombinantes que utilizan el sistema de expresión Qiagen pQE-30. La figura 2 representa un gel SDS-PAGE teñido con Coomassie de las proteínas de fusión etiquetadas-his N-terminal purificadas. Las proteínas recombinantes RrkN1, DsqA2, KesK1 y KnkA se utilizaron para generar anticuerpos en conejos. El análisis de tinción Western de extractos de pared celular de S. aureus revelaron que KeskA, KnkA y DsqA están expresados y asociados con la pared celular (Figura 3). La epa eMRSA-16 representa una cepa n/cA-negativa ya que carece del gen knkA. Una banda inmunoreactiva de 65kDa reacciona con la fracción de pared celular a partir de células de fase exponencial y estacionaria de la cepa 8325-4 (Figura 3, B). La ausencia de esta banda en la cepa eMRSA-16 sugiere que representa el producto de gen de knkA. La inmunotinción Western de la fracción de pared celular de la cepa 8345-4 que utiliza los anticuerpos anti-KesK identificó una banda inmunoreactiva 150kDa tanto en los cultivos de fase exponencial como estacionaria. Una proteína inmunoreactiva dimensionada similar liberada desde la fracción de pared celular de Lactococcus lactis que expresa la longitud completa KesK en un plásmido de expresión (pKS80) sugiere que la banda 150 kDa representa el producto de gen kesK (datos no mostrados). Un muíante ¡nactivado kesK en S. aureus se requeriría para confirmar el tamaño de la proteína KesK liberada de la pared celular. La inmunotinción Western de la fracción de pared celular de la cepa MSSA S. aureus y eMRSA-16 utilizando anticuerpos anti-DsqA identificó una banda inmunoreactiva 130kDa. Los niveles de expresión son superiores en las células de fase estacionaria.
Expresión Heteróloga en Lactococcus lactis
La expresión heteróloga de proteínas de superficie de S.
aureus en Lactoccocus lactis (L. lactis) se ha utilizado previamente como una herramienta para estudiar la función proteína (Sinha et al., 2000). En este estudio este sistema surrogate se utilizará para expresar cada uno de los MSCRAMMs pronosticados en sílice sobre la superficie del L. lactis para buscar una función. KesK y KnkA se han clonado en L. lactis y mostrado mediante tinción dot para ser expresados en superficie (figura 4). No se observó reacción cruzada con el control negativo (pKS80 plásmido sin un inserto) indicando que es una reacción específica. La pared celular y las fracciones de protopíasto de Lactococcus lacti que tienen pKS-KmkA y pKS-KesK se generaron mediante digestión de células con lizozima y mutanolisina y se usan en estudios de tinción Western empleando anticuerpos anti-KnkA y anti-KesK, respectivamente. A diferencia de lo que se observó en S. aureus, KnkA no se detectó en la fracción de pared celular de L. lactis aunque se encontró asociado con la función protopíasto. El motivo de anclaje de KnkA difiere de la secuencia LPXTG de consenso en que contiene un residuo de Alanina en vez de una Treonina (es decir, LPKAG) (Cuadro 1). Recientemente se ha publicado que el S. aureus contiene dos genes de sortase, srtA y srtB (Pallen, 2001). Es posible que esta forma variante del motivo LPXTG sea procesado por medio del segundo gen de sortase, el cual está ausente en L. lactis. Esto también explicaría el ligero incremento en tamaño de la proteína KnkA observada en la fracción de protopíasto, ya que la señal de clasificación de pared celular no había sido adherida.
KesK se detectó en la fracción de pare celular del L. lactis aunque migró en un peso molecular menor que la proteína KesK liberada desde la pared celular de S. aureus. La mayoría de los MSCRAMMs expresados en la superficie de L. lactis están propensos a proteólisis durante el procedimiento de extracción de la pared celular (Louise O'Brien, comunicado personal). Por lo tanto, es posible que la proteína KesK liberada desde la superficie del L. lactis represente una forma truncada de KesK. Los menores tiempos de digestión con lisozima y mutanolisina han demostrado que limitan la extensión de la proteólisis.
Expresión de MSCRAMMs pronosticados en sílice in vivo:
El suero de fase convaleciente de 33 pacientes que se recuperan de infecciones por S. aureus fue probado para su capacidad para reconocer las proteínas de fusión etiquetadas-his N-terminales en una prueba ELISA. El suero recolectado de niños y donadores de sangre sanos se utilizó como controles negativos. Se tomó una reacción positiva como valor igual a o mayor que dos veces el valor del control negativo. Las figuras 5A-5D ilustran que todas las proteínas fueron reconocidas en 27-42% de los pacientes sugiriendo que esas proteínas son expresadas in vivo y son inmunogénicas durante la infección del anfitrión.
Referencias:
Komatsuzawa, H., Ohta, K., Sugai, M., Fujiwara, T., Glanzmann, P., Berger-Bachi , B., Suginaka, H., (2000) Tn551-mediated insertional inactivation of the fmtB gene encoding a cell wall-associated protein abolishes methicillin resistance in Staphylococcus aureus. J. Antimicrob. Chemother. 45:421-31. Sinha, B., Francois, P., Que, Y. A., Hussain, . , Heilmann, C, Moreillon, P., Lew, D., Krause, K. H., Peters, G., Herrmann, M. (2000) Heterologously expressed Staphylococcus aureus fibronectin-binding proteins are sufficient for invasión of host cells. Infect. Immun. 68:6871-6878.
Pallen, M.J., Lam, A.C. Antonio, M., Dunbar, K. (2000) An embarrassment of sortases-a richness of substrates? Trends. Microbio!. 9:97-101.
Ejemplo 2. Aislamiento y Secuenciamiento de Proteínas de Reacción Cruzada a partir de S. Aureus y a partir de Estafilococos coagu lasa-Negativos
Recientemente se ha demostrado que S. epidermis contiene proteínas de superficie estructuralmente relacionadas con proteínas MSCRAMM® de S. aureus (US 09/386,962). Una proteína a partir de S. aureus es de particular interés ya que tiene un homólogo cercano en S. epidermis. La proteína se llama DsqA o SasA (S. aureus) y DgsK (S. epidermis). Están caracterizadas por un dominio "A" típico de aproximadamente 500 residuos de aminoácido, seguidos por dos repeticiones B de 88 residuos que son -40% idénticos, y una repetición de dipéptido SXSX única que puede variar en longitud dependiendo de la cepa. Contenido dentro del dominio A del S. aureus DsqA/SasA es una región de residuo 180 que tiene -40% de identidad a un dominio dimensionado similar dentro de la región A de las proteínas S. aureus RrkN, Pls y proteína S. epidermis Aap. Las regiones A de las proteínas DsqA/SasA y DgsK son 46% idénticas en el nivel de amino ácido, las repeticiones BB son 50% idénticos. Las estrategias de inmunización activa y pasiva que incluyen; vacunas, anticuerpos policlonales y monoclonales que reconocen tanto S. aureus y proteínas de estafilococo coagulasa-negativos son el sujeto de esta invención.
Ejemplos Específicos de Anticuerpos que Reaccionan de Manera Cruzada con Estafilococos Coagulasa-Negativos y S. aureus.
Dominio-A DgsK de estafilococo coagulasa-negativo: Secuencia de Aminoácido (SEQ IDNO: 17) ASETPITSEISSNSETVANQNSTTIKNSQKETVNSTSLESNHSNSTNKQMSSEVTN
TAQSSEKAGISQQSSETSNQSSKLNTYASTDHVESTTINNDNTAQQDQNKSSNVT
SKSTQSNTSSSEKNISSNLTQSIET ATDSLATSEARTSTNQISNLTSTSTSN.QSSP
TSFANLRTFSRF LNTI^PmSTTTTSSLTSNSVWNKDNFNEHMNLSGSATY
DPKTGIATLTPDAYSQKGAISLNTRLDSNRSFRFIGKVNLGNRYEGYSPDGVAGGD
GIGFAFSPGPLGQIGKEGAAVG1GGLNNAFGFKLDTYHNTSTPRSDAKAKADPRN
VGGGGAFGAFVSTDRNGMATTEESTAAKLNVQPTDNSFQDFVIDYNGDTKVMTV tYAGQTFTRNLTDWIKNSGGTTFSLSMTASTGGAKNLQQVQFGTFEYTESAVAj ¿_
RWDANTGKDIIPPKTIAGEVDGWNIDKQLNNFKNLGYSWGTDALKAPNYTETSG
TPTLKLTNSSQTVIYKFKDVQ
S. aureus SasA A-domain: Amino Acid Sequence (SEQ ID N0:18) ASDAPLTSELNTQSETVGNQNSTTIEASTSTADSTSVTKNSSSVQTSNSDTVSSEK
SEKVTSTTNSTSNQQE LTSTSESTSSKNTTSSSDT SVASTSSTEQPINTSTNQS - TASNNTSQSTTPSSVNLNKTSTTSTSTAPVKLRTFSRLAMSTFASAATTTAVTANTI
TVNKDNLKQY TTSGNATYDQSTGIVTLTQDAYSQKGAITLGTRIDSNKSFHFSGK
VNLGNKYEGHGNGGDGIGFAFSPGVLGETGLNGAAVGIGGLSNAFGFKLDTYHNT
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NNTFQDFD!NYNGDTKVMTVKYAGQTWTRNISDWIAKSGTTNFSLS TASTGGAT
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KGYNYTSVDSSYASTYNDTN TVKMTNAGQSVTYYFTDW
A continuación se muestran la secuencia completa de proteína Aap y la codificación de ADN de la misma (con indicación de la presencia del dominio A):
Proteína Aap de S. epidermis (dominio-A subrayado) (SEQ ID NO:19)
S. epidermidis Aap Protein (A-domain underlined) (SEQ ID N0:19)
MGKRRQGPINKKVDFLPNKLN YSIRKFTVGTASILLGSTLIFGSSSHEAKAAEEKQ
VDPITQANQNDSSERSLENTNQPTVNNEAPQMSSTLQAEEGSNAEAPQSEPTKA
EEGGNAEAAQSEPTKAEEGGNAEAPQSEPTKAEEGGNAEAAQSEPTKTEEGSNV
KAAQSEPTKAEEGSNAEAPQSEPTKTEEGSNAKAAQSEPTKAEEGGNAEAAQSE
PTKTEEGSNAEAPQSEPTKAEEGGNAEAPQSEPTKTEEGGNAEAPNVPTIKANSD
NDTQTQFSEAPTRNDLARKEDIPAVSKNEELQSSQPNTDSKIEPTTSEPVNLNYSS
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TGE VGEGEPTEKITKQPVDEIVHYGGEEIKPGHKDEFDPNAPKGSQTTQPGKPG
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EPGKPAEPGTPAEPGKPAESGKPVEPGTPAQSGAPEQPNRSMHSTDNKNQLPD
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S. epidermidis aap DNA (SEQ ID NO:20) atgggcaaac gtagacaagg tcctattaat aaaaaagtgg MG RRQGPINKKVDFLPNKLN YSIRKFTVGTASILLGSTLIFGSSSHEAKAAEEKQ
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EPGTPAEPGKPAEPGKPAEPGKPAEPGKPAEPGTPAEPGTPAEPGKPAEPGTPA
EPG PAEPGTPAEPG PAESGKPVEPGTPAQSGAPEQPNRSMHSTDNKNQLPD
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S. epidermidis aap DNA (SEQ ID NO:20) atgggcaaac gtagacaagg tcctattaat aaaaaagtgg
attttttacc taacaaatta aacaagtatt ctataagaaa attcactgtt ggtacggcct caatattact tggttcgaca cttatttttg gaagtagtag ccatgaagcg aaagctgcag aagaaaaaca agttgatcca attacacaag ctaatcaaaa tgatagtagt gaaagatcac íígaaaacac aaatcaacct actgtaaaca atgaagcacc acagaígtct tctacattgc aagcagaaga aggaagcaat gcagaagcac ctcaatctga gccaacgaag gcagaagaag gaggcaatgc agaagcagct caatctgagc caacgaaggc agaagaagga ggcaatgcag aagcacctca atctgagcca acgaaggcag aagaaggagg caaígcagaa gcagctcaat ctgagccaac gaagacagaa gaaggaagca acgtaaaagc agctcaatct gagccaacga aggcagaaga aggaagcaat gcagaagcac ctcaatctga gccaacgaag acagaagaag gaagcaacgc aaaagcagct caatctgagc caacgaaggc agaagaagga ggcaatgcag aagcagctca atctgagcca acgaagacag aagaaggaag caatgcagaa gcacctcaat ctgagccaac gaaggcagaa gaaggaggca atgcagaagc acctcaatct gagccaacga agacagaaga aggaggcaat gcagaagcac cgaatgttcc aactatcaaa gctaattcag ataatgatac acaaacacaa ttttcagaag cccctacaag aaatgaccta gctagaaaag aagatatccc tgctgtttct aaaaacgagg aattacaatc atcacaacca aacactgaca ^ gtaaaataga acctacaact tcagaacctg tgaatttaaa ttatagttct ccgtttatgt ccttattaag catgcctgct gatagttcat ccaataacac taaaaataca atagatatac cgccaactac ggttaaaggt agggataatt acgattttta cggtagagta gatatcgaaa gtaatcctac agatttaaat gcgacaáatt taacgagata taattatgga cagccacctg gtacaacaac agctggtgca gttcaattta aaaatcaagt tagttttgat aaagatttcg actttaacat tagagtagca aacaatcgtc aaagtaatac aactggtgca gatggttggg ^¾ gctttatgtt cagcaagaaa gatggggatg atttcctaaa aaacggtggt atcttacgtg aaaaaggtac acctagtgca gctggtttca gaattgatac aggatattat aataacgatc cattagataa aatacagaaa caagctggtc aaggctatag agggtatggg acatttgtta aaaatgactc ccaaggtaat acttctaaag taggatcagg tactccatca acagattttc ttaactacgc agataatact actaatgatt tagatggtaa attccatggt caaaaattaa ataatgttaa tttgaaatat aatgcttcaa atcaaacttt tacagctact tatgctggta aaacttggac ggctacgtta tctgaattag gattgagtcc aactgatagt tacaattttt tagttacatc aagtcaatat ggaaatggta atagtggtac atacgcaagt ggcgttatga gagctgattt agatggtgca acattgacat acactcctaa agcagtcgat ggagatccaa ttatatcaac taaggaaata ccatttaata agaaacgtga atttgatcca aacttagccc caggtacaga aaaagtagtc caaaaaggtg aaccaggaat tgaaacaaca acaacaccaa cttatgtcaa tcctaataca ggagaaaaag ttggcgaagg tgaaccaaca gaaaaaataa caaaacaacc agtggatgaa atcgttcaft atggtggcga agaaatcaag ccaggccata aggatgaatt tgatccaaat gcaccgaaag gtagtcaaac aacgcaacca ggtaagccgg gggttaaaaa tcctgataca ggcgaagtag ttactccacc tgtggatgat gtgacaaaat atggtccagt tgatggagat ccgatcacgt caacggaaga aattccattc gacaagaaac gtgaattcaa tcctgattta aaaccaggtg aagagcgtgt taaacaaaaa ggtgaaccag gaacaaaaac aattacaaca ccaacaacta agaacccatt aacaggggaa aaagttggcg aaggtgaacc aacagaaaaa ataacaaaac aaccagtaga tgaaatcaca gaatatggtg gcgaagaaat caagccaggc cataaggatg aatttgatcc aaatgcaccg aaaggtagcc aagaggacgt tccaggtaaa ccaggagtta aaaaccctgg aacaggcgaa gtagtcacac caccagtgga tgatgtgaca aaatatggtc cagttgatgg agatccgatc acgtcaacgg aagaaattcc attcgacaag aaacgtgaat tcaatcctga tttaaaacca ggtgaagagc gcgttaaaca gaaaggtgaa ccaggaacaa aaacaattac aacgccaaca actaagaacc cattaacagg agaaaaagtt ggcgaaggtg aaccaacaga aaaaataaca aaacaaccag tggatgagat tgttcattat ggtggtgaac aaataccaca aggtcataaa gatgaatttg atccaaatgc acctgtagat agtaaaactg aagttccagg taaaccagga gttaaaaatc ctgatacagg tgaagttgtt accccaccag tggatgatgt gacaaaatat ggtccagttg atggagattc gattacgtca acggaagaaa ttccgtttga taaaaaacgc gaatttgatc caaacttagc gccaggtaca gagaaagtcg ttcaaaaagg tgaaccagga acaaaaacaa ttacaacgcc aacaactaag aacccattaa caggagaaaa agttggcgaa ggtaaatcaa cagaaaaagt cactaaacaa cctgttgacg aaattgttga gtatggtcca acaaaagcag aaccaggtaa accagcggaa ccaggtaaac cagcggaacc aggtaaacca gcggaaccag gtacgccagc agaaccaggt aaaccagcgg aaccaggtac gccagcagaá ccaggtaaac cagcggaacc aggtaaacca gcggaaccag gtaaaccagc ggaaccaggt aáaccigcgg-' aaccaggtac gccagcagaá ccaggtacgc cagcagaacc aggtaaacca gcggaaccag gtacgccagc agaaccaggt aaaccagcgg aaccaggtac gccagcagaá ccaggtaaac cagcggaatc aggtaaacca gtggaaccag gtacgccagc acaatcaggt gcaccagaac aaccaaatag atcaatgcat tcaacagata ataaaaatca attacctgat acaggtgaaa
D o m i n i o -A a p a rt i r de S. epidermis Aap ( am i n o áci d os 55-600)
(S EQ I D NO : 21 ) atcgtcaagc taatgaggga acttlagtcg gatctctatt agcaattgtc ggatcattgt tcatatttgg tcgtcgtaaa aaaggtaatg aaaaataatt tcatataaaa actttctgcc attaa
A-Domain from S. epidermidis Aap (amino acids 55-600) (SEQ ID NO:21) 55EKQVDPITQANQNDSSERSLENTNQPTVNNE=APQMSSTLQAEEGSNAEAPQSE
PT AEEGGNAEAAQSEPTKAEEGGNAEAPQSEPTKAEEGGNAEAAQSEPTKTEE
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Producción y Purificación de Proteína
Utilizando PCR, el dominio A de DgsK o SasA se amplificó a partir de las secuencias antes descritas y subcionadas dentro del vector de expresión de E. coli PQE-30 (Qiagen), que permite la expansión de una proteína de fusión recombinante que contiene seis residuos de histidina. Este vector fue transformado de manera subsecuente en una cepa E. coli ATCC 55151, cultivada en un fermentador de 15 litros hasta una densidad óptica (OD600) de 0.7 e inducida con 0.2 mM isopropil-1 -beta-D galactosida (IPTG) durante 4 horas. Las células fueron cultivadas utilizando un ensamble de fibra hueca de AG Technologies (tamaño de poro de 0.45 Dm) y la pasta celular congelada a -80°C. Las células fueron sometidas a lisis en 1X PBS (10 mL de regulador de pH/1 g de pasta celular) utilizando 2 pasadas a través de la French Press @ 1100 psi (77.33 kg/cm2). Las células sometidas a lisis fueron giradas a 17,000 rpm durante 30 minutos para remover los desechos celulares. El sobrenadante fue pasado sobre una columna de Quelatacion Hi-Trap de 5-mL cargada con 0.1M N¡CI2. Después de la carga, la columna fue lavada con 5 volúmenes de columna de 10mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCI (Regulador de pH A), la proteína fue eluida utilizando un gradiente 0-100% de 10m Tris, pH 8.0, 100 mM NaCI, 200 mM de ímidazoí (Regulador pH B) sobre 30 volúmenes de columna. SdrGN1N2N3 o SdrGN2N3 eluidos a -13% Regulador de pH B (~26mM imidazol). Se monitoreo la absorbancia a 280nm. Las fracciones que contienen SdrGN 1 N2N3 o SdrGN2N3 se dializaron en 1x PBS. Cada proteína fue colocada a través de un protocolo de remoción de endotoxina. Los reguladores de pH utilizados durante este protocolo se hicieron libres de endotoxina al pasar sobre una columna de Mono-Q sefarosa de 5-mL (Pharmacia). La proteína se dividió de manera uniforme entre tubos 4x 15mL. El volumen de cada tubo se llevó hasta 9mL con el Regulador de pH A. Se agregó 1mL de Tritón X-114 al 10% a cada tubo y se incubó con rotación durante 1 hora a 4°C. Los tubos fueron colocados en un baño de agua a 37°C para separar las fases. Los tubos fueron girados a 2,000 rpm durante 10 minutos y la fase acuosa superior de cada tubo se recolectó y se repitió la extracción de detergente. Las fases acuosas a partir de la 2da extracción se combinaron y pasaron sobre una columna de quelatación IDA 5-mL (Sigma), cargada con 0.1M N¡CI2 para remover el detergente remanente. La columna fue lavada con 9 volúmenes de columna de Regulador de pH A antes de fluir la proteína con 3 volúmenes de columna del Regulador de pH B. El eluyente fue pasado sobre una columna Detoxigel 5-mL (Sigma) y el flujo de paso recolectado y reaplicado a la columna. El flujo de paso de la segunda pasada fue recolectado y dializado en 1x PBS. El producto purificado fue analizado para concentración, pureza y nivel de endotoxina antes de la administración en los ratones.
Producción de Anticuerpo Monoclonal
El E. coll expresado y las proteínas SasA y DsgK recombinantes purificadas se utilizaron para generar un panel de anticuerpos monoclonales de murina en tanto que el suero de ratón se utilizó como una fuente de anticuerpos policlonales. En resumen, un grupo de ratones Balb/C o SJL recibieron una serie de inmunizaciones subcutáneas de 1-10 mg de proteína en solución o mezcladas con adyuvante como se describió en el Cuadro a continuación.
Esquemas de Inmunización
Inyección RIMMS Día Cantidad^q) Ruta Adyuvante
#1 0 5 Subcutánea FCA/RIBI
#2 2 1 Subcutánea FCA/RIBI
#3 4 1 Subcutánea FCA/RIBI
#4 7 1 Subcutánea FCA/RIBI
#5 9 1 Subcutánea FCA/RIBI
Inyección Convencional Día Cantidad^q) Ruta Adyuvante
Primaria 0 5 Subcutánea FCA lmpulsor#1 14 1 Intraperitoneal RIBI lmpulsor#2 28 1 Intraperitoneal RIBI lmpulsor#3 42 1 Intraperitoneal RIBI
En el momento del sacrificio (RIMMS) o siete días después de un impulsor (convencional) se recolectó el suero y se tituló en pruebas ELISA contra proteínas MSCRAMM® o sobre células completas (S. epidermis y S. aureus). Tres días después del impulsor final, los bazos o nodos linfáticos fueron removidos, se desmenuzaron en una sola suspensión celular y se cultivaron los linfocitos. Los linfocitos se fusionaron después a la línea celular de mieloma P3X63Ag8.653 (ATCC #CRL-1580). La fusión celular, la colocación en placas posterior y la alimentación se ejecutaron de acuerdo con el protocolo de Producción de Anticuerpos Monoclonales a partir de Current Protocols in Immunoloqy (Capitulo 2, Unidad 2).
Cualesquiera clones que fueron generados a partir de la fusión fueron tamizados para producción de anticuerpo anti-SasA específico utilizando una prueba ELISA estándar. Los clones positivos fueron expandidos y probados de manera adicional para actividad en un ensayo de unión celular bacterial a través de citometría de flujo y unión SasA mediante análisis Biacore.
Análisis Biacore
A través del análisis, la velocidad de flujo permaneció constante a 10 ml/min. Antes de la inyección e SasA o DgsK, el anticuerpo de prueba fue adsorbido hacia el fragmento por medio de enlace RAM-Fc. En el momento 0, SasA o DgsK a una concentración de 30 mg/mL se inyectó sobre el fragmento durante 3 minutos seguido por 2 minutos de disociación. Esta fase del análisis midió la asociación relativa y la cinética de disociación de la interacción Mab/SasA o DgsK.
Enlace a Bacteria Completa
Las muestras bacteriales S. aureus Newman, S. aureus 67-0, S. aureus 397 (Sal6), S. aureus Wood, S. aureus 8235-4, S. aureus MRSA 16 resistente a meticilina, S. epidermis ATCC 35984, S. epidermis HB, S. epidermis CN-899 y S. haemolyticus ATCC 43253 fueron recolectadas, lavadas e incubadas con Mab o PBS solo (control) a una concentración de 2 µ9/??? después del bloqueo con IgG de conejo (50 mg/ml). Después de la incubación con anticuerpo, las células bacteriales fueron incubadas con Cabra-F (ab')2~Anti-Ratón-F(ab')2-FITC que sirvió como el anticuerpo de detección. Después del etiquetado de anticuerpo, las células bacteriales fueron aspiradas a través del citómetro de flujo calibre FACS para analizar la emisión de fluorescencia (excitación: 488, emisión: 570). Para cada cepa bacterial, se recolectaron y midieron 10,000 eventos. Esos datos indican que los anticuerpos contra S. aureus SasA fueron capaces de reconocer una proteína homologa sobre la superficie de estafilococos coagulasa-negativos. Los datos soportan el análisis de tinción Western que demuestra que los anticuerpos policlonales de conejo contra S. aureus SasA reaccionan de manera cruzada con una proteína liberada desde la superficie de la célula de S. epidermis HB así como la región-A recombinante a partir de DsgK clonada a partir de S. epidermis (ver Cuadro a continuación y figura 6).
Reactividad de Sueros Policlonales
397 Wood 8325 MRS ATC ATC
New 67- (SAL 46 -4 A C HB CN- C man 0 6) 16 3598 899 4325 4 3
Sueros - - - - - - - - - -de Ratón Normal SasA + + + /- + + + + + + anti- Ratón
Claims (23)
1. Un anticuerpo aislado que se une a una proteína de superficie de estafilococo seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NOS. 2, 4, 6, 8, 01, 12, 14, 16, 17, 18, 19 y 21.
2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es cultivado contra el dominio A de la proteína de superficie.
3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo trata o previene infección por S. aureus en un ser humano o animal.
4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es adecuado para administración oral, intranasal, subcutánea, en aerosol o intravenosa en un ser humano o animal.
5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es de un tipo seleccionado a partir del grupo que comprende de anticuerpos monoclonales de murina, quiméricos, humanizados y humanos.
8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de cadena simple.
9. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque que comprende un fragmento de anticuerpo que tiene la misma especificidad de enlace de un anticuerpo que se enlaza a una proteína de superficie de estafilococo que tiene la secuencia seleccionada a partir del grupo que consta de SEQ ID NOS. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 17, 18, 19 y 21.
10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es cultivado contra una proteína que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consta de SEQ ID NOS. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 17, 18, 19 y 21.
11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de superficie tiene una secuencia de amino ácido codificada por una secuencia de ácido nucléico seleccionada a partir del grupo que comprende secuencias de ácido nucléico SEQ ID NOS. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20 y las secuencias de ácido nucléico que codifican para el dominio A de la proteína Aap o degenerados de la misma.
12. Antisuero aislado que contiene un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1.
13. Un equipo de diagnóstico que comprende un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 y medios para detectar el enlace de ese anticuerpo:
14. Un equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque dichos medios para detectar el enlace comprenden una etiqueta detectable que está unida a dicho anticuerpo.
15. Un método para diagnosticar una infección de S. aureus que comprende agregar un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 a una muestra que se sospecha está infectada con S. aureus, y determinar si los anticuerpos se han enlazado a la muestra.
16. Una composición farmacéutica para tratar o prevenir una infección de S. aureus que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 y un vehículo, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
17. Un método para tratar o prevenir una infección de S. aureus que comprende administrar a un paciente humano o animal una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1.
18. Un método para inducir una respuesta inmunológica que comprende administrar a un ser humano o animal una cantidad inmunogénica de una proteína aislada seleccionada a partir de las secuencias de amino ácido SEQ ID NOS. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 17, 18, 19 Y 21.
19. Un anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1, que tiene la habilidad para enlazarse a una secuencia de amino ácido codificada por la secuencia de ácido nucléico de SEQ ID NOS. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20 y las secuencias de ácido nucléico que codifican para el dominio A de la proteína Aap o degenerados de la misma.
20. Un fragmento activo aislado a partir del dominio A de la proteína DsqA.
21. Un anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1 que comprende además un antibiótico fisiológicamente aceptable.
22. Una vacuna para tratar o prevenir una infección de S. aureus que comprende una cantidad de una secuencia de proteína seleccionada a partir del grupo que comprende SEQ ID NOS. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 17, 18, 19 y 21 en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune, y un vehículo, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
23. Una composición farmacéutica para tratar o prevenir una infección de S. aureus que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 y un vehículo, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. 17. Un método para tratar o prevenir una infección de S. aureus que comprende administrar a un paciente humano o animal una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1. 18. Un método para inducir una respuesta inmunológica que comprende administrar a un paciente humano animal una cantidad inmunogénica de una proteína aislada seleccionada a partir del grupo que comprende las secuencias de amino ácido SEQ ID NOS. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 17, 18 , 19 y 21. 19. Un anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1, que tiene la capacidad para enlazarse a una secuencia de amino ácido codificada por la secuencia de ácido nucléico de SEQ ID NOS. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20 y las secuencias de ácido nucléico que codifican para el dominio A de la proteína Aap o degenerados de la misma. 20. Un fragmento aislado activo a partir del dominio A de la proteína DsqA. 21. Un anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1, que comprende además un antibiótico farmacéuticamente aceptable. 22. Una vacuna para tratar o prevenir una infección de S. aureus que comprende una cantidad de una secuencia de proteína seleccionada a partir del grupo que comprende SEQ ID NOS. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 17, 18, 19 y 21 en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune, y un vehículo, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
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