DE60129877T2 - Amino acid-producing Escherichia strains and process for producing an amino acid - Google Patents

Description

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Gebiet der ErfindungField of the invention

Die vorliegende Erfindung betrifft die Biotechnologie und genauer gesagt ein Verfahren zum Herstellen von Aminosäuren durch Fermentation unter Verwendung eines Aminosäure produzierenden Bakteriums der Gattung Escherichia, welches Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle verwerten kann.The The present invention relates to biotechnology, and more particularly a method for producing amino acids by fermentation under Use of an amino acid producing bacterium of the genus Escherichia, which is sucrose as the sole source of carbon.

Beschreibung des Standes der TechnikDescription of the state of technology

Saccharose und Saccharose enthaltende Substrate (beispielsweise Melasse) werden oft als Ausgangspunkt für die mikrobielle Produktion von kommerziellen Produkten, wie Aminosäuren, Vitaminen und organischen Säuren, eingesetzt. Die Verfahren zum Herstellen von Aminosäuren aus Kohlenhydraten dienen der Maximierung der Effizienz, mit der das Kohlenstoffskelett von Kohlenhydraten in ein gewünschtes Produkt umgewandelt wird.sucrose and sucrose-containing substrates (e.g., molasses) often as a starting point for the microbial production of commercial products, such as amino acids, vitamins and organic acids, used. The methods for producing amino acids Carbohydrates serve to maximize the efficiency with which the Carbon skeleton of carbohydrates converted into a desired product becomes.

Die Mehrheit der Saccharose-positiven Bakterien bewerkstelligen die Aufnahme und die Phosphorilierung von Saccharose durch ein Phosphoenolpyruvat-abhängiges Saccharose-6-Phosphotransferasesystem (Saccharose-PTS), wobei intracelluläres Saccharose-6-phosphat erhalten wird. Dieses Phosphat wird durch Saccharose-6-phosphathydrolase (Invertase oder Sucrase) in D-Glucose-6-phosphat und D-Fructose hydrolysiert, welche ihrerseits durch eine ATP-D-Fructose-6-phosphatphosphotransferase (Fructokinase) phosphoriliert wird. Solche Systeme und metabolischen Wege sind auf molekularer Ebene für die Grammpositiven Bakterien Bacillus subtilis und Streptococcus mutans (Debarbouille et al., 1991, Res. Microbiol., 142: 757-764; Sato et al., 1989, J. Bacteriol., 171: 263-271) und für Gramm-negative Bakterien beschrieben worden. Ein weiteres, Plasmid kodiertes pUR400-System für Enterobacterien ist berichtet worden (Aulkemeyer et al., (1991) Mol. Microbiol., 5: 2913-2922; Schmid et al., 1988. Mol. Microbiol., 2: 1-8; Schmid et al., 1991. Mol. Microbiol., 5: 941-950).The Majority of the sucrose-positive bacteria manage the Absorption and phosphorylation of sucrose by a phosphoenolpyruvate-dependent sucrose-6-phosphotransferase system (sucrose-PTS), being intracellular Sucrose-6-phosphate is obtained. This phosphate is produced by sucrose-6-phosphate hydrolase (Invertase or sucrase) in D-glucose-6-phosphate and D-fructose hydrolyzed, which in turn by an ATP-D-fructose-6-phosphate phosphotransferase (Fructokinase) is phosphorylated. Such systems and metabolic Pathways are at the molecular level for the gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Streptococcus mutans (Debarbouille et al., 1991, Res. Microbiol., 142: 757-764; Sato et al., 1989, J. Bacteriol., 171: 263-271) and for gram-negative bacteria been described. Another plasmid encoded pUR400 system for enterobacteria has been reported (Aulkemeyer et al., (1991) Mol. Microbiol., 5: 2913-2922; Schmid et al., 1988. Mol. Microbiol., 2: 1-8; Schmid et al., 1991. Mol. Microbiol., 5: 941-950).

Obwohl etwa 50 der Wildtypisolate von Escherichia coli Saccharose-positiv sind, können die Laborstämme von E. coli, wie E. coli K12, E. coli B, E. coli C, die derzeit zum Züchten der industriell wichtigen Produktionsstämme verwendet werden, Saccharose nicht verwerten. Diese Eigenschaft kann jedoch auf einfache Weise durch Einverleiben von Saccharoseverwertungsgenen aus Saccharose-positiven Stämmen von E. coli oder Salmonella unter Einsatz der Konjugation, Transduction oder Klonierungsverfahren auf diese Stämme übertragen werden (Wohlhieter et al., 1975, J. Bacteriol., 122:401-406; Parsell and Smith, 1975, J. Gen. Microbiol., 87: 129-137; Alaeddinoglu and Charles, 1979, J. Gen. Microbiol., 110:47-59; Livshits et al., 1982, In: Metabolic plasmids. P.132-134; Garsia, 1985, Mol. Gen. Genet., 201:575-577; US Patent Nr. 5,175,107 ).Although about 50 of the wild type isolates of Escherichia coli are sucrose positive, the laboratory strains of E. coli, such as E. coli K12, E. coli B, E. coli C, which are currently used to grow the industrially important production strains, can not sucrose recycle. However, this property can be readily transferred to these strains by incorporating sucrose utilization genes from sucrose-positive strains of E. coli or Salmonella using conjugation, transduction or cloning methods (Wohlhieter et al., 1975, J. Bacteriol., 122: Parsell and Smith, 1975, J. Gen. Microbiol., 87: 129-137, Alaeddinoglu and Charles, 1979, J. Gen. Microbiol., 110: 47-59, Livshits et al., 1982, In : Metabolic plasmids, P.132-134; Garsia, 1985, Mol. Gen. Genet., 201: 575-577; U.S. Patent No. 5,175,107 ).

Phosphoenolpyruvat (PEP) ist einer der wesentlichen Bausteine in mehreren biosynthetischen Wegen. PEP wird mit Kohlendioxid unter Bildung von Oxalessigsäure kombiniert. Oxalessigsäure dient als Kohlenstoffskelett für Asparaginsäure, Asparagin, Threonin, Isoleucin, Methionin und Lysin. Daneben wird eine äquimolare Menge PEP mit Erythrose-4-phosphat unter Bildung von 3-Deoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat (DAHP), dem ersten Intermediat des gemeinsamen Abschnittes des aromatischen Biosyntheseweges, kondensiert. Aus dieser metabolischen Route können solche kommerziell wichtigen Aminosäuren wie Tryptophan, Phenylalanin und Tyrosin erhalten werden. Die Ausbeute dieser Metaboliten kann durch die Verfügbarkeit von PEP limitiert werden.phosphoenolpyruvate (PEP) is one of the essential building blocks in several biosynthetic Because of. PEP is combined with carbon dioxide to form oxaloacetic acid. Oxalessigsäure serves as a carbon skeleton for aspartic acid, Asparagine, threonine, isoleucine, methionine and lysine. Next to it will be an equimolar one Amount of PEP with erythrose 4-phosphate to give 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate (DAHP), the first intermediate of the common section of the aromatic Biosynthetic pathway, condensed. From this metabolic route, such commercially important amino acids such as tryptophan, phenylalanine and tyrosine. The yield This metabolite can be limited by the availability of PEP become.

Während der Glycolyse werden vier Mol PEP aus zwei Mol Glucose produziert, und die Hälfte des PEP wird obligatorisch verbraucht, um Energie für die Glucoseaufnahme bereitzu stellen. Im Fall der Saccharoseaufnahme produzieren zwei Mol Hexose (Glucose und Fructose), die sich aus einem Mol Saccharose ergeben, auch vier Mol PEP, es wird jedoch nur ein Mol für den Saccharosetransport verbraucht, so dass die Menge des verfügbaren PEP als Quelle für Kohlenstoffskelette für die Biosynthese 1,5-fach erhöht wird. Deshalb ist es möglich, die Aminosäureausbeute durch Bereitstellen des Aminosäure produzierenden Stammes von E. coli mit der Fähigkeit zur Verwertung von Saccharose und durch Einsatz von Saccharose oder Saccharose enthaltenden Substraten als Kohlenstoffquelle zu verbessern.During the Glycolysis produces four moles of PEP from two moles of glucose, and the half the PEP is compulsorily consumed to provide energy for glucose uptake to provide. In the case of sucrose uptake produce two Mol hexose (glucose and fructose), which consists of one mole of sucrose even four moles of PEP, but only one mole is needed for sucrose transport consumed, so that the amount of available PEP as a source of carbon skeletons for the Biosynthesis increased 1.5-fold becomes. That's why it's possible the amino acid yield by providing the amino acid producing strain of E. coli capable of exploiting Sucrose and by use of sucrose or sucrose To improve substrates as a carbon source.

Im Stand der Technik ist der Threonin produzierende Stamm VKPM B-3996 auf der Grundlage von E. coli K-12, der Saccharose verwerten kann ( US Patent Nr. 5,705,371 ), bekannt. Die Restriktion und die Sequenzanalyse der klonierten Saccharosegene aus dem Stamm VKPM B-3996 zeigte, dass sie fast identisch sind zu denjenigen von pUR400 (Zugangsnummer: EMBL X61005; EMBL X67750, GB M38416), welches PTS-Sucrose für den Transport und den Metabolismus kodiert (Lengeler et al., 1982, J. Bacteriol., 151:468-471; Schmid et al., 1988, Mol. Microbiol., 2:1-8; Schmid et al., 1991, Mol. Microbiol., 5:941-950).In the prior art is the threonine-producing strain VKPM B-3996 based on E. coli K-12, which can utilize sucrose ( U.S. Patent No. 5,705,371 ), known. Restriction and sequence analysis of the cloned sucrose genes from strain VKPM B-3996 showed that they are almost identical to pUR400 (accession number: EMBL X61005, EMBL X67750, GB M38416) which encodes PTS sucrose for transport and metabolism (Lengeler et al., 1982, J. Bacteriol., 151: 468-471, Schmid et al , 1988, Mol. Microbiol., 2: 1-8; Schmid et al., 1991, Mol. Microbiol., 5: 941-950).

Ein chromosomal kodierter, nicht-PTS-Metabolismusweg für die Verwertung von Saccharose wurde auch in Escherichia coli gefunden (Bockmann et al., 1992, Mol. Gen. Genet., 235:22-32). Der Syntheseweg umfasst ein Protonsymport-Transportsystem (Permease vom LacY-Typ), eine Invertase, eine Fructokinase und einen Saccharose spezifischen Repressor. Durch Verwendung dieses nicht-PTS-Metabolismusweges konnte der Ausstoß einer Aminosäure, die sich von einem PEP-Vorläufer ableitet, weiter erhöht werden, weil der Saccharosetransport in die Zellen nicht an PEP gekoppelt ist. Dieser Ansatz wurde jedoch für die Verbesserung von Aminosäure produzierenden Stämmen bislang niemals versucht.One Chromosomally encoded, non-PTS metabolism pathway for recovery sucrose has also been found in Escherichia coli (Bockmann et al., 1992, Mol. Gen. Genet., 235: 22-32). The synthetic route comprises a proton signaling transport system (LacY-type permease), an invertase, a fructokinase and a Sucrose specific repressor. By using this non-PTS metabolism pathway could the emission of a Amino acid, distinguished from a PEP precursor derived, further increased because the sucrose transport into the cells is not due to PEP is coupled. However, this approach has been used for the improvement of amino acid producing strains Never tried before.

Tsunekawa, H. et al.: "Acquisition of a sucrose utilization system in Escherichia-coli K-12 derivatives and its applications to industry", Applied an Environmental Microbiology, vol. 58, Nr. 6, 1992, Seiten 2081-2088, ISSN: 0099-2240 offenbart die Konstruktion von phänotypisch stabilen SRC⁺-Derivaten von Escherichia coli K12, der Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle nicht verwerten kann.Tsunekawa, H. et al .: "Acquisition of a sucrose utilization system in Escherichia coli K-12 derivatives and its applications to industry", Applied to Environmental Microbiology, vol. 58, No. 6, 1992, pages 2081-2088, ISSN: 0099-2240 discloses the construction of phenotypically stable SRC ⁺ derivatives of Escherichia coli K12 which can not utilize sucrose as the sole carbon source.

Debabov, V.: "Construction of strains producing L-threonine", Proceedings of the IVth International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms, 1982, Seiten 254 bis 258 offenbart ein Bakterium der Gattung Escherichia, das aus einem Saccharose nicht assimilierenden Stamm konstruiert worden ist, wobei das Bakterium Saccharose-PTS-Gene enthält und die Fähigkeit zur Produktion und Anhäufung von Homoserin in einem Kulturmedium hat, wenn das Bakterium in dem Medium kultiviert wird, das Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle enthält.Debabov, V .: "Construction of strains producing L-threonine ", Proceedings of the IVth International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms, 1982, pages 254 to 258 discloses a bacterium the genus Escherichia, which does not assimilate from a sucrose Strain has been constructed, the bacterium being sucrose PTS genes contains and the ability for production and accumulation of homoserine in a culture medium has when the bacterium in the Medium is cultivated, the sucrose as sole carbon source contains.

Zusammenfassende Darstellung der ErfindungSummary presentation the invention

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Herstellen von Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen von Escherichia coli bereit zu stellen, welche die für den metabolischen Syntheseweg für die Verwertung von Saccharose kodierenden Gene enthalten, insbesondere für den nicht-PTS-Metabolismusweg für die Verwertung von Saccharose.One The object of the present invention is to provide a method for Producing amino acids using trunks of Escherichia coli, which are the ones for the metabolic Synthesis path for contain the utilization of sucrose encoding genes, in particular for the non-PTS metabolism route for the Recycling of sucrose.

Die Erfinder haben gefunden, dass ein Bakterium der Gattung Escherichia mit der Fähigkeit zur Produktion einer Aminosäure die Aminosäure durch Einführen von Saccharosegenen in das Bakterium effizient produziert. Auf diese Weise wurde die vorliegende Erfindung gemacht.The Inventors have found that a bacterium of the genus Escherichia with the ability for the production of an amino acid the amino acid by introducing of sucrose genes efficiently produced in the bacterium. To this Way, the present invention was made.

Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt Folgendes bereit:

• (1) Ein Verfahren zur Produktion von Lysin, welches die Stufe umfasst, bei der ein Bakterium der Gattung Escherichia in einem Kulturmedium, welches Saccharose als Hauptkohlenstoffquelle enthält, kultiviert wird, wobei das Bakterium aus einem Saccharose nicht-assimilierenden Stamm der Gattung Escherichia konstruiert worden ist, wobei das Bakterium Saccharose-PTS-Gene aus Escherichia coli VKPM B-7915 enthält und die Fähigkeit hat, Lysin in einem Kulturmedium, das Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle enthält, zu produzieren und anzuhäufen.
• (2) Verfahren nach Punkt (1), wobei das Bakterium der Gattung Escherichia Escherichia coli ist.

That is, the present invention provides:

• (1) A process for producing lysine, which comprises the step of cultivating a bacterium of the genus Escherichia in a culture medium containing sucrose as the main carbon source, wherein the bacterium has been constructed from a non-assimilating sucrose strain of the genus Escherichia wherein the bacterium contains sucrose PTS genes from Escherichia coli VKPM B-7915 and has the ability to produce and accumulate lysine in a culture medium containing sucrose as the sole carbon source.
• (2) The method according to item (1), wherein the bacterium is of the genus Escherichia Escherichia coli.

In der vorliegenden Erfindung ist die Aminosäure in der L-Konfiguration, wenn nichts anderes angegeben ist.In In the present invention, the amino acid is in the L configuration when nothing else is stated.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend eingehend beschrieben.The The present invention will be described in detail below.

Das Bakterium der Gattung Escherichia, das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ist ein Bakterium, das aus einem Saccharose nicht assimilierenden Stamm von Escherichia coli als Ausgangsstamm konstruiert wird, wobei dieser Stamm Saccharosegene enthält, insbesondere Saccharose-nicht-PTS-Gene, und die Fähigkeit zur Produktion einer Aminsäure hat.The Bacterium of the genus Escherichia, that in the present invention used is a bacterium that is not made from a sucrose assimilating strain of Escherichia coli constructed as a parent strain which strain contains sucrose genes, in particular sucrose-non-PTS genes, and the ability for the production of an amino acid Has.

Ein Saccharose nicht assimilierender Stamm von Escherichia coli ist nicht besonders eingeschränkt, solange er die Fähigkeit hat, eine Aminosäure zu produzieren, oder diese Fähigkeit übertragen kann. Die Beispiele solcher Stämme umfassen E. coli K-12, E. coli B und E. coli C, und deren Derivatstämme, genauer gesagt die nachstehend erwähnten Aminosäure produzierenden Stämme.One Sucrose non-assimilating strain of Escherichia coli not particularly limited, as long as he's the ability has, an amino acid to produce or transfer this ability can. The examples of such strains include E. coli K-12, E. coli B and E. coli C, and their derivative strains, more specifically said the ones mentioned below amino acid producing strains.

Das in der vorliegende Erfindung eingesetzte Bakterium kann durch Einführen von Saccharose-PTS-Genen in einen Aminosäure produzierenden Stamm, wie die vorstehend beschriebenen Stämme, erhalten werden. Alternativ dazu kann das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Bakterium durch Übertragen der Fähigkeit zur Produktion einer Aminosäure auf ein Bakterium der Gattung Escherichia, worin Saccharose-PTS-Gene eingeführt sind, erhalten werden.The bacterium used in the present invention can be prepared by introducing sucrose se-PTS genes into an amino acid producing strain, such as the strains described above. Alternatively, the bacterium used in the present invention can be obtained by transferring the ability to produce an amino acid to a bacterium of the genus Escherichia, in which sucrose PTS genes are introduced.

Eine Aminosäure kann auch effizient durch Einführen von Saccharose-PTS in ein Bakterium der Gattung Escherichia hergestellt werden. Beispiele für Saccharose-PTS-Gene sind die SCR-Gene, die in dem pUR400-System enthalten sind und von Enterobacterien abgeleitet sind (Aulkemeyer et al. (1991) Mol. Microbiol., 5: 2913-2922; Schmid et al., 1988, Mol. Microbiol., 2:1-8; Schmid et al., 1991, Mol. Microbiol., 5:941-950). Alternativ dazu können die Saccharose-PTS-Gene aus dem Transposon Tn2555 präpariert werden (Doroshenko et al., 1988, Molec. Biol., 22:645-658).A amino acid can also be efficient by introducing of sucrose PTS produced in a bacterium of the genus Escherichia become. examples for Sucrose PTS genes are the SCR genes present in the pUR400 system are derived from enterobacteria (Aulkemeyer et al. (1991) Mol. Microbiol., 5: 2913-2922; Schmid et al., 1988, Mol. Microbiol., 2: 1-8; Schmid et al., 1991, Mol. Microbiol., 5: 941-950). alternative can do this prepared the sucrose PTS genes from transposon Tn2555 (Doroshenko et al., 1988, Molec. Biol., 22: 645-658).

Die Saccharose-PTS-Genen können in ein Bakterium der Gattung Escherichia beispielsweise durch Einführen eines rekombinanten Plasmids, welches die gewünschten Gene enthält, in das Bakterium einverleibt werden. Genauer gesagt können die gewünschten Gene in ein Bakterium der Gattung Escherichia durch Einführen eines Plasmids, eines Phagen oder eines Transposons (Berg, D. E. and Berg, C.M., Bio/Tecnol., 1, 417 (1983)), welches die gewünschten Gene trägt, in eine Zelle des Bakteriums einverleibt werden.The Sucrose-PTS genes into a bacterium of the genus Escherichia, for example by introducing a recombinant plasmid containing the desired genes into the Bacteria are incorporated. More specifically, the desired Genes in a bacterium of the genus Escherichia by introducing a Plasmids, a phage or a transposon (Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio / Tecnol., 1, 417 (1983)) containing the desired Bears genes, be incorporated into a cell of the bacterium.

Der Vektor ist beispielsweise ein Plasmidvektor, wie pBR322, pMW118, pUC19 oder dergleichen, oder ein Phagenvektor, einschließlich Phage P1vir, mini-Mud, wie pMu4041 oder dergleichen. Das Transposon ist beispielsweise Mu, Tn10, Tn5 oder dergleichen.Of the For example, vector is a plasmid vector, such as pBR322, pMW118, pUC19 or the like, or a phage vector, including phage P1vir, mini-mud, such as pMu4041 or the like. The transposon is for example Mu, Tn10, Tn5 or the like.

Die Einführung einer DNA in ein Bakterium der Gattung Escherichia kann beispielsweise durch das Verfahren von D. A. Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) oder durch ein Verfahren, bei dem die Empfängerzellen mit Calciumchlorid behandelt werden, um ihre Permeabilität für DNA zu erhöhen (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) und dergleichen durchgeführt werden. Alternativ dazu kann die Einführung einer DNA auch durch Transduktion unter Verwendung eines Phagenvektors durchgeführt werden.The introduction For example, a DNA in a bacterium of the genus Escherichia by the method of D.A. Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) or by a method in which the recipient cells be treated with calcium chloride to increase their permeability to DNA raise (almond, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) and the like carried out become. Alternatively, the introduction of a DNA also by Transduction can be performed using a phage vector.

Die Saccharose-PTS-Gene werden in ein Aminosäure produzierendes Bakterium der Gattung Escherichia mit dem Ergebnis eingeführt, das die Aminosäure aus Saccharose produziert wird. Als Bakterium der Gattung Escherichia, in das die Saccharose-PTS-Gene eingeführt werden, können Stämme eingesetzt werden, welche die gewünschte Aminosäure produzieren können. Daneben kann die Fähigkeit zur Produktion einer Aminosäure auf ein Bakterium übertragen werden, in das die Saccharose-PTS-Gene eingeführt werden. Beispiele der Aminosäure produzierenden Bakterien der Gattung Escherichia coli werden nachstehend beschrieben.The Sucrose PTS genes become an amino acid producing bacterium introduced the genus Escherichia with the result that the amino acid from Sucrose is produced. As a bacterium of the genus Escherichia, in which the sucrose PTS genes are introduced, strains can be used which are the desired ones amino acid can produce. Next to it is the ability for the production of an amino acid transferred to a bacterium into which the sucrose PTS genes are introduced. Examples of amino acid producing Bacteria of the genus Escherichia coli are described below.

Lysin produzierende BakterienLysine producing bacteria

Als Lysin produzierende Bakterien sind E. coli VL612 bevorzugt (Beispiel 5). Zudem können Lysin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia beispielhaft genannt werden, genauer gesagt ein mutierter Stamm mit Resistenz gegenüber Lysinanaloga. Das Lysinanalogon inhibiert die Proliferation von Bakterien der Gattung Escherichia, die Supression ist jedoch vollständig oder teilweise aufgehoben, wenn Lysin in einem Medium koexistiert. Als Beispiele seien Oxalysin, Lysinhydroxamat, (S)-2-Aminoethyl-L-cystein (AEC), Gamma-Methyllysin, Chlorcaprolactam und dergleichen genannt. Mutierte Stämme mit Resistenz gegenüber diesen Lysinanaloga werden erhalten, indem ein üblicher künstlicher Mutationsvorgang auf Bakterien der Gattung Escherichia angewandt wird. Der für die Lysinproduktion einzusetzende Bakterienstamm ist beispielsweise Escherichia coli AJ11442 (hinterlegt als FERM BP-1543 und NRRL 8-12185; vgl. die offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 56-18596 oder das US Patent Nr. 4,346,170 ) und Escherichia coli VL611. Escherichia coli AJ11442 wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (derzeit National Institute of Bioscience and Human Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) (Postleitzahl: 305, 13, Higashi 1 chome, Tsukubashi, Ibarakiken, Japan) am 5. Mai 1981 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-5084 hinterlegt und nach den Bestimmungen des Budapester Abkommens aus der ursprünglichen Hinterlegung am 29. Oktober 1987 in eine internationale Hinterlegung unter der Nummer FERM BP-1543 überführt. In der Aspartokinase der vorstehend beschriebenen Mikroorganismen ist die Rückkopplungshemmung durch Lysin aufgehoben.As lysine-producing bacteria, E. coli VL612 are preferred (Example 5). In addition, lysine-producing bacteria of the genus Escherichia can be exemplified, more specifically a mutant strain with resistance to lysine analogues. The lysine analog inhibits the proliferation of bacteria of the genus Escherichia, but the suppression is completely or partially abolished when lysine coexists in a medium. Examples include oxalysine, lysine hydroxamate, (S) -2-aminoethyl-L-cysteine (AEC), gamma methyl lysine, chloro caprolactam, and the like. Mutant strains resistant to these lysine analogs are obtained by applying a common artificial mutation procedure to bacteria of the genus Escherichia. The bacterial strain to be used for lysine production is, for example, Escherichia coli AJ11442 (deposited as FERM BP-1543 and NRRL 8-12185; Japanese Patent Application No. 56-18596 or that U.S. Patent No. 4,346,170 ) and Escherichia coli VL611. Escherichia coli AJ11442 has been assigned to the National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (currently National Institute of Bioscience and Human Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Postcode: 305, 13, Higashi 1 chome, Tsukubashi , Ibarakiken, Japan) on May 5, 1981 under the accession number FERM P-5084 and transferred under the provisions of the Budapest Agreement from the original deposit on 29 October 1987 to an international deposit under the number FERM BP-1543. In the aspartokinase of the microorganisms described above, feedback inhibition by lysine is abolished.

Daneben können beispielsweise Threonin produzierende Bakterien genannt werden, weil die Inhibition ihrer Aspartokinase durch Lysin im Allgemeinen in Threonin produzierenden Bakterien ebenfalls aufgehoben ist. Als Threonin produzierende Bakterien der Gattung Escherichia coli kann MG442 beispielhaft genannt werden (Gusyatiner, et al., Genetika (auf Russisch), 14, 947-956 (1978).Besides can for example, threonine-producing bacteria are called, because the inhibition of their aspartokinase by lysine in general in threonine-producing bacteria is also abolished. When Threonine-producing bacteria of the genus Escherichia coli can MG442 (Gusyatiner, et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978).

Ein oder mehrere Gene, welche ein oder mehrere Enzyme im Lysinbiosyntheseweg kodieren, können in dem vorstehend genannten Bakterium verstärkt sein. Ein Beispiel eines solchen Gens ist das Gen, das für Phosphoenolpyruvatcarboxylase kodiert und so mutiert ist, dass die Rückkopplungshemmung durch Asparaginsäuren aufgehoben ist (vgl. die Japanische Patentveröffentlichung Nr. 7-83714 ).One or more genes encoding one or more enzymes in the lysine biosynthetic pathway may be enhanced in the aforementioned bacterium. An example of such a gene is the gene encoding phosphoenolpyruvate carboxylase which has been mutated to abolish the feedback inhibition by aspartic acids (see US Pat Japanese Patent Publication No. 7-83714 ).

Eine Aminosäure kann effizient aus Saccharose hergestellt werden durch Kultivieren des vorstehend beschriebenen Bakteriums, in das die Saccharose-PTS-Gene eingeführt sind und welches eine Aminosäure produzieren kann, in einem Saccharose enthaltenden Kulturmedium, wobei die Aminosäure in dem Medium produziert und angehäuft wird, und durch Gewinnen der Aminosäure aus dem Medium. Die Aminosäure ist Lysin.A amino acid can be efficiently made from sucrose by culturing of the bacterium described above into which the sucrose PTS genes introduced are and which produce an amino acid can, in a sucrose-containing culture medium, wherein the amino acid in the Medium produced and piled and by recovering the amino acid from the medium. The amino acid is Lysine.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Produktion von Aminosäuren kann die Kultivierung des Bakteriums der Gattung Escherichia, die Gewinnung und die Reinigung der Aminosäure aus dem flüssigen Medium auf ähnliche Weise wie bei herkömmlichen Fermentationsverfahren durchgeführt werden, wobei die Aminosäure unter Verwendung eines Bakteriums produziert wird. Ein in der Kultur eingesetztes Medium kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium sein, solange das Medium eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle und Mineralien sowie bei Bedarf eine mäßige Menge an Nährstoffen umfasst, welche das eingesetzte Bakterium zum Wachsen benötigt. Als Hauptkohlenstoffquelle wird Saccharose eingesetzt. Eine kleine Menge an Kohlenstoffquellen außer Saccharose kann in dem Medium als Hilfskohlenstoffquelle enthalten sein. Als Stickstoffquelle werden verschiedene Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, andere Stickstoffverbindungen, wie Amine, eine natürliche Stickstoffquelle, Pepton, Sojabohnenhydrolysat und verdaute fermentierte Mikroorganismen eingesetzt. Als Mineralien werden Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-Sulfat, Mangansulfat oder Calciumcarbonat eingesetzt.In the method according to the invention for the production of amino acids may be the cultivation of the bacterium of the genus Escherichia, the Recovery and purification of the amino acid from the liquid medium to similar ones Way as with conventional Fermentation carried out be, with the amino acid produced using a bacterium. One in culture used medium can either be a synthetic medium or a natural one Be medium as long as the medium is a carbon source and a Nitrogen source and minerals and, if necessary, a moderate amount of nutrients which requires the bacterium used to grow. When Main carbon source is sucrose. A small amount at carbon sources except Sucrose may be included in the medium as an auxiliary carbon source be. As the nitrogen source are various ammonium salts, such as Ammonium sulfate, other nitrogen compounds, such as amines, a natural source of nitrogen, Peptone, soybean hydrolyzate and digested fermented microorganisms used. As minerals are potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, Iron (II) sulfate, manganese sulfate or calcium carbonate used.

Die Kultivierung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, beispielsweise als Schüttelkultur, unter Belüften und Rühren bei einer Temperatur von 20-40 °C, vorzugsweise zwischen 30 und 38 °C, durchgeführt. Der pH-Wert der Kultur ist üblicherweise zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,2. Der pH-Wert der Kultur kann mit Ammoniak, Calciumcarbonat, verschiedenen Säuren, verschiedenen Basen und Puffern eingestellt werden. Üblicherweise führt eine 1- bis 3-tägige Kultivierung zu einer Anhäufung der gewünschten Aminosäure in dem flüssigen Medium.The Cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, for example as a shake culture, under aeration and stirring at a temperature of 20-40 ° C, preferably between 30 and 38 ° C, carried out. The pH of the culture is usually between 5 and 9, preferably between 6.5 and 7.2. The pH The culture can be different with ammonia, calcium carbonate, different acids, different Bases and buffers are adjusted. Usually leads one 1 to 3 days Cultivation to an accumulation the desired amino acid in the liquid Medium.

Nach der Kultivierung werden Feststoffe, wie Zellen, aus dem flüssigen Medium durch Zentrifugation und Membranfiltration entfernt, und dann kann die gewünschte Aminosäure durch Innenaustausch, Konzentration und Kristallfraktionierung gewonnen und gereinigt werden.To Cultivation, solids, such as cells, from the liquid medium removed by centrifugation and membrane filtration, and then can the desired amino acid obtained by ion exchange, concentration and crystal fractionation and be cleaned.

Kurze Beschreibung der ZeichnungenBrief description of the drawings

1 zeigt die Konstruktion der Plasmide pM1 und pM2, die von mini-Mud 4041 abgeleitet sind. 1 shows the construction of plasmids pM1 and pM2 derived from mini-Mud 4041.

2 zeigt das Schema der Klonierung der scr-Gene in pM1. 2 shows the scheme of cloning the scr genes into pM1.

3 zeigt die Konstruktion der Plasmide pMT1 und pMT2. 3 shows the construction of plasmids pMT1 and pMT2.

4 zeigt die Konformation des Plasmids pMH10, welches ein Km^R-Gen, Gene A und B des Mu-Phagen, welche für die Mu-Transposase kodieren, das ner-Gen, das für einen negativen Regulator kodiert, und das cts62-Gen enthält, das für den Mu-Repressor kodiert. 4 shows the conformation of the plasmid pMH10, which contains a Km ^R gene, genes A and B of Mu phage coding for the Mu transposase, the ner gene coding for a negative regulator, and the cts62 gene, that coded for the Mu repressor.

Beste Ausführungsform der ErfindungBest embodiment of the invention

Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der folgenden Beispiele eingehender erklärt.in the The present invention will now be described by way of the following examples explained in more detail.

Beispiel 1: Präparation des Donors von Saccharose-PTS-GenenExample 1: Preparation of the donor of sucrose PTS genes

Der Stamm VD1 wurde als Donor der PTS-Gene für die Verwertung von Saccharose (scr) eingesetzt. Dieser Stamm wurde wie folgt erhalten. Das Transposon Tn2555 trägt die scr-Gene (Doroshenko et al., 1988, Molec. Biol., 22:645-658). Die Restriktionsanalyse und die Teilsequenzierung zeigten, dass die scr-Gene von Tn2555 zu denjenigen aus pUR400 (Zugangsnummer: EMBL X61005; EMBL X67750, GB M38416), welche den Saccharosetransport und den Saccharosemetabolismus über das PTS-System kontrollieren, identisch sind.Of the Strain VD1 was used as donor of the PTS gene for the recovery of sucrose (scr) used. This strain was obtained as follows. The transposon Wearing Tn2555 the scr genes (Doroshenko et al., 1988, Molec. Biol., 22: 645-658). Restriction analysis and partial sequencing showed that the scr genes from Tn2555 to those from pUR400 (accession number: EMBL X61005; EMBL X67750, GB M38416), which regulates sucrose transport and sucrose metabolism control the PTS system are identical.

Die scr-Gene von Tn2555 wurden in pM1, einem mini-Mud-Vektor pMu4041-Derivat, erhalten durch die Deletion der Mu-Phagen-Gene, welche für die Transposase und den Repressor kodieren, kloniert (M. Faelen. Useful Mu and mini-Mu derivatives. In: Phage Mu. Symonds et al., Herausgeber, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1987, Seiten 309-316). Dies wurde in zwei Stufen durchgeführt. In der ersten Stufe wurde das SspI-Fragment von pBRS5.2 (pBR325::Tn2555) (Doroshenko et al., 1988, Molek. Biol. 22: 645-658), welches scrYABR-Gene und nur einen Teil des scrK-Gens enthält, in das mit PvuII geschnittene Plasmid pM1 unter Ersetzen des kan-Gens eingeführt.The Tn2555 scr genes were transformed into pM1, a mini-Mud vector pMu4041 derivative, obtained by the deletion of the Mu phage genes, which are responsible for the transposase and the repressor encode, cloned (M.Faelen, Useful Mu and mini-Mu derivatives. In: Phage Mu. Symonds et al., Editors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1987, pp. 309-316). This was done in two stages. In the first step became the SspI fragment of pBRS5.2 (pBR325 :: Tn2555) (Doroshenko et al., 1988, Mol. Biol. 22: 645-658), which scrYABR genes and only part of the scrK gene contains into the PvuII cut plasmid pM1 replacing the kan gene introduced.

Das vorstehend beschriebene Plasmid pM1 wurde wie folgt erhalten (1). Das Plasmid pMu4041 wurde mit HindIII verdaut und unter Ausschneiden des Gens A und des Gens B, die für die Transposase des Phagen Mu kodieren, und des Nährgens, das für einen negativen Regulator kodiert, erneut in die Ringform überführt, wobei das Plasmid pMD4041 erhalten wurde. Dann wurde pMD4041 mit AvaIII und HindIII verdaut und mit T4-DNA-Polymerase abgestumpft, und danach wurde erneut ein Ringschluss durchgeführt, um den cts62-Phage-Mu-Rrepressor zu entfernen.The above-described plasmid pM1 was obtained as follows ( 1 ). The plasmid pMu4041 was digested with HindIII and reconstituted to obtain the plasmid pMD4041 by excising the gene A and the gene B encoding the phage Mu transposase and the nutrient gene encoding a negative regulator , Then, pMD4041 was digested with AvaIII and HindIII and blunted with T4 DNA polymerase, and thereafter ring-closed was performed to remove the cts62 phage Mu repressor.

In der zweiten Stufe wurde das BamHI-Fragment des erhaltenen Plasmids gegen das BamHI-Fragment von pBRS5.2 ausgetauscht, wobei das scrK-Gen wiederhergestellt wurde. Somit wurde der gesamte Saccharose-Cluster von Tn2555 in das Plasmid kodiert, das auch einen amp^R-Marker und Enden von Phage Mu enthielt. Dieses Plasmid, das pMS1 genannt wurde, enthält ein transponierbares DNA-Fragment mini-Mu-scrKYABR (2).In the second step, the BamHI fragment of the resulting plasmid was replaced with the BamHI fragment of pBRS5.2, restoring the scrK gene. Thus, the entire sucrose cluster of Tn2555 was encoded into the plasmid, which also contained an amp ^R marker and ends of phage Mu. This plasmid, called pMS1, contains a transposable DNA fragment mini-Mu-scrKYABR ( 2 ).

Um mini-Mu-scrKYABR in das Bakteriumchromosom zu integrieren, wurde ein Standardverfahren eingesetzt. Das Plasmid pMS1 wurde in die Zellen MG1655(pMH10) eingeführt. Die Mu-Transposase, kodiert durch pMH10 (pACYC177-Derivat, welches ein Km^R-Gen, A- und B-Gene des Mu-Phagen, die für Mu-Transposase kodieren, das ctso2-Gen, das für einen Mu-Repressor kodiert, und das Repressor-Gen cI857 des Phagen lambda enthält), wurde durch 15 minütige Inkubation bei 42 °C unmittelbar nach der Transformation induziert. Es wurden Saccharose-positive (Scr⁺)-Klone auf M9 Agarplatten, enthaltend 0,2 % Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle bei 30 °C selektiert, ge waschen und in LB-Brühe (J. Miller. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor laboratory, New York, 1972), welche keine Antibiotika enthielt, während 48-72 Stunden inkubiert. Dann wurden die geeigneten Verdünnungen der Kulturbrühe auf M9 Agarplatten, enthaltend 0,2 % Saccharose, plattiert. Es wurden mehrere zehn Amp^S-, Km^S-Klone abgenommen und getestet. Es zeigte sich, dass sie kein Plasmid enthielten. Unter diesen wurde der Stamm VD1 (MG1655::mini-MuscrKYABR) selektiert, der ein prototropher, schnellwachsender Saccharose-positiver Stamm ist.To integrate mini-Mu-scrKYABR into the bacterium chromosome, a standard procedure was used. The plasmid pMS1 was introduced into the cells MG1655 (pMH10). The Mu transposase encoded by pMH10 (pACYC177 derivative, which encodes a Km ^R gene, A and B genes of Mu phage coding for Mu transposase, the ctso2 gene encoding a mu repressor and the phage lambda repressor gene cI857) was induced by incubation at 42 ° C for 15 minutes immediately after transformation. Sucrose positive (Scr ⁺ ) clones were selected on M9 agar plates containing 0.2% sucrose as the sole carbon source at 30 ° C, washed and incubated in LB broth (Miller J. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor laboratory, New York, 1972) containing no antibiotics, incubated for 48-72 hours. Then the appropriate dilutions of the culture broth were plated on M9 agar plates containing 0.2% sucrose. Several ten Amp ^S , Km ^S clones were removed and tested. It turned out that they did not contain a plasmid. Among them, strain VD1 (MG1655 :: mini-MuscrKYABR), which is a prototrophic, fast-growing sucrose-positive strain, was selected.

Daneben wurde der Stamm VL478, der das Plasmid pVG478 enthält, welches Saccharose-Gene in dem Transposon Tn2555 trägt (Molecular Genetics, Microbiology and Virology, Nr.6, 23-28 (1987)) auch als Donor von scr-Genen eingesetzt. Der Stamm VL478 wurde bei der Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) unter der Hinterlegungsnummer VKPM B-7915 hinterlegt.Besides was the strain VL478, which contains the plasmid pVG478, which Carries sucrose genes in the transposon Tn2555 (Molecular Genetics, Microbiology and Virology, No. 6, 23-28 (1987)) also used as donors of scr genes. The strain VL478 was used by the Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) under the accession number VKPM B-7915 deposited.

Die vorstehend genannten Stämme wurden als Donoren von scr-Genen in den folgenden Beispielen eingesetzt.The aforementioned strains were as donors of scr genes used in the following examples.

Beispiel 2: Präparation des Threonin produzierenden Stammes von E. coli, welcher Saccharose verwerten kann, und Threoninproduktion unter Verwendung des Stammes (1) (nicht vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst)Example 2: Preparation of threonine-producing Strain of E. coli which can utilize sucrose and threonine production using the strain (1) (not within the scope of the present Invention)

Als Empfängerstamm, in den die PTS-Gene eingeführt wurden, wurde E. coli VL643 wie folgt neu konstruiert.When Recipient strain, into which the PTS genes are introduced E. coli VL643 was redesigned as follows.

Der bekannte Stamm E. coli MG442 (Guayatiner et al., Genetika (auf Russisch), 14, 947-956 (1978), VKPM B-1628) wurde mit der rhtA23-Mutation aus dem Stamm 472T23/pYN7 (VKPM B-2307) transduziert, wobei der Stamm VL64 erhalten wurde. Die Mutation rhtA23 überträgt eine Resistenz gegenüber hohen Konzentrationen von Threonin (>40 mg/ml) oder Homoserin (>5 mg/ml) und verbessert die Threoninproduktion (ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24-29, 1997, abstract No. 457).Of the known strain E. coli MG442 (Guayatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978), VKPM B-1628) was engineered with the rhtA23 mutation the strain 472T23 / pYN7 (VKPM B-2307) transduced, wherein the strain VL64 was obtained. The mutation rhtA23 transmits a resistance to high Concentrations of threonine (> 40 mg / ml) or homoserine (> 5 mg / ml) and improves threonine production (ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24-29, 1997, abstract no. 457).

Der so erhaltene Threonin produzierende Stamm VL643 wurde mit dem Phagen P1_vir, der auf dem Donorstamm VL478 gezüchtet worden war, infiziert. Die Transduktanten wurden auf M9 Minimalmedium, enthaltend 0,2 Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle, selektiert. Auf diese Weise wurde der Stamm VL644 erhalten. Dieser Stamm und der Ausgangsstamm wurden jeweils 18 Stunden bei 37 °C in einer Kulturbrühe kultiviert, und 0,3 ml jeder der erhaltenen Kulturen wurde in 3 ml eines Fermentationsmediums mit der folgenden Zusammensetzung in einem 20 × 200 mm Teströhrchen eingeimpft und 72 Stunden bei 37 °C mit einem Rotationsschüttler kultiviert. Zusammensetzung des Fermentationsmediums (g/l): Saccharose (oder Glucose) 50,0 (NH₄)₂SO₄ 10,0 K₂HPO₄ 1,0 NaCl 1,0 MgSO₄·7H₂O 0,8 FeSO₄·7H₂O 0,02 MnSO₄·5H₂O 0,02 Thiaminhydrochlorid 0,002 CaCO₃ 20

• (MgSO₄·7H₂O und CaCO₃ wurden jeweils getrennt sterilisiert).

The resulting threonine-producing strain VL643 was infected with the phage P1 _vir grown on the donor strain VL478. The transductants were selected on M9 minimal medium containing 0.2% sucrose as the sole carbon source. In this way, the strain VL644 was he hold. This strain and the parent strain were each cultured at 37 ° C. for 18 hours in a culture broth, and 0.3 ml of each of the obtained cultures was inoculated in 3 ml of a fermentation medium having the following composition in a 20 × 200 mm test tube and incubated at 37 ° C. for 72 hours ° C cultivated with a rotary shaker. Composition of the fermentation medium (g / l): Sucrose (or glucose) 50.0 (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 10.0 K ₂ HPO ₄ 1.0 NaCl 1.0 MgSO ₄ .7H ₂ O 0.8 FeSO ₄ .7H ₂ O 0.02 MnSO ₄ .5H ₂ O 0.02 thiamine hydrochloride 0,002 CaCO ₃ 20

• (MgSO ₄ .7H ₂ O and CaCO ₃ were each separately sterilized).

Nach der Kultivierung wurde die angehäufte Menge Threonin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Stamm Glucose Saccharose ^OD560 Threonin (g/l) Ausbeute (%) OD₅₆₀ Threonin (g/l) Ausbeute (%) VL643 10,1 7,0 14,0 – – – VL644 9,9 7,2 14,4 10,5 9,7 19,4 After culturing, the accumulated amount of threonine in the medium and the absorption of the medium at 560 nm were determined by known methods. The results are shown in Table 1. Table 1 tribe glucose sucrose ^OD 560 Threonine (g / l) Yield (%) OD ₅₆₀ Threonine (g / l) Yield (%) VL643 10.1 7.0 14.0 - - - VL644 9.9 7.2 14.4 10.5 9.7 19.4

Tabelle 1 zeigt, dass die beiden Stämme VL643 und VL644 in einem Medium mit Glucose gleichermaßen wuchsen und etwa die selbe Menge Threonin anhäuften. Daneben wuchs der Stamm VL644 in einem Medium mit Saccharose gut und häufte unter dieser Bedingung mehr Threonin mit höherer Ausbeute an.table 1 shows that the two tribes VL643 and VL644 grew equally in a medium with glucose and accumulated about the same amount of threonine. In addition, the trunk grew VL644 in a medium with sucrose well and amassed under this condition more threonine with higher Yield.

Beispiel 3: Präparation des Threonin produzierenden Stammes von E. coli, der Saccharose verwerten kann, und Threoninproduktion unter Verwendung des Stammes (2) (nicht vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst)Example 3: Preparation of threonine-producing Strain of E. coli that can utilize sucrose and threonine production using the strain (2) (not within the scope of the present Invention)

Als Empfängerstamm, in den die PTS-Gene eingeführt wurden, wurde E. coli VL2055 konstruiert.When Recipient strain, into which the PTS genes are introduced were constructed, E. coli VL2055.

E. coli VL2055 wurde von dem bekannten E. coli Stamm VKPM B-3996 abgeleitet ( US Patent Nr. 5,705,371 ). Der Stamm B-3996, dessen Wirtsstamm E. coli TDH-6 ist, ist bezüglich des thrC-Gens defizient und assimiliert Saccharose, wobei das ilvA-Gen eine Leckmutation hat. Der Stamm B-3996 enthält das Plasmid pVIC40, das durch Einführen des thrA*BC Operons, einschließlich des thrA*-Gens, das für AKI-HDI kodiert, welche im Wesentlichen von der Inhibition durch Threonin befreit war, in einen von RSF1010 abgeleiteten Vektor erhalten worden war.E. coli VL2055 was derived from the known E. coli strain VKPM B-3996 ( U.S. Patent No. 5,705,371 ). Strain B-3996, whose host strain is E. coli TDH-6, is deficient in the thrC gene and assimilates sucrose, with the ilvA gene having a leak mutation. Strain B-3996 contains plasmid pVIC40, which is inserted into a vector derived from RSF1010 by introduction of the thrA * BC operon, including the thrA * gene coding for AKI-HDI, which was substantially released from inhibition by threonine had been obtained.

Aus dem Stamm B-3996 wurde VL2055 in den folgenden zwei Stufen konstruiert.Out strain B-3996, VL2055 was constructed in the following two steps.

Am Anfang wurde das plasmidfreie Derivat des Stammes VKPM B-3996, nämlich TDH-6, nach spontaner Eliminierung des Plasmids pVIC40 selektiert. Dann wurde durch ein bekanntes Verfahren (NTG-Mutagenese) eine Mutation erhalten, durch die das Kan-Gen des Transposons Tn5, welches in das tdh-Gen von TDH-6 eingeführt war, inaktiviert wurde. Dann wurde das Saccharose nicht verbrauchende Derivat des erhaltenen Stammes nach der Eliminierung der genetischen Determinanten der Saccharoseassimilation selektiert. Auf diese Weise wurde der Stamm VL2053 erhalten.At the The beginning was the plasmid-free derivative of the strain VKPM B-3996, namely TDH-6, after spontaneous elimination of the plasmid pVIC40 selected. Then became a mutation by a known method (NTG mutagenesis) obtained by the Kan gene of the transposon Tn5 introduced into the tdh gene of TDH-6, was inactivated. Then the sucrose became non-consuming Derivative of the obtained strain after the elimination of the genetic Determinants of sucrose assimilation selected. In this way the strain VL2053 was obtained.

Andererseits wurde das Plasmid pPRT614 ( EP 0 593 792 ), das in E. coli VKPM B-5318 enthalten ist, mit HindIII und BamHI verdaut, wobei das Fragment ausgeschnitten wurde, welches das Threoninoperon unter den Promotor PR des Phagen lambda enthielt. Das Threoninoperon enthält eine Mutation in dem thrA-Gen (thrA*) welche die Unempfindlichkeit von Aspartokinasehomoserindehydrogenase I gegenüber der Rückkopplungshemmung durch Threonin verleiht. Das erhaltene Fragment wurde in pM1, einem mini-Mud-Vektor-pMU4041-Derivat, kloniert (M. Faelen. Useful Mu and mini-Mu derivatives. In: Phage Mu. Symonds et al., Herausgeber Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1987, Seiten 309-316), wobei das Plasmid pMT2 erhalten wurde (3).On the other hand, the plasmid pPRT614 ( EP 0 593 792 ) digested in E. coli VKPM B-5318 was digested with HindIII and BamHI to excise the fragment containing the threonine operon under the phage lambda promoter PR. The threonine operon contains a mutation in the thrA gene (thrA *) which confers the insensitivity of aspartokinase homoserine dehydrogenase I to the feedback inhibition by threonine. The resulting fragment was cloned into pM1, a mini-Mud vector pMU4041 derivative (M.Faelen, Useful Mu and mini-Mu derivatives., In: Phage Mu. Symonds et al., Editor Cold Spring Harbor Laboratory, New York , 1987, pages 309-316) to obtain the plasmid pMT2 ( 3 ).

Zudem wurde das cat-Gen von Tn9 aus pACYC184, welches Resistenz gegenüber Chloramphenicol verleiht, in pMT2 kloniert. Auf diese Weise wurde das Plasmid pMT1 erhalten, welches ein transponierbares Konstrukt von PR-thrA*BC und die von Mu-Enden flankierten cat-Gene (mini-Mu-thrA*BC-cat) enthielt (3).In addition, the cat gene of Tn9 from pACYC184, which confers resistance to chloramphenicol, was cloned into pMT2. In this way the plasmid pMT1 was obtained which contained a transposable construct of PR-thrA * BC and the Mu genes flanked by Mu-ends (mini-Mu-thrA * BC-cat) ( 3 ).

Das Plasmid wurde in die Zellen von E. coli 0600 (pMH10) eingeführt. Die Mu-Transposase, die von pMH10 kodiert wird (pACYC177-Derivat, welches ein Km^R-Gen, die Gene A und B des Phagen Mu, die für Mu-Transposase kodieren, das für einen negativen Regulator kodierende ner-Gen und das für einen Mu-Repressor kodierende cts62-Gen enthält, vgl. 4), wurde durch 15 minütige Inkubation bei 42 °C unmittelbar nach der Transformation induziert.The plasmid was introduced into the cells of E. coli 0600 (pMH10). The Mu transposase encoded by pMH10 (pACYC177 derivative containing a Km ^R gene, phage Mu genes A and B coding for Mu transposase, the N gene coding for a negative regulator, and that for contains a Mu-repressor coding cts62 gene, cf. 4 ) was induced by incubation at 42 ° C for 15 minutes immediately after transformation.

Chloramphenicol resistente (Cm^R) Klone wurden auf LB Agarplatten, die 15 mg/l Chloramphenicol enthielten, bei 30 00 selektiert. Mehrere zehn Km^S-Klone wurden aufgenommen und getestet. Es zeigte sich, dass die meisten dieser Klone kein Plasmid enthielten. Dann wurden die P_R-thrA*BC-cat-Gene aus dem Chromosom eines der selektierten Stämme C600 Thr⁺, CmR unter Verwendung von P1vir in den Stamm VL2053, erhalten in der ersten Stufe, transduziert, wobei der neue plasmidfreie Threonin produzierende Stamm VL2055 erhalten wurde.Chloramphenicol resistant (Cm ^R ) clones were selected on LB agar plates containing 15 mg / L chloramphenicol at 30 ° C. Several ten Km ^S clones were recorded and tested. It was found that most of these clones contained no plasmid. Then, the P _R -thrA * BC-cat genes were transduced from the chromosome of one of the selected strains C600 Thr ⁺ , CmR using P1vir into strain VL2053, obtained in the first step, using the new plasmid-free threonine-producing strain VL2055 was obtained.

Der Threonin produzierende Stamm VL2055 wurde mit dem Phagen P1vir, der auf den Donorstämmen VD1 oder W3350csc gezüchtet worden war, infiziert. Die Transduktanten wurden auf M9 Minimalmedium, enthaltend 50 mg/l Isoleucin und 0,2 Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle, selektiert. Auf diese Weise wurden die Stämme VL2055 Scr bzw. VL2055 Csc erhalten. Diese Stämme und der Ausgangsstamm wurden jeweils 18 Stunden bei 37 ° C in einer Nährbrühe kultiviert, und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml eines Fermentationsmediums mit der folgenden Zusammensetzung in ein 20 × 200 mm Teströhrchen eingeimpft und 72 Stunden bei 37 °C mit einem Rotationsschüttler kultiviert. Zusammensetzung des Fermentationsmediums (g(l): Saccharose (oder Glucose) 80 Isoleucin 0,1 (NH₄)₂SO₄ 22 K₂HPO₄ 2 NaCl 0,8 MgSO₄·7H₂O 0,8 FeSO₄·7H₂O 0,02 MnSO₄·5H₂O 0,02 Thiaminhydrochlorid 0,2 Hefeextrakt 1,0 CaCO₃ 30

• (MgSO₄·7H₂O und CaCO₃ wurden jeweils getrennt sterilisiert).

The threonine-producing strain VL2055 was infected with the phage P1vir grown on the donor strains VD1 or W3350csc. The transductants were selected on M9 minimal medium containing 50 mg / l isoleucine and 0.2 sucrose as the sole carbon source. In this way, strains VL2055 Scr and VL2055 Csc were obtained. These strains and the parent strain were each cultured at 37 ° C for 18 hours in a nutrient broth, and 0.3 ml of the obtained culture was inoculated into 3 ml of a fermentation medium having the following composition in a 20 x 200 mm test tube and incubated at 37 ° C for 72 hours C cultivated with a rotary shaker. Composition of the fermentation medium (g (l): Sucrose (or glucose) 80 isoleucine 0.1 (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 22 K ₂ HPO ₄ 2 NaCl 0.8 MgSO ₄ .7H ₂ O 0.8 FeSO ₄ .7H ₂ O 0.02 MnSO ₄ .5H ₂ O 0.02 thiamine hydrochloride 0.2 yeast extract 1.0 CaCO ₃ 30

• (MgSO ₄ .7H ₂ O and CaCO ₃ were each separately sterilized).

Nach der Kultivierung wurden die angehäufte Menge Threonin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Stamm Glucose Saccharose ^OD560 Threonin (g/l) Ausbeute (%) OD₅₆₀ Threonin (g/l) Ausbeute (%) VL2055 12,0 18,9 23,6 – – – VL2055 scr 11,7 19,5 24,4 11,4 23,3 29,1 VL2055 csc 11,6 19,2 24,0 11,6 27,9 34,9 After culturing, the accumulated amount of threonine in the medium and the absorption of the medium at 560 nm were determined by known methods. The results are shown in Table 2. Table 2 tribe glucose sucrose ^OD 560 Threonine (g / l) Yield (%) OD ₅₆₀ Threonine (g / l) Yield (%) VL2055 12.0 18.9 23.6 - - - VL2055 scr 11.7 19.5 24.4 11.4 23.3 29.1 VL2055 csc 11.6 19.2 24.0 11.6 27.9 34.9

Tabelle 2 zeigt, dass beide Saccharose verbrauchenden Stämme, nämlich VL2055 scr und VL2055 csc, dieselben Wachstumseigenschaften aufwiesen und etwa dieselbe Menge Threonin wie ihr Ausgangsstamm VL2055 anhäuften, wenn sie in einem Glucose enthaltenden Medium kultiviert wurden. Diese Stämme häuften jedoch mehr Threonin bei höherer Ausbeute an, wenn sie in einem Saccharose enthaltenden Medium kultiviert wurden. Daneben war der Stamm VL2055 csc (mit Saccharose-nicht-PTS-Genen) unter dieser Bedingungen produktiver als der Stamm VL2055 scr (mit Saccharose-PTS-Genen).Table 2 shows that both sucrose-consuming strains, VL2055 scr and VL2055 csc, had the same growth characteristics and about the same amount of threonine as their parent strain VL2055 when cultured in a glucose containing medium. However, these strains accumulated more threonine at a higher yield when cultured in a sucrose-containing medium. In addition, strain VL2055 csc (with sucrose-not-PTS genes) was more productive under these conditions than strain VL2055 scr (with sucrose-PTS genes).

Beispiel 4 Präparation des Homoserin produzierenden Stammes von E. coli, der Saccharose verwerten kann, und Homoserinproduktion unter Verwendung dieses Stammes (nicht vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst)Example 4 Preparation of homoserine producing Strain of E. coli that can utilize sucrose and homoserine production using this strain (not within the scope of the present Invention)

Als ein Empfängerstamm, der Homoserin produziert, in den die PTS-Gene eingeführt wurden, wurde E. coli NZ10 rhtA23/pAL4 durch Ableitung von dem Stamm NZ10 konstruiert. Der Stamm NZ10 (thrB) ist eine leuB⁺-Revertante, die von dem E. coli-Stamm C600 (thrB, leuB) erhalten wurde (Appleyard R. K., Genetics, 39, 440-452 (1954)). Dann wurde die rhtA23-Mutation wie in Beispiel 2 beschrieben eingeführt, wobei der Stamm NZ10 rhtA23 erhalten wurde. Dieser Stamm wurde mit dem Plasmid pAL4 transformiert, welches ein pBR322-Vektor ist, in den das thrA-Gen, das für Aspartokinasehomoserindehydrogenase I kodiert, eingeführt war.As a recipient strain producing homoserine into which the PTS genes were introduced, E. coli NZ10 rhtA23 / pAL4 was constructed by derivation of strain NZ10. Strain NZ10 (thrB) is a leuB ⁺ revertant obtained from E. coli strain C600 (thrB, leuB) (Appleyard RK, Genetics, 39, 440-452 (1954)). Then, the rhtA23 mutation was introduced as described in Example 2 to give strain NZ10 rhtA23. This strain was transformed with the plasmid pAL4, which is a pBR322 vector into which the thrA gene coding for aspartokinase homoserine dehydrogenase I was introduced.

Der Homoserin produzierende Stamm NZ10 rhtA23/pAL4 wurde mit dem Phagen P1vir, der auf dem Donorstamm VD1 gezüchtet worden war, infiziert. Die Transduktanten wurde auf M9 Minimalmedium, enthalten 0,2 Saccharose und 50 mg/l Threonin, selektiert. Auf diese Weise wurden die Stämme NZ10 rhtA23 scr/pAL4 erhalten. Dieser Stamm und der Ausgangsstamm wurden jeweils 18 Stunden bei 37 °C in einer Nährbrühe kultiviert, und 3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml eines Fermentationsmediums in einem 20 × 200 ml Teströhrchen eingeimpft und 48 Stunden bei 37 °C auf einem Rotationsschüttler kultiviert.Of the Homoserine-producing strain NZ10 rhtA23 / pAL4 was treated with the phage P1vir, which had been bred on the donor strain VD1, infected. The transductants were on M9 minimal medium containing 0.2 sucrose and 50 mg / l threonine, selected. In this way, the strains were NZ10 rhtA23 scr / pAL4. This strain and the parent strain were each 18 hours at 37 ° C cultivated in a nutrient broth, and 3 ml of the obtained culture were dissolved in 3 ml of a fermentation medium in a 20 x 200 ml test tube inoculated and 48 hours at 37 ° C on a rotary shaker cultured.

Das Fermentationsmedium hatte dieselbe Zusammensetzung wie dasjenige in Beispiel 3, außer dass 0,2 g/l Threonin anstelle von Isoleucin zugegeben wurde.The Fermentation medium had the same composition as that in Example 3, except that 0.2 g / l of threonine was added instead of isoleucine.

Nach der Kultivierung wurde die angehäufte Menge Homoserin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Stamm Glucose Saccharose ^OD560 Homoserin (g/l) Ausbeute (%) OD₅₆₀ Homoserin (g/l) Ausbeute (%) NZ10rhtA23/ pAL4 19,3 7,8 9,7 – – – NZ10rhtA23 Scr/pAL4 20,0 8,0 10,0 21,4 12,2 15,2 After culturing, the accumulated amount of homoserine in the medium and the absorption of the medium at 560 nm were determined by known methods. The results are shown in Table 3. Table 3 tribe glucose sucrose ^OD 560 Homoserine (g / l) Yield (%) OD ₅₆₀ Homoserine (g / l) Yield (%) NZ10rhtA23 / pAL4 19.3 7.8 9.7 - - - NZ10rhtA23 Scr / pAL4 20.0 8.0 10.0 21.4 12.2 15.2

Tabelle 3 zeigt, dass der Stamm NZ10 rhtA23 scr/pAL4 und dessen Ausgangsstamm NZ10 rhtA23/pAL4 etwa gleichermaßen wuchsen und etwa dieselbe Menge Homoserin anhäuften, wenn sie in einem Glucose enthaltenden Medium kultiviert wurden. Der Stamm NZ10 rhtA23 scr/pAL4 häufte jedoch mehr Homoserin mit höherer Ausbeute an, wenn er in einem Saccharose enthaltenden Medium kultiviert wurde.table Figure 3 shows that strain NZ10 rhtA23 scr / pAL4 and its parent strain NZ10 rhtA23 / pAL4 grew about the same and about the same Lot of homoserine piled up, when cultured in a glucose-containing medium. The strain NZ10 rhtA23 scr / pAL4 piled up however, more homoserine with higher Yield when cultured in a sucrose-containing medium has been.

Beispiel 5 Präparation des Isoleucin produzierenden Stammes von E. coli, der Saccharose verwerten kann, und Isoleucinproduktion unter Verwendung dieses Stammes (nicht vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst)Example 5 Preparation of isoleucine-producing Strain of E. coli that can utilize sucrose and isoleucine production using this strain (not within the scope of the present Invention)

Als Isoleucin produzierendes Bakterium der Gattung Escherichia wurde E. coli K-12 Stamm 44-3-15 eingesetzt. Dieser Stamm wurde wie folgt konstruiert. Der Wildtypstamm E. coli K12 VKPM B-7 wurde als Ausgangsstamm eingesetzt. Nach den aufeinander folgenden Vorgängen der NTG-Mutagenese und der Selektion auf Resistenz gegenüber Valin, 4-Aza-DL-leucin und 3-Hydroxy-DL-leucin wurde der Stamm 44 erhalten, der mindestens zwei Mutationen im ilvGMEDA-Operon enthält. Eine Mutation in dem i1vG-Gen (ilvG*), der die Acetohydroxysäuresynthase-II-Aktivität wiederherstellt, und eine Mutation in dem ilvA-Gen (ilvA*), die die Threonindeaminase-Unempfindlichkeit gegenüber der Rückkopplungshemmung durch Isoleucin überträgt. Dieser Stamm kann eine gewisse Menge Isoleucin produzieren.When Isoleucine producing bacterium of the genus Escherichia was E. coli K-12 strain 44-3-15 used. This strain was like this constructed. The wild type strain E. coli K12 VKPM B-7 was used as the starting strain used. After the consecutive processes of NTG mutagenesis and selection for resistance to valine, 4-aza-DL-leucine and 3-hydroxy-DL-leucine, strain 44 was obtained which was at least contains two mutations in the ilvGMEDA operon. A mutation in the i1vG gene (ilvG *), which restores acetohydroxy acid synthase II activity, and a mutation in the ilvA gene (ilvA *), which is the threonine deaminase insensitivity across from the feedback inhibition transmits through isoleucine. This Strain can produce a certain amount of isoleucine.

Andererseits wurde das Plasmid pVR72, ein Derivat des Plasmids pVR4 (Gavrilova et al., 1988, Biotechnologiya (auf Russisch), 4: 600-608), das die ilvG₅MEDA₇₄₃₄YC-Gene enthielt, durch die Einführung der BamHI-Linker in die Schnittstellen von DraIII und XmaIII konstruiert. Dann wurde das BamHI-Fragment von pVR72, welches ilvG₅MEDA₇₄₃₄YC-Gene mit deletiertem Promotor und Attenuator enthielt, in pM2 kloniert, einem Mini-Mud-Vektor pMu4041-Derivat, welches den P_R- Promotor des Phagen lambda enthält. Das erhaltene Plasmid wurde für die Einführung des Mini-Mu-P_R-ilvG*MEDPA*YC-Konstrukts in das Plasmid des Stammes 44 (pMH10) wie vorstehend beschrieben eingesetzt. Nach der Induktion der Mu-Transposase wurden die Klone auf ihre Fähigkeit zur Produktion von Isoleucin getestet. Unter ihnen wurde der produktivste Stamm 44-3 selektiert. Schließlich wurde das Mini-Mu-P_R-thrA*BC-cat-Konstrukt wie vorstehend beschrieben aus C600 THr⁺, Cm^R in den Stamm 44-3 transduziert. Auf diese Weise wurde der Stamm 44-3-15 erhalten.On the other hand, the plasmid pVR72, a derivative of the plasmid pVR4 (Gavrilova et al., 1988, Biotechnologiya (in Russian), 4: 600-608) containing the ilvG ₅ MEDA ₇₄₃₄ YC genes, was replaced by the introduction of the BamHI linker constructed in the interfaces of DraIII and XmaIII. Then, the BamHI fragment of pVR72 containing ilvG ₅ MEDA ₇₄₃₄ YC genes with deleted promoter and attenuator was cloned into pM2, a mini-mamma vector pMu4041 derivative containing the P _R promoter of phage lambda. The resulting plasmid was used for the introduction of the mini Mu-P _R -ilvG * MEDPA * YC construct into the plasmid of strain 44 (pMH10) as described above. Following the induction of Mu transposase, the clones were tested for their ability to produce isoleucine. Among them, the most productive strain 44-3 was selected. Finally, the mini-Mu-P _R -thrA * BC-cat construct was transduced from strain C600 THr ⁺ , Cm ^R into strain 44-3 as described above. In this way, strain 44-3-15 was obtained.

Der Isoleucin produzierende Stamm 44-3-15 wurde mit dem Phagen P1vir, der auf den Donorstämmen VD1 oder W3350csc gezüchtet worden war, infiziert. Die Transduktanden wurden auf M9 Minimalmedium, enthaltend 0,2 Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle, selektiert. Auf diese Weise wurden die Stämme 44-3-15 scr und 44-3-15 Csc erhalten.Of the Isoleucine-producing strain 44-3-15 was probed with the phage P1vir, that on the donor strains VD1 or W3350csc bred had been infected. The transductants were reduced to M9 minimal medium, containing 0.2 sucrose as the sole carbon source. In this way, the strains became 44-3-15 scr and 44-3-15 Csc.

Diese Stämme und der Ausgangsstamm wurden 18 Stunden bei 37 °C in einer Nährbrühe kultiviert, und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurde in 3 ml eines Fermentationsmediums in einem 20 × 200 mm Teströhrchen eingeimpft und 72 Stunden bei 37 °C auf einem Rotationsschüttler kultiviert. Das Fermentationsmedium hatte die selbe Zusammensetzung wie dasjenige in Beispiel 3, außer dass Isoleucin nicht zugegeben wurde. Nach der Kultivierung wurden die zugegebene Menge Isoleucin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Stamm Glucose Saccharose ^OD560 Isoleucin (g/l) Ausbeute (%) OD₅₆₀ Isoleucin (g/l) Ausbeute (%) 44-3-15 16,1 10,4 13,0 – – – 44-3-15 Scr 16,4 10,8 13,5 16,1 13,1 16,4 44-3-15 Csc 15,3 10,5 13,1 16,0 13,6 17,0 These strains and the parent strain were cultured at 37 ° C. for 18 hours in a nutrient broth, and 0.3 ml of the obtained culture was inoculated in 3 ml of a fermentation medium in a 20 × 200 mm test tube and cultured at 37 ° C. for 72 hours on a rotary shaker , The fermentation medium had the same composition as that in Example 3, except that isoleucine was not added. After culturing, the amount of isoleucine added in the medium and the absorption of the medium at 560 nm were determined by known methods. The results are shown in Table 4. Table 4 tribe glucose sucrose ^OD 560 Isoleucine (g / l) Yield (%) OD ₅₆₀ Isoleucine (g / l) Yield (%) 44-3-15 16.1 10.4 13.0 - - - 44-3-15 Scr 16.4 10.8 13.5 16.1 13.1 16.4 44-3-15 Csc 15.3 10.5 13.1 16.0 13.6 17.0

Tabelle 4 zeigt, dass die beiden Saccharose verbrauchenden Stämme, nämlich 44-3-15 Scr und 44-3-15 Csc, dieselben Wachstumseigenschaften hatten und etwa dieselbe Menge Isoleucin wie ihr Ausgangsstamm 44-3-15 anhäuften, wenn er in einem Glucose enthaltenden Medium kultiviert wurde. Diese Stämme akkumulierten jedoch mehr Isoleucin mit höherer Ausbeute, wenn sie in einem Saccharose enthaltenden Medium kultiviert wurden. Daneben war der Stamm 44-3-15 Csc (mit dem Saccharose-nicht-PTS-Genen) unter dieser Bedingung etwas produktiver als der Stamm 44-3-15 Scr (mit Saccharose-PTS-Genen).table Figure 4 shows that the two sucrose consuming strains, 44-3-15 Scr and 44-3-15 Csc, had the same growth characteristics and about the same amount of isoleucine accumulated as their parent strain 44-3-15, if he was cultured in a glucose-containing medium. These strains accumulated however, more isoleucine with higher Yield when cultured in a sucrose-containing medium were. In addition, strain 44-3-15 Csc (with the sucrose-not-PTS gene) was under This condition somewhat more productive than the strain 44-3-15 Scr (with Sucrose PTS genes).

Beispiel 6: Präparation der Lysin produzierenden Stämme von E. coli, die Saccharose verwerten können, und Lysinproduktion unter Verwendung dieser StämmeExample 6 Preparation of Lysine Producing strains of E. coli, which can utilize sucrose, and lysine production under Use of these strains

Als Lysin produzierender Empfängerstamm wurde der E. coli Stamm VL612 eingesetzt. Dieser Stamm wurde von dem bekannten E. coli Stamm Gifl02 (Theze, J. and Saint Girons., J.When Lysine producing recipient strain the E. coli strain VL612 was used. This strain was from the known E. coli strain Gifl02 (Theze, J. and Saint Girons., J.

Bacteriol., 118, 990-998, 1974) in zwei Stufen erhalten. In der ersten Stufe wurden die Mutanten des Stammes, die gegenüber 2 mg/ml S-(2-Aminoethyl)-L-cystein resistent sind, selektiert, und unter diesen wurde der Stamm VL611 gefunden, der Lysin produzieren kann. In der zweiten Stufe wurde die Mutation rhtA23 in VL611 wie vorstehend beschrieben eingeführt, wobei der Stamm VL612 erhalten wurde.Bacteriol., 118, 990-998, 1974) in two steps. In the first stage were the mutants of the strain that were resistant to 2 mg / ml S- (2-aminoethyl) -L-cysteine are resistant, and among these, the strain VL611 found that can produce lysine. In the second stage was introduced the mutation rhtA23 in VL611 as described above, wherein the strain VL612 was obtained.

Der Stamm VL612 wurde mit dem Phagen P1vir, der auf dem Donorstamm VL478 gezüchtet worden war, infiziert. Die Transduktanten wurden auf M9 Minimalmedium, enthaltend 50 mg/l Homoserin und 0,2 Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle, selektiert. Auf diese Weise wurde der Stamm VL613 (VKPM B-3423) erhalten. Dieser Stamm und der Ausgangsstamm wurden jeweils 18 Stunden bei 37 °C in einer Nährbrühe kultiviert, und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml eines Fermentationsmediums in einem 20 × 200 ml Teströhrchen eingeimpft und 72 Stunden bei 37 °C auf einem Rotationsschüttler kultiviert. Das Fermentationsmedium hatte dieselbe Zusammensetzung wie dasjenige in Beispiel 2, außer dass 0,2 g/l Homoserin zugegeben wurde. Nach der Kultivierung wurden die angehäufte Menge Lysin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5 Stamm Glucose Saccharose ^OD560 Leucin (g/l) Ausbeute (%) OD₅₆₀ Leucin (g/l) Ausbeute (%) VL612 11,5 2,8 5,6 – – – VL613 11,2 2,7 5,4 11,4 4,2 8,4 The strain VL612 was infected with the phage P1vir, which had been grown on the donor strain VL478. The transductants were selected on M9 minimal medium containing 50 mg / l homoserine and 0.2 sucrose as the sole carbon source. In this way, strain VL613 (VKPM B-3423) was obtained. This strain and the parent strain were each cultured at 37 ° C for 18 hours in a nutrient broth, and 0.3 ml of the obtained culture was inoculated into 3 ml of a fermentation medium in a 20 x 200 ml test tube and 72 hours at 37 ° C on a rotary shaker cultured. The fermentation medium had the same composition as that in Example 2 except that 0.2 g / L of homoserine was added. After culturing, the accumulated amount of lysine in the medium and the absorption of the medium at 560 nm were determined by known methods. The results are shown in Table 5. Table 5 tribe glucose sucrose ^OD 560 Leucine (g / l) Yield (%) OD ₅₆₀ Leucine (g / l) Yield (%) VL612 11.5 2.8 5.6 - - - VL613 11.2 2.7 5.4 11.4 4.2 8.4

Tabelle 5 zeigt, dass der Stamm VL612 und der Stamm VL613 in einem Glucose enthaltenden Medium etwa gleichermaßen wuchsen und etwa dieselbe Menge Lysin anhäuften. Der Stamm VL613 häufte jedoch mehr Lysin in einer höheren Ausbeute an, wenn er in einem Saccharose enthaltenden Medium kultiviert wurde.table Figure 5 shows that strain VL612 and strain VL613 are in a glucose containing medium grew about the same and about the same Amount of lysine piled up. The strain VL613 piled up however, more lysine in a higher Yield when cultured in a sucrose-containing medium has been.

Beispiel 7: Präparation des Valin produzierenden Stammes von E. coli, der Saccharose verwerten kann, und Valinproduktion unter Verwendung dieses Stammes (nicht vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst) Example 7: Preparation of Valine Producing Strain of E. coli that can utilize sucrose and valine production using this strain (not within the scope of the present Invention)

Als Valin produzierender Stamm der Gattung Escherichia wurde der Stamm Escherichia coli VL1971 eingesetzt. Dieser Stamm ist ein Derivat des bekannten Stamms VL1970 (VKPM B-4411, US Patent Nr. 5,658,766 ), in den die Mutation rhtA23 wie in Beispiel 1 beschrieben eingeführt wurde.As a valine-producing strain of the genus Escherichia, the strain Escherichia coli VL1971 was used. This strain is a derivative of the known strain VL1970 (VKPM B-4411, U.S. Patent No. 5,658,766 ) into which the rhtA23 mutation was introduced as described in Example 1.

Der E. coli Stamm VL1971 wurde mit dem Phagen P1vir infiziert, der auf dem Donorstamm VL478 gezüchtet wurde, und auf M9 Minimalmedium, enthaltend 0,2% Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle, plattiert. Die nach 40 Stunden gewachsenen Transduktanten wurden aufgenommen, gereinigt, und unter ihnen wurde der Valin produzierende Stamm VL1972 (VKPM B-4413), der Saccharose verwerten kann, selektiert.Of the E. coli strain VL1971 was infected with phage P1vir the donor strain VL478 was bred and M9 minimal medium containing 0.2% sucrose sole carbon source, plated. The grown after 40 hours Transductants were ingested, purified, and among them the valine-producing strain VL1972 (VKPM B-4413), the sucrose can recycle, selected.

VL1971 und VL1972 wurden jeweils 18 Stunden bei 37 °C in einer Nährbrühe kultiviert, und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml eines Fermentationsmediums in einem 20 × 200 mm Teströhrchen eingeimpft und 72 Stunden bei 37 °C auf einem Rotationsschüttler kultiviert. Das Fermentationsmedium hatte die selbe Zusammensetzung wie dasjenige in Beispiel 3.VL1971 and VL1972 were each cultured at 37 ° C for 18 hours in a nutrient broth, and 0.3 ml of the obtained Culture was done in 3 ml of a fermentation medium in a 20 x 200 mm test tube inoculated and 72 hours at 37 ° C on a rotary shaker cultured. The fermentation medium had the same composition like the one in example 3.

Nach der Kultivierung wurde die angehäufte Menge Valin in dem Medium und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Stamm Glucose Saccharose OD₅₆₀ Valin(g/l) Ausbeute (%) OD₅₆₀ Valin (g/l) Ausbeute (%) VL1971 12,4 8,0 10,0 – – – VL1972 12,6 8,2 10,2 14,4 11,2 14,0 After culturing, the accumulated amount of valine in the medium and the absorption of the medium at 560 nm were determined by known methods. The results are shown in Table 6. Table 6 tribe glucose sucrose OD ₅₆₀ Valine (g / l) Yield (%) OD ₅₆₀ Valine (g / l) Yield (%) VL1971 12.4 8.0 10.0 - - - VL1972 12.6 8.2 10.2 14.4 11.2 14.0

Tabelle 6 zeigt, dass VL1971 und VL1972 gleichermaßen wuchsen und etwa dieselbe Menge Valin anhäuften, wenn sie in Glucose enthaltenden Medium kultiviert wurden. Der Stamm VL1972 häufte jedoch Valin in höherer Ausbeute an, wenn er in einem Saccharose enthaltenden Medium kultiviert wurde.table Figure 6 shows that VL1971 and VL1972 grew equally and about the same Amount of valine piled up, when cultured in glucose-containing medium. The strain VL1972 piled up however, valine in higher Yield when cultured in a sucrose-containing medium has been.

Es sei angemerkt, dass PTS-Saccharose-Gene die höhere Produktivität auf Valinproduzenten übertragen, obwohl Phosphoenolpyruvat für die Valinsynthese nicht erforderlich ist.It it should be noted that PTS sucrose genes confer higher productivity on valine producers, although phosphoenolpyruvate for the valine synthesis is not required.

Beispiel 8: Präparation des Tryptophan produzierenden Stammes von E. coli, der Saccharose verwerten kann, und die Tryptophanproduktion unter Verwendung dieses Stammes (nicht vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst)Example 8: Preparation of the tryptophan-producing Strain of E. coli that can utilize sucrose and tryptophan production using this strain (not within the scope of the present Invention)

Als Empfängerstamm des Bakteriums der Gattung Escherichia wurde der Stamm SV164(pGH5) ( WO94/08031 ) eingesetzt.As a recipient strain of the bacterium of the genus Escherichia strain SV164 (pGH5) ( WO94 / 08031 ) used.

Der Tryptophan überproduzierende Stamm SV164 (pGH5) wurde mit dem Phagen P1vir, der auf den Donorstämmen VD1 oder W3350csc gezüchtet worden war, infiziert. Die Transduktanten wurden auf M9 Minimalmedium selektiert, welches 50 mg/l Tyrosin, 50 mg/ml Phenylalanin, 0,2 Saccharose als alleinige Kohlenstoffquelle und 15 mg/l Tetracyclin enthielt. Auf diese Weise wurden die Stämme SV164scr (pGH5) bzw. SV164csc (pGH5) erhalten.The tryptophan overproducing strain SV164 (pGH5) was infected with the phage P1vir grown on the donor strains VD1 or W3350csc. The transductants were on M9 Mini medium containing 50 mg / l tyrosine, 50 mg / ml phenylalanine, 0.2 sucrose as the sole carbon source and 15 mg / l tetracycline. In this way strains SV164scr (pGH5) and SV164csc (pGH5) were obtained.

Diese Stämme und der Ausgangsstamm wurden jeweils 18 Stunden bei 29 °C in einer Nährbrühe kultiviert, und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung in einem 20 × 200 mm Teströhrchen eingeimpft und 40 Stunden bei 29 °C auf einem Rotationsschüttler kultiviert. Zusammensetzung des Fermentationsmediums (g/l): Glucose (oder Saccharose) 40 Phenylalanin 0,1 Tyrosin 0,1 (NH₄)₂SO₄ 15 K₂HPO₄ 1,5 NaCl 0,5 MgSO₄·7H₂O 0,3 CaCl₂*2H₂O 0,015 FeSO₄·7H₂O 0,075 Na₃-Citrat 1 Na₂MoO₄·2H₂O 0,00015 H₃BO₃ 0,0025 COCl₂·6H₂O 0,0007 CuSO₄·5H₂O 0,00025 MnCl₂·4H₂O 0,0016 ZnSO₄·7H₂O 0,0003 Thiamin HCl 0,005 Pyrodixin 0,03 Feststoffe der Maisquellflüssigkeit (Ajinomoto) 2 CaCO₃ 30 Tetracyclin 0,015 These strains and the parent strain were each cultured at 29 ° C for 18 hours in a nutrient broth, and 0.3 ml of the obtained culture was inoculated into 3 ml of a fermentation medium of the following composition in a 20 x 200 mm test tube and at 29 ° C for 40 hours cultivated on a rotary shaker. Composition of the fermentation medium (g / l): Glucose (or sucrose) 40 phenylalanine 0.1 tyrosine 0.1 (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 15 K ₂ HPO ₄ 1.5 NaCl 0.5 MgSO ₄ .7H ₂ O 0.3 CaCl ₂ * 2H ₂ O 0,015 FeSO ₄ .7H ₂ O 0,075 Na ₃ citrate 1 Na ₂ MoO ₄ .2H ₂ O 0.00015 H ₃ BO ₃ 0.0025 COCl ₂ .6H ₂ O 0.0007 CuSO ₄ .5H ₂ O 0.00025 MnCl ₂ .4H ₂ O 0.0016 ZnSO ₄ .7H ₂ O 0.0003 Thiamine HCl 0.005 Pyrodixin 0.03 Solids of corn steep liquor (Ajinomoto) 2 CaCO ₃ 30 tetracycline 0,015

Nach der Kultivierung wurden die angehäufte Menge Tryptophan und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Aus Tabelle 7 geht hervor, dass beide Saccharose verwertenden Stämme, nämlich SV164scr (pGH5) und SV164csc (pGH5), nahezu dieselben Wachstumseigenschaften und etwa dieselbe angehäufte Menge Tryptophan wie ihr Ausgangsstamm SV164 (pGH5) hatten, wenn sie in einem Glucose enthaltenden Medium kultiviert wurden. Diese Stämme häuften jedoch mehr Tryptophan mit höherer Ausbeute an, wenn sie in Saccharose enthaltendem Medium kultiviert wurden. Der Stamm SV164csc (pGH5) (mit Saccharose- nicht-PTS-Genen) war unter dieser Bedingung produktiver als der Stamm SV164scr (pGH5) (mit Saccharose PTS-Genen). Tabelle 7 Stamm Glucose Saccharose OD₅₆₀ Tryptophan (g/l) Ausbeute (%) _OD560 Tryptophan (g/l) Ausbeute (%) SV164 (pGH5) 6,0 5,0 12,5 – – – SV164scr (pGH5) 6,2 5,1 12,7 6,2 5,5 13,7 SV164csc (pGH5) 6,0 5,0 12,5 6,2 5,6 14,0 After culturing, the accumulated amount of tryptophan and the absorption of the medium at 560 nm were determined by known methods. The results are shown in Table 7. From Table 7 it can be seen that both sucrose-utilizing strains, SV164scr (pGH5) and SV164csc (pGH5), had nearly the same growth characteristics and about the same accumulated amount of tryptophan as their parent strain SV164 (pGH5) when cultured in a glucose containing medium , However, these strains accumulated more tryptophan in higher yield when cultured in sucrose-containing medium. Strain SV164csc (pGH5) (with sucrose-non-PTS genes) was more productive under this condition than strain SV164scr (pGH5) (with sucrose PTS genes). Table 7 tribe glucose sucrose OD ₅₆₀ Tryptophan (g / l) Yield (%) _OD 560 Tryptophan (g / l) Yield (%) SV164 (pGH5) 6.0 5.0 12.5 - - - SV164scr (pGH5) 6.2 5.1 12.7 6.2 5.5 13.7 SV164csc (pGH5) 6.0 5.0 12.5 6.2 5.6 14.0

Claims (2)

Verfahren zur Produktion von Lysin, welches die Stufe umfasst, bei der ein Bakterium der Gattung Escherichia in einem Kulturmedium, welches Saccharose als Hauptkohlenstoffquelle enthält, kultiviert wird, wobei das Bakterium aus einem Saccharose nicht-assimilierenden Stamm der Gattung Escherichia konstruiert worden ist, wobei das Bakterium Saccharose-PTS-Gene aus Escherichia coli VKPM 3-7915 enthält und die Fähigkeit hat, Lysin in einem Kulturmedium, das Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle enthält, zu produzieren und anzuhäufen.A process for producing lysine, which comprises the step of cultivating a bacterium of the genus Escherichia in a culture medium containing sucrose as the main carbon source, the bacterium being constructed from a non-assimilating sucrose strain of the genus Escherichia, said bacterium containing sucrose PTS genes from Escherichia coli VKPM 3-7915 and having the ability to recover lysine in a culture medium containing sucrose as sole carbon source, to produce and to accumulate. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bakterium der Gattung Escherichia Escherichia coli ist.The method of claim 1, wherein the bacterium is the Genus Escherichia Escherichia coli is.