JP2009165355A

JP2009165355A - L-amino acid-producing microorganism and method for producing l-amino acid

Info

Publication number: JP2009165355A
Application number: JP2006124692A
Authority: JP
Inventors: Yoko Asakura; 陽子朝倉
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2006-04-28
Publication date: 2009-07-30
Also published as: DK2017332T3; EP2017332A1; US8293505B2; WO2007125954A1; ATE554159T1; US20090104667A1; EP2017332A4; EP2017332B1

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a strain belonging to the family Enterobacteriaceae and efficiently producing an L-amino acid, and to provide a method for efficiently producing an L-amino acid using the strain. <P>SOLUTION: An L-amino acid is produced by culturing a microorganism producing an L-amino acid, which belongs to the family Enterobacteriaceae and is modified so as to have orotate phosphoribosyltransferase activity in a culture medium to produce and accumulate the L-amino acid in the medium or cells, and collecting the L-amino acid from the medium or the cells. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製造法に関する。例えば、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、アミノ酸輸液等として、Ｌ−グルタミン酸は調味料として、産業上有用なＬ−アミノ酸である。 The present invention relates to a method for producing an L-amino acid using a microorganism, and particularly to a method for producing an L-amino acid such as L-lysine, L-threonine, L-glutamic acid and the like. For example, L-lysine and L-threonine are industrially useful L-amino acids as additives for animal feeds, health food ingredients, amino acid infusions, etc., and L-glutamic acid as a seasoning.

Ｌ−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。例えば、Ｌ−リジンの製造法としては、例えば、特許文献１〜８に記載された方法を挙げることができる。これらの製造法においては、自然界から分離された菌株または該菌株の人工変異株、さらには、組換えＤＮＡ技術により塩基性Ｌ−アミノ酸生合成酵素の活性が増強するように改変された微生物などが用いられている。 L-amino acids are industrially produced by fermentation using microorganisms belonging to the genera Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia and the like. For example, as a manufacturing method of L-lysine, the method described in patent documents 1-8 can be mentioned, for example. In these production methods, strains isolated from the natural world or artificial mutants of the strains, and microorganisms modified to enhance the activity of basic L-amino acid biosynthetic enzymes by recombinant DNA technology, etc. It is used.

オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ [EC:2.4.2.102.10]は、ピリミジン生合成系の酵素であり、pyrE遺伝子によってコードされている。pyrEはその上流にあるrph（RNase PHをコードする）とオペロンを成すが、エシェリヒア・コリMG1655やW3110では、rphのコード領域の３’末端領域に−１のフレームシフトがあり、その影響でpyrEの発現量が不十分となり、ピリミジン飢餓になると考えられている。(非特許文献１) Orotic acid phosphoribosyltransferase [EC: 2.4.2.102.10] is an enzyme of the pyrimidine biosynthesis system and is encoded by the pyrE gene. pyrE forms an operon with the upstream rph (encodes RNase PH), but Escherichia coli MG1655 and W3110 have a frame shift of -1 at the 3 'end region of the rph coding region, and this causes pyrE. It is thought that the expression level of is insufficient, resulting in pyrimidine starvation. (Non-Patent Document 1)

しかし、rph-pyrE オペロンの発現量、pyrE遺伝子産物の発現量、及びオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性と、腸内細菌による物質生産との関連については知られていなかった。
欧州特許第0643135号公報欧州特許第0733712号公報欧州特許出願公開第1477565号公報欧州特許出願公開第0796912号公報欧州特許出願公開第0837134号公報国際公開第WO01/53459号パンフレット欧州特許出願公開第1170376号公報国際公開第WO2005/010175号パンフレット Journal of Bacteriology, vol. 175, June 1993, p3401-3407 However, the relationship between the expression level of the rph-pyrE operon, the expression level of the pyrE gene product, and the orotate phosphoribosyltransferase activity and substance production by enteric bacteria has not been known.
European Patent No. 0643135 European Patent No. 0733712 European Patent Application Publication No. 1477565 European Patent Application Publication No. 0796912 European Patent Application Publication No. 0837134 International Publication No. WO01 / 53459 Pamphlet European Patent Application Publication No. 1170376 International Publication No. WO2005 / 010175 Pamphlet Journal of Bacteriology, vol. 175, June 1993, p3401-3407

本発明は、Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる腸内細菌科に属する菌株を提供すること、及び該菌株を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a strain belonging to the family Enterobacteriaceae that can efficiently produce an L-amino acid, and to provide a method for efficiently producing an L-amino acid using the strain. .

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強させた微生物を用いることにより、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that an L-amino acid can be efficiently produced by using a microorganism having enhanced orotate phosphoribosyltransferase activity. It came to be completed.

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物。
（２）オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥ遺伝子の発現量を増大させること、及び／または、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの翻訳量を増大させることによりオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された前記微生物
（３）オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥ遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された、前記微生物。
（４）ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンを有し、ｒｐｈ遺伝子のコード領域に−１のフレームシフト変異を生来有する微生物を改変することによって得られる微生物であって、前記フレームシフト変異を解消する変異が導入されたことにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された前記微生物。
（５）ｐｙｒＥ遺伝子の上流のアテニュエーターを欠損したことにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された前記微生物。
（６）前記オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼが、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である、前記微生物：
（Ａ）配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号１２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（７）前記ｐｙｒＥ遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記微生物：
（ａ）配列番号１１の塩基番号７８２〜１４２３の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１１の塩基番号７８２〜１４２３の塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン及びＬ−グルタミン酸からなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である前記微生物。
（９）前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である前記微生物。
（１０）前記微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
（１１）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン及びＬ−グルタミン酸からなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である、前記方法。 That is, the present invention is as follows.
(1) A microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae, which has L-amino acid-producing ability and has been modified to enhance orotate phosphoribosyltransferase activity.
(2) The microorganism in which orotate phosphoribosyltransferase activity is enhanced by increasing the expression level of the pyrE gene encoding orotate phosphoribosyltransferase and / or increasing the translation amount of orotate phosphoribosyltransferase (3) The microorganism as described above, wherein the orotate phosphoribosyltransferase activity is enhanced by increasing the copy number of the pyrE gene encoding orotate phosphoribosyltransferase or by modifying the expression regulatory sequence of the gene.
(4) A microorganism obtained by modifying a microorganism having an rph-pyrE operon and having a frame shift mutation of −1 in the coding region of the rph gene, wherein the mutation that eliminates the frame shift mutation is introduced. Thus, the microorganism having enhanced orotate phosphoribosyltransferase activity.
(5) The microorganism as described above, wherein the orotate phosphoribosyltransferase activity is enhanced by deleting the attenuator upstream of the pyrE gene.
(6) The microorganism, wherein the orotate phosphoribosyltransferase is a protein according to the following (A) or (B):
(A) a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12,
(B) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, having an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acid residues, and having orotate phosphoribosyltransferase activity Protein.
(7) The microorganism, wherein the pyrE gene is the DNA described in (a) or (b) below:
(A) a DNA comprising the nucleotide sequence of nucleotide numbers 782-1423 of SEQ ID NO: 11,
(B) It hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence of base numbers 782-1423 of SEQ ID NO: 11 or a probe that can be prepared from the base sequence, and has orotate phosphoribosyltransferase activity DNA encoding a protein having the same.
(8) The L-amino acid is L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-isoleucine, L-valine, L-leucine, L-threonine, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-tryptophan, L The microorganism as described above, which is one or more L-amino acids selected from the group consisting of cysteine and L-glutamic acid.
(9) The microorganism as described above, wherein the microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae is an Escherichia bacterium, an Enterobacter bacterium, or a Pantoea bacterium.
(10) A method for producing an L-amino acid, comprising culturing the microorganism in a medium, producing and accumulating the L-amino acid in the medium or in the fungus body, and recovering the L-amino acid from the medium or the fungus body. .
(11) The L-amino acid is L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-isoleucine, L-valine, L-leucine, L-threonine, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-tryptophan, L -The method as described above, which is one or more L-amino acids selected from the group consisting of cysteine and L-glutamic acid.

本発明の微生物を用いることにより、効率よく、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリンなどの塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシンなどの脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリンなどのヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリンなどの環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファンなどの芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニンなどの含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギンなどの酸性アミノ酸を発酵生産することが出来る。 By using the microorganism of the present invention, basic amino acids such as L-lysine, L-ornithine, L-arginine, L-histidine, L-citrulline, L-isoleucine, L-alanine, L-valine, L -Aliphatic amino acids such as leucine and L-glycine, amino acids which are hydroxymonoaminocarboxylic acids such as L-threonine and L-serine, cyclic amino acids such as L-proline, L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan Aromatic amino acids such as, sulfur-containing amino acids such as L-cysteine, L-cystine and L-methionine, and acidic amino acids such as L-glutamic acid, L-aspartic acid, L-glutamine and L-asparagine can be produced by fermentation. .

以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物であって、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物である。ここで、Ｌ−アミノ酸生産能とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、培地中または菌体から回収できる程度にＬ−アミノ酸を生成し、蓄積する能力をいう。なお、本発明の微生物は複数のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
<1> Microorganism of the Present Invention The microorganism of the present invention is a microorganism having the ability to produce L-amino acids and belonging to the family Enterobacteriaceae, which has been modified so that the activity of orotate phosphoribosyltransferase is enhanced. Here, the L-amino acid-producing ability refers to the ability to produce and accumulate L-amino acids to the extent that they can be recovered from the medium or cells when the microorganism of the present invention is cultured in the medium. The microorganism of the present invention may be capable of producing a plurality of L-amino acids. The microorganism having L-amino acid-producing ability may be inherently L-amino acid-producing ability, but the following microorganisms can be obtained by using a mutation method or recombinant DNA technology, It may be modified so as to have L-amino acid production ability.

Ｌ−アミノ酸の種類は特に制限されないが、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン等の塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシン等の脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリン等の環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等の芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン等の含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン等の酸性アミノ酸が挙げられる。中でもＬ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、及びＬ−グルタミン酸が好ましく、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−スレオニンが特に好ましい。 The type of L-amino acid is not particularly limited, but basic amino acids such as L-lysine, L-ornithine, L-arginine, L-histidine, L-citrulline, L-isoleucine, L-alanine, L-valine, L- Aliphatic amino acids such as leucine and L-glycine, amino acids which are hydroxymonoaminocarboxylic acids such as L-threonine and L-serine, cyclic amino acids such as L-proline, L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan Aromatic amino acids, sulfur-containing amino acids such as L-cysteine, L-cystine and L-methionine, and acidic amino acids such as L-glutamic acid, L-aspartic acid, L-glutamine and L-asparagine. Among these, L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-isoleucine, L-valine, L-leucine, L-threonine, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-cysteine, and L-glutamic acid are preferable. Glutamic acid and L-threonine are particularly preferred.

＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与
本発明の微生物の親株としては、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌を代表とする腸内細菌科に属する微生物を用いることができる。その他の腸内細菌科に属する微生物としては、エンテロバクター（Enterobacter）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌科に属する微生物が挙げられる。 <1-1> Providing L-amino acid-producing ability As the parent strain of the microorganism of the present invention, microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae such as Escherichia bacteria and Pantoea bacteria can be used. . Other microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae include the genus Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella, Morganella, etc. Examples include microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae belonging to γ-proteobacteria.

エシェリヒア属細菌としては、ナイトハルトらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えばK12株又はその誘導体、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）等が挙げられる。これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America）。 Table 1. In FD Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Escherichia bacteria (Backmann, BJ 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Salmonella Cellular and Molecular Biology / Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, DC) such as Escherichia coli can be used. Examples of wild strains of Escherichia coli include the K12 strain or derivatives thereof, Escherichia coli MG1655 strain (ATCC No. 47076), and W3110 strain (ATCC No. 27325). These can be obtained, for example, from the American Type Culture Collection (ATCC) (address P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America).

また、エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）等に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであ
れば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６６１５）、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭＢＰ−７２０７）及びそれらの誘導体などを用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。 Examples of Enterobacter bacteria include Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, and the like, and Pantoea ananatis is an example of Pantoea bacteria. In recent years, Enterobacter agglomerans has been reclassified as Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, etc., by base sequence analysis of 16S rRNA. There is something. In the present invention, any substance belonging to the genus Enterobacter or Pantoea may be used as long as it is classified into the family Enterobacteriaceae. When breeding Pantoea ananatis using genetic engineering techniques, Pantoea ananatis AJ13355 strain (FERM BP-6614), AJ13356 strain (FERM)
BP-6615), AJ13601 strain (FERM BP-7207) and derivatives thereof can be used. These strains were identified as Enterobacter agglomerans when they were isolated, and deposited as Enterobacter agglomerans, but as described above, they have been reclassified as Pantoea Ananatis by 16S rRNA sequence analysis, etc. .

以下、上述したような親株にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又はこれらの親株にのＬ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された遺伝子組換え株の創製等、従来、エシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。 Hereinafter, a method for imparting L-amino acid-producing ability to the parent strain as described above, or a method for enhancing L-amino acid-producing ability for these parent strains will be described.
To impart L-amino acid-producing ability, acquisition of auxotrophic mutants, analog resistant strains or metabolic control mutants, creation of genetically modified strains with enhanced expression of L-amino acid biosynthetic enzymes, etc. Conventionally, methods that have been adopted for breeding Escherichia bacteria and the like can be applied (see Amino Acid Fermentation, Society Publishing Center, Inc., first published on May 30, 1986, pages 77 to 100). Here, in the breeding of L-amino acid-producing bacteria, properties such as auxotrophy, analog resistance, and metabolic control mutation may be used singly or in combination of two or more. In addition, L-amino acid biosynthesis enzymes whose expression is enhanced may be used alone or in combination of two or more. Furthermore, imparting properties such as auxotrophy, analog resistance, and metabolic regulation mutation may be combined with enhancement of biosynthetic enzymes.

Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルフォネート（EMS）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。 An auxotrophic mutant having L-amino acid-producing ability, an L-amino acid analog-resistant strain, or a metabolically controlled mutant is obtained by subjecting a parent strain or a wild strain to normal mutation treatment, that is, irradiation with X-rays or ultraviolet rays, or N-methyl -N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), treated with a mutagen such as ethyl methanesulfonate (EMS), etc., among the obtained mutant strains, auxotrophy, analog resistance, or metabolism It can be obtained by selecting those that show regulatory mutations and have the ability to produce L-amino acids.

遺伝子組換えとしては、目的Ｌ−アミノ酸の生合成に関する酵素をコードする遺伝子の発現を増強する方法や、目的Ｌ−アミノ酸の分解に関する酵素をコードする遺伝子の活性を低下させる方法などが挙げられる。 Examples of the gene recombination include a method of enhancing the expression of a gene encoding an enzyme related to the biosynthesis of the target L-amino acid, a method of reducing the activity of the gene encoding the enzyme related to the degradation of the target L-amino acid, and the like.

以下、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物の具体例を挙げるが、本発明において使用することができる微生物は以下のものには限定されない。 Hereinafter, although the specific example of the microorganisms which have L-amino acid production ability is given, the microorganisms which can be used in this invention are not limited to the following.

（Ｌ−スレオニン生産菌）
本発明のＬ−スレオニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。 (L-threonine producing bacteria)
Examples of parent strains for inducing the L-threonine producing bacterium of the present invention include E. coli TDH-6 / pVIC40 (VKPM B-3996) (US Pat. No. 5,175,107, US Pat. No. 5,705,371), E. coli 472T23 / pYN7 (ATCC 98081) (U.S. Patent No. 5,631,157), E. coli NRRL-21593 (U.S. Patent No. 5,939,307), E. coli FERM BP-3756 (U.S. Patent No. 5,474,918), E. coli FERM BP- 3519 and FERM BP-3520 (US Pat.No. 5,376,538), E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978)), E. coli VL643 and VL2055 (EP 1149911 A ) And other strains belonging to the genus Escherichia, but are not limited thereto.

TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、
オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。 The TDH-6 strain lacks the thrC gene and is sucrose-utilizing, and the ilvA gene has a leaky mutation. This strain also has a mutation in the rhtA gene that confers resistance to high concentrations of threonine or homoserine. The B-3996 strain carries the plasmid pVIC40 in which the thrA * BC operon containing the mutated thrA gene is inserted into the RSF1010-derived vector. This mutant thrA gene encodes aspartokinase homoserine dehydrogenase I which is substantially desensitized to feedback inhibition by threonine. B-3996 shares were released on November 19, 1987.
Deposited under the accession number RIA 1867 at the All Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia). The strain was also deposited with the accession number B-3996 on 7 April 1987 at Lucian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia). Has been.

E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、本発明のＬ−スレオニン生産菌を誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)に、受託番号VKPM B-5318で寄託されている。 E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B) can also be used as a parent strain for inducing the L-threonine producing bacterium of the present invention. The B-5318 strain is isoleucine non-required, and the control region of the threonine operon in the plasmid pVIC40 is replaced by a temperature sensitive lambda phage C1 repressor and a PR promoter. VKPM B-5318 has been deposited with Lucian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) on May 3, 1990 under the accession number VKPM B-5318.

好ましくは、本発明の細菌は、さらに、下記の遺伝子の１種以上の発現が増大するように改変されたものである。 Preferably, the bacterium of the present invention is further modified so that expression of one or more of the following genes is increased.

スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子
ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子
スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子
推定トランスメンブランタンパク質をコードするrhtA遺伝子
アスパルテート−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子
アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子 Aspartate kinase β-semialdehyde dehydrogenase encoding thrC gene putative transmembrane protein encoding thrB gene threonine synthase encoding mutant thrA gene encoding homoserine kinase resistant to aspartokinase homoserine dehydrogenase I resistant to feedback inhibition by threonine Asd gene encoding aspC gene encoding aspartate aminotransferase (aspartate transaminase)

E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている（ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990）。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。E. coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている（ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990）。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する（WO2005/049808, WO2003/097839）。 The thrA gene encoding aspartokinase homoserine dehydrogenase I of E. coli has been elucidated (nucleotide numbers 337-2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990). The thrA gene is located between the thrL gene and the thrB gene in the chromosome of E. coli K-12. The thrB gene encoding E. coli homoserine kinase has been elucidated (nucleotide numbers 2801 to 3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990). The thrB gene is located between the thrA gene and the thrC gene in the chromosome of E. coli K-12. The thrC gene encoding threonine synthase from E. coli has been elucidated (nucleotide numbers 3734-5020, GenBank accession NC — 000913.2, gi: 49175990). The thrC gene is located between the thrB gene and the yaaX open reading frame in the chromosome of E. coli K-12. All three of these genes function as a single threonine operon. To increase the expression of the threonine operon, the attenuator region that affects transcription is preferably removed from the operon (WO2005 / 049808, WO2003 / 097839).

スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。 The mutant thrA gene encoding aspartokinase homoserine dehydrogenase I, which is resistant to feedback inhibition by threonine, and the thrB and thrC genes are one operon from the well-known plasmid pVIC40 present in the threonine producing strain E. coli VKPM B-3996. Can be obtained as Details of plasmid pVIC40 are described in US Pat. No. 5,705,371.

rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651,
GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている（rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性）。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している（ABSTRACTS of the
17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation
with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A）。 The rhtA gene is present at 18 minutes of the E. coli chromosome close to the glnHPQ operon, which encodes an element of the glutamine transport system. The rhtA gene is ORF1 (ybiF gene, nucleotide numbers 764 to 1651,
GenBank accession number AAA218541, gi: 440181), and located between the pexB gene and the ompX gene. The unit that expresses the protein encoded by ORF1 is called rhtA gene (rht: resistant to homoserine and threonine). It has also been found that the rhtA23 mutation is a G → A substitution at position −1 relative to the ATG start codon (ABSTRACTS of the
17 ^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation
with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A).

E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており（ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307）、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる（White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照）。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。 The asd gene of E. coli has already been clarified (nucleotide numbers 3572511 to 3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi: 16131307) and can be obtained by PCR using primers prepared based on the base sequence of the gene. Yes (see White, TJ et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)). The asd gene of other microorganisms can be obtained similarly.

また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており（ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895）、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。 In addition, the aspC gene of E. coli has already been clarified (nucleotide numbers 983742 to 984932, GenBank accession NC_000913.1, gi: 16128895) and can be obtained by PCR. The aspC gene of other microorganisms can be obtained similarly.

（Ｌ−リジン生産菌）
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（AEC）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、E. coli AJ11442（FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照）及びE. coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。 (L-lysine producing bacteria)
Examples of L-lysine producing bacteria belonging to the genus Escherichia include mutants having resistance to L-lysine analogs. L-lysine analogues inhibit the growth of bacteria belonging to the genus Escherichia, but this inhibition is completely or partially desensitized when L-lysine is present in the medium. Examples of L-lysine analogs include, but are not limited to, oxalysine, lysine hydroxamate, S- (2-aminoethyl) -L-cysteine (AEC), γ-methyllysine, α-chlorocaprolactam, and the like. . Mutant strains resistant to these lysine analogs can be obtained by subjecting bacteria belonging to the genus Escherichia to normal artificial mutation treatment. Specific examples of bacterial strains useful for the production of L-lysine include E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; see US Pat. No. 4,346,170) and E. coli VL611. In these microorganisms, feedback inhibition of aspartokinase by L-lysine is released.

WC196株は、E. coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、E. coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、E. coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている（米国特許第5,827,698号）。 The WC196 strain can be used as an L-lysine producing bacterium of E. coli. This strain was bred by conferring AEC resistance to the W3110 strain derived from E. coli K-12. This strain was named E. coli AJ13069, and on December 6, 1994, National Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (now National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center, Ibaraki, 305-8566, Japan Deposited as FERM P-14690 in Tsukuba City, Higashi 1-chome, 1-chome, 1st 6th), transferred to international deposit based on the Budapest Treaty on September 29, 1995, and given accession number FERM BP-5252 (US Pat. No. 5,827,698).

本発明のＬ−リジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大している株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子(dapA)、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(asd)及びアスルターゼ遺伝子(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。 Examples of parent strains for inducing the L-lysine-producing bacterium of the present invention also include strains in which expression of one or more genes encoding L-lysine biosynthetic enzymes are increased. Examples of such genes include dihydrodipicolinate synthase gene (dapA), aspartokinase gene (lysC), dihydrodipicolinate reductase gene (dapB), diaminopimelate decarboxylase gene (lysA), diaminopimelate dehydrogenase gene (ddh (US Pat. No. 6,040,160), phosphoenolpyruvate carboxylase gene (ppc), aspartate semialdehyde dehydrogenase gene (asd) and aslutase gene (aspA) (EP 1253195 A). In addition, the parent strain is a gene involved in energy efficiency (cyo) (EP 1170376 A), a gene encoding nicotinamide nucleotide transhydrogenase (pntAB) (US Pat.No. 5,830,716), a ybjE gene (WO2005 / 073390), or The expression level of these combinations may be increased.

本発明のＬ−リジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の
化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。 Examples of the parent strain for inducing the L-lysine producing bacterium of the present invention include a decrease or deficiency in the activity of an enzyme that catalyzes a reaction that branches off from the L-lysine biosynthesis pathway to produce a compound other than L-lysine. The stock which is doing is also mentioned. Examples of enzymes that catalyze reactions that branch off from the biosynthetic pathway of L-lysine to produce compounds other than L-lysine include homoserine dehydrogenase, lysine decarboxylase (US Pat. No. 5,827,698), and malate enzyme ( WO2005 / 010175).

（Ｌ−システイン生産菌）
本発明のＬ−システイン生産菌を誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする複数種のcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。 (L-cysteine producing bacteria)
Examples of parent strains for inducing the L-cysteine-producing bacterium of the present invention include E. coli JM15 (US Pat. No. 6,218,168) transformed with multiple cysE alleles encoding a feedback inhibition resistant serine acetyltransferase. (Russian Patent Application No. 2003121601), E. coli W3110 (US Pat.No. 5,972,663) with overexpressed gene encoding a protein suitable for excretion of toxic substances into cells, cysteine desulfohydrase activity decreased Examples include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia such as E. coli strain (JP11155571A2) and E. coli W3110 (WO0127307A1), which has an increased activity of the positive transcriptional regulator of the cysteine regulon encoded by the cysB gene. .

（Ｌ−ロイシン生産菌）
本発明のＬ−ロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。 (L-leucine producing bacteria)
Examples of parent strains for inducing the L-leucine-producing bacterium of the present invention include leucine-resistant E. coil strains (for example, 57 strain (VKPM B-7386, US Pat. No. 6,124,121)) or β-2-thienyl. E. coli strains resistant to leucine analogs such as alanine, 3-hydroxyleucine, 4-azaleucine, 5,5,5-trifluoroleucine (JP-B-62-34397 and JP-A-8-70879), WO96 / 06926 Examples include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia such as E. coli strains and E. coli H-9068 (Japanese Patent Laid-Open No. 8-70879) obtained by the described genetic engineering methods.

本発明の細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。 The bacterium of the present invention may be improved by increasing the expression of one or more genes involved in L-leucine biosynthesis. As an example of such a gene, a gene of leuABCD operon represented by a mutant leuA gene (US Pat. No. 6,403,342) encoding isopropyl malate synthase preferably released from feedback inhibition by L-leucine is mentioned. . Furthermore, the bacterium of the present invention may be improved by increasing the expression of one or more genes encoding proteins that excrete L-amino acids from bacterial cells. Examples of such genes include b2682 gene and b2683 gene (ygaZH gene) (EP 1239041 A2).

（Ｌ−ヒスチジン生産菌）
本発明のＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM
B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116
- B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM
BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E.
coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。 (L-histidine producing bacteria)
Examples of the parent strain for inducing the L-histidine producing bacterium of the present invention include E. coli 24 strain (VKPM
B-5945, RU2003677), E. coli 80 strain (VKPM B-7270, RU2119536), E. coli NRRL B-12116
-B12121 (U.S. Pat.No. 4,388,405), E. coli H-9342 (FERM BP-6675) and H-9343 (FERM
BP-6676) (U.S. Pat.No. 6,344,347), E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087), E. coli.
Examples include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia such as E. coli AI80 / pFM201 (US Pat. No. 6,258,554).

本発明のＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisIE)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。 Examples of parent strains for inducing the L-histidine-producing bacterium of the present invention include strains in which expression of one or more genes encoding L-histidine biosynthetic enzymes are increased. Examples of such genes include ATP phosphoribosyltransferase gene (hisG), phosphoribosyl AMP cyclohydrolase gene (hisI), phosphoribosyl-ATP pyrophosphohydrolase gene (hisIE), phosphoribosylformimino- 5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase gene (hisA), amide transferase gene (hisH), histidinol phosphate aminotransferase gene (hisC), histidinol phosphatase gene (hisB), histidinol dehydrogenase gene (hisD), etc. Is mentioned.

hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより
阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。 L-histidine biosynthetic enzymes encoded by hisG and hisBHAFI are known to be inhibited by L-histidine, and therefore L-histidine-producing ability is feedback-inhibited by the ATP phosphoribosyltransferase gene (hisG). Can be efficiently increased by introducing mutations that confer resistance to (Russian Patent Nos. 2003677 and 2119536).

Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子であるrhtを導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。 Specific examples of strains capable of producing L-histidine include E. coli FERM-P 5038 and 5048 into which a vector holding a DNA encoding an L-histidine biosynthetic enzyme has been introduced (Japanese Patent Laid-Open No. 56-005099). E. coli strain (EP1016710A) introduced with rht, which is an amino acid transport gene, E. coli strain 80 (VKPM) with resistance to sulfaguanidine, DL-1,2,4-triazole-3-alanine and streptomycin B-7270, Russian Patent No. 2119536).

（Ｌ−グルタミン酸生産菌）
本発明のＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC⁺(EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC⁺ (VKPM B-8961) が得られた。 (L-glutamic acid-producing bacterium)
Examples of the parent strain for inducing the L-glutamic acid-producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia such as E. coli VL334thrC ⁺ (EP 1172433). E. coli VL334 (VKPM B-1641) is an L-isoleucine and L-threonine auxotrophic strain having mutations in the thrC gene and the ilvA gene (US Pat. No. 4,278,765). The wild type allele of the thrC gene was introduced by a general transduction method using bacteriophage P1 grown on cells of wild type E. coli K12 strain (VKPM B-7). As a result, L-isoleucine-requiring L-glutamic acid producing bacterium VL334thrC ⁺ (VKPM B-8961) was obtained.

本発明のＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株が挙げられるが、これらに限定されない。このような遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、シトレートシンターゼ(gltA)、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。 Examples of the parent strain for inducing the L-glutamic acid-producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, a strain in which expression of one or more genes encoding L-glutamic acid biosynthetic enzymes are increased. Examples of such genes include glutamate dehydrogenase (gdhA), glutamine synthetase (glnA), glutamate synthetase (gltAB), isocitrate dehydrogenase (icdA), aconite hydratase (acnA, acnB), citrate synthase (gltA ), Phosphoenolpyruvate carbosylase (ppc), pyruvate dehydrogenase (aceEF, lpdA), pyruvate kinase (pykA, pykF), phosphoenolpyruvate synthase (ppsA), enolase (eno), phosphoglycero Mutase (pgmA, pgmI), phosphoglycerate kinase (pgk), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapA), triosephosphate isomerase (tpiA), fructose bisphosphate aldolase (fbp), phosphoful Ktokinase (pfkA, pfkB), glucose phosphine Toisomeraze (pgi), and so forth.

シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。
本発明のＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。 Examples of strains modified to increase expression of citrate synthetase gene, phosphoenolpyruvate carboxylase gene, and / or glutamate dehydrogenase gene include those disclosed in EP1078989A, EP955368A and EP952221A.
Examples of the parent strain for inducing the L-glutamic acid-producing bacterium according to the present invention include a decrease or deficiency in the activity of an enzyme that branches from the biosynthetic pathway of L-glutamic acid and catalyzes the synthesis of a compound other than L-glutamic acid. There are also stocks. Examples of such enzymes include isocitrate triase (aceA), α-ketoglutarate dehydrogenase (sucA), phosphotransacetylase (pta), acetate kinase (ack), acetohydroxy acid synthase (ilvG), Examples include acetolactate synthase (ilvI), formate acetyltransferase (pfl), lactate dehydrogenase (ldh), glutamate decarboxylase (gadAB), and the like. Bacteria belonging to the genus Escherichia lacking α-ketoglutarate dehydrogenase activity or having reduced α-ketoglutarate dehydrogenase activity, and methods for obtaining them are described in US Pat. Nos. 5,378,616 and 5,573,945. .

具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881) Specific examples include the following.
E. coli W3110sucA :: Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)

E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。 E. coli W3110sucA :: Kmr is a strain obtained by disrupting the α-ketoglutarate dehydrogenase gene (hereinafter also referred to as “sucA gene”) of E. coli W3110. This strain is completely deficient in α-ketoglutarate dehydrogenase.

Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したAJ12624(FFRM P-12379)(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。 Other examples of L-glutamic acid-producing bacteria include those belonging to the genus Escherichia and having resistance to an aspartic acid antimetabolite. These strains may be deficient in α-ketoglutarate dehydrogenase, for example, E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (US Pat. No. 5.908,768) and AJ12624 with reduced L-glutamate resolution. (FFRM P-12379) (US Pat. No. 5,393,671); AJ13138 (FERM BP-5565) (US Pat. No. 6,110,714) and the like.

Ｌ−グルタミン酸生産菌の例としては、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられ、上記のようにして得ることができる。このような株としては、Pantoea ananatis AJ13356(米国特許第6,331,419号)がある。Pantoea ananatis AJ13356は、1998年2月19日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１
中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。Pantoea ananatis
AJ13356は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子(sucA)の破壊によりα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損している。この株は、単離された時には、Enterobacter agglomeransと同定され、Enterobacter agglomerans AJ13356として寄託された。しかし、16S rRNAの塩基配列などに基づき、Pantoea ananatisに再分類された。AJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。 Examples of L-glutamic acid-producing bacteria include bacteria lacking α-ketoglutarate dehydrogenase activity or belonging to the genus Pantoea with reduced α-ketoglutarate dehydrogenase activity, which can be obtained as described above. it can. An example of such a strain is Pantoea ananatis AJ13356 (US Pat. No. 6,331,419). On February 19, 1998, Pantoea ananatis AJ13356 was established by the National Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (currently the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, 1-chome Higashi, Tsukuba City, Ibaraki, 305-8566, Japan. Address 1
Deposited as deposit number FERM P-16645 in the center No. 6), transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on January 11, 1999, and assigned deposit number FERM BP-6616. Pantoea ananatis
AJ13356 is deficient in α-ketoglutarate dehydrogenase activity due to disruption of the αKGDH-E1 subunit gene (sucA). When isolated, this strain was identified as Enterobacter agglomerans and deposited as Enterobacter agglomerans AJ13356. However, it was reclassified as Pantoea ananatis based on the base sequence of 16S rRNA. AJ13356 has been deposited as Enterobacter agglomerans with the above depository organization, but is described as Pantoea ananatis in this specification.

（Ｌ−フェニルアラニン生産菌）
本発明のＬ−フェニルアラニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089
(ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。 (L-phenylalanine producing bacteria)
Examples of parent strains for inducing the L-phenylalanine producing bacterium of the present invention include E. coli AJ12739 (tyrA :: Tn10, tyrR) (VKPM B-8197), E. coli HW1089 carrying the mutant pheA34 gene
(ATCC 55371) (U.S. Pat.No. 5,354,672), E. coli MWEC101-b (KR8903681), E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 and NRRL B-12147 (U.S. Pat.No. 4,407,952) ) And other strains belonging to the genus Escherichia, but are not limited thereto. In addition, E. coli K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAB] (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli Also used K-12 [W3110 (tyrA) / pPHATerm] (FERM BP-12662) and E. coli K-12 [W3110 (tyrA) / pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579) named AJ 12604 Yes (EP 488424 B1). Furthermore, L-phenylalanine producing bacteria belonging to the genus Escherichia with increased activity of the protein encoded by the yedA gene or the yddG gene can also be used (US Patent Application Publications 2003/0148473 A1 and 2003/0157667 A1).

（Ｌ−トリプトファン生産菌）
本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,37
3号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667
A1)。 (L-tryptophan producing bacteria)
Examples of parent strains for inducing the L-tryptophan-producing bacterium of the present invention include E. coli JP4735 / pMU3028 (DSM10122) and JP6015 / pMU91 (DSM10123) that lack the tryptophanyl-tRNA synthetase encoded by the mutant trpS gene. US Pat.No. 5,756,345), E. coli SV164 (pGH5) having serA allele encoding phosphoglycerate dehydrogenase not subject to feedback inhibition by serine and trpE allele encoding anthranilate synthase not subject to feedback inhibition by tryptophan (U.S. Patent No. 6,180,37
3), tryptophanase-deficient E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) and AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264) (US Pat.No. 4,371,614), ability to produce phosphoenolpyruvate Examples include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia such as E. coli AGX17 / pGX50, pACKG4-pps (WO9708333, US Pat. No. 6,319,696). L-tryptophan-producing bacteria belonging to the genus Escherichia having an increased activity of the protein encoded by the yedA gene or the yddG gene can also be used (US Patent Application Publications 2003/0148473 A1 and 2003/0157667).
A1).

本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。 Examples of a parent strain for inducing the L-tryptophan producing bacterium of the present invention include an activity of an enzyme selected from anthranilate synthase (trpE), phosphoglycerate dehydrogenase (serA), and tryptophan synthase (trpAB). Also included are strains with more than one species. Since both anthranilate synthase and phosphoglycerate dehydrogenase are subject to feedback inhibition by L-tryptophan and L-serine, mutations that cancel the feedback inhibition may be introduced into these enzymes. Specific examples of strains having such mutations include E. coli SV164 carrying desensitized anthranilate synthase and a mutant serA gene encoding phosphoglycerate dehydrogenase desensitized to feedback inhibition Examples include a transformant obtained by introducing plasmid pGH5 (WO 94/08031) into E. coli SV164.

本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。 As an example of a parent strain for inducing the L-tryptophan-producing bacterium of the present invention, a strain into which a tryptophan operon containing a gene encoding a released anthranilate synthase has been introduced (JP 57-71397, JP 62-244382, US Pat. No. 4,371,614). Furthermore, L-tryptophan-producing ability may be imparted by increasing the expression of a gene encoding tryptophan synthase in the tryptophan operon (trpBA). Tryptophan synthase consists of α and β subunits encoded by trpA and trpB genes, respectively. Furthermore, L-tryptophan production ability may be improved by increasing the expression of isocitrate triase-malate synthase operon (WO2005 / 103275).

（Ｌ−チロシン生産菌）
本発明のＬ−チロシン生産菌を誘導するための親株の例としては、芳香族アミノ酸の生合成系酵素、例えばデオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビンシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)を増強した菌株が挙げられる。（欧州出願公開763127号明細書）また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサーによって制御されることが知られており（tyrR）、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を増強してもよい（欧州特許763127号明細書参照）。これらの酵素活性増強は、Ｌ−トリプトファン生産菌、Ｌ−フェニルアラニン生産菌の誘導にも適用できる。 (L-tyrosine producing bacteria)
Examples of parent strains for inducing the L-tyrosine producing bacterium of the present invention include aromatic amino acid biosynthetic enzymes such as deoxyarabino-hepturonic acid phosphate synthase (aroG), 3-dehydroquinate synthase (aroB). ), Shikimate dehydratase, shikimate kinase (aroL), 5-enolate pyruvine shikimate 3-phosphate synthase (aroA), and chorismate synthase (aroC). (European Application Publication No. 763127) These genes are known to be regulated by tyrosine repressors (tyrR). By deleting the tyrR gene, biosynthetic enzyme activity of aromatic amino acids is reduced. It may be enhanced (see EP 763127). These enzyme activity enhancements can also be applied to the induction of L-tryptophan-producing bacteria and L-phenylalanine-producing bacteria.

（Ｌ−プロリン生産菌）
本発明のＬ−プロリン生産菌を誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。 (L-proline producing bacteria)
Examples of parent strains for inducing the L-proline-producing bacterium of the present invention include those belonging to the genus Escherichia such as E. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433) that lacks the ilvA gene and can produce L-proline. Examples include, but are not limited to, the strains to which they belong.

本発明の細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH
遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。 The bacterium of the present invention may be improved by increasing the expression of one or more genes involved in L-proline biosynthesis. An example of a gene preferable for L-proline-producing bacteria includes a proB gene (German Patent No. 3127361) encoding glutamate kinase that is desensitized to feedback inhibition by L-proline. Furthermore, the bacterium of the present invention may be improved by increasing the expression of one or more genes encoding proteins that excrete L-amino acids from bacterial cells. Such genes include the b2682 and b2683 genes (ygaZH
Gene) (EP1239041 A2).

Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15^th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。 Examples of bacteria belonging to the genus Escherichia having L-proline producing ability include NRRL B-12403 and NRRL B-12404 (British Patent No. 2075056), VKPM B-8012 (Russian Patent Application 2000124295), German Patent No. 3127361 plasmid variants described, Bloom FR et al (the 15 th Miami winter symposium, 1983, p.34) include strain of E. coli, such as a plasmid variants described.

（Ｌ−アルギニン生産菌）
本発明のＬ−アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。 (L-arginine producing bacteria)
Examples of parent strains for inducing the L-arginine-producing bacterium of the present invention include E. coli 237 strain (VKPM B-7925) (US Patent Application Publication 2002/058315 A1) and mutant N-acetylglutamate synthase. Retained derivatives thereof (Russian patent application No. 2001112869), E. coli 382 strain (VKPM B-7926) (EP1170358A1), arginine production strain into which argA gene encoding N-acetylglutamate synthetase has been introduced (EP1170361A1), etc. Strains belonging to the genus Escherichia, but are not limited thereto.

本発明のＬ−アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。 Examples of the parent strain for inducing the L-arginine-producing bacterium of the present invention also include strains in which expression of one or more genes encoding L-arginine biosynthetic enzymes are increased. Examples of such genes include N-acetylglutamylphosphate reductase gene (argC), ornithine acetyltransferase gene (argJ), N-acetylglutamate kinase gene (argB), acetylornithine transaminase gene (argD), ornithine carbamoyltransferase A gene (argF), an arginosuccinate synthetase gene (argG), an arginosuccinate lyase gene (argH), and a carbamoyl phosphate synthetase gene (carAB).

（Ｌ−バリン生産菌）
本発明のＬ−バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。 (L-valine producing bacteria)
Examples of parent strains for inducing the L-valine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains modified to overexpress the ilvGMEDA operon (US Pat. No. 5,998,178). It is preferable to remove the ilvGMEDA operon region required for attenuation so that the operon expression is not attenuated by the produced L-valine. Furthermore, it is preferred that the ilvA gene of the operon is disrupted and the threonine deaminase activity is reduced.

本発明のＬ−バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。 Examples of the parent strain for inducing the L-valine-producing bacterium of the present invention also include a mutant strain having an aminoacyl t-RNA synthetase mutation (US Pat. No. 5,658,766). For example, E. coli VL1970 having a mutation in the ileS gene encoding isoleucine tRNA synthetase can be used. E. coli VL1970 was registered with Lucian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) on June 24, 1988 under the accession number VKPM B-4411. It has been deposited.

さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H⁺-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。 Furthermore, a mutant strain (WO96 / 06926) that requires lipoic acid for growth and / or lacks H ⁺ -ATPase can be used as a parent strain.

（Ｌ−イソロイシン生産菌）
本発明のＬ−イソロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 03567
39, 及び米国特許第5,998,178号)。 (L-isoleucine producing bacterium)
Examples of parent strains for inducing the L-isoleucine-producing bacterium of the present invention include mutants having resistance to 6-dimethylaminopurine (Japanese Patent Laid-Open No. 5-304969), isoleucine analogs such as thiisoleucine and isoleucine hydroxamate And a mutant strain resistant to DL-ethionine and / or arginine hydroxamate (Japanese Patent Laid-Open No. 5-130882), but is not limited thereto. Further, a recombinant strain transformed with a gene encoding a protein involved in L-isoleucine biosynthesis such as threonine deaminase and acetohydroxy acid synthase can also be used as a parent strain (JP-A-2-458, FR 03567).
39, and US Pat. No. 5,998,178).

＜１−２＞活性の増強
本発明の微生物は、上述したようなＬ−アミノ酸の生産能を有する腸内細菌科に属する微生物を、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（以下「OPRTase」と略す）活性が増強するように改変することによって得ることができる。ただし、OPRTase活性が増強するように改変を行った後に、Ｌ−アミノ酸の生産能を付与してもよい。 <1-2> Enhancement of activity The microorganism of the present invention has the activity of phosphoricosyltransferase (hereinafter abbreviated as “OPRTase”) activity of microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae having the ability to produce L-amino acids as described above. It can be obtained by modifying to enhance. However, L-amino acid-producing ability may be imparted after modification so that OPRTase activity is enhanced.

なお、OPRTase活性の増強は、後述するように、OPRTaseをコードする遺伝子の発現量を増強させるように改変することによって達成でき、これらの発現量の増強はプロモーター改変を始めとする発現調節領域改変などによる内因性遺伝子の発現増強であってもよいし、遺伝子を含むプラスミドの導入などによる外因性遺伝子の発現増強であってもよい。またOPRTaseの活性上昇は、アテニュエーター領域を欠損すること、またOPRTaseの上流領域にフレームシフト変異を導入することによっても、達成することができる。さらに、これらを組み合わせてもよい。 The enhancement of OPRTase activity can be achieved by modifying so as to enhance the expression level of the gene encoding OPRTase, as will be described later. For example, the expression of an endogenous gene may be enhanced, or the expression of an exogenous gene may be enhanced by introduction of a plasmid containing the gene. The increase in OPRTase activity can also be achieved by deleting the attenuator region or introducing a frameshift mutation in the upstream region of OPRTase. Furthermore, these may be combined.

本発明のOPRTase活性とは、オロチジン5’-リン酸と二リン酸からオロト酸と5-ホスホ−α−D−リボース一リン酸を生成する活性を意味し（下記式参照）、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼとも呼ばれる（EC 2.4.2.10 ）。 The OPRTase activity of the present invention means the activity of producing orotic acid and 5-phospho-α-D-ribose monophosphate from orotidine 5′-phosphate and diphosphate (see the following formula). Also called ribosyltransferase (EC 2.4.2.10).

オロチジン5’-リン酸 + 二リン酸 → オロト酸 + 5-ホスホ−α−D−リボース一リン酸 Orotidine 5'-phosphate + diphosphate → orotic acid + 5-phospho-α-D-ribose monophosphate

OPRTase活性の増強は、Poulsenらの方法によって確認できる。（Eur.J.Biochem.135:223-229 1983） Enhancement of OPRTase activity can be confirmed by the method of Poulsen et al. (Eur. J. Biochem. 135: 223-229 1983)

「OPRTase活性が増強するように改変された」とは、野生株、または非改変株に対して細胞あたりのOPRTaseの分子の数が増大した場合や、OPRTaseの１分子当たりの活性が向上した場合が該当する。OPRTaseの活性は野生株又は非改変株と比較して、菌体当たり150%以上、好ましくは200％以上、さらに望ましくは菌体当たり300％以上に向上するように改変されていることが好ましい。ここで、対照となる野生株の腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCCNo.47076）、及びW3110株（ATCCNo.27325）、パントエア・アナナティスAJ13335株（FERM BP-6615）などが挙げられる。 “Modified to enhance OPRTase activity” means that the number of OPRTase molecules per cell is increased or the activity per molecule of OPRTase is improved compared to wild-type or non-modified strains Is applicable. It is preferable that the activity of OPRTase is modified so as to be improved to 150% or more per cell, preferably 200% or more, and more desirably 300% or more per cell as compared to the wild type or non-modified strain. Here, as microorganisms belonging to the wild-type Enterobacteriaceae family as controls, Escherichia coli MG1655 strain (ATCC No. 47076), W3110 strain (ATCC No. 27325), Pantoea Ananatis AJ13335 strain (FERM BP-6615) Etc.

OPRTase活性の増強は、OPRTaseをコードする遺伝子の発現量を増強させるように改変することによって達成できる。発現が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、mRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。また、OPRTase活性の増強は、OPRTaseのタンパク質量が非改変株、野生株と比較して上昇していることによって確認することができ、例えば抗体を用いたウェスタンブロットによって検出することが出来る。（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。 Enhancement of OPRTase activity can be achieved by modification so as to enhance the expression level of a gene encoding OPRTase. Confirmation that the expression is improved as compared with a parent strain, for example, a wild strain or an unmodified strain, can be confirmed by comparing the amount of mRNA with a wild type or an unmodified strain. Examples of the method for confirming the expression level include Northern hybridization and RT-PCR (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)). The expression level may be any as long as it is increased compared to the wild strain or the unmodified strain, but for example, 1.5 times or more, more preferably 2 times or more compared to the wild strain or the non-modified strain, It is desirable that it rises 3 times or more. Further, the enhancement of the OPRTase activity can be confirmed by the fact that the amount of OPRTase protein is increased compared to the unmodified strain and the wild strain, and can be detected, for example, by Western blot using an antibody. (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)).

OPRTase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（pyrE遺伝子）としては、例えば、エシェリヒア・コリのpyrE遺伝子、具体的には、配列番号１１の塩基番号７８２〜１４２３の塩基配列を有するpyrE遺伝子(GenBank Accession No.NC_00913 VERSION NC_000913
.2 GI:49175990の塩基番号3813150〜3813791の相補鎖)が挙げられる。 Examples of a gene encoding a protein having OPRTase activity (pyrE gene) include, for example, the pyrE gene of Escherichia coli, specifically, the pyrE gene having the nucleotide sequence of nucleotide numbers 782-1423 of SEQ ID NO: 11 (GenBank Accession No. .NC_00913 VERSION NC_000913
.2 GI: 49175990 complementary strand of base numbers 3813150 to 3813791).

他の微生物由来pyrE遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No. NC_004088の577565..579529の相補鎖に示されるエルシニア・ペスティスのpyrE遺伝子、GenBank Accession No. AL627282の120832..122790の相補鎖に示されるサルモネラ・チフィのPYRE遺伝子、GenBank Accession No. NC_002505の305121..307121の相補鎖に示されるビブリオ・コレラエのpyrE遺伝子、NC_003197の4513714..4515672の相補鎖に示されるサルモネラ・チフィムリウムのOPRTase遺伝子などが挙げられる。 Examples of other microorganism-derived pyrE genes include the Yersinia pestis pyrE gene shown in the complementary strand of 577565..579529 of GenBank Accession No. NC_004088, and the complementary strand of 1200832..122790 of GenBank Accession No. AL627282. The PYRE gene of Salmonella typhi, the pyrE gene of Vibrio cholerae shown in the complementary strand of GenBank Accession No. NC_002505 305121..307121, the OPRTase gene of Salmonella typhimurium shown in the complementary strand of 4513714..4515672 of NC_003197, etc. Can be mentioned.

さらに、pyrE遺伝子のホモログは、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、エシェリヒア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ−プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよく、例えば配列番号９、１０に示される合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅出来るものであってもよい。アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin および AltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993))やPearsonによるFASTA(Methods Enzymol., 183, 63
(1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。 Furthermore, the homologue of the pyrE gene is based on the homology with the genes exemplified above, γ-proteobacteria such as Escherichia genus, Enterobacter genus, Klebsiella genus, Serratia genus, Erbinia genus, Yersinia genus, Corynebacterium It may be cloned from Coryneform bacteria such as Glutamicum, Brevibacterium lactofermentum, Pseudomonas bacteria such as Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium bacteria such as Mycobacterium tuberculosis, etc. It may be one that can be amplified using the synthetic oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 9 and 10. The homology of the amino acid sequence and the base sequence is determined by, for example, the algorithm BLAST (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) by Karlin and Altschul and FASTA (Methods Enzymol., 183, 63 by Pearson).
(1990)). Based on this algorithm BLAST, programs called BLASTN and BLASTX have been developed (see www.ncbi.nlm.nih.gov).

pyrE遺伝子のホモログとは、他の微生物由来または天然もしくは人工の変異型遺伝子で、上記のpyrE遺伝子と構造が高い類似性を示し、宿主に導入あるいは増幅した際にOPRTase活性を向上させる機能を有する遺伝子を意味する。pyrE遺伝子のホモログは、配列番号１２のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有し、かつ、OPRTase活性を有するタンパク質をコードするものを意味する。なお、OPRTase活性を有することは、これらの遺伝子を宿主細胞で発現させ、OPRTase活性を調べることによって確認することができる。 A homologue of pyrE gene is a mutant gene derived from other microorganisms, natural or artificial, and has high structural similarity to the above-mentioned pyrE gene, and has a function of improving OPRTase activity when introduced or amplified in a host. Means gene. The homologue of the pyrE gene has a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more with respect to the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and OPRTase It means that which encodes a protein having activity. The presence of OPRTase activity can be confirmed by expressing these genes in a host cell and examining OPRTase activity.

また、本発明に用いるpyrE遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、コードされるタンパク質のOPRTase活性が損なわれない限り、配列番号１２のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。 In addition, the pyrE gene used in the present invention is not limited to the wild type gene, and one or several at one or more positions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 as long as the OPRTase activity of the encoded protein is not impaired. It may be a mutant or artificially modified protein that encodes a protein having a sequence including amino acid substitutions, deletions, insertions or additions.

ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個を意味する。上記置換は保存的置換が好ましく、保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の
置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、OPRTase遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。 Here, “several” differs depending on the position and type of protein in the three-dimensional structure of amino acid residues, but specifically 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5 Means. The above-mentioned substitution is preferably conservative substitution, and conservative mutation refers to Phe, Trp, Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and Leu, Ile when the substitution site is a hydrophobic amino acid. In the case of a polar amino acid between Val, between Gln and Asn, in the case of a basic amino acid, between Lys, Arg and His, and in the case of an acidic amino acid, between Asp and Glu, In the case of an amino acid having a hydroxyl group, it is a mutation that substitutes between Ser and Thr. Conservative substitutions include Ala to Ser or Thr substitution, Arg to Gln, His or Lys substitution, Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp substitution, Asp to Asn, Glu or Gln. Substitution, Cys to Ser or Ala substitution, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg substitution, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp substitution, Gly to Pro substitution, Substitution from His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr, Ile to Leu, Met, Val or Phe, Leu to Ile, Met, Val or Phe, Lys to Asn, Glu, Gln, His Or Arg, Met to Ile, Leu, Val or Phe, Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, Ser to Thr or Ala, Thr to Ser or Ala Substitution, substitution from Trp to Phe or Tyr, substitution from Tyr to His, Phe or Trp, and substitution from Val to Met, Ile or Leu. In addition, amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as described above include naturally occurring mutations (mutant or variant) such as those based on individual differences or species differences of microorganisms that hold the OPRTase gene. ) Is also included.

またpyrE遺伝子は、配列番号１２の塩基配列の相補配列又は該配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、OPRTase活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。 The pyrE gene may be DNA that hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 or a probe that can be prepared from the sequence, and that encodes a protein having OPRTase activity. Good. Here, the “stringent condition” refers to a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Specifically, this is a condition for washing of ordinary Southern hybridization. ° C, 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 60 ° C., 0.1 × SSC, 0.1% SDS, more preferably 68 ° C., 0.1 × SSC, 0.1% SDS The condition of washing once or more preferably 2 to 3 times at the salt concentration and temperature is mentioned.

上記pyrE遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中のこれらの遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えば、これらの遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよい。 The modification for enhancing the expression of the pyrE gene can be carried out, for example, by increasing the copy number of these genes in a cell using a gene recombination technique. For example, a DNA fragment containing these genes may be ligated with a vector that functions in a host microorganism, preferably a multicopy vector, to produce a recombinant DNA, which is introduced into the microorganism and transformed.

pyrE遺伝子としてエシェリヒア・コリのpyrE遺伝子を用いる場合、配列番号１１の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号９、１０に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、pyrE遺伝子を取得することができる。他の微生物のpyrE遺伝子も、それぞれその微生物において公知のOPRTase遺伝子もしくは他種の微生物のpyrE遺伝子又はpyrEタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから、取得することができる。なお、染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。 When the Escherichia coli pyrE gene is used as the pyrE gene, a primer prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, for example, the primers shown in SEQ ID NOs: 9 and 10, and Escherichia coli chromosomal DNA is used as a template. The pyrE gene can be obtained by PCR (PCR: polymerase chain reaction; see White, TJ et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)). Other microorganisms, such as the pyrE gene, can also be obtained by PCR using primers prepared based on the sequence information of the known OPRTase gene or other types of microorganisms, the pyrE gene or the pyrE protein, or the sequence information It can be obtained from a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library of a microorganism by a hybridization method using the oligonucleotide prepared as a probe. Chromosomal DNA can be obtained from microorganisms that are DNA donors, for example, the method of Saito and Miura (H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Biotechnology Experiments, Japan. Biomedical Society edition, pages 97-98, Bafukan, 1992).

次に、PCR法により増幅されたpyrE遺伝子を、宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターDNAに接続して組換えDNAを調製する。宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。 Next, the pyrE gene amplified by the PCR method is connected to a vector DNA that can function in the cells of the host microorganism to prepare a recombinant DNA. Examples of the vector capable of functioning in the host microorganism cell include a vector capable of autonomous replication in the host microorganism cell.

エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）、 RSF1010（Gene vol.75 (2), p271-288, 1989）、pBR322、pMW219、pMW119（pMWはニッポンジーン社より入手可）、pSTV28、pSTV29（宝バイオ社製）等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。 As vectors capable of autonomous replication in Escherichia coli cells, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184 (pHSG and pACYC are available from Takara Bio Inc.), RSF1010 (Gene vol.75 (2), p271- 288, 1989), pBR322, pMW219, pMW119 (pMW is available from Nippon Gene), pSTV28, pSTV29 (Takara Bio Inc.), and the like. In addition, phage DNA vectors can also be used.

これらの遺伝子を上記ベクターに連結して組み換えＤＮＡを調製するには、pyrE遺伝子を含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor La
boratory Press, (1989)等に記載されている。 In order to prepare recombinant DNA by ligating these genes to the above vector, the vector is cleaved with a restriction enzyme that matches the ends of the DNA fragment containing the pyrE gene. Ligation is usually performed using a ligase such as T4 DNA ligase. For methods such as DNA cleavage, ligation, chromosomal DNA preparation, PCR, plasmid DNA preparation, transformation, setting of oligonucleotides used as primers, etc., ordinary methods well known to those skilled in the art should be adopted. Can do. These methods are described in Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor La
boratory Press, (1989).

上記のように調製した組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal
of Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。また、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153
(1977)）を使用することもできる。 In order to introduce the recombinant DNA prepared as described above into a microorganism, it may be carried out according to the transformation methods reported so far. For example, the electroporation method (Canadian Journal
of Microbiology, 43. 197 (1997)). In addition, as reported for Escherichia coli K-12, a method for increasing the permeability of DNA by treating recipient cells with calcium chloride (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. , 53, 159 (1970)), and a method for introducing competent cells from cells at the growth stage and introducing DNA as reported for Bacillus subtilis (Duncan, CH, Wilson, GA and Young, FE). , Gene, 1, 153
(1977)) can also be used.

一方、pyrE遺伝子のコピー数を高めることは、これらの遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上にこれらの遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、OPRTase遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。染色体上にこれらの遺伝子が転移したことの確認は、これらの遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。 On the other hand, increasing the copy number of the pyrE gene can also be achieved by making these genes exist in multiple copies on the chromosomal DNA of the microorganism. In order to introduce these genes in multiple copies onto the chromosomal DNA of a microorganism, homologous recombination is performed using a sequence present in multiple copies on the chromosomal DNA as a target. As a sequence present in multiple copies on chromosomal DNA, repetitive DNA and inverted repeats present at the end of a transposable element can be used. Alternatively, as disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-109985, it is possible to mount the OPRTase gene on a transposon, transfer it, and introduce multiple copies onto the chromosomal DNA. Confirmation that these genes have been transferred onto the chromosome can be confirmed by Southern hybridization using a part of these genes as a probe.

宿主としてエシェリヒア・コリK12株系統の菌株、例えばMG1655株やW3110株を用いる場合、以下の方法によってもORPTase活性を上昇させることができる。エシェリヒア・コリでは、pyrE遺伝子はその上流にあるrphとオペロンを形成している。エシェリヒア・コリK12株のrph-pyrEオペロンの塩基配列を配列番号１１に示す。配列番号１１において、pyrEのコード領域は塩基番号782〜1423である。K12株では、rphのコード領域の3'末端側（配列番号１１の667位と671位の間）に-1のフレームシフト変異があり、その影響でORPTaseの翻訳量が低減し、OPRTaseの活性が低く抑えられている（Journal of Bacteriology, vol. 175, June 1993, p3401-3407）。従って、OPRTaseの活性を上昇させるには、rph遺伝子の3'端領域より下流、かつ、pyrE遺伝子の上流の領域に前記-1のフレームシフト変異を相補する変異、例えば+1変異又は-2変異、または、-1変異もしくは+2変異を導入するすることにより、ORPTaseの酵素活性を上昇させることができる。具体的には、例えば、配列番号１１の670位と671位の間に１塩基挿入し、フレームシフトを相補する変異を導入することにより、rphのコード領域が長くなり、rphの翻訳終了位置とリボソームとの親和性の高いアテニュエータ領域が近くなることによりリボソームがｍRNAから遊離しにくなり、ORPTaseの酵素活性を上昇させることができると考えられる。このようなフレームシフトが解消されたpyrE遺伝子上流域を含むrph-pyrEオペロンの塩基配列を、配列番号１３に例示する。配列番号１３において、rphのコード領域は、塩基番号１〜７１４である。 When a strain of the Escherichia coli K12 strain, for example, MG1655 strain or W3110 strain is used as the host, ORPTase activity can also be increased by the following method. In Escherichia coli, the pyrE gene forms an operon with the upstream rph. The nucleotide sequence of the rph-pyrE operon of Escherichia coli K12 strain is shown in SEQ ID NO: 11. In SEQ ID NO: 11, the coding region of pyrE is nucleotide numbers 782 to 1423. In the K12 strain, there is a frameshift mutation of -1 on the 3 'end side of the rph coding region (between positions 667 and 671 of SEQ ID NO: 11), which reduces the amount of ORPTase translation and reduces OPRTase activity. (Journal of Bacteriology, vol. 175, June 1993, p3401-3407). Therefore, in order to increase the activity of OPRTase, a mutation that complements the frame shift mutation of -1 downstream of the 3 'end region of the rph gene and upstream of the pyrE gene, such as a +1 mutation or a -2 mutation Alternatively, the enzyme activity of ORPTase can be increased by introducing a -1 mutation or a +2 mutation. Specifically, for example, by inserting a base between positions 670 and 671 of SEQ ID NO: 11 and introducing a mutation that complements the frameshift, the rph coding region becomes longer, and the rph translation end position It is considered that the attenuator region having a high affinity with the ribosome is close, so that the ribosome is hardly released from the mRNA, and the enzyme activity of ORPTase can be increased. The base sequence of the rph-pyrE operon including the upstream region of the pyrE gene in which such frame shift has been eliminated is exemplified in SEQ ID NO: 13. In SEQ ID NO: 13, the coding region for rph is base numbers 1 to 714.

また、例えば，アテニュエーター上流の領域を欠損し前記-1のフレームシフトを相補するような変異を導入することにより、rphのコード領域が長くなり、rphの翻訳終了位置がpyrEの翻訳開始位置に近くなることにより、ORPTaseの酵素活性を上昇させることができる。具体的には、配列番号１１の６１０−６９１位の塩基配列を欠失させることにより達成できる。このような領域を欠損したrph-pyrEオペロンの塩基配列を、配列番号１４に例示する。 In addition, for example, by introducing a mutation that deletes the region upstream of the attenuator and complements the frame shift of -1, the rph coding region becomes longer, and the translation end position of rph is the translation start position of pyrE. By approaching the value, the enzyme activity of ORPTase can be increased. Specifically, this can be achieved by deleting the nucleotide sequence at positions 610-691 of SEQ ID NO: 11. The base sequence of the rph-pyrE operon lacking such a region is exemplified in SEQ ID NO: 14.

さらにpyrE遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載されたようにして、染色体DNA上またはプラスミド上のこれらの遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、これらの遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、又はこれらの遺伝子の発
現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージのPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。 Furthermore, in addition to the amplification of the gene copy number described above, the enhancement of the expression of the pyrE gene can be performed by regulating the expression of promoters and the like of these genes on chromosomal DNA or plasmid as described in WO 00/18935 pamphlet. It can also be achieved by replacing sequences with strong ones, amplifying regulators that increase the expression of these genes, or deleting or weakening regulators that reduce the expression of these genes. The For example, lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter and the like are known as strong promoters.

プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりOPRTase遺伝子の発現が強化される。 Methods for evaluating promoter strength and examples of strong promoters are described in Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128). Furthermore, it is known that the substitution of several nucleotides in the spacer between the ribosome binding site (RBS) and the start codon, particularly in the sequence immediately upstream of the start codon, greatly affects the translation efficiency of mRNA, These can be modified. These promoter substitutions or modifications enhance OPRTase gene expression.

さらに、pyrE遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を増強するために、OPRTase活性が上昇するような変異をこれらの遺伝子に導入してもよい。OPRTase活性が上昇するような変異としてはpyrE遺伝子の転写量が増大するようなプロモーター配列の変異、及び、OPRTaseタンパク質の比活性が高くなるようなこれらの遺伝子のコード領域内の変異が挙げられる。 Furthermore, in order to enhance the activity of the protein encoded by the pyrE gene, a mutation that increases OPRTase activity may be introduced into these genes. Examples of mutations that increase OPRTase activity include mutations in promoter sequences that increase the transcription amount of the pyrE gene and mutations in the coding region of these genes that increase the specific activity of the OPRTase protein.

＜２＞Ｌ−アミノ酸の製造法
本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、本発明の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする。 <2> Method for Producing L-Amino Acid In the method for producing L-amino acid of the present invention, the microorganism of the present invention is cultured in a medium, and L-amino acid is produced and accumulated in the medium or in the microbial cells. L-amino acid is recovered from the body.

使用する培地は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。 As the medium to be used, a medium conventionally used in the fermentation production of L-amino acids using microorganisms can be used. That is, a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic components as required can be used. Here, as the carbon source, saccharides such as glucose, sucrose, lactose, galactose, fructose and starch hydrolysate, alcohols such as glycerol and sorbitol, organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid are used. be able to. As the nitrogen source, inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, aqueous ammonia and the like can be used. As an organic trace nutrient source, it is desirable to contain an appropriate amount of a required substance such as vitamin B1, L-homoserine or a yeast extract. In addition to these, a small amount of potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ion, manganese ion or the like is added as necessary. The medium used in the present invention may be a natural medium or a synthetic medium as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic trace components as required.

培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。 The culture is preferably carried out under aerobic conditions for 1 to 7 days, the culture temperature is 24 ° C. to 37 ° C., and the pH during the culture is preferably 5 to 9. In addition, an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas or the like can be used for pH adjustment. The L-amino acid can be recovered from the fermentation broth by combining an ion exchange resin method, a precipitation method and other known methods. In addition, when L-amino acid accumulates in the microbial cell, for example, the microbial cell is crushed by ultrasonic waves, and the microbial cell is removed by centrifugation. Can be recovered.

なお、塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御するか、又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが少なくとも２ｇ／Ｌ以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／または炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカ
チオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-065287号参照、米国特許出願公開第2002025564号）。 In addition, when producing a basic amino acid, the pH during the cultivation is controlled to 6.5 to 9.0, and the pH of the medium at the end of the cultivation is 7.2 to 9.0. The fermenter pressure is controlled to be positive, or carbon dioxide or a mixed gas containing carbon dioxide is supplied to the culture medium, so that bicarbonate ions and / or carbonate ions in the culture medium are at least 2 g / L or more. And the fermentation is carried out by a method in which the bicarbonate ion and / or carbonate ion is used as a counter ion of a cation mainly composed of a basic amino acid, and the target basic amino acid is recovered. Alternatively, see JP-A-2002-065287, US Patent Application Publication No. 2002025564.

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.

〔実施例１〕 pyrE遺伝子の上流部分を欠失したグルタミン酸生産株の評価
（１）エシェリヒア・コリのsucA遺伝子の欠損
エシェリヒア・コリMG1655よりsucA遺伝子欠損株を作製した。報告されているsucA遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、MG1655株のゲノムDNAを鋳型として、sucA遺伝子のN末およびC末断片をPCR法により増幅した。 [Example 1] Evaluation of glutamic acid-producing strain lacking the upstream part of the pyrE gene (1) Deletion of sucA gene of Escherichia coli A sucA gene-deficient strain was prepared from Escherichia coli MG1655. Primers were synthesized based on the reported nucleotide sequence of the sucA gene, and the N-terminal and C-terminal fragments of the sucA gene were amplified by PCR using the genomic DNA of the MG1655 strain as a template.

N末端断片増幅用PCR用プライマーにはプライマー１、２（配列番号１、２）を、C末端断片増幅用PCR用プライマーにはプライマー３、４（配列番号３、４）を用いた。プライマー１にはHindIIIサイトが、プライマー４にはXbaIサイトがそれぞれデザインされている。 Primers 1 and 2 (SEQ ID NOs: 1 and 2) were used as PCR primers for N-terminal fragment amplification, and primers 3 and 4 (SEQ ID NOs: 3 and 4) were used as PCR primers for C-terminal fragment amplification. Primer 1 has a HindIII site and primer 4 has an XbaI site.

PCR後の増幅DNA断片は、それぞれ、QIAquick PCR Purification Kit（キアゲン社製）にて精製し、精製したN末端DNA断片およびC末端DNA断片、及びプライマー１、４を用いて、クロスオーバーPCR法（A. J. Link, D. Phillips, G. M. Church, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237 (1997)）により、欠損型sucA断片を得た。精製したDNA断片を、HindIII及びXbaI（宝酒造社製）にて切断した後、フェノール／クロロホルム処理、及びエタノール沈殿を行った。同様にHindIII及びXbaIで切断した温度感受性プラスミドpMAN997（WO 99/03988号国際公開パンフレット）と前記DNA断片とをDNA ligation Kit Ver.2（宝酒造社製）を用いて連結した。この連結反応液にて、JM109コンピテント細胞（宝酒造社製）を形質転換し、アンピシリン（シグマ社製）を25μg/mL含むLB寒天プレート（LB＋アンピシリンプレート）に塗布した。30℃で１日培養後、生育したコロニーを25μg/mLのアンピシリンを含むLB培地で30℃にて試験管培養し、自動プラスミド抽出機PI-50（クラボウ社製）を用いてプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドをHindIII及びXbaIで切断し、アガロースゲル電気泳動を行って、目的断片が挿入されているプラスミドをsucA欠失用プラスミドpMAN_ΔsucAとした。尚、前記pMAN997は、pMAN031(S．Matsuyama and S. Mizushima, J. Bacteriol., 162, 1196 (1985))とpUC19（宝酒造社製）のそれぞれのVspI-HindIII断片を繋ぎ換えたものである。 The amplified DNA fragments after PCR were purified by QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), respectively, and the purified N-terminal and C-terminal DNA fragments and primers 1 and 4 were used for crossover PCR ( AJ Link, D. Phillips, GM Church, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237 (1997)) to obtain a defective sucA fragment. The purified DNA fragment was cleaved with HindIII and XbaI (Takara Shuzo), followed by phenol / chloroform treatment and ethanol precipitation. Similarly, a temperature sensitive plasmid pMAN997 (WO 99/03988 international publication pamphlet) cut with HindIII and XbaI and the DNA fragment were ligated using DNA ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo). In this ligation reaction solution, JM109 competent cells (Takara Shuzo) were transformed and applied to an LB agar plate (LB + ampicillin plate) containing 25 μg / mL of ampicillin (Sigma). After culturing at 30 ° C for 1 day, the grown colonies were cultured in a test tube at 30 ° C in LB medium containing 25 µg / mL ampicillin, and plasmid extraction was performed using an automated plasmid extractor PI-50 (Kurabo). It was. The obtained plasmid was cleaved with HindIII and XbaI and subjected to agarose gel electrophoresis, and the plasmid into which the target fragment had been inserted was designated as the plasmid pMAN_ΔsucA for sucA deletion. The pMAN997 is obtained by recombination of the VspI-HindIII fragments of pMAN031 (S. Matsuyama and S. Mizushima, J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)) and pUC19 (Takara Shuzo).

プラスミドpMAN_ΔsucAでエシェリヒア・コリMG1655株をC. T. Chungらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 2172 (1989)）により形質転換し、LB＋アンピシリンプレートで30℃でコロニーを選択した。選択したクローンを30℃で一晩液体培養した後、培養液を10^-3希釈してLB＋アンピシリンプレートにまき、42℃でコロニーを選択した。選択したクローンをLB＋アンピシリンプレートに塗り広げて30℃で培養した後、プレートの1/8の菌体をLB培地 2 mLに懸濁し、42℃で4〜5時間振とう培養した。10^-5希釈した培養液をLBプレートにまき、得られたコロニーのうち数百コロニーをLBプレートとLB＋アンピシリンプレートに植菌し、生育を確認することで、アンピシリン感受性株を選択した。アンピシリン感受性株の数株についてコロニーPCRを行い、sucA遺伝子の欠失を確認した。こうしてE. coli MG1655由来のsucA欠損株MG1655ΔsucAを得た。 Escherichia coli MG1655 strain was transformed with the plasmid pMAN_ΔsucA by the method of CT Chung et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2172 (1989)), and colonies were selected at 30 ° C. with LB + ampicillin plates. The selected clone was subjected to liquid culture at 30 ° C. overnight, and then the culture was diluted 10 ^{−3 and} spread on an LB + ampicillin plate. Colonies were selected at 42 ° C. The selected clone was spread on an LB + ampicillin plate and cultured at 30 ° C. Then, 1/8 cells of the plate were suspended in 2 mL of LB medium and cultured with shaking at 42 ° C. for 4 to 5 hours. An ampicillin sensitive strain was selected by inoculating a culture solution diluted 10 ⁻⁵ on an LB plate, inoculating several hundred colonies out of the obtained colonies on an LB plate and an LB + ampicillin plate, and confirming the growth. Colony PCR was performed on several ampicillin sensitive strains to confirm the deletion of the sucA gene. Thus, a sucA-deficient strain MG1655ΔsucA derived from E. coli MG1655 was obtained.

（２）エシェリヒア・コリのsucA遺伝子の欠損株MG1655ΔsucA株からのpyrE上流部分が欠失した株MG1655ΔsucA rph-pyrE(m)株の構築
MG1655ΔsucA株の染色体上で、pyrE遺伝子の上流（5’側）にあるrph遺伝子内の82bp (E. coli MG1655 genomeの塩基配列(GenBank ACCESSION：NC_000913, VERSION：NC_000913.2 GI:49175990の座標3813882〜3813963、配列番号１１の塩基番号610〜691)は、以下の
ようにして欠失させることができる。まず、MG1655染色体DNAを鋳型とし、合成オリゴヌクレオチド５、６（配列番号５、６）をプライマーとしてPCRを行いDNA断片１を得る。同様にして合成オリゴヌクレオチド７、８（配列番号７、８）をプライマーとしてPCRを行いDNA断片２を得る。次に、DNA断片１、DNA断片２の混合物を鋳型とし、オリゴヌクレオチド５、８をプライマーとしてPCRを行うことにより、欠失型rph-pyrE DNA断片を得、これを温度感受性プラスミドpMAN997（WO 99/03988号国際公開パンフレット）のマルチプルクローニングサイトに挿入することにより、欠失用プラスミド pMAN-rph-pyrE (m) を得る。このプラスミドでMG1655ΔsucA株をC. T. Chungらの方法により形質転換し、LB＋アンピシリンプレートで30℃でコロニーを選択する。選択したクローンを30℃で一晩液体培養した後、培養液を10^-3希釈してLB＋アンピシリンプレートにまき、42℃でコロニーを選択する。選択したクローンをLB＋アンピシリンプレートに塗り広げて30℃で培養した後、プレートの1/8の菌体をLB培地 2 mLに懸濁し、42℃で4〜5時間振とう培養する。10^-5希釈した培養液をLBプレートにまき、得られたコロニーのうち数百コロニーをLBプレートとLB＋アンピシリンプレートに植菌し、生育を確認することで、アンピシリン感受性株を選択する。アンピシリン感受性株の数株についてコロニーPCRを行い、pyrE遺伝子上流部分の目的の欠失を確認する。こうしてE. coli MG1655由来のsucA欠失株MG1655ΔsucAよりpyrE上流部分が欠失した株MG1655ΔsucA rph-pyrE(m)株を得ることができる。 (2) Construction of a strain MG1655ΔsucArph-pyrE (m) lacking the pyrE upstream part from the MG1655ΔsucA strain lacking the sucA gene of Escherichia coli
On the chromosome of MG1655ΔsucA strain, 82 bp in the rph gene upstream (5 'side) of the pyrE gene (base sequence of E. coli MG1655 genome (GenBank ACCESSION: NC_000913, VERSION: NC_000913.2 GI: 49175990 coordinates 3813882 ~ 3813963, nucleotide numbers 610 to 691) of SEQ ID NO: 11 can be deleted as follows: First, synthetic oligonucleotides 5 and 6 (SEQ ID NOs: 5 and 6) are primers using MG1655 chromosomal DNA as a template To obtain DNA fragment 1. Similarly, PCR is carried out using synthetic oligonucleotides 7 and 8 (SEQ ID NOs: 7 and 8) as primers to obtain DNA fragment 2. Next, a mixture of DNA fragment 1 and DNA fragment 2 Is used as a template and oligonucleotides 5 and 8 are used as primers to obtain a deletion-type rph-pyrE DNA fragment, which is used as a multiple cloning site for temperature-sensitive plasmid pMAN997 (WO 99/03988 International Publication Pamphlet). To obtain a deletion plasmid pMAN-rph-pyrE (m) Using this plasmid, the MG1655ΔsucA strain is transformed by the method of CT Chung et al., And colonies are selected at 30 ° C. on LB + ampicillin plates. After overnight culture at 30 ° C, the culture is diluted 10 ^-3 and spread onto LB + ampicillin plates, and colonies are selected at 42 ° C.The selected clones are spread on LB + ampicillin plates and spread at 30 ° C. after culturing, the 1/8 cells of the plate were suspended in LB medium 2 mL, seeded cultures were .10 ^-5 dilutions for 4-5 hours shaking culture at 42 ° C. in LB plates, the resulting colonies Several hundred colonies are inoculated into LB plates and LB + ampicillin plates, and growth is confirmed to select ampicillin sensitive strains. Thus, a strain MG1655ΔsucArph-pyrE (m) in which the upstream portion of pyrE is deleted from the sucA-deficient strain MG1655ΔsucA derived from E. coli MG1655 can be obtained.

（３）MG1655ΔsucA rph-pyrE(m)株のグルタミン酸生成能の評価
pyrE遺伝子上流の欠失によるＬ−グルタミン酸発酵への効果を検討するため、MG1655ΔsucAΔsucA rph-pyrE(m)株を、sucA遺伝子欠損株MG1655ΔsucAを対照として培養し、Ｌ−グルタミン酸生産量を測定した。そのための培地および培養方法ならびに分析方法を以下に示す。26.6時間培養後のＬ−グルタミン酸収率を表１に示した。独立に取得した２クローンについてシングルコロニーアイソレーションして得た株各２株づつ、計４株を培養し、グルタミン酸収率の平均値を示した。 (3) Evaluation of glutamate production ability of MG1655ΔsucA rph-pyrE (m) strain
In order to examine the effect on L-glutamic acid fermentation by deletion of the upstream of the pyrE gene, the MG1655ΔsucAΔsucA rph-pyrE (m) strain was cultured using the sucA gene-deficient strain MG1655ΔsucA as a control, and the amount of L-glutamic acid produced was measured. The medium, culture method and analysis method for this purpose are shown below. Table 1 shows the yield of L-glutamic acid after 26.6 hours of culture. A total of 4 strains, each of 2 strains obtained by single colony isolation for 2 clones obtained independently, were cultured, and the average value of glutamic acid yield was shown.

〔MS培地〕
（最終濃度）
グルコース 40 g/L（別殺菌）
MgSO₄・7H₂O 1 g/L（別殺菌）
(NH₄)₂SO₄ 16 g/L
KH₂PO₄ 1 g/L
Yeast Extract 2 g/L
FeSO₄ 0.01 g/L
MnSO₄ 0.01 g/L
CaCO₃ 30 g/L（別殺菌） [MS medium]
(Final concentration)
Glucose 40 g / L (separate sterilization)
MgSO ₄・ 7H ₂ O 1 g / L (separate sterilization)
(NH ₄ ) ₂ SO ₄ 16 g / L
KH ₂ PO ₄ 1 g / L
Yeast Extract 2 g / L
FeSO ₄ 0.01 g / L
MnSO ₄ 0.01 g / L
CaCO ₃ 30 g / L (separate sterilization)

〔培養方法〕
リフレッシュ(refresh)培養；保存状態の菌をLB寒天培地に接種し、37℃、24時間培養した。
種（seed）試験管培養；リフレッシュ培養した菌をLB液体培地（必要に応じて薬剤添加）に接種し、37℃、16時間培養した。
主(main)培養；種培養液体培地から10％MS液体培地（必要に応じて薬剤添加）に接種し、37℃、 20ml/500ml容坂口フラスコで培養した。 [Culture method]
Refresh culture: The inoculated bacteria were inoculated on LB agar medium and cultured at 37 ° C. for 24 hours.
Seed test tube culture; refresh-cultured bacteria were inoculated into LB liquid medium (added with drug as needed) and cultured at 37 ° C. for 16 hours.
Main culture: Seed culture liquid medium was inoculated into 10% MS liquid medium (added with drug as required) and cultured in a 20 ml / 500 ml Sakaguchi flask at 37 ° C.

〔分析方法〕
グルコース濃度、及びＬ−グルタミン酸濃度は、培養液を15,000rpmで5分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈してバイオバイオテックアナライザーAS-210（サクラ精器）により測定した。尚、培養26.6時間後の培地中のグルコース濃度は11g/lであった。 [Analysis method]
The glucose concentration and L-glutamic acid concentration were measured with a biobiotech analyzer AS-210 (Sakura Seiki) after centrifuging the culture solution at 15,000 rpm for 5 minutes, diluting the supernatant with water at an appropriate magnification. The glucose concentration in the medium after 26.6 hours of culture was 11 g / l.

〔実施例２〕pyrE遺伝子を増幅したスレオニン生産株の評価
（１）エシェリヒア・コリのスレオニン生産株B-3996、B-5318からのpyrE増幅株の構築
pyrE増幅用のプラスミドを以下のようにして構築した。MG1655染色体DNAを鋳型とし、合成オリゴヌクレオチド９、１０（配列番号９、１０）をプライマーとしてPCRを行い、pyrE遺伝子断片を得た。これをプラスミドベクターpMW219（ニッポンジーン）またはpSTV28（TaKaRa）のSmaIサイトにクローニングし、それぞれ pMW219-pyrE、pSTV28-pyrEを得た。 [Example 2] Evaluation of a threonine-producing strain in which the pyrE gene was amplified (1) Construction of a pyrE-amplified strain from Escherichia coli threonine-producing strains B-3996 and B-5318
A plasmid for pyrE amplification was constructed as follows. PCR was performed using MG1655 chromosomal DNA as a template and synthetic oligonucleotides 9 and 10 (SEQ ID NOs: 9 and 10) as primers to obtain a pyrE gene fragment. This was cloned into the SmaI site of plasmid vectors pMW219 (Nippon Gene) or pSTV28 (TaKaRa) to obtain pMW219-pyrE and pSTV28-pyrE, respectively.

スレオニン生産菌B-3996株、B-5318株からのpyrE遺伝子増幅株は、B-3996株、B-5318株にpMW219-pyrE、pSTV28-pyrEをエレクトロポレーションにより導入することによって得ることができる。 PyrE gene amplified strains from threonine-producing bacteria B-3996 and B-5318 can be obtained by introducing pMW219-pyrE and pSTV28-pyrE into B-3996 and B-5318 by electroporation. .

（２）エシェリヒア・コリのスレオニン生産株B3996、B3996のpyrE増幅株のＬ−スレオニン生産能の評価
B3996、B3996由来pyrE増幅株を、下記のようにして培養した後、培養液のＬ−スレオニンを定量し、対照の非増幅株と比べてスレオニン収率が高いことを示すことができる。 (2) Evaluation of L-threonine-producing ability of Escherichia coli threonine-producing strains B3996 and pyrE-amplified strains of B3996
After culturing the B3996 and B3996-derived pyrE amplified strains as described below, L-threonine in the culture solution can be quantified to show that the threonine yield is higher than that of the control non-amplified strain.

（培地）
グルコース 40.0 g/l (A), K₂HPO₄ 0.7 g/l (B), Thiamine HCl 0.2mg/l (C), MgSO₄・7aq1.0g/l (D), (NH₄)₂SO₄ 16.0 g/l (D), FeSO₄・7aq0.01g/l (D), MnSO₄・5aq0.01g/l,
イーストエキストラクト2.0 g/l (D), L-イソロイシン0.05 g/l (D)。A, B, Dは、それぞれKOHでpH7.0にあわせ、別々に殺菌 (115℃，10分オートクレーブ) した後混合し、フィルター滅菌した(C) を添加する。 (Culture medium)
Glucose 40.0 g / l (A), K ₂ HPO ₄ 0.7 g / l (B), Thiamine HCl 0.2 mg / l (C), MgSO ₄ 7aq 1.0 g / l (D), (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 16.0 g / l (D), FeSO 4 · 7aq0.01g / l (D), MnSO 4 · 5aq0.01g / l,
Yeast extract 2.0 g / l (D), L-isoleucine 0.05 g / l (D). A, B, and D are adjusted to pH 7.0 with KOH, sterilized separately (autoclave at 115 ° C for 10 minutes), mixed, and filter sterilized (C) is added.

（培養方法）
LB培地で一晩培養した培養液1 mlを、20 mlの上記培地に植菌し、500 ml坂口フラスコにて37℃で振とう培養する。 (Culture method)
1 ml of the culture solution cultured overnight in LB medium is inoculated into 20 ml of the above medium, and cultured with shaking in a 500 ml Sakaguchi flask at 37 ° C.

（分析方法）
培養液を15,000rpmで５分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈し、アミノ酸アナライザーL-8500で測定する。 (Analysis method)
The culture solution is centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant is diluted with water at an appropriate magnification and measured with an amino acid analyzer L-8500.

〔実施例３〕pyrE遺伝子を増幅したＬ−グルタミン酸生産株の評価
また、OPRTase活性が上昇したＬ−グルタミン酸生産菌の親株としてパントエア・アナナティスAJ13601株を用いることが出来る。なお、パントエア・アナナティスAJ13601株は経済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に受託番号FERM P-17516として1999年8月18日に寄託され、2000年7月6日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。Ｌ−グルタミン酸生産菌からのpyrE遺伝子増幅株の構築は、実施例２と同様の方法でpMW219-pyrE，pSTV28-pyrEを導入することにより得ることが出来る。 [Example 3] Evaluation of L-glutamic acid-producing strain with amplified pyrE gene Pantoea ananatis AJ13601 strain can be used as a parent strain of L-glutamic acid-producing bacterium with increased OPRTase activity. In addition, Pantoea Ananatis AJ13601 was registered as the reference number FERM P-17516 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry (Postal Code: 305-8566, 1-3-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) as of August 18, 1999. The deposit was transferred to the international deposit under the Budapest Treaty on July 6, 2000, and the deposit number FERM BP-7207 was assigned. Construction of a pyrE gene amplified strain from an L-glutamic acid-producing bacterium can be obtained by introducing pMW219-pyrE and pSTV28-pyrE in the same manner as in Example 2.

pyrE遺伝子増幅株は、Ｌ−グルタミン酸生産培地で培養し、往復振とう培養装置で培養
する。培養後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸の量を公知の方法により測定し、Ｌ−グルタミン酸の蓄積が向上していることを確認する。このような方法でＬ−グルタミン酸生産能の向上したpyrE遺伝子増幅株を取得することが出来る。 The pyrE gene amplified strain is cultured in an L-glutamic acid production medium and cultured in a reciprocating shake culture apparatus. After culturing, the amount of L-glutamic acid accumulated in the medium is measured by a known method to confirm that the accumulation of L-glutamic acid is improved. A pyrE gene amplified strain with improved L-glutamic acid-producing ability can be obtained by such a method.

Claims

Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物。 A microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae, which has L-amino acid-producing ability and has been modified to enhance orotate phosphoribosyltransferase activity.

オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥ遺伝子の発現量を増大させること、及び／または、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの翻訳量を増大させることによりオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された請求項１に記載の微生物。 2. The orotate phosphoribosyltransferase activity is enhanced by increasing the expression level of the pyrE gene encoding orotate phosphoribosyltransferase and / or increasing the translation amount of orotate phosphoribosyltransferase. Microorganisms.

オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥ遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された、請求項１又は２に記載の微生物。 The microorganism according to claim 1 or 2, wherein the orotate phosphoribosyltransferase activity is enhanced by increasing the copy number of the pyrE gene encoding orotate phosphoribosyltransferase or by modifying the expression regulatory sequence of the gene. .

ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンを有し、ｒｐｈ遺伝子のコード領域に−１のフレームシフト変異を生来有する微生物を改変することによって得られる微生物であって、前記フレームシフト変異を相補する変異が導入されたことにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された請求項１又は２に記載の微生物。 a microorganism obtained by modifying a microorganism having the rph-pyrE operon and having a frameshift mutation of -1 in the coding region of the rph gene, wherein a mutation complementary to the frameshift mutation has been introduced; The microorganism according to claim 1 or 2, wherein activity of orotate phosphoribosyltransferase is enhanced.

ｐｙｒＥ遺伝子の上流のアテニュエーターを欠損したことにより、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が増強された請求項１又は２に記載の微生物。 The microorganism according to claim 1 or 2, wherein the orotate phosphoribosyltransferase activity is enhanced by deletion of an attenuator upstream of the pyrE gene.

前記オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼが、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の微生物：
（Ａ）配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号１２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。 The microorganism according to any one of claims 2 to 5, wherein the orotate phosphoribosyltransferase is a protein according to (A) or (B) below:
(A) a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12,
(B) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, having an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acid residues, and having orotate phosphoribosyltransferase activity Protein.

前記ｐｙｒＥ遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項２〜６のいずれか一項に記載に記載の微生物：
（ａ）配列番号１１の塩基番号７８２〜１４２３の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１１の塩基番号７８２〜１４２３の塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 The microorganism according to any one of claims 2 to 6, wherein the pyrE gene is the DNA described in (a) or (b) below:
(A) a DNA comprising the nucleotide sequence of nucleotide numbers 782-1423 of SEQ ID NO: 11,
(B) It hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence of base numbers 782-1423 of SEQ ID NO: 11 or a probe that can be prepared from the base sequence, and has orotate phosphoribosyltransferase activity DNA encoding a protein having the same.

前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン及びＬ−グルタミン酸からなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物。 The L-amino acid is L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-isoleucine, L-valine, L-leucine, L-threonine, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-cysteine and The microorganism according to any one of claims 1 to 7, which is one or more L-amino acids selected from the group consisting of L-glutamic acid.

前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物。 The microorganism according to any one of claims 1 to 8, wherein the microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae is an Escherichia bacterium, an Enterobacter bacterium, or a Pantoea bacterium.

請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。 Culturing the microorganism according to any one of claims 1 to 9 in a medium, producing and accumulating an L-amino acid in the medium or in the fungus body, and recovering the L-amino acid from the medium or the fungus body. A process for producing a characteristic L-amino acid.

前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシ
ン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン及びＬ−グルタミン酸からなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である、請求項１０に記載の方法。 The L-amino acid is L-lysine, L-arginine, L-histidine, L-isoleucine, L-valine, L-leucine, L-threonine, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-cysteine and The method according to claim 10, which is one or more L-amino acids selected from the group consisting of L-glutamic acid.