RU2471868C2

RU2471868C2 - Mutant adenylate cyclase, dna coding it, bacteria of enterobacteriaceae family containing said dan and method for preparing l-amino acids

Info

Publication number: RU2471868C2
Application number: RU2010105710/10A
Authority: RU
Inventors: Наталья Сергеевна Ерёмина; Наталия Викторовна Стойнова; Татьяна Абрамовна Ямпольская
Original assignee: Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ)
Priority date: 2010-02-18
Filing date: 2010-02-18
Publication date: 2013-01-10
Also published as: WO2011102305A3; WO2011102305A2; RU2010105710A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: what is presented is a mutant adenylate cyclase having an amino acid sequence presented as SEQ ID NO: 2 wherein a residue of L-lysine in a position matched with position 432 in SEQ ID NO: 2 is substituted by a residue of L-glutamine, and a version of mutant adenylate cyclase having an amino acid sequence presented as SEQ ID NO: 2 wherein a residue of L-lysine in a position matched with position 432 in SEQ ID NO: 2 is substituted by a residue of L-glutamine containing a deletion, an insertion, an addition and/or a substitution of one or more amino acid residues and having activity of adenylate cyclase according to a sequence presented in SEQ ID NO: 2. What is presented is DNA coding mutant adenylate cyclase. What is also presented is a bacterium of Enterobacteriaceae family containing DNA coding mutant adenylate cyclase that is a producer of proteinogenic L-amino acid. What is disclosed is a method for producing proteinogenic L-amino acid involving bacterium growth in the nutrient medium containing ethanol and/or glycerol as a primary carbon source, and recovery of said L-amino acid from the culture fluid.

EFFECT: invention allows producing high efficacy L-amino acid.

10 cl, 3 tbl, 10 ex

Description

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, содержащей мутантную аденилатциклазу.The present invention relates to the microbiological industry, in particular to a method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family containing mutant adenylate cyclase.

Описание предшествующего уровня техникиDescription of the Related Art

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.Traditionally, L-amino acids on an industrial scale can be obtained by fermentation using strains of microorganisms obtained from natural sources, or their mutants, specially modified in order to increase the production of L-amino acids.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, включая трансформацию микроорганизмов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4,278,765). Другие методы увеличения продукции включают повышение активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшение чувствительности целевого фермента к ингибированию по типу обратной связи продуцируемой L-аминокислотой (см., например, международную заявку WO 95/16042 или патенты США 4,346,170; 5,661,012 и 6,040,160).Numerous methods have been described to increase the production of L-amino acids, including transformation of recombinant DNA microorganisms (see, for example, US Pat. No. 4,278,765). Other methods of increasing production include increasing the activity of enzymes involved in the biosynthesis of amino acids, and / or reducing the sensitivity of the target enzyme to feedback inhibition produced by the L-amino acid (see, for example, international application WO 95/16042 or US patents 4,346,170; 5,661,012 and 6,040,160).

Было показано, что мутанты Е.coli K-12, дефицитные по аденилатциклазе (Cya) и катаболитному белку-активатору (Crp) растут на минимальной глюкозной среде медленнее, чем их родительские штаммы. Скорость их роста заметно снижалась при повышенном значении рН - между 6 и 7.8. Было показано, что такая чувствительность к значению рН является прямым следствием мутации cya, поскольку мутация устойчивости к повышенному рН также восстанавливала способность к ферментации различных сахаров. Протонзависимый транспорт пролина и глутамата также снижался и был чувствителен к рН в cya-мутантах. Значение активности мембраносвязанной АТФазы было нормальным. Скорость поглощения клетками кислорода хотя и была снижена, но была не чувствительна к рН (Ahmad D, Newman ЕВ. J Bacteriol.; 170(8):3443-7(1988)).It was shown that E. coli K-12 mutants deficient in adenylate cyclase (Cya) and catabolite activator protein (Crp) grow on a minimal glucose medium more slowly than their parent strains. Their growth rate decreased markedly with an increased pH value - between 6 and 7.8. It has been shown that this sensitivity to pH is a direct consequence of the cya mutation, as the mutation of resistance to increased pH also restored the ability to ferment various sugars. Proton-dependent transport of proline and glutamate also decreased and was pH sensitive in cya mutants. The activity of membrane-bound ATPase was normal. Although the rate of oxygen uptake by the cells was reduced, it was not pH sensitive (Ahmad D, Newman EB. J Bacteriol .; 170 (8): 3443-7 (1988)).

Обнаружено, что дефицитные по аденилатциклазе (cya) мутанты Е.coli K-12 устойчивы к фосмидомицину, специфическому ингибитору не мевалонатного пути, как к фосфомицину. Мутанты Е.coli по glpT были устойчивы к фосфомицину, так же как и к фосмидомицину. Этот факт доказывает, что фосмидомицин траспортировался внутрь через глицерол-3-фосфатный транспортер, GlpT. Анализ с использованием микрочипов ДНК показал, что транскрипция glpT и других генов, имеющих отношение к утилизации глицерина, в значительной степени зависит от присутствия цАМФ (Sakamoto Y, et. al., Biosci Biotechnol Biochem.; 67(9):2030-3(2003)).It was found that E. coli K-12 deficient in adenylate cyclase (cya) mutants are resistant to fosmidomycin, a specific non-mevalonate pathway inhibitor, like phosphomycin. E. coli mutants for glpT were resistant to fosfomycin, as well as to fosmidomycin. This fact proves that fosmidomycin was transported orally via the glycerol-3-phosphate transporter, GlpT. DNA microarray analysis showed that the transcription of glpT and other genes related to glycerol utilization is highly dependent on the presence of cAMP (Sakamoto Y, et. Al., Biosci Biotechnol Biochem .; 67 (9): 2030-3 ( 2003)).

В настоящее время нет сообщений, описывающих использование бактерии, содержащей мутантную аденилатциклазу, для получения L-аминокислот.There are currently no reports describing the use of bacteria containing mutant adenylate cyclase to produce L-amino acids.

Описание изобретенияDescription of the invention

Цели настоящего изобретения включают повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислоты и предоставление способа получения неароматической или ароматической L-аминокислот с использованием этих штаммов.Objectives of the present invention include increasing the productivity of strains producing L-amino acids and providing a method for producing non-aromatic or aromatic L-amino acids using these strains.

Вышеупомянутые цели были достигнуты путем установления того факта, что мутация в аденилатциклазе может привести к повышению продукции L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-глутаминовая кислота, L-пролин, L-аргинин, L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.The above goals were achieved by establishing the fact that a mutation in adenylate cyclase can lead to increased production of L-amino acids such as L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-methionine, L-leucine, L-isoleucine, L- valine, L-histidine, L-glycine, L-serine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, L-proline, L-arginine, L-phenylalanine, L- tyrosine and L-tryptophan.

Настоящее изобретение предоставляет бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую способностью к повышенной продукции аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-глутаминовая кислота, L-пролин, L-аргинин, L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.The present invention provides a bacterium of the Enterobacteriaceae family that is capable of increased production of amino acids such as L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-methionine, L-leucine, L-isoleucine, L-valine, L-histidine, L- glycine, L-serine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, L-proline, L-arginine, L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan.

Целью настоящего изобретения является предоставление мутантной аденилатциклазы, выбранной из группы, состоящей из:An object of the present invention is to provide a mutant adenylate cyclase selected from the group consisting of:

(A) белка, в котором L-лизин в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO:2, замещен другим аминокислотным остатком; и(A) a protein in which L-lysine at the position corresponding to position 432 in SEQ ID NO: 2 is substituted with another amino acid residue; and

(B) варианта белка (А), обладающего аденилатциклазной активностью.(B) a variant of the protein (A) having adenylate cyclase activity.

Также целью настоящего изобретения является предоставление упомянутой мутантной аденилатциклазы, отличающейся тем, что L-лизин в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO:2, замещен L-глутамином.It is also an object of the present invention to provide said mutant adenylate cyclase, characterized in that L-lysine at the position corresponding to position 432 in SEQ ID NO: 2 is substituted with L-glutamine.

Также целью настоящего изобретения является предоставление ДНК, кодирующей упомянутую мутантную аденилатциклазу.It is also an object of the present invention to provide DNA encoding said mutant adenylate cyclase.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии семейства Enterobacteriaceae, содержащей упомянутую ДНК.It is also an object of the present invention to provide an Enterobacteriaceae family bacterium containing said DNA.

Также целью настоящего изобретения является предоставление упомянутой бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия способна к продукции L-аминокислот.It is also an object of the present invention to provide said bacterium, characterized in that said bacterium is capable of producing L-amino acids.

Также целью настоящего изобретения является предоставление упомянутой бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.It is also an object of the present invention to provide said bacterium, characterized in that said bacterium belongs to the genus Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление упомянутой бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия - Escherichia coli.It is also an object of the present invention to provide said bacterium, characterized in that said bacterium is Escherichia coli.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, включающего выращивание упомянутой бактерии в питательной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода этанол или глицерин, и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.It is also an object of the present invention to provide a method for producing an L-amino acid, comprising growing said bacterium in a nutrient medium containing ethanol or glycerol as the sole carbon source, and isolating said L-amino acid from the culture fluid.

Также целью настоящего изобретения является предоставление упомянутого способа, отличающегося тем, что указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.It is also an object of the present invention to provide said method, characterized in that said L-amino acid is selected from the group consisting of an aromatic L-amino acid and a non-aromatic L-amino acid.

Также целью настоящего изобретения является предоставление упомянутого способа, отличающегося тем, что указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.It is also an object of the present invention to provide the aforementioned method, characterized in that said aromatic L-amino acid is selected from the group consisting of L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan.

Также целью настоящего изобретения является предоставление упомянутого способа, отличающегося тем, что указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-греонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.It is also an object of the present invention to provide said method, characterized in that said non-aromatic L-amino acid is selected from the group consisting of L-greonin, L-lysine, L-cysteine, L-methionine, L-leucine, L-isoleucine, L- valine, L-histidine, L-glycine, L-serine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartate, L-glutamine, L-glutamic acid, L-proline and L-arginine.

Более детально настоящее изобретение описано ниже.In more detail, the present invention is described below.

Наилучший способ осуществления настоящего изобретенияBEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

1. Мутантная аденилатциклаза и кодирующий ее фрагмент ДНК согласно настоящему изобретению.1. Mutant adenylate cyclase and its encoding DNA fragment according to the present invention.

Ген cyaA (синонимы: ECK3800, b3806) кодирует белок Cya, аденилатциклазу (синоним В3806). Ген cyaA (нуклеотиды с 3,989,176 по 3,991,722; в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi; 49175990) расположен между геном hemC, ориентированным в противоположном направлении, и геном cyaY, ориентированным в противоположном направлении, на хромосоме Е.coli штамма K-12. Нуклеотидная последовательность гена cyaA и аминокислотная последовательность белка Cya, кодируемого геном cyaA, приведены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, соответственно.The cyaA gene (synonyms: ECK3800, b3806) encodes the Cya protein, adenylate cyclase (synonym for B3806). The cyaA gene (nucleotides 3,989,176 through 3,991,722; in sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database; gi; 49175990) is located between the hemC gene in the opposite direction and the cyaY gene in the opposite direction on the E. coli chromosome strain K-12. The nucleotide sequence of the cyaA gene and the amino acid sequence of the Cya protein encoded by the cyaA gene are shown in the Sequence Listing Numbers SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.

Фраза "активность аденилатциклазы" означает активность, катализирующую синтез циклической АМФ (сАМР) путем внутримолекулярного переноса аденилильной группы АТФ на 3'-гидроксигруппу с высвобождением пирофосфата. Активность аденилатциклазы может быть определена, например, с использованием метода, описанного Yang J.K. and Epstein W. (J Biol Chem.; 258(6):3750-8(1983)).The phrase “adenylate cyclase activity” means an activity that catalyzes the synthesis of cyclic AMP (cAMP) by intramolecular transfer of the adenylyl group of ATP to the 3'-hydroxy group with the release of pyrophosphate. Adenylate cyclase activity can be determined, for example, using the method described by Yang J.K. and Epstein W. (J Biol Chem .; 258 (6): 3750-8 (1983)).

Аденилатциклаза с заменой аминокислотного остатка, соответствующего положению 432 в SEQ ID NO:2, может быть упомянута как "мутантная аденилатциклаза", ДНК, кодирующая мутантную аденилатциклазу, может быть упомянута как "мутантный ген cyaA" или "мутантный ген аденилатциклазы", а аденилатциклаза без замены может быть упомянута как "аденилатциклаза дикого типа".Adenylate cyclase with the replacement of the amino acid residue corresponding to position 432 in SEQ ID NO: 2 can be referred to as “mutant adenylate cyclase”, DNA encoding a mutant adenylate cyclase can be referred to as “mutant cyaA gene” or “mutant adenylate cyclase gene”, and adenylate cyclase substitutions may be referred to as "wild-type adenylate cyclase."

Согласно настоящему изобретению, "остаток L-аминокислоты, соответствующий положению 432" означает аминокислотный остаток, соответствующий аминокислотному остатку в положении 432 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.According to the present invention, “L-amino acid residue corresponding to position 432” means an amino acid residue corresponding to the amino acid residue at position 432 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

Положение аминокислотного остатка может меняться. Например, если в N-концевой области имеет место вставка аминокислотного остатка, аминокислотный остаток, изначально локализованный в положении 432, оказывается в положении 433. В таком случае аминокислотный остаток, соответствующий изначальному положению 432, обозначается как аминокислотый остаток в положении 432 согласно настоящему изобретению.The position of the amino acid residue may vary. For example, if an insertion of an amino acid residue takes place in the N-terminal region, the amino acid residue initially localized at position 432 is at position 433. In this case, the amino acid residue corresponding to the initial position 432 is designated as the amino acid residue at position 432 according to the present invention.

Для определения остатка L-аминокислоты, соответствующего мутации 432 аденилатциклазы, необходимо сделать выравнивание аминокислотной последовательности аденилатциклазы из Е.coli и аминокислотной последовательности аденилатциклазы из представляющей интерес бактерии и определить L-аминокислоту, соответствующую номеру 432 в аденилатциклазе из представляющей интерес бактерии.To determine the L-amino acid residue corresponding to the 432 adenylate cyclase mutation, it is necessary to align the amino acid sequence of the adenylate cyclase from E. coli and the amino acid sequence of the adenylate cyclase from the bacteria of interest and determine the L-amino acid corresponding to number 432 in the adenylate cyclase from the bacterium of interest.

Поскольку у представителей различных родов и штаммов семейства Enterobacteriaceae возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие гена суаА не ограничивается геном, последовательность которого приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID No:1, но также может включать и гомологичные ему гены. Следовательно, вариант белка, кодируемый геном суаА, может иметь гомологию не менее 80%, предпочтительно не менее 90%, и наиболее предпочтительно не менее 95%, с полной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 при условии сохранения активности белка Cya. Термин "вариант белка", используемый в настоящем изобретении, означает белок с изменениями в последовательности, будь то делеции, вставки, добавления или замены аминокислот. Число изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в третичной структуре белка. Оно может быть от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 15, более предпочтительно от 1 до 5 в SEQ ID NO:2. Данные изменения в вариантах могут иметь место в областях, не критичных для третичной структуры белка. Данные изменения возможны потому, что некоторые аминокислоты имеют высокую гомологию друг другу, поэтому такие изменения не влияют на третичную структуру.Since representatives of various genera and strains of the Enterobacteriaceae family may experience some variations in the nucleotide sequences, the concept of the cyaA gene is not limited to the gene shown in the Sequence Listing under SEQ ID No: 1, but may also include genes homologous to it. Therefore, the protein variant encoded by the cyaA gene can have a homology of at least 80%, preferably at least 90%, and most preferably at least 95%, with the full amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, while maintaining the activity of the Cya protein. The term "protein variant", as used in the present invention, means a protein with changes in sequence, be it deletion, insertion, addition or replacement of amino acids. The number of changes in a protein variant depends on the position or type of amino acid residue in the tertiary structure of the protein. It can be from 1 to 30, preferably from 1 to 15, more preferably from 1 to 5 in SEQ ID NO: 2. These changes in variants can occur in areas that are not critical for the tertiary structure of the protein. These changes are possible because some amino acids have a high homology to each other, therefore, such changes do not affect the tertiary structure.

Гомология между двумя аминокислотами последовательностями может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST 2.0, которая считает три параметра: число аминокислот, идентичность и сходство.The homology between two amino acid sequences can be determined using known methods, for example, the BLAST 2.0 computer program, which counts three parameters: amino acid number, identity, and similarity.

Замена, делеция, вставка или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков должны быть консервативными мутациями, при которых сохраняется активность белка. Типичной консервативной мутацией является консервативная замена. Примеры консервативной замены включают: замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gln, His или Lys, замену Asn на Glu, Gln, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gln, замену Cys на Ser или Ala, замену Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gln, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr, замену Ile на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg, замену Met на Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, Ile или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp, и замену Val на Met, Ile или Leu.Substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acid residues should be conservative mutations in which protein activity is maintained. A typical conservative mutation is a conservative substitution. Examples of conservative substitutions include: replacing Ala with Ser or Thr, replacing Arg with Gln, His or Lys, replacing Asn with Glu, Gln, Lys, His or Asp, replacing Asp with Asn, Glu or Gln, replacing Cys with Ser or Ala, replacing Gln with Asn, Glu, Lys, His, Asp, or Arg, replacing Glu with Asn, Gln, Lys, or Asp, replacing Gly with Pro, replacing His with Asn, Lys, Gln, Arg, or Tyr, replacing Ile with Leu, Met , Val or Phe, replace Leu with Ile, Met, Val or Phe, replace Lys with Asn, Glu, Gln, His or Arg, replace Met with Ile, Leu, Val or Phe, replace Phe with Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, replacing Ser with Thr or Ala, replacing Thr with Ser or Ala, replacing Trp with Phe or Tyr, replacing Tyr with His, Phe or Trp, and replacing Val with Met, Ile or Leu.

Поэтому ген cyaA может быть вариантом, который гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, приведенной в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например, гибриды с гомологией не менее 80%, предпочтительно не менее 90%, более предпочтительно не менее 95%, еще более предпочтительно не менее 97%, и наиболее предпочтительно не менее 98%, образуются, а неспецифические гибриды, например, гибриды с меньшей гомологией, чем указано выше, - не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond™ N+ (Amersham) при строгих условиях - 15 минут. Предпочтительна двухтрехкратная отмывка. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, обычно она составляет от 100 п.н. до 1 т.п.н.Therefore, the cyaA gene may be a variant that hybridizes under stringent conditions with the nucleotide sequence shown in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 1, or with a probe that can be synthesized based on the indicated nucleotide sequence. "Stringent conditions" include those conditions under which specific hybrids, for example hybrids with a homology of at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, even more preferably at least 97%, and most preferably at least 98 % are formed, and non-specific hybrids, for example, hybrids with less homology than indicated above, are not formed. A practical example of harsh conditions is a single wash, preferably two or three times, at a salt concentration of 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS, at 60 ° C. The duration of washing depends on the type of membrane used for blotting and, as a rule, is as recommended by the manufacturer. For example, the recommended washing time for Hybond ™ N + nylon membrane (Amersham) under stringent conditions is 15 minutes. Two-time washing is preferred. The length of the probe can be selected depending on the hybridization conditions, usually it is from 100 bp up to 1 kb

Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).Methods for preparing plasmid DNA, DNA restriction and ligation, transformation, selection of nucleotides as a primer, etc. may be conventional methods known to a person skilled in the art. These methods are described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

1. Бактерия согласно настоящему изобретению1. The bacterium according to the present invention

Бактерия согласно настоящему изобретению - это бактерия-продуцент L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, содержащая мутантную аденилатциклазу.The bacterium according to the present invention is a bacterium producing L-amino acids of the Enterobacteriaceae family containing mutant adenylate cyclase.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения в клетку бактерии фрагмента ДНК, кодирующего мутантную аденилатциклазу согласно настоящему изобретению.The bacterium of the present invention can be obtained by introducing into the bacterial cell a DNA fragment encoding the mutant adenylate cyclase of the present invention.

Согласно настоящему изобретению, «бактерия-продуцент L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению L-аминокислоты в питательную среду, когда указанная бактерия выращивается в указанной питательной среде.According to the present invention, “L-amino acid producing bacterium” means a bacterium capable of producing and secreting an L-amino acid into a culture medium when said bacterium is grown in said culture medium.

Используемый здесь термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в ферментационной среде в количествах, больших по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким как штамм Е.coli K-12, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно, не менее чем 1.0 г/л. Термин «L-аминокислота» включает в себя. Градации, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.As used herein, the term “L-amino acid producing bacterium” also means a bacterium that is capable of producing the L-amino acid and causes the accumulation of the L-amino acid in the fermentation medium in quantities greater than the natural or parent E. coli strain, such as strain E .coli K-12, and preferably means that the microorganism is able to accumulate in the medium the target L-amino acid in an amount of not less than 0.5 g / l, more preferably not less than 1.0 g / l. The term "L-amino acid" includes. Graduation, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, L-glutamic acid, L-glutamine, L-glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L- methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine and L-valine.

Термин «ароматическая L-аминокислота» включает в себя L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан. Термин «неароматическая L-аминокислота» включает в себя L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспартат, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-пролин и L-аргинин. Наиболее предпочтительны L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.The term “aromatic L-amino acid” includes L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan. The term “non-aromatic L-amino acid” includes L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-methionine, L-leucine, L-isoleucine, L-valine, L-histidine, L-glycine, L-serine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartate, L-glutamine, L-glutamic acid, L-proline and L-arginine. Most preferred are L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-leucine, L-histidine, L-glutamic acid, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-proline and L-arginine.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock). Предпочтительна бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea.The Enterobacteriaceae family includes bacteria belonging to the genera Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia, etc. More specifically, bacteria classified as belonging to the Enterobacteriaceae family according to the taxonomy used in the NCBI database (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/ can be used. wgetorg? mode = Tree & id = 1236 & lvl = 3 & keep = 1 & srchmode = 1 & unlock). A bacterium belonging to the genus Escherichia or Pantoea is preferred.

Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.coli).The term "bacterium belonging to the genus Escherichia" means that the bacterium belongs to the genus Escherichia in accordance with the classification known to the person skilled in the field of microbiology. As an example of a microorganism belonging to the genus Escherichia used in the present invention, the bacterium Escherichia coli (E. coli) may be mentioned.

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium,. American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.The range of bacteria belonging to the genus Escherichia that can be used in the present invention is not limited in any way, however, for example, the bacteria described in Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1), can be included in the number of bacteria according to the present invention.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).The term "bacterium belonging to the genus Pantoea" means that the bacterium belongs to the genus Pantoea in accordance with the classification known to the specialist in the field of microbiology. Recently, several Enterobacter agglomerans species have been classified as Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii or the like based on analysis of the 16S rRNA nucleotide sequence, etc. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).

Бактерия-продуцент L-аминокислотыL-amino acid producing bacterium

В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, имеющей мутацию в гене cyaA, может использоваться бактерия, способная к продукции ароматической или неароматической L-аминокислоты.As a bacterium according to the present invention having a mutation in the cyaA gene, a bacterium capable of producing an aromatic or non-aromatic L-amino acid can be used.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения мутации в гене cyaA в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-аминокислот. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания способности к продукции L-аминокислот бактерии, в которой уже имеется мутация в гене cyaA.The bacterium of the present invention can be obtained by introducing a mutation in the cyaA gene into a bacterium already possessing the ability to produce L-amino acids. On the other hand, a bacterium according to the present invention can be obtained by imparting the ability to produce L-amino acids of a bacterium that already has a mutation in the cyaA gene.

Предпочтительно, чтобы в бактерии настоящего изобретения была увеличена способность к ассимиляции глицерина или этанола.It is preferred that the ability to assimilate glycerol or ethanol is increased in the bacteria of the present invention.

Для увеличения способности к ассимиляции глицерина в бактерии может быть ослаблена экспрессия гена glpR (EP 1715056) или усилена экспрессия генов метаболизма глицерина (EP 1715055 А), таких как glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa и talC. Предпочтительно может быть усилена экспрессия гена, кодирующего мутантную глицеринкиназу, устойчивую к ингибированию фруктозо-1,6-бифосфатом (Pettigrew, D. W., Liu, W. Z., Holmes, С., Meadow, N. D., and Roseman, S., J. Bacteriol. 178, 10, 2846-52 (1996), Honisch, C. et. al., Genome Reseasch, 14: 2495-2502 (2004), WO 2008/081959 и WO 2008/107277). Кроме того, могут быть увеличены активность глицериндегидрогеназы и активность дигидроксиацетонкиназы (WO 2008/102861).To increase the ability to assimilate glycerol in bacteria, expression of the glpR gene (EP 1715056) or expression of glycerol metabolism genes (EP 1715055 A), such as glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, can be reduced. glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa and talC. Preferably, expression of a gene encoding a mutant glycerol kinase resistant to fructose-1,6-bisphosphate inhibition (Pettigrew, DW, Liu, WZ, Holmes, C., Meadow, ND, and Roseman, S., J. Bacteriol. 178 can be enhanced. 10, 2846-52 (1996), Honisch, C. et. Al., Genome Reseasch, 14: 2495-2502 (2004), WO 2008/081959 and WO 2008/107277). In addition, the activity of glycerin dehydrogenase and the activity of dihydroxyacetonkinase can be increased (WO 2008/102861).

Для увеличения ассимилируемости этанола в бактерии модифицировали ген, кодирующий алкогольдегидрогеназу (adhE) с целью экспрессии под контролем ненативного промотора, функционирующего в аэробных условиях культивирования (WO 2008/010565).To increase the assimilability of ethanol in bacteria, a gene encoding alcohol dehydrogenase (adhE) was modified to express under the control of a non-native promoter functioning under aerobic cultivation conditions (WO 2008/010565).

В настоящем изобретении бактериальный штамм, используемый для получения L-аминокислоты, модифицирован таким образом, что экспрессия гена adhE контролируется ненативным промотором, например, промотором, который не контролирует экспрессию гена adhE в штамме дикого типа. Такая модификация может быть достигнута путем замещения нативного промотора гена adhE на хромосоме ненативным промотором, функционирующим в аэробных условиях культивирования, так чтобы ген adhE gene оказался функционально связанным с этим ненативным промотором. В качестве ненативного промотора, функционирующего в аэробных условиях культивирования, может быть использован любой промотор который может обеспечить экспрессию гена adhE на уровне, выше определенного, в аэробных условиях культивирования. Что касается уровня белка AdhE в настоящем изобретении, активность алкогольдегидрогеназы в экстракте свободных клеток, определенная методом Clark and Cronan (J. Bacteriol. 141 177-183 (1980)), должна быть 1.5 Ед или выше, предпочтительно 5 Ед или выше, и более предпочтительно 10. 5 Ед или выше (на мг белка). Аэробные условия культивирования могут быть такими, какие обычно используются для культивирования бактерий, когда поступление кислорода достигается такими способами как встряхивание, аэрация и перемешивание. Конкретно может использоваться любой промотор, о котором известно, что он обеспечивает экспрессию гена в аэробных условиях культивирования. Например, могут использоваться промоторы генов, вовлеченных в гликолиз, пентозофосфатный путь, цикл трикарбоновых кислот, пути биосинтеза аминокислот и т.д.. Кроме того, известны как сильные промоторы, функционирующие в аэробных условиях культивирования, следующие: P_tac промотор, lac промотор, trp промотор, trc промотор, P_R или P_L промоторы фага λ, их и предпочтительно использовать.In the present invention, the bacterial strain used to produce the L-amino acid is modified so that the expression of the adhE gene is controlled by a non-native promoter, for example, a promoter that does not control the expression of the adhE gene in the wild-type strain. Such a modification can be achieved by replacing the native promoter of the adhE gene on the chromosome with a non-native promoter that functions under aerobic cultivation conditions, so that the adhE gene is functionally linked to this non-native promoter. As a non-native promoter that functions under aerobic cultivation conditions, any promoter that can provide expression of the adhE gene at a level higher than defined under aerobic cultivation conditions can be used. Regarding the level of AdhE protein in the present invention, the activity of alcohol dehydrogenase in the extract of free cells, as determined by the Clark and Cronan method (J. Bacteriol. 141 177-183 (1980)), should be 1.5 Units or higher, preferably 5 Units or higher, and more preferably 10. 5 Units or higher (per mg of protein). The aerobic culture conditions may be those commonly used to cultivate bacteria when oxygen is reached by methods such as shaking, aeration and mixing. Specifically, any promoter that is known to provide gene expression under aerobic culture conditions can be used. For example, promoters of genes involved in glycolysis, pentose phosphate pathway, tricarboxylic acid cycle, amino acid biosynthesis pathways, etc. can be used. In addition, the following are known as strong promoters that function under aerobic cultivation conditions: P _tac promoter, lac promoter, trp promoter, trc promoter, P _R or P _L phage λ promoters, and it is preferable to use them.

Алкогольдегидрогеназа дикого типа может быть подвержена катализируемому металлами окислению. Хотя такая алкогольдегидрогеназа дикого типа и может использоваться, в настоящем изобретении предпочтительно использовать мутантную алкогольдегидрогеназу, устойчивую к аэробной инактивации. Фраза "мутантная алкогольдегидрогеназа, устойчивая к аэробной инактивации" означает, что мутантная алкогольдегидрогеназа в аэробных условиях сохраняет свою активность или активность снижается в меньшей степени по сравнению с алкогольдегидрогеназой дикого типа. В качестве примера мутантной алкогольдегидрогеназы, устойчивой к аэробной инактивации, можно использовать следующие:Wild-type alcohol dehydrogenase may be susceptible to metal-catalyzed oxidation. Although such wild-type alcohol dehydrogenase can be used, it is preferable to use a mutant alcohol dehydrogenase resistant to aerobic inactivation in the present invention. The phrase "mutant alcohol dehydrogenase resistant to aerobic inactivation" means that the mutant alcohol dehydrogenase under aerobic conditions retains its activity or activity decreases to a lesser extent compared to wild-type alcohol dehydrogenase. As an example of a mutant alcohol dehydrogenase resistant to aerobic inactivation, the following can be used:

a) белок, в котором глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 568 в ADH из Е.coli, замещена другим аминокислотным остатком, таким как лизин (WO2008/010565).a) a protein in which the glutamic acid at the position corresponding to position 568 in ADH from E. coli is replaced by another amino acid residue such as lysine (WO2008 / 010565).

b) белок, в котором глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 560 в ADH из Е.coli, замещена другим аминокислотным остатком, таким как лизин.b) a protein in which glutamic acid at the position corresponding to position 560 in E. coli ADH is replaced by another amino acid residue, such as lysine.

c) белок, в котором фенилаланин в положении, соответствующем положению 566 в ADH из Е.coli, замещен другим аминокислотным остатком, таким как валин.c) a protein in which phenylalanine at the position corresponding to position 566 in ADH from E. coli is replaced by another amino acid residue, such as valine.

d) белок, в котором остаток глутаминовой кислоты, остаток метионина, остаток тирозина, остаток изолейцина и остаток аланина в положениях, соответствующих положениям 22, 236, 461, 554 и 786, соответственно, в ADH из Е.coli, замещены другими аминокислотными остатками, например, остатком глицина, остатком валина, остатком цистеина, остатком серина и остатком валина, соответственно;d) a protein in which the glutamic acid residue, methionine residue, tyrosine residue, isoleucine residue and alanine residue at positions corresponding to positions 22, 236, 461, 554 and 786, respectively, in ADH from E. coli are replaced by other amino acid residues, for example, a glycine residue, a valine residue, a cysteine residue, a serine residue and a valine residue, respectively;

e) их комбинация.e) their combination.

Бактерия-продуцент L-треонинаL-threonine producing bacterium

Примеры родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM ВР-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и FERM ВР-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобными им.Examples of the parent strain for producing the L-threonine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain TDH-6 / pVIC40 (VKPM B-3996) (US Pat. Nos. 5,175,107 and 5,705,3371 ), E. coli strain NRRL-21593 (US patent 5939307), E. coli strain FERM BP-3756 (US patent 5474918), E. coli strains FERM BP-3519 and FERM BP-3520 (US patent 5376538), strain E .coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetics, 14, 947-956 (1978)), E. coli strains VL643 and VL2055 (European patent application EP 1149911 A) and the like.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать сахарозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 7 апреля 1987 г. с инвентарным номером В-3996.Strain TDH-6 is deficient in the thrC gene, is able to assimilate sucrose, and contains the ilvA gene with a leaky mutation. The specified strain contains a mutation in the rhtA gene, which causes resistance to high concentrations of threonine and homoserine. Strain B-3996 contains the plasmid pVIC40, which was obtained by introducing into the vector derived from the RSF1010 vector the thrA * BC operon including the thrA mutant gene encoding aspartokinase-homoserine dehydrogenase I, which has a significantly reduced feedback sensitivity to threonine inhibition. Strain B-3996 was deposited on November 19, 1987 at the All-Union Scientific Center for Antibiotics (RF, 117105 Moscow, Nagatinskaya St., 3-A) with inventory number RIA 1867. The strain was also deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (RF , 117545 Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) April 7, 1987 with inventory number B-3996.

В качестве родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению также может быть использован штамм Е.coli ВКПМ В-5318 (Европейская заявка 0593792 В). Штамм В-5318 является прототрофным относительно изолейцина, и чувствительный к температуре С1 репрессор фага λ и P_R-промотор замещает регуляторную область в треониновом опероне на плазмиде pVIC40. Штамм ВКПМ В-5318 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 3 мая 1990 г. с инвентарным номером В-5318.The E. coli strain VKPM B-5318 (European application 0593792 B) can also be used as the parent strain for producing the L-threonine producing bacterium according to the present invention. Strain B-5318 is prototrophic with respect to isoleucine, and the temperature-sensitive C1 repressor of the phage λ and P _R promoter replaces the regulatory region in the threonine operon on the plasmid pVIC40. Strain VKPM B-5318 was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (RF, 117545 Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) May 3, 1990 with accession number B-5318.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:Preferably, the bacterium of the present invention is further modified so as to have increased expression of one or more of the following genes:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;- mutant thrA gene encoding aspartokinase-homoserine dehydrogenase I, resistant to threonine inhibition by feedback type;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;- thrB gene encoding homoserine kinase;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;- thrC gene encoding threonine synthase;

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;- rhtA gene, presumably encoding a transmembrane protein;

- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу, иthe asd gene encoding aspartate β-semialdehyde dehydrogenase, and

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).- aspC gene encoding aspartate aminotransferase (aspartate transaminase).

Нуклеотидная последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrL и thrB. Нуклеотидная последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrA и thrC. Нуклеотидная последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон. Для усиления экспрессии треонинового оперона желательно удалить из оперона область аттенюатора, который влияет на транскрипцию (заявка РСТ WO2005/049808, заявка РСТ WO2003/097839).The nucleotide sequence of the thrA gene encoding aspartokinase-homoserine dehydrogenase I from Escherichia coli is known (nucleotide numbers 337 to 2799 in sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database, gi: 49175990). The thrA gene is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between the thrL and thrB genes. The nucleotide sequence of the thrB gene encoding homoserine kinase from Escherichia coli is known (nucleotide numbers 2801 to 3733 in sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database, gi: 49175990). The thrB gene is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between the thrA and thrC genes. The nucleotide sequence of the thrC gene encoding a threonine synthase from Escherichia coli is known (nucleotide numbers 3734 to 5020 in the sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database, gi: 49175990). The thrC gene is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between the thrB gene and the open uaaX reading frame. All three of these genes function as one threonine operon. To enhance the expression of a threonine operon, it is desirable to remove an attenuator region from the operon that affects transcription (PCT application WO2005 / 049808, PCT application WO2003 / 097839).

Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же как и гены thrB и thrC, может быть получен в виде единого оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.The mutant thrA gene encoding aspartokinase-homoserine dehydrogenase I, which is resistant to feedback threonine inhibition, as well as the thrB and thrC genes, can be obtained as a single operon from the well-known plasmid pVIC40, which is represented in the E. coli producer strain VKPM B-3996. Plasmid pVIC40 is described in detail in US Pat. No. 5,705,371.

Ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е.coli около оперона glnHPQ, который кодирует компоненты транспортной системы глутамина, ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541 в базе данных GenBank, gi:440181), расположен между генами рехВ и ompX. Участок ДНК, экспрессирующийся с образованием белка, кодируемого рамкой считывания ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine). Также было показано, что мутация rhtA23 представляет собой замену А-на-G в положении -1 по отношению к старт кодону ATG (тезисы 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, тезисы 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457; Европейская заявка ЕР 1013765 A).The rhtA gene is located 18 minutes from the E. coli chromosome near the glnHPQ operon, which encodes the components of the glutamine transport system, the rhtA gene is identical to ORF1 (ybiF gene, nucleotide numbers 764 to 1651 in sequence with accession number AAA218541 in the GenBank database, gi: 440181) , located between the genes pXB and ompX. A region of DNA expressed to form the protein encoded by the ORF1 reading frame was named the rhtA gene (rht: resistance to homoserine and threonine). The rhtA23 mutation has also been shown to represent an A-to-G substitution at position -1 with respect to the start of the ATG codon (Abstracts of the 17 ^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, Abstracts of the 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology , San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457; European application EP 1013765 A).

Нуклеотидная последовательность гена asd из E.coli известна (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16131307) и может быть получена с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.The nucleotide sequence of the asd gene from E. coli is known (nucleotide numbers 3572511 to 3571408 in sequence with accession number NC_000913.1 in the GenBank database, gi: 16131307) and can be obtained using PCR (polymerase chain reaction; link to White, TJ et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) using primers synthesized based on the nucleotide sequence of the gene. Asd genes from other microorganisms can be obtained in a similar way.

Также нуклеотидная последовательность гена aspC из Е.coli известна (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi:16128895) и может быть получена с помощью ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.Also, the nucleotide sequence of the aspC gene from E. coli is known (nucleotide numbers 983742 to 984932 in the sequence with accession number NC_000913.1 in the GenBank database, gi: 16128895) and can be obtained by PCR. AspC genes from other microorganisms can be obtained in a similar way.

Бактерия-продуцент L-лизинаL-lysine producing bacterium

Примеры бактерий-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутанты, обладающие устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично снимается, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются оксализином, лизингидроксаматом, S-(2-аминоэтил)-L-цистеином (АЕС), γ-метиллизном, α-хлорокапролактамом и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, традиционными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL В-12185; смотри патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах аспартокиназа устойчива к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.Examples of bacteria producing L-lysine belonging to the genus Escherichia include mutants that are resistant to the L-lysine analogue. The L-lysine analogue inhibits the growth of bacteria belonging to the genus Escherichia, but this inhibition is completely or partially removed when L-lysine is also present in the medium. Examples of the L-lysine analogue include, but are not limited to, oxalysine, lysine hydroxyamate, S- (2-aminoethyl) -L-cysteine (AEC), γ-methyllysis, α-chlorocaprolactam, and so on. Mutants that are resistant to these lysine analogues can be obtained by treating bacteria belonging to the genus Escherichia with traditional mutagens. Specific examples of bacterial strains used to produce L-lysine include Escherichia coli strain AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; see US Pat. No. 4,346,170) and Escherichia coli strain VL611. In these microorganisms, aspartokinase is resistant to feedback inhibition by L-lysine.

Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии-продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был получен путем селекции фенотипа устойчивости к АЕС у штамма W3110, производного от штамма Escherichia coli K-12. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry), в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 6 декабря 1994 года и получил инвентарный номер FERM Р-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 29 сентября 1995 года, и штамм получил инвентарный номер FERM BP-5252 (патент США 5827698).Strain WC196 can be used as a bacterium producer of L-lysine Escherichia coli. This bacterial strain was obtained by selection of the phenotype of resistance to AEC in strain W3110, derived from strain Escherichia coli K-12. The resulting strain was named Escherichia coli AJ13069 and was deposited at the National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry), currently called the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Organizational Depository for Patenting, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan ( National in Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), December 6, 1994 and received accession number FERM P -14690. Then, the strain was internationally deposited in accordance with the terms of the Budapest Treaty on September 29, 1995, and the strain received accession number FERM BP-5252 (US patent 5827698).

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-лизина, включают, но не ограничиваются ими, дигидродипиколинатсинтазу (dapA), аспартокиназу (lysC), дигидродипиколинатредуктазу (dapB), диаминопимелатдекарбоксилазу (lysA), диаминопимелатдегидрогеназу (ddh) (патент США. 6,040,160), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ррс), аспартатсемиальдегиддегидрогеназу (asd), никотинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) и аспартазу (aspA) (европейская заявка ЕР 1253195 А). Кроме того, родительские штаммы могут иметь повышенный уровень экспрессии гена, вовлеченного в процесс дыхания (cyo) (европейская заявка ЕР 1170376 А), гена, кодирующего никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) (патент США 5,830,716), гена ybjE (заявка РСТ WO2005/073390), или комбинации этих генов.Examples of parental strains for producing L-lysine producing bacteria of the present invention also include strains in which the expression of one or more genes encoding L-lysine biosynthesis enzymes is enhanced. Examples of enzymes involved in the biosynthesis of L-lysine include, but are not limited to, dihydrodipicolinate synthase (dapA), aspartokinase (lysC), dihydrodipicolinate reductase (dapB), diaminopimelate carboxylase (lysA), diaminoproimene-patent-yl-6-azolephenol-6-enumero-carboxymene-6-carboxylic acid. ppc), aspartate semialdehyde dehydrogenase (asd), nicotinamide adenine dinucleotide transhydrogenase (pntAB) and aspartase (aspA) (European application EP 1 253 195 A). In addition, parental strains may have an increased expression level of the gene involved in the respiration process (cyo) (European application EP 1170376 A), the gene encoding nicotinamide nucleotranshydrogenase (pntAB) (US patent 5,830,716), the ybjE gene (PCT application WO2005 / 07335/0733) or combinations of these genes.

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина, включают гомосериндегидрогеназу, лизиндекарбоксилазу (патент США 5,827,698) и малатдегидрогеназу (заявка РСТ WO2005/010175).Examples of parent strains for the production of L-lysine producing bacteria according to the present invention also include strains in which enzyme activity is reduced or absent which catalyze the formation of compounds other than L-lysine branching off from the main L-lysine biosynthesis pathway. Examples of enzymes that catalyze the formation of non-L-lysine compounds branching off from the main L-lysine biosynthesis pathway include homoserine dehydrogenase, lysine decarboxylase (US Pat. No. 5,827,698) and malate dehydrogenase (PCT application WO2005 / 010175).

Бактерия-продуцент L-цистеинаL-cysteine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-цистеина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli JM 15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующими устойчивые к ингибирбтванию по типу обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США 6218168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е.coli W3110, содержащий сверхэкспрессированные гены, кодирующие белок, способный к секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5972663); штаммы Е.coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патент Японии JP11155571A2); штамм Е.coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (международная заявка РСТ WO 0127307 А1) и подобные им.Examples of parent strains used to produce the L-cysteine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain JM 15 transformed with various cysE alleles encoding resistance to ingestion feedback type serine acetyltransferase (US patent 6218168, patent application of the Russian Federation 2003121601); E. coli strain W3110 containing overexpressed genes encoding a protein capable of secretion of compounds toxic to the cell (US patent 5972663); E. coli strains containing cysteine desulfohydrase with reduced activity (Japanese patent JP11155571A2); E. coli strain W3110 with increased activity of the positive transcriptional regulator of the cysteine regulon encoded by the cysB gene (international application PCT WO 0127307 A1) and the like.

Бактерия-продуцент L-лейцинаL-Leucine Producer Bacteria

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-лейцина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli, устойчивые к аналогам лейцина, включающих, например, β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (выложенные патентные заявки Японии 62-34397 и 8-70879), штаммы Е.coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке РСТ 96/06926; Е.coli штамм Н-9068 (JP8-70879A), и подобные им.Examples of parent strains used to produce the L-leucine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strains that are resistant to leucine analogues, including, for example, β-2 -thienylalanine, 3-hydroxyleucine, 4-azaleucine and 5,5,5-trifluoroleucine (Japanese Patent Laid-open 62-34397 and 8-70879), E. coli strains obtained using the genetic engineering methods described in PCT 96 / 06926; E. coli strain H-9068 (JP8-70879A), and the like.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD, и предпочтительно представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6403342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (европейская заявка ЕР 1239041 А2).The bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes involved in the biosynthesis of L-leucine. Examples of such genes include the leuABCD operon genes, and are preferably represented by the mutant leuA gene encoding feedback feedback depleted L-leucine isopropyl malate synthase (US Pat. No. 6,333,342). In addition, the bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes encoding proteins that export the L-amino acid from a bacterial cell. Examples of such genes include the b2682 and b2683 genes (ygaZH genes) (European application EP 1239041 A2).

Бактерия-продуцент L-гистидинаL-histidine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-гистидина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-гистидина, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 24 (ВКПМ В-5945, патент РФ 2003677); штамм Е.coli 80 (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536); штаммы Е.coli NRRL В-12116 - В12121 (патент США 4388405); штаммы Е.coli Н-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (PERM ВР- 6676) (патент США 6344347); штамм Е.coli H-9341 (PERM BP-6674) (Европейский патент 1085087); штамм Е.coli AI80/pFM201 (патент США 6258554) и подобными им.Examples of parent strains used to produce L-histidine producing bacteria of the present invention include, but are not limited to, L-histidine producing bacteria belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain 24 (VKPM B-5945, patent RF 2003677); E. coli strain 80 (VKPM B-7270, RF patent 2119536); E. coli strains NRRL B-12116 - B12121 (US Pat. No. 4,388,405); E. coli strains H-9342 (FERM BP-6675) and H-9343 (PERM BP-6676) (US patent 6344347); E. coli strain H-9341 (PERM BP-6674) (European patent 1085087); E. coli strain AI80 / pFM201 (US Pat. No. 6,258,554) and the like.

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-гистидин, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-гистидина. Примеры таких генов включают гены, кодирующие АТФ-фосфорибозилтрансферазу (hisG), фосфорибозил-АМФ-циклогидролазу (hisI), фосфорибозил-АТФ- фосфогидролазу (hisIE), фосфорибозилформимино-5-аминоимидазолкарбоксамидриботидизомеразу (hisA), амидотрансферазу (hisH), гистидинолфосфатаминотрансферазу (hisC), гистидинолфосфатазу (hisB), гистидинолдегидрогеназу (hisD) и т.д.Examples of parent strains for producing bacteria producing L-histidine according to the present invention also include strains in which the expression of one or more genes encoding L-histidine biosynthesis enzymes is enhanced. Examples of such genes include genes encoding ATP-phosphoribosyltransferase (hisG), phosphoribosyl-AMP-cyclohydrolase (hisI), phosphoribosyl-ATP-phosphohydrolase (hisIE), phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxymeridotisulfoferisomerase histidinolphosphatase (hisB), histidinol dehydrogenase (hisD), etc.

Известно, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-гистидина (hisG, hisBHAFI), ингибируются L-гистидином, поэтому способность к продукции L-гистидина также может быть значительно усилена введением мутации, придающей устойчивость к ингибированию по типу обратной связи, в ген АТФ-фосфорибозидтрансферазы (hisG) (патенты РФ. 2003677 и 2119536).It is known that genes encoding L-histidine biosynthesis enzymes (hisG, hisBHAFI) are inhibited by L-histidine, therefore, the ability to produce L-histidine can also be significantly enhanced by introducing a feedback inhibition mutation into the ATP-gene phosphoriboside transferase (hisG) (RF patents. 2003677 and 2119536).

Специфические примеры штаммов, обладающих способностью к продукции L-гистидина, включают Е.coli FERM-P 5038 и 5048, в которые был введен вектор, содержащий ДНК, кодирующую фермент биосинтеза L-гистидина (заявка Японии 56-005099 А), штаммы E.coli, в которые введен ген rht, для экспорта аминокислоты (европейская заявка ЕР 1016710 А), штамм Е.coli 80, которому придана устойчивость к сульфагуанидину, DL-1,2,4-триазол-3-аланину и стрептомицину (ВКПМ В-7270, патент РФ. 2119536), и т.д.Specific examples of strains with the ability to produce L-histidine include E. coli FERM-P 5038 and 5048, into which a vector containing DNA encoding the L-histidine biosynthesis enzyme (Japanese application 56-005099 A), strains E. coli into which the rht gene has been introduced for export of the amino acid (European application EP 1016710 A), strain E. coli 80, which is given resistance to sulfaguanidine, DL-1,2,4-triazole-3-alanine and streptomycin (VKPM B- 7270, RF patent. 2119536), etc.

Бактерия-продуцент L-глутаминовой кислотыL-glutamic acid producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli VL334 thrC⁺ (Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е.coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофом по L-изолейцину и L-треонину с мутациями в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). В этот штамм была перенесена природная аллель гена thrC методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е.coli K12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм, ауксотроф по L-изолейцину, VL334thrC⁺ (ВКПМ В-8961), который обладает способностью к продукции L-глутаминовой кислоты.Examples of parental strains used to produce the L-glutamic acid producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain VL334 thrC ⁺ (European patent EP 1172433). Strain E. coli VL334 (VKPM B-1641) is an auxotroph of L-isoleucine and L-threonine with mutations in the thrC and ilvA genes (US patent 4278765). The natural allele of the thrC gene was transferred to this strain by the general transduction method using bacteriophage P1 grown on cells of the natural E. coli K12 strain (VKPM B-7). The result was a strain, auxotroph for L-isoleucine, VL334thrC ⁺ (VKPM B-8961), which is capable of producing L-glutamic acid.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают глутаматдегидрогеназу (gdh), глутаминсинтетазу (glnA), глутаматсинтетазу (gltAB), изоцитратдегидрогеназу (icdA), аконитатгидратазу (acnA, acnB), цитратсинтазу (gltA), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ррс), пируватдегидрогеназу (aceEF, lpdA), пируваткиназу (pykA, pykF), фосфоенолпируватсинтазу (ppsA), енолазу (eno), фосфоглицеромутазу (pgmA, pgmI), фосфоглицераткиназу (pgk), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (gapA), триозофосфатизомеразу (tpiA), фруктозобифосфатальдолазу (fbp), фосфофруктокиназу (pfkA, pfkB) и глюкозофосфатизомеразу (pgi).Examples of parent strains used to produce the L-glutamic acid producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains in which the expression of one or more genes encoding L-glutamic acid biosynthesis enzymes is enhanced. Examples of such enzymes include glutamate dehydrogenase (gdh), glutamine synthetase (glnA), glutamate synthetase (gltAB), isocitrate dehydrogenase (icdA), aconitate hydrate, acnA, acnu zarzudenosefruzidazufarzudenosephase (glutamine), phosphate synthase pykA, pykF), phosphoenolpyruvate synthase (ppsA), enolase (eno), phosphoglycerometase (pgmA, pgmI), phosphoglycerate kinase (pgk), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogen phosphate dehydrogenase (gapA) isofluosophosphate pfkB) and glucose phosphatisomerase (pgi).

Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что усилена экспрессия гена цитратсинтетазы, гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или гена глутаматдегидрогеназы, включают описанные в европейских заявках ЕР1078989А, ЕР955368А и ЕР952221А.Examples of strains modified in such a way that the expression of the citrate synthetase gene, phosphoenolpyruvate carboxylase gene and / or glutamate dehydrogenase gene is enhanced include those described in European applications EP1078989A, EP955368A and EP952221A.

Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что ослаблена экспрессия гена цитратсинтетазы и/или гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или недостаточна активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, включают описанные в европейских заявках ЕР1078989А, ЕР955368А и ЕР952221А.Examples of strains modified in such a way that the expression of the citrate synthetase gene and / or the phosphoenolpyruvate carboxylase gene and / or the inactivity of α-ketoglutarate dehydrogenase is weakened include those described in European applications EP1078989A, EP955368A and EP952221A.

Примеры родительских штаммов для получения продуцирующих L-глутаминовую кислоту бактерий, согласно настоящему исследованию, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют синтез отличных от L-глутаминовой кислоты соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают изоцитратлиазу, α-кетоглутаратдегидрогеназу, фосфотрансацетилазу, ацетаткиназу, синтазу ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтазу, форматацетилтрансферазу, лактатдегидрогеназу и глутаматдекарбоксилазу. Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы и способы их получения описаны в патентах США 5,378,616 и 5,573,945. Конкретно, примеры таких штаммов включают в себя следующие штаммы:Examples of parental strains for producing L-glutamic acid producing bacteria according to the present study also include strains in which enzyme activity is reduced or absent that catalyzes the synthesis of compounds other than L-glutamic acid branching from the main pathway of L-glutamic acid biosynthesis. Examples of such enzymes include isocitrate lyase, α-ketoglutarate dehydrogenase, phosphotransacetylase, acetate kinase, acetohydroxy acid synthase, acetolactate synthase, format acetyl transferase, lactate dehydrogenase and glutamate decarboxylase. Bacteria belonging to the genus Escherichia, lacking the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase or having reduced activity of α-ketoglutarate dehydrogenase and methods for their preparation are described in US patents 5,378,616 and 5,573,945. Specifically, examples of such strains include the following strains:

E.coli W3110sucA::Km^R E.coli W3110sucA :: Km ^R

Е.coli AJ12624 (FERM ВР-3853)E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)

Е.coli AJ12628(PERM BP-3854)E. coli AJ12628 (PERM BP-3854)

E.coli AJ12949 (FERM BP-4881)E.coli AJ12949 (FERM BP-4881)

E.coli W3110sucA::Km^R - это штамм, полученный в результате разрушения гена α-кетоглутаратдегидрогеназы (далее называемого "ген sucA") в штамме E.coli W3110. У этого штамма активность α-кетоглутаратдегидрогеназы отсутствует полностью.E.coli W3110sucA :: Km ^R is a strain obtained by disrupting the α-ketoglutarate dehydrogenase gene (hereinafter referred to as the “sucA gene”) in the E. coli W3110 strain. In this strain, the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase is completely absent.

Другие примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Escherichia и обладающие устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты и дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, например, штамм AJ13199 (FERM BP-5807) (патент США 5,908,768), или штамм FERM P-12379, дополнительно обладающий низкой активностью по расщеплению L-глутаминовой кислоты (патент США 5,393,671); штамм E.coli AJ13138 (FERM BP-5565) (патент США 6,110,714) и подобные им.Other examples of bacteria producing L-glutamic acid include bacteria belonging to the genus Escherichia and resistant to aspartic acid antimetabolites and deficient in the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase, for example, strain AJ13199 (FERM BP-5807) or US patent 5,908,768) strain FERM P-12379, additionally having low activity for the cleavage of L-glutamic acid (US patent 5,393,671); E. coli strain AJ13138 (FERM BP-5565) (US patent 6,110,714) and the like.

Примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя мутантные штаммы, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишены активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, и могут быть получены описанным выше способом. Примерами таких штаммов являются штамм Pantoea ananatis AJ13356 (патент США 6,331,419), штамм Pantoea ananatis AJ13356, депонированный в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 19 февраля, 1998 и получивший инвентарный номер FERM Р-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 г., и штамм получил инвентарный номер FERM BP-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ13356 не имеет α-KGDH активности в результате разрушения гена αKGDH-E1 субъединицы (sucA). Вышеупомянутый штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ13356. Тем не менее, позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств. Несмотря на то, что штамм AJ13356, был депонирован в указанный выше депозитарий как Enterobacter agglomerans, для целей данного описания он будет упоминаться как Pantoea ananatis.Examples of the L-glutamic acid producing bacterium include mutant strains belonging to the genus Pantoea that are devoid of α-ketoglutarate dehydrogenase activity or have reduced α-ketoglutarate dehydrogenase activity, and can be obtained as described above. Examples of such strains are Pantoea ananatis AJ13356 strain (US patent 6,331,419), Pantoea ananatis AJ13356 strain deposited at the National Institute of Biological Sciences and Human Technologies, Agency for Industrial Science and Technology, Department of International Trade and Industry, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (currently called the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Organizational Depository for Patenting Purposes, Central 6, 1-1, Higashi 1-Ch Ome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) February 19, 1998 and received accession number FERM P-16645. Then, the international deposit of this strain was made according to the conditions of the Budapest Treaty of January 11, 1999, and the strain received accession number FERM BP-6615. The Pantoea ananatis strain AJ13356 does not have α-KGDH activity as a result of the destruction of the αKGDH-E1 gene subunit (sucA). The above strain, when isolated, was identified as Enterobacter agglomerans and deposited as Enterobacter agglomerans AJ13356 strain. However, it was later classified as Pantoea ananatis based on the 16S rRNA nucleotide sequence and other evidence. Although strain AJ13356 was deposited with Enterobacter agglomerans at the above depository, for the purposes of this description it will be referred to as Pantoea ananatis.

Бактерия-продуцент L-фенилаланинаL-phenylalanine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-фенилаланина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКМП В-8197); штамм HW1089 (АТСС-55371), содержащий ген pheA34 (патент США 5354672); мутантный штамм MWEC101-b (KR8903681); штаммы NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL В-12146 и NRRL В-12147 (патент США 4407952) и подобные им. Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты L-фенилаланина, такие как штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAB] (FERM ВР-3566), штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAD] (PERM ВР-12659), штамм E.coli К-12[W3110(tyrA)/pPHATerm] (PERM BP-12662) и штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB], названный как AJ12604 (PERM BP-3579) (Европейский патент ЕР488424 В1). Кроме того, также могут быть использованы бактерии-продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с повышенной активностью белков, кодируемых геном yedA или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1).Examples of parental strains used to produce the L-phenylalanine-producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as strain AJ12739 (tyrA :: Tn10, tyrR) (VKMP B-8197); strain HW1089 (ATCC-55371) containing the pheA34 gene (US patent 5354672); mutant strain MWEC101-b (KR8903681); strains NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 and NRRL B-12147 (US patent 4407952) and the like. Also, bacteria belonging to the genus Escherichia, producers of L-phenylalanine, such as E. coli K-12 strain [W3110 (tyrA) / pPHAB] (FERM BP-3566), E. coli K strain, can be used as parent strains. -12 [W3110 (tyrA) / pPHAD] (PERM BP-12659), strain E. coli K-12 [W3110 (tyrA) / pPHATerm] (PERM BP-12662) and strain E. coli K-12 [W3110 (tyrA ) / pBR-aroG4, pACMAB], named as AJ12604 (PERM BP-3579) (European patent EP488424 B1). In addition, L-phenylalanine producing bacteria belonging to the genus Escherichia with increased activity of the proteins encoded by the yedA gene or yddG gene can also be used (US patent applications 2003/0148473 A1 and 2003/0157667 A1).

Бактерия-продуцент L-триптофанаL-tryptophan producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-триптофана, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), лишенные активности триптофанил-тРНК синтетазы, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е.coli SV164 (pGH5), содержащий аллель serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, не ингибируемую серином по типу обратной связи и аллель trpE, кодирующий антранилатсинтазу, не ингибируемую триптофаном по типу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е.coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL В-12264), в которых отсутствует активность триптофаназы (патент США 4371614); штамм Е.coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps, в котором усилена способность к синтезу фосфоенолпирувата (заявка РСТ WO9708333, патент США 6319696), и подобные им. Также могут быть использованы бактерии-продуценты L-триптофана принадлежащие к роду Escherichia, в которых увеличена активность белка, кодируемого геном yedA или геном yddG (заявки на патент США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1).Examples of parent strains used to produce L-tryptophan producing bacteria of the present invention include, but are not limited to, L-tryptophan producing bacteria belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strains JP4735 / pMU3028 (DSM10122) and JP6015 / pMU91 (DSM10123) lacking the activity of tryptophanyl tRNA synthetase encoded by the mutant trpS gene (US patent 5756345); E. coli strain SV164 (pGH5) containing a serA allele encoding a phosphoglycerate dehydrogenase non-feedback inhibitable serine and a trpE allele encoding anthranilate synthase non-feedback inhibitory tryptophan (US Pat. No. 6,180,373); E. coli strains AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) and AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264) in which tryptophanase activity is absent (US patent 4371614); E. coli strain AGX17 / pGX50, pACKG4-pps, which enhances the ability to synthesize phosphoenolpyruvate (PCT application WO9708333, US patent 6319696), and the like. Can also be used bacteria-producers of L-tryptophan belonging to the genus Escherichia, in which the activity of the protein encoded by the yedA gene or yddG gene is increased (US patent applications 2003/0148473 A1 and 2003/0157667 A1).

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана, согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых увеличена активность одного или нескольких ферментов, выбранных из группы, состоящей из антранилатсинтазы, фосфоглицератдегидрогеназы, и триптофансинтазы. И антранилатсинтаза, и фосфоглицератдегидрогеназа подвержены ингибированию L-триптофаном и L-серином по типу обратной связи, так что в эти ферменты могут быть введены мутации, снижающие чувствительность к ингибированию по типу обратной связи. Специфические примеры штаммов с такой мутацией включают Е.coli SV164, антранилатсинтаза которой не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи, и штамм-трансформант, полученный введением в Е.coli SV164 плазмиды pGH5 (заявка РСТ WO 94/08031), которая содержит мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи.Examples of parent strains used to produce the L-tryptophan producing bacterium of the present invention also include strains in which the activity of one or more enzymes selected from the group consisting of anthranilate synthase, phosphoglycerate dehydrogenase, and tryptophan synthase is increased. Both anthranilate synthase and phosphoglycerate dehydrogenase are feedback inhibited by L-tryptophan and L-serine, so mutations can be introduced into these enzymes that reduce the sensitivity to feedback inhibition. Specific examples of strains with such a mutation include E. coli SV164, whose anthranilate synthase is not sensitive to feedback inhibition, and a transformant strain obtained by introducing the plasmid pGH5 into E. coli SV164 (PCT application WO 94/08031), which contains the mutant gene serA encoding phosphoglycerate dehydrogenase, which is not sensitive to feedback inhibition.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана, согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которые введен триптофановый оперон, содержащий ген, кодирующий антранилатсинтазу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи (заявка Японии 57-71397 А, заявка Японии 62-244382 А, патент США 4,371,614). Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть придана путем усиления экспрессии гена (из триптофанового оперона), кодирующего триптофансинтазу (trpBA). Триптофансинтаза состоит из двух субъединиц α и β, которые кодируются trpA и trpB соответственно. Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть увеличена усилением экспрессии оперона изоцитратлиазы-малатсинтазы (заявка РСТ WO2005/103275).Examples of parental strains used to produce the L-tryptophan producing bacterium of the present invention also include strains that have introduced a tryptophan operon containing a gene encoding anthranilate synthase that is not sensitive to feedback inhibition (Japanese application 57- 71397 A, Japanese Patent Application 62-244382 A, U.S. Patent 4,371,614). In addition, the ability to produce L-tryptophan can be imparted by enhancing the expression of a gene (from the tryptophan operon) encoding tryptophan synthase (trpBA). Tryptophan synthase consists of two subunits α and β, which are encoded by trpA and trpB, respectively. In addition, the ability to produce L-tryptophan can be increased by enhancing the expression of the operon of isocitrate lyase-malatesynthase (PCT application WO2005 / 103275).

Бактерия-продуцент L-пролинаL-proline producing bacterium

Примеры бактерий-продуцентов L-пролина, используемых в качестве родительского штамма согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 702ilvA (ВКПМ В-8012), дефицитного по гену ilvA и способного к продукции L-пролина (Европейский патент ЕР 1172433). Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-пролина. Предпочтительно, примеры таких генов для бактерий-продуцентов L-пролина, включают ген proB, кодирующий глутаматкиназу с десенсибилизированной регуляцией L-пролином по типу обратной связи (патент Германии 3127361). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, экскретирующие L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примерами таких генов являются гены b2682 и b2683 (ygaZH гены) (Европейская патентная заявка ЕР1239041А2).Examples of L-proline producing bacteria used as the parent strain of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain 702ilvA (VKPM B-8012), deficient in the ilvA gene and capable of producing L-proline (European patent EP 1172433). The bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes involved in the biosynthesis of L-proline. Preferably, examples of such genes for bacterium-producing L-proline include the proB gene encoding glutamate kinase with desensitized feedback regulation of L-proline (German patent 3127361). In addition, the bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes encoding proteins that secrete the L-amino acid from a bacterial cell. Examples of such genes are the b2682 and b2683 genes (ygaZH genes) (European Patent Application EP1239041A2).

Примеры бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-пролина, включают следующие штаммы Е.coli: NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутанты, описанные в патенте Германии DE 3127361, плазмидные мутанты, описанные у Bloom F.R. et al (The 15^th Miami winter symposium, 1983, p.34), и подобные им.Examples of bacteria belonging to the genus Escherichia and having the ability to produce L-proline include the following E. coli strains: NRRL B-12403 and NRRL B-12404 (UK patent GB 2075056), VKPM B-8012 (RF patent application 2000124295), plasmid mutants described in German patent DE 3127361, plasmid mutants described in Bloom FR et al (The 15 ^th Miami winter symposium, 1983, p. 34), and the like.

Бактерия-продуцент L-аргининаL-arginine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925) (патентная заявка США 2002/058315 A1) и его производные, содержащие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм Е.coli 382 (ВКПМ В-7926) (Европейская патентная заявка ЕР 1170358А1), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (Европейская патентная заявка ЕР1170361А1), и подобные им.Examples of parental strains used to produce the L-arginine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain 237 (VKPM B-7925) (US patent application 2002 / 058315 A1) and its derivatives containing mutant N-acetylglutamate synthase (RF patent application 2001112869), E. coli 382 strain (VKPM B-7926) (European patent application EP 1170358A1), arginine producing strain into which the argA gene encoding the gene encoding N-acetylglutamate synthetase (European Patent Application EP1170361 A1), and the like.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина, согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина. включают N-ацетилглутамилфосфатредуктазу (argC), орнитинацетилтрансферазу (argJ), N-ацетилглутаматкиназу (argB), ацетилорнитинтрансаминазу (argD), орнитинкарбамоилтрансферазу (argF), синтетазу аргининсукциниловой кислоты (argG), лиазу аргининсукциниловой кислоты (argH), и карбамоилфосфатсинтетазу(carAB).Examples of parental strains used to produce the L-arginine producing bacterium of the present invention also include strains in which the expression of one or more genes encoding L-arginine biosynthesis enzymes is enhanced. Examples of L-arginine biosynthesis enzymes. include N-acetylglutamylphosphate reductase (argC), ornithine acetyl transferase (argJ), N-acetyl glutamate kinase (argB), acetylornithine transaminase (argD), ornithinecarbamoyl transferase (argF), arginine-arginyl-carboxylic acid, synthase (arginine-argon-acetyl-nitric acid),

Бактерия-продуцент L-валинаL-valine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-валина, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, модифицированные с целью сверхэкспрессии оперона ilvGMEDA (патент США 5998178). Желательно удалить область оперона ilvGMEDA, которая необходима для ослабления экспрессии, с тем, чтобы экспрессия оперона не ослаблялась образующимся L-валином. Далее, желательно разрушить в опероне ген ilvA с тем чтобы снизить активность треониндеаминазы.Examples of parental strains used to produce the L-valine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains modified to overexpress the ilvGMEDA operon (US Pat. No. 5,998,178). It is desirable to remove the region of the ilvGMEDA operon that is necessary to attenuate expression so that the expression of the operon is not attenuated by the resulting L-valine. Further, it is desirable to destroy the ilvA gene in the operon in order to reduce the activity of threonine deaminase.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-валина, согласно настоящему изобретению, также включают в себя мутантные штаммы, имеющие мутацию аминоацил-тРНК-синтетазы (патент США 5658766). Например, может использоваться штамм Е.coli VL1970, который имеет мутацию в гене ileS, кодирующем изолейцин-тРНК-синтетазу. Штамм Е.coli VL1970 депонирован в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 24 июня 1988 г. с инвентарным номером ВКПМ В-4411.Examples of parental strains used to produce the L-valine producing bacterium of the present invention also include mutant strains having an aminoacyl tRNA synthetase mutation (US Pat. No. 5,658,766). For example, an E. coli strain VL1970 can be used which has a mutation in the ileS gene encoding isoleucine-tRNA synthetase. The strain E. coli VL1970 was deposited in the Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) on June 24, 1988 with accession number VKPM B-4411.

Далее, в качестве родительских штаммов также могут использоваться мутантные штаммы, для роста которых требуется липоевая кислота, и/или с недостаточным количеством H⁺-АТФазы (заявка РСТ WO96/06926).Further, mutant strains that require lipoic acid and / or with an insufficient amount of H ⁺ -ATPase (PCT application WO96 / 06926) can also be used as parent strains.

Бактерия-продуцент L-изолейцинаL-isoleucine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-изолейцина, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, мутантные штаммы с устойчивостью к 6-диметиламинопурину (заявка Японии 5-304969А), мутантные штаммы с устойчивость к аналогу изолейцина, такому как тиаизолейцин и гидроксамат изолейцина, и мутантные штаммы, дополнительно имеющие устойчивость к DL-этионину и/или гидроксамату аргинина (заявка Японии 5-130882А). Кроме того, в качестве родительских штаммов также могут использоваться рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, кодирующими белки, вовлеченные в биосинтез L-изолейцина, такие как треониндеаминаза и ацетогидроксатсинтаза (заявка Японии 2-458А, патент Франции 0356739 и патент США 5998178).Examples of parent strains used to produce the L-isoleucine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, mutant strains resistant to 6-dimethylaminopurine (Japanese application 5-304969A), mutant strains resistant to isoleucine analogue such as thiaisoleucine and isoleucine hydroxamate, and mutant strains additionally resistant to DL-ethionine and / or arginine hydroxamate (Japanese application 5-130882A). In addition, recombinant strains transformed with genes encoding proteins involved in the biosynthesis of L-isoleucine, such as threonine deaminase and acetohydroxate synthase (Japanese application 2-458A, French patent 0356739 and US patent 5998178) can also be used as parent strains.

2. Способ согласно настоящему изобретению.2. The method according to the present invention.

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.The method according to the present invention is a method for producing an L-amino acid, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium for the purpose of producing and accumulating an L-amino acid in a nutrient medium and isolating the L-amino acid from the culture fluid.

В способе настоящего изобретения в качестве источника углерода в ферментационной среде могут использоваться глицерин и/или этанол.In the method of the present invention, glycerol and / or ethanol can be used as a carbon source in the fermentation medium.

"Глицерин" подразумевает вещество с номенклатурным названием пропан-1,2,3-триол. Сырой глицерин подразумевает полученный промышленным способом глицерин, содержащий также примеси. Сырой глицерин получают путем гидролиза жиров и масел водой при высокой температуре и при высоком давлении, или с использованием реакции этерификации для получения биодизельного топлива. Биодизельное топливо включает метиловые эфиры алифатической кислоты, полученные трансэтерификацией из жиров и масел и метанола. Сырой глицерин получают как побочный продукт данной реакции (Fukuda, H., Kondo, A., and Noda, H., 2001, J, Biosci. Bioeng., 92, 405-416). В процессе получения биодизельного топлива во многих случаях для трансэтерификации используют метод щелочного катализа, а для нейтрализации добавляют кислоты. Поэтому сырой глицерин получается 70-95% чистоты (по весу) и содержит также воду и примеси. Сырой глицерин, полученный в процессе получения биодизельного топлива, содержит кроме воды остаточный метанол, соли щелочных металлов, таких как Na, поскольку NaOH используют в качестве катализатора, и кислоту, такую как H₂SO₄, используемую для нейтрализации щелочи. Хотя это зависит от производителя и способов получения, количество этих солей и метанола может достигать нескольких процентов. Сырой глицерин преимущественно содержит ионы из щелочи и кислоты для нейтрализации, такие как ионы натрия, ионы калия, хлорид-ионы и сульфат-ионы в количестве 2-7%, предпочтительно 3-6%, более предпочтительно 4-5.8%, в пересчете на весовые проценты сырого глицерина. Хотя метанол может отсутствовать, в основном он присутствует в количестве 0.01% и менее."Glycerin" means a substance with the nomenclature name propane-1,2,3-triol. Crude glycerin means industrially produced glycerin, also containing impurities. Crude glycerin is obtained by hydrolysis of fats and oils with water at high temperature and high pressure, or using an esterification reaction to produce biodiesel. Biodiesel includes aliphatic acid methyl esters obtained by transesterification from fats and oils and methanol. Crude glycerin is obtained as a by-product of this reaction (Fukuda, H., Kondo, A., and Noda, H., 2001, J, Biosci. Bioeng., 92, 405-416). In the process of producing biodiesel, in many cases, the alkaline catalysis method is used for transesterification, and acids are added to neutralize. Therefore, crude glycerin is 70-95% pure (by weight) and also contains water and impurities. The crude glycerin obtained in the biodiesel production process contains, in addition to water, residual methanol, alkali metal salts such as Na, since NaOH is used as a catalyst, and an acid such as H ₂ SO ₄ used to neutralize the alkali. Although it depends on the manufacturer and methods of preparation, the amount of these salts and methanol can reach several percent. Crude glycerin mainly contains alkali ions and neutralizing acids, such as sodium ions, potassium ions, chloride ions and sulfate ions in an amount of 2-7%, preferably 3-6%, more preferably 4-5.8%, based on weight percent of crude glycerin. Although methanol may be absent, it is mainly present in an amount of 0.01% or less.

Сырой глицерин может кроме того содержать следовые количества металлов, органических кислот, фосфора, алифатических кислот и т.д. Примеры органических кислот включают муравьиную кислоту, уксусную кислоту и т.д., и хотя они могут отсутствовать, преимущественно они присутствуют в количестве 0.01% и менее. Предпочтительно присутствие следовых количеств металлов, требуемых для роста микроорганизмов, например, магния, железа, кальция, марганца, меди, цинка и т.д. Магний, железо и кальций преимущественно присутствуют в количестве 0.00001-0.1%, предпочтительно 0.0005-0.1%, более предпочтительно 0.004-0.05%, еще более предпочтительно 0.007-0.01%, в пересчете на весовые проценты сырого глицерина. Марганец, медь и цинк преимущественно присутствуют в количестве 0.000005-0.01%, предпочтительно 0.000007-0.005%, более предпочтительно 0.00001-0.001%, в пересчете на весовые проценты сырого глицерина.Crude glycerin may also contain trace amounts of metals, organic acids, phosphorus, aliphatic acids, etc. Examples of organic acids include formic acid, acetic acid, etc., and although they may be absent, they are predominantly present in an amount of 0.01% or less. Preferably, the presence of trace amounts of the metals required for the growth of microorganisms, for example, magnesium, iron, calcium, manganese, copper, zinc, etc. Magnesium, iron, and calcium are advantageously present in an amount of 0.00001-0.1%, preferably 0.0005-0.1%, more preferably 0.004-0.05%, even more preferably 0.007-0.01%, based on weight percent of crude glycerol. Manganese, copper and zinc are predominantly present in an amount of 0.000005-0.01%, preferably 0.000007-0.005%, more preferably 0.00001-0.001%, based on the weight percent of crude glycerol.

Степень чистоты сырого глицерина может быть 10% или выше, предпочтительно 50% или выше, более предпочтительно 70% или выше, особенно предпочтительно 80% или выше. При условии что количество примесей в вышеупомянутых пределах, степень чистоты глицерина может быть 90% или выше.The degree of purity of crude glycerol can be 10% or higher, preferably 50% or higher, more preferably 70% or higher, particularly preferably 80% or higher. Provided that the amount of impurities is within the aforementioned limits, the degree of glycerol purity may be 90% or higher.

Предпочтительно использование сырого глицерина, полученного при производстве биодизельного топлива. Кроме того, предпочтительно использование сырого глицерина, который обеспечивает лучшую продукцию L-аминокислоты, чем при использовании того же количества реактива глицерина. Лучшая продукция L-аминокислоты, чем при использовании того же количества реактива глицерина означает увеличение количества получаемой кислоты на 5% и более, предпочтительно на 10% и более, более предпочтительно на 20% и более, по сравнению с продукцией при использовании в качестве источника углерода реактива глицерина. "Реактив глицерина" означает глицерин, продаваемый в качестве реактива или имеющий степень чистоты, эквивалентную степени чистоты глицерина, продаваемого в качестве реактива. Преимущественно глицерин имеет степень чистоты 99% по весу и выше, особенно предпочтителен чистый глицерин. Выражение "реактив глицерина в таком же количестве, как сырой глицерин" означает, что реактив глицерина- такого же веса, как сырой глицерин за исключением воды, в том случае если глицерин содержит воду.It is preferable to use crude glycerol obtained in the production of biodiesel. In addition, it is preferable to use crude glycerol, which provides better production of L-amino acids than when using the same amount of glycerol reagent. Better L-amino acid production than using the same amount of glycerin reagent means an increase in the amount of acid produced by 5% or more, preferably 10% or more, more preferably 20% or more, compared to products when used as a carbon source glycerol reagent. “Glycerol reagent” means glycerin marketed as a reagent or having a purity equivalent to that of glycerol marketed as a reagent. Mostly glycerol has a purity of 99% by weight or higher, pure glycerin is particularly preferred. The expression “glycerol reagent in the same amount as crude glycerin” means that the glycerol reagent is the same weight as crude glycerin with the exception of water, if the glycerin contains water.

Сырой глицерин может быть разбавлен растворителем, таким как вода. В таком случае вышеупомянутое описание относительно глицерина и примесей может быть применимо к сырому глицерину до разбавления. То есть, когда используют раствор сырого глицерина и когда количество растворителя снижено и составляет до 30% по весу и менее, 20% по весу и менее, более предпочтительно 10% по весу и менее, если содержание глицерина и примесей - внутри вышеупомянутых пределов, этот сырой глицерин соответствует понятию "сырой глицерин" настоящего изобретения.Crude glycerin may be diluted with a solvent such as water. In such a case, the above description regarding glycerol and impurities may be applicable to crude glycerin prior to dilution. That is, when a crude glycerol solution is used and when the amount of solvent is reduced to 30% by weight or less, 20% by weight or less, more preferably 10% by weight or less, if the content of glycerol and impurities is within the above limits, this crude glycerin corresponds to the concept of "crude glycerin" of the present invention.

Этанол - моноспирт с молекулярной формулой C₂H₅OH и может использоваться как самостоятельно, так представлять собой смесь в среде, такую как этанол, получаемый в среде при этанольной ферментации и т.д.Ethanol is a monoalcohol with the molecular formula C ₂ H ₅ OH and can be used both independently and as a mixture in a medium, such as ethanol obtained in a medium by ethanol fermentation, etc.

Этанол может присутствовать в среде в любой концентрации при условии, что выбранная бактерия может ассимилировать его в качестве источника углерода. Когда он используется в качестве единственного источника углерода в среде, он присутствует в количестве 20% (по соотношению веса к объему - w/v) и менее, более предпочтительно 10% w/v и менее, еще более предпочтительно 2% w/v и менее. Кроме того, этанол может присутствовать в среде в любой концентрации при условии, что выбранная бактерия может ассимилировать его в качестве источника углерода. Когда он используется в качестве единственного источника углерода в среде, он присутствует в количестве 0.001% w/v и более, предпочтительно 0.05% w/v и более, более предпочтительно 0.1% w/v и более.Ethanol can be present in the medium at any concentration, provided that the selected bacterium can assimilate it as a carbon source. When used as the sole carbon source in the medium, it is present in an amount of 20% (w / v by weight to volume ratio) or less, more preferably 10% w / v or less, even more preferably 2% w / v and less. In addition, ethanol can be present in the medium at any concentration, provided that the selected bacterium can assimilate it as a carbon source. When it is used as the sole carbon source in the medium, it is present in an amount of 0.001% w / v or more, preferably 0.05% w / v or more, more preferably 0.1% w / v or more.

Что касается питательной среды, когда этанол используется в качестве единственного источника углерода, предпочтительно его присутствие в среде в количестве 10% w/v и менее, более предпочтительно 5% w/v и менее, еще более предпочтительно 1% w/v и менее.As for the nutrient medium, when ethanol is used as the sole carbon source, it is preferably present in the medium in an amount of 10% w / v or less, more preferably 5% w / v or less, even more preferably 1% w / v or less.

Хотя концентрацию этанола можно определять различными методами, наиболее удобный и общепринятый - ферментативный метод (Swift R., 2003, Addiction, 98:73-80). Концентрация алифатической кислоты может быть определена известными методами, такими как газовая хроматография и ВЭЖХ (TrAC Trends Anal. Chem., 2002, 21:686-697; Lin J.T., Snyder L.R., and McKeon, T.A., 1998, J. Chromatogr. A., 808:43-49).Although the concentration of ethanol can be determined by various methods, the most convenient and generally accepted is the enzymatic method (Swift R., 2003, Addiction, 98: 73-80). Aliphatic acid concentration can be determined by known methods such as gas chromatography and HPLC (TrAC Trends Anal. Chem., 2002, 21: 686-697; Lin JT, Snyder LR, and McKeon, TA, 1998, J. Chromatogr. A. 808: 43-49).

Кроме того, среда может содержать смесь этанола. Концентрации этанола, добавляемого в среду, могут быть любыми при условии, что выбранная бактерия может ассимилировать их в качестве источника углерода. Однако когда смесь этанола используется в качестве единственного источника углерода в среде, предпочтительно ее присутствие в количестве 20% w/v и менее, более предпочтительно 10% w/v и менее, еще более предпочтительно 2% w/v и менее, в выражении общей концентрации. Кроме того, смесь этанола может присутствовать в среде в любой концентрации при условии, что бактерия может ассимилировать ее в качестве источника углерода. Однако когда смесь этанола используется в качестве единственного источника углерода в среде, желательно ее содержание в среде в количестве 0.001% w/v и более, предпочтительно 0.05% w/v и более, более предпочтительно 0.1% w/v и более, в выражении общей концентрации этанола.In addition, the medium may contain a mixture of ethanol. The concentration of ethanol added to the medium can be any, provided that the selected bacterium can assimilate them as a carbon source. However, when the ethanol mixture is used as the sole carbon source in the medium, its presence is preferably in an amount of 20% w / v or less, more preferably 10% w / v or less, even more preferably 2% w / v or less, in terms of total concentration. In addition, a mixture of ethanol can be present in the medium at any concentration, provided that the bacterium can assimilate it as a carbon source. However, when the ethanol mixture is used as the sole carbon source in the medium, its content in the medium in an amount of 0.001% w / v and more, preferably 0.05% w / v and more, more preferably 0.1% w / v and more, in terms of the total ethanol concentration.

Кроме этанола и глицерина в среде могут содержаться также другие источники углерода, например, углеводы, такие как глюкоза, фруктоза, сахароза, лактоза, галактоза, меласса, гидролизат крахмала, спирты, такие как глицерин, и органические кислоты, такие как фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота. Особенно предпочтительны глюкоза, сахароза, фруктоза и глицерин. В качестве глицерина также может быть использован сырой глицерин, получаемый при производстве биодизельного топлива. Источник углерода может быть одним видом вещества или смесью двух и более видов веществ. Когда используются другие источники углерода, доля этанола, алифатической кислоты или смеси этанола и глицерина в источнике углерода предпочтительно должна составлять 10% по весу и более, более предпочтительно 30% по весу и более, еще более предпочтительно 50% по весу и более.In addition to ethanol and glycerol, other carbon sources may also be present in the medium, for example, carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, lactose, galactose, molasses, starch hydrolyzate, alcohols such as glycerin, and organic acids such as fumaric acid, citric acid acid and succinic acid. Particularly preferred are glucose, sucrose, fructose and glycerin. Crude glycerin obtained from the production of biodiesel can also be used as glycerin. The carbon source may be one type of substance or a mixture of two or more types of substances. When other carbon sources are used, the proportion of ethanol, aliphatic acid or a mixture of ethanol and glycerol in the carbon source should preferably be 10% by weight or more, more preferably 30% by weight or more, even more preferably 50% by weight or more.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости могут быть осуществлены способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.According to the present invention, the cultivation, isolation and purification of the L-amino acid from a culture or similar liquid can be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which the amino acid is produced using bacteria.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. В качестве источника углерода используют этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.The nutrient medium used for growing can be either synthetic or natural, provided that the medium contains sources of carbon, nitrogen, mineral additives and, if necessary, the appropriate amount of nutrient additives necessary for the growth of microorganisms. Ethanol and glycerin are used as a carbon source. Various inorganic ammonium salts, such as ammonia and ammonium sulfate, other nitrogen compounds, such as amines, natural nitrogen sources, such as peptone, soybean hydrolyzate, microorganism fermentolizate, can be used as a nitrogen source. As mineral additives, potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, iron sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like can be used. As vitamins, thiamine, yeast extract, and the like can be used.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно, выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной среде.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as mixing the culture fluid on a rocking chair, shaking with aeration, at a temperature in the range from 20 to 40 ° C, preferably in the range from 30 to 38 ° C. The pH of the medium is maintained in the range from 5 to 9, preferably from 6.5 to 7.2. The pH of the medium can be adjusted by ammonia, calcium carbonate, various acids, bases and buffer solutions. Typically, growing for 1 to 5 days leads to the accumulation of the target L-amino acid in the culture medium.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.After growth, solid residues, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or filtration through a membrane, and then the L-amino acid can be isolated and purified by ion exchange chromatography, concentration and / or crystallization.

ПримерыExamples

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.The present invention will be described in more detail below with reference to the following non-limiting Examples.

Пример 1. Конструирование штамма. E.coli MG1655 cyaA^K432QP_Ltac-adhE*.Example 1. Construction of the strain. E. coli MG1655 cyaA ^K432Q P _Ltac -adhE *.

Для получения штамма Е.coli, способного более эффективно утилизировать этанол, был использован метод отбора в соответствии с методикой адаптивной эволюции, описанной Fong S. et al (http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.3832305). Культуру штамма MG1655 P_L-tacadhE* (WO 2008010565) в течение продолжительного времени поддерживали в экспоненциальной фазе роста путем ежедневных пассажей на свежую минимальную среду (М9) с добавлением 2% (v/v) этанола. Каждые 100 часов эксперимента отбирали пробы культуры и определяли скорость роста в такой же среде. К 700 ч эксперимента больше не наблюдалось увеличения скорости роста. Суспензию клеток этой "fitness" культуры высевалина чашки с LB для получения индивидуальных колоний. Определили скорость роста семи независимых клонов. Показано, что все эти клоны и "fitness" культура имеют одинаковую скорость роста на этаноле. Один из этих клонов, Fit73, был выбран для дальнейших исследований.To obtain E. coli strain capable of more efficiently utilizing ethanol, the selection method was used in accordance with the adaptive evolution methodology described by Fong S. et al (http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.3832305 ) The culture of strain MG1655 P _L-tac adhE * (WO 2008010565) was maintained in the exponential growth phase for a long time by daily passages on fresh minimal medium (M9) supplemented with 2% (v / v) ethanol. Every 100 hours of the experiment, culture samples were taken and the growth rate in the same medium was determined. By 700 hours of the experiment, an increase in growth rate was no longer observed. The cell suspension of this "fitness" culture was plated cups with LB to obtain individual colonies. The growth rate of seven independent clones was determined. It was shown that all these clones and the "fitness" culture have the same growth rate on ethanol. One of these clones, Fit73, was selected for further research.

С использованием сравнительного анализа последовательностей генома (NimbleGen) выбранного клона Fit73 "fitness" штамма обнаружили 16 мутаций: 3 синонимичных и 13 несинонимичных. Одна из несинонимичных мутаций обнаружена в гене суаА: A→G в положении 1294. В результате данной мутации остаток лизина в положении 432 аденилатциклазы замещается глутамином.Using a comparative analysis of the genome sequences (NimbleGen) of the selected clone Fit73 "fitness" strain, 16 mutations were found: 3 synonymous and 13 non-synonymous. One of the non-synonymous mutations was found in the cyaA: A → G gene at position 1294. As a result of this mutation, the lysine residue at position 432 of adenylate cyclase is replaced by glutamine.

Затем данный штамм маркировали устойчивостью к хлорамфениколу (Cm^R) после гена cyaA^K432Q следующим образом. Фрагмент ДНК, содержащий маркер устойчивости к хлорамфениколу (Cm^R), кодируемый геном cat, интегрировали в хромосому штамма Fit73 после гена cyaA^K432Q с использованием метода, описанного Datsenko K.A. and Wanner B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645), называемым "Red-опосредованная интеграция" и/или "Red-зависимая интеграция".This strain was then labeled with chloramphenicol resistance (Cm ^R ) after the cyaA ^K432Q gene as follows. The DNA fragment containing the chloramphenicol resistance marker (Cm ^R ) encoded by the cat gene was integrated into the chromosome of Fit73 strain after the K432Q ^cyaA gene using the method described by Datsenko KA and Wanner BL (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 , 6640-6645), called "Red-mediated integration" and / or "Red-dependent integration".

Фрагмент ДНК, содержащий маркер Cm^R, кодируемый геном cat, получили в ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175) и праймеров P1 (SEQ ID NO:3) и P2 (SEQ ID NO:4). ПЦР проводили с использованием амплификатора "Gene Amp PCR System 2700" (Applied Biosystems). Реакционная смесь (общий объем - 50 мкл) состояла из 5 мкл 10х ПЦР-буфера с 25 мМ MgCl₂ ("Fermentas", Lithuania), no 200 мкМ каждого dNTP, no 25 пкМ каждого используемого праймера и 1 Ед Taq-полимеразы ("Fermentas", Lithuania). Для ПЦР амплификации в реакционную смесь в качестве матрицы добавляли приблизительно 5 нг плазмидной ДНК. Использовали следующие температурные условия для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: денатурация 30 сек при 95°С, отжиг 30 сек при 55°С, элонгация 40 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С. Затем амплифицированный фрагмент ДНК очищали с использованием электрофореза в агарозном геле, экстрагировали с использованием "GenElute Spin Columns" ("Sigma", USA) и осаждали этанолом.A DNA fragment containing the Cm ^R marker encoded by the cat gene was obtained by PCR using the plasmid pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175) and primers P1 (SEQ ID NO: 3) and P2 (SEQ ID NO) as a template :four). PCR was performed using a Gene Amp PCR System 2700 amplifier (Applied Biosystems). The reaction mixture (total volume 50 μl) consisted of 5 μl 10x PCR buffer with 25 mM MgCl ₂ (Fermentas, Lithuania), no 200 μM of each dNTP, no 25 pcM of each primer used, and 1 Unit of Taq polymerase (" Fermentas ", Lithuania). For PCR amplification, approximately 5 ng of plasmid DNA was added as a template to the reaction mixture. Used the following temperature conditions for PCR: denaturation at 95 ° C for 5 min; subsequent 25 cycles: denaturation 30 sec at 95 ° C, annealing 30 sec at 55 ° C, elongation 40 sec at 72 ° C; and final polymerization: 5 min at 72 ° C. The amplified DNA fragment was then purified using agarose gel electrophoresis, extracted using GenElute Spin Columns (Sigma, USA) and ethanol precipitated.

Полученный фрагмент ДНК использовали для электропорации и Red-зависимой интеграции в бактериальную хромосому выбранного "fitness" штамма Е.coli Fit73.The obtained DNA fragment was used for electroporation and Red-dependent integration into the bacterial chromosome of the selected “fitness” strain of E. coli Fit73.

Клетки штамма Fit73 выращивали в течение ночи при 30°С в жидкой среде LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), затем разводили в 100 раз средой SOB (дрожжевой экстракт, 5 г/л; NaCl, 0.5 г/л; триптон, 20 г/л; KCl, 2.5 мМ; MgCl₂, 10 мМ) содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и L-арабинозу (10 мМ) (арабинозу используют для индукции плазмиды, содержащей гены Red системы) и выращивали при 30°С до достижения значения оптической плотности бактериальной культуры OD₆₀₀=0.4-0.7. Выросшие клетки из 10 мл бактериальной культуры трижды отмывали ледяной деионизированной водой, после чего суспендировали в 100 мкл воды. 10 мкл раствора фрагмента ДНК (100 нг) в деионизованной воде добавляли к суспензии клеток. Электропорацию проводили с использованием электропоратора "Bio-Rad" (USA) (No. 165-2098, version 2-89) согласно инструкции производителя. Клетки после шока добавляли к 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), инкубировали в течение 2 часов при 37°С, затем высевали на чашки с L-агаром, содержащим 25 мкг/мл хлорамфеникола. Выросшие в течение 24 часов колонии тестировали на присутствие маркера Cm^R после гена cyaA^K432Q методом ПЦР с использованием праймеров Р3 (SEQ ID NO:5) и Р4 (SEQ ID NO:6). Для этого свежевыросшую колонию суспендировали в 20 мкл воды и затем 1 мкл полученной суспензии использовали для ПЦР. µl of obtained suspension was used for PCR. Использовали следующие температурные условия для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 30 циклов: денатурация 30 сек при 95°С, отжиг 30 сек при 55°С, элонгация 30 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С. Клетки нескольких протестированных Cm^R колоний содержали требуемый фрагмент ДНК 2076 п.н., что подтверждает присутствие маркера Cm^R после гена cyaA^K432Q. Один из полученных штаммов излечили от термочувствительной плазмиды pKD46 путем культивирования при 37°С.Fit73 strain cells were grown overnight at 30 ° C in LB liquid medium containing ampicillin (100 μg / ml), then diluted 100 times with SOB medium (yeast extract, 5 g / l; NaCl, 0.5 g / l; tryptone, 20 g / L; KCl, 2.5 mM; MgCl ₂ , 10 mM) containing ampicillin (100 μg / ml) and L-arabinose (10 mM) (arabinose used to induce a plasmid containing the Red genes of the system) and grown at 30 ° C until the optical density of the bacterial culture reaches OD ₆₀₀ = 0.4-0.7. The grown cells from 10 ml of the bacterial culture were washed three times with ice-cold deionized water, and then suspended in 100 μl of water. 10 μl of a solution of a DNA fragment (100 ng) in deionized water was added to the cell suspension. Electroporation was performed using a Bio-Rad electroporator (USA) (No. 165-2098, version 2-89) according to the manufacturer's instructions. Cells after shock were added to 1 ml of SOC medium (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), incubated for 2 hours at 37 ° C, then plated on plates with L-agar containing 25 μg / ml chloramphenicol. Colonies ^grown within 24 hours were tested for the presence of the Cm ^R marker after the cyaA ^K432Q gene by PCR using primers P3 (SEQ ID NO: 5) and P4 (SEQ ID NO: 6). For this, a freshly grown colony was suspended in 20 μl of water, and then 1 μl of the resulting suspension was used for PCR. µl of obtained suspension was used for PCR. Used the following temperature conditions for PCR: denaturation at 95 ° C for 5 min; the next 30 cycles: denaturation 30 sec at 95 ° C, annealing 30 sec at 55 ° C, elongation 30 sec at 72 ° C; and final polymerization: 5 min at 72 ° C. The cells of several tested Cm ^R colonies contained the desired DNA fragment of 2076 bp, which confirms the presence of the Cm ^R marker after the cyaA ^K432Q gene. One of the obtained strains was cured of the heat-sensitive plasmid pKD46 by culturing at 37 ° C.

С использованием Р1 трансдукции cyaA*-cat фрагмент из полученного штамма ввели в штамм MG1655 P_L-tacadhE* (WO2008010565). Протестировали рост полученного штамма на среде М9 с добавлением 2% этанола. Было показано, что мутация cyaA^K432Qоказывает большое влияние на рост: мутантный ген суаА* улучшал рост штамма MG1655 P_L-tacadhE* до приблизительно 50% от роста штамма Fit73.Using P1 transduction of cyaA * -cat, a fragment from the obtained strain was introduced into strain MG1655 P _L-tac adhE * (WO2008010565). The growth of the obtained strain was tested on M9 medium with the addition of 2% ethanol. The cyaA ^K432Q mutation was shown to have a large effect on growth: the mutant cyaA * gene improved the growth of strain MG1655 P _L-tac adhE * to approximately 50% of the growth of strain Fit73.

Таким образом был получен штамм, содержащий мутантный ген cyaAK432Q. Штамм был назван MG1655 cyaA^K432Q P_Ltac-adhE*.Thus, a strain containing the mutant cyaAK432Q gene was obtained. The strain was named MG1655 cyaA ^K432Q P _Ltac -adhE *.

Пример 2. Влияние мутации гена суаА на продукцию L-треонина.Example 2. The effect of mutations of the cyaA gene on the production of L-threonine.

Для оценки влияния мутации K432Q гена суаА на продукцию треонина был сконструирован штамм Е.coli MG1655Δtdh, rhtA*, cyaA^K432Q P_L-tacadhE* путем переноса фрагмента ДНК хромосомы штамма Е.coli MG1655 cyaA^K432Q P_Ltac-adhE* в штамм E.coli MG1655 Δtdh rhtA* P_Ltac-adhE* (WO2008010565) методом Р1 трансдукции. Затем штаммы Е.coli MG1655Δtdh, rhtA*, P_L-tacadhE* и MG1655Δtdh, rhtA*, cyaA^K432Q P_L-tacadhE* трансформировали плазмидой pVIC40 (плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5,705,371). Таким образом были сконструированы штаммы- продуценты треонина MG1655Δtdh, rhtA*, P_L-tacadhE*/ pVIC40 и MG1655Δtdh, rhtA*, cyaA^K432Q P_L-tacadhE*/pVIC40.To assess the effect of the K432Q mutation of the cyaA gene on threonine production, the E. coli strain MG1655Δtdh, rhtA *, cyaA ^K432Q P _L-tac adhE * was constructed by transferring the chromosome DNA fragment of the E. coli strain MG1655 cyaA ^K432Q P _Ltac- adhE * to E. coli MG1655 Δtdh rhtA * P _Ltac -adhE * (WO2008010565) by transduction P1. Then E. coli strains MG1655Δtdh, rhtA *, P _L-tac adhE * and MG1655Δtdh, rhtA *, cyaA ^K432Q P _L-tac adhE * were transformed with plasmid pVIC40 (plasmid pVIC40 is described in detail in US patent 5,705,371). Thus, the threonine producing strains MG1655Δtdh, rhtA *, P _L-tac adhE * / pVIC40 and MG1655Δtdh, rhtA *, cyaA ^K432Q P _L-tac adhE * / pVIC40 were constructed.

Штаммы E.coli MG1655Δtdh, rhtA*, P_L-tacadhE*/ pVIC40 и MG1655Δtdh, rhtA*, cyaA^K432Q P_L-tacadhE*/ pVIC40 культивировали при 37°С в течение 18 ч в питательной среде и по 0.1 мл каждой из полученных культур инокулировали в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200 мм и культивировали при 32°С в течение 48 ч на роторной качалке. После культивирования количество накопленного в среде L-треонина определяли с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол: уксусная кислота: вода=4:1:1 (v/v). Для визуализации использовали раствор (2%) нингидрина в ацетоне. Пятно, содержащее L-треонин, вырезали; L-треонин элюировали 0.5% водным раствором CdCl₂, после чего оценивали количество L-треонина спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Результаты 8 независимых пробирочных ферментаций приведены в Таблице 1.Strains of E. coli MG1655Δtdh, rhtA *, P _L-tac adhE * / pVIC40 and MG1655Δtdh, rhtA *, cyaA ^K432Q P _L-tac adhE * / pVIC40 were cultured at 37 ° C for 18 h in nutrient medium and 0.1 ml each from the obtained cultures were inoculated in 2 ml of fermentation medium in 20 × 200 mm test tubes and cultured at 32 ° С for 48 h on a rotary shaker. After cultivation, the amount of L-threonine accumulated in the medium was determined by paper chromatography using the mobile phase of the following composition: butanol: acetic acid: water = 4: 1: 1 (v / v). For visualization, a solution (2%) of ninhydrin in acetone was used. A spot containing L-threonine was excised; L-threonine was eluted with a 0.5% aqueous solution of CdCl ₂ , after which the amount of L-threonine was estimated by spectrophotometric method at a wavelength of 540 nm. The results of 8 independent in vitro fermentations are shown in Table 1.

Как следует из Таблицы 1, штамм MG1655Δtdh, rhtA*, cyaA^K432Q PL-_tacadhE*/ pVIC40 накапливал большее количество L-треонина по сравнению со штаммом MG1655Δtdh, rhtA*, P_L-tacadhE*/ pVIC40 как на среде, содержащей этанол, так и на среде, содержащей глицерин.As follows from Table 1, strain MG1655Δtdh, rhtA *, cyaA K432Q ^PL- _tac adhE * / pVIC40 accumulated a greater amount of L-threonine compared to strain MG1655Δtdh, rhtA *, P _L-tac adhE * / pVIC40 as on a medium containing ethanol , and on a medium containing glycerin.

Состав среды для ферментации (г/л):The composition of the medium for fermentation (g / l):

Этанол/глицеринEthanol / Glycerin 20/4020/40 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 2222 K₂HPO₄ K ₂ HPO ₄ 22 MgSO₄·7H₂OMgSO ₄ · 7H ₂ O 0.80.8 MnSO₄·5H₂OMnSO ₄ · 5H ₂ O 0.020.02 FeSO₄·7H₂OFeSO ₄ · 7H ₂ O 0.020.02 ТиамингидрохлоридThiamine hydrochloride 0.0020.002 Дрожжевой экстрактYeast extract 1.01.0 СаСО₃ CaCO ₃ 30thirty

K₂HPO₄ и СаСО₃ стерилизовали по отдельности. Значение рН доводили до 7.0.K ₂ HPO ₄ and CaCO ₃ were individually sterilized. The pH was adjusted to 7.0.

Пример 3. Влияние мутации гена суаА на продукцию L-лизина.Example 3. The effect of mutations of the cyaA gene on the production of L-lysine.

Для оценки влияния мутации K432Q гена суаА на продукцию L-лизина сначала ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655::P_L-tacadhE* (US2009203090 (А1) могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лизина Е.coli WC196 (pCABD2) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма WC196 P_L-tacadhE* (pCABD2). В составе плазмиды pCABD2 имеются ген dapA, кодирующий дигидродипиколинатсинтазу с мутацией, снимающей ингибирование L-лизином по типу обратной связи, ген lysC, кодирующий аспартокиназу III с мутацией, снимающей ингибирование L-лизином по типу обратной связи, ген, dapB, кодирующий дигидродипиколинатредуктазу, и ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидрогеназу (US Patent 6,040,160).To assess the effect of the K432Q mutation of the cyaA gene on L-lysine production, first DNA fragments of the chromosome of the above E. coli strain MG1655 :: P _L-tac adhE * (US2009203090 (A1) can be transferred to the E. coli L-lysine producer strain WC196 (pCABD2) using P1 transduction (Miller, JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) to obtain strain WC196 P _L-tac adhE * (pCABD2). As part of the plasmid pCABD2 there is a dapA gene encoding a dihydrodipicolinate synthase with a mutation that deactivates feedback inhibition of L-lysine, a lysC gene encoding aspartokinase III with a mutation that deletes L inhibition -lysine feedback type gene, dapB encoding dihydrodipicolinate reductase, and ddh gene encoding diaminopimelate dehydrogenase (US Patent 6,040,160).

Затем штамм Е.coli WC196 P_L-tacadhE* cat-cyaA^K432Q (pCABD2) может быть получен путем переноса фрагментов ДНК из хромосомы штамма Е.coli MG1655 cyaA^K432Q P_Ltac-adhE* в штамм Е.coli WC196 P_L-tacadhE* (pCABD2) с помощью Р1 трансдукции.Then, E. coli strain WC196 P _L-tac adhE * cat-cyaA ^K432Q (pCABD2) can be obtained by transferring DNA fragments from the chromosome of E. coli strain MG1655 cyaA ^K432Q P _Ltac- adhE * to E. coli strain WC196 P _L-tac adhE * (pCABD2) using P1 transduction.

Штаммы Е.coli, WC196 P_L-tacadhE* cat- cyaA^K432Q (pCABD2) и WC196 P_L-tacadhE* (pCABD2), могут быть выращены в L-среде, содержащей 20 мг/л стрептомицина, при 37°С; и 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 20 мл ферментационной среды, содержащей необходимые антибиотики, в колбы объемом 500 мл. Культивирование может проводиться при 37°С в течение 16 часов с использованием возвратно-поступательной качалки со скоростью перемешивания 115 об/мин. После выращивания количество L-лизина и остаточной глюкозы в среде может быть измерено известным способом (Biotech-analyzer AS210, производитель- Sakura Seiki Co.). Затем, для каждого из штаммов может быть рассчитан выход L-лизина в пересчете на потребленный этанол.E. coli _{strains, WC196 P L-tac adhE *} cat- cyaA K432Q (pCABD2) and _{WC196 P L-tac adhE * (} pCABD2), can be grown in L-medium containing 20 mg / L streptomycin at 37 ° C ; and 0.3 ml of the obtained cultures can be introduced into 20 ml of a fermentation medium containing the necessary antibiotics into 500 ml flasks. Cultivation can be carried out at 37 ° C for 16 hours using a reciprocating rocking chair with a stirring speed of 115 rpm. After cultivation, the amount of L-lysine and residual glucose in the medium can be measured in a known manner (Biotech-analyzer AS210, manufactured by Sakura Seiki Co.). Then, for each of the strains, the yield of L-lysine can be calculated in terms of the ethanol consumed.

Может быть использована ферментационная среда следующего состава (г/л):Can be used in a fermentation medium of the following composition (g / l):

ЭтанолEthanol 20twenty (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 2424 KK ₂₂ HPOHPO _4four 1.01.0 MgSO₄ 7H₂OMgSO ₄ 7H ₂ O 1.01.0 FeSO₄ 7H₂OFeSO ₄ 7H ₂ O 0.010.01 MnSO₄ 5H₂OMnSO ₄ 5H ₂ O 0.010.01 Дрожжевой экстрактYeast extract 2.02.0

рН доводят до 7.0 с помощью KOH, и среду автоклавируют при 115°С в течение 10 мин. Этанол и MgSO₄ 7Н₂О стерилизуют отдельно. Также добавляют СаСО₃ до концентрации 30 г/л, предварительно простерилизованного сухим жаром при 180°С в течение 2 часов.The pH was adjusted to 7.0 with KOH and the medium was autoclaved at 115 ° C for 10 minutes. Ethanol and MgSO ₄ 7H ₂ O are sterilized separately. CaCO _{3 is} also added to a concentration of 30 g / l, previously sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours.

Пример 4. Влияние мутации гена суаА на продукцию L-гистидина.Example 4. The effect of mutations of the cyaA gene on the production of L-histidine.

Для оценки влияния мутации K432Q гена суаА на продукцию L-гистидина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655::P_L-tacadhE* (US 2009203090 (А1) могут быть перенесены в штамм-продуцент L-гистидина Е.coli 80 с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма 80 P_L-tacadhE*. Штамм 80 описан в патенте РФ 2119536 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 15 октября 1999 г. с инвентарным номером ВКПМ В-7270, затем 12 июля 2004 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.To evaluate the effect of the K432Q mutation of the cyaA gene on L-histidine production, DNA fragments of the chromosome of the above E. coli strain MG1655 :: P _L-tac adhE * (US2009203090 (A1) can be transferred to the E. coli L-histidine producer strain 80 using P1 transduction (Miller, JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) to obtain strain 80 P _L-tac adhE *. Strain 80 is described in RF patent 2119536 and deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms (Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) October 15, 1999 with inventory number VKPM B-7270, then on July 12, 2004 an international deposit of this strain according to the terms of the Budapest Treaty.

Затем штамм Е.coli 80 P_L-tacadhE* cat-cyaA^K432Q может быть получен путем переноса фрагментов ДНК из хромосомы штамма Е.coli MG1655 cyaA^K432Q P_Ltac-adhE* в штамм Е.coli 80 P_L-tacadhE* с помощью Р1 трансдукции.Then, the E. coli strain 80 P _L-tac adhE * cat-cyaA ^K432Q can be obtained by transferring DNA fragments from the chromosome of the E. coli strain MG1655 cyaA ^K432Q P _Ltac- adhE * to the E. coli strain 80 P _L-tac adhE * s using P1 transduction.

Штаммы E.coli 80 P_L-tacadhE* cat-cyaA^K432Q и 80 P_L-tacadhE* могут быть выращены на L-бульоне при 29°С в течение 6 часов. Затем по 0.1 мл полученных культур может быть внесено в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 29°С в течение 65 часов на роторной качалке (350 об/мин). После выращивания количество накопленного в среде гистидина может быть определено с помощью бумажной хроматографии. Может быть использована подвижная фаза следующего состава: п-бутанол - уксусная кислота - вода=4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (0.5%) в ацетоне может быть использован для визуализации.Strains of E. coli 80 P _L-tac adhE * cat-cyaA ^K432Q and 80 P _L-tac adhE * can be grown on L-broth at 29 ° C for 6 hours. Then, 0.1 ml of the obtained cultures can be introduced into 2 ml of fermentation medium in 20 × 200 mm test tubes, and the cultures can be grown at 29 ° С for 65 hours on a rotary shaker (350 rpm). After growing, the amount of histidine accumulated in the medium can be determined by paper chromatography. The mobile phase of the following composition can be used: p-butanol - acetic acid - water = 4: 1: 1 (v / v). A solution of ninhydrin (0.5%) in acetone can be used for visualization.

Состав ферментационной среды (рН 6.0) (г/л):The composition of the fermentation medium (pH 6.0) (g / l):

ЭтанолEthanol 20.020.0 МаменоMemeno 0.2 общего азота0.2 total nitrogen L-пролинL-proline 1-01-0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 25.025.0 KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 2.02.0 MgSO₄ 7H₂OMgSO ₄ 7H ₂ O 1.01.0 FeSO₄ 7H₂OFeSO ₄ 7H ₂ O 0.010.01 MnSO₄ MnSO ₄ 0.010.01 ТиаминThiamine 0.0010.001 БетаинBetaine 2.02.0 СаСО₃ CaCO ₃ 60.060.0

Этанол, пролин, бетаин и СаСО₃ стерилизуют отдельно. рН доводят до 6.0 перед стерилизацией.Ethanol, proline, betaine and CaCO _{3 are} sterilized separately. The pH is adjusted to 6.0 before sterilization.

Пример 5. Влияние мутации гена cyaA на продукцию L-лейцина.Example 5. The effect of mutations of the cyaA gene on the production of L-leucine.

Для оценки влияния мутации K432Q гена суаА на продукцию L-лейцина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655::P_L-tacadhE* (US2009203090 (А1) могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лейцина Е.coli NS1391 с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма NS1391 P_L-_tacadhE*.To assess the effect of the K432Q mutation of the cyaA gene on L-leucine production, DNA fragments of the chromosome of the above E. coli strain MG1655 :: P _L-tac adhE * (US2009203090 (A1) can be transferred to the E. coli NS1391 L-leucine producer strain using P1 transduction (Miller, JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) to obtain strain NS1391 P _L - _tac adhE *.

Затем штамм Е.coli NS1391 P_L-tacadhE* cyaA^K432Q может быть получен путем переноса фрагментов ДНК из хромосомы штамма Е.coli MG1655 Δtdh rhtA* cyaA^K432Q P_Ltac-adhE* в штамм Е.coli NS1391 P_L-tacadhE* с помощью Р1 трансдукции.Then E. coli strain NS1391 P _L-tac adhE * cyaA ^K432Q can be obtained by transferring DNA fragments from the chromosome of E. coli strain MG1655 Δtdh rhtA * cyaA ^K432Q P _Ltac- adhE * to E. coli strain NS1391 P _L-tac adhE * using P1 transduction.

Штаммы Е.coli NS1391 P_L-tacadhE* cyaA^K432Q и NS1391 P_L-tacadhE* могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры указанные штаммы могут быть выращены на роторной качалке (250 об/мин) при 32°С в течение 18 часов в пробирках размером 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозы. Затем в ферментационную среду может быть внесено по 0.21 мл (10%) посевного материала. Ферментацию можно проводить в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки могут быть выращены в течение 48-72 часов при 32°C с перемешиванием (250 об/мин). Количество L-лейцина может быть измерено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол - уксусная кислота - вода=4:1:1).Strains of E. coli NS1391 P _L-tac adhE * cyaA ^K432Q and NS1391 P _L-tac adhE * can be grown for 18-24 hours at 37 ° C on plates with L-agar. To obtain a seed culture, these strains can be grown on a rotary shaker (250 rpm) at 32 ° C for 18 hours in 20 × 200 mm test tubes containing 2 ml of L-broth with 4% sucrose. Then, 0.21 ml (10%) of seed can be added to the fermentation medium. Fermentation can be carried out in 2 ml of minimal fermentation medium in test tubes measuring 20 × 200 mm. Cells can be grown for 48-72 hours at 32 ° C with stirring (250 rpm). The amount of L-leucine can be measured using paper chromatography (composition of the mobile phase: butanol - acetic acid - water = 4: 1: 1).

Состав ферментационной среды (рН 7.2) (г/л):The composition of the fermentation medium (pH 7.2) (g / l):

ЭтанолEthanol 0/10.0/20.0/30.00 / 10.0 / 20.0 / 30.0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 25,025.0 K₂HPO₄ K ₂ HPO ₄ 2.02.0 MgSO₄ H₂OMgSO ₄ H ₂ O 1.01.0 ТиаминThiamine 0.010.01 СаСО₃ CaCO ₃ 25.025.0

Этанол и мел стерилизуют отдельно.Ethanol and chalk are sterilized separately.

Пример 6. Влияние мутации гена суаА на продукцию L-фенилаланина.Example 6. The effect of mutations of the cyaA gene on the production of L-phenylalanine.

Для оценки влияния мутации K432Q гена суаА на продукцию L- фенилаланина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655::P_L-tacadhE* (US2009203090 (А1) могут быть перенесены в штамм-продуцент L-фенилаланина Е.coli AJ12739 с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма AJ12739 P_L-tacadhE*. Штамм AJ12739 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 6 ноября 2001 года с инвентарным номером ВКПМ В-8197, затем 23 августа 2002 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.To assess the effect of the K432Q mutation of the cyaA gene on the production of L-phenylalanine, DNA fragments of the chromosome of the above E. coli strain MG1655 :: P _L-tac adhE * (US2009203090 (A1) can be transferred to the E. coli L-phenylalanine producing strain AJ12739 using P1 transduction (Miller, JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) to obtain strain AJ12739 P _L-tac adhE *. Strain AJ12739 was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms (VKPM ) (Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) November 6, 2001 with inventory number VKPM V-8197, then on August 23, 2002 an international native deposit under the provisions of the Budapest Treaty.

Затем штамм Е.coli AJ12739 P_L-tacadhE* cyaA^K432Q может быть получен путем переноса фрагментов ДНК из хромосомы штамма Е.coli MG1655 cyaA^K32Q P_Ltac-adhE* в штамм Е.coli AJ12739 P_L-tacadhE* с помощью Р1-трансдукции.Then, E. coli strain AJ12739 P _L-tac adhE * cyaA ^K432Q can be obtained by transferring DNA fragments from the chromosome of E. coli strain MG1655 cyaA ^K32Q P _Ltac- adhE * to E. coli strain AJ12739 P _L-tac adhE * using P1 transduction.

Штаммы Е.coli AJ12739 P_L-tacadhE* cat-cyaA^K432Q и AJ12739 P_L-tacadhE* могут быть выращены при 37°С в течение 18 часов в питательном бульоне, 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке. По окончании ферментации количество накопленного в среде фенилаланина может быть определено с помощью тонкослойной хроматографии (TLC). Для этой цели могут быть использованы TLC-пластинки размером 10×15 см, покрытые 0.11 мм-слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (Акционерное Общество Сорбполимер, Краснодар, Россия). Пластинки Сорбфил могут быть экспонированы в подвижной фазе следующего состава: пропан-2-ол: этилацетат: 25% водного аммиака: вода=40:40:7:16 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.Strains of E. coli AJ12739 P _L-tac adhE * cat-cyaA ^K432Q and AJ12739 P _L-tac adhE * can be grown at 37 ° C for 18 hours in nutrient broth, 0.3 ml of the obtained cultures can be introduced into 3 ml of fermentation medium in test tubes measuring 20 × 200 mm, and cultures can be grown at 37 ° C for 48 hours on a rotary shaker. At the end of the fermentation, the amount of phenylalanine accumulated in the medium can be determined by thin layer chromatography (TLC). For this purpose, 10 × 15 cm TLC plates coated with a 0.11 mm layer of Sorbfil silica gel without a fluorescent indicator can be used (Sorbpolymer Joint-Stock Company, Krasnodar, Russia). Sorbfil plates can be exposed in the mobile phase of the following composition: propan-2-ol: ethyl acetate: 25% aqueous ammonia: water = 40: 40: 7: 16 (v / v). A solution (2%) of ninhydrin in acetone can be used for visualization.

Состав ферментационной среды (г/л):The composition of the fermentation medium (g / l):

ЭтанолEthanol 20.020.0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 16.016.0 K₂HPO₄ K ₂ HPO ₄ 0.10.1 MgSO₄ 7H₂OMgSO ₄ 7H ₂ O 1.01.0 FeSO₄ 7H₂OFeSO ₄ 7H ₂ O 0.010.01 MnSO₄ 5H₂OMnSO ₄ 5H ₂ O 0.010.01 Тиамин HClThiamine HCl 0.00020.0002 Дрожжевой экстрактYeast extract 2.02.0 ТирозинTyrosine 0.1250.125 СаСО₃ CaCO ₃ 20.020.0

Этанол и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.Ethanol and magnesium sulfate are sterilized separately. CaCO _{3 is} sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours. The pH was adjusted to 7.0.

Пример 7. Влияние мутации гена cyaA на продукцию L-аргинина. Для оценки влияния мутации K432Q гена суаА на продукцию L-аргинина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655::P_L-tacadhE* (US2009203090 (A1) могут быть перенесены в штамм-продуцент L-аргинина Е.coli 382 с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма 382 P_L-tacadhE*. Штамм 382 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года с инвентарным номером ВКПМ В-7926, затем 18 мая 2001 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.Example 7. The effect of mutations of the cyaA gene on the production of L-arginine. To assess the effect of the K432Q mutation of the cyaA gene on L-arginine production, DNA fragments of the chromosome of the above E. coli strain MG1655 :: P _L-tac adhE * (US2009203090 (A1) can be transferred to the E. coli 382 L-arginine producer strain using P1 transduction (Miller, JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) to obtain strain 382 P _L-tac adhE *. Strain 382 was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms (VKPM ) (Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) on April 10, 2000 with inventory number VKPM B-7926, then on May 18, 2001 an international deposit was made this strain according to the terms of the Budapest Treaty.

Затем штамм Е.coli 382 P_L-tacadhE* cyaA^K432Q может быть получен путем переноса фрагментов ДНК из хромосомы штамма MG1655 cyaA^K432Qcat P_Ltac-adhE* в штамм Е.coli 382 P_L-tacadhE* с помощью Р1-трансдукции.Then, the E. coli 382 P _L-tac adhE * cyaA K432Q ^strain can be obtained by transferring DNA fragments from the chromosome of the MG1655 cyaA ^K432Q cat P _Ltac- adhE * strain to the E. coli 382 P _L-tac adhE * strain using P1 transduction .

Штаммы Е.coli 382 P_L-tacadhE* cat-cyaA^K432Q и 382 P_L-tacadhE* могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона, по 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.Strains of E. coli 382 P _L-tac adhE * cat-cyaA ^K432Q and 382 P _L-tac adhE * can be grown with stirring at 37 ° C for 18 hours in 3 ml of nutrient broth, 0.3 ml of the resulting cultures can be added in 3 ml of fermentation medium in 20 × 200 mm test tubes, and cultures can be grown at 32 ° C for 48 hours on a rotary shaker.

После выращивания количество накопленного в среде L-аргинина может быть определено с помощью бумажной хроматографии, при этом может быть использован следующий состав подвижной фазы: бутанол: уксусная кислота: вода=4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне может быть использован для визуализации. Пятно, содержащее L-аргинин, может быть вырезано; L-аргинин может быть элюирован 0.5% водным раствором CdCl₂, после чего количество L-аргинина может быть определено спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.After growing, the amount of L-arginine accumulated in the medium can be determined using paper chromatography, and the following composition of the mobile phase can be used: butanol: acetic acid: water = 4: 1: 1 (v / v). A solution of ninhydrin (2%) in acetone can be used for visualization. A stain containing L-arginine can be excised; L-arginine can be eluted with a 0.5% aqueous solution of CdCl ₂ , after which the amount of L-arginine can be determined spectrophotometrically at a wavelength of 540 nm.

ЭтанолEthanol 20.020.0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 35.035.0 KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 2.02.0 MgSO₄ 7H₂OMgSO ₄ 7H ₂ O 1.01.0 Тиамин HClThiamine HCl 0.00020.0002 Дрожжевой экстрактYeast extract 5.05.0 СаСО₃ CaCO ₃ 33.033.0

MgSO₄·7H₂O, этанол и СаСО₃ стерилизуют отдельно.MgSO ₄ · 7H ₂ O, ethanol and CaCO _{3 are} sterilized separately.

Пример 8. Влияние мутации гена суаА на продукцию L-триптофана.Example 8. The effect of mutations of the cyaA gene on the production of L-tryptophan.

Для оценки влияния мутации K432Q гена суаА на продукцию L-триптофана ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655::P_L-tacadhE* (US2009203090 (А1) могут быть перенесены в штамм-продуцент L-триптофана Е.coli SV164 (pGH5) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма SV164 P_l-tacadhE*(pGH5). Штамм SV164 содержит аллель trpE, кодирующий антранилатсинтазу, не подверженную ингиброванию триптофаном по типу обратной связи. Плазмида pGH5 содержит мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, не подверженную ингиброванию серином по типу обратной связи. Штамм SV164 (pGH5) подробно описан в патенте США 6180373.To assess the effect of the K432Q mutation of the cyaA gene on L-tryptophan production, DNA fragments of the chromosome of the above E. coli strain MG1655 :: P _L-tac adhE * (US2009203090 (A1) can be transferred to the E. coli L-tryptophan producing strain SV164 (pGH5) using P1 transduction (Miller, JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) to obtain strain SV164 P _l-tac adhE * (pGH5). Strain SV164 contains the allele Feedback trpE encoding anthranilate synthase not susceptible to tryptophan inhibition Plasmid pGH5 contains a mutant serA gene encoding phosphoglycerate dehydrogenase not susceptible Feedback Serine Inhibition: Strain SV164 (pGH5) is described in detail in US Pat. No. 6,180,373.

Затем штамм Е.coli SV164 P_L-tacadhE* cyaA^K432Q (pGH5) может быть получен путем переноса фрагментов ДНК из хромосомы штамма MG1655 cyaA^K432Qcat P_Ltac-adhE* в штамм Е.coli SV164 P_L-tacadhE* (pGH5) с помощью Р1-трансдукции.Then, E. coli strain SV164 P _L-tac adhE * cyaA ^K432Q (pGH5) can be obtained by transferring DNA fragments from the chromosome of strain MG1655 cyaA ^K432Q cat P _Ltac- adhE * to E. coli strain SV164 P _L-tac adhE * (pGH5 ) using P1 transduction.

Штаммы Е.coli SV164 P_L-tacadhE* cat-cyaA^K432Q (pGH5) и SV164 P_L-tacadhE* (pGH5) могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона с добавлением тетрациклина (маркера плазмиды pGH5, 20 мг/л). По 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды, содержащей тетрациклин (20 мг/л), в пробирках размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке при 250 об/мин. После выращивания количество накопленного в среде триптофана может быть определено с помощью TLC, как описано в Примере 6.Strains of E. coli SV164 P _L-tac adhE * cat-cyaA ^K432Q (pGH5) and SV164 P _L-tac adhE * (pGH5) can be grown with stirring at 37 ° C for 18 hours in 3 ml of broth supplemented with tetracycline (plasmid marker pGH5, 20 mg / L). 0.3 ml of the obtained cultures can be introduced into 3 ml of a fermentation medium containing tetracycline (20 mg / l) in 20 × 200 mm test tubes, and the cultures can be grown at 37 ° C for 48 hours on a rotary shaker at 250 rpm / min After growing, the amount of tryptophan accumulated in the medium can be determined using TLC, as described in Example 6.

Компоненты ферментационной среды представлены в Таблице 3; группы компонентов А, В, С, D, Е, F и Н стерилизуют отдельно, как и показано в Таблице 3, чтобы избежать нежелательных взаимодействий во время стерилизации.The components of the fermentation medium are presented in Table 3; the groups of components A, B, C, D, E, F and H are sterilized separately, as shown in Table 3, in order to avoid unwanted interactions during sterilization.

Пример 9. Влияние мутации гена суаА на продукцию L-глутаминовой кислоты.Example 9. The effect of mutations of the cyaA gene on the production of L-glutamic acid.

Для оценки влияния мутации K432Q гена суаА на продукцию L-глутаминовой кислоты ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655::P_L-tacadhE* (US2009203090 (А1) могут быть перенесены в штамм-продуцент L-глутаминовой кислоты Е.coli VL334thrC⁺ (Европейский Патент 1172433) с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H; (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма VL334thrC⁺ P_L-tacadhE*. Штамм VL334thrC+ депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 6 декабря 2004 г. с инвентарным номером ВКПМ В-8961, затем 8 декабря 2004 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.To evaluate the effect of the K432Q mutation of the cyaA gene on the production of L-glutamic acid, DNA fragments of the chromosome of the above E. coli strain MG1655 :: P _L-tac adhE * (US2009203090 (A1) can be transferred to the L-glutamic acid producing strain E. coli VL334thrC ⁺ (European Patent 1172433) by P1 transduction (Miller, JH; (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) to obtain strain VL334thrC ⁺ P _L-tac adhE *. The strain VL334thrC + was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms (Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) December 6, 2004 with accession number VKPM V-8961, then December 8, 2004 was converted to an international deposit under the Budapest Treaty.

Затем штамм Е.coli VL334thrC⁺ P_L-tacadhE* cyaA^K432Q может быть получен путем переноса фрагментов ДНК из хромосомы штамма MG1655 cyaA^K432Qcat P_Ltac-adhE* в штамм Е.coli VL334thrC⁺ P_L-tacadhE* с помощью Р1-трансдукции.Then, E. coli strain VL334thrC ⁺ P _L-tac adhE * cyaA ^K432Q can be obtained by transferring DNA fragments from the chromosome of strain MG1655 cyaA ^K432Q cat P _Ltac- adhE * to E. coli strain VL334thrC ⁺ P _L-tac adhE * using P1 transduction.

Штаммы Е.coli VL334thrC⁺ P_L-tacadhE* cyaA^K432Q и VL334thrC⁺ P_L-tacadhE* могут быть выращены при 37°С со встряхиванием в течение 18 ч в 3 мл питательной среды. По 0.3 мл полученных культур могут быть инокулированы в 3 мл ферментационной среды в пробирках 20×200 мм и могут быть выращены при 37°С в течение 48 ч на роторной качалке при 250 об/мин.Strains of E. coli VL334thrC ⁺ P _L-tac adhE * cyaA ^K432Q and VL334thrC ⁺ P _L-tac adhE * can be grown at 37 ° C with shaking for 18 h in 3 ml of culture medium. 0.3 ml of the resulting cultures can be inoculated in 3 ml of fermentation medium in 20 × 200 mm tubes and can be grown at 37 ° C for 48 h on a rotary shaker at 250 rpm.

ЭтанолEthanol 20.020.0 Сульфат аммонияAmmonium sulfate 25.025.0 KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 2.02.0 MgSO₄ 7H₂OMgSO ₄ 7H ₂ O 1.01.0 ТиаминThiamine 0.00010.0001 L-изолейцинL-isoleucine 0.050.05 СаСО₃ CaCO ₃ 25.025.0

Этанол и СаСО₃ стерилизуют отдельно.Ethanol and CaCO _{3 are} sterilized separately.

Пример 10. Влияние мутации гена суаА на продукцию L-валина.Example 10. The effect of mutation of the cyaA gene on the production of L-valine.

Для оценки влияния мутации K432Q гена суаА на продукцию L-валина сначала был сконструирован штамм-продуцент L-валина Е.coli H-81 P_L-tacadhE* путем переноса фрагментов ДНК хромосомы штамма Е.coli MG1655::P_L-tacadhE* (патентная заявка США 2009203090 А1) в штамм - продуцент валина Е.coli H-81 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY). Затем штамм Е.coli H-81 P_L-tacadhE* cyaA^K432Q был получен путем переноса фрагментов ДНК хромосомы штамма Е.coli MG1655 cyaA^K432Qcat P_Ltac-adhE* в штамм Е.coli H-81 P_L-tacadhE* с помощью Р1 трансдукции.To assess the effect of the K432Q mutation of the cyaA gene on L-valine production, the E. coli L-valine producing strain H-81 P _L-tac adhE * was first constructed by transferring the DNA fragments of the chromosome of E. coli strain MG1655 :: P _L-tac adhE * (US patent application 2009203090 A1) to a strain producing E. coli H-81 valine using P1 transduction (Miller, JH Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY). Then, the E. coli strain H-81 P _L-tac adhE * cyaA ^K432Q was obtained by transferring the DNA fragments of the chromosome strain E. coli MG1655 cyaA ^K432Q cat P _Ltac- adhE * to the E. coli strain H-81 P _L-tac adhE * using P1 transduction.

Штаммы H-81 P_L-tacadhE* cyaA^K32Q и H-81 P_L-tacadhE* культивировали при 37°С в течение 18 ч в питательной среде и по 0.1 мл каждой из полученных культур инокулировали в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200 мм и культивировали при 32°С в течение 72 ч на роторной качалке. После культивирования в течение 24 часов в ферментационной среде, содержащей этанол, и в течение 18 часов в ферментационной среде, содержащей глицерин, определяли количество накопленного L-валина с использованием метода ТСХ, как описано в Примере 6. Результаты 8 независимых пробирочных ферментации приведены в Таблице 2.The strains H-81 P _L-tac adhE * cyaA ^K32Q and H-81 P _L-tac adhE * were cultured at 37 ° C for 18 h in nutrient medium and 0.1 ml of each of the obtained cultures were inoculated in 2 ml of fermentation medium in test tubes 20 × 200 mm and cultivated at 32 ° C for 72 hours on a rotary shaker. After culturing for 24 hours in a fermentation medium containing ethanol and for 18 hours in a fermentation medium containing glycerol, the amount of accumulated L-valine was determined using TLC, as described in Example 6. The results of 8 independent fermentation tubes are shown in Table 2.

Как следует из Таблицы 2, штамм H-81 P_L-tacadhE* cyaA^K432Q накапливал большее количество L-валина по сравнению со штаммом H-81 P_L-tacadhE* как на среде, содержащей этанол, так и на среде, содержащей глицерин.As follows from Table 2, the H-81 P _L-tac adhE * cyaA K432Q ^strain accumulated a greater amount of L-valine compared to the H-81 P _L-tac adhE * strain both on the medium containing ethanol and on the medium containing glycerol.

Этанол/ГлицеринEthanol / Glycerin 20/8020/80 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 15fifteen KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 1.51.5 MgSO₄·7H₂oMgSO ₄ · 7H ₂ o 1one Mameno(TN)Mameno (TN) 0.40.4 СаСО₃ CaCO ₃ 2525

СаСО₃ стерилизовали сухим жаром при 180°С в течение 2 ч. Значение рН доводили до 7.0.CaCO _{3 was} dry-sterilized at 180 ° C for 2 hours. The pH was adjusted to 7.0.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to the Best Mode for Carrying Out the Invention, it will be apparent to those skilled in the art that various changes can be made and equivalent replacements made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.

Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.Each of the above documents has a link, and all cited documents are part of the description of the present invention.

Таблица 1Table 1 ШтаммStrain Глицерин, 4%Glycerin, 4% Этанол,2%Ethanol, 2% OD₅₄₀ OD ₅₄₀ Thr, г/лThr, g / l OD₅₄₀ OD ₅₄₀ Thr, г/лThr, g / l MG1655 Δtdh rhtA* P_Ltac-adhE/pVIC40MG1655 Δtdh rhtA * P _Ltac -adhE / pVIC40 27.027.0 8.58.5 10.910.9 4.34.3 MG1655 Δtdh rhtA* cyaA^K432Q P_Ltac-adhE/pVIC40MG1655 Δtdh rhtA * cyaA ^K432Q P _Ltac -adhE / pVIC40 23.123.1 12.112.1 11.411.4 5.25.2

Таблица 2table 2 ШтаммStrain Этанол, 2% (24 ч)Ethanol, 2% (24 h) Глицерин, 8% (18 ч)Glycerin, 8% (18 h) OD₅₅₀ OD ₅₅₀ Val, г/лVal, g / l OD₅₅₀ OD ₅₅₀ Val, г/лVal, g / l H-81 P_L-tacadhE*H-81 P _L-tac adhE * 5.1±0.45.1 ± 0.4 0.7±0.10.7 ± 0.1 16.1±1.616.1 ± 1.6 1.8±0.11.8 ± 0.1 H-81 P_L-tacadhE*cyaA^K432Q H-81 P _L-tac adhE * cyaA ^K432Q 19.4±0.819.4 ± 0.8 1.2±0.11.2 ± 0.1 21.0±1.021.0 ± 1.0 2.7±0.22.7 ± 0.2

Таблица 3Table 3 РастворSolution КомпонентComponent Конечная концентрация, г/лFinal concentration, g / l АBUT KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 1.51.5 NaClNaCl 0.50.5 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 1.51.5 L-метионинL-methionine 0.050.05 L-фенилаланинL-phenylalanine 0.10.1 L-тирозинL-tyrosine 0.10.1 Мамено (общий N)Mameno (total N) 0.070.07 ВAT ГлюкозаGlucose 20.020.0 MgSO₄ 7H₂OMgSO ₄ 7H ₂ O 0.30.3 СFROM FeSO₄ 7H₂OFeSO ₄ 7H ₂ O 0.0110.011 DD Na₂MoO₄ 2H₂ONa ₂ MoO ₄ 2H ₂ O 0.0750.075 Н₃ВО₃ H ₃ IN ₃ 1.01.0 CoCl₂ 6H₂OCoCl ₂ 6H ₂ O 0.000150.00015 CuSO₄ 5H₂OCuSO ₄ 5H ₂ O 0.00250.0025 MnCl₂ 4H₂OMnCl ₂ 4H ₂ O 0.000070.00007 ZnSO₄ 7H₂OZnSO ₄ 7H ₂ O 0.000250.00025 ЕE Тиамин HClThiamine HCl 0.00160.0016 FF СаСО₃ CaCO ₃ 0.00030.0003 GG ПиридоксинPyridoxine 0.0050.005

рН раствора А доводят до значения 7.1 при помощи NH₄OH.The pH of solution A was adjusted to 7.1 with NH ₄ OH.

Claims

1. Мутантная аденилатциклаза, выбранная из группы, состоящей из:
(A) белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:2, в котором остаток L-лизина в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO:2, замещен на остаток L-глутамина; и
(B) варианта белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:2, в котором остаток L-лизина в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO:2, замещен на остаток L-глутамина, содержащего делецию, вставку, добавление и/или замену одного или нескольких аминокислотных остатков и обладающего активностью аденилатциклазы в соответствии с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2.1. Mutant adenylate cyclase selected from the group consisting of:
(A) a protein having the amino acid sequence represented as SEQ ID NO: 2, in which the L-lysine residue at the position corresponding to position 432 in SEQ ID NO: 2 is substituted with the L-glutamine residue; and
(B) a variant of a protein having the amino acid sequence represented as SEQ ID NO: 2, in which the L-lysine residue at the position corresponding to position 432 in SEQ ID NO: 2 is replaced by a L-glutamine residue containing a deletion, insertion, addition and / or replacing one or more amino acid residues and having adenylate cyclase activity in accordance with the sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

2. ДНК, кодирующая мутантную аденилатциклазу по п.1.2. DNA encoding the mutant adenylate cyclase according to claim 1.

3. Бактерия семейства Enterobacteriaceae, содержащая ДНК по п.2, - продуцент протеиногенной L-аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина, L-аргинина, L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.3. A bacterium of the Enterobacteriaceae family containing DNA according to claim 2, is a producer of a proteinogenic L-amino acid selected from the group consisting of L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-methionine, L-leucine, L-isoleucine, L-valine, L-histidine, glycine, L-serine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, L-proline, L-arginine, L-phenylalanine, L- tyrosine and L-tryptophan.

4. Бактерия по п.3, отличающаяся тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.4. The bacterium according to claim 3, characterized in that said bacterium belongs to the genus Escherichia.

5. Бактерия по п.4, отличающаяся тем, что указанная бактерия принадлежит к виду Escherichia coli.5. The bacterium according to claim 4, characterized in that said bacterium belongs to the species Escherichia coli.

6. Способ получения протеиногенной L-аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина, L-аргинина, L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана, включающий выращивание бактерии по любому из пп.3-5 в питательной среде, содержащей в качестве основного источника углерода этанол и/или глицерин, и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.6. A method of obtaining a proteinogenic L-amino acid selected from the group consisting of L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-methionine, L-leucine, L-isoleucine, L-valine, L-histidine, glycine, L -serine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, L-proline, L-arginine, L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan, including growing bacteria according to any from PP.3-5 in a nutrient medium containing ethanol and / or glycerol as the main carbon source, and the allocation of the specified L-amino acids from the culture fluid.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанная протеиногенная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.7. The method according to claim 6, characterized in that said proteinogenic L-amino acid is selected from the group consisting of an aromatic L-amino acid and a non-aromatic L-amino acid.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.8. The method according to claim 7, characterized in that said aromatic L-amino acid is selected from the group consisting of L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.9. The method according to claim 7, characterized in that said non-aromatic L-amino acid is selected from the group consisting of L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-methionine, L-leucine, L-isoleucine, L-valine , L-histidine, glycine, L-serine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, L-proline and L-arginine.

10. Способ по любому из пп.6 или 7, отличающийся тем, что указанная протеиногенная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-треонина и L-валина. 10. The method according to any one of claims 6 or 7, characterized in that said proteinogenic L-amino acid is selected from the group consisting of L-phenylalanine, L-threonine and L-valine.