DE60128640T2

DE60128640T2 - Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem 4-Halo-3-Hydroxybutanoat

Info

Publication number: DE60128640T2
Application number: DE60128640T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Minoo-shi Asako; Kenji Minoo-shi Matsumura; Masatoshi Toyonaka-shi Shimizu; Nobuya Toyama-shi Ito; Ryuhei Toyonaka-shi Wakita
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2000-12-07
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2021-12-08
Also published as: US6884607B2; EP1213354A3; EP1213354A2; DE60128640D1; US20050019816A1; EP1213354B1; US20030134402A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Optisch aktives 4-Halogen-3-hydroxybutanoat und verwandte Verbindungen sind als nützliche Zwischenverbindungen für die Herstellung von Pharmazeutika und Agrochemikalien bekannt.
Verschiedene Verfahren für optisch aktives 4-Halogen-3-hydroxybutanoat und davon abgeleitete Verbindungen sind bisher bekannt gewesen, aber diese Verfahren sind in der Ausbeute oder industriellen Anwendbarkeit nicht immer zufriedenstellend.
Zusammenfassung der Erfindung
Der vorliegenden Erfindung gemäss können optisch aktives 4-Halogen-3-hydroxybutanoat und verwandte Verbindungen leicht in einer industriell wünschenswerten Weise gewonnen werden.
Die vorliegende Erfindung liefert:

1. eine Polynucleotidsequenz mit: a) einer Polynucleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird; b) einer Polynucleotidsequenz, die unter strengen Bedingungen mit einer Polynucleotidsequenz hybridisiert, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, wobei die Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz eines Proteins ist, das in der Lage ist, durch asymmetrische Reduktion von 4-Brom-3-oxobutanoat bevorzugt (S)-4-Brom-3-hydroxybutanoat zu erzeugen; worin die strengen Bedingungen die Bildung eines Hybrids unter Bedingungen einer hohen Ionenkonzentration: 6 × SSC (900 mM Natriumchlorid, 90 mM Natriumcitrat) bei 65 °C und die Aufbewahrung des Hybrids nach 30 Minuten bei 65 °C unter Bedingungen einer geringen Ionenkonzentration: 0,1 × SSC (15 mM Natriumchlorid und 1,5 mM Natriumcitrat), umfassen; oder c) einer Polynucleotidsequenz, die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird (hierunter als „das vorliegende Gen oder das vorliegende Polynucleotid" bezeichnet;
2. ein Protein mit: I) einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1; II) einer Aminosäuresequenz, die von einer Polynucleotidsequenz kodiert wird, die unter strengen Bedingungen (wie weiter oben definiert) mit einer Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 hybridisiert, die für eine Aminosäuresequenz eines Proteins kodiert, das in der Lage ist, durch asymmetrische Reduktion of 4-Brom-3-oxobutanoat bevorzugt (S)-4-Brom-3-hydroxybutanoat zu erzeugen; oder III) einer von Penicillium citrinum abgeleiteten Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, substituiert oder addiert worden sind, wobei die Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz eines Proteins ist, das in der Lage ist, durch asymmetrische Reduktion von 4-Brom-3-oxobutanoat bevorzugt (S)-4-Brom-3-hydroxybutanoat zu erzeugen (hierunter als „das vorliegende Protein oder Enzym" bezeichnet);
3. einen Prozess zur Herstellung von (S)-4-Halogen-3-hydroxybutanoat, der umfasst, 4-Halogen-3-oxobutanoat mit dem wie oben definierten Protein, einem nichthumanen Transformanten, der das Protein erzeugt, oder einem behandelten Produkt des Transformanten umzusetzen;
4. ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven 3-Hydroxybutanoats der Formel (1a):
worin R₁ eine Alkylgruppe darstellt, während R₂₀ eine Methylgruppe darstellt, die mit einem Halogenatom substituiert sein kann, wobei das Verfahren umfasst, 3-Oxobutanoat der Formel (2a):
worin R₁ und R₂₀ wie oben definiert sind, mit ganzen Zellen eines Mikroorganismus oder einem behandelten Produkt davon umzusetzen, wobei der Mikroorganismus zu Penicillium citrinum gehört, ein Polynucleotid der Erfindung umfasst und in der Lage ist, die Oxogruppe in der 3-Stellung der Verbindung der Formel (2a) asymmetrisch zur entsprechenden 3-Hydroxygruppe zu reduzieren;

Eingehende Beschreibung der Erfindung
Zuerst wird eine Beschreibung des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung gegeben, der sich auf das vorliegende Gen bezieht. Das vorliegende Gen kann ein Wildtypgen oder ein künstlich wie unten beschrieben durch Einführung einer Mutation mittels eines ortsspezifischen Mutationseinführungsverfahrens und/oder einer mutagenen Behandlung im Wildtypgen erzeugtes Gen sein. Das Wildtypgen kann unter Mikroorganismen herausgefunden und gewonnen werden, die in der Lage sind, durch asymmetrische Reduktion von 4-Brom-3-oxobutanoat-Ester bevorzugt (S)-4-Brom-3-hydroxybutanoat-Ester zu erzeugen. Beispiele des Mikroorganismus sind u.a. zur Gattung Penicillium gehörende Mikroorganismen wie Penicillium citrinum.
Beispiele des vorliegenden Gens sind u.a. in (a) bis (c) oben gezeigte Polynucleotide und dergleichen.
Die strengen Bedingungen in (b) oben umfassen Bedingungen, auf die in einem Verfahren der Southern-Hybridisierung Bezug genommen wird, das zum Beispiel in „Cloning and Sequence" (beaufsicht. von K. Watanabe, hrsg. von M. Sugiura, veröff. von Noson Bunkasha Co. Ltd. 1989) beschrieben wurde. Konkreter sind Beispiele des Polynucleotids u.a. ein Polynucleotid, das durch die folgenden Bedingungen definiert ist:
1) das Polynucleotid hybridisiert mit einem Polynucleotid, das für die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 kodiert, um unter Bedingungen einer hohen Ionenkonzentration (6 × SSC: 900 mM Natriumchlorid, 90 mM Natriumcitrat) bei 65 °C einen Hybriden mit dem Polynucleotid zu bilden, das für die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 kodiert, und
2) der gebildete Polynucleotidhybrid wird, nachdem er während 30 Minuten bei 65 °gehalten worden ist, als ein Hybrid bei einer niedrigen Ionenkonzentration aufbewahrt (0,1 × SSC: 15 mM Natriumchlorid, 1,5 mM Natriumcitrat).
Beispiele des vorliegenden Gens sind weiter u.a. auch:

d) ein Polynucleotid, das für eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 kodiert, in der ein Teil der Nucleotide deletiert, substituiert oder addiert worden ist; und
e) eine Polynucleotidsequenz, die eine Sequenzidentität von 80% oder mehr mit der Polynucleotidsequenz besitzt, die für eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 kodiert; und dergleichen.

Diese Polynucleotidsequenzen können ein Polynucleotid sein, das durch Klonieren vom Wildtypgen gewonnen wurde, oder ein Polynucleotid, das vom geklonten Gen oder einem rekombinanten Gen davon durch künstliche Einführung einer partiellen Deletierung, Substitution oder Addition von Nucleotid(en) in der Polynucleotidsequenz gewonnen wurde, die für die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 kodiert. Konkrete Beispiele sind u.a. eine Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 2, eine Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 28 und dergleichen.
Die wie oben definierten Polynucleotide (a) bis (d) der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel hergestellt werden, indem eine cDNA-Bibliothek hergestellt und PCR (polymerase chain reaction: Polymerase-Kettenreaktion) mit der cDNA als einer Schablone und einem geeigneten Primer ausgeführt wird. Die cDNA-Bibliothek kann nach gentechnischen Verfahren (z.B. „A new cell engineering experiment protocoll", hrsg. von der Cancer Research Unit, Medical Science Research Laboratory, University of Tokyo, Shujinsha Co. Ltd. 1993) zum Beispiel aus Mikroorganismen hergestellt werden, die zur Gattung Penicillium gehören, wie Penicillium citrinum.
Die Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 28 kann amplifiziert werden, indem PCR unter Verwendung der zuvor erwähnten cDNA-Bibliothek als einer Schablone und einer Oligonucleotidsequenz von SEQ ID NO: 23 sowie einer Oligonucleotidsequenz von SEQ ID NO: 24 als Primern ausgeführt wird.
Beispiele der PCR-Bedingungen sind u.a. eine Reaktionsbedingung, in der ein Reaktionsgemisch, das vier Typen von dNTP, jedes in einer Menge hinzugefügt, dass seine endgültige Konzentration im Gemisch 20 μM war, 15 pmol von zwei Oligonucleotidtypen als Primern, 1,3 E. von tac-Polymerase und die cDNA-Bibliothek als eine Schablone enthielt, auf 97 °C erhitzt wird (während 2 min), 10mal ein Zyklus der Umsetzung bei 97 °C (während 0,25 min), 50 °C (während 0,5 min) und 72 °C (während 1,5 min), 20mal ein Zyklus der Umsetzung bei 97 °C (während 0,25 min), 55 °C (während 0,5 min) und 72 °C (während 2,5 min) sowie 7 min bei 72 °C.
Eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym kann an das 5'-Terminal des für die PCR verwendeten Primers angefügt werden.
Das vorliegende Gen kann auch durch eine PCR hergestellt werden, in der als eine Schablone die oben beschriebene cDNA und als Primer ein Oligonucleotid, das aus einer partiellen Sequenz der Polynucleotidsequenz ausgewählt wurde, die für die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 kodiert (d.h. ein Olignucleotid mit etwa 14 oder mehr Nucleotiden am 5'-Terminal der Polynucleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 kodiert), sowie ein Oligonucleotid, das etwa 14 oder mehr Nucleotide komplementär zu einer Nucleotidsequenz in der Nähe der DNA-inserierenden Stelle des für die Konstruktion der cDNA verwendeten Vektors umfasst, verwendet werden.
Klonieren des amplifizierten Polynucleotids in einen Vektor kann nach den Verfahren, wie sie in „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Press, „Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, ISBN 0-471-50338-X, usw. offenbart werden, einen rekombinanten Vektor liefern, der für die vorliegende Erfindung geeignet ist. Beispiele des Vektors, der verwendet werden kann, sind u.a. pUC119 (Takara Shuzo Co. Ltd.), pTV118N (Takara Shuzo Co Ltd.), pBluescriptll (Toyobo Co. Ltd.), pCR2.1-TOPO^TM (Invitrogen Co. Ltd.), pTrc99A (Pharmacia) und pKK223-3 (Pharmacia).
Alternativ kann das vorliegende Gen gewonnen werden, indem als eine Sonde eine Nucleotidsequenz hybridisiert wird, die etwa 15 oder mehr Nucleotide umfasst, die aus der Nucleotidsequenz ausgewählt werden, die für die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 kodiert, wobei die cDNA in einen Vektor eingesetzt wird, der von einem Mikroorganismus oder einem Phagen abgeleitet wurde, und wobei die erwünschte DNA, die spezifisch an die Sonde bindet, unter Hybridisierungsbedingungen, wie sie unten beschrieben werden, erkannt wird.
Kolonie-Hybridisierung oder Plaque-Hybridisierung können als ein Verfahren verwendet werden, um eine Sonde mit einer chromosomalen DNA oder einer cDNA-Bibliothek zu hybridisieren, und können je nach dem Typ des Vektors ausgewählt werden, der für Herstellung der Bibliothek verwendet wird.
Kolonie-Hybridisierung wird bevorzugt zusammen mit der Bibliothek verwendet, die aus einem Plasmidvektor hergestellt wird. Zum Beispiel wird die Bibliotheks-DNA in einen Wirts-Mikroorganismus eingeführt, um einen Transformanten zu erzeugen, der Transformant wird verdünnt, eine Agarplatte wird mit dem verdünnten Produkt inokuliert und die Platte inkubiert, bis eine Kolonie erscheint.
Plaque-Hybridisierung wird bevorzugt zusammen mit der Bibliotheks-DNA verwendet, die aus einem Phagenvektor hergestellt wurde. Zum Beispiel wird ein Wirts-Mikroorganismus mit dem Phagen gemischt, der die Bibliothek besitzt, das anfallende Gemisch wird unter für eine Infektion geeigneten Bedingungen mit einem sanften Agar-Kultivierungsmedium gemischt, die Mischung wird dann auf eine Agarplatte gebracht und inkubiert, bis die Bildung einer Plaque bestätigt wird.
Eine Membran wird auf die Oberflächen des Agar-Kultivierungsmediums gelegt, das durch die oben beschriebenen Hybridisierungsverfahren gewonnen wurde, wodurch der Transformant oder Phage an der Membran adsorbiert, um eine transkribierte Membran zu ergeben. Nachdem diese Membran einer alkalischen Behandlung unterworfen wurde, wird sie neutralisiert und die DNA dann auf der Membran immobilisiert. Konkreter wird im Falle einer Plaque-Hybridisierung eine Nitrocellulosemembran oder eine Nylonmembran (z.B. Hybond-N⁺ – eingetr. Warenzeichen der Amersham Inc.) auf das zuvor erwähnte Agar-Kultivierungsmedium gelegt und während etwa einer Minute stehen gelassen, so dass das Phage-Teilchen durch die Membran adsorbiert wird. Dann wird die Membran während etwa drei Minuten in Alkalilösung (z.B. 1,5 M Natriumchlorid und 0,5 M Natriumhydroxid) eingetaucht, bis das Phage-Teilchen aufgelöst ist. Nach Flution der Phagen-DNA auf die Membran wird sie während etwa fünf Minuten in eine Neutralisationslösung (z.B. 1,5 M Natriumchlorid und 0,5 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung von pH 7,5) eingetaucht. Dann wird die Membran während fünf Minuten mit einer Lösung (z.B. 0,3 M Natriumchlorid, 30 mM Zitronensäure, 0,2 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung von pH 7,5) gewaschen. Danach wird sie während etwa 90 Minuten auf etwa 80 °C erhitzt, bis die Phagen-DNA auf der Membran immobilisiert ist.
Hybridisierung wird mit der DNA als einer Sonde ausgeführt, indem die Membran verwendet wird, die in den zuvor erwähnten Schritten vorbereitet wurde. Die Hybridisierung kann nach dem Verfahren ausgeführt werden, das zum Beispiel in „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Auflage (1989), von J. Sambrook, E. F. Frisch und T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, offenbart wird.
Die als eine Sonde verwendete DNA kann entweder mit einem radioaktiven Isotop oder einem Fluorophor markiert werden. Die Sonden-DNA kann zum Beispiel markiert werden, indem PCR ausgeführt wird, bei der das dCTP in der PCR-Reaktionslösung mit dem Random Primer Labeling Kit (Takara Shuzo Co. Ltd.) durch (α-32P)dCTP ersetzt und die Sonden-DNA als eine Schablone verwendet wird. Die Markierung der Sonden-DNA mit dem Fluorophor kann zum Beispiel mit dem ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System, das von Amersham hergestellt wird, und dergleichen erreicht werden.
Die Hybridisierung kann zum Beispiel wie folgt ausgeführt werden: Die im zuvor erwähnten Schritt vorbereitete Membran wird in eine Prä-Hybridisierungslösung eingetaucht, die Natriumchlorid in einer Konzentration von 450 bis 900 mM, Natriumcitrat in einer Konzentration von 45 bis 90 mM, Natriumdodecylsulfat (SDS) in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0 Gew.%, denaturierte nichtspezifische DNA in einer Konzentration von 0 bis 200 μl/ml (eine bevorzugte Prä-Hybridisierungslösung enthält 900 mM Natriumchlorid, 90 mM Natriumcitrat, 1,0% SDS und 100 μl/ml modifizierte Kalbsthymus-DNA) sowie wahlweise Albumin, Ficoll und Polyvinylpyrrolidon in Konzentrationen von je 0 bis 0,2 Gew.% enthält, worin die Lösungsmenge 50 bis 200 μl je cm² der Membran beträgt und während ein bis vier Stunden bei 42 bis 65 °C gehalten wird.
Dann wird die Membran in eine Lösung eingetaucht, die gewonnen wird, indem die wie oben verwendete Prä-Hybridisierungslösung mit der im zuvor erwähnten Schritt hergestellten Sonde in einer Menge gemischt wird, die 1,0 × 10⁴ bis 2,0 × 10⁶ Impulsen pro Minute je cm² der Membranoberfläche entspricht, und während 12 bis 20 Stunden bei 42 bis 65 °C gehalten, wobei die Menge der Lösung 50 bis 200 μl je cm² der Membran beträgt.
Nach der Hybridisierung wird die Membran herausgenommen und bei 42 bis 65 °C mit einer Waschlösung gewaschen, die 15 bis 300 mM Natriumchlorid, 1,5 bis 30 mM Natriumcitrat und 0,1 bis 1,0 Gew.% SDS enthält (eine bevorzugte Waschlösung enthält 15 mM Natriumchlorid und 1,5 mM Natriumcitrat sowie 1,0% SDS). Die gewaschene Membran wird leicht mit 2x SSC (300 mM Natriumchlorid und 30 mM Natriumcitrat) gespült und dann getrocknet. Diese Membran wird zum Beispiel einer Autoradiographie unterworfen, um die Position der Sonde auf der Membran zu erkennen, wodurch die Position des Klons des DNA-Hybriden auf dem ursprünglichen Agar-Kulturmedium festgestellt und der die gewünschte DNA enthaltende Klon aufgelesen und isoliert werden kann. Das vorliegende Gen kann gewonnen werden, indem der so gewonnene Klon kultiviert wird.
Der rekombinante Vektor gemäss vorliegender Erfindung kann gewonnen werden, indem die im zuvor erwähnten Schritt hergestellte DNA in den Vektor geklont wird, und zwar nach den Verfahren, das in „Molecular Cloning: A Laborstory Manual", 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Press, „Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, ISBN 0-471-50338-X, usw. offenbart wird. Beispiele des Vektors sind u.a. pUC119 (Takara Shuzo Co. Ltd.), pTV118N (Takara Shuzo Co. Ltd.), pBluescriptll (Toyobo Co. Ltd.), pCR2.1-TOPO^TM (Invitrogen Co. Ltd.), pTrc99A (Pharmacia) und pKK223-3 (Pharmacia) und dergleichen.
Die zuvor erwähnte DNA-Sequenz kann mit dem Didesoxy-Verfahren analysiert werden, das in Proceedings of Natural Academy of Science USA (1977), 74, Seiten 5463–5467, von F. Sanger, S. Nicklen und A. R. Coulson beschrieben wird. Um Muster für Analyse der DNA-Sequenz vorzubereiten, kann das handelsübliche Reagens wie zum Beispiel ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit von Perkin-Elmer oder dergleichen verwendet werden.
Die Aktivität des Enzymproteins, das von der gewonnenen DNA kodiert wird, die vom Transformanten erzeugt wird, kann bestätigt werden, indem ein Vektor eingeführt wird, der einen Promotor in operativer Verknüpfung mit der gewonnenen DNA besitzt, die abwärts vom Promotor angesiedelt ist, wie unten für einen Mikroorganismus beschrieben, und das kultivierte Produkt des Transformanten mit 4-Brom-3-oxobutanoat umgesetzt wird, um die Menge von (S)-4-Brom-3-hydroxybutanoat in der Reaktion zu analysieren.
Der obige Satz „ein Promotor in operativer Verknüpfung mit der DNA" bedeutet, dass die Verknüpfung mit dem Promotor so erfolgt, dass das Gen der vorliegenden Erfindung unter der Kontrolle des Promotors in einer Wirtszelle exprimiert wird, in die das Gen eingeführt wurde, um die Wirtszelle zu transformieren. Beispiele des Promotors sind u.a. der Lactose-Operonpromotor von Escherichia coli, der Tryptophan-Operonpromotor von Escherichia coli und ein synthetischer Promotor wie der tac-Promotor oder der trc-Promotor, die in Escherichia coli funktionieren können. Es ist auch möglich, den Promotor zu verwenden, der die Expression des Vorliegenden in Penicillium citrinium an sich kontrolliert.
Allgemein wird das vorliegende Gen in Gestalt eines rekombinanten Vektors, der einen Promotor in operativer Verknüpfung mit der DNA besitzt, in die Wirtszelle eingeführt. Ein Vektor, der ein selektives Markergen besitzt (z.B. ein Gen, das Antibiotikumresistenz verleiht, wie gegenüber Kanamycin oder Neomycin resistente Gene), kann ebenfalls verwendet werden, wodurch der den Vektor besitzende Transformant ausgewählt werden kann, indem der Phänotyp des relevanten selektiven Markergens als ein Indikator verwendet wird.
Beispiele der Wirtszelle, in die der Vektor, wie er oben beschrieben wurde, oder ein DNA-Konstrukt, das einen Promotor in operativer Verknüpfung mit dem vorliegenden Gen enthält, eingeführt werden kann, sind u.a. Mikroorganismen, die zu Escherichia, Bacillus, Corynebacterium, Staphylococcus, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces oder Aspergillus gehören.
Ein geeignetes Verfahren wird ausgewählt, um den Transformanten in Übereinstimmung mit der als Wirt verwendeten Zellenart zu erzeugen. Zu Beispielen solcher Verfahren gehören das Calciumchlorid-Verfahren, das in „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, und „Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, ISBN 0-471-50338-X usw. offenbart wird, sowie das Elektroporationsverfahren, das in „Method in Electroporation: Gene Pulser/E. coli Pulser System", Bio-Rad Laborstories (1993), beschrieben wird, usw.
Das vorliegende Gen, das im Transformanten enthalten ist, kann bestätigt werden, indem der Ort des Restriktionsenzyms überprüft wird, durch Analyse der Polynucleotidsequenz, Southern-Hybridisierung, Western-Hybridisierung usw. bezüglich der DNA, die auf die Herstellung der Vektor-DNA aus dem Transformanten folgend gemäss dem normalen Verfahren hergestellt wurde, das in „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, angegeben ist.
Das vorliegende Protein wird hierunter erklärt.
Beispiele der Aminosäuresequenz, in der ein oder mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 deletiert, substituiert oder addiert worden sind, sind zusätzlich zu den in I) bis III) oben definierten u.a. eine Aminosäuresequenz, die sechs zusätzliche Aminosäuren Trp-Ile-Ser-Thr-Lys-Leu am C-Terminal der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 besitzt.
Das vorliegende Protein kann erzeugt werden, indem der Transformant, der das vorliegende Gen enthält, kultiviert wird.
Beispiele des Mediums, das verwendet werden kann, um die transfizierten Wirts-Mikroorganismen zu kultivieren, sind u.a. verschiedene Medien, die eine Kohlenstoffquelle oder eine Stickstoffquelle, ein organisches Salz, ein anorganisches Salz oder dergleichen in geeigneten Mengen enthalten.
Beispiele der Kohlenstoffquelle sind u.a. Saccharide wie Glucose, Dextrin und Sucrose, Zuckeralkohol wie Glycerin, organische Säure wie Fumarsäure, Citronensäure und Brenztraubensäure, Tieröl, Pflanzenöl und Melassen. Die Menge dieser auf die Medien anzuwendenden Kohlenstoffquellen liegt normalerweise im Bereich von etwa 0,1 bis 30% (Gew./Vol.) bezüglich der Kulturlösung.
Beispiele der Stickstoffquelle sind u.a. natürlich vorkommende organische Stickstoffquellen wie Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Malzextrakt, pulverisierte Sojabohnen, Maisquellwasser, Baumwollsamen, getrocknete Hefe und Casaminosäure; Ammoniumsalz von anorganischer Säure wie Aminosäuren und Natriumnitrat, Ammoniumsalz von anorganischer Säure wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat; Ammoniumsalz von organischer Säure wie Ammoniumfumarat und Ammoniumcitrat; und Harnstoff. Von diesen Substanzen können ein Ammoniumsalz von organischer Säure, natürlich vorkommende Stickstoffquelle und Aminosäure in vielen Fällen auch als Kohlenstoffquellen verwendet werden. Die Menge dieser Stickstoffquellen, die auf die Medien angewendet werden kann, liegt normalerweise im Bereich von etwa 0,1 bis 30% (Gew./Vol.) bezüglich des Kulturmediums.
Beispiele des organischen und anorganischen Salzes sind u.a. Chlorid, Sulfat, Acetat, Carbonat und Phosphat von Calcium, Natrium, Magnesium, Eisen, Mangan, Cobalt und Zink. Konkrete Beispiele dafür sind u.a. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfid, Eisen(II)sulfid, Mangansulfid, Cobaltchlorid, Zinksulfat, Kupfersulfat, Natriumacetat, Calciumcarbonat, Mono kaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat und dergleichen. Die Menge dieser organischen und/oder anorganischen Salze, die auf die Medien angewendet werden kann, liegt normalerweise im Bereich von etwa 0,0001 bis 5% (Gew./Vol.) bezüglich des Kulturmediums.
Eine kleine Menge von Isopropylthio-β-D-galactosid (IPTG) kann als ein Induktor der Erzeugung des vorliegenden Proteins dem Medium für die Kultivierung des Transformanten beigefügt werden, der einen Promotor (z.B. tac-Promotor, trc-Promotor und lac-Promotor, die durch Allolactose induziert werden) in operativer Verknüpfung mit dem Gen besitzt.
Die Kultivierung des Transformanten, der das vorliegende Gen besitzt, kann mit einem herkömmlichen Verfahren ausgeführt werden, das für die Kultivierung einer Wirtszelle wie eines Mikroorganismus verwendet wird. Zum Beispiel kann sie mit dem folgenden Verfahren erfolgen: flüssige Kultivierung wie Kultivierung im geschüttelten Reagensglas, Rüttelkolbenkultivierung, Flaschenfermenterkultivierung, Tankkultivierung, Kultur auf festem Nährboden.
Die Kultivierungstemperatur kann innerhalb des Bereichs variiert werden, in dem der Mikroorganismus wachsen kann. Sie liegt normalerweise innerhalb des Bereichs von 15 bis 40 °C. Der pH-Wert des Mediums wird bevorzugt innerhalb des Bereichs von etwa 6 bis 8 eingestellt. Die Kultivierungszeit variiert je nach den Kultivierungsbedingungen, normalerweise werden etwa ein bis fünf Tage bevorzugt.
Das vorliegende Protein kann durch ein geeignetes Reinigungsverfahren gereinigt werden, das gewöhnlich angewendet werden kann, um ein Protein zu reinigen. Beispiele dafür sind u.a. die folgenden Verfahren. Zellen werden gesammelt, indem kultivierte Produkte des Transformanten einem Zentrifugieren der Kultur unterworfen werden, und die gesammelten Zellen werden durch physikalischen Aufschluss wie Ultraschallbehandlung und die French Press oder durch chemischen Aufschluss mit einem lytischen Enzym wie Lysozym aufgeschlossen. Verunreinigungen werden durch Zentrifugieren und Membranfilter aus der gewonnenen, aufgeschlossenen Lösung entfernt, wodurch ein zellfreier Extrakt hergestellt wird. Der Extrakt kann durch ein geeignetes Auftrenn- und Raffinierverfahren wie Kationentauscher-Säulenchromatographie, Anionentauscher-Säulenchromatographie, hydrophobe Säulenchromatographie und Gel-Säulenchromatographie in Fraktionen zerlegt werden, wodurch das vorliegenden Protein gereinigt werden kann.
Beispiele des Trägers, der für die Chromatographie verwendet werden kann, sind u.a. eine Zellulose, in die eine Carboxymethylgruppe (CM), eine Diethylaminoethylgruppe (DEAE), eine Phenylgruppe oder eine Butylgruppe eingeführt worden ist, oder ein unlöslicher Polymerträger wie Dextrin, Agarose oder dergleichen. Eine handelsübliche Säule, die mit dem Träger gefüllt wird, kann verwendet werden. Beispiele der auf dem Markt verfügbaren Säule sind u.a. Q-Sepharose FF, Phenyl-Sepharose HP (Handelsnamen der Amersham Pharmacia Biotech) und TSK-Gel G3000SW (Handelsname der Toso Co. Ltd.).
Die das vorliegende Protein enthaltende Fraktion kann zum Beispiel ausgewählt werden, indem die Befähigung zur bevorzugten Erzeugung von (S)-4-Brom-3-hydroxybutanoat durch asymmetrische Reduktion von 4-Brom-3-oxobutanoat geprüft wird.
Als Nächstes wird eine Beschreibung des Verfahrens zur Herstellung von (S)-4-Halogen-3-hydroxybutanoat der Formel (1) gegeben:
worin R₁ eine Alkylgruppe darstellt und R₂ eine Methylgruppe darstellt, die mit einem Halogenatom substituiert ist, wobei das Verfahren umfasst, 4-Halogen-3-oxobutanoat der Formel (2):
worin R₁ und R₂ die gleichen wie oben definiert darstellen, mit dem vorliegenden Enzym, einem das Enzym produzierenden Transformanten oder einem behandelten Produkt davon umzusetzen. in der Formel (1) und (2) bedeutet R₁ C1- bis C8-Alkylgruppen, R₂ bedeutet mit einem Halogenatom oder Halogenatomen substituierte Methylgruppe.
Beispiele der C1- bis C8-Alkylgruppe, die durch R₁ dargestellt werden, sind u.a. Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, t-Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl- und Octylgruppen.
Beispiele einer Methylgruppe, die mit einem Halogenatom oder Halogenatomen (z.B. Fluor, Chlor, Brom oder Iod) substituiert ist und durch R₂ dargestellt wird, sind u.a. Monofluormethyl-, Monochlormethyl-, Monobrommethyl-, Difluormethyl-, Dichlormethyl-, Dibrommethyl-, Trifluormethyl- und Trichlormethylgruppen.
Konkrete Beispiele dafür sind u.a. 4-Halogen-3-oxobutanoat-Ester einschliesslich Methyl-4-chlor-3-oxobutanoat, Ethyl-4-chlor-3-oxobutanoat, Propyl-4-chlor-3-oxobutanoat, Methyl-4-brom-3-oxobutanoat, Ethyl-4-brom-3-oxobutanoat, Propyl-4-brom-3-oxobutanoat und Octyl-4-brom-3-oxobutanoat.
Die Herstellung erfolgt gewöhnlich in Gegenwart von Wasser und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phophat der reduzierten Form (hiernach als „NADPH" bezeichnet). Das in diesem Falle verwendete Wasser kann eine wässrige Pufferlösung sein. Beispiele von Pufferagens, das für diese wässrige Pufferlösung verwendet werden kann, sind u.a. ein Alkaliphosphat-Metallsalz wie Natriumphosphat und Kaliumphosphat, Alkaliacetat-Metallsalz wie wässrige Natriumacetatlösung und Kaliumacetat sowie deren Mischungen.
Die Reaktion kann in der gleichzeitigen Gegenwart eines organischen Lösungsmittels ausgeführt werden. Beispiele des organischen Lösungsmittels sind u.a. ein Ether wie t-Butylmethylether, Diisopropylether, Tetrahydrofuran oder dergleichen; ein Ester wie Ethylformiat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat, Ethyipropionat, Butylpropionat oder dergleichen; ein Kohlenwasserstoff wie Toluol, Hexan, Cyclohexan, Heptan, Isooctan oder dergleichen; ein Alkohol wie Methanol, Ethanol, 2-Propanol, Butanol, t-Butylalkohol oder dergleichen; eine organische Schwefelverbindung wie Dimethylsulfoxid oder dergleichen; ein Keton wie Aceton oder dergleichen; ein Nitril wie Acetonitril oder dergleichen; und deren Gemische.
Die Reaktion von 4-Halogen-3-oxobutansäureester der Formel (2) mit dem vorliegenden Enzym, einem Transformanten, der das Enzym produziert, oder einem behandelten Produkt davon wird gewöhnlich unter Rühren, Schütteln oder Mischen von Wasser, NADPH und 4-Halogen-3-oxobutanoat-Ester zusammen mit dem Transformanten oder der behandelten Substanz ausgeführt, wahlweise in Gegenwart des organischen Lösungsmittels.
Der pH-Wert der Reaktion kann geeignet festgelegt werden, normalerweise innerhalb eines Bereiches von 3 bis 10. Die Reaktionstemperatur liegt im Hinblick auf die Stabilität des 4-Halogen-3-oxobutanoat-Esters und eines Produktes davon sowie im Hinblick auf die Reaktionsgeschwindigkeit normalerweise im Bereich von 0 bis 60 °C.
Der Reaktionsfortschritt kann zum Beispiel überwacht werden, indem 4-Halogen-3-oxobutanoat-Ester in der Reaktionslösung durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie oder dergleichen verfolgt wird. Die Reaktionszeit liegt gewöhnlich im Bereich von 05 Stunden bis 10 Tagen.
Nach beendeter Reaktion kann das (S)-4-Halogen-3-hydroxybutanoat durch geeignete Verfahren vom Reaktionsgemisch abgetrennt und wiedergewonnen werden. Zum Beispiel wird das Reaktionsgemisch einer Nachbehandlung wie Extraktion, Aufkonzentrieren des organischen Lösungsmittels oder einer wahlweisen Kombination davon ausgesetzt, und das Produkt kann, wenn erforderlich, durch Säulenchromatographie und Destillation weiter gereinigt werden.
Das vorliegende Protein, der Transformant, der dieses erzeugt, oder das behandelte Produkt davon können in der Reaktion in unterschiedlichen Formen verwendet werden. Beispiele seiner anwendbaren Form sind u.a. das kultivierte Produkt des Transformanten, der das vorliegende Gen enthält, die das vorliegende Gen enthaltende Transformantenzelle; das behandelte Produkt davon; zellfreier Extrakt; ein rohes gereinigtes Protein; ein gereinigtes Protein; und das immobilisierte Produkt davon.
Beispiele des behandelten Produkts des Transformanten sind u.a. ein gefriergetrockneter Transformant, ein mit organischem Lösungsmittel behandelter Transformant, ein getrockneter Transformant, ein zerriebener Transformant, ein selbst-aufgeschlossener Transformant, ein ultraschall-behandelter Transformant, ein Extrakt des Transformanten und ein akali-behandelter Transformant. Immobilisierte Produkte können zum Beispiel durch das Trägerbindungsverfahren (wobei das vorliegende Protein auf einem anorganischen Träger wie Silicagel, Keramik oder dergleichen, auf Cellulose und Ionentauscherharz adsorbiert wird) und das Einschlussverfahren (wobei das vorliegende Protein in der Netzstruktur eines Polymers wie Polyacrylamid, einem schwefelhaltigen Polysaccharidgel (z.B. Carageen-Gel), Alginsäure-Gel und Agar-Gel eingefangen wird) gewonnen werden.
In Anbetracht der geringeren, den Produktionsanlagen auferlegten Einschränkungen werden statt des Transformanten selbst, der das vorliegende Gen enthält, bevorzugt sterilisierte Transformanten als ein behandeltes Produkt für eine industrielle Produktion verwendet.
Beispiele des Verfahren zur Sterilisation des Transformanten für diesen Zweck sind u.a. die physikalische Sterilisation (Erhitzen, Trocknen, Gefrieren, Lichtstrahlen, Ultraschall, Filtration und die Anwendung elektrischen Stroms) und chemische Sterilisation (Alkali, Säure, Halogen, oxidierende Mittel, Schwefel, Bor, Arsen, Metall, Alkohol, Phenol, Amin, Sulfid, Ether, Aldehyd, Keton, Cyan und Antibiotika). Vorzugsweise wird ein Verfahren ausgewählt, das von weniger Verschmutzung oder Verunreinigung im Reaktionssystem und weniger Verlust an enzymatischer Aktivität des vorliegenden Proteins begleitet ist.
Die Reaktion wird bevorzugt in Gegenwart von NADPH ausgeführt. Das NADPH wird mit dem Fortschritt der Reaktion zu β-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat der oxidierten Form (hiernach als „NADP⁺" bezeichnet) umgewandelt. Da das NADP⁺ durch ein Enzym, das in der Lage ist, das NADP⁺ zu NADPH umzuwandeln, in das ursprüngliche NADPH zurückverwandelt werden kann, kann ein solches Enzym, das in der Lage ist, das NADP⁺ in NADPH umzuwandeln, ebenfalls zur Reaktion hinzugefügt werden.
Beispiele des Enzyms, das in der Lage ist, das NADP⁺ in NADPH umzuwandeln, sind u.a. eine Glucose-Dehydrogenase, eine Alkohol-Dehydrogenase, eine Aldehyd-Dehydrogenase, eine Aminosäure-Dehydrogenase, eine organische Dehydrogenase (Apfelsäure-Dehydrogenase) und dergleichen.
Die Aktivität der Glucose-Dehydrogenase im Reaktionssystem kann durch Hinzufügen von Glucose erhöht werden.
Das Protein, das in der Lage ist, das NADP⁺ in NADPH umzuwandeln, kann in beliebiger Gestalt auf das Reaktionssystem angewandt oder ihm hinzugefügt werden, zum Beispiel als das Enzym, ein Mikroorganismus, der die enzymatische Aktivität besitzt, oder ein behandeltes Produkt davon.
Wechselweise kann der Mikroorganismus, der die oben beschriebene Aktivität besitzt, ein Transformant, der ein Gen besitzt, das für ein Enzym kodiert, das in der Lage ist, das NADP⁺ in NADPH umzuwandeln, oder ein behandeltes Produkt des Transformanten sein. Das behandelte Produkt umfasst hierin ein Äquivalent davon.
Der Transformant, der das Gen des Enzyms besitzt, das wie oben beschrieben in der Lage ist, das NADP⁺ in NADPH umzuwandeln, und das vorliegende Gen können in dieser Reaktion eingesetzt werden.
Beide Gene können in eine Wirtszelle eingeführt werden, indem diese mit einem einzigen Vektor, der beide Gene besitzt, oder mit einer Mehrzahl von rekombinanten Vektoren, in die das betreffende Gen eingeführt worden ist, transfiziert wird. Ein weiteres Verfahren zur Einführung des Gens umfasst, das vorliegende Gen oder beide Gene in Chromosom einer Wirtszelle einzuführen.
Beispiele des Verfahrens, beide Gene in einen einzigen Vektor einzuführen, sind u.a. ein Verfahren zur Konstruktion eines Vektors durch die Verknüpfung von Expressionskontrollbereichen wie Promotoren und Terminatoren mit betreffenden Genen und ein Verfahren zur Konstruktion eines rekombinanten Vektors für die Expression eines Operons wie des Lactose-Operons, das multiple Cistronen enthält.
Als Nächstes wird eine Beschreibung des zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung gegeben, der sich auf ein Verfahren bezieht, einen optisch aktiven 3-Hydroxybutansäureester der Formel (1a), wie er oben definiert wurde, herzustellen, wobei das Verfahren umfasst, 3-Oxobutansäureester der Formel (2a), wie er oben definiert wurde, mit ganzen Zellen eines Mikroorganismus oder einem behandelten Produkt davon umzusetzen, und der Mikroorganismus zu Penicilliium citrinum gehört, ein Polynucleotid der Erfindung umfasst und in der Lage ist, die Oxogruppe in der 3-Stellung der Verbindung der Formel (2a) asymmetrisch zur entsprechenden 3-Hydroxygruppe zu reduzieren.
Dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung zufolge kann die gewünschte, optisch aktive Esterverbindung leicht in einer industriell wünschenswerten Weise erzeugt werden.
Beispiele einer C1- bis C8-Alkylgruppe, die in der allgemeinen Formel (1) und (2) durch R₁ dargestellt wird, sind u.a. Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, t-Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl- und Octylgruppen.
Beispiele einer Methylgruppe, die mit einem Halogenatom oder Halogenatomen substituiert sein kann und durch R₂₀ dargestellt wird, sind u.a. die Methylgruppe und mit einem Halogenatom oder Halogenatomen substituierte Methylgruppen. Beispiele der mit einem Halogenatom oder Halogenatomen substituierten Methylgruppe sind konkret u.a. Monofluormethyl-, Monochlormethyl-, Monobrommethyl-, Difluormethyl-, Dichlormethyl-, Dibrommethyl-, Trifluormethyl- und Trichlormethylgruppen.
Im vorliegenden Herstellungsverfahren wird die Reaktion der Umwandlung eines 3-Oxobutanoats der Formel (1a) in ein optisch aktives 3-Hydroxybutanoat der Formel (2a) zustande gebracht, indem Zellen oder Zellprodukte von einem oder mehreren Mikroorganismen eingesetzt werden, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Penicillium citrinum besteht.
Konkrete Beispiele von Zellen oder Zellprodukten von Mikroorganismen, die in der Reaktion verwendet werden können, sind u.a. diejenigen von Penicillium citrinum IFO 4631.
Die Kultivierung von Mikroorganismen, die in diesem Aspekt der Erfindung verwendet werden können, kann zum Beispiel ausgeführt werden, wie für die Herstellung des Transformanten beschrieben, indem das gleiche Kulturmedum und die gleichen Bedingungen wie im ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Mikroorganismen, die im vorliegenden Herstellungsverfahren verwendet werden können, können unter Verwendung von Medien für unterschiedliche Mikroorganismen kultiviert werden, die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, organische und anorganische Salze und andere wie zweckmässig umfassen.
Beispiele von in den Medien enthaltenen Kohlenstoffquellen sind u.a. Glucose, Sucrose, Glycerin, Stärke, organische Säuren und Melassen. Beispiele von Stickstoffquellen sind u.a. Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Casaminosäure, Malzextrakt, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Baumwollsamenmehl, getrocknete Hefe, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat. Beispiele von organischen und anorganischen Salzen sind u.a. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumcarbonat, Monokaliumphosphat, Dikaliumphosphat, Calciumcarbonat, Ammoniumacetat, Mangansulfat, Kupfersulfat, Zinksulfat, Eisen(II)sulfat und Cobaltchlorid.
Beispiele von Verfahren der Kultivierung sind u.a. Kultur mit festem Nährboden und flüssige Kultur (wie Reagenzglaskultur, Kolbenkultur und Flaschenfermenterkultur).
Die Temperatur für die Kultivierung und der pH-Wert des Mediums sind nicht auf irgendwelche konkreten Werte beschränkt, solange sie innerhalb des Bereichs liegen, der die Mikroorganismen wachsen lässt. Die Temperatur für die Kultivierung kann zum Beispiel im Bereich von 15 bis 45 °C, der pH des Mediums im Bereich von 4 bis 8 liegen.
Die Kultivierungsdauer kann je nach den Kultivierungsbedingungen geeignet festgelegt werden und beträgt gewöhnlich ein bis sieben Tage.
Mikroorganismenzellen, die durch Kultivierung gewonnen wurden, können ohne jegliche Behandlung in der Reaktion gemäss den vorliegenden Herstellungsverfahren verwendet werden. Zum Beispiel wird die Kultivierungsflüssigkeit eingesetzt, wie sie anfällt, ein Verfahren, bei dem Zellen durch Zentrifugieren der kultivierten Flüssigkeit oder dergleichen geerntet werden, und feuchte Zellen, die durch Waschen der geernteten Zellen mit einer Pufferlösung oder Wasser gewonnen werden, können eingesetzt werden.
Beispiele von Produkten von Mikroorganismenzellen, die in der vorliegenden Reaktion verwendet werden können, sind u.a. Produkte, die anfallen, wenn die durch Kultivierung gewonnenen Zellen Behandlungen mit einem organischen Lösungsmittel (Aceton, Ethanol und dergleichen) unterworfen werden, gefriergetrocknete Zellen, alkalibehandelte Zellen und Produkte, die anfallen, wenn die Zellen physikalisch oder enzymatisch aufgeschlossen werden. Beispiele von Zellprodukten sind des Weiteren u.a. die durch Immobilisierung mit wohlbekannten Verfahren nach den oben beschriebenen Behandlungen gewonnenen.
Die Reaktion wird gewöhnlich in Gegenwart von Wasser ausgeführt, und das Wasser kann in Gestalt von Pufferlösungen verwendet werden. Beispiele von Pufferagentien, die in den Pufferlösungen verwendet werden können, sind u.a. Alkalimetallsalze von Phosphorsäure wie Natriumphosphate und Kaliumphosphate sowie Alkalimetallsalze von Essigsäure wie Natriumacetat und Kaliumacetat. In solchen Fällen kann der pH-Wert der wässrigen Schicht, wenn erforderlich, während der Reaktion innerhalb des Bereichs variiert werden, in dem die Reaktion voranschreitet, und liegt gewöhnlich im Bereich von 3 bis 10.
Die Reaktion kann weiter ein hydrophobes organisches Lösungsmittel nutzen, so dass die Reaktion im Zweischichtensystem von Wasser und einem solchen hydrophoben organischen Lösungsmittel ausgeführt werden kann. Beispiele von hydrophoben organischen Lösungsmitteln, die in diesem Falle verwendet werden können, sind u.a. ein Ester wie Ethylformiat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat, Ethylpropionat, Butylpropionat oder dergleichen, ein Alkohol wie n-Butylalkohol, n-Amylalkohol, n-Octylalkohol oder dergleichen; ein aromatischer Kohlenwasserstoff wie Benzol, Toluol, Xylol oder dergleichen, ein Ether wie Diethylether, Diisopropylether, Methyl-t-butylether oder dergleichen, ein halogenierter Kohlenwasserstoff wie Chloroform, 1,2-Dichlorethan oder dergleichen und eine Mischung davon.
Die Konzentration der Ausgangsverbindung in der Reaktion, d.h. des 3-Oxobutanoats der Formel (1a), beträgt gewöhnlich 50% (Gew./Vol.) oder weniger. Damit die Konzentration des 3-Oxobutanoats der Formel (1a) im Reaktionssystem auf einem fast konstanten Niveau gehalten werden kann, kann das 3-Oxobutanoat der Formel (la) dem Reaktionssystem kontinuierlich oder sukzessiv zugegeben werden.
Die Reaktionstemperatur liegt gewöhnlich im Bereich von 0 bis 60 °C. In der Reaktion können Saccharide wie Glucose, Sucrose und Fructose, Alkohole wie Ethanol, Tenside wahlweise zugefügt werden.
Die Reaktionszeit liegt gewöhnlich im Bereich von 0,5 Stunden bis 10 Tagen. Der Reaktionsfortschritt kann zum Beispiel überwacht werden, indem die Menge der Ausgangsverbindung in der Reaktionslösung nach Zugabe eines 3-Oxobutanoats der Formel (1a) mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Gaschromatographie oder dergleichen bestimmt wird.
Nach beendeter Reaktion kann ein optisch aktives 3-Hydroxybutanoat der Formel (2a) isoliert werden, indem die Reaktionslösung üblichen Nachbehandlungen wie Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, Aufkonzentrieren usw. unterworfen wird. Die isolierte Verbindung kann, wenn erforderlich, mit Säulenchromatographie, Destillation oder dergleichen weiter gereinigt werden.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung eingehend unter Bezugnahme auf Ausführungsformen beschrieben, die keineswegs den Umfang der vorliegenden Erfindung begrenzen.
Bezugsbeispiel 1
100 ml eines Mediums (Kartoffeldextrosebouillon von Becton Dickinson, aufgelöst in Wasser im Verhältnis von 24 g/l) wurden in einen 500-ml-Kolben gegeben und während 15 Minuten bei 121 °C sterilisiert. Dann wurden 0,5 ml eines Stammes von Penicillium citrinum IFO 4631, die in einem Medium der gleichen Zusammensetzung kultiviert worden waren (48 Stunden Schüttelkultur bei 30 °C), zugegeben und während 72 Stunden bei 30 °C geschüttelt und kultiviert. Dann wurde die gewonnene Kultivierungslösung zentrifugiert (8000 g während zehn Minuten), und der anfallende Niederschlag wurde gesammelt. Dieser Niederschlag wurde dreimal in 50 ml 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7) gewaschen, um etwa 1,0 g feuchte Bakterienzelle zu gewinnen.
10 g der feuchten Bakterienzelle wurden verwendet, um Gesamt-RNA nach dem Guanidin-Phenol-Chloroform-Thiocyanat-Verfahren herzustellen, und etwa 1,5 mg Gesamt-RNA wurden gewonnen. Weiter wurden aus 0,5 mg der Gesamt-RNA mit Oligotex(dT)30-Super (Takara Shuzo Co. Ltd.) etwa 9,3 μg poly(A)-haltige RNA gewonnen.
Die cDNA-Bibliothek wurde nach dem Verfahren von Gubler und Hoffman wie folgt hergestellt. Eine einsträngige cDNA wurde hergestellt, indem die RNA (3,0 μg), die das obige Poly(A) enthielt, der Oligo(dT)I8-Linkerprimer (einschliesslich Xhol-Stelle, Takara Shuzo Co. Ltd.) sowie RAV-2-RTase und SuperScriptll-RTase verwendet wurde. E. coli-DNA-Polymerase, E. co/i-RNase/E. co/i-DNA-Ligase-Mischung und T4-DNA-Polymerase wurden zu dieser Reaktionslösung hinzugefügt, um Synthese der doppelsträngigen cDNA und glatte Terminalisierung auszuführen. Darauf folgte die Ligation zwischen dieser doppelsträngigen cDNA und dem EcoRl-NotI-BamHI-Adaptor (Takara Shuzo Co. Ltd.). Die DNA wurde ligiert, phosphoryliert und mit XhoI aufgeschlossen. Die niedermolekulare DNA wurde durch die Spinnsäule (Takara Shuzo Co. Ltd.) entfernt, und λZapII (EcoRI-XhoI-Aufschluss) und Ligation wurden ausgeführt. Danach erfolgte die Verpackung mit dem In-vitro-Verpackungskit (Stratagene Inc.), wodurch eine cDNA-Bibliothek (hiernach als „cDNA-Bibliothek" (A) bezeichnet) erhalten wurde.
Beispiel 1

1) 23 g feuchte Bakterienzellen des Stammes Penicillium citrinum IFO 4631, die unter den gleichen Bedingungen wie die des Vergleichsbeispiels 1 hergestellt worden waren, wurden in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) aufgeschlämmt und mit einer Dynomill aufgeschlossen (hergestellt von Symal Enterprise Inc., Glasperle 0,1 bis 0,2 mm Durchmesser, 3000 U/min während 30 min). Die in diesem Schritt gewonnene, aufgeschlossene Lösung wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen (10 000 g während 10 min). Der Überstand wurde weiter einer Ultrazentrifugierung unterworfen (100 000 g während 120 min), um 160 ml des ultrazentrifugierten Überstandes zu liefern.

Ammoniumsulfat wurde allmählich zu 160 ml des im zuvor erwähnten Schritt gewonnenen, ultrazentrifugierten Überstandes hinzugefügt, bis die Konzentration 1,5 M erreichte. Dann wurde die Lösung auf eine Säule für hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie [Hi-Load Phenyl (26/10), hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech, die mit Bis-Tris-Propanpuffer (20 mM, pH 7,0) ins Gleichgewicht gebracht worden war, der 1,5 M Ammoniumsulfat enthielt] gegeben und mit Bis-Tris-Propanpuffer als mobiler Phase, die Ammoniumsulfat enthielt (Konzentrationsgradient des Ammoniumsulfats: 1,5 M → 0,6 M), eluiert. So wurden 20 ml einer eluierten Fraktion mit einer Ammonium sulfatkonzentration von 1,1 bis 0,9 M als eine Fraktion gewonnen, die eine reduzierende Enzymaktivität besitzt.
Die eluierte Fraktion wurde einer Entsalzung unterworfen und mit Tris-HCl-Pufferlösung (20 mM, pH 7,7) ersetzt, dann auf eine Ionentauscher-Chromatographiesäule [Hi-Load Q-Sepharose (16(10), hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech] gegeben, die mit Tris-HCl-Pufferlösung (20 mM, pH 7,7) gepuffert war. Natriumchloridhaltige Tris-HCl-Pufferlösung (Konzentrationsgradient des Natriumchlorids: 0 → 0,5 M) wurde als eine mobile Phase zum Eluieren verwendet. Sc wurden 3 ml einer Fraktion, die Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,02 bis 0,08 M enthielt, als eine Fraktion gewonnen, die reduzierende Enzymaktivität besitzt. Die Fraktion wurde aufkonzentriert, und die aufkonzentrierte Lösung wurde einer Gelfiltration unterworfen (Säule: Superdex 200 (10/30) (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech); mobile Phase: Bis-Tris-Propanpuffer (20 mM, pH 7,0)). So wurde 1 ml einer Fraktion, die einem Molekulargewicht von etwa 33 000 Dalton entsprach (hiernach als „aktive Fraktion (A)" bezeichnet) als eine Fraktion gewonnen, die eine reduzierende Enzymaktivität besass.
Die reduzierende Enzymaktivität der durch Chromatographie oder dergleichen gewonnenen Fraktion wurde gemäss den folgenden Schritten gemessen.
Die durch die Chromatographie gewonnene, eluierte Fraktion wurde zu 0,9 ml Phosphorsäurepufferlösung (20 mM, pH 7,0) hinzugefügt, die Methyl-4-brom-3-oxobutanoat (1,56 mg/ml) und NADPH (0,226 mg/ml) enthielt, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu liefern. Danach wurde sie während 20 Sekunden bei 37 °C gehalten, die Extinktion wurde bei 340 nm gemessen. Der NADPH-Verbrauch wurde aus der Extinktion bei 340 nm berechnet, wodurch die reduzierende Enzymaktivität der Fraktion wiedergewonnen wurde.

2) Die in dem zuvor erwähnten Schritt gewonnene aktive Fraktion (A) wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach dem Verfahren unterworfen, das bei „Laemmli, U.K., Nature, (1970) 227 680" beschrieben wird. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit einer Anfärbelösung, Coomassie-Brillantblau G250 (hergestellt von BioRad Inc.), angefärbt, und das Gel auf dem angefärbten Anteil wurde herausgeschnitten. Dieses Gel wurde einer reduktiven Alkylierung mit Dithiothreit und Acetamid-Iodid unterworfen. Nach der Trypsinbehandlung wurde ein Peptid aus dem Gel extrahiert. Das extrahierte Peptid wurde durch HPLC (Säule: TSK-Gel ODS-80 = Ts, 2,0 mm × 250 mm (Toso Co. Ltd.), mobile Phase: Konzentrationsgradient von 0,1% wässrigem Trifluoracetat/Acetonitril = 100 : 0 → 20 : 80) fraktioniert. Ein Proteinsequenzer (494cLC) wurde verwendet, um unter Verwendung der fünf Fraktionen die Aminosäuresequenzen zu bestimmen, die TOS-MS zufolge hochrein befunden wurden.

Die ermittelten Aminosäuresequenzen werden in SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 und 7 gezeigt.

3) Die Oligonucleotidprimer von SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13 und 14 wurden auf der Grundlage der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 synthetisiert.

PCR wurde ausgeführt, indem jeweils einer der Oligonucleotidprimer von SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13 und 14 sowie ein SK-Oligonucleotidprimer (von Stratagene) als ein Primer und die zuvor erwähnte cDNA(A) als eine Schablone unter den folgenden Reaktionsbedingungen in der Reaktionslösung verwendet wurden, die die folgende Zusammensetzung besass. (Ein von Roche Diagnostics hergestelltes Expand High-Fidelity PCR-System wurde verwendet.) Zusammensetzung der Reaktionslösung:

cDNA-Bibliothek, Vorratslösung	1 μl
dNTP (Mischung mit je 2,5 mM)	0,4 μl
Primer (20 pmol/μl)	Je 0,75 μl
10x-Puffer (mit MgCl)	5 μl
enz. Expand HiFi (3,5 × 10³ E/ml)	0,375 μl
Deionisiertes Wasser	41,725 μl

Reaktionsbedingungen
Das Reaktionsgefäss, das die Reaktionslösung der zuvor erwähnten Zusammensetzung enthielt, wurde in das Perkin-Elmer-GeneAmp-PCR-System 2400 gesetzt und auf 97 °C erhitzt (während 2 min). Dann wurde ein Zyklus von 97 °C (0,25 min) –450 °C (0,5 min) → 72 °C (1,5 min) zehnmal, ein Zyklus von 97 °C (0,25 min) → 55 °C (0,5 min) → 72 °C (2,5 min) zwanzigmal wiederholt und das Gefäss während 7 min bei 72 °C gehalten.
Danach wurde ein Anteil der PCR-Reaktionslösung einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen, und eine Bande eines DNA-Fragments von etwa 740 bp wurde für die folgenden Fälle nachgewiesen: der Oligonucleotidprimer, der die Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 10 enthält, und der SK-Oligonucleotidprimer wurden als Primer verwendet; der Oligonucleotidprimer, der die Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 12 enthält, und der SK-Oligonucleotidprimer wurden als Primer verwendet; und der Oligonucleotid- Primer, der die Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 14 enthält, und der SK-Oligonucleotidprimer wurden als Primer verwendet.
Unter Verwendung jeder PCR-Reaktionslösung, für die die Bande eines DNA-Fragments von etwa 740 bp nachgewiesen wurde, wurde jedes der zuvor erwähnten DNA-Fragmente von etwa 740 bp mit der existierenden „PCR-Produkt-Einfügungsstelle" des pCR2.1-TOPO-Vektors ligiert (wobei ein von Invitrogen hergestellter TOPO^TM-TA-Klonierkit verwendet wurde). E. coli DH5α wurde mit der gewonnenen Ligationslösung transformiert. 30 μl einer wässrigen, 4-%igen Lösung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (hiernach als „X-gal" bezeichnet) und 30 μl 0,1 M IPTG wurden auf das LB-Agarmedium (1% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt und 1% Natriumchlorid) aufgebracht, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt. Es wurde mit dem gewonnenen Transformanten inokuliert und inkubiert. Von den gebildeten Kolonien wurde jede weisse aufgenommen und ein sterilisiertes LB-Medium (2 ml), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, damit inokuliert. Es wurde in einem Prüfröhrchen unter Schütteln inkubiert (bei 30 °C während 24 Stunden). Plasmid wurde unter Verwendung des QlAprep Spin Miniprep Kits (hergestellt von Qiagen) aus allen kultivierten Bakterienzellen hergestellt.
Das Plasmid, das aus dem DNA-Fragment abgeleitet wurde, das durch PCR unter Verwendung des Oligonucleotidprimers von SEQ ID NO: 10 und des SK-Oligonucleotidprimers als Primer gewonnen wurde, wird hiernach als „p27-1" beschrieben werden; das Plasmid, das aus dem DNA-Fragment abgeleitet wurde, das duch PCR unter Verwendung des Oligonucleotidprimers von SEQ ID NO: 12 und des SK-Oligonucleotidprimers als Primer gewonnen wurde, wird als „p27-2" beschrieben werden; und das Plasmid, das aus dem DNA-Fragment abgeleitet wurde, das durch PCR unter Verwendung des Oligonucleotidprimers von SEQ ID NO: 14 und des SK-Oligonucleotidprimers gewonnen wurde, wird als „p27-3" beschrieben werden.
Die Polynucleotidsequenz des in jedes der Plasmide p27-1, p27-2 und p27-3 eingefügten DNA-Fragments wurde analysiert, und es wurde gefunden, dass die Polynucleotidsequenzen der eingefügten DNA-Fragmente bis auf die Primersequenzanteile identisch sind.
Die Polynucleotidsequenz des in das Plasmid p27-1 eingefügten DNA-Fragments wird in SEQ ID NO: 15 gezeigt.
Die Analyse der Polynucleotidsequenz des in das Plasmid eingefügten DNA-Fragments erfolgte wie folgt. Eine Sequenzreaktion wurde mit jedem als Schablone verwendeten Plasmid gemäss Dye Terminator Cycle Sequence FS Ready Reaction Kit (von Perkin Elmer) ausgeführt, und die Polynucleotidsequenz der gewonnenen DNA wurde mit dem DNA-Sequenzer 373A (von Perkin Elmer) analysiert.

4) Oligonucleotidprimer, die die Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 16 oder 17 enthielten, wurden auf der Grundlage der Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 15 synthetisiert.

PCR wurde unter den folgenden Reaktionsbedingungen in der Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung ausgeführt, indem die Oligonucleotidprimer, die SEQ ID NO: 16 enthielten, und die SK-Oligonucleotidprimer (von Stratagene) oder der Oligonucleotidprimer von SEQ ID NO: 17 und der T7-Oligonucleotidprimer (von Stratagene) als ein Primer und die zuvor erwähnte cDNA(A) als eine Schablone verwendet wurden. (Ein Expand High-Fidelity PCR-System von Roche Diagnostics wurde verwendet.) Zusammensetzung der Reaktionslösung:

Reaktionsbedingungen
Das Reaktionsgefäss, das die Reaktionslösung der zuvor erwähnten Zusammensetzung enthielt, wurde in das Perkin-Elmer-GeneAmp-PCR-System 2400 gesetzt und auf 97 °C erhitzt (während 2 min). Dann wurde ein Zyklus von 97 °C (0,25 min) 55 °C (0,5 min) → 72 °C (1,5 min) zehnmal, ein Zyklus von 97 °C (0,25 min) → 55 °C (0,5 min) → 72 °C (2,5 min) zwanzigmal wiederholt. Weiter wurde es während 7 min bei 72 °C gehalten.
Danach wurde ein Anteil der PCR-Reaktionslösung einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Eine Bande eines DNA-Fragments von etwa 350 bp wurde nachgewiesen, wenn der Oligonucleotidprimer, der die Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 16 enthielt, und der SK-Oligonucleotidprimer als Primer verwendet wurden. Eine Bande eines DNA-Fragments von etwa 650 bp wurde nachgewiesen, wenn der Oligonucleotidprimer, der die Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 17 enthielt, und der T7-Oligonucleotidprimer als ein Primer verwendet wurden.
Unter Verwendung der PCR-Reaktionslösung, die das DNA-Fragment von etwa 350 bp enthielt, das in der zuvor erwähnten PCR gewonnen wurde, oder der PCR-Reaktionslbsung, die das DNA-Fragment von etwa 650 bp enthielt, wurden das zuvor erwähnte DNA-Fragment von etwa 350 bp und das DNA-Fragment von etwa 650 bp mit der existierenden „PCR-Produkt-Einfügestelle" des pCR2.1-TOPO-Vektors ligiert (wobei ein TOPO^TM-TA-Klonierkit von Invitrogen verwendet wurde). E. coli DH5α wurde mit der gewonnenen Ligationslösung transformiert. 30 μl einer wässrigen, 4-%igen Lösung von X-gal und 30 μl 0,1 M IPTG wurden auf das LB-Agarmedium aufgebracht, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt. Es wurde mit dem gewonnenen Transformanten inokuliert und inkubiert. Von den gebildeten Kolonien wurde jede weisse aufgenommen und ein sterilisiertes LB-Medium (2 ml), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, damit inokuliert. Es wurde in einem Prüfröhrchen unter Schütteln inkubiert (bei 30 °C während 24 Stunden). Plasmid wurde unter Verwendung des QlAprep Spin Miniprep Kits (von Qiagen) aus allen kultivierten Bakterienzellen hergestellt.
Das Plasmid, das aus dem DNA-Fragment abgeleitet wurde, das durch PCR unter Verwendung des Oligonucleotidprimers von SEQ ID NO: 16 und des SK-Oligonucleotidprimers als Primer gewonnen wurde, wird hiernach als Plasmid pBR-1 bezeichnet werden; und das Plasmid, das aus dem DNA-Fragment abgeleitet wurde, das durch PCR unter Verwendung des Oligonucleotidprimers von SEQ ID NO: 17 und des T7-Oligonucleotidprimers als Primer gewonnen wurde, wird als pBR-2 bezeichnet werden.
Die Polynucleotidsequenz des in jedes der Plasmide pBR-1 und pBR-2 eingefügten DNA-Fragments wurde analysiert. Die Polynucleotidsequenz des in das Plasmid pBR-1 eingefügten DNA-Fragments wird in SEQ ID NO: 18 gezeigt. Die Polynucleotidsequenz des in das Plasmid pBR-2 eingefügten DNA-Fragments wird in SEQ ID NO: 19 gezeigt.
Die Analyse der Polynucleotidsequenz des in das Plasmid eingefügten DNA-Fragments erfolgte wie folgt. Eine Sequenzreaktion wurde mit jedem als eine Schablone verwendeten Plasmid gemäss Dye Terminator Cycle Sequence FS Ready Reaction Kit (von Perkin Elmer) ausgeführt, und die Polynucleotidsequenz der gewonnenen DNA wurde mit dem DNA-Sequenzer 373A (von Perkin Elmer) analysiert.

5) Ein Oligonucleotidprimer von SEQ ID NO: 20 wurde auf der Grundlage der Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 15 synthetisiert. Ein Oligonucleotidprimer von SEQ ID NO: 21 wurde auf der Grundlage der Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 19 synthetisiert.

PCR wurde mit der folgenden Zusammensetzung der Reaktionslösung und unter den folgenden Reaktionsbedingungen ausgeführt, indem der Oligonucleotidprimer von SEQ ID NO: 20 und der Oligonucleotidprimer von SEQ ID NO: 21 als Primer und die zuvor erwähnte cDNA-Bibliothek (A) als eine Schablone verwendet wurden. (Ein Expand High-Fidelity PCR-System von Roche Diagnostics wurde verwendet.) Zusammensetzung der Reaktionslösung:

Reaktionsbedingungen
Das Reaktionsgefäss, das die Reaktionslösung der zuvor erwähnten Zusammensetzung enthielt, wurde in das Perkin-Elmer-GeneAmp-PCR-System 2400 gesetzt und auf 97 °C erhitzt (während 2 min). Dann wurde ein Zyklus von 97 °C (0,25 min) → 55 °C (0,5 min) → 72 °C (1,5 min) zehnmal, ein Zyklus von 97 °C (0,25 min) 55 °C (0,5 min) → 72 °C (2,5 min) zwanzigmal wiederholt. Weiter wurde es während 7 min bei 72 °C gehalten.
Danach wurde ein Anteil der PCR-Reaktionslösung einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Eine Bande eines DNA-Fragments von etwa 400 bp wurde nachgewiesen.
Unter Verwendung der PCR-Reaktionslösungen, die das DNA-Fragment von etwa 400 bp enthielten, das in der zuvor erwähnten PCR gewonnen worden war, wurde mit der existierenden „PCR-Produkt-Einfügestelle" des pCR2.1-TOPO-Vektors ligiert (wobei ein TOPO^TM-TA-Klonierkit von Invitrogen verwendet wurde). Die gewonnene Ligationslösung wurde verwendet, um E. coli DH5α zu transformieren.
30 μl einer wässrigen, 4-%igen Lösung von X-gal und 30 μl 0,1 M IPTG wurden auf das LB-Agarmedium aufgebracht, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt. Es wurde mit dem gewonnenen Transformanten inokuliert und inkubiert. Von den gebildeten Kolonien wurde jede weisse aufgenommen und ein sterilisiertes LB-Medium (2 ml), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, damit inokuliert. Es wurde in einem Prüfröhrchen unter Schütteln inkubiert (bei 30 °C während 24 Stunden). Plasmid wurde unter Verwendung des QlAprep Spin Miniprep Kits (von Qiagen) aus allen kultivierten Bakterienzellen hergestellt. (Hiernach wird dies als Plasmidplasmid pBR-3 beschrieben werden.)
Die Polynucleotidsequenz des in jedes des Plasmids pBR-3 eingefügten DNA-Fragments wurde analysiert. Die Polynucleotidsequenz des in das Plasmid pBR-3 eingefügten DNA-Fragments wird in SEQ ID NO: 22 gezeigt.
Die Analyse der Polynucleotidsequenz des in das Plasmid eingefügten DNA-Fragments erfolgte wie folgt. Eine Sequenzreaktion wurde mit dem Dye Terminator Cycle Sequence FS Ready Reaction Kit (von Perkin Elmer) und Plasmid pBR-3 als einer Schablone ausgeführt, und die Polynucleotidsequenz der gewonnenen DNA wurde mit dem DNA-Sequenzer 373A (von Perkin Elmer) analysiert.
Eine OLR-Suche wurde auf der Grundlage der SEQ ID NO: 18, 19 und 22 ausgeführt, um die Polynucleotidsequenz (SEQ ID NO: 28) des Gens zu bestimmen, das für das Protein kodiert, das in der Lage ist, durch asymmetrische Reduktion von Methyl-4-brom-3-oxobutanoat, das im Stamm Penicillium citrinum IFO4631 enthalten ist, bevorzugt Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoat zu erzeugen. Des Weiteren wurde auf der Grundlage der Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 28 die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 des Proteins bestimmt. Ein Vergleich zwischen SEQ ID NO: 1 und den SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 und 7 zeigte, dass die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 und 7 fast mit einem Teil der Aminosäuresequenz von SEQ NO: 1 zusammenfallen.
Beispiel 2

1) Der Oligonucleotidprimer von SEQ ID NO: 23 wurde auf der Grundlage der Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 18 synthetisiert, derjenige von SEQ ID NO: 24 wurde auf der Grundlage der Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 19 synthetisiert.

PCR wurde mit der folgenden Zusammensetzung der Reaktionslösung und den folgenden Reaktionsbedingungen ausgeführt, indem die Oligonucleotidprimer, die die Polynucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 23 und 24 enthielten, als Primer und die zuvor erwähnte cDNA (A) als eine Schablone verwendet wurden. (Ein Expand High-Fidelity PCR-System von Roche Diagnostics wurde verwendet.) Zusammensetzung der Reaktionslösung:

Reaktionsbedingungen
Das Gefäss, das die Reaktionslösung der zuvor erwähnten Zusammensetzung enthielt, wurde in das Perkin-Elmer-GeneAmp-PCR-System 2400 gesetzt und auf 97 °C erhitzt (während 2 min). Dann wurde der Zyklus von 97 °C (0,25 min) → 55 °C (0,5 min) → 72 °C (1,5 min) zehnmal, der Zyklus von 97 °C (0,25 min) → 55 °C (0,5 min) → 72 °C (2,5 min) zwanzigmal wiederholt. Weiter wurde es während 7 min bei 72 °C gehalten.
Danach wurde ein Anteil der PCR-Reaktionslösung einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Eine Bande eines DNA-Fragments von etwa 1000 bp wurde nachgewiesen.
Zwei Typen von Restriktionsenzym (NcoI und BamHI) wurden zur verbleibenden PCR-Reaktionslösung hinzugefügt, und das DNA-Fragment von etwa 1000 bp wurde einem doppelten Aufschluss unterworfen, gefolgt von Reinigung des enzym-aufgeschlossenen DNA-Fragments.
Der Plasmidvektor pTV118N (Takara Shuzo Co. Ltd.) wurde durch zwei Typen von Restriktionsenzym (NcoI und BamHI) aufgeschlossen, und die aufgeschlossenen DNA-Fragmente wurden dann gereinigt.
Die dem Enzymaufschluss unterworfenen DNA-Fragmente wurden vermischt und durch T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli DH5α wurde durch die im obigen Schritt gewonnene Ligationslösung transformiert.
Der gewonnene Transformant wurde in einem LB-Agarmedium kultiviert, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt. Sechs von den gewachsenen Kolonien wurden willkürlich ausgewählt. Das sterilisierte LB-Medium (2 ml), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wurde mit diesen ausgewählten Kolonien inokuliert. Unter Schütteln wurde es in einem Prüfröhrchen inkubiert (während 24 Stunden bei 30 °C). Von jeder kultivierten Bakterienzelle wurde mit dem QlAprep Spin Miniprep Kit (von Qiagen) ein Plasmid hergestellt. Ein Anteil des im obigen Schritt gewonnenen Plasmids wurde mittels zweier Typen von Restriktionsenzym einem doppelten Aufschluss unterworfen. Dann wurde Elektrophorese ausgeführt, und es wurde überprüft, dass alle Plasmide etwa 1000 bp der zuvor erwähnten DNA-Fragmente eingefügt enthielten. (Dieses Plasmid wird hiernach als Plasmid pTRPc beschrieben werden.)

2) E. coli HB101 wurde durch Plasmid pTRPc transformiert. Ein sterilisiertes LB-Medium (100 ml), das 0,1 mM IPTG und 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wurde mit dem gewonnenen Transformanten inokuliert und unter Schütteln (während 12 Stunden bei 30 °C) kultiviert. Die gewonnene Kultivierungslösung wurde einer zentrifugalen Auftrennung unterworfen, um 0,4 g feuchter Bakterienzellen zu gewinnen. 300 mg Methyl-4-brom-3-oxobutanoat, 0,4 g der zuvor erwähnten feuchten Bakterienzellen, 9 mg NADP⁺, 750 mg Glucose, 1,2 mg Glucose-Dehydrogenase (von Amano Pharmaceutical Co. Ltd.), 15 ml 100 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,5) und 15 ml Butylacetat wurden vermischt und während 7 Stunden bei 30 °C gerührt. Während des Rührens wurde eine wässrige 2 M Natriumcarbonatlösung allmählich hinzugefügt, so dass der pH-Wert der Reaktionslösung im Bereich von 6,5 ± 0,2 gehalten wurde. Dann wurde die Reaktionslösung einer zentrifugalen Auftrennung unterworfen, um eine organische Schicht zu liefern. Diese organische Schicht wurde einer Gehaltsanalyse durch Gaschromatographie unter den unten angegebenen Bedingungen unterworfen. Es wurde gefunden, dass Methyl-4-brom-3-hydroxybutanoat in einer Ausbeute von 98,5%, bezogen auf das für die Reaktion verwendete Methyl-4-brom-3-oxobutanoat, gewonnen wurde. Die optische Reinheit des Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoats in der organischen Schicht wurde unter den unten angegebenen Bedingungen gemessen und zu 96,1% e.e. gefunden. Diese organische Schicht wurde aufkonzentriert, um rohes Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoat zu erhalten.

Gehaltsanalysebedingungen

Säule: HR-20M (0,53 mm × 30 m, 1 μm) (von Shinwa Kako Co. Ltd.)
Säulentemperatur: 120 °C (5 min) → 3 °C → 150 °C (5 min) → 10 °C/min → 200 °C (5 min)
Trägergas: Helium (Strömungsgeschwindigkeit: 20 ml/min)
Detektor: FID
Bedingungen für die Messung der optischen Reinheit
Säule: G-TA (0,25 cm × 30 m, 0,125 μm) (by Astech Ltd.)
Säulentemperatur: 11000(20 min) → 5 °C/min → 180 °C (1 min).
Trägergas: Helium (Strömungsgeschwindigkeit: 1 ml/min).
Detektor: FID
Splitverhältnis: 1/50

Die absolute Konfiguration des Produkts wurde durch Vergleich mit einem echten Muster von Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoat bestimmt.
Beispiel 3

1) Plasmid pTRPc wurde einem doppelten Aufschluss vermittels zweier Typen von Restriktionsenzym (NcoI und BamHI) unterworfen, und die anfallenden DNA-Fragmente wurden gereinigt. Plasmid pTrc99A (von Pharmacia) wurde einem doppelten Aufschluss vermittels zweier Typen von Restriktionsenzym (NcoI und BamHI) unterworfen, und die anfallenden DNA-Fragmente wurden gereinigt.

Die aufgeschlossenen DNA-Fragmente wurden vermischt und durch T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli DH5α wurde durch die im obigen Schritt gewonnene Ligationslösung transformiert.
Der gewonnene Transformant wurde auf einem LB-Medium kultiviert, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt. Sechs von den gewachsenen Kolonien wurden willkürlich ausgewählt. Das sterilisierte LB-Medium (2 ml), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wurde mit diesen ausgewählten Kolonien inokuliert. Es wurde unter Schütteln in einem Prüfröhrchen inkubiert (während 24 Stunden bei 30 °C).
Plasmide wurden mit dem QlAprep Spin Miniprep Kit (von Qiagen) aus jeder kultivierten Bakterienzelle hergestellt. Ein Anteil des im obigen Schritt aufgelesenen Plasmids wurde einem doppelten Aufschluss vermittels zweier Typen von Restriktionsenzym (NcoI und BamHI) unterworfen. Dann wurde Elektrophorese ausgeführt, und es wurde überprüft, dass alle Plasmide die zuvor erwähnten DNA-Fragmente von etwa 1000 bp eingefügt enthielten. (Dieses Plasmid wird hiernach als Plasmid pTrcRPc beschrieben werden.)

2) E. coli HB101 wurde durch Plasmid pTrcRPc transformiert. Der gewonnene Transformant wurde in einem sterilisierten LB-Medium (100 ml), das 0,1 mM IPTG und 50 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert. Das Medium wurde unter Schütteln inkubiert (12 Stunden bei 30 °C). Die gewonnene Kultivierungslösung wurde einer zentrifugalen Auftrennung unterworfen, um 0,4 g feuchter Bakterienzellen zu ergeben.

1500 mg Methyl-4-brom-3-oxobutanoat, 0,4 g der zuvor erwähnten feuchten Bakterienzellen, 18 mg NADP⁺, 3000 mg Glucose, 3 mg Glucose-Dehydrogenase (von Amano Pharmaceutical Co. Ltd.), 15 ml 100 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,5) und 15 ml Butylacetat wurden vermischt und während 7 Stunden bei 30 °C gerührt. Während des Rührens wurde eine wässrige 2 M Natriumcarbonatlösung allmählich hinzugefügt, so dass der pH-Wert der Reaktionslösung im Bereich von 6,5 ± 0,2 gehalten wurde. Dann wurde die Reaktionslösung einer zentrifugalen Auftrennung unterworfen, um eine organische Schicht zu ergeben. Diese organische Schicht wurde einer Gehaltsanalyse unter den in Beispiel 2 angegebenen Bedingungen unterworfen. Es wurde gefunden, dass Methyl-4-brom-3-hydroxybutanoat in einer Ausbeute von 99,2%, bezogen auf das verbrauchte Methyl-4-brom-3-oxobutanoat, gewonnen wurde. Die optische Reinheit des Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoats in der organischen Schicht wurde unter den in Beispiel 2 angegebenen Bedingungen gemessen und zu 95,7% e.e. gefunden.
Diese organische Schicht wurde weiter aufkonzentriert, um rohes Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoat zu erhalten.
Beispiel 4

1) Bacillus megaterium, Stamm IFO 12108, wurde in einem sterilisierten LB-Medium kultiviert, wodurch 0,4 g Bakterienzellen gewonnen wurden. Aus diesen Bakterienzellen wurde chromosomale DNA (hierunter als „Chromosom-DNA (B)" bezeichnet) mit dem Qiagen Genomic-tip (von Qiagen) nach dem Verfahren gereinigt, das in der dort beigegebenen Anleitung beschrieben wird.
2) Die Oligonucleotidprimer von SEQ ID NO: 25 und 26 wurden auf der Grundlage der Polynucleotidsequenz der Glucose-Dehydrogenase synthetisiert, die von Bacillus megaterium IWG3 abgeleitet ist, wie im Journal of Biological Chemistry, Band 264, Nr. 11, 6381–6385 (1989) beschrieben.

PCR wurde in der Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung und unter den folgenden Reaktionsbedingungen ausgeführt, indem die Primer von SEQ ID NO: 25 und 26 als Primer und die zuvor erwähnte DNA (B) als eine Schablone verwendet wurden. (Ein Expand High-Fidelity PCR-System von Roche Diagnostics wurde verwendet.) Zusammensetzung der Reaktionslösung:

Chromosom-DNA-Vorratslösung	1 μl
dNTP (Mischung mit je 2,5 mM)	0,4 μl
Primer (20 pmol/μl)	Je 0,75 μl
10x-Puffer (mit MgCl)	5 μl
enz. Expand HiFi (3,5 × 10³ E/ml)	0,375 μl
Deionisiertes Wasser	41,725 μl

Reaktionsbedingungen
Das Reaktionsgefäss, das die Reaktionslösung der zuvor erwähnten Zusammensetzung enthielt, wurde in das Perkin-Elmer-GeneAmp-PCR-System 2400 gesetzt und auf 97 °C erhitzt (während 2 min). Dann wurde der Zyklus von 97 °C (0,25 min) → 55 °C (0,5 min) → 72 °C (1,5 min) zehnmal, der Zyklus von 9700(0,25 min) → 55 °C (0,5 min) → 72 °C (2,5 min) zwanzigmal wiederholt. Weiter wurde es während 7 min bei 72 °C gehalten.
Danach wurde ein Anteil der PCR-Reaktionslösung einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Eine Bande eines DNA-Fragments von etwa 950 bp wurde nachgewiesen.
Unter Verwendung der im obigen Schritt gewonnenen PCR-Reaktionslösungen und des TOPO^TM-TA-Klonierkits von Invitrogen wurde das DNA-Fragment von etwa 950 bp, das in der zuvor erwähnten PCR gewonnen worden war, mit der existierenden „PCR-Produkt-Einfügestelle" des pCR2.1-TOPO-Vektors ligiert. Die gewonnene Ligationslösung wurde verwendet, um E. coli DH5α zu transformieren.
30 μl einer wässrigen, 4-%igen Lösung von X-gal und 30 μl 0,1 M IPTG wurden auf das LB-Agarmedium aufgebracht, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt. Es wurde mit dem gewonnenen Transformanten inokuliert und inkubiert. Von den gebildeten Kolonien wurde eine weisse Kolonie aufgenommen und ein sterilisiertes LB-Medium (2 ml), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, damit inokuliert. Es wurde in einem Prüfröhrchen unter Schütteln inkubiert (bei 30 °C während 24 Stunden). Ein Plasmid wurde unter Verwendung des QlAprep Spin Miniprep Kits (von Qiagen) aus den kultivierten Bakterienzellen hergestellt. Ein Anteil des im obigen Schritt hergestellten Plasmids wurde mit einem Restriktionsenzym (EcoRI) aufgeschlossen. Dann wurde Elektrophorese ausgeführt, und es zeigte sich, dass das Plasmid das zuvor erwähnte DNA-Fragment von etwa 950 bp eingefügt enthält. (Dieses Plasmid wird hiernach als Plasmid pSDGDH12 beschrieben werden.) Die Polynucleotidsequenz des in das Plasmid pSDGDH12 eingefügten DNA-Fragments wurde analysiert. Das Ergebnis wird in SEQ ID NO: 27 gezeigt.
Die Analyse der Polynucleotidsequenz des in das Plasmid eingefügten DNA-Fragments erfolgte wie folgt. Eine Sequenzreaktion wurde mit dem Dye Terminator Cycle Sequence FS Ready Reaction Kit (von Perkin Elmer) und dem Plasmid pSDGDH12 als einer Schablone ausgeführt, und die Polynucleotidsequenz der gewonnenen DNA wurde mit dem DNA-Sequenzer 373A (von Perkin Elmer) analysiert.

3) Plasmid pSDGDH12 wurde einem doppelten Aufschluss vermittels zweier Typen von Restriktionsenzym (BamHI und XbaI) unterworfen, und die anfallenden DNA-Fragmente wurden gereinigt.

Plasmid pTrcRPc wurde einem doppelten Aufschluss vermittels zweier Typen von Restriktionsenzym (BamHI und XbaI) unterworfen, und die anfallenden DNA-Fragmente wurden gereinigt.
Jedes der aufgeschlossenen DNA-Fragmente wurde durch T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli DH5α wurde durch die im obigen Schritt gewonnene Ligationslösung transformiert. Der gewonnene Transformant wurde auf einem LB-Medium kultiviert, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt. Sechs von den gewachsenen Kolonien wurden willkürlich ausgewählt. Das sterilisierte LB-Medium (2 ml), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wurde mit diesen ausgewählten Kolonien inokuliert. Es wurde unter Schütteln in einem Prüfröhrchen inkubiert (während 24 Stunden bei 30 °C). Plasmid wurde mit dem QlAprep Spin Miniprep Kit (von Qiagen) aus allen kultivierten Bakterienzellen hergestellt. Ein Anteil des im obigen Schritt hergestellten Plasmids wurde einem doppelten Aufschluss vermittels zweier Typen von Restriktionsenzym (BamHI und XbaI) unterworfen. Dann wurde Elektrophorese ausgeführt, und es zeigte sich, dass alle Plasmide die eingefügten DNA-Fragmente von etwa 1000 bp enthielten. (Dieses Plasmid wird hiernach als Plasmid pTrcRSbG12 beschrieben werden.)

4) Plasmid pTrcRSbG12 wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren. Ein sterilisiertes LB-Medium (100 ml), das 0,1 mM IPTG und 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wurde mit dem gewonnenen Transformanten inokuliert. Es wurde unter Schütteln inkubiert (12 Stunden bei 30 °C). Die inkubierte Lösung wurde einer zentrifugalen Auftrennung unterworfen, um 0,3 g feuchter Bakterienzellen zu gewinnen.

0,3 g Methyl-4-brom-3-oxobutanoat, 0,3 g der zuvor erwähnten feuchten Bakterienzellen, 9 mg NADP⁺, 750 mg Glucose, 15 ml 100 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,5) und 15 ml Butylacetat wurden vermischt und während 7 Stunden bei 30 °C gerührt. Während des Rührens wurde eine wässrige 2 M Natriumcarbonatlösung allmählich hinzugefügt, so dass der pH-Wert der Reaktionslösung im Bereich von 6,5 ± 0,2 gehalten wurde. Dann wurde die Reaktionslösung einer zentrifugalen Auftrennung unterworfen, um eine organische Schicht zu ergeben. Diese organische Schicht wurde einer Gehaltsanalyse unter den in Beispiel 2 angegebenen Bedingungen unterworfen. Es wurde gefunden, dass Methyl-4-brom-3-hydroxybutanoat in einer Ausbeute von 99%, bezogen auf das verwendete Methyl-4-brom-3-oxobutanoat, erzeugt worden war. Die optische Reinheit des Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoats in der organischen Schicht wurde unter den in Beispiel 2 angegebenen Bedingungen gemessen und zu 96% e.e. gefunden.
Diese organische Schicht wurde weiter aufkonzentriert, um rohes Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoat zu erhalten.
Beispiel 5

1) Der Oligonucleotidprimer von SEQ ID NO: 29 wurde auf der Grundlage der Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 19 synthetisiert.

PCR wurde in der Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung und unter den folgenden Reaktionsbedingungen ausgeführt, indem die Oligonucleotidprimer, die die Polynucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 23 und 29 enthielten, als Primer und das zuvor erwähnte Plasmid pTRPc als eine Schablone verwendet wurden. (Ein Expand High-Fidelity PCR-System von Roche Diagnostics wurde verwendet.) Zusammensetzung der Reaktionslösung:

Plasmid pTRPc-Lösung	1 μl
dNTP (Mischung mit je 2,5 mM)	0,4 μl
Primer (20 pmol/μl)	Je 0,75 μl
10x-Puffer (mit MgCl)	5 μl
enz. Expand HiFi (3,5 × 10³ E/ml)	0,375 μl
Deionisiertes Wasser	41,725 μl

Reaktionsbedingungen
Das Reaktionsgefäss, das die Reaktionslösung der zuvor erwähnten Zusammensetzung enthielt, wurde in das Perkin-Elmer-GeneAmp-PCR-System 2400 gesetzt und auf 97 °C erhitzt (während 2 min). Dann wurde ein Zyklus von 97 °C (0,25 min) → 55 °C (0,5 min) → 72 °C (1,5 min) zehnmal, ein Zyklus von 97 °C (0,25 min) → 55 °C (0,5 min) → 72 °C (2,5 min) zwanzigmal wiederholt. Weiter wurde es während 7 min bei 72 °C gehalten.
Danach wurde ein Anteil der PCR-Reaktionslösung einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Eine Bande eines DNA-Fragments von etwa 1000 bp wurde nachgewiesen. Die verbleibende PCR-Reaktionslösung wurde gereinigt und mit zwei Typen von Restriktionsenzym (NcoI und BamHI) aufgeschlossen, und das DNA-Fragment von etwa 1000 bp wurde einem doppelten Aufschluss unterworfen, gefolgt von einer Reinigung der enzym-aufgeschlossenen DNA-Fragmente.
Der Plasmidvektor pTV118N (Takara Shuzo Co. Ltd.) wurde mit zwei Typen von Restriktionsenzym (NcoI und BamHI) aufgeschlossen, und die aufgeschlossenen DNA-Fragmente wurden dann gereinigt.
Die DNA-Fragmente Aufschluss oben wurden vermischt und mit T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli DH5α wurde durch die im obigen Schritt gewonnene Ligationslösung transformiert.
Der gewonnene Transformant wurde auf einem LB-Agarmedium kultiviert, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt. Sechs von den gewachsenen Kolonien wurden willkürlich ausgewählt. Das sterilisierte LB-Medium (2 ml), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wurde mit diesen ausgewählten Kolonien inokuliert. Unter Schütteln wurde es in einem Prüfröhrchen inkubiert (während 24 Stunden bei 30 °C). Von jeder kultivierten Bakterienzelle wurde mit dem QlAprep Spin Miniprep Kit (von Qiagen) ein Plasmid hergestellt. Ein Anteil des im obigen Schritt hergestellten Plasmids wurde mittels zweier Typen von Restriktionsenzym (NcoI und BamHI) einem doppelten Aufschluss unterworfen. Dann wurde Elektrophorese ausgeführt, und es zeigte sich, dass alle Plasmide die zuvor erwähnten, eingefügten DNA-Fragmente von etwa 1000 bp enthielten. (Dieses Plasmid wird hiernach als Plasmid pTRPcS beschrieben werden.) Die Sequenz des in das Plasmid pTRPcS eingefügten DNA-Fragments wurde analysiert und wird in SEQ ID NO: 30 gezeigt. Die Sequenzanalyse des DNA-Fragments erfolgte durch eine Sequenzreaktion mit dem Dye Terminator Cycle Sequenceing FS Ready Reaction Kit (von Perkin Elmer) und dem Plasmid pTRPcS als einer Schablone, und die gewonnene Polynucleotidsequenz der DNA wurde mit dem DNA-Sequenzer 373A (von Perkin Elmer) analysiert.
2) E. coli HB101 wurde durch Plasmid pTRPcS transformiert. Ein sterilisiertes LB-Medium (100 ml), das 0,1 mM IPTG und 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wurde mit dem gewonnenen Transformanten inokuliert und unter Schütteln (während 12 Stunden bei 30 °C) kultiviert. Die gewonnene Kultivierungslösung wurde einer zentrifugalen Auftrennung unterworfen, um 0,4 g feuchter Bakterienzellen zu gewinnen. 300 mg Methyl-4-brom-3-oxobutanoat, 0,4 g der zuvor erwähnten feuchten Bakterienzellen, 9 mg NADP⁺, 750 mg Glucose, 1,2 mg Glucose-Dehydrogenase (von Amano Pharmaceutical Co. Ltd.), 15 ml 100 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,5) und 15 ml Butylacetat wurden vermischt und während 19 Stunden bei 30 °C gerührt. Während des Rührens wurde eine wässrige 2 M Natriumcarbonatlösung allmählich hinzugefügt, so dass der pH-Wert der Reaktionslösung im Bereich von 6,5 ± 0,2 gehalten wurde. Dann wurde die Reaktionslösung einer zentrifugalen Auftrennung unterworfen, um eine organische Schicht zu ergeben. Diese organische Schicht wurde einer Gehaltsanalyse durch Gaschromatographie wie in Beispiel 2 unterworfen. Es wurde gefunden, dass Methyl-4-brom-3-hydroxybutanoat in einer Ausbeute von 97,3%, bezogen auf das für die Reaktion verwendete Methyl-4-brom-3-oxobutanoat, gewonnen wurde. Die optische Reinheit des Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoats in der organischen Schicht wurde unter den unten angegebenen Bedingungen gemessen und zu 96,5% e.e. gefunden. Diese organische Schicht wurde aufkonzentriert, um rohes Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoat zu erhalten.
Beispiel 6

1) Die Oligonucleotidprimer von SEQ ID NO: 31 und 32 wurden auf der Grundlage der Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 27 synthetisiert.

PCR wurde in der Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung und unter den folgenden Reaktionsbedingungen ausgeführt, indem die Oligonucleotidprimer von SEQ ID NO: 31 und 32 als Primer und die zuvor erwähnte DNA(B) als eine Schablone verwendet wurden. (Ein Expand High-Fidelity PCR-System von Roche Diagnostics wurde verwendet.) Zusammensetzung der Reaktionslösung:

Reaktionsbedingungen
Das Reaktionsgefäss, das die Reaktionslösung der zuvor erwähnten Zusammensetzung enthielt, wurde in das Perkin-Elmer-GeneAmp-PCR-System 2400 gesetzt und auf 97 °C erhitzt (während 2 min). Dann wurde ein Zyklus von 97 °C (0,25 min) → 55 °C (0,5 min) → 72 °C (1,5 min) zehnmal, ein Zyklus von 97 °C (0,25 min) → 55 °C (0,5 min) → 72 °C (2,5 min) zwanzigmal wiederholt. Weiter wurde es während 7 min bei 72 °C gehalten.
Danach wurde ein Anteil der PCR-Reaktionslösung einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Eine Bande eines DNA-Fragments von etwa 850 bp wurde nach gewiesen. Die verbleibende PCR-Reaktionslösung wurde gereinigt und mit zwei Typen von Restriktionsenzym (NcoI und BamHI) aufgeschlossen, und das DNA-Fragment von etwa 850 bp wurde einem doppelten Aufschluss unterworfen, gefolgt von einer Reinigung.
Der Plasmidvektor pTV118N (Takara Shuzo Co. Ltd.) wurde mit zwei Typen von Restriktionsenzym (NcoI und BamHI) aufgeschlossen, und die aufgeschlossenen DNA-Fragmente wurden dann gereinigt.
Die aufgeschlossenen DNA-Fragmente oben wurden vermischt und mit T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli DH5α wurde durch die im obigen Schritt gewonnene Ligationslösung transformiert.
Der gewonnene Transformant wurde in einem LB-Agarmedium kultiviert, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt. Sechs von den gewachsenen Kolonien wurden willkürlich ausgewählt. Das sterilisierte LB-Medium (2 ml), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, wurde mit diesen ausgewählten Kolonien inokuliert. Unter Schütteln wurde es in einem Prüfröhrchen inkubiert (während 24 Stunden bei 30 °C). Von jeder kultivierten Bakterienzelle wurde mit dem QlAprep Spin Miniprep Kit (von Qiagen) ein Plasmid gewonnen. Ein Anteil des im obigen Schritt hergestellten Plasmids wurde mittels zweier Typen von Restriktionsenzym (NcoI und BamHI) einem doppelten Aufschluss unterworfen. Dann wurde Elektrophorese ausgeführt, und es zeigte sich, dass alle Plasmide die zuvor erwähnten, eingefügten DNA-Fragmente von etwa 850 bp enthielten. (Dieses Plasmid wird hiernach als Plasmid pTGDH12 beschrieben werden.)

2) Die Oligonucleotidprimer von SEQ ID NO: 33 wurden auf der Grundlage der Polynucleotidsequenz des Plasmidvektors pTV118N (von Takara Shuzo Co. Ltd.) synthetisiert. Die PCR-Reaktion wurde in der Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung unter den folgenden Reaktionsbedingungen ausgeführt, indem die Oligonucleotidprimer von SEQ ID NO: 32 und 33 als Primer und das Plasmid pTGH12 als eine Schablone verwendet wurden.

Plasmid pTGDH12-Lösung	1 μl
dNTP (Mischung mit je 2,5 mM)	0,4 μl
Primer (20 pmol/μl)	Je 0,75 μl
10x-Puffer (mit MgCl)	5 μl
enz. Expand HiFi (3,5 × 10³ E/ml)	0,375 μl
Deionisiertes Wasser	41,725 μl

Reaktionsbedingungen
Das Reaktionsgefäss, das die Reaktionslösung der zuvor erwähnten Zusammensetzung enthielt, wurde in das Perkin-Elmer-GeneAmp-PCR-System 2400 gesetzt und auf 97 °C erhitzt (während 2 min). Dann wurde ein Zyklus von 97 °C (0,25 min) 55 °C (0,5 min) → 72 °C (1,5 min) zehnmal, ein Zyklus von 97 °C (0,25 min) → 55 °C (0,5 min) → 72 °C (2,5 min) zwanzigmal wiederholt. Weiter wurde es während 7 min bei 72 °C gehalten.
Danach wurde ein Anteil der PCR-Reaktionslösung einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Eine Bande eines DNA-Fragments von etwa 1000 bp wurde nachgewiesen. Unter Verwendung der oben gewonnenen PCR-Reaktionslösung und des TOPO^TM-TA-Klonierkits von VER.Eby Invitrogen Co. Ltd. wurde das gewonnene DNA-Fragment von etwa 1000 bp mit einer existierenden PCR-Produkt-Einfügestelle des pCR2.1-TOPO-Vektors ligiert, und E. coli DH5α wurde mit der Ligationslösung transformiert.
30 μl einer wässrigen, 4-%igen Lösung von X-gal und 30 μl 0,1 M IPTG wurden auf das LB-Agarmedium aufgebracht, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt. Es wurde mit dem gewonnenen Transformanten inokuliert und inkubiert. Von den gebildeten Kolonien wurde eine weisse Kolonie aufgenommen und ein sterilisiertes LB-Medium (2 ml), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, damit inokuliert. Es wurde in einem Prüfröhrchen unter Schütteln inkubiert (bei 30 °C während 24 Stunden). Ein Plasmid wurde unter Verwendung des QlAprep Spin Miniprep Kits (von Qiagen) aus den kultivierten Bakterienzellen hergestellt. Ein Anteil des im obigen Schritt hergestellten Plasmids wurde mit einem Restriktionsenzym (BamHI) aufgeschlossen. Dann wurde Elektrophorese ausgeführt, und es zeigte sich, dass das Plasmid das zuvor erwähnte, eingefügte DNA-Fragment von etwa 1000 bp enthält. (Dieses Plasmid wird hiernach als Plasmid pCGDH12 beschrieben werden.)

3) Plasmid pCGDH12 wurde einem Aufschluss mit Restriktionsenzymen (BamHI) unterworfen, und das anfallende DNA-Fragment von etwa 1000 bp wurde gereinigt.

Plasmidvektor pACYC184 (Nippon Gene Co. Ltd.) wurde einem Aufschluss eines Restriktionsenzyms (BamHI) unterworfen, und die anfallenden DNA-Fragmente wurden gereinigt und weiter mit alkalischer Phosphatase (Takara Shuzo Co. Ltd.) dephosphoryliert, um Selbstligation zu verhindern.
Die aufgeschlossenen DNA-Fragmente oben wurden vermischt und mit T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli DH5α wurde durch die im obigen Schritt gewonnene Ligationslösung transformiert. Der gewonnene Transformant wurde auf einem LB-Agarmedium kultiviert, das 20 μg/ml Chloramphenicol enthielt. Vier von den gewachsenen Kolonien wurden willkürlich ausgewählt. Das sterilisierte LB-Medium (2 ml), das 20 μg/ml Chloramphenicol enthielt, wurde mit diesen ausgewählten Kolonien inokuliert. Unter Schütteln wurde es in einem Prüfröhrchen inkubiert (während 24 Stunden bei 30 °C). Von allen kultivierten Bakterienzellen wurde mit dem QlAprep Spin Miniprep Kit (von Qiagen) ein Plasmid hergestellt. Ein Anteil des im obigen Schritt hergestellten Plasmids wurde einem Aufschluss durch ein Restriktionsenzym (BamHI) unterworfen. Dann wurde Elektrophorese ausgeführt, und es zeigte sich, dass alle Plasmide die eingefügten DNA-Fragmente von etwa 1000 bp enthielten. (Dieses Plasmid wird hiernach als Plasmid pAGDH12 beschrieben werden.)

4) Plasmide pTRPc und pAGDH12 wurden verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren. Ein sterilisiertes LB-Medium (100 ml), das 0,1 mM IPTG und 50 μg/ml Ampicillin sowie 20 μg/ml Chloramphenicol enthielt, wurde mit dem gewonnenen Transformanten inokuliert. Es wurde unter Schütteln (während 18 Stunden bei 30 °C) kultiviert. Die inkubierte Lösung wurde einer zentrifugalen Auftrennung unterworfen, um 0,4 g feuchter Bakterienzellen zu gewinnen.

0,3 g Methyl-4-brom-3-oxobutanoat, 0,4 g der zuvor erwähnten feuchten Bakterienzellen, 9 mg NADP⁺, 750 mg Glucose, 15 ml 100 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,5) und 15 ml Butylacetat wurden vermischt und während 19 Stunden bei 30 °C gerührt. Während des Rührens wurde eine wässrige 2 M Natriumcarbonatlösung allmählich hinzugefügt, so dass der pH-Wert der Reaktionslösung im Bereich von 6,5 ± 0,2 gehalten wurde. Dann wurde die Reaktionslösung einer zentrifugalen Auftrennung unterworfen, um eine organische Schicht zu ergeben. Diese organische Schicht wurde einer Gehaltsanalyse unter den in Beispiel 2 angegebenen Bedingungen unterworfen. Es wurde gefunden, dass Methyl-4-brom-3-hydroxybutanoat in einer Ausbeute von 98,6%, bezogen auf das verwendete Methyl-4-brom-3-oxobutanoat, erzeugt worden war. Die optische Reinheit des Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoats in der organischen Schicht wurde unter den in Beispiel 2 angegebenen Bedingungen gemessen und zu 96,2% e.e. gefunden.
Diese organische Schicht wird weiter aufkonzentriert, um rohes Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoat zu erhalten.
Beispiel 7
100 ml eines sterilisierten Mediums (hergestellt durch Auflösen von 200 g Kartoffelextrakt und 20 g Dextrose in 1 l Wasser) wurden in einen 500-ml-Sakaguchi-Kolben gebracht und mit Zellen von Penicillium citrinum IFO 4631 inokuliert. Die Kultivierung erfolgte bei 30 °C unter aeroben Bedingungen und Schütteln. Die Kultur wurde dann zentrifugiert, um Zellen zu ernten, und die geernteten Zellen wurden in 5 ml Kochsalzlösung aufgeschlämmt. Dieser Zellenaufschlämmung wurden 300 ml kalten Acetons zugegeben, und die Zellen wurden filtriert. Die anfallenden Zellen wurden unter Vakuum getrocknet, um aceton-getrocknete Zellen von Penicillium citrinum IFO 4631 zu erhalten.
Zu 15 mg der oben beschriebenen, aceton-getrockneten Zellen von Penicillium citrinum IFO 4631 wurden 1,5 ml Butylacetat, in denen 15 mg Methyl-4-brom-3-oxobutanoat aufgelöst waren, sowie 1,5 ml 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,5, in dem 75 mg Glucose, 9 mg NADP⁺ und 15 E. von Glucose-Dehydrogenase aufgelöst waren, zugegeben, und das Gemisch wurde während 18 Stunden bei 30 °C geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde dann zentrifugiert, um die organische Schicht abzutrennen. Die organische Schicht wurde mit Gaschromatographie auf den Gehalt analysiert, und es bestätigte sich, dass sich 5,5 mg Methyl-4-brom-3-hydroxybutanoat gebildet hatten.
Analysebedingungen für Gehalt

Säule: HR-20M (0,53 mm × 30 m, 1 μm) (hergestellt von Shinwa Kako Ltd.). Säulentemperatur: 120 °C (5 min) → 3 °C/min → 150 °C (5 min) → 10 °C/min → 200 °C (5 min).
Trägergas: Helium (Strömungsgeschwindigkeit: 20 ml/min).
Detektor: FID.

Dann wurde das durch Aufkonzentrieren der organischen Schicht unter Vakuum isolierte Methyl-4-brom-3-hydroxybutanoat in Dichlormethan aufgelöst, und Trifluoressigsäureanhydrid wurde hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während einer Stunde stehen gelassen. Diese Lösung wurde unter den unten beschriebenen Bedingungen der optischen Isomerenanalyse analysiert, und es wurde ermittelt, dass das anfallende Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoat 98% e. e. war.
Analysebedingungen für optische Isomeren

Säule: Chirasil-DEX CB (0,32 mm × 25 m, 0,25 μm) (hergestellt von Chrompack Ltd.).
Säulentemperatur: 80 °C (20 min) → 7 °C/min → 150 °C (5 min).
Trägergas: Helium (Strömungsgeschwindigkeit: 1,25 ml/min).
Detektor: FID.

In diesem Falle wurde die absolute Konfiguration des Produkts durch Vergleich mit dem echten Muster von Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoat ermittelt.
Beispiel 8
100 ml eines sterilisierten Mediums (hergestellt durch Auflösen von 200 g Kartoffelextrakt und 20 g Dextrose in 1 l Wasser) wurden in einen 500-ml-Sakaguchi-Kolben gebracht und mit Zellen von Cryptococcus humicolus IFO 1527 inokuliert. Die Kultivierung erfolgte bei 30 °C unter aeroben Bedingungen und Schütteln. Die Kultur wurde dann zentrifugiert, um Zellen zu ernten, und die geernteten Zellen wurden in 5 ml Kochsalzlösung aufgeschlämmt. Dieser Zellenaufschlämmung wurden 300 ml kalten Acetons zugegeben, und die Zellen wurden filtriert. Die anfallenden Zellen wurden unter Vakuum getrocknet, um aceton-getrocknete Zellen von Ctyptococcus humicolus IFO 1527 zu erhalten.
Zu 15 mg der aceton-getrockneten Zellen von Cryptococcus humicolus IFO 1527 wurden 1,5 ml Butylacetat, in denen 15 mg Methyl-4-brom-3-oxobutanoat aufgelöst waren, sowie 1,5 ml 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,5, in dem 75 mg Glucose, 9 mg NADP⁺ und 15 E. von Glucose-Dehydrogenase aufgelöst waren, zugegeben, und das Gemisch wurde während 18 Stunden bei 30 °C geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde dann zentrifugiert, um die organische Schicht abzutrennen. Die organische Schicht wurde mit Gaschromatographie auf den Gehalt analysiert, und es bestätigte sich, dass sich 2,0 mg Methyl-4-brom-3-hydroxybutanoat gebildet hatten.
Als Nächstes wurde das durch Aufkonzentrieren der organischen Schicht unter Vakuum isolierte Methyl-4-brom-3-hydroxybutanoat in Dichlormethan aufgelöst, und Trifluoressigsäureanhydrid wurde hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während einer Stunde stehen gelassen. Diese Lösung wurde unter den gleichen Bedingungen der optischen Isomerenanalyse wie in Beispiel 7 analysiert, und es wurde ermittelt, dass das anfallende Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoat 88% e.e. war.
Beispiel 9
100 ml eines sterilisierten Mediums (hergestellt durch Auflösen von 20 g Glucose, 5 g Polypepton, 3 g Hefeextrakt, 3 g Fleischextrakt, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat und 2 g Ammoniumsulfat in 1 l Wasser) wurden in einen 500-ml-Sakaguchi-Kolben gebracht und mit 0,3 ml eines kultivierten Produkts von Bacillus alvei IFO 3343t inokuliert, die in einem Medium der gleichen Zusammensetzung vorkultiviert worden waren. Die Kultivierung erfolgte während zweier Tage bei 30 °C unter Schütteln. Das kultivierte Produkt wurde dann zentrifugiert, um Zellen zu ernten, und die geernteten Zellen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen und dann in 5 ml Kochsalzlösung aufgeschlämmt. Dieser Zellenaufschlämmung wurden 300 ml kalten Acetons zugegeben, und die Zellen wurden filtriert. Die anfallenden Zellen wurden unter Vakuum getrocknet, um aceton-getrocknete Zellen von Bacillus alvei IFO 3343t zu erhalten.
Zu 15 mg der oben beschriebenen, aceton-getrockneten Zellen von Bacillus alvei IFO 3343t wurden 1,5 ml Butylacetat, in denen 15 mg Methyl-4-brom-3-oxobutanoat aufgelöst waren, sowie 1,5 ml 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,5, in dem 75 mg Glucose, 9 mg NAD⁺ und 15 E. von Glucose-Dehydrogenase aufgelöst waren, zugegeben, und das Gemisch wurde während 18 Stunden bei 30 °C geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde dann zentrifugiert, um die organische Schicht abzutrennen.
Der Gehalt des Produkts in der organischen Schicht wurde mit Gaschromatographie analysiert, und es wurde gefunden, dass sich 4,5 mg Methyl-4-brom-3-hydroxybutanoat gebildet hatten.
Als Nächstes wurde das durch Aufkonzentrieren der organischen Schicht unter vermindertem Druck isolierte Methyl-4-brom-3-hydroxybutanoat in Dichlormethan aufgelöst, und Trifluoressigsäureanhydrid wurde hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während einer Stunde stehen gelassen. Diese Lösung wurde unter den gleichen Analysebedingungen wie in Beispiel 7 analysiert, und es wurde ermittelt, dass die Reinheit des anfallenden Methyl-(R)-4-brom-3-hydroxybutanoats 96% e.e. war.
Beispiel 10
18 l eines sterilisierten Mediums (hergestellt durch Auflösen von 20 g Glucose, 5 g Polypepton, 3 g Hefeextrakt, 3 g Fleischextrakt, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat und 2 g Ammoniumsulfat in 1 l Wasser) wurden in einen 30-I-Flaschenfermenter gebracht und 180 ml einer Kultur von Bacillus alvei IFO 3343t zugegeben, die in einem Medium der gleichen Zusammensetzung vorkultiviert worden waren. Die Kultivierung erfolgte während zweier Tage bei 30 °C unter Schütteln. Das kultivierte Produkt wurde dann zentrifugiert, um Zellen zu ernten. Die geernteten Zellen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen und dann in Kochsalzlösung aufgeschlämmt. Dieser Zellenaufschlämmung wurde kaltes Aceton zugegeben, und die Zellen wurden filtriert.
Die anfallenden Zellen wurden unter Vakuum getrocknet, um aceton-getrocknete Zellen von Bacillus alvei IFO 3343t zu gewinnen.
Zu 750 mg der oben beschriebenen, aceton-getrockneten Zellen von Bacillus alvei IFO 3343t wurden 150 mg Ethyl-4,4,4-trifluor-3-oxobutanoat und 30 ml 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,5, in dem 750 mg Glucose, 9 mg NAD⁺ und 2,25 mg (70 E./mg) von Glucose-Dehydrogenase aufgelöst waren, zugegeben, und das Gemisch wurde während 27 Stunden bei 30 °C geschüttelt. Später wurde Ethylacetat hinzugefügt und dann zentrifugiert.
Die organische Schicht wurde mit Gaschromatographie analysiert, und es wurde gefunden, dass sich 114 mg Ethyl-4,4,4-trifluor-3-hydroxybutanoat gebildet hatten.
(Analysebedingungen für Gehalt)

Säule: DB-1 (0,53 mm × 30 m, 1,5 μm).
Säulentemperatur: 40 °C (5 min) → 4 °C/min → 60 °C (0 min) → 30 °C/min → 290 °C (2 min).
Trägergas: Helium (Strömungsgeschwindigkeit: 20 ml/min).
Detektor: FID.

Als Nächstes wurde das durch Aufkonzentrieren der organischen Schicht unter vermindertem Druck isolierte Ethyl-4,4,4-trifluor-3-hydroxybutanoat in Dichlormethan aufgelöst, und Trifluoressigsäureanhydrid wurde hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur während einer Stunde stehen gelassen. Diese Lösung wurde unter den gleichen Analysebedingungen wie unten beschrieben analysiert, und es wurde ermittelt, dass die Reinheit des anfallenden Ethyl-(R)-4,4,4-trifluor-3-hydroxybutanoats 99 e.e. war.
(Analysebedingungen für optische Isomeren)

Säule: Gamma-Dex 120 (0,25 mm × 30 m, 0,25 μm) (hergestellt von Supelco Ltd.).
Säulentemperatur: 80 °C (5 min) → 5°C/min → 130 °C → 20 °C/min → 200 °C (5 min).
Trägergas: Helium (Strömungsgeschwindigkeit: 1,25 ml/min).
Detektor: FID.

Beispiel 11
900 ml eines flüssigen Mediums (hergestellt durch Auflösen von 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 5 g Natriumchlorid in 1000 ml Wasser und tropfenweise Zugabe von wässriger 1 N Natriumhydroxidlösung, um den pH-Wert auf 7,0 einzustellen) wurden in einen Kolben gebracht und sterilisiert, dann wurden Ampicillin und Isopropylthio-β-D-galactosid (IPTG) hinzugefügt, um eine Konzentration von 100 μg/ml bzw. 0,4 mM zu liefern. Das Medium wurde mit 1 ml der kultivierten Flüssigkeit inokuliert, die anfiel, wenn in dem flüssigen Medium der oben erwähnten Zusammensetzung ein transformierter E. coli-Stamm JM109/pUAR kultiviert wurde, der durch Transformation eines E. coli-Stammes JM109 mit einem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von Plasmid pUAR gewonnen worden war, das die in SEQ ID NO. 35 gezeigte DNA enthielt (Hinterlegungs-Nr. FERM BP-7752 unter dem Budapester Vertrag), und während 14 Stunden bei 37 °C unter Schütteln kultiviert. Die Kultur wurde zentrifugiert (15 000 g, 15 Minuten, 4 °C), um Zellen zu ernten, die in 30 ml 50 mM Monokaliumphosphat-Dikaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) aufgeschlämmt und danach zentrifugiert (15 000 g, 15 Minuten, 4 °C) wurden, um gewaschene Zellen zu erhalten.
Zu 50 ml 50 mM Monokaliumphosphat-Dikaliumphosphat-Puffer (pH 7,0), der 5% 2-Propanol enthielt, wurden 0,1 mmol NAD⁺ und 6 g der oben beschriebenen, gewaschenen Zellen hinzugefügt. Dieser Mischung wurden 50 ml Decan zugefügt, die 70 mg (0,31 mmol) Isopropyl-4-brom-3-oxobutanoat enthielten, und die Mischung wurde während einer Nacht und eines Tages bei Zimmertemperatur gerührt. Celite wurde dann in die Reaktionslösung gegeben, für eine Weile gerührt und abfiltriert, um die anfallende Lösung abzutrennen. Die wässrige Schicht wurde weiter dreimal mit Ethylacetat extrahiert, und die kombinierten organischen Schichten wurden aufkonzentriert, um 50 mg Isopropyl-4-brom-3-hydroxybutanoat zu liefern.
¹H-NMR CDCl₃), δ (ppm): 1,26 (6H), 2,60 (2H), 3,21 (1H), 3,50 (2H), 4,19–4,28 (1H), 5,02–5,11 (1H).
Chemische Reinheit: 99% (GC). Optische Reinheit: 77% e.e. (HPLC, eine Daicel Chiralcel OD-Säule. Bewegliche Phase: Hexan/Isopropanol = 98/2 mit 0,1% Trifluoressigsäure, 0,5 ml/min, UV 220 nm.).
Retentionszeit: 21 Minuten.
Im Folgenden wird ein Bezugsbeispiel zur Herstellung des echten Musters für die Bestimmung der optischen Reinheit von Isopropyl-4-brom-3-hydroxybutanoat beschrieben.
Bezugsbeispiel 2
23 g Isopropyl-3-oxobutanoat wurden in Methylenchlorid aufgelöst, und 26 g Brom wurden zugetropft, während auf Eis gekühlt wurde. Das Gemisch wurde auf Zimmertemperatur erwärmt und während 8 Stunden gerührt, wonach die Reaktionslösung zu 35 g Isopropyl-4-brom-3-hydroxybutanoat aufkonzentriert wurde.
4 g Isopropyl-4-brom-3-hydroxybutanoat wurden in 50 ml Ethanol aufgelöst, und während es auf Eis gekühlt wurde, wurde eine Aufschlämmung von 4,04 g Natriumborhydrid in 10 ml Ethanol langsam zugetropft. Nach beendeter Zugabe wurde der Reaktionslösung Essigsäure zugegeben, die Wasserschicht und die Ethylacetatschicht wurden getrennt. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und aufkonzentriert. Der anfallende Rückstand wurde einer Säulenchromatographie auf Silicagel unterworfen (Lösungsmittel für die Entwicklung: Hexan/Ether), um 1,3 g Isopropyl-4-brom-3-hydroxybutanoat zu liefern.
¹H-NMR CDCl₃), δ (ppm): 1,26 (6H), 2,60 (2H), 3,21 (1H), 3,50 (2H), 4,19–4,28 (1H), 5,02–5,11 (1H).
Das anfallende Isopropyl-4-brom-3-hydroxybutanoat wurde durch HPLC mit einer Daicel Chiralcel OD-Säule analysiert (bewegliche Phase: Hexan/2-Propanol = 98/2 mit 0,1 % Trifluoressigsäure, 0,5 ml/min, UV-Detektor bei 220 nm), was ein fast gleiches Flächenverhältnis von zwei Peaks bei einer Retentionszeit von 19 und 21 Minuten ergab.
Beispiel 12
1,6 g (15 mmol) Calciumchlorid und 0,6 g (8,1 mmol) Calciumhydroxid wurden in 3,7 ml Wasser aufgelöst und während 20 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Bei der gleichen Temperatur wurden 2,00 g (10 mmol) Methyl-4-brom-3-hydroxybutanoat über einen Zeitraum von 5 min zugetropft. Nach Rühren während weiterer 10 min wurde die Mischung mit Eis gekühlt, und 0,6 g (12 mmol) Natriumcyanid wurden hinzugefügt. Dann wurde das Gemisch während 4,5 Stunden bei einer Innentemperatur von 25 bis 33 °C gerührt. Dann wurde konzentrierte Chlorwasserstoffsäure tropfenweise zur Reaktionslösung hinzugefügt, und Ethylacetat wurde fünfmal für Extraktion verwendet. Die organische Schicht wurde unter vermindertem Druck aufkonzentriert, um 1,2 g 4-Cyan-3-hydroxybutansäure zu gewinnen. Die Reinheit der gewonnenen 4-Cyan-3-hydroxybutansäure war 91% (Hochleistungs-Flüssigchromatographie in Flächenprozent).
Beispiel 13
35 g 4-Cyan-3-hydroxybutansäure wurden in 250 g Ethylacetat aufgelöst, und 41 g Triethylamin sowie 54 g Diethylsulfat wurden bei Zimmertemperatur hinzugefügt. Dann wurde die Mischung während 30 min bei einer Innentemperatur von 55 bis 60 °C gerührt. Nach Abkühlenlassen der Reaktionslösung auf Zimmertemperatur wurde sie einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung zugegeben, und Ethylacetat wurde für Extraktion verwendet. Die organische Schicht wurde mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, und der durch Aufkonzentrieren unter vermindertem Druck gewonnene Rückstand wurde einer Destillation unter vermindertem Druck unterworfen, wodurch 24,5 g Ethyl-4-cyan-3-hydroxybutanoat gewonnen wurden. Die Reinheit des gewonnenen Ethyl-4-cyan-3-hydroxybutanoats war 99% (Gaschromatographie in Flächenprozent).
Beispiel 14
22,8 g (205 mmol) Calciumchlorid und 8,4 g (114 mmol) Calciumhydroxid wurden in 50 g Wasser aufgelöst und während 20 Minuten gerührt. Dann wurden bei Zimmertemperatur 28,0 g (142 mmol) Methyl-4-brom-3-hydroxybutanoat über einen Zeitraum von 5 min zugetropft. Die Mischung wurde während 10 min bei Zimmertemperatur gerührt und dann mit Eis gekühlt, und 8,7 g (178 mmol) Natriumcyanid wurden hinzugefügt. Dann wurde das Gemisch während 4,5 Stunden bei einer Innentemperatur von 25 bis 33 °C weiter gerührt. Dann wurde konzentrierte Chlorwasserstoffsäure zugetropft, und Ethylacetat wurde fünfmal für Extraktion verwendet. Der Rückstand, der durch Aufkonzentrieren der organischen Schicht unter vermindertem Druck gewonnen wurde, wurde in Ethylacetat aufgelöst und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösung, aus der Magnesiumsulfat durch Filtrieren entfernt worden war, wurde mit Eis gekühlt, und 20,0 g (198 mmol) Triethylamin sowie 26,5 g (172 mmol) Diethylsulfat wurden dazugegeben. Es wurde während etwa 30 min gerührt, während allmählich auf Zimmertemperatur erwärmt wurde. Weiter wurde während 40 min bei einer Innentemperatur von 55 bis 63 °C gerührt. Dann wurde die Reaktionslösung mit Eis gekühlt, und 50 ml gesättiges Natriumhydrogencarbonat wurde dazugegeben, das dann gerührt wurde. Diese Lösung wurde abgetrennt, und die Lösungsschicht wurde wiederum einer Extraktion mit Ethylacetat unterworfen. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde der Destillation unter vermindertem Druck unterworfen, und 15,7 g Ethyl-4-cyan-3-hydroxybutanoat wurden gewonnen. Die Reinheit des gewonnenen Ethyl-4-cyan-3-hydroxybutanoats war 95% (Gaschromatographie in Flächenprozent).
Beispiel 15
100 ml eines sterilisierten Mediums (hergestellt durch Auflösen von 200 g Kartoffelextrakt und 20 g Dextrose in 1 l Wasser) wurden in einen 500-ml-Sakaguchi-Kolben gebracht und mit 0,3 ml eines kultivierten Produkts von Penicillium citrinum IFO 4631 inokuliert. Die Kultivierung wurde unter Schütteln aerobisch bei 30 °C ausgeführt. Das kultivierte Produkt wurde dann zentrifugiert, um Zellen zu ernten, und die geernteten Zellen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen. Zu dieser Zellenaufschlämmung wurden 300 ml kalten Acetons hinzugefügt, und die Zellen wurden durch Filtrieren gesammelt. Die gesammelten Zellen wurden unter Vakuum bei Zimmertemperatur getrocknet, um acetonbehandelte Zellen von Penicillium citrinum IFO 4631 zu gewinnen. Die gleiche Prozedur wude 15mal wiederholt, um 150 g der aceton-behandelten Zellen von Penicillium citrinum IFO 4631 zu liefern.
Eine Lösung wurde hergestellt, indem 75 g Glucose, 0,85 g Nicotin-Adenin-Dinucleotid-Phosphat der oxidierten Form, 0,11 g Glucose-Dehydrogenase (Amino-2-glucose von Amano Enzyme) in 1500 g Phosphatpufferlösung (pH 6,5) aufgelöst und 1300 g Butylacetat sowie 37 g Methyl-4-brom-3-oxobutanoat hinzugefügt wurden, dann wurden 150 g der oben beschriebenen, aceton-behandelten Zellen von Penicillium citrinum IFO 4631 unter Rühren dazugegeben. Wässrige 15-%ige Natriumcarbonatlösung wurde zugetropft, so dass der pH-Wert der Reaktionslösung in einem Bereich von 6,5 ± 0,5 gehalten wurde. Nach Rühren während 24 Stunden wurden 90 g Celite dazugegeben und unter vermindertem Druck filtriert. Die vom Filtrat abgetrennte organische Schicht wurde unter vermindertem Druck aufkonzentriert, um 28 g Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoat zu liefern.
Chemische Reinheit: 88%, optische Reinheit: 97% e.e.
Analyse der chemischen Reinheit

Säule: HR-20M (0,53 mm × 30 m, 1 μm) (hergestellt von Shinwa Kako Ltd).
Säulentemperatur: 120 °C (5 min) → 3 °C/min → 150 °C (5 min) → 10 °C/min 200 °C (5 min).
Trägergas: Helium (Strömungsgeschwindigkeit: 20 ml/min).
Detektor: FID.

Analyse der optischen Reinheit
Hochleistungs-Flüssigchromatographie

Säule: Daicel Chiralcel OD-Säule (4,6 mm ∅ × 25 cm, 10 μm)
Bewegliche Phase: Hexan/2-Propanol, 0,5 ml/min,
Säulentemperatur: 40 °C,
Detektor: UV (220 nm)

23 g Calciumchlorid und 8,4 g Calciumhydroxid wurden in 50 g Wasser aufgelöst und während 20 min gerührt. Dann wurden 28,0 g des oben gewonnenen Methyl-(S)-4-brom-3-hydroxybutanoats über einen Zeitraum von 5 min bei Zimmertemperatur zugetropft. Das Gemisch wurde während 10 min bei Zimmertemperatur gerührt und dann mit Eis gekühlt, und 8,7 g Natriumcyanid wurden dazugegeben. Dann wurde das Gemisch weiter während 4,5 Stunden bei einer Innentemperatur von 25 bis 33 °C gerührt. Dann wurde konzentrierte Chlorwasserstoffsäure tropfenweise zur Reaktionslösung zugegeben, um den pH-Wert auf weniger als 1 einzustellen, und fünfmal mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden unter vermindertem Druck aufkonzentriert, um einen Rückstand zu liefern, der in Ethylacetat aufgelöst und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet wurde. Magnesiumsulfat wurde durch Filtrieren entfernt, um eine Lösung von (R)-4-Cyan-3-hydroxybutansäure zu liefern.
Die Lösung wurde mit Eis gekühlt, und 20,0 g (198 mmol) Triethylamin und 27 g Diethylsulfat wurden dazugegeben. Es wurde während etwa 30 min gerührt, während allmählich auf Zimmertemperatur erwärmt wurde. Es wurde weiter während 40 min bei einer Innentemperatur von 55 bis 63 °C gerührt. Dann wurde die Reaktionslösung mit Eis gekühlt, und 50 ml gesättigtes Natriumhydrogencarbonat wurden dazugegeben und abgetrennt. Die wässrige Schicht wurde wiederum mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde unter vermindertem Druck aufkonzentriert, um 14 g Ethyl-(R)-4-cyan-3-hydroxybutanoat zu liefern.
(Reinheit: 95%, optische Reinheit: 97% e.e.)
MS (EI, m/z): 157 (M⁺),
¹H-NMR CDCl₃), δ (ppm): 1,29 (t, 6H), 2,57–2,71 (m, 4H), 3,57 (d, 1H), 4,20 (q, 2H), 4,30–4,39 (m, 1H).
[α]_D ²⁵: 28° (C: 1,02, CHCl₃)
FREIER TEXT FÜR SEQUENZENTABELLE

SEQ ID NO: 8 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 9 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 10 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 11 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 12 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 13 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 14 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 16 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 17 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 20 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 21 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 23 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 24 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 25 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 26 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 27 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 28 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 29 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 30 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 31 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 32 Für PCR konstruierter Oligonucleotidprimer
SEQ ID NO: 33

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polynucleotid, umfassend: a) eine Polynucleotidsequenz für eine Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird; b) eine Polynucleotidsequenz, die unter strengen Bedingungen mit einer Polynucleotidsequenz hybridisiert, die für eine Aminosäuresequenz codiert, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, wobei die Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz eines Proteins ist, das in der Lage ist, bevorzugt (S)-4-Brom-3-hydroxybutanoat durch asymmetrische Reduktion von 4-Brom-3-oxobutanoat zu erzeugen; worin die strengen Bedingungen die Bildung eines Hybrids unter Bedingungen einer hohen Ionenkonzentration: 6 × SSC (900 mM Natriumchlorid, 90 mM Natriumcitrat) bei 65 °C und die Aufbewahrung des Hybrids nach 30 Minuten bei 65 °C unter Bedingungen einer geringen Ionenkonzentration: 0,1 × SSC (15 mM Natriumchlorid und 1,5 mM Natriumcitrat), umfassen; oder c) eine Polynucleotidsequenz, die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird.
DNA-Konstrukt, einen Promotor in operativer Verknüpfung mit einem Polynucleotid, wie in Anspruch 1 definiert, umfassend.
Rekombinanter Vektor, ein Polynucleotid, wie in Anspruch 1 definiert, oder ein DNA-Konstrukt, wie in Anspruch 2 definiert, umfassend.
Nichthumaner Transformant, ein Polynucleotid, wie in Anspruch 1 definiert, oder ein DNA-Konstrukt, wie in Anspruch 2 definiert, oder einen Vektor, wie in Anspruch 3 definiert, umfassend.
Transformant nach Anspruch 4, worin der Transformant ein Mikroorganismus ist.
Transformant nach Anspruch 5, worin der Mikroorganismus E. coli ist.
Verfahren zur Herstellung eines Transformanten, das den Schritt umfasst, einen rekombinanten Vektor, wie in Anspruch 3 definiert, in eine Wirtszelle einzuführen.
Rekombinanter Vektor, umfassend: a) ein Polynucleotid, wie in Anspruch 1 definiert, oder ein DNA-Konstrukt, wie in Anspruch 2 definiert; und b) ein Polynucleotid, das für ein Enzym codiert, das in der Lage ist, oxidiertes β-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat in eine reduzierte Form umzuwandeln.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 8, worin das Enzym, das in der Lage ist, oxidiertes Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat in eine reduzierte Form umzuwandeln, Glucose-Dehydrogenase ist.
Nichthumaner Transformant, einen Vektor nach Anspruch 8 oder 9 umfassend.
Transformant nach Anspruch 10, worin der Transformant ein Mikroorganismus ist.
Transformant nach Anspruch 11, worin der Mikroorganismus E. coli ist.
Nichthumaner Transformant, umfassend: a) ein Polynucleotid, wie in Anspruch 1 definiert, oder ein DNA-Konstrukt, wie in Anspruch 2 definiert; und b) ein Polynucleotid, das für ein Enzym kodiert, das in der Lage ist, oxidiertes β-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat in eine reduzierte Form umzuwandeln.
Protein, umfassend: I) eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1; II) eine Aminosäuresequenz, die durch eine Polynucleotidsequenz codiert wird, die unter strengen Bedingungen mit einer Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 hybridisiert, die für eine Aminosäuresequenz eines Proteins codiert, das in der Lage ist, bevorzugt (S)-4-Brom-3-hydroxybutanoat durch asymmetrische Reduktion von 4-Brom-3-oxobutanoat zu erzeugen, worin die strengen Bedingungen die Bildung eines Hybrids unter Bedingungen einer hohen Ionenkonzentration: 6 × SSC (900 mM Natriumchlorid, 90 mM Natriumcitrat) bei 65 °C und die Aufbewahrung des Hybrids nach 30 Minuten bei 65 °C unter Bedingungen einer geringen Ionenkonzentration: 0,1 × SSC (15 mM Natriumchlorid und 1,5 mM Natriumcitrat), umfassen; oder III) eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, die von Penicillium citrinum abgeleitet ist und worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, ersetzt oder hinzugefügt sind, wobei die Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz eines Proteins ist, das in der Lage ist, bevorzugt (S)-4-Brom-3-hydroxybutanoat durch asymmetrische Reduktion von 4-Brom-3-oxobutanoat zu erzeugen.
Verfahren zur Herstellung von (S)-4-Halogen-3-hydroxybutanoat, das umfasst, ein 4-Halogen-3-oxobutanoat mit einem Protein, wie es in Anspruch 14 definiert wird, einem Transformanten, der das Protein erzeugt, oder einem behandelten Produkt des Transformanten umzusetzen.
Verfahren nach Anspruch 15, das umfasst, die Koexistenz eines Enzyms zuzulassen, das in der Lage ist, oxidiertes β-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat in eine reduzierte Form umzuwandeln.
Verfahren nach Anspruch 16, worin das Enzym, das in der Lage ist, oxidiertes β-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat in eine reduzierte Form umzuwandeln, eine Glucose-Dehydrogenase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, worin das 4-Halogen-3-oxobutanoat mit einem Transformanten, wie in einem der Ansprüche 10 bis 13 definiert, oder mit einem behandelten Produkt des Transformanten in Berührung gebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, worin das (S)-4-Halogen-3-hydroxybutanoat durch die Formel (1) dargestellt wird:
worin R₁ eine Alkylgruppe darstellt und R₂ eine Methylgruppe darstellt, die mit einem Halogenatom substituiert ist, und worin das Verfahren umfasst, ein 4-Halogen-3-oxobutanoat der Formel (2):
umzusetzen, worin R₁ und R₂ wie oben definiert sind.
Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven 3-Hydroxybutanoats der Formel (1a):
worin R₁ eine Alkylgruppe darstellt und R₂₀ eine Methylgruppe darstellt, die mit einem Halogenatom substituiert sein kann, und worin das Verfahren umfasst, ein 3-Oxobutanoat der Formel (2a):
worin R₁ und R₂₀ wie oben definiert sind, mit ganzen Zellen eines Mikroorganismus oder einem behandelten Produkt davon umzusetzen, wobei der Mikroorganismus zu Penicillium citrinum gehört, ein Polynucleotid nach Anspruch 1 umfasst und in der Lage ist, die Oxogruppe in der 3-Stellung der Verbindung der Formel (2a) asymmetrisch zur entsprechenden 3-Hydroxygruppe zu reduzieren.
Verfahren nach Anspruch 20, worin R₂₀ eine Halogenmethylgruppe darstellt.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, worin der Mikroorganismus ein Stamm von Penicillium citrinum (IFO 4631) ist.