DE60127948T2

DE60127948T2 - Verfahren zur herstellung von avermectinderivaten

Info

Publication number: DE60127948T2
Application number: DE60127948T
Authority: DE
Inventors: Hirofumi Endo; Hiroyuki Machida-shi YAMAGUCHI; Yutaka Sunto-gun KANDA; Shinichi Machida-shi HASHIMOTO; Satoshi Setagaya-ku Omura; Haruo Kawasaki-shi IKEDA
Original assignee: Kitasato Institute; Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: Kitasato Institute; KH Neochem Co Ltd
Priority date: 2000-02-24
Filing date: 2001-02-23
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2021-02-24
Also published as: AU2001234164A1; EP1270728A4; EP1270728A1; CA2402398A1; US20040101936A1; DE60127948D1; WO2001062939A1; EP1270728B1; ATE360086T1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 22,23-Dihydroavermectin B1a oder einem Derivat davon, das als Medikament nützlich ist, eine Substratzusammensetzung und eine modifizierte Avermectin-Aglyconsynthase, die bei der Herstellung verwendet wird, und ein Gen, das das Enzym codiert.
Fachgebiet
Ein herkömmliches Verfahren zur Herstellung von 22,23-Dihydroavermectin B1a beinhaltet ein Verfahren zur Extraktion eines Avermectin-Gemisches mit organischen Lösungsmitteln aus verschiedenen Mikroorganismen, die eine Vielzahl von Avermectinen produzieren, Reinigung von Avermectin B1 im Extrakt und Reduktion der Kohlenstoffbindung zwischen der Position 22 und 23 von Avermectin B1 mit Wasserstoff in Gegenwart einer katalytischen Menge der Verbindungen (Japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 61198/79 ). Ein Gemisch aus 22,23-Dihydroavermectin B1a und 22,23-Dihydroavermectin B1b, das durch das Verfahren erhalten wird, das als 22,23-Dihydroavermectin B1 bezeichnet wird, wird als Medikament verwendet.
Avermectin ist eine Polyketid-Verbindung, die wie bei anderen Polyketid-Verbindungen durch kontinuierliche Kondensation von niedrigen Fettsäuren, Reduktion einer Carbonylgruppe an der β-Position einer verlängerten Acylgruppe, Dehydration oder Enoylreduktion biosynthetisiert wird. Diese verschiedenen, sich wiederholenden synthetischen Verfahren vieler Polyketid-Verbindungen werden von polymeren und multifunktionalen Enzymkomplexen durchgeführt, von denen jeder eine spezifische aktive Stelle (Domäne) besitzt, die für die jeweilige katalytische Aktivität erforderlich ist. Eine allgemeine Reaktionsformel der Polyketid-Biosynthese wird beispielsweise in Ann. Rev. Gen., 24, 37 (1990) und Ann. Rev. Microbiol., 47, 875 (1993) dargestellt.
DNA, die eine Polyketid-Synthase codiert, codiert gewöhnlich alle erforderlichen Aktivitätsstellen für die Synthese des Polyketid-Rückgrads (Aglycon) und enthält Module, d.h. sich wiederholende Einheiten, die an Kondensationsschritten und Modifikationsschritten nach der Kondensation beteiligt sind. Abhängig von der genetischen Information, die in jedem Modul vorhanden ist, wird die Verlängerung oder Modifizierung einer Acylgruppe bestimmt. Eine Polyketid-Synthase wirkt spezifisch auf eine spezifische konstitutionelle Carbonsäureeinheit, die an jedem Kondensationsschritt beteiligt ist oder wirkt auf eine Stelle, die die spezifische modifizierende Funktion nach der Kondensation definiert.
Im Hinblick auf den Biosynthesemechanismus von Avermectin-Aglycon wurde berichtet, dass Avermectin-Aglycon genauso wie bei anderen Polyketid-Verbindungen niedrige Fettsäuren wie Essigsäure und Propionsäure als dessen Komponenten enthält [J. Antibiot., 39, 541-549 (1986)], und eine aus Modulen bestehende Polyketid-Synthase liegt in Avermectin-produzierenden Bakterien vor [Gene, 115, 119-125 (1992), Ann. New York Acad. of Sci., 721, 123-132 (1994)]. Über DNA-Fragmente, die an der Biosynthese von Avermectin (Japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 15391/91 ) oder an Domänenstrukturen einiger Module [Ann. New York Acad. Sci., 721, 123-132 (1994)] beteiligt sind, wurde berichtet, obwohl die Nucleotidsequenz, die deren Basis ist, nicht offenbart ist. D.h. die Existenz einiger Module in der Avermectin-Aglyconsynthase ist eine bloße Annahme, während die Struktur der gesamten Synthase nicht aufgeklärt wurde. Die hier genannten Erfinder führten eine intensive Untersuchung der Avermectin-Aglycon-Biosynthase-Gene durch, wodurch die Domänenstruktur jedes an der Biosynthese von Avermectin-Aglycon beteiligten Moduls abgeleitet wurde.
Unter den 22,23-Dihydroavermectin B1-Komponenten ist 22,23-Dihydroavermectin B1a als hochwirksames Medikament bekannt [Antimicrobial Agent and Chemotherapy, 15, 372-378 (1979) und japanische veröffentlichte, geprüfte Patentanmeldung Nr. 54113/87 ]. Avermectin B1a, das ein Rohmaterial für die Synthese von 22,23-Dihydroavermectin B1a ist, wird durch Züchtung von Avermectin B1a produzierenden Mikroorganismen und dessen Reinigung aus der Kultur erhalten.
Dokument WO 00/01827 offenbart Nucleinsäuremoleküle, die mindestens einen Teil einer Typ I-Polyketid-Synthase codieren, sowie Nucleinsäuremoleküle, die einen Polylinker mit Mehrfachrestriktionsenzymschnittstellen anstelle eines oder mehrerer PKS-Gene besitzen, die Enzyme codieren, die mit einer Reduktion in Verbindung stehen.
Dokument WO 99/03986 beschreibt ein Verfahren zur Produktion neuer Polyketide. Insbesondere modifizierte PKS-Gencluster, die neue Polyketide in einem effizienten System in einer Wirtszelle oder in einem zellfreien Extrakt produzieren, werden beschrieben. Die neuen Polyketide sind auf den Einbau von Diketiden der Formel
zurückzuführen, wobei A eine Einheit ist, die das Diketid aktiviert und mindestens einer von R¹ und R² ist ein Substituent, der kein nativ auftretender Substituent in dem Diketid ist, das normalerweise vom modifizierten PKS-Cluster prozessiert wird.
Streptomyces avermitilis, der Avermectin produziert, produziert 8 Komponenten der Avermectine mit analogen Strukturen (Japanische veröffentlichte, geprüfte Veröffentlichung Nr. 17558/90 ). Unter den Stämmen, die selektiv Avermectin-Komponenten produzieren, die mutiert wurden und aus Streptomyces avermitilis gezüchtet wurden, wurden keine Stämme erhalten, die nur Avermectin B1a produzieren. Daher sollte Avermectin B1a für die Zwecke der 22,23-Dihydroavermectin B1a-Produktion aus Avermectinen mit analogen Strukturen isoliert werden. Da es jedoch außerordentliche Ähnlichkeiten unter den Avermectin-Strukturen gibt, ist es sehr schwierig, ausschließlich Avermectin B1a industriell zu isolieren. Aus diesem Grund ist man der Ansicht, dass eine derzeit verwendete 22,23-Dihydroavermectin-Zubereitung aus Dihydroavermectin B1a und Dihydroavermectin B1b besteht.
Nach Ikeda et al., PNAS, 96, 1999, S. 9509-9514, zeigte die Analyse des Gen-Clusters aus Streptomyces avermitilis, das für die Biosynthese des Polyketid-Avermectin-Anthelminthicas verantwortlich ist, dass es vier größere ORFs enthält, die riesige multifunktionale Polypeptide der Avermectin-Polyketid-Synthese (AVES1, AVES2, AVES3 und AVES4) codieren. Diese dicht zusammenliegenden Polyketid-Synthese-Gene, die für die Avermectin-Biosynthese verantwortlich sind, codieren zusammen 12 homologe Sätze mit Enzymaktivitäten (Module), von denen jeder eine spezifische Runde der Polyketid-Kettenverlängerung katalysiert.
Die Notwendigkeit der Hydrierung mit einem speziellen Katalysator nach der Reinigung erschwert den Vorgang zur Herstellung von 22,23-Dihydroavermectin B1 und führt zu erhöhten Kosten.
Daher können, falls ausschließlich 22,23-Dihydroavermectin B1a direkt produziert werden kann, alle Probleme, die mit der herkömmlichen industriellen Produktion einhergehen, gelöst werden und Medikamente, die ausschließlich 22,23-Dihydroavermectin B1a enthalten, welches die höchste antiparasitäre Aktivität in seiner Komponente besitzt, können produziert werden. Ein Verfahren zur selektiven und direkten Produktion von 22,23-Dihydroavermectin B1a ist jedoch noch nicht bekannt.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur selektiven und direkten Produktion von nur 22,23-Dihydroavermectin B1a bereitzustellen.
Die hier genannten Erfinder haben intensive Studien durchgeführt, um das vorstehende Ziel zu erreichen und haben herausgefunden, dass 22,23-Dihydroavermectin B1a oder ein Derivat davon direkt produziert werden kann, indem ein Gen modifiziert wird, das eine Avermectin-Aglyconsynthase codiert, um ein modifiziertes Enzym zu erhalten und eine Verbindung zuzulassen, die ein Substrat des modifizierten Enzyms ist, um auf eine Zelle zu wirken, in der die modifizierten Gene exprimiert wurden. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieses Ergebnisses vollendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft die folgenden Punkte (1) bis (10).

(1) Eine N-Acetylcysteaminthioester-Verbindung, dargestellt durch die Formel (I):
wobei R¹ Methyl ist und R² sec-Butyl ist.
(2) Ein Verfahren zur Herstellung einer N-Acetylcysteaminthioester-Verbindung nach (1), das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Verbindung, dargestellt durch Formel (II)
als Ausgangsmaterial verwendet wird, wobei R¹ Methyl ist und R² sec-Butyl ist, und das Verfahren die Schritte umfasst:
(a) Ozonoxidation einer Verbindung und nachfolgendes Hinzufügen von Kohlenstoffketten mittels der Wittig-Reaktion;
(b) Entfernen der t-Butyldimethylsilyl-Schutzgruppe von der in Schritt (a) erhaltenen Verbindung und Wiedereinführen einer anderen Schutzgruppe unter Verwendung von Chlortriethylsilan;
(c) Reduzieren der ungesättigten α-β-Kohlenstoffbindung der sich ergebenden Verbindung in Gegenwart eines Palladium-Kohlenstoff-Katalysators, Hydrolysieren eines Esters mit Kaliumhydroxid, Neutralisieren des Reaktionsgemisches und Zugabe von N-Acetylcysteamin in Gegenwart eines Kondensierungsmittels, um eine Thioesterverbindung zu erhalten; und
(d) Entfernen der Schutzgruppe durch Zugabe von Essigsäure zu der Thioesterverbindung.
(3) Ein Verfahren zur Herstellung von 22,23-Dihydroavermectin B1a, das die Schritte umfasst:
(a) das Inkontaktbringen einer Kultur einer nicht-menschlichen Transformanten, die eine DNA enthält, die eine modifizierte Avermectin-Aglyconsynthase codiert, die mindestens eine Domäne mit einer beseitigten Aktivität umfasst, wobei die Domäne ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus ATs [Aminosäure 29 bis 344 von SEQ ID NO. 4], ACPs [Aminosäure 366 bis 451 von SEQ ID NO. 4], KS1 [Aminosäure 481 bis 914 von SEQ ID NO. 4], AT1 [Aminosäure 1051 bis 1356, von SEQ ID NO. 4], ACP1 [Aminosäure 1979 bis 2060 von SEQ ID NO. 4] und KS2 [Aminosäure 2086 bis 2515 von SEQ ID NO. 4], oder ein behandeltes Produkt davon, oder die Synthase, die von der DNA codiert wird, mit der N-Acetylcysteaminthioester-Verbindung nach (1) in einem Medium; und
(b) das Sammeln des produzierten und in dem Medium angereicherten 22,23-Dihydroavermectins B1a.
(4) Das Verfahren zur Herstellung von 22,23-Dihydroavermectin B1a nach (3), dadurch gekennzeichnet, dass eine N-Acetylcysteaminthioester-Verbindung nach (1) als Substratverbindung für eine modifizierte Avermectin-Aglyconsynthase benutzt wird, die mindestens eine Domäne mit einer beseitigten Aktivität umfasst, wobei die Domäne ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus ATs [Aminosäure 29 bis 344 von SEQ ID NO. 4], ACPs [Aminosäure 366 bis 451 von SEQ ID NO. 4], KS1 [Aminosäure 481 bis 914 von SEQ ID NO. 4], AT1 [Aminosäure 1051 bis 1356 von SEQ ID NO. 4], ACP1 [Aminosäure 1979 bis 2060 von SEQ ID NO. 4] und KS2 [Aminosäure 2086 bis 2515 von SEQ ID NO. 4].
(5) Das Verfahren nach (3) oder (4), wobei die modifizierte Avermectin-Aglyconsynthase mutierte ATs [Aminosäure 29 bis 344 von SEQ ID NO. 4], ACPs [Aminosäure 366 bis 451 von SEQ ID NO. 4], KS1 [Aminosäure 481 bis 914 von SEQ ID NO. 4], AT1 [Aminosäure 1051 bis 1356, von SEQ ID NO. 4], ACP1 [Aminosäure 1979 bis 2060 von SEQ ID NO. 4] und KS2 [Aminosäure 2086 bis 2515 von SEQ ID NO. 4] umfasst, in denen eine spezifische Aminosäure in einem aktiven Zentrum mit einer anderen Aminosäure ausgetauscht ist.
(6) Das Verfahren gemäß einem der Punkte (3) bis (5), wobei die modifizierte Avermectin-Aglyconsynthase ein Polypeptid umfasst, das aus der Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO. 8, besteht.
(7) Das Verfahren nach (3), wobei die DNA eine DNA umfasst, die aus der Nucleotidsequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO. 3, besteht.
(8) Das Verfahren nach (3), wobei die nicht-menschliche Transformante ein Mikroorganismus ist.
(9) Das Verfahren nach (8), wobei der Mikroorganismus der Gattung Streptomyces angehört.
(10) Das Verfahren nach (9), wobei der Mikroorganismus, der der Gattung Streptomyces angehört, Streptomyces avermitilis ist.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend im Einzelnen beschrieben.
[1] Strukturelle Analyse der Avermectin-Aglyconsynthase
(1) Isolierung des Avermectin-Aglyconsynthasegens und Bestimmung der Nucleotidsequenz
Verfahren zur Isolierung der Avermectin-Aglyconsynthasegene schließen ein in der japanischen veröffentlichten, ungeprüften Patentanmeldung Nr. 15391/91 beschriebenes Verfahren und die in Molecular Cloning, 2. Ausgabe beschriebene Koloniehybridisierung ein.
Genauer gesagt, wird die chromosomale DNA von Streptomyces avermitilis mit einem geeigneten Restriktionsenzym, beispielsweise Sau3AI, partiell verdaut. Beispiele schließen das folgende Verfahren ein. Ein Cosmidvektor, der in Escherichia coli replizieren kann, wird an einer einzigartigen Restriktionsenzymschnittstelle, wie der BamHI-Schnittstelle, gespalten. Der gespaltene Cosmidvektor wird mit der verdauten chromosomalen DNA gebunden und dann mit dieser rekombinanten DNA transformiert, und eine Transformante, die Avermectin-Aglyconsynthasegene trägt, wird aus den erhaltenen Transformanten durch Koloniehybridisierung ausgewählt.
Spezifische Beispiele für DNA, die durch das Verfahren erhalten wird, können DNA einschließen, die die in SEQ ID NO: 1 oder 2 gezeigte Nucleotidsequenz besitzen. Die in diesen Sequenzen enthaltenen offenen Leserahmen (ORF) sind ORF1 (Nucleotidnr. 1 bis 11916 von SEQ ID NO: 1), ORF2 (Nucleotidnr. 11971 bis 30688 von SEQ ID NO: 1), ORF3 (Nucleotidnr. 1 bis 14643 von SEQ ID NO: 2) und ORF4 (Nucleotidnr. 14824 bis 31419 von SEQ ID NO: 2). Beispiele der Aminosäuresequenz des von diesen Sequenzen codierten Polypeptids schließen Sequenzen ein, die jeweils in den SEQ ID NOs: 4, 5, 6 und 7 gezeigt werden. 1 zeigt eine Restriktionskarte der Avermectin-Aglyconsynthasegenregionen (aveAI und aveAII) in genomischer DNA von Streptomyces avermitilis zusammen mit der abgeleiteten Transkriptionseinheit (Pfeil).
(2) Ableitung des Moduls und der Domäne der Avermectin-Aglyconsynthase
Module, Domänen und ORFs, die für die Avermectin-Aglyconsynthasegene relevant sind, können durch Vergleich der Ähnlichkeit mit den Sequenzen von 3 Arten von Polyketidsynthase-Domänen von Erythromycin bestimmt werden [Nature, 348, 176-178 (1990), Science, 252, 675-679 (1991), Eur. J. Biochem., 204, 39-49 (1992)].
Die Kondensationsreaktion, die eine Grundreaktion in der Synthese des Polyketids ist, erfordert verschiedene katalytische Aktivitäten einschließlich eines Acyl-Trägerproteins (ACP), einer β-Ketoacyl-ACP-Synthase (KS) und einer Acyltransferase (AT).
In vielen Fällen sind die durch die Kondensationsreaktion erzeugten β-Carbonylgruppen modifiziert. Jedoch können abhängig von einem Modul einige β-Carbonylgruppen nicht modifiziert sein und für die nächste Kondensationsreaktion verwendet werden.
Katalytische Aktivitäten, die mit der Modifizierung einer β-Carbonylgruppe nach der Kondensationsreaktion assoziiert sind, schließen eine β-Ketoacyl-ACP-Reduktase (KR), eine Dehydratase (DH) und eine Enoyl-Reduktase (ER) ein. Die Biosynthese einer Polyketid-Kette wird durch Trennen von einer Polyketid-Synthase durch die Thioesterase (TE)-Aktivität beendet. Alle oder mehrere dieser Modifizierungsaktivitäten wirken in jedem Kondensationsvorgang, so dass die Struktur eines Endprodukts bestimmt wird.
Die Avermectin-Aglyconsynthasegene (aveAI und aveAII) von Streptomyces avermitilis sind durch Gene charakterisiert, die mehrere offene Leserahmen besitzen, von denen jeder eine oder mehrere sich wiederholende Einheiten umfasst, die als Modul bezeichnet werden, genauso wie sie die anderen bekannten Polyketid-Biosynthese-Gene besitzen. Das Modul wird als Genfragment definiert, das Aktivitäten für eine einmalige Synthese codiert, d.h. eine einmalige Kondensationsreaktion und andere verschiedene nachfolgende Modifizierungsreaktionen der β-Carbonyl-Gruppe. Jedes Modul codiert alle oder mehrere der ACP, KS und AT, die mit der Kondensationsreaktion in der Poliketid-Synthese assoziiert sind, und KR, DH und ER; die mit der Modifizierungsreaktion der β-Carbonyl-Gruppe assoziiert sind. Ferner gibt es auch ein Modul, das keine Domäne für eine Modifizierungsreaktion besitzt. Ein Polypeptid, das von einem derartigen Modul codiert wird, wird als Synthase-Einheit (SE) bezeichnet.
2(b) und (c) zeigen einen Biosyntheseweg von 6,8a-Seco-6,8a-desoxy-5-oxoavermectin-Aglycon, das mit Avermectin-Aglyconsynthasen von Streptomyces avermitilis synthetisiert wird.
PKS-1 ist offensichtlich mit der Initiationsreaktion assoziiert, da das Initiationsmodul (SEs), das sich von anderen Modulen unterscheidet, Acyltransferase (AT)-Aktivität auf der N-terminalen Seite besitzt. PKS-3 ist offensichtlich mit der Endreaktion des Polyketids assoziiert, da Modul 9 (SE9) eine Thioesterase-(TE)-Domäne besitzt.
Beispiele für abgeleitete Avermectin-Synthase-Gene, eine Syntheseeinheit, die von den Modulen codiert wird, der Domäne, die jede Synthese-Einheit ausmacht, und einer Subdomäne, die eine DNA ist, die die Domäne codiert schließen die folgenden Sequenzen ein.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe werden wie folgt definiert.
Modul stellt ein Genfragment dar, das die Aktivitäten der einmaligen Kondensationsreaktion und verschiedene nachfolgende Modifizierungsreaktionen der β-Carbonyl-Gruppe codiert.
Die Synthase-Einheit (SE) stellt ein von einem Modul codiertes Polypeptid dar.
Die Domäne stellt das Polypeptid dar, das jeweils katalytische Aktivität besitzt, die eine Synthase-Einheit ausmacht.
Die Subdomäne ist ein Genfragment, das eine Domäne codiert.
Diese Module werden durch die folgenden Nucleotidnummern in den SEQ ID NOs: 1 und 2 dargestellt. D.h. die Module sind in SEQ ID NO: 1 dargestellt als
Initiationsmodul: 85 bis 1353,
Modul 1: 1441 bis 6180,
Modul 2: 6256 bis 11658,
Modul 3: 12076 bis 15147,
Modul 4: 15217 bis 19938,
Modul 5: 20008 bis 24690,
Modul 6: 24781 bis 30309, und
sind in SEQ ID NO: 2 dargestellt als
Modul 7: 100 bis 4692,
Modul 8: 4771 bis 7818,
Modul 9: 7906 bis 14619,
Modul 10: 14935 bis 20334,
Modul 11: 20413 bis 25734,
Modul 12: 25810 bis 31125.
Die Aminosäuresequenzen der verschiedenen Synthase-Einheiten (SE), die von diesen Modulen codiert werden, werden durch die folgende Aminosäuren dargestellt. D.h. die Sequenzen sind in SEQ ID NO: 4 dargestellt als
Initiations-SE: 29 bis 451,
SE1: 481 bis 2060,
SE2: 2086 bis 3886;

in SEQ ID NO: 5 als
SE3: 36 bis 1059,
SE4: 1083 bis 2656,
SE5: 2680 bis 4240,
SE6: 4271 bis 6113;

in SEQ ID NO: 6 als
SE7: 34 bis 1564,
SE8: 1591 bis 2606,
SE9: 2636 bis 4873; und

in SEQ ID NO: 7 als
SE10: 38 bis 1837,
SE11: 1864 bis 3637,
SE12: 3663 bis 5434.
DNAs, die die Avermectin-Aglyconsynthase-Domänen (Subdomänen) codieren, werden durch die folgenden Nucleotidnummern dargestellt. D.h. die DNAs sind in SEQ ID NO: 1 dargestellt als
ATs: 85 bis 1032,
ACPs: 1096 bis 1353;

in Modul 1,
KS1: 1441 bis 2742,
AT1: 3148 bis 4068,
KR1: 5143 bis 5676,
ACP1: 5935 bis 6180;

in Modul 2,
KS2: 6256 bis 7545,
AT2: 7906 bis 8829,
DH2: 8947 bis 9384,
KR2: 10609 bis 11142,
ACP2: 11413 bis 11658;

in Modul 3,
KS3: 12076 bis 13368,
AT3: 13756 bis 14694,
ACP3: 14902 bis 15147;

in Modul 4,
KS4: 15217 bis 16506,
AT4: 16917 bis 17862,
KR4: 18886 bis 19419,
ACP4: 19693 bis 19938;

in Modul 5,
KS5: 20008 bis 21297,
AT5: 21658 bis 22584,
KR5: 23602 bis 24138,
ACP5: 24445 bis 24690;

in Modul 6,
KS6: 24781 bis 26079,
AT6: 26413 bis 27336,
DH6: 27475 bis 27894,
KR6: 29227 bis 29760,
ACP6: 30064 bis 30309; und

und sind auch dargestellt in SEQ ID NO: 2 als

in Modul 7,
KS7: 100 bis 1383,
AT7: 1648 bis 2673,
KR7: 3634 bis 4188,
ACP7: 4447 bis 4692;

in Modul 8,
KS8: 4771 bis 6060,
AT8: 6322 bis 7344,
ACP8: 7573 bis 7818;

in Modul 9,
KS9: 7906 bis 9258,
AT9: 9676 bis 10773,
DH9: 10885 bis 11289,
KR9: 12547 bis 13104,
ACP9: 13378 bis 13659,
TE9: 13879 bis 14619;

in Modul 10,
KS10: 14935 bis 16224,
AT10: 16543 bis 17565,
DH10: 17689 bis 18066,
KR10: 19285 bis 19842,
ACP10: 20089 bis 20334;

in Modul 11,
KS11: 20413 bis 21705,
AT11: 21991 bis 23019,
DH11: 23149 bis 23529,
KR11: 24685 bis 25242,
ACP11: 25489 bis 25734;

in Modul 12,
KS12: 25810 bis 27102,
AT12: 27367 bis 28392,
DH12: 28516 bis 28878,
KR12: 30076 bis 30633,
ACP12: 30880 bis 31125.
Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der verschiedenen Domänen, die von diesen Subdomänen codiert werden, sind dargestellt als:
in SEQ ID NO: 4,
ATs: 29 bis 344,
ACPs: 366 bis 451,
KS1: 481 bis 914,
AT1: 1050 bis 1356,
KR1: 1715 bis 1892,
ACP1: 1979 bis 2060,
KS2: 2086 bis 2515,
AT2: 2636 bis 2943,
DH2: 2983 bis 3128,
KR2: 3537 bis 3714,
ACP2: 3805 bis 3886;

in SEQ ID NO: 5,
KS3: 36 bis 466,
AT3: 596 bis 908,
ACP3: 978 bis 1059,
KS4: 1083 bis 1512,
AT4: 1653 bis 1964,
KR4: 2306 bis 2483,
ACP4: 2575 bis 2656,
KS5: 2680 bis 3109,
AT5: 3230 bis 3538,
KR5: 3878 bis 4056,
ACP5: 4159 bis 4240,
KS6: 4271 bis 4703,
AT6: 4741 bis 5048,
DH6: 5095 bis 5234,
KR6: 5679 bis 5856,
ACP6: 5955 bis 6036;

in SEQ ID NO: 6,
KS7: 34 bis 461,
AT7: 550 bis 891,
KR7: 1212 bis 1396,
ACP7: 1483 bis 1564,
KS8: 1591 bis 2020,
AT8: 2108 bis 2448,
ACP8: 2525 bis 2606,
KS9: 2636 bis 3086,
AT9: 3226 bis 3591,
DH9: 3629 bis 3763,
KR9: 4183 bis 4363,
ACP9: 4460 bis 4553,
TE9: 4627 bis 4873; und

in SEQ ID NO: 7,
KS10: 38 bis 467,
AT10: 574 bis 914,
DH10: 956 bis 1081,
KR10: 1488 bis 1673,
ACP10: 1756 bis 1837,
KS11: 1864 bis 2294,
AT11: 2390 bis 2732,
DH11: 2776 bis 2902,
KR11: 3288 bis 3473,
ACP11: 3556 bis 3637,
KS12: 3663 bis 4093,
AT12: 4182 bis 4523,
DH12: 4565 bis 4685,
KR12: 5085 bis 5270,
ACP12: 5353 bis 5434.
[2] Herstellung der modifizierten Avermectin-Aglyconsynthase
(1) Einführung der ortsspezifischen Mutation
DNA, die eine modifizierte Avermectin-Aglyconsynthase mit einer Mutation codiert, damit die Aktivität in mindestens einer Domäne eliminiert oder signifikant erniedrigt wird, wird basierend auf den vorstehenden Angaben hergestellt. Die Domäne, in der die Aktivität eliminiert oder signifikant erniedrigt wird, kann jede der vorstehend beschriebenen Domänen sein und sie sind vorzugsweise ATs, ACPs, KS1, AT1, KR1, ACP1, KS2, DH2 und KR2.
Mutationen zur Eliminierung oder signifikanten Erniedrigung der Aktivität in diesen Domänen sind nicht besonders begrenzt. Beispiele davon schließen die Deletion oder Substitution eines Aminosäurerests im aktiven Zentrum ein. Es ist wichtig, dass ein Avermectin-Aglyconsynthase-Protein produziert wird, indem es aus zwei großen Transkriptionseinheiten translatiert wird. Wenn daher ein Terminationscodon oder eine Mutation durch Verschiebung des Leserahmens in das Gen eingeführt wird, das in der stromaufwärtsliegenden Domäne der Transkriptionseinheit vorhanden ist, wird die Transkription mitten im Verlauf beendet, und in einigen Fällen wird die Aktivität der stromabwärtsliegenden Domäne nicht exprimiert. In einem derartigen Fall, auch wenn keine Mutation in der stromabwärtsliegenden Domäne des Gens an sich vorliegt, wird die gesamte mutierte Transkriptionseinheit betrachtet, als ob sie deaktiviert wurde. Um den Einfluss auf die gesamte Transkriptionseinheit zu minimieren, wird die Mutation, die eingeführt werden soll, vorzugsweise durchgeführt, indem die Einführung einer Verschiebung des Leserahmens oder eines Terminationscodons verhindert wird. Stärker bevorzugt wird die Mutation durchgeführt, indem eine spezifische Aminosäure in einem aktiven Zentrum mit einer anderen Aminosäure substituiert wird. Beispiele einer derartigen Mutation schließen eine Mutation ein, in der Serin als aktives Zentrum von AT, Serin als aktives Zentrum von ACP oder Cystein als aktives Zentrum von KS [Eur. J. Biochem., 204, 39-49 (1992)] mit einer anderen Aminosäure substituiert ist. Spezifischere Beispiele schließen eine Mutation ein, in der „T", durch das Nucleotid 1969 in der Nucleotidsequenz repräsentiert wird, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, die KS1 codiert, mit „G" substituiert ist. Als Folge dieser Mutation wird ein Cystein-Rest, der durch die Aminosäure 657 in der Aminosäuresequenz repräsentiert wird, die in SEQ ID NO: 4 dargestellt ist, mit einem Glycin-Rest ersetzt. Der Cystein-Rest, der durch die Aminosäure 657 in der Aminosäuresequenz repräsentiert wird, die in SEQ ID NO: 4 dargestellt ist, ist auch in einer anderen Ketosynthase konserviert [Eur. J. Biochem., 204, 39-49 (1992)], und man schließt daraus, dass er bei der Expression der Aktivität in dieser Domäne wesentlich ist.
Verfahren zur Einführung einer Mutation sind nicht besonders begrenzt und beinhalten: ein Verfahren, in dem Zellen mit DNA, die eine Avermectin-Aglyconsynthase ohne Mutation codiert, einer Mutation durch NTG-Behandlung oder UV-Bestrahlung unterzogen werden; ein Verfahren, in dem DNA an sich, die eine Avermectin-Aglyconsynthase ohne Mutation codiert, mit einem Mutagen wie Hydroxyharnstoff behandelt wird; und ein Verfahren, in dem eine ortsspezifische Mutation basierend auf der Nucleotidsequenz-Information über das Avermectin-Aglyconsynthasegen eingeführt wird. Darunter ist das Verfahren zur Einführung einer ortsspezifischen Mutation basierend auf der Nucleotidsequenz-Information geeignet, da eine spezifische Mutation in riesige Gene wie das Avermectin-Aglyconsynthasegen eingeführt werden kann, ohne eine unbeabsichtigte Mutation zu verursachen. Beispielsweise kann eine Mutation gemäß Verfahren eingeführt werden, die in Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Current Protocols in Molecular Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985) und Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985), beschrieben werden.
(2) Herstellung von mit rekombinanter DNA transformierten Zellen und Herstellung der modifizierten Avermectin-Aglyconsynthase
Verfahren zum Erhalten einer modifizierten Avermectin-Aglyconsynthase schließen ein Verfahren unter Verwendung von Stämmen ein, die die in (1) beschriebene modifizierte Avermectin-Aglyconsynthase aufweist, und ein Verfahren unter Verwendung einer Transformante, die durch Ligieren der Mutagen-behandelten DNA oder der durch ortsspezifische Mutation eingeführten DNA, beschrieben in (1), hergestellt wird, und Vektor-DNA ein, um eine rekombinante DNA herzustellen, und die rekombinante DNA wird in eine Wirtszelle eingeführt, so dass eine Transformante hergestellt wird. Die in dem letzteren Verfahren verwendete Wirtszelle schließt Bakterien, Hefe, filamentöse Pilze, tierische Zellen, Pflanzenzellen und Insektenzellen ein, solange die eingeführten modifizierten Gene in der Zelle exprimierbar sind. Es ist möglich, als Expressionsvektor jeden Vektor zu verwenden, der in den vorstehenden Wirtszellen autonom replizieren kann oder in dessen Chromosomen integriert werden kann und der einen Promotor an einer Stelle enthält, der die Transkription der eingeführten modifizierten Gene (hier nachstehend als DNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, bezeichnet) erlaubt.
Wenn ein Prokaryont (z.B. Bakterium) als Wirtszelle verwendet wird, kann ein bevorzugter rekombinanter Vektor, der DNA umfasst, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, in Prokaryonten autonom replizierbar sein und einen Promotor, eine Ribosomenbindungssequenz, die DNA der vorliegenden Erfindung und einen Terminator umfassen. Der Vektor kann ferner ein Gen umfassen, das den Promotor reguliert.
Beispiele von Expressionsvektoren schließen pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (von denen jeder im Handel von Boehringer Mannheim erhältlich ist), pKK233-2 (hergestellt von Pharmacia), pSE280 (hergestellt von Invitrogen), pGEMEX-1 (hergestellt von Promega), pQE-8, pQE-9, pQE-60, pQE-70 (von denen jeder von QIAGEN hergestellt wird), pKYP10 (Japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 110600/83 ), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306, (1985)], pBluescript II SK(-) (hergestellt von Stratagene), pTrS30 [hergestellt aus Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)], pTrS32 [hergestellt aus Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)], pGHA2 [hergestellt aus Escherichia coli IGHA2 (FERM BP-400), japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 221091/85 ], pGKA2 [hergestellt aus Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-6798), japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 221091/85 ], pTerm2 ( US4686191 , US4939094 , US5160735 ), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pGEX (hergestellt von Pharmacia), pUC19 [Gene, 33 103 (1985)], pUC118 (hergestellt von Pharmacia), pET-System (hergestellt von Novagen), pIJ702 und pIJ922 etc. ein.
Beispiele chromosomaler Integrationsvektoren schließen einen Vektor ein, der vom Actinophagen R4 stammt [J. Bacteriol., 173, 4237 (1991)].
Beispiele homologer Rekombinationsvektoren schließen pKC7 ein (Japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 189774/94 ).
Jeder Promotor, der in der Lage ist, in Wirtszellen zu funktionieren, kann verwendet werden, einschließlich Promotoren, die von Escherichia coli oder einem Phagen stammen, wie der trp-Promotor (Ptrp), lac-Promotor (Plac), P_L-Promotor, P_R-Promotor und T7-Promotor. Ein künstlich konstruierter, modifizierter Promotor kann ebenfalls verwendet werden, einschließlich eines Promotors, der durch Bindung von zwei Ptrp-Promotoren hintereinander (Ptrp × 2) erhalten wird, des tac-Promotors, des lac T7-Promotors und des let I-Promotors.
Es wird bevorzugt, ein Plasmid mit einer geeigneten Entfernung (z.B., 6-18 Nucleotide) zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz (d.h. Ribosom-bindende Sequenz) und einem Start-Codon zu verwenden. In dem rekombinanten Vektor der vorliegenden Erfindung ist ein Terminator nicht unbedingt für die Expression der DNA der vorliegenden Erfindung erforderlich, befindet sich jedoch wünschenswerterweise unmittelbar stromabwärts eines Strukturgens.
Wirtszellen schließen einen Mikroorganismus ein, der zu Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Streptomyces und dergleichen gehört. Spezifische Beispiele schließen Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli Nr.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli GI698, Escherichia coli TB1, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC13869, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. D-0110, Streptomyces lividans TK23, Streptomyces lividans ATCC69411, Streptomyces coelicolor ATCC13405, Streptomyces griseus ATCC23915, Streptomyces avermitilis ATCC31267, Streptomyces avermitilis FERM BP-2773 und Streptomyces avermitilis FERM BP-2775 etc. ein
Der rekombinante Vektor kann durch irgendeines der Verfahren zum Einführen von DNA in die vorstehenden Wirtszellen eingeführt werden: beispielsweise das Verfahren, bei dem Calciumionen verwendet werden [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], das Protoplastenverfahren (Japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 248394/88 ) und das in Gene, 17, 107 (1982) und Molecular & General Genetics, 168 111 (1979), beschriebene Verfahren.
Wenn Hefe als Wirtszelle verwendet wird, schließen Beispiele von verwendbaren Expressionsvektoren YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19 und pHS15 etc. ein.
Jeder Promotor, der in der Lage ist, in Hefezellen zu funktionieren, kann verwendet werden, einschließlich Glykolyse-Gen-Promotoren wie Hexosekinase, PHO5-Promotor, PGK-Promotor, GAP-Promotor, ADH-Promotor, gal 1-Promotor, gal 10-Promotor, Hitzeschock-Polypeptid-Promotor, MF α1-Promotor und CUP 1-Promotor.
Wirtszellen schließen Mikroorganismen ein, die zu Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Pichia und Candida gehören. Spezifische Beispiele schließen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius oder Candida utilis etc. ein.
Der rekombinante Vektor kann durch irgendeines der Verfahren zum Einführen von DNA in Hefe eingeführt werden: beispielsweise Elektroporation [Methods Enzymol., 194, 182 (1990)], das Sphäroplasten-Verfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)], das Lithiumacetat-Verfahren [J. Bacteriology, 153, 163 (1983)] und das in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) beschriebene Verfahren.
Wenn eine tierische Zelle als Wirtszelle verwendet wird, schließen Beispiele von verwendbaren Expressionsvektoren pcDNAI, pcDM8 (hergestellt von Funakoshi), pAGE107 [Japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 22979/91 , Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 (Japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 227075/90 ), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI/Amp (hergestellt von Invitrogen), pREP4 (hergestellt von Invitrogen), pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], und pAGE210 etc. ein.
Jeder Promotor, der in der Lage ist, in tierischen Zellen zu funktionieren, kann verwendet werden, einschließlich eines Promotors für das unmittelbar frühe (IE) Gen des Cytomegalievirus (CMV), des frühen SV40-Promotors, eines retroviralen Promotors, des Metallothionein-Promotors, des Hitzeschock-Promotors und SRα-Promotors. Ein Enhancer für das IE-Gen des menschlichen CMV kann auch zusammen mit einem derartigen Promotor verwendet werden.
Wirtszellen schließen menschliche Namalwa-Zellen, Affen-COS-Zellen, chinesische Hamster-CHO-Zellen oder HBT5637 (Japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 299/88) ein.
Der rekombinante Vektor kann durch irgendeines der Verfahren zum Einführen von DNA in tierische Zellen eingeführt werden: beispielsweise Elektroporation [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], Calcium-Phosphat-Verfahren (Japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 227075/90 ), Lipofektionsverfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] und das in Virology, 52, 456(1973) beschriebene Verfahren etc.
Wenn eine Insektenzelle als Wirtszelle verwendet wird, kann ein Polypeptid durch ein in Current Protocols in Molecular Biology; Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992); oder Bio/Technology, 6, 47 (1988), beschriebenes Verfahren exprimiert werden.
Genauer gesagt, können ein rekombinanter Gentransfervektor und ein Baculovirus gemeinsam in Insektenzellen eingeführt werden, um ein rekombinantes Virus im Überstand aus der Insektenzellkultur zu erhalten. Anschließend können Insektenzellen weiter mit dem sich ergebenden rekombinanten Virus infiziert werden, um das Polypeptid zu exprimieren.
Ein bei dem vorstehenden Verfahren zu verwendender Gentransfervektor schließt pVL1392, pVL1393 bzw. pBlueBacIII (hergestellt von Invitrogen) ein. Als Baculovirus kann beispielsweise das Autographs californica-Kernpolyedervirus, das Noctuidae-Insekten infiziert, verwendet werden.
Insektenzellen schließen Spodoptera frugiperda-Eizellen, Sf9- und Sf21-, [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)], und Trichoplusia ni-Eizellen, High 5 (hergestellt von Invitrogen) etc. ein.
Die gemeinsame Einführung des rekombinanten Gentransfervektors und des Baculovirus in Insektenzellen zur rekombinanten Virusproduktion kann durch das Calcium-Phosphat-Verfahren (Japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 227075/90 ) oder das Lipofektionsverfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] erfolgen.
Wenn eine Pflanzenzelle als Wirtszelle verwendet wird, schließen Beispiele eines Expressionsvektors das Ti-Plasmid und den Tabakmosaikvirus-Vektor etc. ein.
Jeder Promotor, der in der Lage ist, in Pflanzenzellen zu funktionieren, kann verwendet werden, einschließlich des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV)-35S-Promotors und Reis-Actin 1-Promotors.
Wirtszellen schließen Pflanzenzellen wie Tabak, Kartoffel, Tomate, Karotte, Sojabohne, Brassica, Luzerne, Reis, Weizen und Gerste ein.
Der rekombinante Vektor kann durch irgendeines der Verfahren zum Einführen von DNA in Pflanzenzellen eingeführt werden: beispielsweise das Agrobacterium-Verfahren (Japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 140885/84 , japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 70080/85 , WO94/00977 ), Elektroporationsverfahren (Japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 251887/85 ), und Partikelbeschuss-Verfahren (Japanisches Patent Nr. 2606856 , Japanisches Patent Nr. 2517813 ).
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann durch Züchten einer Transformante der vorliegenden Erfindung erhalten werden, die wie vorstehend angegeben in einem Medium hergestellt wird, bis das Polypeptid der vorliegenden Erfindung produziert und in der Kultur angehäuft wird, und das Polypeptid aus der Kultur gesammelt wird.
Die Transformante der vorliegenden Erfindung kann in einem Medium nach einem herkömmlichen Verfahren gezüchtet werden, das zur Züchtung von Wirtszellen verwendet wird.
Wenn die Transformante der vorliegenden Erfindung von einem prokaryontischen Wirt wie Escherichia coli oder einem eukaryontischen Wirt wie Hefe stammt, kann das Medium zur Züchtung der Transformante ein natürliches oder synthetisches Medium sein, sofern das Medium eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze etc. enthält, die von der Transformante assimiliert werden können und die effiziente Züchtung der Transformante ermöglicht.
Jede von der Transformante assimilierte Kohlenstoffquelle kann verwendet werden. Beispiele schließen Kohlenhydrate wie Glucose, Fructose, Saccharose, Melasse, die dieselben enthält, Stärke und Stärkehydrolysate; organische Säuren wie Essigsäure und Propionsäurealkohole wie Ethanol und Propanol ein.
Beispiele einer verwendbaren Stickstoffquelle schließen Ammoniak, Ammoniumsalze anorganischer oder organischer Säuren wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat; andere Stickstoff enthaltende Verbindungen; und Peptone; Fleischextrakte, Hefeextrakte, Maisquellwasser, Caseinhydrolysate, Sojabohnenmehl, Sojabohnenmehlhydrolysate, verschiedene fermentierte Mikroorganismuszellen und Hydrolysate davon ein.
Hier verwendbare anorganische Salze schließen Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat, Calciumcarbonat und dergleichen ein.
Die Züchtung erfolgt unter aeroben Bedingungen, wie sie für die Schüttelkultur oder Submerskultivierung unter Rühren mit Belüftung verwendet werden. Die Kulturtemperatur liegt vorzugsweise im Bereich von 15 bis 40°C und die Kulturdauer beträgt gewöhnlich 16 Stunden bis 7 Tage. Während dem Züchten wird der pH-Wert vorzugsweise bei einem pH-Wert von 3,0 bis 9,0 gehalten. Der pH-Wert wird unter Verwendung einer anorganischen oder organischen Säure, einer alkalischen Lösung, Harnstoff, Calciumcarbonat, Ammoniak und dergleichen eingestellt.
Falls erforderlich, können dem Medium während der Kultur Antibiotika wie Ampicillin and Tetracyclin zugegeben werden.
Wo ein Mikroorganismus mit einem rekombinanten Vektor transformiert wird, der einen induzierbaren Promotor enthält, kann die Transformante in einem Medium gezüchtet werden, das, falls erforderlich, mit einem Induktor ergänzt ist. Beispielsweise kann im Falle eines Mikroorganismus, der mit einem rekombinanten Vektor transformiert wurde, der den lac-Promotor umfasst, dem Medium Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid oder dergleichen zugegeben werden, und im Falle eines Mikroorganismus, der mit einem rekombinanten Vektor transformiert wurde, der den trp-Promotor umfasst, kann Indolacrylsäure oder dergleichen zugegeben werden.
Ein Medium zur Züchtung einer Transformante, die von einer tierischen Wirtszelle stammt, kann ein allgemein verwendetes Medium wie das RPMI 1640-Medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle-MEM-Medium [Science, 122, 501 (1952)], modifiziertes Dulbecco-MEM-Medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199-Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] oder irgendeines dieser Medien sein, das mit fötalem Rinderserum zusätzlich ergänzt ist.
Die Züchtung erfolgt gewöhnlich bei einem pH-Wert von 6 bis 8, bei einer Temperatur von 30 bis 40°C für einen Zeitraum von 1 bis 7 Tagen in Gegenwart von 5% CO₂.
Falls erforderlich, können dem Medium während der Kultur Antibiotika wie Kanamycin und Penicillin zugegeben werden.
Das Medium zur Züchtung einer Transformante, die von einer Insektenwirtszelle stammt, kann ein allgemein verwendetes Medium wie TNM-FH-Medium (hergestellt von Pharmingen), Sf-900 II SFM-Medium (hergestellt von Life Technologies), ExCell 400 und ExCell 405 [beide hergestellt von JRH Biosciences], Grace's Insekten-Medium [Nature, 195, 788 (1962)] oder dergleichen sein.
Die Züchtung erfolgt bei einem pH-Wert von 6 bis 7, bei einer Temperatur von 25 bis 30°C für einen Zeitraum von 1 bis 5 Tage.
Falls erforderlich, können dem Medium während der Kultur Antibiotika wie Gentamycin zugegeben werden.
Die von einer Pflanzenwirtszelle stammende Transformante kann als Zelle gezüchtet werden oder man lässt sie in Pflanzenzellen oder Organe differenzieren. Das Medium zur Züchtung einer derartigen Transformante kann ein allgemein verwendetes Medium wie Murashige und Skoog (MS)-Medium, White-Medium oder irgendeines dieser Medien sein, die zusätzlich mit einem Pflanzenhormon wie Auxin oder Cytokinin ergänzt sind.
Die Züchtung erfolgt gewöhnlich bei einem pH-Wert von 5 bis 9, bei einer Temperatur von 20 bis 40°C für einen Zeitraum von 3 bis 60 Tagen.
Falls erforderlich, können einem Medium während der Kultur Antibiotika wie Kanamycin und Hygromycin zugegeben werden.
Wie vorstehend angegeben, kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung durch Züchten einer von einem Mikroorganismus, einer von einer tierischen Zelle, einer von einer Pflanzenzelle stammenden Transformante stammen, die einen rekombinanten Vektor trägt, der eine DNA umfasst, die das Polypeptid auf eine übliche Weise codiert, um das Polypeptid zu produzieren und anzuhäufen, und dann das Polypeptid aus der Kultur zu gewinnen.
Ein Gen von Interesse kann entweder direkt oder als sekretorisches Protein oder Fusionspolypeptid nach dem Verfahren wie in Molecular Cloning, 2. Ausgabe beschrieben, exprimiert werden.
Bei der Expression in Hefe-, tierischen, Insekten- oder Pflanzenzellen kann ein Polypeptid mit einem daran hinzugefügten Zucker oder einer daran hinzugefügten Zuckerseitenkette versehen werden.
Das Protein der vorliegenden Erfindung kann durch intrazelluläre Produktion durch Wirtszellen, extrazelluläre Sekretion durch Wirtszellen oder Produktion auf äußeren Membranen durch Wirtszellen erfolgen. Ein derartiges Produktionsverfahren kann abhängig von der Art der verwendeten Wirtszellen oder nach Änderung der Struktur des Proteins gewählt werden.
Falls das Polypeptid der vorliegenden Erfindung in Wirtszellen oder auf den äußeren Membranen von Wirtszellen produziert wird, kann das Polypeptid effizient aus den Wirtszellen unter Verwendung des Verfahrens von Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], des Verfahrens von Lowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)] oder Verfahren wie in den japanischen veröffentlichten, ungeprüften Patentanmeldungen Nr. 336963/93 und 823021/94 beschrieben, extrazellulär sekretiert werden.
Genauer gesagt, kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung effizient aus Wirtszellen sekretiert werden, indem es mit einem Signalpeptid exprimiert wird, anschließend genetische Rekombinationsverfahren verwendet werden, das Signalpeptid stromaufwärts eines Polypeptids hinzugefügt wird, das die aktive Stelle des Polypeptids der vorliegenden Erfindung enthält.
Die Polypeptid-Produktion kann erhöht werden, indem ein Genamplifizierungssystem verwendet wird, das gemäß dem in der japanischen veröffentlichten, ungeprüften Patentanmeldung Nr. 227075/90 beschriebenen Verfahren ein Dehydrofolatreduktasegen oder dergleichen verwendet.
Ferner können tierische oder Pflanzenzellen, die ein Transgen tragen, erneut differenziert werden, um ein tierisches Individuum zu erzeugen, das ein Transgen (transgenes nicht-menschliches Lebewesen) trägt oder ein pflanzliches Individuum, das ein Transgen (transgene Pflanze) trägt, die zur Produktion des Polypeptids der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Wenn die Transformante ein tierisches oder ein pflanzliches Individuum ist, kann das Polypeptid erhalten werden, indem das Individuum auf eine übliche Art ernährt oder gezüchtet wird, um das Polypeptid zu produzieren und anzureichern, und dann das Polypeptid aus dem Tier oder dem Pflanzenindividuum zu gewinnen.
Um das Polypeptid der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines tierischen Individuums zu produzieren, kann man beispielsweise in einem Tier, das ein Transgen trägt, das Polypeptid der vorliegenden Erfindung auf bekannte Art und Weise erzeugen, wie bei American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996); American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996); und Bio/Technology, 9, 830 (1991) beschrieben.
Im Falle eines tierischen Individuums kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung beispielsweise erhalten werden, indem ein transgenes nicht-menschliches Lebewesen, das eine DNA-Insertion trägt, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, ernährt wird und darin das Polypeptid produziert und angereichert wird, und dann das Polypeptid von dem Tier gesammelt wird. Das Polypeptid kann in der Milch (Japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 309192/88 ), im Ei und dergleichen des Tieres produziert und angereichert werden. Es kann jeder Promotor verwendet werden, der in einem Tier funktioniert, beispielsweise Promotoren, die spezifisch sind für Brustdrüsenzellen, wie der β-Casein-Promotor, β-Lactoglobulin-Promotor und jeder saure Molkeprotein-Promotor, der bevorzugt wird.
Um das Polypeptid der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines pflanzlichen Individuums zu produzieren, kann beispielsweise eine transgene Pflanze, die eine DNA-Insertion trägt, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, gezüchtet werden, um dort das Polypeptid auf bekannte Art und Weise zu produzieren und anzureichern, wie bei Tissue Culture (Soshiki Baiyo), 20 (1994); Tissue Culture, 21 (1995) und Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997), beschrieben, und dann kann das Polypeptid aus der Pflanze gewonnen werden.
Zur Isolierung und Reinigung des aus der Transformante der vorliegenden Erfindung hergestellten Polypeptids können herkömmliche Verfahren zur Isolierung und Reinigung der Enzyme verwendet werden.
Wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung beispielsweise in einer löslichen Form in Zellen exprimiert wird, werden die Zellen nach Beendigung der Züchtung durch Zentrifugation gesammelt, in einem wässrigen Puffer suspendiert und dann mit einem Ultraschall-Zellzertrümmerer, einer French Press, einem Manton-Gaulin-Homogenisator, einer Dynomill-Kugelmühle oder dergleichen aufgebrochen, so dass ein zellfreier Extrakt erhalten wird. Eine gereinigte Zubereitung kann durch Zentrifugation des zellfreien Extrakts erhalten werden. Der erhaltene Überstand wird dann herkömmlichen Isolierungs- und Reinigungsverfahren für Enzyme unterzogen, d.h. Lösungsmittelextraktion, Aussalzen oder Entsalzen mit Ammoniumsulfat etc., Präzipitation mit organischem Lösungsmittel, Anionenaustausch-Chromatographie auf Harz wie Diethylaminoethyl (DEAE)-Sepharose oder DIAION HPA-75 (hergestellt von Mitsubishi Chemical Industries Ltd.), Kationenaustauschchromatographie auf Harz wie S-Sepharose FF (hergestellt von Pharmacia), hydrophobe Chromatographie auf Harz wie Butylsepharose oder Phenylsepharose, Gelfiltration unter Verwendung eines Molekularsiebs, Affinitätschromatographie, Chromatofokussierung oder Elektrophorese wie isolelektrische Fokussierung oder Kombinationen davon.
Falls das Polypeptid als Einschlusskörper in Zellen exprimiert wird, werden die Zellen auf ähnliche Weise gesammelt, aufgebrochen und zentrifugiert, so dass sich unlösliches Material des Polypeptids als präzipitierte Fraktion ergibt. Das sich ergebende unlösliche Polypeptid wird dann mit einem proteindenaturierenden Mittel solubilisiert. Die solubilisierte Lösung wird dann verdünnt oder dialysiert, um das Mittel auf eine niedrigere Konzentration zu senken, so dass das Polypeptid in seine normale Konfiguration renaturiert werden kann. Die gereinigte Präparation des Polypeptids kann dann durch Verwendung derselben Isolierungs- und Reinigungsverfahren erhalten werden, wie vorstehend beschrieben.
Falls das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Derivat davon mit einer daran hinzugefügten Zuckerkette extrazellulär sekretiert wird, können das Polypeptid oder dessen Derivate aus dem Kulturüberstand gewonnen werden. Und zwar die Kultur wird demselben Verfahren unterzogen, wie vorstehend beschrieben, wie Zentrifugation, so dass sich ein Kulturüberstand ergibt. Aus dem Kulturüberstand kann eine gereinigte Zubereitung auf dieselbe Art und Weise zur Isolierung und Reinigung erhalten werden, wie vorstehend beschrieben.
Das so erhaltene Polypeptid kann beispielsweise ein Polypetid sein, das die in SEQ ID NO: 8 dargestellte Aminosäuresequenz besitzt.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann durch chemische Syntheseverfahren einschließlich des Fmoc-Verfahrens (Fluorenylmethyloxycarbonyl-Verfahren), t-Boc-Verfahrens (t-Butyloxycarbonyl-Verfahren) usw. produziert werden. Es kann auch chemisch unter Verwendung eines Peptidsynthese-Geräts synthetisiert werden, das von Advanced ChemTech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive oder Shimadzu Corporation etc. erhältlich ist.
Dagegen kann ein Verfahren zum Einbau von DNA mit einer Mutation, die in vitro in die chromosomale DNA der Wirtszelle eingeführt wurde, durch jedes Verfahren durchgeführt werden, das die homologe Rekombination von DNA nutzt. Beispiele derartiger Verfahren schließen ein in der japanischen veröffentlichten, ungeprüften Patentanmeldung Nr. 189774/94 beschriebenes Verfahren ein.
Zellen, die ein modifiziertes Avermectin-Aglyconsynthasegen mit einer Mutation besitzen, die wie vorstehend beschrieben eingeführt wurde, sind insofern nicht besonders begrenzt, als die Zellen das Gen tragen können und jegliche prokaryontische Zellen wie Escherichia coli, Bacillus subtilis und Actinomyces sein können. Beispiele davon schließen Mikroorganismen ein, die zu Streptomyces avermitilis gehören.
[3] Herstellung einer Substratverbindung zur Herstellung von 22,23-Dihydroavermectin B1a oder einem Derivat davon
In der vorliegenden Erfindung kann die Substratverbindung zur Herstellung von 22,23-Dihydroavermectin B1a oder einem Derivat davon jede Substanz sein, sofern die Substanz als Substrat für die Avermectin-Aglyconsynthase verwendet werden kann, wie vorstehend beschrieben. Genauer gesagt, kann beim Verfahren zur Synthese von Avermectin-Aglycon die Substanz ein Substrat für die Domäne sein, die für den letzten Reaktionsschritt in der modifizierten Domäne verantwortlich ist, und vorzugsweise wird eine N-Acetylcysteamin-Verbindung verwendet. Wenn beispielsweise die in 2 dargestellte KS-Domäne von SE1 modifiziert ist, besitzt die N-Acetylcysteamin-Verbindung vorzugsweise eine Struktur, wie durch Formel (I) dargestellt:
wobei R¹ Methyl ist und R² sec-Butyl ist.
Spezifische Beispiele derartiger Verbindungen schließen eine Verbindung (in der nachstehenden Tabelle dargestellte Verbindung 4) ein, die durch die vorstehende Formel dargestellt wird, wobei R¹ Methyl ist und R² sec-Butyl ist. Die Verbindung verwendet beispielsweise die in der nachstehenden Tabelle dargestellte Verbindung A als Ausgangsmaterial und kann chemisch auf folgende Weise über die Verbindungen 1 bis 3 synthetisiert werden, die in der Tabelle ähnlich dargestellt sind.
Am Anfang wird Verbindung 1 unter Verwendung von Verbindung A als Ausgangsmaterial hergestellt und eine Ozonoxidation durchgeführt, worauf sich die Wittig-Reaktion anschließt, um Kohlenstoffketten hinzuzufügen. Nachdem das t-Butyldimethylsilyl von Verbindung 1 entschützt wird, wird eine Schutzgruppe unter Verwendung von Chloroethyltrisilan neu eingeführt, um Verbindung 2 zu erhalten. Folglich wird die ungesättigte α-β-Kohlenstoffbindung in Verbindung 2 in Gegenwart eines Palladiumkohlenstoff-Katalysators reduziert, der Ester wird mit Kaliumhydroxid hydrolysiert und neutralisiert, gefolgt von der Zugabe von N-Acetylcysteamin in Gegenwart eines Kondensationsmittels. So wird eine Thioesterverbindung, Verbindung 3 erhalten. Schließlich wird zur Verbindung 3 Essigsäure gegeben, um die Schutzgruppe zu entfernen. So wird Verbindung 4 hergestellt.
Die Zwischenprodukte und die Verbindungen von Interesse im vorstehenden Herstellungsverfahren werden Trennungsreinigungsverfahren unterzogen, die gewöhnlich in der organischen synthetischen Chemie, beispielsweise bei der Filtration, Extraktion, beim Waschen, Trocknen, Konzentration, Rekristallisierung oder bei verschiedenen Chromatographien verwendet werden, und sie können daher isoliert und gereinigt werden. Das Zwischenprodukt kann ohne Reinigung in der nachfolgenden Reaktion eingesetzt werden.
Tabelle 1 Verbindungen
[4] Herstellung von 22,23-Dihydroavermectin B1a oder einem Derivat davon
Jede Kultur, Zellen oder behandelte Zellen der Zellen, die durch die Transformation der Wirtszelle in [2]-2 erhalten werden, können in der Reaktion mit den Substratverbindungen verwendet werden, sofern das modifizierte Avermectin-Aglycon, das in der transformierten Zelle exprimiert wird, funktionsfähig ist.
Behandelte Zellen schließen getrocknete Zellen, gefriergetrocknete Produkte, mit oberflächenaktiven Mitteln oder mit organischen Lösungsmitteln behandelte Produkte, mit Enzym behandelte Produkte, mit Ultraschall behandelte Produkte, mechanisch gemahlene Produkte, Proteinfraktionen von Zellen und immobilisierte Zellen von behandelten Zellen ein.
Jedes Verfahren, das die Substratverbindung auf die transformierte Wirtszelle wirken lässt, kann verwendet werden, sofern die Synthese von Avermectin-Aglycon gestört wird. Spezifische Beispiele davon schließen ein Verfahren, bei dem man die Zellkultur oder behandelte Produkte davon mit dem Substrat in einem geeigneten Medium reagieren lässt, und ein Verfahren ein, bei dem die Zellen gezüchtet werden, indem das Substrat am Anfang oder mitten im Verlauf der Kultur zugegeben wird.
Die in der Reaktion verwendeten Medien schließen Wasser, Puffer wie Phosphat, Carbonat, Acetat, Borat, Citrat und Tris, wässrige Lösungen, die organische Lösungsmittel enthalten, beispielsweise Alkohole wie Methanol und Ethanol, Ester wie Ethylacetat, Ketone wie Aceton und Amide wie Acetamid ein. Falls erforderlich, können oberflächenaktive Mittel wie Triton X-100 (hergestellt von Nacalai Tesque, Inc.) oder Nonion HS204 (hergestellt von NOF Corp.) oder organische Lösungsmittel wie Toluol und Xylol in einer Menge von etwa 0,1 bis 20 g/l verwendet werden.
Die Reaktion erfolgt 1 bis 96 Stunden in der vorstehenden wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6 bis 8, bei 20 bis 50°C.
Wenn die Wirtszelle in einem Medium gezüchtet wird, kann das Züchten auf dieselbe Weise erfolgen wie zum Erhalt des Polypeptids.
22,23-Dihydroavermectin B1a oder ein Derivat davon kann aus dem Reaktionsprodukt oder der Kultur isoliert werden, die durch irgendeines der vorstehenden Verfahren nach herkömmlichen Isolierungsverfahren erhalten wird. Beispielsweise wird die gezüchtete Zelle mit Aceton oder Methanol behandelt, um 22,23-Dihydroavermectin B1a oder ein Derivat davon zu extrahieren, und nach dem Entfernen des Rückstandes konzentriert. Das Konzentrat wird mit Methylenchlorid verarbeitet, die Methylenchlorid-Schicht wird fraktioniert und unter verringertem Druck weiter fraktioniert. So kann die betreffende Verbindung erhalten werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine graphische Darstellung, die eine Restriktionskarte der BamHI-, Bg/II-, ClaI-, EcoRI-, KpnI-, MluI-, PstI-, StuI- und XhoI-Schnittstellen der Avermectin-Aglyconsynthasegene aveAI und aveAII von Streptomyces avermitilis zeigt. Die Pfeile zeigen die abgeleitete Transkriptionsrichtung jedes Gens.
2(a) zeigt die Position der Avermectin-Aglyconsynthasegene auf dem Chromosom und die Domänensequenz der Synthase-Einheiten, 2(b) und 2(c) zeigen die abgeleiteten Schritte der Avermectin-Aglyconsynthese, und 2(d) zeigt die Struktur von 6,8-sec-6,8a-Desoxy-5-oxoavermectin-Aglycon und die Position der integrierten niedrigen Fettsäuren in seinem Skelett, die von einer Polyketidsythase synthetisiert worden waren, die ein Genprodukt der Avermectin-Aglyconsynthasegene aveAI und aveAII ist.

ACP:: Acylträgerprotein
KS:: β-Ketoacyl-ACP-Synthase
AT:: Acyltransferase
KR:: β-Ketoacyl-ACP-Reduktase
DH:: Dehydratase
ER:: Enoylreduktase
TE:: Thioesterase

3 ist eine graphische Darstellung, die ein Vorgehen zur Konstruktion eines bei der Transformation von Streptomyces avermitilis zu verwendenden Plasmids zeigt, wobei (I) das Plasmid pKS1 zeigt, das durch Clonieren von KS1 hergestellt wurde, das DNA enthält, die einen Aminosäurerest in einem aktiven Zentrum codiert, (II) das Plasmid pKSmut zeigt, das durch Clonierung der KS1 codierenden DNA hergestellt wird, indem ein Aminosäurerest in einem aktiven Zentrum substituiert wird, (III) das Plasmid pKSmutRL zeigt, das durch Anwendung von Addition und Substitution eines DNA-Fragments an pKSmut hergestellt wird, das in (IV) gezeigt wird und (IV) ist die Restriktionskarte von DNA, die KS1 codiert, das bei der Konstruktion von pKSmutRL verwendet wird.
In der Zeichnung gibt „A" die Position der Nucleotide an, die substituiert wurden, und HindIII, PstI, BamHI, KpnI und EcoRI geben die DNA-Schnittstellen jedes Restriktionsenzyms an. Die Zahlenwerte in (I), (II) und (III) geben an, wenn ein gewünschtes Nucleotid von jedem Plasmid als Nr.1 bestimmt wird, und geben die Entfernung (bp) von dem Nucleotid an, und die Zahlenwerte in dem Kreis geben die Gesamtplasmidlänge (bp) an. Die Zahlenwerte in (IV) entsprechen den in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nucleotiden. Abkürzungen der Zeichnungen sind wie folgt.

bla:: β-Lactamase (Pfeil gibt die Transkriptionsrichtung an)
ori:: Replikationsursprung (Ursprung)
Plac:: β-Lactamase-Promotor (Pfeil gibt die Richtung des Promotors an)
IG:: intergene M13-Phagenregion (intergene M13-Region)

Beste Arten zur Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird detaillierter mit Bezugnahme auf Beispiele beschrieben; jedoch sollen diese Beispiele nicht den Umfang der vorliegenden Erfindung begrenzen.
[Beispiel 1] Bestimmung der Nucleotidsequenz und Struktur des Avermectin-Aglyconsynthasegens.
Eine Nucleotidsequenz der DNA, die die Avermectin-Aglyconsynthase codiert, die von Streptomyces avermitilis K2033 ( U.S.-Patent Nr. 5206155 , FERM BP-2773) stammt, wurde wie folgt bestimmt.
Ein kontinuierliches oder sich mit dem Avermectin-Aglyconsynthasegen überlappendes DNA-Fragment wurde aus einem Cosmid subcloniert, das Fragmente der Avermectin-Aglyconsynthasegene (aveAI und aveAII) enthält, die mit einem Gen gemeinsam isoliert wurden, das die Avermectin-B5-O-Transmethylase codiert [aveD; Gene, 206, 175-180 (1998)]. Die Nucleotidsequenzen der in diese Subclone eingebauten DNA-Fragmente wurden dann bestimmt.
Genauer gesagt, wurden die gesamten Nucleotidsequenzen von aveAI und aveAII durch Subclonierung der mit BamHI gespaltenen Fragmente von 3,4 kbp, 2,0 kbp, 0,5 kbp, 6,8 kbp, 7,0 kbp, 7,8 kbp, 3,7 kbp, 4,8 kbp, 1,3 kbp, 2,4 kbp, 0,7 kbp, 1,0 kbp, 5,4 kbp, 2,5 kbp, 1,9 kbp, 0,1 kbp, 7,0 kbp, 3,1 kbp, 4,7 kbp und 1,3 kbp bestimmt, die man in der in 1 dargestellten BamHI-Restriktionskarte von aveAI und aveAII findet; durch Spalten der eingebauten DNA-Fragmente in diesen Subclonen mit Exonuclease III und S1-Nuclease, um eine Reihe von Deletionsfragmenten herzustellen; und dann durch Durchführen einer Cycle-Sequencing-Reaktion unter Verwendung von Fluoreszenzmarkierten Primern, um eine Nucleotidsequenz jedes deletierten Fragments zu bestimmen. aveAI und aveAII besaßen die in SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2 dargestellten Nucleotidsequenzen.
[Beispiel 2] Herstellung des Stammes, der zur direkten Herstellung von 22,23-Dihydroavermectin B1a verwendet wird.
Das in 3 dargestellte Plasmid wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt und bei der Transformation von Streptomyces avermitilis verwendet.
(1) Subclonieren eines KS1 enthaltenden DNA-Fragments
Die KS1 enthaltende Cosmid-DNA aus den Cosmid-DNAs, die Avermectin-Aglyconsynthasegene enthalten, wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gespalten, gefolgt von einer Agarosegelelektrophorese (beschrieben bei Molecular Cloning, 2. Ausgabe), und ein 2,0 kb-DNA-Fragment (vgl. 1, 1701 bis 3716, dargestellt in SEQ ID NO: 1) enthaltend einen Cysteinerest (Aminosäure 657, dargestellt in SEQ ID NO: 4), der ein aktives Zentrum von KS1 ist, wurde aufgetrennt und nach dem in Molecular Cloning, 2. Ausgabe, beschriebenen Verfahren gereinigt. Plasmid pUC118 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde mit BamHI gespalten und mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) dephosphoryliert. Es wurden jeweils etwa 0,1 μg von einem KS1 enthaltenden 2,0 kb-DNA-Fragment und ein mit BamHI gespaltenes pUC118-Plasmid 16 Stunden bei 16°C unter Verwendung von Ligation High (hergestellt von Toyobo Co., Ltd.) ligiert. 10 μl dieses DNA-Ligierungsreaktanten wurden mit kompetenten Zellen von Escherichia coli DH5α (hergestellt von Nippon Gene Co., Ltd.) in Kontakt gebracht und nach dem in Molecular Cloning, 2. Ausgabe, beschriebenen Verfahren transformiert. Bei der Selektion der Transformante wurde ein LB-Agarmedium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) verwendet. 50 μl wässrige Lösung mit 0,1 mol/l Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 50 μl 2%-ige wässrige Lösung 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-gal, hergestellt von Nacalai Tesque, Inc.) in Dimethylformamid (hergestellt von Nacalai Tesque, Inc.) wurden zuvor auf die 20 ml LB-Agarmedium ausplattiert. Die Kolonie der Transformante, die das rekombinante Plasmid trägt, hat seine β-Galactosidase-Aktivität verloren und kann daher 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid nicht abbauen, wobei es eine weiße Farbe entwickelt. Diese weiße Kolonie wurde mit Hilfe einer Impföse aufgenommen, auf 10 ml LB-Medium angeimpft und einer 16-stündigen Schüttelkultur bei 37°C unterzogen. Das Plasmid wurde dann aus den Zellen extrahiert und nach dem in Molecular Cloning, 2. Ausgabe, beschriebenen alkalischen Phosphatase-Verfahren gereinigt. Ein Teil des sich ergebenden rekombinanten Plasmids wurde mit einem Restriktionsenzym PstI gespalten, und es wurde bestätigt, dass Plasmid pKS1 erhalten wurde, in das ein die KS1-Gene enthaltendes DNA-Fragment in der selben Richtung wie das von pUC118 codierte lacZ eingebaut wurde.
(2) Einführung der Nucleotidsubstitution in das aktive Zentrum von KS1
Das Nucleotid wurde unter Verwendung des Takara LA PCR-in-vitro-Mutagenese-Kits (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) substituiert. Das Nucleotid wurde hier anschließend nach der im Kit beigefügten Vorschrift substituiert. Das die KS1-Gene enthaltende rekombinante Plasmid, das in (1) vorstehend hergestellt wurde, wurde als Matrizen-DNA für die 1. PCR verwendet. Als Primer für die 1. PCR-(a) wurden 5'-ACCGTGGACACGGGGGGCTCGGCATCGCTCGT-3', dargestellt in SEQ ID NO: 9 (entsprechend 1954 bis 1985, dargestellt in SEQ ID NO: 1, „T" an der Position 1969 wurde mit „G" substituiert) und M13M4-Primer (im Kit enthalten) als Primer zur Einführung der Mutation verwendet. Der M13RV-Primer und der MUT4-Primer (im Kit enthalten) wurden als Primer für die 1. PCR-(b) verwendet. in der 1. PCR erfolgte die Inkubation 5 Minuten bei 98°C, und dann wurden 30 Reaktionszyklen ausgeführt, bestehend aus 30 Sekunden bei 94°C, 2 Minuten bei 55°C und 3 Minuten bei 72°C als ein Zyklus. In der PCR wurde der TaKaRa-PCR-Thermalcycler 480 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet. Jede Reaktionslösung wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, und ein in der 1. PCR-(a) amplifiziertes etwa 1,8 kb großes Fragment und ein in der 1. PCR-(b) amplifiziertes etwa 2,0 kb großes Fragment wurden jeweils aufgetrennt und zur Verwendung für den nachfolgenden Schritt gereinigt. Zwischen den in der 1. PCR erhaltenen Fragmenten wurde durch 15-minütiges Inkubieren bei 98°C, Herabsetzen der Temperatur auf 37°C im Laufe einer Stunde und anschließendem 15-minütigem Inkubieren bei 37°C Heteroduplex-DNA erzeugt. Nachdem der Reaktionslösung LA Taq-Polymerase zugegeben wurde, wurde das Gemisch 3 Minuten bei 72°C inkubiert, um das Ende der Heteroduplex-DNA in glatte Enden umzuwandeln. In der anschließenden 2. PCR wurden Reaktionszyklen ausgeführt, bestehend aus 20 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und 3 Minuten bei 72°C als ein Zyklus. Ein Teil des 2. PCR-Produkts wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, und die Amplifikation eines etwa 2,0 kb-Fragments wurde bestätigt. Die restliche Lösung der 2. PCR wurde gründlich mit einer mit Wasser gesättigten Phenol : Chloroform = 1 : 1 Lösung gemischt und dann zentrifugiert. Der Überstand wurde einer Ethanolpräzipitation nach dem in Molecular Cloning, 2. Ausgabe, beschriebenen Verfahren unterzogen, getrocknet und dann erneut in Wasser gelöst. Der DNA-Lösung wurden die Restriktionsenzyme HindIII und EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) zugegeben, und die DNA wurde gespalten. Anschließend wurde die Agarosegelelektrophorese durchgeführt, so dass ein 2,0 kb-DNA-Fragment aufgetrennt und gereinigt wurde. Der Plasmidvektor pUC19 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde ebenfalls mit HindIII und EcoRI gespalten. Das 2,7 kb-Fragment wurde dann aufgetrennt und durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Das mit HindIII und EcoRI gespaltene 2,0 kb-DNA-Fragment wurde mit pUC19 unter Verwendung von Ligation High ligiert und zur Transformation von Escherichia coli DH5α verwendet. Wie vorstehend bei (1) wurden IPTG und X-gal auf das LB-Agarmedium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, zur Selektion der Transformanten ausplattiert. Aus den Transformanten, die als weiße Kolonien erhalten wurden, wurden mehrere Stämme ausgewählt und auf 10 ml LB- Medium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, angeimpft und einer 16-stündigen Schüttelkultur bei 37°C unterzogen. Anschließend wurden die Stämme geerntet und die von jedem Stamm getragene Plasmid-DNA wurde extrahiert und durch ein alkalisches Verfahren gereinigt.
(3) Die Bestätigung der Einführung der Nucleotidsubstitution durch Nucleotidsequenzierung
Bei der Nucleotidsequenzierung wurden ABI PRISM DNA-Sequenzier-Kits, Farbprimer-Cyclesequencing-Ready-Reaction-Kits mit AmpliTaqR-DNA-Polymerase, FS-21M13-(hergestellt von PE Applied Biosystems) und ABI373A verwendet. Jede rekombinante Plasmid-DNA, von der man in Betracht zieht, dass sie Nucleotidsubstitutionen besitzt, die KS1 einführen, das vorstehend in (2) erhalten wurde, wurde als Matrize verwendet, und Sequenzierproben wurden von PCR nach der dem Sequenzier-Kit beigelegten Vorschrift hergestellt. Jede Probe wurde einer Elektrophorese unter Verwendung von ABI373A unterzogen, und die sich ergebenden Daten wurden unter Verwendung einer Software für die Genanalyse, Genetyx (hergestellt Software Development Co., Ltd.), analysiert. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass Plasmid-DNA (pKS1mut) erhalten wurde, die ein etwa 2,0 kb großes BamHI-Fragment enthält, das 1701 bis 3716 in SEQ ID NO: 3 entspricht. SEQ ID NO: 3 umfasst eine Nucleotidsequenz, in der Thymidin an der Position 1969 mit Guanin in der 1. bis zur 11916. Nucleotidsequenz, dargestellt in SEQ ID NO: 1, substituiert ist.
(4) Einführung der Nucleotidsubstitution in chromosomale DNA von Streptomyces avermitilis.
Um die Plasmidmutation in chromosomale DNA durch homologe Rekombination einzuführen, ist ein sinnvoll langer homologer Bereich erforderlich. Da die Mutation in die DNA durch PCR eingeführt wird, kann die Mutation in die Region eingeführt werden, die nicht der Zielort ist. Daher sollte der möglichst weiteste Bereich, der nicht der Mutationsort ist, mit DNA substituiert werden, die von chromosomaler DNA von Streptomyces avermitilis stammt, um unnötige Mutationen zu eliminieren. In der homologen Rekombination verwendete Plasmid-DNA wurde auf folgende Weise konstruiert und zur Transformation von Streptomyces avermitilis verwendet.
pKS1mut, vorstehend in (3) hergestellt, wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und SalI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gespalten und dann einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, um ein 4,1 kb DNA-Fragment zu trennen und zu reinigen. Anschließend wurde pKS1 mit PstI und SalI gespalten, gefolgt von einer Elektrophorese, und 1,57 kb PstI und SalI gespaltene Fragmente wurden getrennt und gereinigt. Jedes gesammelte DNA-Fragment wurde unter Verwendung von Ligation High ligiert und dann mit kompetenten Zellen von Escherichia coli DH5α zur Transformation in Kontakt gebracht. Die Transformante wurde selektiert unter Verwendung von LB-Agarmedium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin. Die Transformanten wurden 16 Stunden bei 37°C gezüchtet, und mehr als zehn Kolonien wurden mit Hilfe einer Impföse aufgenommen, auf 10 ml LG-Medium angeimpft, das 50 mg/ml Ampicillin enthielt und einer 16-stündigen Schüttelkultur bei 37°C unterzogen, geerntet, und das von jedem Stamm getragene Plasmid wurde durch das alkalische Verfahren gereinigt. Jedes Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und SalI gespalten, einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, und es wurde bestätigt, dass Plasmid pKS1mutR, enthaltend 4,1 kb- und 1,57 kb-DNA-Fragmente, erhalten wurde.
Anschließend wurde pKS1mutR mit dem Restriktionsenzym KpnI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Dann wurde ein Cosmid, das eine von Nucleotid 817 bis 1887 repräsentierte KpnI-Region enthält, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, mit KpnI gespalten, gefolgt von einer Elektrophorese, und ein etwa 1,1 kb großes KpnI-Fragment wurde aufgetrennt und gereinigt.
Jedes gereinigte DNA-Fragment wurde unter Verwendung von Ligation High ligiert und dann mit kompetenten Zellen von Escherichia coli DH5α zur Transformation in Kontakt gebracht. Die Transformante wurde unter Verwendung von LB-Agarmedium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, selektiert. Die Transformanten wurden 16 Stunden bei 37°C gezüchtet, und mehr als zehn Kolonien wurden mit Hilfe einer Impföse aufgenommen, auf 10 ml LG-Medium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, angeimpft und einer 16-stündigen Schüttelkultur bei 37°C unterzogen, geerntet, und das von jedem Stamm getragene Plasmid wurde durch das alkalische Verfahren gereinigt. Jedes Plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym PstI gespalten, einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und es wurde bestätigt, dass Plasmid pKS1mutRL, enthaltend 1,27 kb-, 1,57 kb und 2,7 kb-DNA-Fragmente, erhalten wurde.
Anschließend wurde pKS1mutRL mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI gespalten, und 2,9 kb HindIII- und EcoRI-DNA-Fragmente wurden aufgetrennt und durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Der Plasmidvektor pKC7 (Japanische veröffentlichte, ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 189774/94 ) wurde ebenfalls mit HindIII und EcoRI gespalten und dann durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Diese beiden DNA-Fragmente wurden 16 Stunden bei 16°C unter Verwendung von Ligation High ligiert und dann mit kompetenten Zellen von Escherichia coli DH5α zur Transformation in Kontakt gebracht. Die Transformanten wurden unter Verwendung von LB-Agarmedium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, selektiert. Jene Transformanten wurden 16 Stunden bei 37°C gezüchtet und mehr als zehn Kolonien wurden mit Hilfe einer Impföse aufgenommen und auf 10 ml LG-Medium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, angeimpft. Jene Transformanten wurden 16 Stunden bei 37°C gezüchtet, und dann wurden die Zellen geerntet, und das von jedem Stamm getragene Plasmid wurde durch das alkalische Verfahren gereinigt. Jedes Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI gespalten und dann einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. So wurde bestätigt, dass Plasmid pKC-KS1mut, das ein 2,9 kb-Fragment trägt, erhalten wurde.
Das KS1mut-Fragment wurde in die KS1-Region des Chromosoms von Streptomyces avermitilis K2038 (FERM BP-2775) durch homologe Rekombination unter Verwendung von pKC-KS1mut nach dem in der japanischen veröffentlichten, ungeprüften Patentanmeldung Nr. 189774/94 beschriebenen Verfahren integriert. Um zu bestätigen, dass pKC-KS1mut auf der chromosomalen DNA ersetzt wurde, wurde die chromosomale DNA des so erhaltenen rekombinanten Stamms durch das in der japanischen veröffentlichten, ungeprüften Patentanmeldung Nr. 189774/94 beschriebene Verfahren hergestellt, und die PCR erfolgte unter Verwendung der chromosomalen DNA als Matrize und unter Verwendung der in SEQ ID NO: 10 dargestellten synthetischen DNA (5'-ATAAGCTTAATCGATCCGCTGTCCGGTA-3', die eine Sequenz enthält, die den Nucleotiden 1758 bis 1776 in SEQ ID NO: 1 entspricht) und der in SEQ ID NO: 11 dargestellten synthetischen DNA (5'-ATGAATTCCCTCCAAAATCACATGCGCATT-3', die den Nucleotiden 2710 bis 2729 in SEQ ID NO: 1 entspricht) als Primer-Set. Das etwa 1,0 kb große amplifizierte DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI gespalten und das etwa 1,0 kb große amplifizierte Fragment wurde dann aufgetrennt und durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Der Plasmidvektor pUC19 wurde ebenfalls mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI gespalten und dann durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und gereinigt.
Die beiden so erhaltenen DNA-Fragmente wurden 16 Stunden bei 16°C unter Verwendung von Ligation High ligiert und dann zur Transformation von Escherichia coli DH5α verwendet. IPTG und X-gal wurden auf das LB-Agarmedium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, zur Selektion der Transformante ausplattiert. Aus den Transformaten wurden mehrere Stämme, die als weiße Kolonien erhalten wurden, ausgewählt und auf 10 ml LG-Medium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, angeimpft. Nachdem die Transformanten durch Schütteln gezüchtet wurden, wurden die Zellen geerntet und das von jedem Stamm getragene Plasmid wurde durch das alkalische Verfahren gereinigt. Das so erhaltene Plasmid wurde verwendet, um die Nucleotidsequenz auf die Weise zu bestimmen, wie vorstehend in (3) beschrieben. So wurde bestätigt, dass der betreffende Streptomtces avermitidis-KS1mut-Stamm erhalten wurde.
[Beispiel 3] Synthese der Substratverbindung
Die physiochemischen Daten der folgenden Verbindungen wurden unter Verwendung der folgenden Instrumente gemessen.

MS JEOL.Ltd HX/HX110A

¹H NMR JEOL.Ltd Lambda 300 (300 MHz)
In den physikalischen Daten der Verbindungen gibt „FABMS" das durch das „FAB"-Verfahren erhaltene Massenspektrum an. Der Begriff „herkömmliche Nachbearbeitung" bezieht sich auf die Bearbeitung nach der Reaktion.
Nach Beendigung der Reaktion in jedem Schritt werden der Reaktionslösung in jedem Schritt fakultativ Wasser, Säuren, Puffer oder dergleichen zugegeben, um mit einem nicht wässrigen Lösungsmittel wie Ethylacetat, Äther, Chloroform und Dichloromethan zu extrahieren. Der Extrakt wird mit Wasser, einer Kochsalzlösung etc. gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, so dass das Lösungsmittel durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt wird.
(1) Synthese von Verbindung 1
Verbindung A (16 g, 0,060 mol; Tabelle 1) wurde in Methanol (620 ml) gelöst und ein Ozon-Luftstrom wurde bei -78°C unter 4-stündigem Rühren durchgeblasen. Nachdem 15 Minuten Luft in die Reaktionslösung geblasen wurde, wurde Dimethylsulfid (44 ml, 0,60 mol) dazugegeben und das Gemisch wurde 15 Stunden bei 25°C gerührt. Nach der herkömmlichen Nachbearbeitung wurde der Rest in Toluol (290 ml) gelöst, Methyl(triphenylphosphoranyliden)acetat (33,7 g, 0,10 mol) dazugegeben und das Gemisch wurde 17 Stunden bei 65°C gerührt. Nach der herkömmlichen Nachbearbeitung erfolgte die Reinigung durch Chromatographie auf Kieselgel (eluiert bei Hexan/Ethylacetat = 100/0 bis 10/1), so dass sich Verbindung 1 (9,4 g, Ausbeute 53%; Tabelle 1) ergab.
¹H NMR (CDCl₃) δ ppm; 7,04 (dd, J = 8,3, 15,8 Hz, 1H), 5,78 (dd, J = 1,1, 15,7 Hz, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,48 (t, J = 3,5 Hz, 1H), 2,52 (m, 1H), 1,35-1,54 (m, 2H), 1,10 (m, 1H), 1,04 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 0,40 (s, 9H), 0,37 (d, J = 7,4 Hz, 3H), 0,35 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,03 (s, 3H), 0,02 (s, 3H)
FABMS: M/Z 315 (M+H)⁺
Auf der molekularen Formel basierender theoretischer Wert: C₁₇H₃₄N₃Si = 314
(2) Synthese von Verbindung 2
Verbindung 1 (0,20 g, 0,63 mmol) wurde in Methanol (8,9 ml) gelöst und 10% Wasserstoffchlorid/Methanol-Lösung (0,99 ml) wurde dazugegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunden bei 50°C gerührt. Nach der herkömmlichen Nachbearbeitung wurde der Rest in N,N-Dimethylformamid (6,2 ml), Chlortritylsilan (0,31 ml, 1,8 mmol) gelöst und Imidazol (0,21 g, 3,1 mmol) dazugegeben, und das Gemisch wurde 1,5 Stunden bei 25°C gerührt. Nach der herkömmlichen Nachbearbeitung erfolgte die Reinigung durch Chromatographie auf Kieselgel (eluiert bei Hexan/Ethylacetat = 25/1), so dass sich Verbindung 2 (0,18 g, Ausbeute 93%; Tabelle 1) ergab.
¹H NMR (CDCl₃) δ ppm; 7,04 (dd, J = 8,4, 15,7 Hz, 1H), 5,79 (dd, J = 1,1, 15,7 Hz, 1H), 3,73 (s, 3H), 3,48 (dd, J = 4,1, 5,4 Hz, 1H), 2,51 (m, 1H), 1,35-1,51 (m, 2H), 1,12 (m, 1H), 0,81-1,08 (m, 18H), 0,47-0,66 (m, 6H)
FABMS: m/z 315 (M+H)⁺
Auf der molekularen Formel basierender theoretischer Wert: C₁₇H₃₄N₃Si = 314
(3) Synthese von Verbindung 3
Verbindung 2 (4,1 g, 0,013 mol) wurde in Ethanol (200 ml) gelöst, 10% Palladium-Kohlenstoff (0,41 g) wurde dazugegeben, und das Gemisch wurde 4,5 Stunden unter Wasserstoffatmosphäre bei 25°C gerührt. Nachdem die Reaktionslösung durch Celite R545 geschickt wurde, wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der Rest wurde in 1,4-Dioxan (100 ml) und Wasser gelöst, eine wässrige Lösung aus 4 mol/l Kaliumhydroxid (6,4 ml, 0,026 mol) wurde dazugegeben, und das Gemisch wurde 3,5 Stunden bei 60°C gerührt. Der Reaktionslösung wurde zur Neutralisierung DOWEX 50W zugegeben, und das Lösungsmittel wurde dann durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der Rest wurde in Dichlormethan (200 ml), N-Acetylcysteamin (1,8 ml, 0,017 mol), Salzsäure/1-Ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)carbodiimid (3,2 g, 0,017 mol) gelöst und 4-Dimethylaminopyridin (0,32 g, 0,0026 mol) wurde dazugegeben, und das Gemisch wurde 11 Stunden bei 25°C gerührt. Nach der herkömmlichen Nachbearbeitung erfolgte die Reinigung durch Chromatographie auf Kieselgel (eluiert bei Hexan/Ethylacetat = 1/1) so dass sich Verbindung 3 (3,8 g, Ausbeute 74%; Tabelle 1) ergab.
¹H NMR (CDCl₃) δ ppm; 5,80 (br s, 1H), 3,43 (dd, J = 6,1, 12,5 Hz, 2H), 3,32 (dd, J = 3,7, 5,3 Hz, 1H), 3,02 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,63 (dd, J = 5,3, 9,9 Hz, 1H), 2,54 (dd, J = 6,3, 9,4 Hz, 1H), 1,97 (s, 3H), 1,94 (m, 1H), 1,58 (m, 1H), 1,31-1,54 (m, 3H), 1,16 (m, 1H), 0,81-1,00 (m, 18H), 0,61 (q, J = 7,6Hz, 6H)
FABMS: m/z 404 (M+H)⁺
Auf der molekularen Formel basierender theoretischer Wert: C₂₀H₄₁NO₃SiS = 403
(4) Synthese von Verbindung 4
Verbindung 3 (15 mg, 0,038 mmol) wurde in Tetrahydrofuran (0,46 ml) und Wasser (0,46 ml) gelöst, Essigsäure (0,45 ml) wurde dazugegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0°C gerührt. Nach der herkömmlichen Nachbearbeitung erfolgte die Reinigung durch Dünnschichtchromatographie (eluiert bei Chloroform/Methanol = 10/1), so dass sich Verbindung 4 (7,7 mg, Ausbeute 71%, Reinheit 63%; Tabelle 1) ergab.
¹H NMR(CDCl₃) δ ppm; 5,88 (br s, 1H), 3,64 (dd, J = 6,0, 12,3 Hz, 2H), 3,20 (m, 1H), 3,02 (dt, J = 1,8, 6,4 Hz, 2H), 2,58-2,72 (m, 2H), 2,06 (m, 1H), 1,97 (s, 3H), 1,43-1,70 (m, 3H), 1,33 (m, 1H), 1,28 (m, 1H), 0,82-0,95 (m, 9H)
FABMS: m/z 290 (M+H)⁺
Auf der molekularen Formel basierender theoretischer Wert: C₁₄H₂₇NO₃S = 289
[Beispiel 4] Direkte Herstellung von 22,23-Dihydroavermectin B1a
10 μl der in Beispiel 2 erhaltenen Sporensuspension von Streptomyces avermitidis KS1mut wurden in ein Teströhrchen, enthaltend 10 ml Ansatzkulturmedium [ein Medium, hergestellt durch Einstellen einer Lösung, enthaltend 20 g Lactose, 15 g Distillers solubles, 2,5 g autolysierte Hefe (Difco) und 1.000 ml destilliertes Wasser, auf einen pH-Wert von 7,2 mit 2 mol/l Kaliumhydroxid, gefolgt von einer 15-minütigen Hochdruck-Dampfsterilisation bei 121°C] angeimpft und wurde durch 20-stündiges Schütteln bei 28°C gezüchtet, um eine Ansatzkultur zu erhalten. 0,4 ml dieser Ansatzkultur wurde auf einen Erlenmeyerkolben (Volumen 100 ml), enthaltend 20 ml Produktionsmedium, [ein Medium, das hergestellt wurde, indem 46 g Glucose, 24 g peptonisierte Milch (Oxoid), 2,5 g autolysierte Hefe (Difco), 2,5 ml Polypropylenglycol #2000 und 1.000 ml destilliertes Wasser einer 15-minütigen Hochdruck-Dampfsterilisation bei 121°C unterzogen wurde] übertragen und 3 Tage bei 28°C unter Verwendung eines Rotationsschüttlers bei 220 Upm gezüchtet, dann wurden der Kultur 50 μl 1 mg/ml Methanollösung der in Beispiel 3 synthetisierten Verbindung 4 (enthaltend 50% Verbindung 4) zugegeben, und das Züchten durch Schütteln erfolgte wiederum 2 Tage bei 28°C. Nach Beendigung der Kultur wurde der Kultur die doppelte Menge Methanol zugegeben, und das Gemisch wurde gründlich gerührt. Danach wurde das gerührte Produkt 5 Minuten bei Raumtemperatur bei 3.000 Upm zentrifugiert, um Zellen zu präzipitieren. Der Überstand wurde dann einer Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Analyse unterzogen.
HPLC-Analyse
Chromatographiebedingungens

Säule: Inertsil ODS-2 (4,6 × 150 mm, hergestellt von GL Sciences Inc.)
Vorsäule: Vorsäule E-Kartusche (4 × 10 mm, hergestellt von GL Sciences Inc.)
Mobile Phase: Acetonitril : Methanol : Wasser = 70 : 10 : 20
Fließrate: 0,6 ml/min
Nachweis: 246 nm
Temperatur: 55°C

Der Methanolextrakt der Kultur wurde unter den vorstehenden Bedingungen für die Analyse analysiert, und als Ergebnis wurde nur im Kulturextrakt, dem Verbindung 4 zugegeben wurde, ein Peak bei einer Retentionszeit von 21,7 Minuten beobachtet. Als Ergebnis der Analyse von 22,23-Dihydroavermectin B1a unter den äquivalenten Bedingungen war die Retentionszeit dieselbe, d.h. 21,7 Minuten. Wenn 22,23-Dihydroavermectin B1a als Standard bestimmt wurde, betrug die Ausbeute der Substanz, die eine Retentionszeit von 21,7 Minuten zeigte, 23,3 mg/l.
Es wurde eine dreidimensionale HPLC-Analyse unter Verwendung eines Mehrfachwellenlängen-Detektors MD-915 (hergestellt von Jasco) durchgeführt, und als Ergebnis betrug die maximale Absorptionswellenlänge des Peaks bei der Retentionszeit von 21,7 Minuten 248 nm und dessen Spektrum fiel mit demjenigen von 22,23-Dihydroavermectin B1a zusammen.
Der Peak bei der Retentionszeit von 21,7 Minuten wurde durch HPLC fraktioniert, und 5 mg weißes Pulver wurden erhalten und einer Massenspektrometrie unterzogen. Die Ergebnisse waren wie folgt.
m/z 873,5 (M+) C₄₈H₇₃O₁₄
Dies fiel mit den bei Ivermectin und Abamectin, William C. Campbell (1989) beschriebenen Daten von 22,23-Dihydroavermectin B1a zusammen.
Wie aus der vorstehenden Beschreibung offensichtlich ist, war die durch Zugabe von Verbindung 4 zu Streptomtces avermitidis-KS1mut und Züchtung des Stamms erhaltene Substanz 22,23-Dihydroavermectin B1a. In der vorstehenden Züchtung unter Zugabe von Verbindung 4 wurde gar kein Avermectin-Analogon außer 22,23-Dihydroavermectin B1a produziert. Da die einzelne Produktion von 22,23-Dihydroavermectin B1a in die Praxis umgesetzt wurde, wurde gezeigt, dass die Produktion von 22,23-Dihydroavermectin B1a signifikant vereinfacht wurde.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Nach der vorliegenden Erfindung kann 22,23-Dihydroavermectin B1a, das als Medikament, tierärztliches Medikament und Pestizid nützlich ist, direkt produziert werden. Daher können die herkömmlichen Verfahren zur Reinigung von Avermectin B1a im industriellen Maßstab und zur chemischen Modifizierung von Avermectin B1a, die kompliziert und schwierig sind, weggelassen werden. Dies kann die Kosten und die Zeit für die industrielle Produktion von 22,23-Dihydroavermectin B1a wesentlich reduzieren. Dies realisiert auch die Produktion der Formulierung, die nur 22,23-Dihydroavermectin B1a enthält, das als Medikament hoch wirksam ist.
[Sequenzprotokoll Freier Text]

SEQ ID NO: 9 stellt synthetische DNA dar, basierend auf der Sequenz zwischen den Nucleotiden 1954 und 1985, dargestellt in SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 10 stellt synthetische DNA dar, basierend auf der Sequenz zwischen den Nucleotiden 1758 und 1776, dargestellt in SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 11 stellt synthetische DNA dar, basierend auf der Sequenz zwischen den Nucleotiden 2710 und 2729, dargestellt in SEQ ID NO: 1

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

N-Acetylcysteaminthioester-Verbindung dargestellt durch die Formel (I):
wobei R¹ Methyl ist und R² sec-Butyl ist.
Verfahren zur Herstellung der N-Acetylcysteaminthioester-Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung, dargestellt durch Formel (II)
als Ausgangsmaterial verwendet wird, wobei R¹ Methyl ist und R² sec-Butyl ist und das Verfahren die Schritte umfaßt: (a) Ozonoxidation der Verbindung und nachfolgende Zugabe von Kohlenstoffketten mittels der Wittig-Reaktion; (b) Entfernen der Schutzgruppe t-Butyldimethylsilyl von der in Schritt (a) erhaltenen Verbindung und Wiedereinführen einer anderen Schutzgruppe unter Verwendung von Chlortriethylsilan; (c) Reduzieren der ungesättigten α-β-Kohlenstoffbindung der resultierenden Verbindung in Gegenwart eines Palladium-Kohlenstoff-Katalysators, Hydrolysieren eines Esters mit Kaliumhydroxid, Neutralisieren des Reaktionsgemisches und Zugabe von N-Acetylcysteamin in Gegenwart eines Kondensierungsmittels, um eine Thioesterverbindung zu erhalten; und (d) Entfernen der Schutzgruppe durch Zugabe von Essigsäure zu der Thioesterverbindung.
Verfahren zur Herstellung von 22,23-Dihydroavermectin B1a, das die Schritte umfasst: (a) das Inkontaktbringen einer Kultur einer nicht-menschlichen Transformanten, die eine DNA enthält, die eine modifizierte Avermectin-Aglyconsynthase codiert, die mindestens eine Domäne mit einer beseitigten Aktivität umfasst, wobei die Domäne ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ATs [Aminosäure 29 bis 344 von SEQ ID NO. 4], ACPs [Aminosäure 366 bis 451 von SEQ ID NO. 4], KS1 [Aminosäure 481 bis 914 von SEQ ID NO. 4], AT1 [Aminosäure 1051 bis 1356, von SEQ ID NO. 4], ACP1 [Aminosäure 1979 bis 2060 von SEQ ID NO. 4] und KS2 [Aminosäure 2086 bis 2515 von SEQ ID NO. 4], oder ein behandeltes Produkt davon, oder die Synthase, die durch die DNA codiert wird, mit der N-Acetylcysteaminthioester-Verbindung gemäß Anspruch 1 in einem Medium; (b) das Sammeln des produzierten und in dem Medium angereicherten 22,23-Dihydroavermectins B1a.
Verfahren zur Herstellung von 22,23-Dihydroavermectin B1a gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine N-Acetylcysteaminthioester-Verbindung gemäß Anspruch 1 als Substratverbindung für eine modifizierte Avermectin-Aglyconsynthase benutzt wird, die mindestens eine Domäne mit einer beseitigten Aktivität umfasst, wobei die Domäne ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ATs [Aminosäure 29 bis 344 von SEQ ID NO. 4], ACPs [Aminosäure 366 bis 451 von SEQ ID NO. 4], KS1 [Aminosäure 481 bis 914 von SEQ ID NO. 4], AT1 [Aminosäure 1051 bis 1356, von SEQ ID NO. 4], ACP1 [Aminosäure 1979 bis 2060 von SEQ ID NO. 4] und KS2 [Aminosäure 2086 bis 2515 von SEQ ID NO. 4]
Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei die modifizierte Avermectin-Aglyconsynthase mutierte ATs [Aminosäure 29 bis 344 von SEQ ID NO. 4], ACPs [Aminosäure 366 bis 451 von SEQ ID NO. 4], KS1 [Aminosäure 481 bis 914 von SEQ ID NO. 4], AT1 [Aminosäure 1051 bis 1356, von SEQ ID NO. 4], ACP1 [Aminosäure 1979 bis 2060 von SEQ ID NO. 4] und KS2 [Aminosäure 2086 bis 2515 von SEQ ID NO. 4] umfasst, in denen eine spezifische Aminosäure in einem aktiven Zentrum mit einer anderen Aminosäure ausgetauscht ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die modifizierte Avermectin-Aglyconsynthase ein Polypeptid umfasst, das aus der Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO. 8 besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die DNA eine DNA umfasst, die aus der Nucleotidsequenz wie dargestellt in SEQ ID NO. 3 besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die nicht-menschliche Transformante ein Mikroorganismus ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Mikroorganismus der Gattung Streptomyces angehört.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus, der der Gattung Streptomyces angehört, Streptomyces avermitilis ist.