JP6311935B2 - 2型tnf受容体の発現を抑制する合成ペプチド及びその利用 - Google Patents
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Description
なお、本出願は2012年10月18日に出願された日本国特許出願2012−231148号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
かかるTNFが結合する受容体として、分子量が約55kDaの1型TNF受容体(Tumor Necrosis Factor Receptor 1、以下「TNF−R1」と記載する場合がある。)、及び、分子量が約75kDaの2型TNF受容体(Tumor Necrosis Factor Receptor 2、以下「TNF−R2」と記載する場合がある。)が存在する。
その一方で、我が国における失明の原因のトップであり高齢化社会において大きな問題となっている緑内障の進行が、野生型マウスと比較してTNF−R2ノックアウトマウスでは遅くなることが報告されている(S. McKinnonらの口頭発表「Neuroinflammation in glaucoma」、XIX Biennial Meeting of the International Society for EYE RESEARCH、2010年7月18日〜23日)。
また、網膜剥離による光受容体(Photoreceptor)の変性には、TNF−R2を介したTNF−αが関与する一方、TNF−R1の欠乏はかかる光受容体の変性にあまり影響しないことが報告されている(非特許文献2)。
このことから、例えば、対象とする生体器官、組織若しくは部位(より微視的にいえば該器官、組織若しくは部位に存在する細胞)においてTNF−R2の発現量を低下させてTNF−R1に対するTNF−R2の存在比を変化させる(低下させる)ことができれば、TNF−R2の過剰な発現によって生じ得る当該生体器官、組織若しくは部位における望ましくない生理作用を発現させない(若しくは抑制する)ことが可能である。
例えば、上述した報告例にあるように、緑内障や網膜剥離等の網膜疾患の場合、網膜に存在する視細胞や神経節細胞におけるTNF受容体の存在比(発現比)を通常よりもTNF−R2の存在率(発現率)が小さくなるように調節することにより、視細胞や神経節細胞のアポトーシスを抑制することができる。
そこで本発明は、生体内(インビボ:in vivo)又は生体外(インビトロ:in vitro)において、所望する生体器官、組織若しくは部位に存在する少なくとも1種の細胞におけるTNF−R2の発現を抑制する方法、該方法に利用される合成ペプチド、ならびに該ペプチドを含む組成物(薬剤組成物)を提供することを目的として創出された発明である。
ここで「TNF−R2を発現可能な細胞」とは、生体内(インビボ)若しくは生体外(インビトロ)において定常的若しくは一時的にTNF−R2の発現が確認される細胞をいう。例えば、ヒトやその他の哺乳動物の免疫系の細胞や神経系を構成する細胞は、ここでいうTNF−R2、即ちデスドメインを有しないことによってTNF−R1とは明確に区別される約75kDaのTNF受容体を発現可能な細胞の典型例である。
そして、かかるAPPシグナル配列若しくはその改変APPシグナル配列からなる合成ペプチドを種々のTNF−R2を発現する細胞(培養細胞)に供給したところ、TNF−R2の発現を抑制し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、ここで開示される組成物の主成分である「TNF−R2発現抑制ペプチド」、具体的には、アミロイド前駆体タンパク質(APP)中のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列、または、該シグナルペプチドのアミノ酸配列中の1個又は数個(典型的には2個又は3個)のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加されて形成されたアミノ酸配列から実質的に構成される合成ペプチドを、所定のTNF−R2を発現可能な対象細胞に供給する(例えば所定のTNF−R2を発現可能な対象細胞を培養中の培養液に本発明に係る組成物或いはペプチドを添加する。)ことによって、当該合成ペプチドが供給された細胞においてTNF−R2の発現を抑制することができる。
また、ここで開示されるTNF−R2発現抑制用組成物(TNF−R2発現抑制ペプチド)は、TNF−R2が関与する疾病(傷害)を改善させることを目標とした研究開発分野(例えば医学、薬学、遺伝学、生化学、生物学に関連する分野。以下同じ。)において好適に実施することができる。
即ち、TNF−R2を発現可能な細胞において該TNF−R2の発現を抑制する方法であって、アミロイド前駆体タンパク質(APP)中のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列、または、該シグナルペプチドのアミノ酸配列中の1個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加されて形成されたアミノ酸配列から実質的に構成される合成ペプチドを前記細胞に供給することを特徴とする方法を提供する。
かかる方法によると、生体内又は生体外において、所定の生体器官、組織若しくは部位に存在する少なくとも1種のTNF−R2を発現可能な細胞の該TNF−R2の存在量(発現量)を減少させることができる。
従って、本発明によると、ここで開示されるTNF−R2発現抑制用組成物(即ちTNF−R2発現抑制ペプチド)を用いてTNF−R2の存在量を減少させた細胞を製造することができる。換言すれば、本発明は、ここで開示されるTNF−R2発現抑制用組成物(TNF−R2発現抑制ペプチド)を用いることを特徴とする、TNF−R2の存在量を減少させた細胞を製造する方法を提供する。
MLPGLALLLLAAWTARA(配列番号1)、
MLPSLALLLLAAWTVRA(配列番号2)、
MLPGLALVLLAAWTARA(配列番号3)、または
MLPSLALLLLTTWTARA(配列番号4)、
であることが好ましい。
これら、ヒト(配列番号1)、マウス(配列番号2)、ブタ(配列番号3)、モルモット(配列番号4)由来のAPPシグナル配列又はその改変APPシグナル配列を利用することによって、対象細胞のTNF−R2の発現を好適に抑制することができる。また、本発明の実施において用いられる合成ペプチドは、総アミノ酸残基数が25以下の化学合成ペプチドであることが好ましい。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
また、本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね50以下(例えば25以下、特には20以下)のような比較的分子量の小さいものをいう。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のN末端アミノ酸及びC末端アミノ酸を包含する用語である。
また、本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結ばれたポリマー(核酸)を指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限定されない。種々の長さのDNAフラグメント及びRNAフラグメントが本明細書におけるポリヌクレオチドに包含される。
上述のとおり、ここで開示されるTNF−R2発現抑制ペプチドは、APPシグナル配列又はその改変APPシグナル配列から実質的に構成される合成ペプチドであるという点において、自然界には存在しない合成ペプチドといえる。
ここで開示されるTNF−R2発現抑制ペプチドを構成するAPPシグナル配列の好適例を表1に示す。
また、使用する合成ペプチドとしては、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が50以下が適当であり、30以下が望ましく、例えば25以下(例えば20以下、典型的には17又は18〜20)が好ましい。APPシグナル配列のアミノ酸残基数はこのような範囲に収まる。APPシグナル配列又は改変APPシグナル配列のみから成るペプチドは、好適にここで開示される調節方法に用いられる。
なお、ここで開示されるTNF−R2発現抑制ペプチドは、APPシグナル配列若しくは改変APPシグナル配列をペプチド鎖の実質的な構成部分(主体をなす構成部分)とするものであればよく、目的とする生理活性機能を失わない限りにおいてAPPシグナル配列又はその改変APPシグナル配列以外のアミノ酸残基を含むペプチドであってもよい。
このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、容易にTNF−R2発現抑制ペプチドを提供することができる。なお、ペプチドのコンホメーション(立体構造)については、使用する環境下(生体外若しくは生体内)で目的の活性を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原(抗原)になり難いという観点から直鎖状又はへリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難いという観点からも好適である。
なお、ここで開示されるTNF−R2発現抑制ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がL型アミノ酸であるものが好ましいが、アミノ酸残基の一部又は全部がD型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするTNF−R2発現抑制ペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。
そして、宿主細胞(分泌された場合は培地中)からペプチドを単離し、精製することによって、目的のTNF−R2発現抑制ペプチドを得ることができる。なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型DNA(即ちTNF−R2発現抑制ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片)を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物(ATP、RNAポリメラーゼ、アミノ酸類等)を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット(例えば、日本の東洋紡績(株)から入手可能なPROTEIOS(商標)Wheat germ cell-free protein synthesis kit)が市販されている。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、DNAの形態であってもよく、RNA(mRNA等)の形態であってもよい。DNAは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖(センス鎖)であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖(アンチセンス鎖)であってもよい。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、TNF−R2発現抑制ペプチド生産のための組換え遺伝子(発現カセット)を構築するための材料として使用することができる。
なお、かかるTNF−R2発現抑制ペプチドは、目的とする生理活性を損なわない限りにおいて、塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、他の塩(例えば金属塩)であってもよい。本明細書及び特許請求の範囲に記載の「合成ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。
なお、TNF−R2発現抑制ペプチド(主成分)及び種々の担体(副成分)を材料にして種々の形態の組成物(薬剤)を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修,Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
或いは、各種の腫瘍(癌)に含まれるがん細胞(腫瘍細胞)に対して本発明を適用することができる。
或いはまた、ES細胞(胚性幹細胞)、iPS細胞(人工多能性幹細胞)、脂肪幹細胞、軟骨幹細胞等の間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、等の幹細胞に対して本発明を適用することができる。
例えば、生体外で培養している細胞(細胞塊)、組織、器官に対しては、対象とする培養細胞(培養組織又は器官)の培地に目的のペプチドを添加するとよい。添加量及び添加回数は、培養物の種類、細胞密度(培養開始時の細胞密度)、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されないが、ヒト或いはヒト以外の哺乳動物の細胞、組織等を培養する場合、培地中のペプチド濃度が概ね0.1μM〜100μMの範囲内、好ましくは0.5μM〜20μM(例えば1μM〜10μM)の範囲内となるように、1〜複数回添加することが好ましい。
ここで開示されるTNF−R2発現抑制ペプチドをインビトロ培養系に添加することにより、当該培養系においてTNF−R2の発現を抑制し、TNF−R1に対するTNF−R2の存在比を低下させることができる。
なお、本発明の実施対象として好ましい哺乳動物として、例えば、マウス、ラット、モルモット等の齧歯類、ウマ、ロバ等の奇蹄類、ブタ、ウシ等の偶蹄類、チンパンジー、オランウータン、カニクイザル等の霊長類(ヒトを除く)、等が例示される。
或いは、錠剤等の固体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを直接所定の組織(即ち該組織を構成している細胞)に投与することができる。なお、添加量及び添加回数は、上記存在バランスを調節したい細胞の種類、該細胞が存在する部位、器官、組織等の条件によって異なり得るため特に限定されない。
上述した表1に示す配列番号1のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと、配列番号2のアミノ酸配列からなる合成ペプチドとを後述するペプチド合成器を用いて製造した。なお、以下の説明では、合成した計2種類のペプチドを、配列番号に対応させてサンプル1、サンプル2と呼称する。これらペプチドは、全体が17アミノ酸残基から成る直鎖状の化学合成ペプチドである。いずれのペプチドも、市販のペプチド合成機(Intavis AG社製品)を用いてマニュアルどおりに固相合成法(Fmoc法)を実施して合成した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。合成した各ペプチドはDMSOに溶かした後、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)で希釈し1mMのストック液を調製した。
上記実施例1において合成された両ペプチドの性能をマウス脊髄の神経芽細胞腫由来の培養細胞である細胞株(Neuro2a株)を用いて調べた。コントロール区としてペプチド無添加区を設けた。本評価試験の詳細は以下のとおりである。
Neuro2a細胞株を8.5×104cells/mLの密度に直径6cmの培養ディッシュに播種した。培地は一般的なDMEM培地(10%のFBS、1%のペニシリンを含有する。)を用い、37℃、5%CO2条件下のCO2インキュベータ内で一晩培養した。
その一晩培養後、培地を2%のFBS、20μMのレチノイン酸、1%のペニシリンを含有するDMEM培地に交換し、同条件で7日間培養することによってレチノイン酸を用いた誘導を行った。その後、培地を2%のFBS、20μMのレチノイン酸、1%のペニシリンに加えて5μMとなる量のサンプル1若しくはサンプル2に係るペプチドを含有するDMEM培地(このときDMSOを12.5μL含む。)に交換し、同条件で2日間培養を継続した。なお、コントロール区(ペプチド無添加区)においては、ペプチド無しで上記の量のDMSOだけ加えたDMEM培地(2%FBS、20μMレチノイン酸、1%のペニシリンを含む。)を用いて2日間の培養を行った。
具体的には、各試験区において、TNF−R2の測定は、抗TNF−R2ヤギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc製品、SC-1074)を最終濃度:4×10−3mg/mLとなるように各試験管に添加し、37℃で所定時間インキュベートした。そして、二次抗体として蛍光色素(Alexa(登録商標)488)で標識した抗ヤギIgG抗体(ロバ:Invitrogen社製品、A11055)を最終濃度:4×10−3mg/mLとなるように試験管に添加し、37℃で所定時間インキュベートした。
一方、TNF−R1の測定は、抗TNF−R1ウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc製品、SC-7895)を最終濃度:4×10−3mg/mLとなるように各試験管に添加し、37℃で所定時間インキュベートした。そして、二次抗体として蛍光色素(Alexa(登録商標)488)で標識した抗ウサギIgG抗体(ヤギ:Invitrogen社製品、A11034)を最終濃度:2×10−3mg/mLとなるように試験管に添加し、37℃で所定時間インキュベートした。
一方、サンプル1及びサンプル2の何れをマウス由来の培養細胞に添加した場合でも、コントロール区と比較してTNF−R1の存在量(発現量)については殆ど変化が認められなかった(コントロール区と比較してTNF−R1の発現量は僅かに上昇した。)。従って、サンプル1又はサンプル2のようなAPPシグナル配列から実質的に構成される合成ペプチドを用いることによって、対象とする生体器官、組織若しくは部位(微視的には該器官、組織若しくは部位に存在する細胞)におけるTNF−R2の発現を抑制することができ、併せてTNF−R1に対するTNF−R2の存在比を低下させることができる。
上記実施例1において合成された両ペプチドの性能をヒトの神経芽細胞腫由来の培養細胞である細胞株(SK−N−SH株)を用いて調べた。コントロール区としてペプチド無添加区を設けた。本評価試験の詳細は以下のとおりである。
SK−N−SH細胞株を1.5×105cells/mLの密度に直径6cmの培養ディッシュに4mL播種した。培地は一般的なDMEM培地(10%のFBS、2mMのL−グルタミン、50ユニット/mLのペニシリン、及び50μg/mLのストレプトマイシンを含有する。)を用い、37℃、5%CO2条件下のCO2インキュベータ内で二晩培養した。
その二晩培養後、培地を2%のFBS、2mMのL−グルタミン、20μMのレチノイン酸、50ユニット/mLのペニシリン、及び50μg/mLのストレプトマイシンを含有するDMEM培地に交換し、同条件で5日間培養することによってレチノイン酸を用いた誘導を行った。その後、培地を2%のFBS、2mMのL−グルタミン、20μMのレチノイン酸、50ユニット/mLのペニシリン、及び50μg/mLのストレプトマイシンに加えて5μMとなる量のサンプル1若しくはサンプル2に係るペプチドを含有するDMEM培地(このときDMSOを5μL含む。)に交換し、同条件で2日間培養を継続した。なお、コントロール区(ペプチド無添加区)においては、ペプチド無しで上記の量のDMSOだけ加えたDMEM培地(2%FBS、2mMのL−グルタミン、20μMレチノイン酸、50ユニット/mLのペニシリン、及び50μg/mLのストレプトマイシンを含む。)を用いて2日間の培養を行った。
具体的には、各試験区において、TNF−R2の測定は、抗TNF−R2ヤギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc製品、SC-1074)を最終濃度:4×10−3mg/mLとなるように各試験管に添加し、氷上で所定時間静置した。そして、二次抗体として蛍光色素(Alexa(登録商標)647)で標識した抗ヤギIgG抗体(ロバ:Invitrogen社製品、A21447)を最終濃度:4×10−3mg/mLとなるように試験管に添加し、氷上で所定時間静置した。
一方、TNF−R1の測定は、抗TNF−R1マウスモノクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc製品、SC-52739)を最終濃度:2×10−3mg/mLとなるように各試験管に添加し、氷上で所定時間静置した。そして、二次抗体として蛍光色素(Alexa(登録商標)488)で標識した抗マウスIgG抗体(ヤギ:Invitrogen社製品、A10029)を最終濃度:4×10−3mg/mLとなるように試験管に添加し、氷上で所定時間静置インキュベートした。
一方、サンプル1及びサンプル2の何れをヒト由来の培養細胞に添加した場合でも、コントロール区と比較してTNF−R1の存在量(発現量)については殆ど変化が認められなかった(コントロール区と比較してTNF−R1の発現量は僅かに上昇した。)。従って、サンプル1又はサンプル2のようなAPPシグナル配列から実質的に構成される合成ペプチドを用いることによって、対象とする生体器官、組織若しくは部位(微視的には該器官、組織若しくは部位に存在する細胞)におけるTNF−R2の発現を抑制することができ、併せてTNF−R1に対するTNF−R2の存在比を低下させることができる。
上記合成ペプチド(TNF−R2発現抑制ペプチド)50mgと結晶化セルロース50mg及び乳糖400mgとを混合した後、エタノールと水の混合液1mLを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、ここで開示されるTNF−R2発現抑制ペプチドを主成分とする顆粒剤(顆粒状組成物)を得た。
Claims (5)
- アミロイド前駆体タンパク質(APP)中のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列、または、該シグナルペプチドのアミノ酸配列中の1個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加されて形成されたアミノ酸配列から実質的に構成される合成ペプチドを、インビトロにおいて、2型TNF受容体(TNF−R2)を発現可能な細胞に供給することを特徴とする、
前記細胞であって且つTNF−R2の存在量を減少させた細胞をインビトロにおいて製造する方法。 - 前記アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドのアミノ酸配列は、
MLPGLALLLLAAWTARA(配列番号1)、
MLPSLALLLLAAWTVRA(配列番号2)、
MLPGLALVLLAAWTARA(配列番号3)、または
MLPSLALLLLTTWTARA(配列番号4)、
である、請求項1に記載の方法。 - 前記細胞がヒト又はそれ以外の哺乳動物の神経系を構成する細胞である、請求項1又は2に記載の方法。
- 2型TNF受容体(TNF−R2)を発現可能な細胞における該TNF−R2の発現を抑制するための組成物であって、
アミロイド前駆体タンパク質(APP)中のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列、または、該シグナルペプチドのアミノ酸配列中の1個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加されて形成されたアミノ酸配列から実質的に構成される合成ペプチドと、
薬学的に許容可能な担体と、
を含む、TNF−R2発現抑制用組成物。 - 前記アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドのアミノ酸配列は、
MLPGLALLLLAAWTARA(配列番号1)、
MLPSLALLLLAAWTVRA(配列番号2)、
MLPGLALVLLAAWTARA(配列番号3)、または
MLPSLALLLLTTWTARA(配列番号4)、
である、請求項4に記載の組成物。
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